Rapport de Bactriologie

Le but de ce TP est dapprendre mettre en vidence toute une srie de bactries grce leurs caractristiques micro-biologiques, afin de les identifier lors de leur prsence dans un aliment. Nous tudierons successivement des cocci et des bacilles Gram positif, puis des bacilles Gram ngatif. Nous finirons enfin, par lanalyse micro-biologique daliments. I) Etudes de Cocci et Bacilles Gram positif : 1) Cocci Gram positif : Les deux germes tudis sont Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis. Ce sont deux des germes les plus couramment retrouvs dans le milieu extrieur. a) S. aureus : Il est une trs rpandu dans la nature, il est commensal de la peau et des cavits naturelles de lhomme, on le retrouve donc de manire assez frquente dans produits alimentaires, cosmtiques ou pharmaceutiques. Aprs une coloration de Gram, nous observons des amas de cocci G+ plus ou moins important. La recherche de la catalase est nettement positif (gros dgagement gazeux), loxydase na pas t faite. Pour raliser la recherche de la catalase, nous plaons sur une lame de verre une goutte deau oxygne, puis nous y dposons le bout dune pipette Pasteur avec laquelle, nous avons prlever des agents bactrien. Dans le cadre de ltude biochimique de S. aureus, nous avons ensemenc des milieux disolements dit de Baird-Parker, Chapman et une glose TS. Le milieu de Baird-Parker est se compose en plus dlments nutritifs de lcithine, qui en prsence dune lcithinase est dgrade donnant ainsi naissance des zones opaques. Le milieu contient en plus un agent de slection qui est la tellurique potassique. Cette agent est selon le type bactrien toxique ou non, S. aureus est capable de se dvelopper sur un tel milieu. Sur un tel milieu S. aureus donnera des colonies avec une zone dclaircissement puis une zone opaque. La glose de Chapman contient du mannitol et du NaCl trs forte concentration. Le NaCl est utilis comme agent de slction. Si les colonies sont capables de pousser sur un tel milieu et quelles utilisent le mannitol, la glose devient jaune. La glose TS est utilis car il sagit dun milieu beaucoup moins slctif. Parallelement a lisolation du germe, nous allons ensemenc un bouillon TS de manire avoir plus de matriel pour travailler dans de bonne condition. Puis nous ensemenons un tube, permettant de dterminer le type respiratoire de lagent bactrien. Aprs 24H. dincubation 37C, nous lisons les premiers rsultats. La glose TS permet dobserver de petites colonies rgulire ronde, denviron 1 mm de diamtre, et de couleur blanchtre. Sur Baird-Paker, on observe des colonies ponctiformes noir. Le type respiratoire rvle que lensemble du tube a t colonis, la bactrie est donc arobie-anarobie facultative. Le milieu de Chapman rvle la prsence de petite colonie ponctiforme, avec une dcoloration nette du milieu en jaune, notre germe est donc mannitol +. Le bouillon TS quand lui est devenu trouble, il y a donc bien eu multiplication bactrienne. Ltat frais raliser partir du bouillon TS, nous rvle la prsence damas de cocci de diffrentes tailles. Aprs lecture des rsultats du premier jour, nous ensemenons partir du bouillon TS une glose lADN de manire a tudier la capacit de S. aureus utiliser les acides nuclique du milieu, un glose de Mueller-Hinton (on effectue un tapissage de la glose par du bouillon TS) utiliser pour le diagnostic de S. aureus, sur le mme milieu, nous tudierons la rsistance du germe lO129, la bacitracine et la furadone. La glose au sang permettra quand elle de dterminer le pouvoir hmolythique du germe.

Puis nous ensemmencerons un bouillon qui permettra la recharge de la coagulase, une des enzymes caractristique de S. aureus. Touts les milieux ensemencs prcdemment sont placs ltuve 37C pendant 24H, de mme que le milieu de Baird-Parker du 1er jour . Le lendemain, nous observons lvolution de nos milieux. Sur glose de Mueller-Hinton, nous retrouvons un tapis bactrien blanchtre confluant, sauf au niveau de certain disque antibiotique. Une lecture rapide de cet antibiogramme, nous rvle que le germe insensible lO129, le disque de furadone est entour dans gros halo jaune au niveau duquel on retrouve aucune colonie bactrienne, en ce qui concerne de le disque de bacitracine, on observe un halo blanc autour de ce dernier. La lecture du milieu de Baird-Parker rvle des colonies ronde rgulire denviron 1 mm de diamtre avec un halo translucide autour dun autre halo plus dense. La glose au sang nous rvle la prsence de petite colonie blanche, rgulire ronde, denviron 1 mm de diamtre largement -hmolytique. La recherche de la DNase est positive, en effet nous observons un halo denviron une deux fois la largeur de la strie bactrienne. Nous rajoutons au bouillon pour coagulase le plasma de Lapin, puis nous plaons le tout dans un bain-marie 37C. Aprs deux heures, nous observons un prise en masse (coagulation) net du milieu contenu dans le tube hmolyse. Nous pouvons donc rcapituler les caractristiques de notre souche bactrienne de S. aureus : - Cocci en amas, Gram + (G+), immobiles - Catalase +, coagulase +, DNAse + - Anarobie-arobie facultative, mannitol + - Rsistant lO129, et semblant tre sensible la furadone, et rsistant la bacitracine (lecture rapide sans mesure du diamtre du halo autour du disque dantibotique) Il est a not que ni loxydase, ni le Clumping Factor nont t recherche. Il serait tout de mme intressant de connatre le rsultat de la recherche du Clumping Factor pour le typage du S. aureus ( vrifier). b) Enterococcus faecalis : Ce germe est un pathogne que lon retrouvera frquemment dans le fces, les eaux contamines et les plantes. Ce germe peut aussi ce retrouver dans des aliments non striliss, mais de sera pas forcement un marqueur de contamination fcale. Aprs une coloration de Gram, nous observons des cocci G+ lgrement trapus. La recherche de la catalase est ngative. A partir de notre culture pur, nous ensemenons une glose TS permettant disoler des colonies bactriennes, un type rspiratoire, ainsi quun bouillon TS. Nous plaons le tout ltuve 37C sauf pour le bouillon TS qui est placer 44C. Aprs 24H. dincubation nous lisons nos glose. La glose TS rvle le prsence de petites c olonies ronde blanchtre denviron 1 mm de diamtre. Le germe semble se dvelopper sur lensemble du tube du type rspiratoire, le germe est donc aro-anarobie facultatif. Le bouillon TS est quand lui devenu trouble, avec un dpt blanchtre au niveau du culot. Ltat frais fait partir du bouillon TS rvle la prsence ce cooci qui semblent tre arranger et chane, et ils sont immobiles ( part les mouvements Browniens). Toujours partir de ce bouillon TS, nous ensemenons une glose Slanetz, une glose au tellurite de potassim, une glose bile-esculine et un bouillon hypersal. La glose de Slanetz est utilse pour le diagnostique des entrocoques, elle possde un agent de slection qui est lazide de K+, les colonies dE. faecalis devraient apparatre violette fuschia. De mme que le milieu bile-esculine permettra la slection des entrocoques grce la bile. Puis nous plaons lensemble des milieux 37C pendant 24H. Le milieu de Slanetz, nous rvle de + petite colonie violette ponctiforme, caractristiques des entrocoques. Sur le milieu au tellurite de K , nous observons de petite colonie noir ponctiforme. Le tube bile-esculine est devenu entirement noir, sauf au niveau du culot. Nous observons dautre part un trouble dans le bouillon hypersal. Le recherche de DNAse est ngative. Nous pouvons donc rcapituler les caractristiques fondamentales de notre germe : - cocci G+ en chane lgrement trapus - catalase - type respiratoire aro-anarobie facultatif

2) Bacilles Gram + : Les germes tudis sont Bacillus creus et Listeria monocytogene et L. innucua ,ainsi que Clostridium sporogenes. a) Bacillus creus : Ce germe est couramment responsable de problmes de strilisation dans lindustrie ou lorigine dintoxication alimentaire. Dans le but dtudier certaines caractristiques de ce germes nous avons effectu les tests suivants. Au microscope, nous observons des bacilles G+ effil, allong, formant des chanettes relativement longues aprs coloration de Gram. La ralisation dun tat frais nous rvle que les bacilles sont immobiles. Le test de la catalase se rvle positif. Sur glose TS, on observe de grosses colonies beiges, rgulires. Ces colonies sont trs grosses donc pour lisolement, il est ncessaire de faire sur de la bote un ensemencement par une simple piqre. Au 3me jour de culture, et aprs induction de la sporulation ( grce au sulfate de manganse) de B. cereus, nous observons des spores subterminales non dformantes. Ces spores sont caractristique de ce germe. Le rvlation d spores est ralise laide es dune coloration au vert malachite, et une contre coloration la saphranine. Le type respiratoire nous rvle que le germe peut se developper sur lensemble du tube, il est donc aro-anarobie facultative. Le milieu de Mossel contenant de la polymyxine B (inhibiteur de la croissance de certains germes interfrants), de la lcithine et du mannitol. On observe alors aprs incubation de 24H. 37C une colonie de 9 mm de diamtre entoure dun halo opaque denviron 5 mm. Le germe est donc lecithinase + (halo opaque). Le milieu vire une couleur fuschia dons le germe est mannitol -, et dgrade les peptones du milieu avec production de NH3 responsable de lalcalinisation du milieu. Le milieu de Mueller-Hinton contenant un disque de pnicilline 100, nous montre que la culture est confluante sauf sur un rayon de 2 mm autour du disque dantibiotique. Le germe est donc rsistant la pnicilline, cela peut-tre corrle la prsence dune pnicillinase. Sur la glose au sang, nous observons de grosses colonies blanches de 9 mm de diamtre, et possdant une activit hmolytique.

b) Listeria monocytogenes et innocua : Le but de ces manipulations est dtre capable de poser un diagnostic diffrentielle entre deux espces du mme genre. L. monocytogenes tant pathogne alors que L. innocua est non pathogne. La coloration Gram rvlent la prsence de petits bacilles trapus G+ formant de petits amas. Ces observations sont valables pour les deux espces bactrienne. Ltat frais est ralis partir de deux bouillon qui on t incuber rspctivement 25C et 37C. A 25C, nous nobservons rien pour L. innocua alors que pour L. monocytogenes les bactries sont immobiles. A 37C, les bactries sont mobiles pour L. monocytogenes et lgrement mobile pour L. innocua. En thorie L. innocua est immobile 37C, mais il est possible que le bouillon se soit refroidit rapidement et ai donc permis la bactrie de produire des flagelles. Il est noter que les bactries sont animes par un mouvement de bascule. Le test de recherche de la catalase est positif. Sur glose TS L. monocytogenes et L. innocua donnent des colonies blanches, denviron 2 mm de diamtre, rgulires et lisses. Ltude du type respiratoire nous montre que les bactries sont c apables de se dvelopper sur lensemble de la glose par consquence, elles sont toutes les deux aro-anarobie facultative. Lisolement sur glose dOxford des deux espces nous donne des petites colonie gristres, rondes, rgulires avec un halo noir autour des

colonies. Ceci sexplique par le fait quelles sont capables de rduire lesculine du milieu en esculetine, qui ragira avec le Fe2+. On tudie aussi la prolifration des germes dans un bouillon TS placer diffrente temprature (25C et 37C), et les rsultats sont les suivants : 24H. L. innocua semble stre dveloppe 37C et pas 25C, et de mme pour L. monocytigenes. Ces rsultats sont en contradiction avec des observations qui dmontrent que L. innocua se dveloppe mieux 25C qu 37c et inversement pour L. monocytogenes. Nous essayons dtudier la mobilit de nos germes, pour cela nous ensemenons deux milieu Mannitol mobilit par germes , ces milieux seront incubs une temprature de 25C ou de 37C. Aprs 24H dincubation, nous n remarquons aucun dveloppement bactrien pour e les tube de L. monocytogenes, alors que pour L. innocua les germes sont mobiles 25C et immobiles 37C. Nous tudions la capacit de nos agents mtaboliser certain sucres. Pour cela nous utilisons deux tubes contenant du CTA auquel nous additionnons soit du Xylose soit du Rhamnose, puis nous plaons les tubes 24H 37C. Nous obtenons les rsultats suivant, L. innocua : tube xylose est orange de mme que le tube du Rhamnose. Pour L. monocytogenes nous obtenons un tube xylose orange et un tube rhamose jaune. Par consquent L. innocua est Xylose et Rhamnose -, alors que L. monocytogenes est Xylose et Rhamnose +.Les rsultats pour L. innocua sont encore en contradiction avec des observations antrieures, qui rvlaient que ce germes tait Xyl+ et Rha-. On peut donc penser que notre germe perdu la capacit dutiliser le Xylose. Pour dfinitivement diffrencier les deux souches, nous ralisons un CAMP test dans une glose sang. En effet lors dun tel test, nous dposons sur le milieu une souche particulire de S. aureus, et nous disposons de part et dautres nos germes. Dans un tel test le pouvoir hmolytique de S. aureus est renforc en prsence de L. monocytogenes. Les colonies de L. innocua proximit des colonies de S. aureus ne renforce pas son pouvoir hmolytique, alors que dans le cas de L. monocytogenes cest le cas. Les bactris sont donc rspectivement CAMP- et CAMP +.

C) Clostridium sporogenes : La coloration de Gram rvle de petits btonnets G+ en chanette ou isols. Ltat raliser partir de la culture pur, nous montre des mouvement orient relativement linaire. Le type respiratoire nous montre que C. sporogenes se dveloppe dans les 2/3 infrieur du tube, avec observation dun dgagement gazeux. Le germe est donc anarobie stricte. Un bouillon thioglycolate et rzazurine est ensemenc et placer 24H 37C. La rzazurine est un indicateur doxygnation, qui devient donc rose en surface et jaune dans le reste du tube (car absence dO 2 ). Le milieu contient galement 1% dagarose pour alourdier le milieu de manire limiter les courants de convection dans ltuve. Le germe est capable de pousser dans le tube, mais sarrte 2 mm de la surface, l ou lindicateur devient jaune. Un e glose TSC (Triptase Sulfite Cyclosrine) est ralis. La glose doit tre rgnre 100C pois refroidit 50C et enfin on additionne de la D -cyclosrine. Ce milieu est slectif des Clostridium. On observe que le germe donne une coloration noire sarrtant 3 mm de la surface du tube. 3) Linconnue X7 : La coloration Gram rvle de petites cocci G+, ovode, trapus en amas, catalase -. Il doit donc probablement sagir de E. faecalis. Sur glose TS incuber 37C pendant 24H., on obtient des petites colonies rondes, blanchtre, rgulire denviron 1 2 mm de diamtre. Sur Baird-Paker la piqre est noire, elle est possde donc un elcithinase.On obtient une piqre avec un halo jaune autour, sur Chapman, le germe est donc capable de ce dvelopper en prsence de grande quantit de sel et est capable dutiliser le mannitol. Son type rspiratoire est aro-anarobie, sur milieu de spporulation, nous nobservons aucune colonie. Le milieu de Blantz rvle des colonies violettes ponctiformes, sur glose au sang, les colonies sont lgrement hmolytique, et sur Tellurite de K+, les colonies sont noire ponctiformes sans halo autour. Tous ces rsultats tendent confirmer que X7 est bien des germes dE. faecalis.

II) Etudes de Bacilles Gram - : 1) Enterobacteriacae : a)Salmonella enteritidis : Salmonella est lune des premires causes dintoxication dorigine alimentaire en France. Il entrane lapparition de syndromes intestinaux de gravits plus ou moins importants (fivre entriques, gastroentrites), ainsi que des septicmies. Sa dtection est donc trs importante. La coloration Gram rvle des petits bacilles trapus G isols ou en amas, la recherche de la catalase est ngative. On effectue aussi la recherche de loxydase, pour cela , on utilise un disque ractif s lequel ur on met en contact laide dune pipette Pasteur des germes, puis nous lisons le rsultat au bout de 5 6s. de manire viter lapparition de faux ngatif. La recherche reste ngative. Un tat frais raliser laide dun bouillon TS incuber pendant 24H. 37C, nous rvle que les bacilles sont lgrement mobiles. Aprs 24H dincubation 37C, nous observons les premiers milieux. Sur Drigalski, nous obtenons des colonies rondes vertes au milieu et translucide au bord, denviron 1 2 mm de diamtre. Ce milieu permet la caractrisation des micro-organismes fermentant le lactose, dans notre cas les bactries sont donc lactose . La glose TS montre la prsence de petites colonies rondes, rgulires, blanchtre-jaune, denviron 1 2 mm de diamtre. Le milieu vert brillant permet un isolement slectif de Salmonella sp. sauf de Salmonella typhi, cest pour cela qui est recommand dans la recherche de notre agent bactrien. Sur cette glose, nous obtenons des colonie blanchtre sur fond rose. Elles sont rondes et rgulires avec un diamtre denviron 1 2 mm, il faut noter quil se dgage de la bote une odeur ftide. Sur hecktoen, nous observons des colonies rondes, noire au centre et translucide en priphrie , denviron 1 mm de diamtre, le fond est bleu noir. Ce milieu permet un isolement slectif des bacilles entropachignes (Salmonella et Shigella). Le type rspiratoire nous montre que le germe est capable de ce dvelopper sur lensemble du tube de glose, par consquent il est aro-anarobie facultatif. De plus, nous observons un dgagement gazeux, et une odeur vraiment ftide (uf pourri), notre bactrie est donc peut-tre H2 S+. Sur ligler, nous remarquons que la pente est rose, le culot noir ainsi quun dgagement gazeux, notre bactrie produit donc bien de lH2S et est lactose -. Aprs 24H. le bouillon de Clark et Lubs est devenu trouble. Le milieu de Hugh-Leifson est utilis pour la mise en vidence du type respiratoire, on ajout pralablement quelques gouttes de Glucose. L'observation de l'acidification ventuelle sur toute la hauteur du tube ensemenc en piqre centrale permet de conclure. L'ensemencement de deux tubes dont un recouvert de vaseline strile est ralis de manire avoir un tube en anarobie stricte. Les deux tubes sont devenus jaunes, on peut donc conclure que notre germe fermente le glucose. Nous ensemenons aussi un milieu Citrate de Simmons. Les bactries utilisant le citrate comme seule source de carbone bleuissent normalement le milieu (alcalinisation)les bactries ne l'utilisant pas ne cultivent pas.Toutefois, des bactries peuvent utiliser le citrate comme seul source de carbone sans bleuir. Ici, la pente bleuie, notre germe est donc citrate +. Le milieu mannitol mobilit, nous rvlent que les bactries sont lgrement mobile, et le milieu tant devenu jaune-orang que le germe est mannitol+ (milieu jaune : mannitol + ; milieu rouge : mannitol -). Aprs 24H. dincubation dans le bouillon ure-indole, nous rvelons ce milieu. Si le milieu est rouge (basique) : urase + milieu orange ou jaune : urase - , aprs addition de ractif de Kovacs il y a apparition d: anneau rouge (indole +), anneau jaune (indole -). Ici le milieu est orang et ne varie pas aprs ajout du ractif de Kovacs, par consquence notre bactrie est Indole- et Urase-. Nous ralisons la recherche de la -galactosidase partir dun milieu lactos, sa recherche est reste ngative. A partir du bouillon nitrate, nous recherchons les nitrites. On ajoute au bouillon les ractifs Nitrite 1 et 2. Une coloration rouge signifie la prsence de nitrites. (bactrie nitrate rductase + stade nitrites).En cas de milieu incolore, on ajoute le zinc rducteur des nitrates. Attendre quelques minutes. Une coloration rouge montre la prsence de nitrites : la bactries est Nitrate rductase -. Une absence de coloration montre l'absence de nitrates : la bactrie les a rduit en azote. Ici, nous

Aprs 48H. dincubation, nous rvlons le milieu de Clark et Lubs. Aprs addition d'hydroxyde
observons que notre bactrie est nitrate rductase +.

de sodium ou de potassium et de napht-1-ol sur un aliquote du milieu (0.5 ml) : coloration rose (VP+) ou non (VP -). Pour la raction de rouge de mthyl, nous rajoutons ?????
c) E. coli :

2) Bacille arobies stricts : a)Pseudomonas aeroginosa et P. fluorescens: Cette bactrie est lune des plus rpandues en milieu hospitalier, et elle est responsable de certaines infections nosocomiale. La coloration Gram rvle des bacilles G-, la recherche de catalase est positive, de mme que la recherche de loxydase. Ltat frais, nous montre des bacilles prsentant un mouvement de bascule. Nous placerons lensemble des tubes incuber 30C 24H. sauf exception. Le type respiratoire montre que les bactries ne ce dveloppent que dans la partie suprieure du tube, les bactries sont donc arobies strictes. Nous recherchons des pigment caractristiques de ces germes, pour cela nous ensemenons des milieux King A et King B. Pour King A, la pyocyanine bleuit le milieu. Une coloration rouge traduit la production de pyorubine. Pour King B, la pyoverdine jaunit le milieu. Cette molcule prsente une fluorescence 340 nm. Ces deux caractristiques sont retrouvs dans le cas de P. aeruginosa et seul King B est positif pour P. fluorescens. Sur MEAD, on obtient des colonies jauneblanchtre, ce qui signifie.. Sur glose TS, on obtient des colonie ponctiforme, jauntre. On observe aprs 48H. dincubation que P. fluorescens se dveloppe dans un bouillon TS plac 4C et nous dans le mme bouillon placer 41C. Le milieu de Hugh Leifson nous rvle que P. fluorescens est capable de ferment le glucose en arobie stricte.

b)Alcaligenes faecalis : Ce micro-organisme est un saprophyte du sol et de leau. Commensal du tube digestif, il peut provoquer certains troubles intestinaux, ainsi que la protolyse du lait. Aprs coloration de Gram, on observe des petits bacilles G- isols, la recherche de la catalase est positive de mme que recherche de loxydase. Ltat frais nous montre que les bacilles sont extrmement mobiles. Les diffrents milieux sont placs 30C pendant 24H. Le type respiratoire nous montre que les bactries ne sont capables que de ce dvelopper dans la partie suprieure du tube, elles sont donc arobies strictes. Sur glose TS, on observe des colonies ponctiformes, translucide desquelles ce dgage une odeur fruite. Sur Drigalski les colonies sont prennent diffrentes coloration : Colonies jaunes : lactose + Colonies vertes ou bleues : lactose -. Ce milieu est utiliser pour le diagnostic des bactries G-, mais toutes ne poussent pas dessus. On observe aucune modification de la couleur du milieu, nos bactries sont donc lactose-. La recherche de la nitrate rductase partir dun bouillon nitrat est ngative. d) Acinobacter calcoaceticus, Var. anitratus :

III) Analyse bactriologique daliments : Lanalyse microbiologique des aliments est quelque chose de trs important. En effet, lors de la confection des aliments, des germes pathognes ou non peuvent venir ce glisser dans laliment. Il est alors comprhensible que certains de ces germes dits pathognes puissent entraner des troubles de gravits plus ou moins importants selon la personne. Il est donc important de pouvoir les detects sils sont prohibs ou de les quantifis si ils sont accepts dans une certaine mesure. 1) Saucisse de Lyon : Pour lanalyse de cet aliment, nous utilisons la procdure dcrite dans le livret de TP et du JO : Produits de charcuterie cuits, tranches ou non, quenelles (J.O. 19-01-80 modifi le J.O. 01-04-93) Rsultats : - Aprs 24H. dincubation : .Flore msophile : (PCA) aucune colonie sur les botes .Coliformes : (VRBL) aucune colonie sur les botes .Coliformes thermotolrants : (VRBL) aucune colonie sur les botes .Salmonelles : ngatif .Sulfito-rducteur : (TSC) aucune colonie sur le tube .S. aureus : (Baird-Parker) aucune colonie sur les botes Aprs 48H dincubation : .Flore msophile : (PCA) aucune colonie sur les botes .S. aureus : (Baird-Parker) 2 colonies caractristiques repartis sur deux botes, colonies se sont rvles catalase+. Dnombrements : .Flore msophile : <900 colonies/g .Coliformes : <9 colonies/g .Coliformes thermotolrants : <9 colonies/g .S. aureus : 18 colonies/g .Sulfito-rducteur : <9 colonies/g .Salmonella : absence/25G (3.105 /g) (103 /g) (10 /g) (102 /g) (30/g) (absence/25G)

les

2) Yahourt :