TEKNIK ISOLASI

Ir. Woro Hastuti Satyantini, M.Si.

Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga 2007

Teknik Isolasi : metode/teknik untuk mengisolasi fitoplankton

Tujuan isolasi : untuk memperoleh fitoplankton monospesies (spesies tunggal) dengan cara mengisolasi sampel plankton yang didapat dari alam

Ada 6 metode isolasi : 1. 2. 3. 4. 5. 6. Metode pipet kapiler Metode pipet kapiler yang disederhanakan Metode streak plating Metode spray plating Metode isolasi pada media agar Metode isolasi dari atmosfer

Dari ke 6 metode isolasi metode pipet kapiler dan streak plating yang direkomendasikan untuk semua isolasi 4 metode lain variasi metode isolasi

1.Metode Pipet Kapiler - sterilisasi petri dish, watch glass, segitiga kaca - gelas kaca diletakkan di atas watch glass - 6-8 tetes medium kultur diletakkan di atas watch glass atau plate dengan 3 lubang - tambahkan 2-3 tetes sampel dari alam ke dalam medium kultur pada watch glass - Pasteur pipet steril dipanaskan ujungnya hingga berpijar lalu ditarik dengan pinset hingga membentuk ujung kapiler - tentukan unit plankton yang diinginkan dengan melihatnya di bawah mikroskop - ujung pipet kapiler diletakkan dekat unit plankton yang akan diambil - unit plankton yang terambil dipindahkan pada tetes medium di watch glass kedua, dst - terakhir memasukkannya ke dalam test tube berisi medium kultur untuk penumbuhan plankton tersebut

2. Pipet Kapiler Yang Disederhanakan - 10-15 tetes sampel diletakkan pada bag. Tengah tutup petri dish - 6-8 tetes medium kultur diletakkan melingkari tetes sampel searah jarum jam - unit plankton yang diinginkan pada tetes sampel diambil dengan menggunakan pipet kapiler - pindahkan unit plankton yang didapat pada tetes 1 yg melingkari tetes sampel hingga tetes ke 6 - terakhir memindahkan unit plankton yg benar-benar single sel dari tetes ke 6 masuk ke dalam test tube yg telah berisi medium kultur untuk penumbuhan plankton

3. Streak Plating Bila uk. Plankton < 10 m isolasi mudah dengan streak atau spray plating - menyiapkan petri dish berisi media agar dengan konsentrasi 1,5% setebal -2/3 bag. tinggi petri - 1-2 tetes sampel diteteskan dekat sisi pinggir petri dish - jarum ose dipanaskan di atas api bunsen yg sebelumnya dicelupkan pada alkohol 70% - jarum ose dibiarkan dingin sejenak lalu digunakan untuk menggores sampel yg telah diteteskan pada media agar - tutup dengan tutup petri dish, letakkan secara terbalik dan diinkubasi 4- 8 hari - setelah tumbuh, diamati di bawah stereomikroskop, ambil plankton yg diinginkan dengan jarum steril, letakkan pd tetesan medium kultur pd objek glass dan amati di bawah mikroskop - streaking pada media agar ke dua lalu diinkubasi - koloni plankton yg tumbuh selanjutnya dipindahkan pd test tube berisi medium kultur

4. Spray plating
Hampir sama dengan streak plating, hanya sampel disemprotkan pd permukaan medium agar dengan pasteur pipet yang dilengkapi kompressor udara atau pompa udara spray plating

5.

Isolasi pada agar

pemisahan plankton dari kontaminan Menyiapkan petri dish berisi medium agar Membuka tutup petri dish, biarkan permukaan agar sedikit mengering 1 tetes sampel diteteskan pd bag. tengah medium agar pada petri Dengan menggunakan jarum ose steril dan pengamayan di bawah mikroskop dilakukan penarikan unit plankton yang diinginkan dengan cara zigzag hingga terisolasi dari yg lain Unit plankton yang terisolasi diambil dengan pipet kapiler atau dengan memotong agar dengan mikrospatula pindah ke test tube berisi medium kultur

6. Isolasi dari atmosfer - Menyiapkan petri dish berisi media agar - Meletakkan dengan posisi vertikal ke arah atmosfer selama 5-10 menit dari benda yang bergerak dengan kecepatan 50-70mph - Menutup dengan tutup petri dish, diletakkan terbalik dan diinkubasi pada ruang steril selama 2-6 minggu - Selanjutnya diikuti dengan metode streak plating

Beberapa metode isolasi mikroalga monospesies

kultur

Metode-metode ini tidak hanya mengisolasi spesies yg diinginkan dari populasi plankton di alam yg berisi spesies mix, tetapi dapat juga digunakan untuk mengisolasi spesies kultur yg terkontaminasi dengan organisme lain

Dari 6 metode isolasi, dapat pula menggunakan 3 metode di bawah ini yaitu : 1. Metode pipet dan kait 2. Metode agar plate (streaking on agar) 3. Metode kultur berulang

1. Metode pipet dan kait

2. Metode Agar Plate (Streaking Plate)

3. Metode sub kultur berulang

sampel

pengenceran

Media yg berbeda

Hasil isolasi baru dapat dilihat setelah inkubasi beberapa hari Isolasi harus dikerjakan pada tempat yg steril dan diinkubasi dalam ruang yg cukupintensitas cahaya

Pembuatan medium agar untuk isolasi

- Menimbang

bacto agar sebanyak 1,5 gr dilarutkan dalam 100 ml air (tawar atau laut) sesuai dengan jenis plankton yang akan diisolasi - Dipanaskan sampai mendidih dan lar. menjadi jernih - Selama pemanasan dilakukan pengadukan agar tidak menggumpal - Setelah mendidih, larutan diangkat dari pemanasan - Setelah agak dingin, ditambahkan pupuk/nutrien sesuai dengan jenis plankton yang akan diisolasi - Larutan agar dituang ke dalam petri dish steril dengan ketebalan (1/2 tinggi petri) atau ke dalam tabung reaksi steril dengan posisi miring (agar slant) - Setelah media agar membeku, siap digunakan untuk menanam inokulan

Komposisi pupuk/nutrien untuk kultur skala laboratorium

No . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Bahan Kimia EDTA NaH2PO4.2H2O FeCl3.6H2O H3BO3 MnCl2 NaNO3 Na2SiO3.9H2O Trace metal solution Vitamin Aquadest sampai Conwy/Walne 45 gr 20 gr 1,5 gr 33,6 gr 0,36 gr 100 gr 1 ml 1 ml 1000 ml Guillard 10 gr 10 gr 2,9 gr 3,6 gr 100 gr 5 gr/ml 1 ml 1 ml 1000 ml

Komposisi Trace Metal Solution

No . 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Bahan Kimia ZnCl2 CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O (NH4)6.Mo7O24.4H2O Aquabidest sampai

Conwy/Walne 2,1 gr 2,0 gr 2,0 gr 0,9 gr 100 ml

Guillard 1,96 gr 4,40 gr 2,0 gr 1,26 gr 100 ml

Kultur Di Media Cair

Tahap kultur selanjutnya dari media agar Koloni fitoplankton yang tumbuh dan berkembang di media agar dipindahkan ke media cair dengan menggunakan jarum ose steril Tabung-tabung reaksi yang telah berisi bibit fitoplankton hasil isolasi ditempatkan dalam rak tabung reaksi dan diletakkan pada rak dengan dilengkapi lampu neon Selama kultur di tabung reaksi sesering mungkin dikocok untuk menghindari pengendapan dan untuk difusi udara Pertumbuhan dan perkembangan fitoplankton semakin meningkat kepadatannya pindah ke erlenmeyer 100-250 ml dst, sampai vol. masal pindah ke erlenmeyer 500 ml

Kontaminasi - Kultur fitoplankton membutuhkan medium kultur

yang steril - Untuk menghasilkan kultur fitolankton yang murni, maka semua alat, media dan bahanbahan lain yang digunakan harus steril

Ada 4 metode untuk menghasilkan kultur fitoplankton yang bebas kontaminan yaitu :
1. Centrifuse 2. Treatment ultrasonic 3. Treatment antibiotik 100 mg penicillin G 50 mg streptomycin SO4

mix dengan 10 ml aquadest

10 mg chloramphenicol dilarutkan dalam 1 ml 95% ethanol mix dengan lar. Penicillin dan streptomycin 4. Treatment Potassium Tellurite (K2TeO3) 1-1,5% lar. Agar + 10 mg/l K2TeO3