Departamento de Ingeniera Qumica Ingeniera Civil Qumica Laboratorio de Enzimas (Ctedra Diseo de Bioreactores)

1ER LABORATORIO DE BIOCATLISIS ENZIMTICA: DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA (ENZIMA LIBRE) Y DE CONTENIDO DE PROTENAS.

INTRODUCCION Como es bien sabido, las enzimas son protena. Polmeros de residuos aminoacdicos unidos mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de las reacciones qumicas del metabolismo celular. La produccin de enzimas, de actividades especficas, es seguida por una purificacin y una estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan diversos excipientes (otras protenas y azcares, por ejemplo). Por lo que un preparado enzimtico comercial no es 100% puro. De manera de cuantificar la enzima presente en una formulacin comercial se realizan determinaciones de su actividad enzimtica y del contenido de protenas. El objetivo de este prctico es la determinacin de la actividad enzimtica de lactasa y del contenido de protenas de una formulacin comercial de Lactasa a partir de Aspergillus oryzae (ENZECO Fungal Lactase).

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Con respecto a la determinacin de la actividad de la enzima, debemos recordar que la actividad enzimtica: - indica el mximo potencial cataltico de una enzima y esta dado por la velocidad inicial de la reaccin - la velocidad de reaccin se mide, cuantificando la evolucin del producto o del sustrato de reaccin en el tiempo, pero este ltimo es ms dificultoso ya que se utiliza en exceso y las variaciones en corto tiempo no son notorias. - Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH ptimo) y a concentraciones saturantes de sustrato - La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite catalizar 1 mol de sustrato por minuto de reaccin a las condiciones antes mencionadas. - La medicin de actividad se ve afectada por los siguientes factores: Denaturacin de la enzima (por temperatura) Reversibilidad de la reaccin enzimtica. Inhibicin de la enzima (por producto o inhibidor externo) Desaturacin de la enzima (baja concentracin de sustrato) - Para evitar los tres primeros factores, la medicin se realiza a tiempos cortos; el ltimo factor se evita ala utilizar una concentracin saturante de sustrato. - Al evitar tales problemas la velocidad de reaccin slo est condicionada por la cantidad de enzima utilizada en la reaccin.

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La determinacin de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae se realizar mediante el siguiente protocolo - Colocar 1.8 mL de lactosa (como sustrato) en una concentracin de 100 g/L preparada en tampn acetato pH 4.5 0.1M - Incubar durante aproximadamente 3 minutos a 53C, para llevar el sustrato a la temperatura ptima de reaccin de la enzima - Adicionar 0.2 mL de la solucin de lactasa previamente diluida - Incubar durante el tiempo de reaccin seleccionado (2, 5, 10, 15 minutos) - Detener la reaccin mediante ebullicin durante 5 minutos - Determinar el contenido de glucosa en la muestra mediante el mtodo de glucostat - Interpolar en la curva de calibracin - Realizar un blanco La determinacin de glucosa se realiza segn un Kit enzimtico: - A 0.03 mL de muestra (la solucin inactivada) agregar 3 mL del reactivo - Incubar a 37C por 10 minutos (para realizar la reaccin) - Leer el valor de la absorbancia a 495 nm, contra un blanco de agua destilada y reactivo La solucin enzimtica debe ser menor a 20 ppm para obtener una relacin lineal del producto obtenido en el tiempo hasta los 15 minutos. Las experiencias deben ser realizadas por duplicado. La solucin enzimtica debe ser realizada en tampn acetato pH 4.5 0.1M de manera de mantener la actividad de la enzima. Cada grupo deber escoger 1 concentracin de enzima para trabajar.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PROTEICA Para la determinacin de protenas, se utilizar el mtodo de bradford, por ser una tcnica sencilla y rpida para determinar enlaces peptdicos, y que presenta menor interferencias que otros mtodos de anlisis. El alumno deber realizar diversas diluciones a partir de una solucin patrn de lactasa y determinar su contenido en protenas segn el protocolo que se indica a continuacin: - A 0.3 mL de muestra agregar 3 mL de reactivo bradford (entregado por las ayudantes) - Agitar suavemente para homogeneizar la solucin y permitir la reaccin - Esperar por aproximadamente 15 minutos (no ms de una hora) - Leer en espectrofotmetro a una longitud de onda de 595 nm contra un blanco de agua destilada y reactivo - Interpolar el valor obtenido en la curva de calibracin (entregada por las ayudantes) - *nota: las diluciones en este caso se pueden realizar con agua destilada

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SOLUCIONES A PREPARAR PRCTICO ACTIVIDAD ENZIMTICA

1. Sustrato: Lactosa (sustrato) en una concentracin de 100 g/L preparada en tampn acetato pH 4.5 a 0.1M. Preparar 200 mL. 2. Tampn acetato: Solucin tampn a 0.1 M, constituida por la mezcla de acido actico (acido) y de acetato de sodio (base).

Previamente preparar dos soluciones, una de acido actico y la otra de acetato de sodio, a 0.2 M cada una de ellas. Preparar 200 mL de cada una de estas soluciones.
Para obtener una solucin del tampn a pH 4.5, usando la siguiente tabla interpolar y obtener las cantidades en mL a adicionar del acido (X) y la base (Y).

pH 4.4 4.6

X 30.5 25.5

Y 19.5 24.5

Sumando los volmenes de acido y base se obtienen 50 mL y eso nos da una solucin a 0.2 M. Como deseamos obtener 0.1 M debemos diluirlo a 100 mL (aforar el matraz a 100 ML con agua destilada). Preparar 200 mL: Para ser usadas en la solucin de sustrato. Por lo tanto debemos agregar el doble de los volmenes obtenidos de X y de Y, y luego aforar a 200 mL con agua destilada. Antes de aforar con agua destilada adicionar el sustrato (20 g para 200 mL). 3. Soluciones de la enzima diluida: Efectuar la dilucin de acuerdo a la concentracin del preparado enzimtico original y la concentracin deseada.

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RESULTADOS FUNDAMENTALES A ENTREGAR EN EL INFORME:

1.

2.

3.

Cada grupo deber recolectar los resultados obtenidos en las experiencias hechas por los distintos grupos. Con estos resultados se deber hacer el informe del prctico de laboratorio. Debern obtener de cada grupo la evolucin de la concentracin de producto (glucosa) en el tiempo, para la concentracin especfica de enzima usada en cada grupo. Con estos resultados se debern construir 2 graficas. La primera de ellas debe mostrar la evolucin de la concentracin de producto (moles.L-1) en el tiempo (min) para cada una de las concentraciones de enzima. La segunda grafica debe mostrar la evolucin de la velocidad inicial de reaccin (moles.L-1.min-1) en funcin de la concentracin de enzima (protenas, mg.L-1) usada. La concentracin que cada grupo uso es de preparado enzimtico y NO de enzima, para obtener la concentracin de enzima considere que el preparado enzimtico contienen un 30% en peso de enzima (el 70% restante son excipientes azucares, estabilizantes y otros). Finalmente se deber entregar el valor de la actividad enzimtica especfica del preparado enzimtico original, expresada en UI/mg enzima (protena).

El informe debe ser entregado dentro de los 15 das posteriores a la finalizacin del prctico de laboratorio.