UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA XOCHIMILCO Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud Tronco Divisional Procesos Celulares Fundamentales Grupo: BB-51

Investigacin modular

Identificacin de Enterobacterias en comida rpida de la ciudad de Mxico

ngel Castillo-Villa1; Ivn L. Tinajero-Lira2; Omar O. Villegas-Villegas3; Sarvia B. Cassina-Magalln4
1Estudiantes de las licenciaturas en 1Agronoma, 2, 3 Qumica Farmacutica Biolgica, Medicina Veterinaria Y Zootecnia de la Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco. 2 3 4

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Resumen
Enterobacterias son un gnero de bacilos gramnegativos no esporulados, que tienen como habitad natural el intestino del hombre, as como tambin en plantas y diversos vegetales, de las cuales las de mayor importancia medica son: Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morgnella, Providencia, Citobacter, Edwardsiella, Cedacea, Kluyvera, y Rahnella. Existen diversos medios de cultivo para enterobacterias dentro de los cuales los ms destacados son los simples, diferenciadores, selectivos y enriquecidos. Las pruebas bioqumicas ms utilizadas para identificar gnero y especie de enterobacterias son: produccin de indol, prueba de rojo de metilo, Voges-Proskauer, utilizacin de citrato de sodio, produccin de acido sulfhdrico, hidrlisis de la urea, produccin de enzimas, pruebas de movilidad, hidrlisis de la gelatina, y fermentacin de azucares, algunas enterobacterias producen antgenos O, H, K y antgenos de pilis , sus factores de virulencia pueden ser las endotoxinas, las capsulas, la variacin antignica, las exotoxinas, los factores de adherencia, la localizacin intracelular y las bacteriocinas. El objetivo por el cual se realizo esta investigacin, fue para estudiar si realmente la comida que se analizo est contaminada con algn tipo de enterobacterias patgenas, evidentemente se pretendi desde el inicio saber qu tipo de enterobacterias son las que se encuentran en la comida analizada. Se planteo desde el inicio que el segundo puesto de comida de donde se compro la muestra numero 2 sera el ms contaminado, a diferencia del primer puesto de comida de donde se obtuvo la muestra numero 1, adems se planteo que las enterobacterias que habitan en los alimentos que se venden en la va pblica de la ciudad de Mxico, son patgenas para el ser humano. Se utilizaron 2 tortas cubanas compradas en dos tiendas de comida diferentes como muestra, en total se necesitaron 4 das para llevar a cabo esta investigacin. En el da uno se realizaron cultivos con las respectivas muestras, en el da dos se

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realizaron resiembras de los cultivos heterogneos para obtener cultivos puros, en el da tres se llevaron a cabo las siembras de cultivos puros en los juegos de pruebas bioqumicas para enterobacterias, y en el da cuatro se realizo la lectura de las pruebas bioqumicas para identificar genero y especie de enterobacterias. Mediante la lectura de las pruebas bioqumicas, basndose en algunas reacciones clave, en tablas obtenidas de Koneman y col. 2008, y mediante la metodologa utilizada en el laboratorio. Se logro aislar en las muestras analizadas enterobacterias como: Shigella, providencia, y Shigella sonnei. Debido a los resultados y de acuerdo a las hiptesis planteadas, se llego a concluir que efectivamente la muestra numero 2 fue la ms contaminada de las dos muestras analizadas. La nica diferencia fue que no se logro aislar de las muestras, la cantidad necesaria de bacterias para causar alguna infeccin sistmica, o de alguna otra clase.

Abstract
Enterobacteriaceae are a genus of gram-negative bacilli not sporulated, whose natural habitat, the intestine of man, as well as in plants and various vegetables, of which the most important medicines are: Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morgnella, Providence, Citobacter, Edwardsiella, Cedacea, Kluyvera, and Rahnella. Various culture media for Enterobacteriaceae in which the highlights are the simple, differentiating, selective and enriched. The most commonly used biochemical tests to identify the genus and species of Enterobacteriaceae are: production of indole, methyl red test, Voges-Proskauer, sodium citrate utilization, hydrogen sulphide production, urea hydrolysis, enzyme production, testingmobility, gelatin hydrolysis, and fermentation of sugars, some enterobacteria produce antigens O, H, K and pilis antigens, their virulence factors may be the endotoxins, the capsules, antigenic variation, exotoxins, adherence factors, intracellular localization and bacteriocins. The purpose for which was conducted this investigation was to study whether the food that was analyzed is contaminated with some kind of pathogenic enterobacteria, evidently intended from the start what type of enterobacteria are found in food analysis. It is stated from the outset that the second food Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 3

stand where you bought the sample number 2 would be the most polluted, unlike the first food stand where the sample is number 1, also argue that the enterobacteria are living in Food sold on the streets of Mexico City, are pathogenic to humans.We used 2 "Cuban cake" bought in two different grocery stores and shows, in total it took 4 days to carry out this research. On day one were cultured with the respective samples on day two were heterogeneous replanting of crops to obtain pure cultures on day three were performed sowing of pure cultures in the games of biochemical tests for Enterobacteriaceae, and on day four readings were made by biochemical tests to identify genus and species of Enterobacteriaceae. By reading the biochemical tests, based on some key reactions in tables obtained from Koneman et al. 2008, and by the methodology used in the laboratory. Was isolated in samples enterobacteria such as Shigella, providence, and Shigella sonnei. Because of the results and according to the hypotheses, it was concluded that indeed the sample number 2 was the most polluted in the two samples. The only difference was that it was isolated from the samples, the amount of bacteria needed to cause systemic infection, or any other class.

Introduccin Las Enterobacterias o Enterobacteriaceae son un grupo muy diverso de bacilos o bacterias gramnegativos, que tienen como habitad natural el intestino del hombre y varias especies animales (hospederos), se les ha encontrado en insectos y algunos son patgenos de plantas. Todas estas forman una familia taxonmica que ha sido estudiada y clasificada por Ewing y Edward, ampliada por Brenner y col., La familia Enterobacteriaceae est formada por aproximadamente 31 gneros y 139 especies y miles de serotipos (Brock 2008). Algunos miembros de la familia siempre se asocian a enfermedades cuando se aslan en el hombre, por ejemplo: Shigella, Salmonella, Yersinia pestis. Mientras que otros son miembros
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de la flora normal que producen infecciones oportunistas, por ejemplo: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, proteus mirrabilis (Romero 2007). Las enterobacterias son causantes de un gran nmero de enfermedades infecciosas en el humano, entre las ms comunes se encuentran los sndromes diarreicos y disentricos (Murray 2006), causados por cepas de E. coli, Salmonella y Shigella, la fiebre tifoidea, causada por especies de Salmonella. Se tiene casos de neumona causados por Klebsiella pneumoniae, especies del proteus, E. coli y varios miembros del grupo Klebsiella enterobacter se aslan de heridas traumticas, contaminadas con tierra o material vegetal o de incisiones abdominales despus de una ciruga. El shock endotxico es una manifestacin potencialmente letal de la infeccin por enterobacterias (Romero 2007, Daz y col. 2008, Davey 1985). Los alimentos tambin se pueden vender en las calles, en ferias, o en acontecimientos deportivos o culturales. Los alimentos que se venden en las calles, preparados en pequea escala, son cosas corrientes en los pases no industrializados, especialmente en los centros urbanos. Pueden ser preparados en el punto de venta o bajo techado y ser llevados al punto de venta en carros (Bryan 1993).

Los alimentos contienen microorganismos caractersticos de los ingredientes de los productos y de los tratamientos a los cuales han sido sometidos (Davey 1985). La microflora existente en la superficie de los alimentos, las poblaciones microbianas existentes en los alimentos rara vez es esttica (Mossel y Moreno 2003).
Serratia Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 5

Es un gnero de bacteria gramnegativa, anaerobio facultativo, basiliforme de la familia Enterobacteriaceae. La especie ms comn en el gnero, la Serratia marcescens, es normalmente el nico patgeno y usualmente causa infeccin nosocomial (Kagan y col 2002, Weiss 2006). Sin embargo, raramente cepas de Serratia plymuthica, Serratia liquefaciens, Serratia rubidaea, y Serratia odoriferae han causado enfermedad por medio de infeccin.[ Los miembros de este gnero producen un pigmento rojo caracterstico, la prodigiosina, y puede ser distinguidas de los otros miembros de la familia Enterobacteriaceae por su nica produccin de tres enzimas: DNasa, lipasa, y gelatinasa (Daz y col. 2008, Turbyfill y Oaks 1990). Las especies de Serratia tienden a colonizar los tractos respiratorios y urinarios, y el tracto gastrointestinal en adultos (Navarro y col. 2010). La infeccin por Serratia es responsable del 2% de las infecciones nosocomiales del torrente sanguneo, tracto respiratorio inferior, vas urinarias, heridas quirurgicas, piel y tejidos blancos en pacientes adultos. Brotes de meningitis por S. marcescens, infeccin de heridas, y artritis han sucedido en pabellones de pediatra (Terajima y col. 2003). Todas las bacterias del gnero Serratia presentan resistencia a muchos antibiticos a causa de la presencia de factores R, los cuales son una tipo de plsmido que codifica enzimas de resistencia a antibiticos. El ms importante de estos es el SmaI. Por ello, esta bacteria presenta una resistencia primaria a todas las penicilinas, a las cefalosporinas y a la polimixina (Alvarado y col. 2005). El tratamiento para infecciones leves puede realizarse con trimetoprim, sulfamidas o fluoroquinolona. Para infecciones ms graves, se utilizan fluoroquinolonas (ciprofloxacino, levofloxacino), carbapenemes (ertapenem, imipenem, meropenem), o ms frecuentemente cefalosporinas de tercera generacin,

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generalmente asociado a un aminoglucsido (gentamicina) (Murray 2006, Brock 2008, Romero 2007).

Escherichia coli
La Escherichia coli (tambin conocida por la abreviacin de su nombre, E. coli) es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras (Koneman y col. 2008, Eneca y Bergendal 1955) Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacterilogo alemn, quien la denomin Bacterium coli. Posteriormente la taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor (Romero 2007). sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa (Romero 2007, Murray 2006, Brock 2008, Koneman y col. 2008). En su hbitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamferos sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere elementos genticos que codifican factores virulentos, la bacteria acta como un comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando as a la absorcin de nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal de un neonato adhirindose a las mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas despus de la primera comida (Nature 2003). Puede causar infecciones intestinales y extraintestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato

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excretor, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumona (ICMF 2001). Est dividida por sus propiedades virulentas, pudiendo causar diarrea en humanos y otros animales. Otras cepas causan diarreas hemorrgicas por virtud de su agresividad, patogenicidad y toxicidad. En muchos pases ya hubo casos de muerte con esta bacteria. Generalmente les pasa a nios entre 1 ao y 8 aos, causado generalmente por la contaminacin de alimentos, y por la mala coccin de los mismos, es decir, a temperaturas internas y externas menores de 70 C (Mossel y Moreno 2003, Bryan 1993).
Proteus

Proteus es un gnero de bacterias gramnegativas, que incluye patgenos responsables de muchas infecciones del tracto urinario. Las especies de Proteus normalmente no fermentan lactosa por razn de tener una galactosidasa, pero algunas se han mostrado capaces de hacerlo. Son oxidasa-negativas y ureasapositivas. Algunas especies son mtiles. Tienden a ser organismos pleomrficos, no esporulados ni capsulados y son productoras de fenilalanina desaminasa. Con la excepcin de P. mirabilis, todos los Proteus reaccionan positivos con la prueba del indol. Es un gnero de bacterias ubicuas, residentes del tracto intestinal del hombre y algunos animales (Eneca y Bergendal 1955). Crecen en medios corrientes y moderadamente selectivos a temperatura corporal de 37C. Crecen formando capas diseminadas por virtud de su gran motilidad. Existen variantes inmviles que forman colonias lisas. La estructura antignica est compuesta por antgeno somtico O, flagelar H y superficial K. El antgeno flagelar H contribuye a la capacidad invasora de las vas urinarias. La variante X del antgeno somtico O est presente en algunas cepas de P. mirabilis. Otros grupos antignicos definidos son el OX2, OX19 y OXK. El grupo OX19 (y a veces
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el grupo OX2) da reacciones cruzadas (aglutinacin) en pacientes con Rickettsia prowazekii y sa es la base de la prueba de Weil Flix (Yvette y col. 2002).

Salmonella
Este gnero est formado por un grupo integrado por ms de 2 000 serotipos que colonizan el intestino del hombre y de varias especies animales. La especie tipo de infecciones humanas es Salmonella typhi, otras especies Salmonella enteritidis con varios serotipos y Salmonella cholerae-suis (Eneca y Bergendal 1955). Las salmonelosis en el hombre se manifiestan por 3 tipos de cuadros clnicos: fiebres entricas (fiebre tifoidea y paratifoidea), enteritis y septicemias (Murray 2006 y Romero 2007). Las enteritis son los cuadros ms benignos, se manifiestan por diarrea severa que generalmente se autolimita en menos de una semana. La fiebre tifoidea es un padecimiento que puede manifestarse en forma benigna o en forma grave sobre todo cuando se presentan complicaciones como son: perforacin intestinal, hemorragia, colecistitis o abscesos en diferentes rganos. Las paratifoideas son cuadros generalmente benignos y rara vez se manifiestan complicaciones (Martnez y col 2007, Urbanova 1999). La fiebre tifoidea es un padecimiento que se encuentra en todas las latitudes en todos los pases del mundo. Es ms frecuente en los pases en vas de desarrollo,
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en donde se encuentra en forma endmica con brotes epidmicos. La mayor incidencia se encuentra en la edad escolar, es poco frecuente antes de los siete aos de edad (Turbyfill y Oaks 1990). Los portadores crnicos, sobre todo si manejan alimentos, son los responsables de las epidemias o de los casos aislados, ya que pueden excretar 1010 por gramo de materias fecales de salmonellas. Este padecimiento tiene una tendencia estacional, generalmente lo vamos a encontrar con mayor frecuencia durante el verano y el otoo ya que son las estaciones ms calurosas, y la ingestin de agua contaminada es una de las fuentes de infeccin (Romero 2007, Koneman y col 2008).

Shigella
El gnero Shigella est formado por varias especies de las cuales cuatro se han encontrado con mayor frecuencia en las infecciones humanas: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei (Romero 2007, Koneman y col 2008, Murray 2006, Nature 2003). Al padecimiento, la shigelosis, se le conoce como disentera bacilar, que se manifiesta con fiebre, diarrea primero y despus pseudodiarrea con tenesmo rectal. Tambin se observan las formas hiperagudas que son las formas ms graves con deshidratacin y desequilibrio electroltico y las formas atenuadas, generalmente muy benignas, autolimitantes, sin complicaciones (Romero 2007). Los bacilos producen pequeos abscesos a nivel de colon y particularmente en el asa sigmoides que despus evolucionan a la formacin de ulceras. Este padecimiento se encuentra en todos los pases, pero sobre todo en aquellos de
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escasos recursos, en donde encontramos la infeccin en forma endmica. El pico de la prevalencia es la edad escolar, los nios se infectan por agua o alimentos contaminados por portadores que puedan eliminar hasta 108 por g de materias fecales, en nuestro medio la venta de frutas preparadas o aguas frescas en las puertas de las escuelas es una costumbre que favorece mucho estas infecciones, los portadores eliminan el bacilo durante varios meses despus del padecimiento o bien las personas infectadas que tienen cuadros atenuados o infeccione asintomtica. El nmero de casos es muy reducido en los pases con sistema eficiente de potabilizacin del agua para beber y donde sus habitantes observan una higiene aceptable (Koneman y col 2008, Romero 2007). El diagnostico se hace, adems de cuadro clnico por la identificacin de las especies en el coprocultivo. Debido a que casi nunca coloniza tejidos extraintestinales, solo las muestras de materias fecales son de utilidad. Los factores de patogenicidad son: una endotoxina, la invasividad y una exotoxina (Rivera y col. 2010). Caractersticas de enterobacterias las pruebas de identificacin presuntiva de

En general existen tres tipos de medios para el aislamiento de bacterias: los primeros permiten el crecimiento de cualquier microorganismo y se utilizan generalmente para un aislamiento primario. Los segundos como su nombre lo indica sirven para el crecimiento selectivo de uno o varios tipos de bateras. Los de enriquecimiento contienen suplementos que permiten aumentar el nmero de un tipo de bacterias e inhibir el crecimiento de otras. Para recuperar las bacterias de inters a partir de una muestra que puede contener una mezcla de microorganismos, deben utilizarse medios de cultivo selectivos. Se debe conocer la composicin de cada formula. La concentracin relativa y el propsito de cada
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compuesto que se incluye. Por ejemplo, el agar Salmonella-Shigella (SS); contiene alrededor de cinco veces la concentracin de sales biliares del agar MacConkey por lo que es ms inhibitorio para E. coli y ms selectivo para la recuperacin de especies de Salmonella (Rivera y col. 2010). Se dispone de tres tipos generales de medios para la recuperacin de enterobacterias a partir de muestras que potencialmente alojan mezclas de bacterias. Medio no selectivo para aislamiento primario (por ejemplo, agar sangre). Agar selectivo y diferencial (por ejemplo, agar MacConkey y agar salmonella-Shigella). Caldos de enriquecimiento (por ejemplo: caldo selenito) (Rivera y col. 2010). Medios de aislamiento selectivos para enterobacterias En 1905 MacConkey descubri por primera vez un medio diferencial selectivo (agar rojo neutro-sales biliares) que utilizo para aislar bacilos entricos gramnegativos de muestras que contenan muestras de especies bacterianas. Incorporo lactosa y el indicador rojo neutro en este medio con el fin de proporcionar el medio visual para detectar la utilizacin de lactosa por el microorganismo de prueba. En ese momento, todos los bacilos gramnegativos no esporulados se denominaban aun microorganismos entricos; sin embargo, los microbilogos avan reconocido que algunas especies eran mas patgenas para el ser humano que otras. Los patrones de utilizacin de hidratos de carbono de varias especies de bacterias ya se conocan a principios del siglo xx y la fermentacin de lactosa, en particular, fue reconocida como un marcador importante para diferenciar ciertos patgenos entricos. Holt-Harris y Teague, descubrieron en 1916 un medio con eosina y azul de metileno como indicadores para diferenciar entre colonias fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. Se incluyo en el medio sacarosa para detectar a los grupos del grupo
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coliforme que fermentan la sacarosa ms fcilmente que la lactosa (Romero 2007, Koneman y col 2008). Los agares MacConkey y eosina-azul de metileno, son solo moderadamente inhibidores y estn ideados para evitar el crecimiento de las bacterias grampositivas en los cultivos mixtos. Se inhiben tambin muchas especies de microorganismos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales, sin embargo, todas las enterobacterias crecen bien. Hace poco, los investigadores del Becton-Dickinson crearon una nueva formula de agar MacConkey, MacConkey 3, para mejorar la recuperacin de enterobacterias sensibles al CO2. En un estudio se demostr que el medio de MacCkonkey 3 proporciona una mejor recuperacin y un mayor tamao de colonias, tanto cuando se incuban con aire como con dixido de carbono en comparacin con el agar MacConkey; contiene rojo neutro como indicador de potencial de hidrogeno y en consecuencia, las colonias metabolisadoras de lactosa aparecen rosadas por la produccin de cidos mixtos. Las bacterias productoras de cidos fuertes como E. coli, forman colonias rojo profundo con un precipitado rosado difuso en el agar que rodea las colonias causado por la precipitacin de las sales biliares en el medio que ocurre con un potencial de hidrogeno bajo. Las bacterias que producen cidos mas dbiles forman colonias rosa claro o colonias que son mas claras en la periferia y que tienen centros rosados, y el agar que rodea las colonias se mantiene claro. La aparicin del brillo, causado por la precipitacin del colorante en las colonias es muy sugestiva de E. coli, aunque otros productores de cidos fuertes, como Yersinia enterolityca, pueden tener un aspecto similar (Koneman y col 2008). Agar EMB: Es un medio diferencial para el aislamiento y deteccin de enterobacterias o de bacilos coliformes. Contiene colorantes analticos (eosina y azul de metileno), que inhiben a las bacterias grampositivas y
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a las

gramnegativas exigentes. Estos colorantes se combinan para formar un

precipitado a un pH acido y de ese modo sirven adems como indicadores de la produccin de cido. El medio puede contener solo lactosa como fuente de carbono y da reacciones ms en paralelo al agar MacConkey, pero tambin puede estar adicionado con sacarosa y nctar fermentadores de sacarosa. Las colonias de bacterias fuertemente fermentadoras de lactosa como E. coli, se ven de un color negro verdoso o con brillo metlico. Las fermentadoras dbiles como Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Hafnia. Producen colonias purpura. Las no fermentadoras que incluyen Proteus, Salmonella y Shigella, producen colonias transparentes (Rivera y col 2010). Medios de aislamiento altamente selectivos para enterobacterias Los medios se hacen altamente selectivos al agregar sustancias inhibidoras en concentraciones mas altas que en agar MacConkey o EMB. Estos medios son utilizados primariamente para inhibir el crecimiento de E. coli y otros coliformes, pero permiten el crecimiento de especies de salmonella y Shigella. Los mas comnmente usados son el agar salmonella-Shigella (SS). El agar xilosa-lisinadesxicolato (XLD) y el agar Hektoen entrico (HE). La decisin respecto de cual de estos medios utilizar para el aislamiento de patgenos entricos depende de la preferencial personal y de las especies que van a ser seleccionadas. A continuacin se describen stos medios (Rivera y col. 2010). Agar SS: Es un medio altamente selectivo formulado para inhibir el crecimiento de la mayora de las bacterias coliformes y permitir el desarrollo de salmonella y Shigella. Contiene altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio que inhiben a todas las bacterias grampositivas y muchas gramnegativas incluyendo las coliformes. La lactosa es la nica fuente de carbono y el rojo neutro es el indicador para la deteccin de cido. Presenta Tiosulfato de sodio como fuente de azufre, cualquier bacteria que produce un
H2S se detecta por un precipitado Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 14

negro formado con citrato frrico. Las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color rojo, como cepas poco frecuentes de salmonella arizone. Las colonias de salmonella aparecen sin color con centro negro, debido a la produccin de H2S. Las especies de Shigella muestran colonias sin color y sin ennegrecimiento (Koneman y col. 2008, Rivera y col. 2010). Agar HE: Incrementa el rendimiento de especies de Salmonella o Shigella a partir de flora normal numerosa, contiene alta concentracin de sales biliares que inhiben el crecimiento de todas las bacterias grampositivas y retarda el de muchas cepas coliformes. Las bacterias producen cidos a partir de lactosa y sacarosa, y la fucsina cida al reaccionar con azul de timol, produce un color amarillo a pH bajo. Contiene Tiosulfato de sodio como fuente de azufre y la produccin de H2S se detecta mediante citrato frrico de amonio. Las bacterias fermentadoras rapidas de lactosa. Como E. coli, son inhibidoras moderadamente y producen colonias naranja brillantes a rosado salmn. Las colonias de Salmonella son azulVerdosas con centros de H2S. Shigella parecen ms verde que Salmonella y las colonias palidecen hacia la periferia. Las cepas de Proteus son inhibidas en cierta forma y las colonias que desarrollan son pequeas y transparentes (Rivera y col. 2010). Agar XLD: Es un medio inhibidor de bacilos coliformes que el agar HE y fue diseado para detectar Shigella en heces despus del enriquecimiento en caldo para gramnegativos. Contiene sales biliares en concentracin relativamente baja que hace que el medio sea menos selectivo que el SS y que el HE. Contiene tres carbohidratos para la produccin de cidos y el indicador de pH es el rojo fenol. Las bacterias lisina positiva, como especies de Salmonella, producen colonias inicialmente amarillas por la utilizacin de xilosa y colonias rojas retardadas por la descarboxilacion de la lisina. La deteccin de H2S es similar al del agar HE. E
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coli. Especies de Klebsiella enterobacter y de proteus producen colonias amarillas. La mayora de las especies de salmonella producen colonias rojas con centros negros. Shigella, providencia y muchas especies de proteus no utilizan ningn carbohidrato y producen colonias transparentes. Las colonias de citobacter son amarillas con centro negro (Rivera y col. 2010). Medios de enriquecimiento para enterobacterias Estos medios se utilizan para favorecer el crecimiento de ciertas especies bacterianas al mismo tiempo que inhibe el desarrollo de microorganismos no deseados. Los caldos de enriquecimiento se emplean principalmente para la recuperacin de especies de salmonella y Shigella de muestras donde el nmero de bacterias se encuentran en un nmero relativamente bajo. Estos medios funcionan bajo el principio de que E. coli y otras bacterias gramnegativas se mantienen en una fase de retardo prolongado por los inhibidores qumicos presentes en el caldo. Las especies salmonella y Shigella se inhiben mucho menos, Entran en una fase exponencial de crecimiento y son recuperadas mucho ms rpido de las muestras. Sin embargo, despus de varias horas, el medio de enriquecimiento deja de suprimir el crecimiento de E. coli y otros ultima instancia sobrecrecen en el microorganismos entricos, los cuales en

cultivo por lo tanto, para la recuperacin de especies de salmonella y Shigella, se recomienda que el caldo de enriquecimiento se subcultive antes de las 8 horas. Los dos medios de enriquecimiento ms comunes son el caldo selenito y el caldo gramnegativo (GN) (Rivera y col. 2010, Koneman y col. 2008). Caldo selenito: Se recomienda para el aislamiento de salmonellas de muestras que tienen altas concentraciones de bacterias mixtas como heces, orina o aguas cloacales, que tienen altas concentraciones de bacterias mixtas. El selenito de sodio inhibe E. coli y otros bacilos coliformes, incluyendo muchas cepas de
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Shigella. El medio funciona mejor en condiciones anaerobias. Se recomienda el subcultivo dentro de las 8-12 horas en agar SS (Rivera y col. 2010). Caldo GN: Sirve para la recuperacin de especies de salmonella y Shigella cuando estn en bajo numero en las muestras fecales. Contienen baja concentracin de desoxicolato por lo que es menos inhibidor para e coli y otros coliformes. La mayora de las cepas de Shigella crecen bien. El desoxicolato y el citrato que contiene el caldo, son inhibidores de bacterias grampositivas. Contiene una concentracin elevada de manitol. Por lo que inhibe el crecimiento de proteus y a su vez apoya el crecimiento de salmonella y Shigella, ya que ambas son capaces de fermentar manitol. El caldo puede volverse turbio dentro de las 4-6 horas despus de la inoculacin. Se recomienda el subcultivo en agar HE o XLD dentro de este lapso (Koneman y col 2008, Rivera y col. 2010). Pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias A pesar de que los medios de aislamiento primarios se basan en reacciones bioqumicas que realizan las bacterias en el medio, se requiere de otros mtodos para la identificacin de la especie. Estos mtodos son las pruebas bioqumicas, que se basa en la determinacin de las caractersticas fenotpicas adicionales que reflejan el genotipo y por lo tanto, la identidad nica de los microorganismos que se analizan. Existen una gran cantidad de pruebas y numerosos esquemas disponibles para la identificacin final de especies de enterobacterias (Martnez y col. 2007, Rivera y col. 2010, Koneman y col. 2008). Las pruebas que generalmente se utilizan para identificar las caractersticas metablicas de las enterobacterias son: Utilizacin de carbohidratos: se determina el tipo de azucares que pueden fermentar las bacterias, normalmente se utiliza el agar hierro triple azcar (TSI) o medio Kliger. Produccin de
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catalasa: se detecta si la bacteria presenta la enzima catalasa, se requiere de perxido de hidrogeno Produccin indol: sirve para comprobar la presencia de la enzima triptofanasa, se utiliza el reactivo de kovac o el de Ehrlich. Rojo de metilo: identifica las especies de bacterias que producen cidos fuertes a partir de glucosa, se requiere del medio Voges-Proskauer/rojo de metilo (VP-RM) Prueba de Voges-Proskauer: mide la conversin de acetil-metil-carbonil o acetoina en diacetilo, se necesita el medio VP. Utilizacin de citrato: detecta la capacidad de un microorganismo para utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono, se requiere el medio citrato de Simmons Produccin de ureasa: determina si la bacteria produce la enzima ureasa. Se utiliza caldo de urea. Produccin de acido sulfurhdrico: se identifica si la bacteria es capaz de liberar azufre en forma de acido sulfurhdrico a partir de aminocidos que contienen azufre u otro compuesto que contenga azufre, esto se puede observar en el medio SIM o TSI. Movilidad: se determina si la bacteria presenta flagelos, se puede utilizar el medio SIM o MIO Actividad de o-nitrofenil--Dgalactopiranosido: con esta prueba se detecta la presencia de la enzima- galactosidasa, se conoce como prueba de ONPG. Descarboxilacion de lisina, ornitina y arginina: se utiliza para determinar si las bacterias contienen enzimas para descarboxilar aminocidos especficos, esto se observa con el caldo descarboxilar de Moeller. Produccin de fenilalanina desaminasa: se detecta la presencia de la enzima responsable de la desaminacion oxidativa de la fenilalanina, se utiliza el agar urea de Chistensen. Reduccin de nitratos: se comprueba si la bacteria puede reducir los nitratos en nitritos, se requiere el caldo nitrato o agar de nitrato (Rivera y col 2010, Koneman y Col. 2008). Prueba del rojo de metilo

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Las bacterias que siguen fundamentalmente la va de fermentacin acida mixta producen a menudo el acido suficiente como para mantener el pH por debajo de 4.4 (el valor critico de color de acido del indicador de rojo de metilo). La prueba del rojo de metilo proporciona una caracterstica til para identificar especias bacterianas que producen cidos fuertes a partir de glucosa. La prueba segn su descripcin original, requiere 48 a 72 hrs de incubacin antes de obtener un resultado valido, tiempo inaceptable para la mayora de los laboratorios de microbiologa. Se utiliza una muestra alcuota de 0.5ml de caldo con un inoculo relativamente importante del microorganismo de prueba. Se agregan 1 a 2 gotas de reactivo de rojo de metilo despus de 18-24 horas de incubacin a 35C y la aparicin del color rojo indica prueba positiva (Koneman y col. 2008).

Prueba de Voges-Proskauer Los detalles de la prueba se basan en la conversin del acetil metilcarbinol (acetoina) en diacetilo atraves de la accin de hidrxido de sodio y oxigeno diatomico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo bajo la accin cataltica de -naftol y creatina. Obsrvese que la formacin de acetoina y butilenglicol es una va alternativa para el metabolismo del acido pirvico. Las bacterias que utilizan esta va como ciertas cepas dentro del grupo Klebsiella enterobacter, SerratiaHafnia, producen solo pequeas cantidades de cidos mixtos que pueden ser insuficientes para descender el pH del medio de rojo de metilo lo suficiente como para producir un cambio de color. En consecuencia, la mayora de las especies de enterobacterias Voges-Proskauer positivas, con raras excepciones, son rojo de metilo negativas y viceversa (Koneman y col. 2008).
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 Produccin de indol El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. Las bacterias que tiene la enzima triptofanasa pueden catalizar el triptfano y producir as indol, acido pirvico y amoniaco. El indol puede detectarse en el medio de prueba del triptfano observado el desarrollo de un color rojo despus de agregar una solucin que contiene pdimetilaminobenzaleido (reactivo de Herlich o de kovac) (Koneman y col. 2008). La eleccin entre los reactivos de Herlich y de Kovac depende de la preferencia personal. El reactivo de Herlich es ms sensible y es el preferido cuando se devalan bacilos no fermentadores y anaerobios en los cuales la produccin de indol es mnima. Como el indol es soluble en compuestos orgnicos se debe agregar xileno o cloroformo al medio de prueba antes de agregar el reactivo de Herlich, este paso de extraccin es menos crtico para el reactivo de Kovac porque se utiliza alcohol amlico como diluyente (Koneman y col. 2008, Calzadilla 2003).

Utilizacin del citrato El principio de la prueba de utilizacin del citrato, es determinar la capacidad de un organismo para utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono para metabolismo y crecimiento. La formula original, descrita por koser en 1923, era un medio de caldo que contena fosfato amnico sdico, fosfato mono potsico, sulfuro de magnesio y citrato de sodio. Se omitieron las protenas y los hidratos de carbono como fuentes de carbono y nitrgeno. El parmetro de evaluacin de
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la prueba de joser era la presencia o ausencia de turbidez visible despus de la incubacin del microorganismo de prueba: este parmetro en realidad era una medida de la capacidad del microorganismo para utilizar carbono a partir del citrato de sodio para producir el crecimiento suficiente como para volverse visible. Sin embargo, pronto se reconoci que podra ocurrir una turbidez inespecfica en el medio de koser Simmons resolvi este problema agregando agar y azul de bromotimol a la formula de koser, lo que proporciono un parmetro de color mas sensible. Se vierte en un tubo de ensayo e inclina el medio de agar citrato de Simmons. Se siembra en estra un pequeo inoculo de una colonia de crecimiento del microorganismo de prueba en la superficie de la porcin inclinada de agar. Cuando el inoculo es demasiado grande., los compuestos orgnicos preformados dentro de las paredes celulares de las bacterias moribundas pueden liberar suficiente carbono y nitrgeno como para producir un resultado falso positivo en la prueba. Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo diferencial con un microorganismo desconocido, es importante sembrar en estra primero el medio de citrato para evitar el traspaso de protenas o hidratos de carbono desde los otros medios. La produccin de un color azul en el medio de prueba despus de 24 horas de incubacin a 35 grados indica la presencia de productos alcalinos y un resultado positivo en la prueba de utilizacin de citrato. Si se utiliza carbono del citrato de sodio, tambin se extrae hidrogeno del fosfato de amonio contenido en el medio y se libera amoniaco. En ocasiones, se detecta un crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra en estra antes de la conversin del medio a un color azul. Este crecimiento visible tambin indica un resultado positivo de la prueba (Koneman y col. 2008). Produccin de ureasa

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Los microorganismos que tienen la enzima ureasa hidrolizan la urea, liberan amoniaco y producen un cambio de color rojo rosado en el medio (Calzadilla 2003). Se deben sealar importantes diferencias entre el caldo de urea de Stuart y el agar, urea de chstense. El caldo de Stuart tiene muchos buffers de sales de fosfato y tienen un pH de 6,8. El microorganismo de prueba debe formar cantidades bastante grandes de amoniaco antes de que el sistema buffer se vea superado y el pH del medio se eleve por encima de 8.08 para producir un cambio de color en el indicador. Por lo tanto es un caldo casi selectivo para especies de Proteus. El agar urea de Chistensen tiene menos buffers que el caldo urea de Stuart y contiene peptonas y glucosa (Murcia 2004). Este medio enriquecido favorece el crecimiento de muchas especies de bacterias que no pueden desarrollarse en el caldo de Stuart y la menor capacidad de amortiguacin permite la deteccin de cantidades menores de amoniaco. Los microorganismos que producen menos urea como ciertas especies de Klebsiella, brucella y bordetella, pueden ser evaluados con agar urea de Chistensen para muchas de estas especies, una reaccin de urea positiva se detecta primero como un cambio de color rosa o rojo en la Procin inclinada del agar. El pico de flauta vira al principio al rojo por que la reaccin alcalina que resulta del desdoblamiento de pequeas cantidades de urea, aumenta por las aminas formadas por la descarboxilacion oxidativa de los aminocidos en la porcin expuesta al aire del medio (Koneman y col. 2008).

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 Produccin de sulfuro de hidrogeno La capacidad de ciertas especies bacterianas para liberar azufre de los aminocidos que contienen azufre u otros compuestos en forma de H2S es una caracterstica importante para su identificacin. Los medios mas utilizados para la deteccin de H2S y las fuentes de azufre y los indicadores de sulfuro y deteccin de H2S. Las diferencias para detectar la produccin de H2S en los diferentes medios son el resultado de una alteracin en una mas de estas condiciones. El
H2S detectado en un medio puede no ser detectado en otro, y es necesario

conocer el sistema de prueba utilizado cuando se interpretan protocolos de identificacin. El medio SIM es mas sensible que el KIA para la deteccin de H2S, debido talvez a la consistencia semislida de KIA, la ausencia de hidratos de carbono para suprimir la formacin de H2S y el uso de hierro peptonizado como indicador. Por otro lado, el KIA es ms sensible que el agar hierro triple azcar porque se cree que la sacarosa suprime los mecanismos enzimticos responsables de la produccin de H2S. El acetato de plomo es el indicador mas sensible y debe emplearse siempre que se evalen bacterias que producen solo pequeas cantidades de H2S. Lamentablemente, cuando se incorpora acetarto de plomo en medios de cultivo tambin inhiben el crecimiento de muchas bacterias con requerimientos nutricionales especiales, sobre todo las que pueden requerir un sistema de deteccin sensible. Estos microorganismos pueden se evaluados para la produccin de H2S colocando una tira de papel filtro impregnada en acetato de plomo debajo de la tapa de un tubo de cultivo con medio KIA. As, es posible utilizar la extrema sensibilidad del indicador de acetato de plomo sin incorporarlo en forma directa en el medio. Con todos los sistemas de deteccin de
H2S, el parmetro es un sulfuro insoluble de un metal pesado, que produce un

precipitado negro en el medio o en la tira de papel de filtro. Como debe haber iones hidrogeno disponibles para la formacin de H2S el emblanquecimiento se
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observa primero en los medios de prueba en los cuales la formacin de acido es mxima, es decir, a lo largo de la lnea de inoculacin, dentro de las profundidades de los medios de agar inclinado o en los centros de las colonias que crecen sobre las superficies de agar (Koneman y col. 2008). Motilidad La motilidad bacteriana es otro determinante importante para la identificacin final de una especie. Las bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo nmero y localizacin varan entre las especies. Existen tinciones flagelares para esta determinacin (Koneman y col. 2008). La motilidad bacteriana se puede observar colocando una gota de medio de caldo de cultivo en un portaobjetos microscpico y observndola directamente con un microscopio, existen cmaras colgantes para gotas donde es posible ver el preparado con mayor aumento sin el peligro de descender los ovejitos sobre la gota contaminada. Esta tcnica se utiliza sobre toso para detectar la motilidad de las especies de bacterias que no crecen bien en medios de agar semislido, sin embargo, las enterobacterias crecen bien y se utilizan mas comnmente tubos que contienen agar semislido (Koneman y col. 2008, Rivera 2010). Los medios para motilidad tienen concentraciones de agar de 0.4% o menores. Con concentraciones mayores, el gel es demasiado firme como para permitir que los microorganismos se dispersen con libertad. Los medios combinados, como el SIM o el agar MIO, tienen un uso amplio en los laboratorios de microbiologa clnica por que se tiende a medir ms de una caracterstica en el mismo tubo. Se debe interpretar primero la prueba de motilidad por que el agregado de un reactivo de indol puede oscurecer los resultados. Como el medio SIM y el agar MIO tienen un fondo ligeramente turbio, las interpretaciones pueden ser difciles con especies
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bacterianas que crecen lentamente en estos medios. En estos casos se recomienda un medio para prueba de motilidad, por que sostiene el crecimiento de la mayora de las bacterias con requerimientos nutricionales especiales y tiene un aspecto claro como el cristal la prueba de motilidad se interpreta haciendo un examen macroscpico del medio para una zona difusa de crecimiento que se propaga desde la lnea de inoculacin. Se han recomendado las sales de tetrazolio en un medio para motilidad como auxiliar para la detencin visual del crecimiento bacteriano. Estas sales son incoloras pero son convertidas en complejos de formazan rojo insolubles por las propiedades reductoras de las bacterias en crecimiento. En un medio de prueba para motilidad que contiene tetrazolio, la aparicin del color rojo ayuda a rastrear la propagacin de bacterias desde la lnea de inoculacin. Sin embargo, estas sales pueden inhibir ciertas bacterias con requerimientos nutricionales especiales y no se pueden utilizar en todos los cazos. Entre las enterobacterias, algunas especies de Shigella y Klebsiella son uniformemente inmviles. La mayora de las especies mviles de enterobacterias pueden detectarse a 35 grados centgrados; sin embargo, Yersinia, en el cual las protenas flagelares se desarrollan ms rpidamente a temperaturas inferiores, es mvil a 22 grados centgrados (temperatura ambiente) pero no a 35 grados centgrados. Listeria es otra especie bacteriana que requiere incubacin a temperatura ambiente antes de que desarrolla motilidad, las pseudomonas, un microorganismo que solo crece bien en presencia de oxigeno, produce una pelcula de propagacin sobre la superficie de agar para motilidad y no muestra la extensin en abanico caracterstica desde la lnea de inoculacin por que no crece en las porciones ms profundas deficientes de oxigeno del tubo (Koneman y col 2008, Rivera 2010). Uso del agar hierro triple azcar
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En la prctica, los microorganismos capaces de fermentare la glucosa se detectan observando las reacciones que producen cuando crecen en agar hierro triple azcar (TSI). Cuando un microorganismo no puede fermentar la lactosa, se observa una reaccin alcalina-inclinado-alcalina-inferior (sin cambios), lo que indica la ausencia de produccin de cido y la incapacidad del microorganismo de prueba para fermentar cualquier azcar presente. Esta sola razn es suficiente para excluir a un microorganismo de las enterobacterias. La formula del agar hierro triple azcar se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).

Tabla 1. Tabla de los reactivos qumicos de los que se compone el agar hierro triple azcar (TSI). Formula del agar hierro triple azcar Extracto de vacuno, 3g Extracto de levadura, 3g Peptona, 15g Peptona de proteosa, 5g Lactosa, 10g igualar 1L glucosa, 1g Sulfato ferroso, 0.2g Sacarosa, 10g pH final, 7.4 Cloruro de sodio, 5g Tiosulfato de sodio, 0.3g Agar, 12g Rojo fenol, 0.024g Agua destilada hasta

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En esta tabla se puede observar cualitativa y cuantitativamente que tipos de reactivos qumicos son con los que se prepara el agar hierro triple azcar (Koneman y col. 2008).

Son importantes varias observaciones cuando se estudian las formulas del agar hierro triple azcar. La incorporacin de cuatro derivados proteicos: extracto de carne de vaca, extracto de levadura, peptona y peptona proteosa enriquece mucho desde el punto de vista nutricional al agar hierro triple azcar. La ausencia de inhibidores permite el crecimiento de todas las especies de bacterias raras excepto aquellas con requerimientos nutricionales muy especiales (excluidas las anaerobias estrictas). Por lo tanto, solo pueden utilizarse cuando se evalan especies bacterianas seleccionadas a partir de una colonia nica recuperada en placas de agar primarias o selectivas. La glucosa, la lactosa y la sacarosa estn distribuidas de manera uniforme tanto en la porcin inclinada como en la porcin inferior (profunda) del tubo. Sin embargo, la lactosa est presente en una concentracin diez veces la de la glucosa, asimismo la relacin de la sacarosa con la glucosa es de 10:1. Esta relacin 10:1 es importante para comprender los principios bioqumicos que se explican mas adelante. El sulfato ferroso como detector de sulfuro de hidrogeno es algo menos sensible que otras sales frricas o ferrosas; por consiguiente debe haber discrepancias en las lecturas de sulfuro de hidrogeno entre el agar hierro triple azcar y otros medios de prueba. El indicador rojo fenol es amarillo por debajo de un pH de 6.8. Como el pH del medio uninoculado est amortiguado a un pH de 7,4, las cantidades relativamente pequeas de produccin de acido conducen a un cambio visible de color (Koneman y col. 2008). Juegos de pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias
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Un juego de bioqumicas consiste en: un tubo con medios semislidos de SIM de color mbar, dos tubos con caldo VP-RM de color mbar, un tubo con medio inclinado de citrato de Simmons de color verde, un tubo con medio inclinado de agar hierro triple azcar de color naranja y un tubo con caldo urea de color rosa plido. Uno de los juegos de bioqumicas corresponde a los controles negativos o testigos de las pruebas. Estos controles se preparan introduciendo el asa bacteriolgica estril y fra, sin una muestra. Incuba estos tubos sin sembrar junto con los tubos inoculados a 37 grados centgrados durante 24 horas (Rivera 2010). Como hacer las siembras en los juegos de bioqumicas Evidentemente para llevar acabo esta investigacin, se tuvo que conocer una metodologa para hacer los inculos correctamente en los juegos de pruebas bioqumicas, ya que de no hacerlos correctamente como se indican, se pudo haber conducido a esta investigacin a unos resultados no deseados (Rivera 2010, Koneman y col. 2008). Prueba Voges-Proskauer y Rojo de metilo Con el asa bacteriolgica se debe tomar un inoculo denso de un cultivo puro y resuspenderlo en ambos tubos (un inoculo por tubo a la vez), posteriormente dejar incubar los tubos a 36 grados centgrados por 24 horas (Koneman y col. 2008).

Citrato de Simmons Con el asa bacteriolgica se debe tomar un inoculo ligero del cultivo puro y sembrarlo en forma de una estra abierta sobre el rea inclinada del medio
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inclinado de citrato de Simmons. Es importante que no se puncione la capa profunda del medio puesto que sirve de control de color, posteriormente dejar incubar el tubo a 37 grados centgrados por 24 horas (Koneman y col. 2008). Indol Con el asa bacteriolgica recta, se debe colectar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y se debe sembrar por picadura en el medio SIM introduciendo dicho inoculo por el centro y a 3mm del fondo del tubo y extrae el asa siguiendo la estra formada al picar el medio. Posteriormente se debe incubar el tubo a 37 grados centgrados por 24 horas (Koneman y col. 2008). Caldo urea Con el asa bacteriolgica se debe colectar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y se debe sembrar en el caldo urea, posteriormente se debe dejar incubar el tubo a 37 grados centgrados (Koneman y col. 2008). Agar hierro triple azcar (TSI) Con el asa bacteriolgica recta, colecta un inoculo poco denso del cultivo de bacterias y se debe sembrar por picadura en el fondo y en forma de estra en la superficie. Posteriormente se debe incubar el tubo a 37 grados centgrados durante 24 horas (Koneman y col. 2008).

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 Planteamiento del Problema

En los distintos alimentos que consume el hombre diariamente existen grandes cantidades de enterobacterias, desde luego esto depende de que tipo de alimento estemos tratando, stas pueden ser patgenas, se sabe que todos los alimentos contienen una microflora normal en sus superficies y que los mismos pueden ser un foco de diversos microorganismos en el caso que los alimentos no estn siendo elaborados con altas medidas de higiene, por ende al no tener diversas medidas de higiene en los alimentos que se venden en la va publica de la ciudad de Mxico, esto sobre todo al momento de su preparacin, la concentracin de enterobacterias y microorganismos diversos, aumenta en su concentracin, produciendo as graves daos en la salud.
Objetivos

El objetivo general de esta investigacin es Comprobar, que efectivamente se puedan aislar enterobacterias presentes en los alimentos adquiridos en establecimientos de venta de comida rpida en va pblica de la Ciudad de Mxico. Para ello se tendr que: Realizar diferentes muestreos de alimentos de establecimientos de venta de comida rpida en la va pblica de la ciudad de Mxico, realizar cultivos de las muestras en medios especficos para enterobacterias y as mediante la aplicacin de pruebas bioqumicas poder identificar el gnero y especie de las enterobacterias que estarn presentes en estos alimentos. Y por ultimo, Comprobar la existencia de enterobacterias patgenas en los alimentos adquiridos en establecimientos de venta de comida rpida en va pblica de dos establecimientos diferentes especficos.

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 Hiptesis

Evidentemente se cree que Los alimentos adquiridos en establecimientos de venta de este tipo de comida rpida en la va pblica, causa un gran dao por la presencia de enterobacterias u otro tipo de microorganismos diferentes que evidentemente son patgenos para la salud, esto depende desde luego a que tipo de alimento nos estemos refiriendo (ANITOX 2009), se sabe que todos los alimentos contienen una cierta cantidad de microorganismos especficos que habitan dentro de la flora alimentaria normal (ICMF 2001), desde luego, existen diversas variables que provocan que este tipo de alimentos que se venden diariamente en la ciudad de Mxico, en la va publica. Sean los causantes de diversas infecciones sistmicas o de otro tipo, esto desde luego al alterar la concentracin superficial de los microorganismos diversos que habitan en los alimentos, dentro de los cuales existen las enterobacterias que habitan en la microflora normal alimentaria. Se cree que los lugares donde se venden este tipo de alimentos, que ciertamente son establecimientos de la va publica, son los que estn ms contaminados a diferencia de la comida que consumimos diariamente en nuestras casas, y esto se atribuye a que no se toman las medidas higinicas adecuadas al momento de su elaboracin. En la presente investigacin se le esta dando nfasis a este problema, y para llevarla acabo se esta basando en dos establecimientos especficos de donde venden este tipo de comida rpida, al realizar cultivos de dichos alimentos, se obtendrn colonias de enterobacterias patgenas las cuales podrn ser identificadas mediante la aplicacin de pruebas bioqumicas. Para finalizar esta idea se estima que el segundo establecimiento de comida analizado (de donde se adquiri la muestra 2, la denominada sper torta).
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Ser en el que se logre identificar una cantidad mayor de enterobacterias, a diferencia del primer establecimiento de donde se compro la muestra numero 1 (la denominada muertorta), los resultados que se pretenden obtener son los de lograr aislar en la muestra 2 especies de shigella, proteus, salmonella, providencia, Klebsiella, Serratia y algunas otras ms de importancia media. As pues se llega a pensar esto, debido a que existe la evidencia suficiente de que en el segundo establecimiento, es el que contiene en su respectivo tipo de alimento que venden, una cantidad de bacterias que son capaces de causar infeccin, a diferencia del primer establecimiento. Sin ms que agregar se esta llegando a un punto crucial en esta investigacin, que es el de comprobar por medio de metodologas aplicadas especficamente a estos alimentos, si es verdad la hiptesis planteada. Materiales y Mtodos Para realizar esta investigacin, se opto por hacer las pruebas bioqumicas para identificacin de enterobacterias en un tipo de comida mexicana llamada torta evidentemente esta comida fue comprada en la ciudad de Mxico, se tomaron como muestra dos tiendas que venden tortas cubanas, ya que las tortas cubanas tienen una gran variedad de ingredientes, tales como: jamn, pierna de cerdo, salchicha, queso amarillo, queso blanco, milanesa de res, huevo, chorizo, jitomate, aguacate, cebolla, mayonesa, chiles jalapeos y chiles chipotles (figura 1). La forma en que se preparan estas tortas y el ambiente en el que las preparan, fue motivo especial por el cual se crey que estos alimentos seria capaces de portar una gran cantidad de enterobacterias. En total fueron dos tortas las que se compraron para el anlisis, la primera se compro en una torteria ubicada en la calzada de Acoxpa, esquina con canal de Miramontes, delegacin Tlalpan (figura 2). La segunda se compro en una torteria ubicada sobre la calzada de las bombas, delegacin Coyoacn, a un costado de la Universidad Autnoma
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Metropolitana Xochimilco, las cuales fueron transportadas envueltas en una bolsa de papel estraza, posteriormente despus de comprar las muestras a analizar, se trasportaron de inmediato al laboratorio, en donde se realizo el anlisis en 4 das. En el primer da, se realizaron los cultivos de las dos muestras, la torta numero 1 fue la denominada muertorta, y la torta numero 2 fue la denominada sper torta, de estas muestras se realizaron 4 cultivos diferentes en 2 cajas de agar MacConkey (figura 6), dos cultivos de la torta 1, uno concentrado y otro diluido, y de igual forma para la torta numero 2. Para homogenizar la torta numero 1 se tuvo que licuar 150 g de torta con 125 ml de una solucin salina por 5 minutos (figura 3), se vaci el contenido en un vaso de precipitado de 500 ml, y se hizo la siembra por estriado cruzado. Para la muestra diluida se agregaron 50g de la muestra concentrada y 80 ml de solucin salina, se disolvi y se hizo la siembra por estriado cruzado. Para la torta numero 2, se hizo exactamente lo mismo, posteriormente se guardaron las cajas de agar MacConkey en una estufa a 36 grados Celsius, durante 24 horas. Al da siguiente, da 2. Se obtuvo un cultivo casi nulo de las muestras, ya que fueron muy pocas bacterias las que crecieron (grafica 1), de esas pocas bacterias se hizo la resiembra en tres cajas ms de agar MacConkey, con la finalidad de obtener cultivos puros, as, se hicieron 4 resiembras diferentes, uno con la muestra 1 concentrada y 1 diluida, y otro de la muestra 2 concentrada y el ultimo con la muestra 2 diluida, se guardaron nuevamente en la misma estufa las 5 cajas de agar MacConkey. Al tercer da el crecimiento bacteriano fue suficiente (grafica 1), de tal modo que la muestra uno concentrada fue fermentadora intensa de lactosa, la muestra 2 concentrada fue fermentadora ligera, la muestra 2 diluida no fue fermentadora, y la muestra 1 diluida fue fermentadora intensa. Posteriormente, se hicieron las siembras de los cultivos puros en 4 juegos de pruebas bioqumicas (figura 4), el primer juego fue el de la muestra 1 concentrada, el juego numero 2 fue el de la muestra 2
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concentrada, el juego numero 3 fue el de la muestra 2 diluida y el juego numero 4 fue el de la muestra 1 diluida, se hizo el incoluo y posteriormente se guardaron todos los juegos de bioqumicas en la estufa, junto con los agares MacConkey. Al cuarto da, el crecimiento en los tubos de las pruebas bioqumicas fue el adecuado para realizar las lecturas indicadas (tabla 2) para identificar el gnero y especie de las enterobacterias que se obtuvieron.

Tabla 2. Tabla de las lecturas de las pruebas bioqumicas fundamentales para la identificacin de enterobacterias ms comunes.

Prueba bioqumica

Modo de hacer la prueba

Lectura de la prueba bioqumica

Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en la zona inclinada del pico de flauta. Citrato de Simmons Hacer la siembra por estriado Prueba negativa: no se observa crecimiento de cambio ni color en el medio.

Pico de flauta rojo/profundidad amarilla: medio alcalino/acido / (Alc / Ac). Glucosa fermentadora; lactosa o sacarosa no fermentadora Pico de flauta amarillo/ profundidad amarilla: medio Acido / Acido

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(Ac/AC). Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada. Pico de flauta rojo/ profundidad roja: medio alcalino/ alcalino (Alc/Alc). Agar hierro triple azcar Previo sembrado en el medio solido TSI. Reaccin negativa, no hay fermentacin de ninguno de los carbohidratos.

Prueba positiva: color rosa fuerte (rosa mexicano), en el caldo. Prueba negativa: color amarillo o sin cambio en el caldo urea. Caldo urea Previa inoculacin en el caldo urea

Adicionar al tubo del caldo VogesProskauer los siguientes reactivos en el orden indicado. Para evitar la contaminacin de los reactivos en la prueba de Voges-Proskauer, utilizar una pipeta de 1mL en cada uno de ellos. a) 0.6mL de la solucin etlica de naftol al 5% b) 0.2mL de la solucin de KOH al Voges-Proskauer 40% c) agitar el tubo y dejarlo en reposo de 10 a 15 minutos. Prueba positiva: color rojo en el medio (presencia de acetoina).

Prueba negativa: color amarillo o cobrizo en el medio. Adicionar 2 gotas del indicador rojo de metilo al otro tubo de caldo VogesRojo de metilo Proskauer, y agitar. Prueba positiva: color rojo en el medio. Reaccin retardada: color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo en el medio. Prueba positiva: el medio de SIM debe encontrarse turbio. Prueba negativa: solo debe existir crecimiento a lo largo de la picadura. Movilidad Previo sembrado en el medio SIM Prueba positiva: color negro en la picadura o en todo el tubo. prueba negativa: ausencia de color negro en el tubo Produccin de H2S Previo sembrado en el medio SIM

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En esta tabla se puede mostrar como fue que se hicieron las lecturas de las pruebas bioqumicas, y as mismo como se tuvieron que haber echo las mismas, para la identificacin de las enterobacterias que se obtuvieron al final.

Grafica 1: Grafica del crecimiento bacteriano en el agar de MacConkey, a lo largo de los 4 das de investigacin.

En esta grafica se puede observar que el crecimiento bacteriano de cada una de las muestras tomadas (en porcentaje total), esta en funcin del tiempo (96
% de crecimien to bacterian

horas), para realizar esta grafica se necesito conocer el rea total del agar MacConkey, para posterior mente hacer el calculo del crecimiento bacteriano en una determinada rea inoculada a lo largo de 96 horas.

Resultados

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identificaron las bacterias de las muestras por medio de pruebas bioqumicas aplicadas a las muestras (tabla 4). Despus de 4 das de anlisis se llego a los resultados de que en la Muestra 1 concentrada se obtuvieron bacterias del gnero: Shigella o Providencia, estos resultados los obtuvimos basndonos solo en reacciones clave (tabla 3) y en las lecturas de las pruebas bioqumicas (tabla 2). Por otra parte para la Muestra 1 diluida, se obtuvo el aislamiento de bacterias del gnero: Shigella o Providencia, de igual forma basndonos solo en reacciones clave y las lecturas de las pruebas bioqumicas. El resultado de la Muestra 2 concentrada, fue el deseado, ya que desde un principio se planteo que seria la muestra ms contaminada a diferencia de la primer muestra, en esta muestra se logro el aislamiento de bacterias del genero shigella, especficamente Shigella sonnei, evidentemente para la muestra 2 diluida se obtuvo el mismo resultado ya que es por lgica que era una muestra ms diluida que la anterior, as se obtuvo de igual forma Shigella sonnei, evidentemente en una concentracin ms pequea que la muestra 2 concentrada (ver grafica 1). De esta forma el resultado fue satisfactorio, ya que se encontr lo que se buscaba. Resumiendo estos hechos, en la tabla numero 4, se presentan los resultados de las lecturas de las pruebas bioqumicas para identificacin de enterobacterias que se obtuvieron de los respectivos juegos (figura 5).

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Tabla 3: tabla de los hechos o reacciones clave de las pruebas bioqumicas para la identificacin especifica de los gneros de enterobacterias.

Sulfuro de hidrogeno positivas Edwardsiella tarda vulgaris Especies de Salmonella mirabilis Citobacter freundii Voges-Proskauer positivas Especies de Klebsiella de Pantoea Especies de Enterobacter Serratia Especies de Hafnia Fenilalanina desaminasa positivas Especies de Proteus de Providencia Especies de Morganella Inmviles a 36 grados C. Especies de Shigella Klebsiella Especies de Yersinia (mviles a 22 grados C.) Especies de Especies Especies Especies de Proteus Proteus

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En esta tabla se puede observar algunas de las reacciones que fueron claves para la identificacin de las enterobacterias que se obtuvieron al final de la investigacin (tabla tomada de Koneman y col. 2008 pg. 227).

Tabla 4: pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias en el laboratorio de la Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco.

Juego de pruebas bioqumicas

TSI

Gas

H2S

R M

V P

IND

CIT

URE A

MOV

OH-H3O+ 1 OH-H3O+ + 2 OH-H3O+ 3 + + + -

H3O+H3O +

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En esta tabla se puede observar los resultados de las pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias, de donde posteriormente se paso a la conclusin de la deduccin en base a estos resultados, del tipo de enterobacterias que estuvieron presentes en las muestras analizadas (Cuadro modificado por los autores de sta investigacin, tomado en base a Koneman y col. 2008).

Tabla 5: Tabla de las caractersticas ms comunes en las pruebas bioqumicas para la identificacin del gnero y especies ms comunes de enterobacterias patgenas para el ser humano.

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En esta tabla se muestran las reacciones ms importantes de las pruebas bioqumicas para la identificacin de las enterobacterias patgenas ms comunes, dicha tabla fue en la que se vaso esta investigacin, TSI= agar hierro triple azcar, H2S = cido sulfhdrico, RM = rojo de metilo, VP = Voges-Proskauer, IND = indol, CIT = citrato de Simmons, URE = ureasa, MOV = movilidad (modificado de Koneman y col. 2008, pg. 226). Conclusin Como conclusin final se puede decir, que las hiptesis planteadas de esta investigacin fueron un tanto correctas. De acuerdo a los resultados obtenidos, se logra comprobar que efectivamente como lo indica la grafica 1, la muestra de la que se logro aislar mayor cantidad de enterobacterias fue la muestra 2, especficamente la muestra 2 concentrada. Tambin se puede observar que de acuerdo a los resultados obtenidos de las pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias (tabla 4), se logro aislar especies de providencia y shigella sonnei, as pues, se puede afirmar que las hiptesis planteadas, las cuales nos mencionan que se obtendran especies de shigella, providencia, proteus, salmonella, Klebsiella, Serratia y algn otro tipo de enterobacterias fueron
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un tanto ciertas. Ya que como lo indican los resultados se lograron aislar especies de shigella, como lo son shigella sonnei, y providencia De cierto modo se concluye que en la comida rpida analizada, si existe la posibilidad de que se encuentren habitando especies bacterianas del genero enterobacteriacae. Y que de cierta forma son capaces de causar patogenias especificas en los seres humanos al ingerir este tipo de alimentos vendidos en la va publica de la ciudad de Mxico preparados con escases higinica, y por ltimo se puede decir que la comida est contaminada, pero, no existen cantidades suficientes de microorganismos como para causar una infeccin severa, as, se puede decir vulgarmente que no ocurre dao alguno al momento de consumir estos alimentos.

Bibliografa 1. ANITOX. 2009. Las enterobacterias en los alimentos. Trademark Anitox Corp. 1:1.
2. Aranguren Martha Murcia. 2004. Identificacin de enterobacterias. 4:1-12.

3. Brock Michael T. Madigan. 2008. Biologa de los microorganismos. Pearson prentice hall. 10:345-380.
Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 42

4. Bryan F.L. 1993. Street vending in developing countries. Food Aust. HACCP. 45:80-84.
5. Calzadilla de Valds N. 2003. Susceptibilidad antimicrobiana y perfil

plasmdico en cepas de Shigella aisladas en Cuba. Trabajo para optar por el ttulo de especialista de primer grado en microbiologa. La Habana.
6. Davey G.R. 1985. Food poisoning in tunew south wales: 1977-1984. Food

technol. Aust. 37:453-456.

7. Daz Leonor Rigau, Luis Enrique Cabrera Rodrguez, Tania Fernndez Nez,

Marisol Arias Vegas, Gilda Scull. 2008. Epidemiologa: 1-10.

Serogrupos y susceptibilidad

antimicrobiana en cepas de Shigella. Centro Municipal de Higiene y

8. Eneca Harry, Ellen Bergendal. 1955. The treatment of shigellosis i. synergistic

effect of antibiotics on shigella. American Journal Dig. Dis. 24:131-140.

9. Erajima K Hirose, Izumiya H, Tamura K, Arakawa E, Takai N, 2005.

Antimicrobial susceptibility of Shigella sonnei isolates in Japan and molecular analysis of S. sonnei isolates with reduced susceptibility to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother; 49(3):1203-5. 10. ICMF. 2001. Microorganismos de los alimentos. ACRIBIA. 6:545-562.
11. Kagan Lori J., Allison E. Aiello, Elaine Larson. 2002. The role of the home

environment in the transmission of infectious diseases. Journal of Community Health. 22(4):247-267. 12. Koneman W. Elmer. 2008. Diagnostico microbiolgico. Medica panamericana. 6:204-288.
13. Luzmila Alvarado, Guzmn, Yoli; Guzmn, Militza y Betancourt, Jos. 2005.

Salmonella spp. and Shigella spp. Associated with Acute Diahrreic Syndrome from Children Under Six Year of age. Kasmera. 33(2): 132 141.

Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 43

14. Martnez Bustos A. Jaime, Serrano Drago Elisa, Moles y Cervantes Luis Pedro, Ibarra Ramrez Rodrigo, Rojas Serrana Nora. 2007. Mtodos bsicos para el aislamiento e identificacin de enterobacterias del agua. Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco, Manual de laboratorio de la Divisin de Ciencias biolgicas y de la salud. 26:1-29. 15. Mossel A. A. David. Moreno Garca Benito. 2003. Microbiologa de los alimentos. ACRIBIA. 2:302-336, 239-268.
16. Murray R. Patrick. Rosenthal S. Ken. 2006. Microbiologa mdica. Elsevier.

5:323-338. 17. Nature publishing Group. 2003. Microbiology miscellany. Nature. 423:199-201. 18. Navarro Ferran, Elisenda Miro y Beatriz Mirelis. 2010. Lectura interpretada del antibiograma de enterobacterias. Enfermedades infecciosas y microbiologa clnica. 28(9):638-645.
19. Rivera Sandra Patricia, Bacteriol, Liliana Janeth Flrez, Statist, Janeth

Sanabria, 2010. Standardization of a quantification method for Salmonella spp. And Shigella spp. in specific liquid media. Colombia medica. 41(1):60-70. 20. Romero cabello Ral. 2007. Microbiologa y parasitologa humana, bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias. Medica panamericana. 3:743-809.
21. Turbyfill R. Kevin, Oaks V Edwin.

1990. Antigenic domains of Shigella

virulence proteins. Department of Enteric Infections, Washington, D.C. 20:783784. 22. Unidad Nacional de Salud Ambiental. Cuba, Informe anual. La Habana: Ministerio de Salud Pblica; 2003.
23. Urbanova E. 1999. Selective Medium for Primary Isolation of Members of the

Tribe Proteeae. Folia Microbio. 44 (6): 629-634.

Universidad Autnoma Metropolitana Xochimilco Pgina 44

24. Weiss Jerrold Arturo. 2007. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature. 417:91-94. 25. Yvette Weinrauch, Doreen Drujan, Steven D. Shapiro, Jerrold Weiss, Arturo Zychlinsky.2002. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature. 417:91-94.

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Anexos

Figura 1. Esta es una imagen de la denominada muertorta, En esta imagen se muestra como est preparada la comida que se analiz, se puede ver que la estufa en la que se prepara no est limpia o en condiciones para preparar alimentos, as tambin se puede observar la gran cantidad de ingredientes que contiene; los cuales no se sabe cual haya sido su desinfeccin previa.

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Figura 2. En esta imagen se puede observa el puesto de comida, se puede ver tambin que est en la va pblica, esta imagen fue tomada a las 3:00 de la maana ya que es la hora en la que ms se vende este tipo de alimentos.

Figura 3. Aqu se muestra el mtodo que se utilizo para la homogenizacin de las muestras, se utilizaron 125 ml de solucin salina para posteriormente licuar por 5 minutos 150 g de muestra.

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Figura 4. En esta imagen se muestra como se hicieron los inculos de los cultivos puros en los juegos de pruebas bioqumicas.

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Figura 5: en esta imagen se muestran los resultados obtenidos de los cultivos en los juegos de pruebas bioqumicas para la identificacin de enterobacterias.

Figura 6: en esta imagen se muestran los tres cultivos puros de las primeras muestras.

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