UNIVERSIDAD AUTONOMA DE DURANGO CAMPUS ZACATECAS

MAESTRIA EN NUTRICIN CLINICA Docente: DR. HUMBERTO RAFAEL BRAVO DELGADO Alumna: DRA. DULCE MARA LOZANO ALDRETE Investigacin: ANLISIS BIOQUMICO DE SANGRE DE RATN MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRA. Semestre: 2, GRUPO B Fecha de entrega: DE DICIEMBRE DE 2011

NDICE

INTRODUCCINPgina 1

MARCO TERICO.Pgina 2

OBJETIVOS.Pgina 7

MATERIAL Y MTODOS..Pgina 8

RESULTADOS ..Pgina 11

DISCUSIN...Pgina 14

CONCLUSINPgina 15

REFERENCIAS BIBLIOGRFICASPgina 16

INTRODUCCIN

Se presenta una panormica de sucesos histolgicos y bioqumicos presentes en un ratn albino de la raza mus musculus, que fue alimentado con una dieta hiperglucemica, con la finalidad de identificar los consecuentes cambios histolgicos en tejido heptico; adems de cambios en niveles plasmticos en cuanto a : protenas, glucosa, creatinina, colesterol y triacilglicridos, los cuales fueron determinados por espectrofotometra.

MARCO TERICO

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la espectrofotometra.

La espectrofotometra UV-visible
Es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro.

Espectrofotmetro UV-visible
Todos los espectrofotmetros constan, de: 1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

La transmitancia (T)
La transmitancia de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 . La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa.

La absorbancia (A)
Es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La transmitancia y la absorbancia se miden utilizando el espectrofotmetro.

Protenas
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas constituyentes de los seres vivos (biomolcula). Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas.

Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

Enzimtica: catalizadoras de reacciones qumicas (sacarasa y pepsina) Contrctiles (actina y miosina).

Homeosttica: colaboran en el mantenimiento del pH, Transduccin de seales (rodopsina) Protectora y vitales para la coagulacin sangunea (trombina y fibringeno) Hormonas: reguladoras de actividades celulares

Transportadoras (hemoglobina) Sostn (colgeno)

Inmunolgica (anticuerpos de defensa natural contra infecciones o agentes extraos). Como la globulinas. Receptoras: capaces de desencadenar una respuesta determinada. Proporcionan presin coloidosmotica al plasma albmina).

Al ser las ms verstiles y abundantes de la clula, por tanto son fundamentales en todos los aspectos de la estructura y funcin de la misma.
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Glucosa
La glucosa es un azcar simple que constituye la fuente principal de energa para el organismo y la unidad estructural bsica de los polisacridos. Los carbohidratos ingeridos son transformados a glucosa, absorbidos por el intestino delgado, y distribuidos a travs de la circulacin hacia las distintas partes del organismo. La utilizacin de glucosa por el organismo depende de la disponibilidad de la insulina, una hormona producida por el pncreas. La insulina acta controlando el transporte de glucosa al interior de las clulas del organismo, informando al organismo de almacenar el exceso de glucosa en forma de glucgeno (para un almacenamiento a corto plazo) y/o en forma de triglicridos en las clulas adiposas (grasas). La vida no es compatible sin glucosa o insulina, y debe mantenerse adems un equilibrio entre ambas. El nivel de glucosa plasmtica est determinado por el balance entre la cantidad de glucosa que entra y sale del torrente sanguneo. Por tanto, los principales determinantes son el consumo alimentario, la tasa de entrada a las clulas musculares, tejido adiposo y otros rganos y, la actividad glucosttica del hgado.

Acilglicridos

Son lpidos simples formados por la esterificacin de una, dos o tres molculas de cidos grasos con una molcula de glicerina. Tambin reciben el nombre de glicridos o grasas simples. Segn el nmero de cidos grasos, se distinguen tres tipos de estos lpidos:
Los Los

monoglicridos, que contienen una molcula de cido graso diglicridos, con dos molculas de cidos grasos

Los triglicridos, con tres molculas de cidos grasos.

Los Triacilglicridos son los principales lpidos de depsito o reserva en las clulas animales.
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Esteroides
Los esteroides son lpidos que derivan del esterano. Comprenden dos grandes grupos de sustancias: 1. Esteroles: Como el colesterol y las vitaminas D. 2. Hormonas esteroideas: Como las hormonas suprarrenales y las hormonas sexuales. El colesterol forma parte estructural de las membranas a las que confiere estabilidad. Es la molcula base que sirve para la sntesis de casi todos los esteroides. Se encuentra en forma de alcohol libre o ster de cido graso de cadena larga del grupo hidroxilo en el carbono 3. Es slido a temperatura ambiente, funde a 150 C, es insoluble al agua y se extrae fcilmente de los tejidos con cloroformo, ter, benceno o alcohol caliente. (Lehninger, captulo 11).

CREATININA
La creatinina es un compuesto orgnico generado a partir de la degradacin de la creatina (que es un nutriente til para los msculos). Es un producto de desecho del metabolismo normal de los msculos que usualmente es producida por el cuerpo en una tasa muy constante dependiendo de la masa de los msculos.

La creatina se sintetiza en el hgado a partir de metionina, glicina y arginina. En el msculo esqueltico se fosforila para formar fosforilcreatina (reserva energtica importante para la sntesis de ATP) y normalmente es filtrada por los riones y excretada en la orina. La medicin de la creatinina es la manera ms simple de monitorear la funcin de los riones. (Fisiologa humana Ganong, captulo 17).

OBJETIVOS

GENERAL.
Realizar anlisis bioqumico de sangre de ratn mediante espectrofotometra.

ESPECFICOS.
1. Determinar cmo repercute una dieta hiperglucemica, aumentando los

niveles de glucosa plasmtica de manera significativa.

2. Determinar la existencia de una hipertrigliceridemia bajo el rgimen de dita hiperglucemica.

3. Determinar que los niveles

de colesterol podran no verse afectados y

mantenerse en su lmite normal con una dieta hiperglucemica.

4. Determinar modificaciones en la creatinina y protenas asociados a una

afeccin renal, secundarios a una estricta dieta hiperglucemica.

MATERIAL Y MTODOS
El trabajo se realizo con un ratn albino de la raza mus muscularis, los parmetros iniciales de peso y talla antes de los procedimientos a realizar fueron: 10 cm y 5 gr respectivamente. Fue alimentado durante 20 das con una dieta hiperglucemica a base de barra de chocolate abuelita, pan dulce empaquetado de marca marinela (canelitas, gansitos, etc.), pan de dulce casero, dulce de cajeta de leche con coco y como bebidas: refresco de coca-cola y jugos fruttsy y jumex de varios sabores.

El nmero de comidas fue de 3-4 veces al da, es importante mencionar que no hubo sedentarismo por parte del roedor, por el contrario, durante los 20 das de dieta mantuvo una vigorosa actividad fsica en su rueda de columpio. Cabe mencionar que antes de ser sacrificado mantuvo un ayuno prolongado de 24 horas.

Para dar inicio a los procedimientos, en laboratorio se prepararon diversas soluciones para gel, soluciones para teir el gel y soluciones buffer, entre ellas:

Buffer 6.8 (Tris base 2 gr y agua pH 6.8 HCl 10 ml, aforar a 20 ml). Buffer 8.8 (Tris base 3.63 g, Agua pH 8.8 10 ml, aforar a 20 ml). Acrilamida 30% (Acrilamida 43.8 g, Bis-acrilamida 1.2 g aforar a 200 ml). TEMED 8.4% (TEMED 0.84 ml, aforar a 10 ml). Persulfato de Amonio 12.5% (PA 1.25 gr, aforar a 10 ml). BSA (albmina de suero bovina 0.01 g, aforar a 10 ml) al 0.1%. cido tricloroactico 12.5% (TCA 125 g, en 1000 ml). Etanol 50% (etanol 250ml, aforar a 500 ml). Azul de cromassie 0.1% (azul de cromassie 0.4 g, metanol 160 ml, cido actico 28 ml, agua 212 ml. Todo para 400 ml). Etanol/actico/agua para 400 ml (etanol 120 ml, actico 28 ml, agua 252 ml). Metanol/actico/agua para 400 ml (metanol 100 ml, actico 40 ml, agua 260 ml). Buffer de cmara 5x, para 300 ml (tris base 4.5 g, glicina 21.6 g, SDS 1.5 gr, agua 300ml). cido dinitrosaliclico DNS (NaOH 1.6 gr disuelto en agua destilada, 30 gr de tartrato de sodio potasio, 1 gr de DNS, disolver y aforar a 100 ml de agua destilada, almacenado a 4C en frasco mbar).
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Para la preparacin de estas soluciones, se utilizo bscula manual Adamequipment. Modelo AQ26105. Tubos de ensayo, pipetas mecnicas marca BRAND de 0.5 a 10 microlitros, de 10 a 100 microlitros y de 100 a 1000 microlitros; as como pipetas manuales, matraces Kimax de 250, 500 y 1000 ml. Probetas de 50 ml y vasos de precipitado Kimax de 250 y 600.

Posteriormente el ratn fue sacrificado con una gasa impregnada de formol (el da 21, despus de haber iniciado con la dieta hiperglicemica) y se disec con equipo de diseccin marca Guttek, con el fin de extraer el hgado, el cual se observ en microscopio electrnico marca Zeigen modelo mains voltaje 110 v 120 v. Enseguida el hgado fue macerado con 4 ml de KCl al 30% en un mortero, se vaci esta mezcla a un tubo de vidrio para calentarse a 100 C por 15 minutos en termo bao Felisa, a 100 C.

El resto del ratn se macer en un mortero con 10 ml de agua destilada para obtener una muestra suficiente de sangre, la cual se coloc en un tubo de ensayo y se centrifug durante 15 minutos en centrfuga marca LabCorp of Amrica para

separar el plasma. A partir del plasma obtenido, se tom 0.5 ml del mismo y se mezcl con 0.5 ml de Leamy, se coloc la mezcla en un tubo de ensayo plstico con tapa, para calentar durante 5 minutos a 100 C en termo bao Felisa. Se dej enfriar y se inyect en la electroforesis, la cual ya estaba preparada con los geles necesarios.

Del mismo plasma se hizo determinacin de glucosa, protenas, colesterol y triacilglicridos mediante lectura en espectofotmetro, el cual se calibr a cero antes de comparar la cubeta con la muestra, para obtener un resultado confiable.

Para determinar protenas, se coloc en una cubeta para espectrofotmetro 0.5 ml de plasma y 2 ml de reactivo Biuret, se ley a 550 nm.
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Para determinar glucosa se coloc en un tubo de ensayo 0.5 ml de plasma y 0.5 ml de DNS y 5 ml de agua destilada. Posteriormente se coloc en una cubeta para espectrofotmetro 1 ml de esta solucin y se ley a 540 nm.

Para determinar creatinina se coloc 0.5 ml de plasma y 0.5 ml de agua destilada y se ley en espectrofotmetro.

Para determinar triacilglicridos, se coloc en una cubeta para espectrofotmetro, 1 ml de reactivo y 0.01 ml de plasma, se dejaron las cubetas por 10 minutos a temperatura ambiente y se ley una cubeta con estndar y la muestra contra otra cubeta con reactivo blanco a 500 nm antes de 60 minutos.

Para determinar colesterol, se coloc en una cubeta para espectrofotmetro, 1 ml de reactivo de color y 0.01 ml de plasma, se incub a 37 C por 10 minutos a

temperatura ambiente y se ley comparando con estndar y reactivo de color en cubetas separadas a 500 nm despus de 60 minutos.

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RESULTADOS Y DISCUSIN

1. GLUCOSA
Los resultados de glucosa los podemos plasmar mediante la frmula para interpolar: G= Y1+(X0-X1) (Y2-Y1) (X2-X1) G= 0.6+0.141 = 0.647
Muestr a HG Glucos a 0.74

G= 0.6+(0.740-0.033) (0.2) = (0.68-0.033)

G=0.6+(0.707) (0.2) = (0.647) de

G= 0.6+0.21= 0.81 mg/ml

glucosa mg/ml 0.81

81 mg/dl Glucosa

GRAFICA No.1 Muestra el valor de Glucosa, obtenido en anlisis de sangre de ratn, alimentado con una dieta hiperglucemica, comparado con los paramentaros normales de glucosa en humanos.

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2. PROTENAS
Muestra HG

O 4.8 mg/dl de Protenas mg/mL

0.182 0.04808

Protenas Abs

Prot

GRAFICA No.2 Muestra el valor de Protenas, obtenido en anlisis de sangre de ratn, alimentado con una dieta hiperglucemica, comparado con los paramentaros humanos. normales de glucosa en

3. CREATININA
Muestra Creatinina Abs HG 0.249-0.25 Creatinina mg/dL 0.106

GRAFICA No.3 Muestra el valor de Creatinina, obtenido en anlisis de sangre de ratn, alimentado con una dieta hiperglucemica, comparado con los paramentaros normales de glucosa en humanos.

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4. COLESTEROL
Muestra HG Colesterol mg/dl 158.2089552

GRAFICA No. 4 Muestra el valor de Colesterol, obtenido en anlisis de sangre de ratn, alimentado con una dieta hiperglucemica, comparado con los paramentaros normales de glucosa en humanos.

5. TRIGLICERIDOS
Muestra HG TG ABS 0.258 TG en mg/dL 153.115727

GRAFICA No.5 Muestra el valor de Triglicridos, obtenido en anlisis de sangre de ratn, alimentado con una dieta hiperglucemica, comparado con los paramentaros normales de glucosa en humanos.

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DISCUSIN

Los resultados hallados muestran que en este estudio la dieta hiperglucemica no afecto significativamente los parmetros estudiados. Segn algunos autores una dieta hiperglucemica desencadena una hiperglucemia, que origina enfermedades como la Diabetes Mellitus entre otras. Y que posteriormente se complica con un dao renal, reflejado en dichos parmetros. En este caso podramos considerar que el roedor pasaba gran parte del da en actividad fsica y que adems antes de ser sacrificado tuvo un ayuno prolongado de 24 hrs. Otros aspecto importante

sera considerar el tiempo de la dieta en estudio (20 das), muy corto quiz para repercutir en los resultados.

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CONCLUSIN

En este anlisis bioqumico de ratn, se determina como los niveles de glucosa, no se vieron afectados como se esperaba, a pesar de la dieta hiperglucemica, las protenas se mantuvieron en sus parmetros normales al igual que la creatinina, orientndonos a disminuir la posibilidad de un dao renal, propiciado por dicha dieta. En cuanto a los lpidos, a pesar de que el colesterol no se vio afectado, se aprecia una hipetrigliceridemia leve. De tal forma que el tipo de dieta a seguir puede, o no verse reflejada en cambios importantes de cualquier organismo, dependiendo de diferentes factores.

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BIBLIOGRAFIA

1.- Guytn M.D. Arthur C.; Tratado de Fisiologa Mdica.; Decimo primera edicin Editorial ElsieverPgina 885

2.- Diego Fernando Burbano Villaics.; Glucosa en sangre. Articulo Cientfico.; Fuente: http://es.scribd.com/doc/62488010/glucosa 9/11/2011.

3.- Brandon Arvalo.; Lpidos.; fuente

http://es.scribd.com/doc/51947376/lipidos

9/11/2011.

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