DNA REPAIR

Pemeliharaan integritas informasi di dalam molekul DNA sangat penting bagi kelangsungan hidup spesies. Jadi dapat disimpulkan bahwa spesies yang bertahan hidup berhasil mekanisme untuk memperbaiki kerusakan DNA-nya yang terjadi akibat kesalahan replikasi atau gangguan dari lingkungan. DNA bukanlah substansi yang lemah, telah dilengkapi dengan mekanisme tertentu yang mampu menetralisasi gangguan-gangguan yang terjadi sehingga tidak membawa efek negatif. Mekanisme yang dimiliki DNA tersebut adalah mekanisme DNA repair (perbaikan DNA) yang terjadi pada fase tertentu dalam siklus sel. Pada fase G1 (Gap 1) terdapat check point yaitu suatu tempat dimana susunan DNA akan dikoreksi dengan seteliti-telitinya. Apabila ada kesalahan, sel mempunyai dua pilihan : Pertama, kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun, apabila kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk mengambil pilihan kedua yaitu dimatikan daripada hidup membawa pengaruh buruk bagi lingkungan sekelilingnya. Saat itulah keputusan untuk berapoptosis diambil. Sel dengan DNA normal akan meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (Sintesis), G2 (Gap 2) dan M (Mitosis). Kerusakan DNA akibat bahan kimia, fisik, dan lingkungan diklasifikasikan menjadi empat tipe, yaitu:

I.

Perubahan satu basa A. Depurinasi B. Deaminasi sitosin menjadi uraasil C. Deaminasi adenine menjadi hipoxantin D. Alkilasi basa E. Insersi atau delesi nukleotida F. Penyertaan analog basa

II.

Perubahan dua basa A. Dimmer antartimin (pirimidin) yang diinduksi oleh sinar UV B. Ikatan silang agen pengalkil bifungsional

III.

Pemutusan rantai A. Radiasi pengionan B. Disintegrasi radioaktivitas C. Pembentukan radikal bebas oksidatif elemen rangka (tulang punggung) oleh

IV.

Ikatan silang A. Antara basa di untai yang sama atau berlawanan B. Antara DNA dan molekul protein (mis. Histon)

MEKANISME PERBAIKAN DNA Region abnormal DNA, baik karena kesalahan penyalinan atau kerusakan DNA, diganti melalui empat mekanisme, yaitu:
1. Mismatch repair (perbaikan ketidakcocokan) 2. Base excision repair (perbaikan dengan memotong basa) 3. Nucleotide

excision

repair

(perbaikan

dengan

mengeluarkan/memotong nukleotida)
4. Double strand break repair (perbaikan kerusakan untai ganda)

Tabel. Mekanisme perbaikan DNA

Mekanisme Mismatch repair (perbaikan ketidakcocokan)

Masalah Kesalahan (lengkung berpasangan

Solusi penyalinan Pemotongan tak yang diarahkan

untai oleh dan

dengan metal, pencernaan oleh penggantian Pengeluaran basa oleh N-glikosilase, pengeluaran tanpa penggantian suatu Pengeluaran sekitar 30 oligomer nukleotida gula basa,

dua sampai lima basa eksonuklease, atau satu basa)

Base excision repair (perbaikan dengan memotong basa) Nucleotide excision repair (perbaikan memotong nukleotida) Double break repair (perbaikan kerusakan ganda) strand dengan

Kerusakan yang radiasi Kerusakan segmen

satu

basa

timbul

spontan

akibat bahan kimia atau

DNA

secara

spontan akibat bahan kimia atau radiasi

dan penggantian

Radiasi kemoterapi,

pengionan, radikal

Sinapsis,

penguraian,

untai bebas oksidatif

penyusunan, dan ligasi.

1. Mismatch repair (Perbaikan yang tidak berpasangan/ketidakcocokan)

Mismatch repair memperbaiki kesalahan yang dibuat ketika DNA disalin. Contohnya, C dapat terselip berhadapan dengan A, atau polymerase dapat tergelincir atau tersendat dan menyisipkan dua sampai lima basa tambahan yang tidak berpasangan. Protein-protein yang spesifik memindai DNA yang baru dibentuk menggunakan metilasi adenine di dalam sekuens GATC sebagai titik referensi. Untai cetakan mengalami metilasi, dan untai yang baru dibentuk tidak demikian. Perbedaan ini tidak memungkinkan enzim perbaikan mengidentifikasi untai yang mengandung kesalahan nukleotida dan memerlukan pergantian. Jika ditemukan ketidakcocokan atau lengkung kecil, suatu GATC endonuklease memotong untai yang mengandung mutasi di tempat yang berkorespondensi dengan GATC. Suatu eksonuklease kemudianmencerna untai ini dari GATC dan melalui mutasi sehingga DNA yang cacat tersebut dapat dibuang. Hal ini dapat berlangsung dari kedua ujung jika cacat tersebut diapit oleh dua tempat GATC. Cacat ini kemudian di isi oleh enzim sel normal sesuai aturan pembentukan pasangan basa. Untuk memperbaiki basa yang tidak berpasangan methylase yang disebut dengan harus diketahui

pasangan basa mana yang salah. Pada E. coli, ini dapat diketahui oleh "Dam methylase", dimana dapat memetilasi adenines yang terdapat pada urutan (5')GATC . Segera sesudah replikasi DNA, template strand dimetilasi, tetapi strand yang baru disintesa belum dimetilasi. Jadi antara template strand dan new strand akan berbeda. Pada E. coli, diperlukan tiga protein (Mut S, Mut C, dan Mut H) untuk mengenali mutasi dan memotong untai. Enzim lain di dalam sel, termasuk ligase, plimerase, dan SSB mengeluarkan dan mengganti untai.

Dimulai dengan berikatannya protein MutS pada mismatched base pairs. Kemudian MutL mengaktifkan MutH untuk bergabung bersama pada urutan GATC. MutH akan membelah strand yang tidak dimetilasi pada tempat GATC . Selanjutnya, segment dari tempat pembelahan akan dibuang oleh enzim exonuclease (dengan bantuan enzim helicase II dan SSB proteins). Bila pembelahannya pada bagian 3' dari kerusakan, akan dipotong oleh enzim exonuclease I dan bila pada bagian 5' oleh enzim exonuclease VII atau RecJ untuk mendegradasi single tranded DNA. Kekosongannya akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase III dan DNA ligase. Jarak antara tempat GATC dengan kerusakan bisa mencapai sepanjang 1,000 base pairs .

Gambar. Mismatch repair DNA. Mekanisme kesalahan ini memperbaiki satu pembentukan

pasangan basa (mis. C dengan A, bukannya T dengan A) atau sepotong cacat pendek DNA oleh yang suatu di tidak berpasangan. Bagian yang dikenali endonuklease yang melakukan pemotongan untai-tunggal sekuens GATC termetilasi. Untai DNA dikeluarkan melalui mutasi, diganti, lalu disambung kembali.

2. Base excision repair (Perbaikan dengan memotong Basa)

Depurinasi DNA, yang terjadi secara spontan karena labilitas termal ikatan N-gglikosida purin, terjadi dengan kecepatan 5.00010.000/sel/hari pada suhu 370 C. enzim-enzim spesifik mengenali bagian yang mengalami depurinasi dan menggantikannya dengan purin yang secara langsung, tanpa interupsi pada tulang punggung phospodiester. Basa sitosin, adenine, dan guanine di DNA secara spontan membentuk, masing-masing, urasil, hipoxantin, xantin. Karena tidak ada satupun dari ketiga basa tersebut yang terdapat di DNA pada keadaan normal, tidaklah mengherankan jika N-glikosilase spesifik dapat mengenali basa-basa abnormal ini yang mengeluarkan sendiri basa dari DNA. Pengeluaran ini menandai letak kecacatan dan memungkinkan

endonuklase apurinik atau apirimidinik memotong gula tanpa basa. Basa yang sesuai kemudian memotong gula tanpa basa ini. Basa yang sesuai kemudian dipasang oleh DNA polymerase, dan ligase memperbalikkan DNA ke keadaannya semula. Rangkaian kejadian ini disebut base excision repair (perbaikan dengan memotong basa). Dengan rangkaian langka serupa yang mula-mula melibatkan defek, basa teralkilasi dan analog basa dapat dikeluarkan dari DNA dan DNA dipulihkan kebentuknya semula. Mekanisme ini cocok untuk menggantikan basa tunggal, tetapi tidak efektif untuk mengganti region DNA yang rusak. Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deamination atau alkylation. Tempat kerusakan basa tersebut disebut dengan "abasic site" atau "AP site". Pada E.coli, enzim DNA glycosylase dapat mengenal AP site dan membuang basanya. Kemudian AP endonuclease membuang AP site dan nucleotida sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA polymerase I dan DNA ligase.

Gambar. Base Excison-repair DNA, enzim urasil DNA glikosilasil membuang urasil yang terbentuk dari deaminasi spontan sitosin di DNA. Suatu endonuklease memotong kerangka utama untai di dekat defek; lalu setelah endonuklease mengeluarkan beberapa basa, defek tersebut diisi melalui kerja polimerasi dan untai tersebut kembali dihubungkan oleh suatu ligase.

3. Nucleotide

excision

repair

(perbaikan

dengan

memotong

nukleotida) Mekanisme ini digunakan untuk menggantikan suatu regio DNA dengan panjang30 bp yang mengalami kerusakan. Penyebab umum kerusakan DNA semacam ini adalah sinar ultraviolet (UV), yang memicu pembentukan dimmer antarpirimidin siklobutan, dan merokok, yang menyebabkan pembentukan adduct (addition product) benzo [a]piren-guanin. Radiasi pengion, obat kemoterapi kanker, dan

berbagai bahan kimia yang terdapat dilingkungan yang dan dapat menyebabkan modifikasi basa, putusnya untai, ikatan silang antara basa di untai yang berhadapan atau DNA dan protein, dan berbagai defek lain. Cacat-cacat ini diperbaiki oleh suatu proses yang disebut perbaikan yang disebut eksisi nukleotida. Proses rumit, yang melibatkan lebih banyak produk gen dibandingkan dengan dua tipe perbaikan sebelumnya, pada dasar mencakup hidrolisis dua ikatan phospodiester di untai yang mengandung kecacatan. Suatu nuclease eksisi khusus (eksinuklease), yang terdiri dari paling sedikit tigan subunit pada E. coli dan 16 polipeptida pada manusia, melaksanakan tugas ini. Di sek eukariot, enzim-enzim memotong antara ikatan phospodiester ketiga dan kelima 3 dari lesi, dan dari sisi 5 potongan terletak di suatu tempat antara ikatan keduapuluh satu dan keduapuluh lima. Karena itu, terjadi eksisi suatu fragmen DNA dengan panjang 27-29 nukleotida. Untai yang dikeluarkan kemudian diganti, juga pembentukan pasangan basa yang tepat, melalui kerja polymerase lain yang belum diketahui ( / ligase. Pada E. coli, protein UvrA, UvrB, dan UvrC berperan dalam membuang nukleotida ( dimer akibat UV light). Kemudian kekosongan akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase I dan DNA ligase. "radiation"), seperti RAD3, RAD10, dan lain-lain. Pada yeast, proteins Uvr's dikenal dengan nama RADxx ("RAD" kependekan dari pada manusia), dan

ujung-ujung untai disatukan dengan untai yang sudah ada oleh DNA

Gambar. Perbaikan-eksisi nukleotida (nukleotida excision repair). Mekanisme ini digunakan untuk memperbaiki defek besar DNA dan umumnya melibatkan lebih banyak protein disbanding mismatch repair atau perbaikan eksisi basa. Setelah kelainan dideteksi (ditandai oleh XXXX) dan DNA yang mengandung kelainan tersebut diraikan/(unwinding), suatu nuclease eksisi (eksinuklease) memotong DNA disebelah hulu dan hilir dari bagian yang cacat. Celah ini kemudian diisi oleh polymerase dan disambung kembali.

4. Double strand break repair (perbaikan kerusakan untai ganda)

Perbaikan kerusakan untai ganda merupakan bagian dari proses fisiologis tata ulang gen imunoglobulin. Perbaikan ini merupakan mekanisme penting untuk memperbaiki DNA yang rusak, seperti yang terjadi akibat radiasi pengion atau pembentukan radikal bebas oksidatif. Sebagian obat kemoterapi merusak sel dengan merusak untai ganda atau perbaikannya.

Mula-mula terdapat dua protein yang berperan dalam penyatuan kembali non homolog suatu kerusakan untai ganda. Ku, suatu heterodimer subunit 70 kDa dan 86 kDa, berikatan dengan ujung-ujung bebas DNA aktivitas helikase dependen-ATP laten. Heterodimer Ku yang berikatan dengan DNA merekrut suatu protein kinase unit, protein kinase dependen DNA (DNA PK). DNA-PK memiliki satu ikatan bagi ujung-ujung bebas DNA dan satu tempat ikatan untuk dsDNA tepat di bagian dalam ujung-ujung unit. Karena itu, enzim-enzim ini memungkinkan aproksimasi kedua ujung yang terpisah. Ujung bebas kompleks DNA-Ku-DNA-PK membangkitkan aktivitas kinnase pada ujung-ujung yang KU terpisah. dan DNA-PK secara lain timbale di untai balik yang memphosporilasi molekul DNA-PK

berlawanan, ditrans. DNA-PK kemudian kemudian terlepas dari DNA dan KU, menyebabkan aktivasi Ku helikase. Hal ini menyebabkan penguraian kedua ujung DNA. DNA yang telah di urai dan sudah diaproksimasi kemudian membentuk pasangan basa; kelebihan ekor nukleotida dibuang oleh eksonuklease; dan celah yang ada di isi dan ditutup oleh DNA ligase.

Gambar. protein berikatan

Perbaikan kinase untuk

kerusakan

untai ganda DNA. Protein Ku dan dependen-DNA mendekatkan yang telah

kedua untai dan menguraikannya. Fragmen-fragmen berjajar membentuk pasangan

basa; kelebihan ujung dikeluarkan, mungkin oleh endonuklease atau eksonuklease terkait DNA-PK, dan celah ligase. kemudian diisi; dan kontinuitas untai dipulihkan oleh