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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA

DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIA
LABORATRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS

36.571-000 VIOSA - MG BRASIL

TCNICA DE MICROGOTA PARA CONTAGEM DE CLULAS BACTERIANAS VIVEIS EM UMA SUSPENSO

Reginaldo da Silva Romeiro, PhD Professor Titular da UFV

TELEFONE:(O31)899-2620 - FAX:(031)899-2240 - E-Mail: rromeiro@mail.ufv.br

INFORMAO BSICA Face s reduzidas dimenses da clula bacteriana e s peculiaridades com que ela se divide, o crescimento de bactrias estudado em termos de aumento da populao em funo do tempo e no de aumento nas dimenses celulares de indivduos (STANIER et alii, 1986; SIGEE, 1993), mesmo porque poderia haver interpretaes errneas do que crescimento e do que acmulo. Imaginando-se um frasco de Erlenmeyer, por exemplo, que contenha uma cultura bacteriana em ativa fase de crescimento, cada mililitro deste caldo de cultura deve conter milhes de clulas da bactria. Nem todas, obviamente, esto viveis, fazendo-se aqui necessrio diferenciar de modo muito claro o que contagem de clulas totais e contagem de clulas viveis. O nmero de clulas viveis presentes em um suspenso tem sido genericamente denominado u.f.c. ("unidades formadoras de colnias"), sendo a sigla equivalente em ingls c.f.u. ("colony forming units"). UFC (unidade formadora de colnia) usado quase como sinnimo de clula vivel. Os mtodos de contagem de colnias em placas ancoram-se no princpio que, sendo a diluio e o semeio em placas bem feitos, cada colnia surgida considerada originria de uma nica clula vivel (viva e, se fitopatognica, potencialmente capaz de infectar o hospedeiro e causar infeco). O nmero de clulas totais (somatrio de viveis mais no viveis) pode ser estimado, numa suspenso, por meio de diferentes mtodos, todos eles envolvendo contagem e ele , no mximo igual, e quase sempre maior, que o de clulas viveis (Fig. 1).

NMERO DE CLULAS

TOTAIS

VIVEIS (u.f.c.)
TEMPO

Figura 1: Clulas viveis (______) e totais (..........) numa cultura bacteriana, em funo do tempo A quantificao de UFC necessariamente envolve o preparo, com toda assepsia, de uma suspenso de clulas bacterianas, que a seguir sofre diluies em srie e uma alquota de cada diluio semeada em placa. Aps a incubao, conta-se o nmero de colnias, sempre assumindo-se ser cada colnia originria de uma nica clula. Existem diferentes metodologias para a estimativa do nmero de UFC numa suspenso de clulas bacterianas. Atualmente, a tcnica genericamente denominada de microgota tem sido extensivamente usada por permitir enorme economia de tempo, de
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material, assim como por tornar possvel a realizao concomitante de um grande nmero de repeties. A estimativa do nmero de clulas viveis (UFC) em uma suspenso bacteriana de grande importncia em bacteriologia, por exemplo, para se ajustar a concentrao de inculo antes de inoculaes, para quantificar patgenos bacterianos em lotes de sementes, em solo, em rizoplano e em filoplano, para estudos de sobrevivncia, epidemiologia, para investigar a efetividade de produtos qumicos em teste para controle, etc.

OBSERVAO IMPORTANTE Bactrias multiplicam-se muito rapidamente e as fitopatognicas, por exemplo, tm um perodo de gerao variando de 40 a 90 minutos. Isso significa que, havendo demora para preparo das suspenses, leituras, etc., a populao pode dobrar e ser cometido um erro de at 50% ou maior. Assim, para realizar esse tipo de trabalho, deve-se operar com todos os recipientes, solues, reagentes, culturas e suspenses de clulas resfriadas previamente, em geladeira, a 4oC.

PREPARO DA SUSPENSO BACTERIANA A bactria em estudo deve ser cultivada em um meio que no favorea a excessiva formao de material capsular, pois os glumos resultantes da aglomerao de clulas podem interferir na contagem. Para minimizar esse tipo de problema, pode-se, por exemplo, substituir a fonte de carbono do meio de cultura. No caso do meio 523 (KADO & HESKET, 1970) rotineiramente utilizado no Laboratrio de Bacteriologia de Plantas da UFV, a sacarose substituda por glicose uma vez que o primeiro acar estimula intensa formao de cpsula na clula bacteriana (SILVA, 1996). Deve-se, ainda, suspender o crescimento bacteriano em soluo salina contendo 0,3-0,5% de Tween 80 para promover a disperso das clulas, no momento de se efetuarem as diluies.

DILUIO DA SUSPENSO BACTERIANA A suspenso bacteriana deve sofrer uma diluio serial de 1:10 em soluo salina (0,85% NaCl) estril. Para isso podem-se utilizar tubos de ensaio ou ento tubos de Eppendorf. Os tubos de ensaio devem conter 9,0 ml de soluo salina contendo 0,3 a 0,5% de Tween 80. soluo salina do tubo de ensaio adicionar-se- 1,0 ml da suspenso bacteriana, sucessivamente at a diluio 1,0 x 10-10. Quando se deseja maior preciso, as diluies podem ser de 1:5 ou, at mesmo, de 1:2. Os tubos de Eppendorf podem substituir os tubos de ensaio de vidro na diluio serial, desde que previamente esterilizados (autoclavagem, calor seco ou microondas) e recebem 0,9 ml de soluo salina estril contendo 0,3 a 0,5% de Tween 80. A srie de diluio feita adicionando-se ao primeiro tubo 0,1 ml da suspenso bacteriana, e procedendo-se diluio em srie.
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PREPARO DA PLACA DE CONTAGEM Verte-se em placas de Petri o meio na superfcie do qual sero depositadas as microgotas da suspenso bacteriana. A superfcie do meio deve estar seca o suficiente para que a microgota seja rapidamente absorvida mas que no impea o crescimento das colnias. Para isso, as placas devem ficar expostas, destampadas, a 37C , por 12 horas sob luz UV ou a 60C por 1 hora. Aps as placas atingirem a temperatura ambiente, as microgotas referentes a cada diluio so depositadas sobre a superfcie do meio. Devido ao formato convexo da gota, ocorre uma maior concentrao de clulas na periferia, o que poderia interferir na contagem devido coalescncia de colnias. Para evitar que isso acontea, aps serem depositadas todas as gotas em uma placa, fazem-se movimentos circulares suaves, com a placa tampada, sobre a superfcie na qual ela se encontra, de modo a espalhar a gota. Aps incubao faz-se a contagem propriamente dita.

CONTAGEM Examinando-se a placa sob binocular estereoscpica, podem-se observar pequenas colnias, que surgiro com maior ou menor tempo de incubao dependendo da bactria em estudo. Pode-se, com o auxlio de uma caneta de retroprojetor dividir a rea da microgota, sobre o vidro, em campos, de modo a facilitar a contagem das colnias. Deve-se acompanhar o crescimento das colnias at a obteno de nmero constante sem permitir a coalescncia entre elas. O nmero de colnias considerado ideal para a contagem situa-se entre 5 e 100 colnias por microgota, embora se possa fazer a contagem com relativa facilidade de at 300 colnias por microgota. O nmero final de colnias obtido pela mdia aritmtica das repeties. No Quadro 1 h um exemplo hipottico de contagem realizada. Considerando ambas diluies 10-5 103,75 + 11,25(10) = 216,25, em que 216,25/2 = 108,125. Corrigindo-se a diluio: 108,125 x 102 x 105 = 108,125 x 107 = =1,08 x 109 ufc/ml. Conclui-se pois que a suspenso original continha 1,08 x 109 ufc/ml. Quadro 1: Exemplo hipottico de dados de contagem do nmero de colnias em placas onde se realiza a tcnica de microgota, em que o smbolo () representa um nmero grande demais de colnias para ser contado. DILUIO REALIZADA 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 REPETIO (R) R2 R3 104 9 99 11 MDIA ESTIMADA 103,75 11,25

112 10

100 15

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VANTAGENS E DESVANTAGENS DA CONTAGEM EM MICROGOTA 1. A contagem em microgota otimiza a utilizao de material, principalmente meio de cultura e placas de Petri. Enquanto a contagem na superfcie do meio requer 1 placa para cada repetio de cada diluio, em microgota uma placa pode suportar at 12 microgotas, sejam elas todas repetio de uma mesma diluio ou no (Figura 2). Caso fosse utilizado um dos outros dois mtodos de contagem, seriam necessrias 12 placas ao invs de 1.

Figura 2. Exemplo de como podem ser dispostas as microgotas em uma placa de Petri, para se terem 4 repeties de cada diluio. 2. Os riscos de contaminao so minimizados pois o nmero de operaes envolvidas menor. No h necessidade, por exemplo, de se espalhar a gota na superfcie do meio com o auxlio de uma esptula de Drigalski, nem de placas serem abertas e fechadas muitas vezes. 3. H necessidade de apenas uma pipeta bem calibrada para a coleta das alquotas de 10 l que formaro as microgotas. 4. Como se trabalham com volumes muitos pequenos, deve-se atentar para uma perfeita homogeneizao das suspenses bacterianas.

CORRELAO ENTRE CLULAS VIVEIS E CLULAS TOTAIS NUMA SUSPENSO BACTERIANA Geralmente de interesse do pesquisador estabelecer algum tipo de correlao, preferencialmente matemtica, entre o nmero de clulas viveis e o nmero de clulas totais numa suspenso bacteriana. Isto porque invivel realizar uma contagem em placas, seja pelo mtodo tradicional, seja pela tcnica de microgotas, todas as vezes que se tenciona ajustar a concentrao de inculo de uma suspenso bacteriana.
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DILUIO 1:2

. . .

DENSIDADE TICA
DE CLULAS
SUSPENSO

.. .
DILUIO 1:10

. . .

U.F.C.

Figura 3: Esquema explicativo do processamento das duas sries distintas de diluies H vrias maneiras de se fazer isso, uma das mais simples aquela em que se prepara, asseticamente, uma suspenso de clulas bacterianas a partir de cultura em fase logartmica de crescimento e se procedem a duas sries de diluies que so, respectivamente, semeadas em placa e submetidas a estimativa de turbidez (Fig. 3). Os dados so ento analisados estatisticamente, por meio de regresso linear, quando se consegue estabelecer uma correlao matemtica entre turbidez (medida indireta do nmero de clulas totais) e u.f.c. (Fig. 4).

D E N S ID A D E T IC A (5 4 0 n m )

1 ,0 0 0 ,9 0 0 ,8 0 0 ,7 0 0 ,6 0 0 ,5 0 0 ,4 0 0 ,3 0 0 ,2 0 0 ,1 0 0 ,0 0 5 ,0 .1 0 8 1 ,0 .1 0 9 1 ,5 .1 0 9 2 ,0 .1 0 9

C F.

/m

l=

(O

40

, -0

01

0/1 3)

10

0,

99

98

U .F .C . / m l

Figura 4: Correlao entre turbidez (OD540) e nmero de clulas viveis (U.F.C.) em uma suspenso preparada em salina a partir de cultura de Agrobacterium tumefaciens, com 24 horas de idade. Adaptado de NAPOLEO (1996) Contudo, algumas observaes e condies se fazem necessrias para que estimativas de um parmetro em funo do outro se revistam de validade cientfica.
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A correlao s vlida se se trabalha com culturas na fase exponencial de crescimento, quando o nmero de clulas viveis e de clulas totais aproximadamente o mesmo. A validade tambm s pode ser aceita e precisa se todas as condies so mantidas inalteradas - temperatura e tempo de incubao, isolamento, meio de cultura, aerao, comprimento de onda para leitura, etc. Obtida a equao de regresso e todas as condies permanecendo constantes, basta ler a densidade tica da suspenso e calcular, usando a equao, o nmero de clulas viveis e, a partir da, fazer as diluies necessrias para ajuste da concentrao de inculo, sempre que necessrio. Como os espectrofotmetros comuns no detectam baixas intensidades de turbidez em suspenses, a srie de diluies para leitura de absorbncia deve ser feita com fator 1:2 ao passo que a srie para semeio em placa pode ser 1:10 ou 1:5.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICA GUIMARES, W.V. 1995. Curva de Crescimento de E. coli. Roteiro de aula prtica do Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Viosa. 2p. NAPOLEO, R. L. Avaliao de antagonistas a Agrobacterium tumefaciens isolados de rizosfera, de rizoplano e de tumores de roseira. Imprensa Universitria-UFV. 1996. 61p (Tese de MS) SIGEE, D. C. Bacterial Plant pathology. Cambridge University Press. Cambridge. 1993. 325p. SILVA, D. O. Universidade Federal de Viosa. Departamento de Microbiologia. 36.571.000 Viosa, Minas Gerais. Brasil. (Comunicao Pessoal). 1996 STANIER, R. Y., INGRAHAM, J. L., WHEELIS, M. L., PAINTER, P. R. 1986. The Microbial World. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. 689p. WINKLER,U., RUGER, W., WACKERNAGEL, W. Bacterial, Phage and Molecular Genetics. An Experimental Course. Spring-Verlay Berlin Heidelberg. New York. 1976. 240p.

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