- Verso Preliminar -
Editora Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria SEPN 515, Edifcio Omega. Bloco B, Braslia (DF), CEP 70770-502 Internet: www.anvisa.gov.br Gerncia-Geral de Tecnologia em Servios e Sade Gerncia de Investigao e Preveno das Infeces e dos Eventos Adversos permitida a reproduo total desta obra, desde que citada a fonte. 1. ed. 2004. Tiragem: 200 exemplares em CD
Edio nova com modificaes no contedo e no ttulo, tendo como base o Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica publicado em 2000.
1. Infeco Hospitalar Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Brasil. ANVISA Ministrio da Sade.
Coordenao do Projeto
Adelia Aparecida Maral dos Santos Gerncia de Investigao e Preveno das Infeces e dos Eventos / ANVISA / MS
Autor
Colaboradores
Angela von Nowakonski - Servio de Microbiologia Clnica do Hospital das Clinicas - UNICAMP / Campinas SP Caio Marcio Figueiredo Mendes - Universidade de So Paulo, Laboratrio Fleury / So Paulo SP Carlos Emlio Levy - Laboratrio de Microbiologia - Centro Infantil Boldrini / Campinas SP Carmen Oplustil - Laboratorio Fleury / So Paulo SP Cssia Maria Zoccoli - Farmacutica Bioqumica Cludia Maria Leite Maffei - Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, USP / Ribeiro Preto SP Elza Masae Mamizuka - Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP / So Paulo SP Emerson Danguy Cavassin - Laboratrio de Microbiologia, Hospital das Clnicas da UE / Londrina PR Flvia Rossi - Mdica Microbiologista Clnica Igor Mimica - Faculdade de Cincias Mdicas da Santa Casa / So Paulo SP Helena Petridis Consultora tcnica da ANVISA Lycia Mara Jenne Mimica - Faculdade de Cincias Mdicas da Santa Casa / So Paulo SP Marcia de Souza Carvalho Melhem - Instituto Adolfo Lutz / So Paulo SP Maria Carmen Gonalves Lopes - Laboratrio de Microbiologia, Centro Infantil Boldrini / Campinas SP Marines Dalla Valle Martino - Hospital Israelita Albert Einstein / So Paulo SP Nilton Lincopan Ps-Graduao da Faculdade de Cincias Farmacuticas - USP Rosngela Aparecida Mendes Silva - Laboratrio de Microbiologia, Centro Infantil Boldrini / Campinas SP
Revisores
Claude Andr Solari - Sociedade Brasileira de Microbiologia / So Paulo SP Helena Petridis Consultora tcnica ANVISA Jos Carlos Serufo - Sociedade Brasileira de Medicina Tropical / Faculdade de Medicina da UFMG Lauro Santos Filho - Departamento de Cincias Farmacuticas da UFPB / Joo Pessoa PB Maria Rita Elmor Laboratrio de Microbiologia do Hospital Srio Libans / So Paulo SP Pedro Bertollini - Professor aposentado da Faculdade de Odontologia de Piracicaba / USP Slvia Figueiredo Costa Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da USP
CONTEDO GERAL
Mdulo I
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Mdulo V
1.
Mdulo II
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Mdulo VI
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Mdulo III
Mdulo VII
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Mdulo IV
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
A primeira edio do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Hospitalar teve como proposta padronizar as tcnicas microbiolgicas consideradas fundamentais na rotina e que pudessem dar respaldo s atividades das Comisses de Controle de Infeco Hospitalar. Se, por um lado, sua virtude foi a simplicidade e objetividade no desenvolvimento dos temas, as suas limitaes e a rpida evoluo do conhecimento nesta rea logo reclamaram sua atualizao. Estamos, agora, diante da oportunidade de resgatar algumas falhas daquela primeira edio, procurando ampliar e aprofundar temas considerados essenciais, contando com um seleto e conceituado corpo editorial e de colaboradores. Nossa expectativa de que os laboratrios de microbiologia, a partir das bases oferecidas por este Manual, possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar. No tivemos a pretenso de alcanar o contedo e a profundidade dos manuais-textos de microbiologia tradicionalmente consultados e que tambm nos serviram de referncia, mas sim, de servir como manual de bancada de tcnicas consagradas, procedimentos bsicos padronizados e informaes atualizadas de utilidade no meio hospitalar. Esta edio revisada e ampliada foi programada em 10 mdulos, abrangendo os seguintes temas:
Mdulo I Mdulo II Mdulo III Mdulo IV Mdulo V Mdulo VI Principais sndromes infecciosas Segurana e controle de qualidade no laboratrio clnico Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica Descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos Deteco e identificao bactrias de importncia mdica Deteco e identificao micobactrias de importncia mdica
Deteco e identificao de fungos de importncia mdica Deteco e identificao de vrus de importncia mdica (em produo) Principais mtodos de deteco da resistncia no Laboratrio Clnico (em produo) Laboratrio de Microbiologia e sua interao com a Comisso de Controle de Infeco Hospitalar (em produo)
Esperamos assim atender grande maioria de microbiologistas que, afastados dos grandes centros, no tm acesso a informaes atualizadas na rea de Microbiologia e que, melhor capacitados, possam estar altura das expectativas das Comisses de Controle de Infeco Hospitalar, oferecendo um suporte tcnico atualizado e mais eficiente.
O ambiente hospitalar inevitavelmente um grande reservatrio de patgenos virulentos e oportunistas, de modo que as infeces hospitalares podem ser adquiridas no apenas por pacientes, que apresentam maior susceptibilidade, mas tambm, embora menos freqentemente, por visitantes e funcionrios do prprio hospital. Os patgenos implicados nas infeces hospitalares so transmitidos ao indivduo tanto via endgena, ou seja, pela prpria flora do paciente quanto pela via exgena. Esta ltima inclui veculos como mos, secreo salivar, fluidos corpreos, ar e materiais contaminados, como por exemplo, equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos mdicos. Muitos destes procedimentos so invasivos, isto , penetram as barreiras de proteo do corpo humano, de modo a elevar o risco de infeco (vide Tabela) Os principais fatores que influenciam a aquisio de uma infeco so: status imunolgico idade (recm-nascidos e idosos so mais vunerveis) uso abusivo de antibiticos procedimentos mdicos, em particular, os invasivos immunosupresso falhas nos procedimentos de controle de infeco Exemplos de microrganismos da flora normal humana
Pele Staphylococcus Micrococcus Propionibacterium Corynebacterium Streptococcus Malassezia Pityrosporum Trato respiratrio Staphylococcus Corynebacterium Streptococcus Hemophilus Neisseria Branhamella Trato Digestivo Bacteroides Lactobacillus Enterococcus Escherichia coli Proteus Klebsiella Enterobacter Bifidobacterium Ouvido Staphylococcus Corynebacterium Citrobacter Fusobacterium spirochetes Olhos Staphylococcus Streptococus Neisseria Cavidade oral Lactobacillus Neisseria Streptococcus Fusobacterium Actinomyces Treponema Bacteroides Trato Urogenital Streptococcus Bacteroides Mycobacterium Neisseria Enterobacter Clostridium Lactobacillus Candida Trichomonas
Mdulo I
NDICE 1. Infeces do trato urinrio ..............................................................................................1 Introduo ........................................................................................................................ 1 Patognese........................................................................................................................ 2 Epidemiologia e fatores de risco............................................................................................ 3 Sinais e sintomas clnicos..................................................................................................... 3 Diagnstico laboratorial ....................................................................................................... 5 2. Infeces de ossos e articulaes ....................................................................................9 Introduo ........................................................................................................................ 9 Microrganismos mais freqentes ........................................................................................... 9 Coleta e transporte do material .......................................................................................... 10 Processamento de amostra ................................................................................................ 10 3. Infeces da pele e tecido subcutneo ..........................................................................12 Introduo ...................................................................................................................... 12 Leses eritematosas e superficiais: aspectos clnicos e diagnstico........................................... 12 Ulceraes e ndulos: aspectos clnicos e diagnstico ............................................................ 14 Fstulas e queimados: aspectos clnicos e diagnstico............................................................. 15 Feridas cirrgicas: aspectos clnicos e diagnstico ................................................................. 17 Infeces complicadas e leses causadas por mordedura: aspectos clnicos e diagnstico............ 18 4. Infeces intestinais......................................................................................................21 Introduo ...................................................................................................................... 21 Principais causas infecciosas de desinteria............................................................................ 22 Associaes entre os aspectos clncios e os agentes etiolgicos ............................................... 24 Diagnstico laboratorial ..................................................................................................... 27 Relatrio de resultados...................................................................................................... 28 5. Infeces abdominais ....................................................................................................30 Agentes microbianos mais frequentes .................................................................................. 30 Coleta e transporte do material .......................................................................................... 30 Processamento das amostras ............................................................................................. 30 6. Infeces do sistema nervoso central............................................................................32 Introduo ...................................................................................................................... 32 Dados epidemiolgicos e etiologia de processos infecciosos do snc........................................... 33 Diagnstico laboratorial ..................................................................................................... 35 7. Infeces sistmicas......................................................................................................38 Introduo ...................................................................................................................... 38 Fatores de risco para bacteremia e fungemia ........................................................................ 38 Diagnstico em hemoculturas............................................................................................. 39 Infeco relacionada a cateter vascular................................................................................ 41 8. Infeces genitais .........................................................................................................43 Introduo ...................................................................................................................... 43 Candidase vulvo-vaginal ................................................................................................... 43 Tricomonase ................................................................................................................... 44 Vaginose bacteriana.......................................................................................................... 45 Infeco gonoccica.......................................................................................................... 46 Infeces por chlamydia trachomatis ................................................................................... 48 Infeces por mycoplasma spp. .......................................................................................... 49 Outras infeces genitais e seus patgenos .......................................................................... 50 9. Infeces do trato respiratrio superior ........................................................................51 Introduo ...................................................................................................................... 51 Quadro clnico, agentes etiolgicos e diagnstico laboratorial .................................................. 51 10. Infeces do trato respiratrio inferior..........................................................................53 Pneumonia da comunidade ................................................................................................ 53 Pneumonia hospitalar........................................................................................................ 54 Diagnstico laboratorial das pneumonias.............................................................................. 56 Pacientes neutropnicos e imunossuprimidos ........................................................................ 60 11. Referncias bibliogrficas..............................................................................................62
Mod - 1
ITU no complicada: ocorre primariamente em mulheres jovens sexualmente ativas sem anormalidade anatmica ou funcional do aparelho genitourinrio. ITU complicada: ocorre em indivduos que j possuem alguma anormalidade estrutural ou funcional do processo de diurese, presena de clculos renais ou prostticos, doenas subjacentes em que haja predisposio a infeco renal (diabetes melittus, anemia falciforme, doena policstica renal, transplante renal) ou na vigncia de cateterismo vesical, instrumentao ou procedimentos cirrgicos do trato urinrio. Pelo maior risco, as ITUs em crianas, gestantes, homens e infeces do trato urinrio alto so consideradas infeces complicadas.
PATOGNESE
As trs possibilidades de um microrganismo alcanar o trato urinrio e causar infeco so: Via ascendente: o microrganismo poder atingir atravs da uretra, a bexiga, ureter e o rim. Esta via a mais freqente, principalmente em mulheres (pela menor extenso da uretra) e em pacientes submetidos instrumentao do trato urinrio. Via hematognica: ocorre devido a intensa vascularizao do rim podendo o mesmo ser comprometido em qualquer infeco sistmica; a via de eleio para ITU(s) por alguns microrganismos como Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Histoplasma spp., sendo tambm a principal via das ITU(s) em neonatos. Via linftica: rara embora haja a possibilidade de microrganismos alcanarem o rim pelas conexes linfticas entre o intestino e o rim e/ou entre o trato urinrio inferior e superior. Aps o microrganismo atingir o trato urinrio poder ocorrer ou no infeco na dependncia dos seguintes fatores: Adequao dos mecanismos de defesa do hospedeiro Propriedades antibacterianas da urina (elevada osmolalidade e baixo ph) e da mucosa do trato urinrio (citocinas, mecanismos antiaderncia). Efeito mecnico da mico. Resposta imune e inflamatria. Integridade anatmica e funcional das vias urinrias. Tamanho do inculo (quanto maior o inculo que alcana o rim, maior a chance de infeco). A medula renal altamente susceptvel a infeco por baixas contagens bacterianas, ocorrendo o inverso no crtex renal. Virulncia do microrganismo Aderncia s clulas uroepiteliais e vaginais Resistncia atividade bactericida do soro Produo de hemolisina e fator citotxico necrotizante tipo i. Nos pacientes com cateterismo vesical, os microrganismos atingem a bexiga atravs de trs caminhos: no momento da insero do cateter atravs da luz do cateter atravs da interface mucosa-cateter Por outro lado, os fatores envolvidos na fisiopatognese das infeces urinrias associadas ao uso de cateteres vesicais so: fenmenos inflamatrios locais (corpo estranho). eliminao dos mecanismos habituais de defesa (esvaziamento incompleto da bexiga, alteraes da imunidade local, via aberta de passagem at a bexiga). obstruo mecnica das glndulas periuretrais (facilitando quadros de uretrites e epididimites). Nos pacientes com prostatite ou epididimite, os microrganismos atuam, principalmente, atravs do refluxo da urina infectada nos ductos prostticos e ejaculatrios.
Mod - 2
Em mulher ps-menopausa as infeces recorrentes, com trs ou mais culturas positivas e sintomticas em um ano, ou 2 dois episdios de ITU em seis meses, tem como fator predisponente a cistocele, incontinncia e aumento do volume de urina residual. Pacientes internados desenvolvem ITUs mais freqentemente que pacientes comunitrios, tendo em vista as condies gerais dos pacientes hospitalizados e a alta probabilidade de instrumentao do trato urinrio, que so os maiores contribuintes para esta diferena. A ocorrncia de bacteriria em pacientes hospitalizados sem cateterismo estimada em 1%, e o risco de infeco varia de acordo com o sistema de drenagem utilizado, e a durao do cateterismo. No sistema aberto, atualmente em desuso, cerca de 100% dos pacientes apresentaro bacteriria em 2 a 4 dias a partir da cateterizao, no sistema fechado 5 a 10% dos pacientes apresentaro bacteriria por cada dia de cateterizao. A importncia da ITU hospitalar est na sua elevada freqncia e principalmente por ser considerada a principal causa de bacteremia por Gram negativos.
Mod - 3
sondagem vesical. Em crianas maiores de dois anos com controle esfincteriano, pode-se utilizar a urina de jato mdio. Adultos com ITU baixa, limitada a uretra e bexiga, geralmente apresentam disria freqente, urgncia miccional e ocasionalmente dor na regio particularmente pielonefrite, so freqentemente acompanhadas pelos mesmos sintomas das infeces baixas, alm supra-pbica. As ITUs altas, particularmente pielonefrite, so freqentemente acompanhadas pelos mesmos sintomas das infeces baixas, alm de dor nos flancos e febre. Bacteremia quando presente poder confirmar um diagnstico de pielonefrite ou prostatite.
AGENTES ETIOLGICOS DAS INFECES DO TRATO URINRIO
A flora normal da regio periuretral definida de acordo com a faixa etria e condies do paciente e, raramente, causam ITUs apresentando em geral contagem de colnias menor que 1000 UFC/ml, sendo constituda de: Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. (difterides), Staphylococcus spp. (exceto Staphylococcus aureus e S. saprophyticus), Lactobacillus spp. Manifestaes clnicas e microrganismos freqentemente associados com os vrios tipos de ITUs.
Tipo de Infeco Manifestao clnica Aguda: febre, nusea, calafrios, vmito, dor no flanco Crnica: assintomtica Disria e frequncia Cistite Disria, frequncia, corrimento uretral Microrganismo isolado Enterobactrias: E. coli e outros grams negativos, Enterococcus e Staphylococcus aureus Diagnstico e contagem de colnias (UFC/ml) 105
Pielonefrite
Escherischia coli e outros grams negativos, S. saprophyticus, Enterococcus Chlamydia Trachomatis (a) Mycoplasma hominis (b) Ureaplasma urealyticum (c) Neisseria gonorrhoeae (d) Trichomonas vaginalis (e) Candida albicans e spp. (f)
105
Uretrite
Urocultura negativa a) Diagnstico por IFD b) e c) secreo uretral semeada em meios de cultura especficos. Alguns kits permitem contagem de colnias - 104 ucf/ml d) cresce em ACH e TM e) exame direto de jato inicial de urina centrifugada f) podem crescer em gar sangue ou CLED Urocultura ou cultura da secreo prosttica 103 ucf/ml *diagnstico por IFD
Aguda: febre, calafrios, dor lombar Prostatite Crnica: assintomtica ou semelhante aos sintomas da aguda
N. gonorrhoeae, E. coli, Proteus spp. e outras enterobactrias Menos frequente: Enterococcus spp. P. aeruginosa e Chlamydia trachomatis* Questionvel: micoplasmas
Cistite Pielonefrite
Escherischia coli e outras enterobactrias P. aeruginosa Acinetobacter spp., Enterococos Candida albicans, C. glabrata e Candida spp. Staphylococcus coag. Neg
105
Mod - 4
DIAGNSTICO LABORATORIAL
A maioria das ITUs diagnosticada atravs de dados clnicos e laboratoriais como piria e ou bacteriria e tambm pela urocultura com contagem de colnias. Pesquisa da Piria - reflete a possibilidade de resposta inflamatria do trato urinrio. A causa mais comum a infeco bacteriana que poder ser confirmada pela urocultura; porm a piria poder ser evidenciada nas situaes clnicas apresentadas abaixo, cuja urocultura resulta negativa. a) No infecciosa: doena tbulo-intersticial (nefropatia por analgsicos e beta-lactmicos) clculos e corpos estranhos terapia com ciclofosfamida rejeio de transplante renal trauma genitourinrio neoplasias glomerulonefrite
b) Infecciosa (microrganismos de difcil cultivo): Tuberculose e infeces causadas por micobactrias atpicas Haemophilus influenzae Chlamydia spp. e Ureaplasma urealyticum Gonococos Anaerbios Fungos vrus (herpes, adenovrus, varicela-zoster) Leptospiras c) Outras causas infecciosas: durante ou at uma semana aps o tratamento adequado da ITU Infeco mascarada pela antibioticoterapia infeces adjacentes ao trato urinrio (apendicite, diverticulite e prostatite) A pesquisa de piria poder ser realizada por diferentes mtodos manuais e automatizados:
Mtodos Microscpico: - Gram Princpios Limites de Deteco
Reconhecimento das bactrias por caractersticas morfo-tintoriais. Gram de uma gota de urina no ccentrifugada
Pequeno aumento 10x Aumento 40x Grande aumento 100x Contagem na cmera de hemocitmetro Determinao da excreo Determinao no sedimento
30 leuccitos/campo 5 leuccitos/campo 1-2 leuccitos/campo 10 plcitos/ml (valor clnico) 400.000 leuccitos/hora 10 plcitos/ml (valor clnico)
- cmara de contagem - excreo urinria de leuccitos - sedimento urinrio Testes Qumicos: - fitas nitrato redutase teste de Griess - esterase leucocitria
Bactrias gram negativas reduzem Nitrato a Nitrito Detecta a presena dessa enzima nos leuccitos
104 UFC/ml falso neg em cocos gram + e Pseudomonas Equivale a 5 leuccitos/campo 40x
Mod - 5
Os testes utilizando fitas reagentes tm bom valor preditivo para afastar infeco urinria, no entanto apresentam baixo desempenho para sugerir ITU. Altas doses de vitamina C podem dar falso teste negativo para nitrito na fita, e a presena de Trichomonas pode dar teste positivo para esterase leucocitria. Valores de Sensibilidade, especificidade e valor preditivo (VP) dos testes nitrito e esterase leucocitria, para predizer 105 UFC/ml
TESTE Nitrito Esterase leucocitria Sensibilidade % 69 71 Especificidade % 90 85 VP (%) do teste positivo 57 47 VP (%) do teste negativo 94 94
Bacterioscopia de urina: Com a urina no centrifugada, e apenas homogeneizada, pegar uma ala com 10 l de urina e depositar sobre uma lmina de vidro; Deixar secar, fixar na chama e corar pelo gram. Com objetiva de imerso (1000x) fazer contagem. Se encontrar 1 ou mais bactrias por campo, sugere 105 UFC. A presena de clulas epiteliais e vrios tipos morfolgicos de bactrias sugere contaminao. Bacteriria - a pesquisa de bacteriria poder ser realizada atravs da bacterioscpia da urina, testes bioqumicos e cultura de urina.
0.95
0.85
0.88
0.51
0.99
0.98
0.65
coliformes/ml
O resultado da urocultura dever ser avaliado juntamente com os outros dados laboratoriais (pesquisa de bacteriria e/ou piria) e clnicos (presena ou ausncia de sintomas, fatores predisponentes, populao de risco, etc.). Considerando-se que as amostras de urina submetidas a cultura so provenientes de pacientes com sintomas de ITU e de pacientes assintomticos com alto risco de Infeco. Apresentamos na tabela seguinte os diversos mtodos utilizados para a quantificao da urina e posterior identificao e antibiograma.
Mod - 6
Lamino-cultivo O lamino-cultivo consiste de um recipiente plstico cilndrico, onde pode tambm ser coletado a urina, com uma tampa ligada a um suporte plstico com duas faces contendo meios de cultura como CLED e Mac Conkey ou outras combinaes. Esta tcnica tem sido muito utilizada tanto por laboratrios com pequena rotina, como aqueles de grande movimento pelos seguintes motivos: Facilita a semeadura, pois no necessita de ala calibrada ou outra medida de volume. Facilita o transporte da urina semeada utilizando o prprio recipiente do lamino-cultivo. Fcil conservao do produto em temperatura ambiente por cerca de seis meses. Identificao sumria dos principais patgenos encontrados, dependendo do produto adquirido. Estes meios permitem identificar atravs de algumas provas bioqumicas rpidas alguns dos principais gneros de bactrias ou pelo menos sugerir ou afastar a presena de E. coli. A coleta deve seguir os padres normais de assepsia e orientao, e a semeadura feita sobre o prprio lamino-cultivo, de forma que as faces do produto sejam colocadas uniformemente em contato com a urina. despejando-se a urina durante a coleta ou aps coletada em frasco estril semeada com um swab embebido na urina homogeneizada.
As principais desvantagens do mtodo so: o mtodo semi-quantitativo superfcie menor de leitura e observao de crescimento
Mtodo Pour plate Preparar previamente a diluio da urina para obteno de um fator a ser utilizado na interpretao. 9,9 ml de salina + 0,1 ml da urina (10-2) 9,9 ml de salina + 0,1 ml da 1 diluio (10-4) Adicionar 1 ml da ltima diluio em placa de Petri (150 mm) Acrescentar o gar Mller Hinton (fundido), homogeneizando e incubando 35-37C em aerobiose durante 24 h. A leitura feita multiplicando o nmero de colnias obtido, pelo fator de diluio.
Semeadura com Ala Calibrada Alguns trabalhos recomendam a semeadura das urinas somente com a ala calibrada 0,01l (10 L), procurando detectar-se contagem de colnias a partir de 100 UFC/ml, outros trabalhos porm recomendam a semeadura de acordo com a origem da amostra como o proposto abaixo.
Recomendao da Inoculao por Ala Calibrada segundo a origem da amostra clnica de urina Amostra Jato mdio feminino 0,001 ml ou 1 l
1
0,010 ml ou 10 l X
Mod - 7
X X X X
- uma colnia com ala de 1 L = 1000 UFC/ml - uma colnia com ala de 10 L = 100 UFC/ml Utilizado para amostras onde a contagem de colnias baixa tem significado clnico
Esse mtodo consiste em utilizar a urina no diluda, e fazer a semeadura utilizando-se uma ala de platina ou de plstico (disponvel comercialmente), de dimetro calibrado capaz de carrear uma quantidade fixa de urina (0,001 ou 0,01ml), padronizando desse modo o fator de diluio. Tcnica: Em sua execuo a ala bacteriolgica introduzida em uma amostra de urina bem homogeneizada, fazendo-se movimentos para baixo e para cima no sentido vertical. A ala carregada ento utilizada para inocular cada meio de cultura, fazendo-se, inicialmente, uma linha reta no centro da placa e completando-se o espalhamento com uma srie de passagens em um ngulo de 90, atravs da linha original. Importante item de controle de qualidade utilizar alas calibradas periodicamente aferidas ou, quando possvel, alas descartveis. Meios de cultura: As placas com meio seletivo (Mac Conkey ou EMB) e outro meio no seletivo (gar Sangue de Carneiro a 5%) devero ser incubadas 24 horas 35-37C, devendo este perodo ser prolongado quando as condies clnicas justificarem ou quando houver suspeita de infeco por Gram positivos (Enterococos e Streptococcus agalactiae ou leveduras). Atualmente utiliza-se muito o meio CLED, que permite crescimento das enterobacterias, impedindo o espalhamento dos Proteus, a maioria dos gram positivos e leveduras. prudente a leitura em 48-72 horas quando a contagem de leuccitos ou a bacterioscopia sugerirem infeco urinria e no for verificado crescimento bacteriano em 24 horas. Nos casos de suspeita clnica de ITU por anaerbios, o material clnico adequado para cultura a urina obtida por puno supra-pbica e semeada de acordo com as orientaes deste manual para cultura de anaerbios. Quando houver suspeita de ITU fngica, recomenda-se semear de acordo com as orientaes deste manual referentes s infeces fngicas. Outros dados laboratoriais que podem contribuir para o diagnstico: Hematria: quando detectada isoladamente sugere tuberculose renal, litase renal, doena policstica renal, cistite viral e trauma aps cateterizao. Proteinria: resposta fisiolgica exerccios fsicos prolongados ou postura ereta (proteinria ortotstica) Hemocultura positiva: indica a presena de microrganismo na corrente sangnea proveniente de um stio conhecido (pulmo, osso, dente etc.) ou de um stio desconhecido. Em pacientes com pielonefrite aguda a hemocultura positiva em 25%. A bacteremia tambm bastante freqente nos neonatos com infeco do trato urinrio. Prostatite - Cerca de 50% dos homens em algum momento da vida iro apresentar sintomas sugestivos de prostatite, embora apenas 5-10% sero caracterizados como casos agudos ou crnicos. Os demais apresentaro quadros inflamatrios no infecciosos. O diagnstico de prostatite bacteriana aguda , muitas vezes, confundido nos homens abaixo de 50 anos com infeco urinria. A prostatite pode ser detectada com base em uroculturas positivas, ou cultura de secreo prosttica com presena de neutrfilos na secreo. Os sintomas, geralmente, so intensos na infeco aguda, enquanto que na prostatite crnica eles so insidiosos, manifestando-se por infeces urinrias repetidas, ou sintomas genitourinrios irritativos ou obstrutivos. Na fase aguda contra-indicada a coleta de secreo prosttica pela dor, embora o toque retal cuidadoso j possa sugerir este diagnstico, documentado por urocultura. Os principais agentes so a E. coli, Proteus spp.,e outras enterobacterias, sendo menos freqente o enterococo. controvertido o papel de estafilococos, Gardnerella, Haemophilus, Chlamydia, Mycoplasma, Trichomonas e vrus.
Mod - 8
Ps-operatrio
Ps-mordida de animal Insuficincia vascular Anemia falciforme P diabtico e lcera de decbito Infeco por HIV
Enterobactrias, anaerbios.
Bartonella henselae
Mod - 9
Imunossuprimidos Usurios de droga endovenosa e pacientes que fazem hemodilise crnica Locais onde as doenas tem alta prevalncia Infeco hospitalar
Aspergillus spp., Complexo M. avium, Candida spp. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
ARTRITE SPTICA
Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae
Crnica e monoarticular Por faixa etria
At 3 meses: S. aureus, Enterobacterias, S. agalactiae (grupo B) e Neisseria gonorrhoeae. 3 meses a 14 anos: S. aureus (27%), S. pyogenes (14%), S. pneumoniae (14%), Haemophilus influenzae (3%), bacilos Gram negativos (6%), Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis (14%) e desconhecida (36%). Adultos: N. gonorrhoeae, S. aureus, Streptococcus spp., raramente bacilos gram negativos.
PRTESES ARTICULARES
S. aureus Staphylococcus spp (coagulase negativos) Artrite reacional ou Sindrome de Reiter Pode ocorrer aps semanas infeco por: Campylobacter jejuni, Shigella, Salmonella. Chlamydia trachomatis, Yersinia enterocolitica,
Poliartrite assimtrica que pode acompanhar de uretrite, conjuntivite, uveite e rash cutneo. importante lembrar como diagnstico diferencial de artrite migratria causada pela febre reumtica, ps-infeco, por Streptococcus pyogenes.
PROCESSAMENTO DE AMOSTRA
No laboratrio de microbiologia, estas amostras sero processadas nas seguintes etapas:
Mod - 10
Avaliao da qualidade do material encaminhado: Identificao adequada, frasco/meio de transporte correto, volume da amostra suficiente para os testes requeridos, data/horrio da coleta. Colorao de Gram: Sero observados forma, colorao e agrupamento dos microrganismos, alm da presena de clulas (leuccitos ntegros ou degenerados, incluses bacterianas, etc). Se houver suspeita de microrganismos lcool-cido resistentes, preparar tambm lminas para colorao de Ziehl Neelsen, e na suspeita de fungos, preparao de azul de lactofenol ou de algodo. Semeadura em meios adequados:
Meios de cultura para bactrias aerbias gar sangue Incubar a 35C durante 18 a 24 h Verificar crescimento bacteriano: se negativo, incubar mais 24 h se positivo, identificar o microrganismo gar chocolate suplementado Incubar a 35C em jarra com 5% CO2 durante 18 a 24 h Verificar o crescimento bacteriano: se negativo, reincubar se positivo, proceder identificao do microrganismo Meios de cultura para bactrias anaerbias Brucella gar acrescido de vitamina K (menadiona) e hemina Incubar a 35C em jarra de anaerobiose durante 48 h Verificar crescimento se negativo, repicar a amostra do tioglicolato a cada 48 h at completar 7 dias se positivo, proceder identificao da bactria Se houver suspeita clnica de micobactrias, semear em meios especiais (Lowenstein Jensen ou Middlebrook); aguardar 60 dias para concluir a cultura como negativa. Se houver suspeita clnica de fungos, semear em gar Sabouraud-glicose; incubar temperatura ambiente durante 4 semanas. Em caso de suspeita clnica, outras culturas especiais podem ser disponibilizadas com meios especficos: culturas para Legionela, Micoplasma, Clamdia e outros agentes fastidiosos. As culturas para vrus demandam estrutura laboratorial especializada em cultura clular. Quando realizadas devem ser finalizadas com a tipagem monoclonal de cada vrus suspeito.
Culturas especiais
Mod - 11
ERISIPELA E CELULITE
A erisipela uma infeco cutnea geralmente causada por estreptococo do grupo A, tendo sido descritos raros casos devidos a estreptococos C e G. A infeco envolve principalmente a derme e as partes mais superficiais do tecido subcutneo com envolvimento proeminente dos linfticos superficiais. A erisipela apresenta uma rea cutnea endurecida, edematosa, avermelhada e dolorida, eventualmente com pequenas vesculas ou bolhas na superfcie cutnea. O quadro clnico tpico caracterizado pelo aparecimento de alteraes cutneas com bordas elevadas e nitidamente
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demarcadas com pele adjacente normal ou no envolvida. O ataque agudo de febre e calafrio notrio com invarivel presena de linfoadenopatia. Ao contrrio da erisipela, a margem da rea de celulite pouco definida sem elevao central. O estreptococo do grupo A e o S. aureus so considerados os agentes etiolgicos mais comuns. Algumas espcies de Vibrio e Aeromonas podem causar celulite aps introduo do microrganismo atravs da ferida ou lacerao ocorrida durante a natao em gua doce ou gua do mar. A celulite causada por H. influenzae relativamente rara, mas a forma distinta desta infeco que ela est geralmente associada com bacteremia e afeta tipicamente crianas de seis meses a 3 anos de idade. Diagnstico Laboratorial O diagnstico de impetigo feito geralmente atravs das caractersticas clnicas das leses. A confirmao bacteriolgica geralmente no necessria, mas pode-se cultivar em gar sangue o material obtido da base da leso aps lavagem com gua e sabo, assepsia local com lcool a 70% e remoo da crosta. Evidncia sorolgica de infeco recente por Streptococcus do grupo A poder ser utilizado no diagnstico retrospectivo. A deteco do anticorpo anti-Dnase B um indicador mais sensvel de infeco cutnea pelo estreptococo do que o ttulo de ASLO (anti-estreptolisina O), provavelmente devido inibio de estreptolisina pelos lipdios da pele presentes na leso.
FOLICULITE
uma infeco e inflamao dos folculos pilosos geralmente iniciada pelo bloqueio do folculo ou por pequenos traumas. A infeco caracterizada por ppulas ou pstulas cncavas, perfuradas por plo circundado por um halo eritematoso. A infeco em geral causada pelo S. aureus. Embora a etiologia da foliculite possa ser confirmada por cultura do ps ou exsudato da leso, esta prtica geralmente no necessria. Outras causas menos comuns de foliculite incluem membros da famlia Enterobacteriaceae (especialmente Proteus sp). Esta pode ocorrer em pacientes com Acne vulgaris que recebem antibiticos orais por um perodo prolongado de tempo. Recentemente foram verificados surtos de foliculite atravs do uso de banheiras de hidromassagem e piscinas contaminadas com Pseudomonas aeruginosa. A erupo cutnea consiste de coceira, ppulas eritematosas ou ppulopustulosas. A erupo no nica em aparncia, mas tem distribuio caracterstica envolvendo principalmente as ndegas, quadris, coxas e axilas. Estas so reas onde se localizam as glndulas sudorparas apcrinas as quais tendem a ser ocludas quando se usam roupas apertadas. Alm da erupo, muitos pacientes manifestam febre baixa, cefalia, indisposio, dor de ouvido (devido otite externa concomitante) e dor no peito (devido mastite). A doena pode levar vrias semanas, mas geralmente autolimitada, de cura espontnea, no necessitando de terapia especfica. Diagnstico Laboratorial Na foliculite estafiloccica, geralmente a bactria no vista no Gram e nem na cultura. J na foliculite por Pseudomonas, o microrganismo pode ser recuperado de pstulas maiores, embora na maioria dos casos a cultura tambm se apresenta negativa.
FURUNCULOSE E CARBNCULO
O furnculo um abscesso que se inicia no folculo piloso como um ndulo avermelhado, tornando-se doloroso e amolecido. O carbnculo mais profundo e extenso, apresentando-se freqentemente como abscessos subcutneos mltiplos envolvendo vrios folculos e glndulas sebceas, drenados atravs dos folculos pilosos. O carbnculo pode estar associado com febre, mal-estar e pode se complicar pela celulite ou bacteremia. Tanto o furnculo como o carbnculo ocorrem em tecido cutneo pela frico e abafamento dos stios onde se encontram os folculos (virilha, axila, pescoo e face). O S. aureus o patgeno mais freqente. Tratamento com compressas quentes geralmente adequado para pequenos furnculos localizados. Antibiticos anti-estafiloccicos tais como oxacilina e clindamicina podem ser necessrios na presena de febre ou na existncia de celulite circundante, especialmente se o furnculo ou carbnculo estiveram localizados na face.
PARONQUIA
uma infeco superficial na prega da unha que pode ser aguda ou crnica. As infeces agudas so devidas a Staphylococcus aureus, que poder ser cultivado de drenagem purulenta.
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Tratamento com compressas quentes so geralmente adequadas, embora a inciso cirrgica e drenagem sejam necessrias. A paronquia crnica geralmente associada com imerses freqentes das mos em gua de sabo, sendo o agente mais comum a Candida sp. Diagnstico Laboratorial Poder ser confirmado pela cultura do aspirado ou drenagem do ps em aerobiose no gar Sangue. Diagnstico de leses eritematosas superficiais
Doenas e Sndromes Agente etiolgico mais freqente Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes (grupo A), eventualmente outros sorogrupos (G,C ou B) Diagnstico Laboratorial
Impetigo
Gram, Cultura em gar Sangue ou gar Chocolate Gram, Cultura em gar Sangue, gar chocolate, Caldo trypticase soja
Erisipela
Celulite
Streptococcus pyogenes, S. aureus Menos freqentes: Enterobactrias, Pasteurella spp., Aeromonas spp., Clostridium spp., B. anthracis, Erysipelotrix spp.
Gram, Cultura em gar Sangue, gar Chocolate, gar Mac Conkey, Caldo tioglicolato, Caldo trypticase soja.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida spp. Candida spp., Epidermophyton spp., Microsporum spp.
Micoses superficiais
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Blastomicose, Criptococose
Cultura em gar Sangue, Sabouraud, dextrose + cloranfenicol + ciclohexemida, Tinta da china e/ou calcofluor para C. neoformans. Colorao de Gram/ Albert Layburn, Meios de Loefler e gar cistina-telurito. Cultura em gar Sangue e gar Sangue telurito
Difteria cutnea
Corynebacterium diphtheriae
Antraz
Bacillus anthracis
Maduromicos e
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sem cloranfenicol + Cicloheximida. Ziehl-Neelsen, auramina, cultura em meio de Lowenstein-Jensen, PCR Gram, cultura do aspirado ou do tecido profundo em gar-sangue e gar Mac Conkey
QUEIMADOS
Historicamente, o estreptococo hemoltico e o estafilococo foram os microrganismos mais comumente encontrados em infeces de queimados. Com o advento dos antimicrobianos, tais infeces foram substitudas por Staphylococcus aureus oxacilina-resistentes (ORSA), bacilos Gram negativos, notadamente Pseudomonas aeruginosa e leveduras como a Candida albicans ou fungos filamentosos como Fusarium sp. Diagnstico Laboratorial A superfcie queimada contm tecido morto e fluido rico em protenas. Microrganismos da flora do prprio paciente ou do meio ambiente colonizam esta superfcie. O crescimento dos germes sobre tal superfcie continua at que esteja presente uma densa carga microbiana. Quando a concentrao bacteriana for grande o suficiente, ocorre infiltrao dos tecidos mais profundos provocando infeco generalizada com bacteremia. Os estudos sugerem que a ocorrncia de invaso, seguida de complicaes est associada contagem bacteriana de 105 UFC/grama de tecido. Isto leva ao desenvolvimento de mtodos quantitativos, tanto em esfregaos como em culturas como tambm para as bipsias cirurgicamente removidas das queimaduras. Foi demonstrado que culturas somente de tecidos superficiais so inadequados e freqentemente enganosos. Conseqentemente, a cultura de tecido profundo empregada em muitos laboratrios, apesar de tal procedimento ser tambm controverso devido dificuldade na interpretao. Embora a bipsia tenha sido amplamente empregada, os resultados mostram inadequaes. As queimaduras nem sempre so colonizadas e a seleo dos stios da bipsia importante. Este conceito levou ao emprego de uma variedade de tcnicas para estimar em que profundidade os microrganismos se disseminam. Tais mtodos incluem uma variedade de tcnicas histopatolgicas e microbiolgicas. Cultura e bacterioscpico quantitativo - o esfregao e a cultura quantitativa so realizadas com bipsias removidas cirurgicamente da queimadura. Enquanto alguns preferem no mnimo 0,5g de tecido outros aceitam uma poro menor. Escolhe-se uma rea com sinais de infeco, aps limpeza do local retira-se um fragmento de tecido vivo que deve ser acondicionado em recipiente estril. No laboratrio a bipsia pesada, empregando-se balana com preciso de 0,001 g. O tecido ento homogeneizado em caldo ou salina com volume conhecido utilizando-se um liqidificador ou homogeinizador eltrico. O material diludo razo de 10 at 10-5 (peso/vol.) e semeado em vrios meios de cultura, incluindo o gar sangue e gar Mac Conkey e em casos suspeitos cultura para bactrias anaerbias estritas. Os germes isolados so identificados e submetidos a estudos de sensibilidade. E o valor quantitativo de cada microrganismo isolado calculado a partir do peso inicial da bipsia e da diluio empregada. Os mtodos para testar a sensibilidade de drogas de uso tpico foram desenvolvidos, porm no so de emprego rotineiro por falta de padronizao e porque o significado clnico continua duvidoso. O bacterioscpico quantitativo pode ser realizado ao mesmo tempo, segundo o mtodo desenvolvido por Magee e cols. Uma quantidade conhecida do homogeneizado espalhada por uma rea total de 1 cm2 em uma lmina e deixado para secar. A colorao feita e 10 campos so examinados com objetiva de imerso com aumento de 100 vezes. Uma srie de clculos permite a determinao de contagem bacteriana em termos de microrganismos por grama de tecido. Tcnicas histopatolgicas - as tcnicas histopatolgicas foram usadas para detectar infeces fngicas e na tentativa de localizar o microrganismo no tecido queimado. Os mtodos histopatolgicos apresentam uma srie de desvantagens: A quantidade do tecido examinado muito pequena sendo limitado para pequenos cortes feitos a partir de bipsia.
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O reconhecimento do germe em corte histolgico muito mais difcil em lminas coradas necessitando de microscopista experiente. A concentrao bacteriana necessria para permitir seu reconhecimento embora ainda no estabelecida parece ser ao redor de 105 UFC ou mais por grama de tecido. O mtodo histopatolgico necessita de cultura simultnea para obter a identificao e o antibiograma dos microrganismos. Embora a correlao entre cultura e exame histopatolgico, em geral, seja boa, s vezes ocorrem discrepncias.
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erradamente identificado como difteride numa cultura em caldo, a menos que se realize colorao para pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes. Quando se relata isolamento de microrganismos em feridas infectadas essencial levar-se em conta a origem da amostra clnica. Assim, todos os estafilococos coagulase-negativa isolados de feridas de esternotomia infectadas ou associados com cirurgia vascular ou de implante ortopdico, devem ser considerados como potencialmente patognicos fazendo-se o antibiograma. Inversamente, baixo nmero de estafilococos coagulase negativa associado com flora entrica em ferida infectada de inciso no clon deveria ser descartada no devendo realizar antibiograma neste caso. A razo dessa conduta que tal microrganismo no constitui problema clnico e ir desaparecer quando outros patgenos forem eliminados. Diagnstico de Infeco de Feridas Cirrgicas
Infeces Infeco ps-operatria simples Agente Etiolgico Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus grupo A, Enterobactrias, Enterococos, Bacteroides spp., Clostridium spp. Streptococcus grupo A, Staphylococcus aureus, Enterobactrias, Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Vibrio vulnificus, Bacteroides spp., Clostridium spp., cocos anaerbios, cocos microaerfilos, Fusobacterium spp. Diagnstico Laboratorial Gram, Cultura do ps, aspirado ou tecido em gar Sangue, gar Mac Conkey, Caldo tioglicolato empregando cultura em aerobiose e meio seletivo para anaerbios em ambiente de anaerobiose estrita. Gram, Cultura em aerobiose, em jarra de anaerobiose e microaerofilia (mtodo da vela) do ps ou tecido. gar sangue, gar Mac Conkey, Caldo tioglicolato, gar enriquecido e seletivo para anaerbios estritos.
INFECES COMPLICADAS E LESES CAUSADAS POR MORDEDURA: ASPECTOS CLNICOS E DIAGNSTICO INFECES COMPLICADAS
As infeces complicadas da pele e de estruturas subjacentes podem ocorrer aps cirurgia ou trauma. A classificao dessas infeces difcil devido superposio do stio anatmico afetado, ao microrganismo responsvel e manifestao clnica. Muitas destas infeces so graves, de progresso rpida, e associadas com altas taxas de mortalidade. A gangrena infecciosa doena rara onde as necroses bolhosas da pele podem estar associadas com bacteremia e leses metastticas. Esta doena freqentemente fatal. A gangrena sinergstica, s vezes referida como gangrena de Meleney, em geral uma complicao da cirurgia do trato alimentar. Tal infeco inicia-se como uma lcera prxima ferida e pode se disseminar para afetar mais a parede abdominal anterior. A gangrena gasosa est geralmente associada com Clostridium perfringens, microrganismo que tanto pode colonizar a ferida sem causar doena como pode causar celulite grave, estender-se para a musculatura evoluindo para mionecrose e, com freqncia, para o bito. Esta infeco pode estar mais associada com supurao aquosa e fina do que com exsudato purulento. Uma sndrome semelhante de necrose muscular pode ser causada por Aeromonas hydrophila e Vibrio vulnificus, enquanto a celulite pode ainda ser causada por Vibrio spp., Klebsiella spp., Escherichia coli e/ou outros anaerbios que no Clostridium spp. tais como Bacteroides spp. e cocos. A fasciite necrotizante inicia-se geralmente como ferida cirrgica do abdmen e dissemina-se lateralmente para os flancos, at a linha de mamilo e desce para a regio inguinal. O tecido que recobre a pele parece normal no incio da doena, tornando-se vermelho azulado conforme a doena progride. O ps pode ser drenado atravs da pele dos flancos ou de outras partes da ferida original. A doena de Fournier uma forma de fasciite necrotizante que afeta a regio do perneo ou escroto, onde as camadas superficiais da pele enegrecem e descamam. Pode haver envolvimento de bactrias Mod - 18
anaerbias como Bacteroides spp. Fusobacterium spp., Clostridium spp. e cocos Gram-positivos, bem como bactrias facultativas como Enterobactrias, estafilococos, enterococos. Os estreptococos microaerfilos so vistos freqentemente em sinergia gangrenar ou associados com S. aureus e membros da famlia Enterobacteriaceae. A infeco pode se complicar e estender-se para os msculos da perna quando h comprometimento vascular, assim como em pacientes com diabete mellitus. Pode existir mionecrose extensiva causada por anaerbios como Clostridium spp., cocos anaerbios e Bacteroides spp. em rea de insuficincia vascular. A flora facultativa tambm pode estar presente, incluindo Proteus spp. Diagnstico Laboratorial As bactrias comumente isoladas de feridas infectadas incluem S. aureus, S. pyogenes (grupo A), cocos anaerbios, Clostridium spp., especialmente C. perfringens, membros da famlia Enterobacteriaceae, Bacteroides spp. e Fusobacterium spp. Para pesquisa laboratorial eficiente necessita-se da coleta de volume adequado (at 5mL) de aspirado de ps ou bipsia de tecido. As amostras clnicas lquidas podem ser transportadas em tubos para transporte de anaerbios ou sacos plsticos com ambiente anaerbio; se no houver disponibilidade de nenhum desses meios de transporte, pode-se utilizar a prpria seringa onde se colheu o material clnico, enviando-se o material o mais rpido possvel ao laboratrio. Recomenda-se processar o material dentro da primeira hora. Os cortes de tecido devem ser enviados ao laboratrio em tubo com salina para manter a umidade. Tecidos para anlise microbiolgica no devem ser colocados em formol, podendo ser colocados em meio de transporte. A colorao de Gram pode indicar uma variedade de microrganismos associados com a leso e uma terapia presuntiva poder ser guiada pelo resultado do Gram. No caso particular da mionecrose causada por C. perfringens, o agente pode ser facilmente reconhecido por sua morfologia de bacilo Gram-positivo tpico com extremidade angular. Nestes casos nota-se pouca quantidade de ps na amostra. As amostras podem ser cultivadas em gar sangue ou gar Mac Conkey. Os germes facultativos comuns iro aparecer em 24 horas. O exame microbiolgico de todas essas infeces requer cultura para bactrias anaerbias, assim como para aerbios e anaerbios facultativos. Diagnstico de Infeces Complicadas
Quadro Clnico Fasciite Necrotizante Agente Etiolgico S. pyogenes ou anaerbios associados a bactrias facultativas E. coli, P. aeruginosa, P. mirabilis, Enterococcus spp., anaerbios estritos, etc. Diagnstico Laboratorial gar sangue, gar Mac Conkey, Caldo tioglicolato. gar sangue, gar Mac Conkey, Caldo tioglicolato.
Gangrena de Fournier
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Agente Etiolgico Pasteurella multocida (co e gato), Streptobacillus moniliformis (rato), Anaerbios, Capnocytophaga spp. (co), Staphylococcus aureus (co e gato) Bartonella henselae/quintana
Histologia, cultura em gar sangue com 5-10% CO2. PCR Gram, cultura de aerbios em gar sangue, gar Mac Conkey, gar chocolate e cultura em anaerobiose em meio enriquecido e seletivo para anaerbios.
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4. INFECES INTESTINAIS
INTRODUO
A doena diarrica continua a figurar como o maior problema da sade humana. Foi estimada uma ocorrncia de um bilho de episdios de diarria no mundo por ano em crianas abaixo de cinco anos de idade, resultando em 5 milhes de bitos. A diarria particularmente devastadora em crianas que sofrem concomitantemente de doenas infecciosas, como sarampo, imunodeficincia e subnutrio protica, fatores muito freqentes nos pases em desenvolvimento. Em tais pases, estima-se que a criana apresenta trs a quatro vezes mais episdios de diarria por ano do que as que vivem em pases de elevado nvel de saneamento bsico e com sistemas adequados de suprimento de gua. Embora a morbidade e a mortalidade devido doena diarrica sejam mais importantes em crianas lactentes, esta enfermidade tem impacto importante tambm em adultos. Os adultos em mdia sofrem de um a dois episdios de diarria anualmente. Este fato resulta em custos econmicos devido utilizao das fontes de recursos para sade e perda da produtividade. As causas das sndromes gastrointestinais acompanhadas de dor, diarria ou desinteria podem ser: Infecciosas, causadas por bactrias, fungos (menos freqentes), vrus, parasitas e protozorios. No infecciosas, alrgicas, causadas por erro alimentar, envenenamento, etc. O custo para se fazer um exame de fezes de qualquer paciente para todos os patgenos em potencial descritos na literatura proibitivo. Devem ser desenvolvidas estratgias para assegurar a maior taxa de positividade possvel, uma vez que a coprocultura tem um custo alto por resultado positivo. A identificao daqueles casos de doenas diarricas causadas por agentes que necessitam de terapia que no seja apenas a hidratao oral de particular importncia. Tambm importante identificar o agente etiolgico responsvel por surtos de toxinfeco alimentar, para que as tcnicas de manuseio alimentar possam ser notificadas para prevenir transmisses posteriores. A maioria dos casos de diarria comunitria em adultos de causa inflamatria e, as fezes, podem ser triadas para verificar a presena de leuccitos atravs da colorao de azul de metileno. Entretanto, a sensibilidade da pesquisa de leuccitos nas fezes menor que 90%. A ausncia de leuccitos no poder descartar agentes causadores de diarria inflamatria, mas a presena destes pode diferenciar dos agentes causadores de diarria no inflamatria, incluindo microrganismos toxignicos como Vibrios, E. coli (ETEC), agentes virais e certos agentes parasitrios. Nos meses de inverno, as crianas com diarria devem ser triadas primeiro para Rotavirus e, somente quando o exame for negativo, as amostras fecais devem ser testadas para outros patgenos bacterianos. Estudos de vigilncia realizados por Laboratrios de Referncia, como triagem de fezes para vrios agentes por um perodo de 3 a 6 meses e a avaliao do impacto destes estudos na taxa de positividade do exame de fezes, podero auxiliar na determinao de quais microrganismos devero ser includos na triagem de rotina pelos laboratrios que atendem a comunidade. Um outro papel importante que o laboratrio desempenha no controle da diarria de pacientes da comunidade na deteco de surtos de fontes comuns. O laboratrio deve notificar as autoridades da Sade Pblica toda vez que houver crescente isolamento de patgenos entricos. Por exemplo, em muitas instituies infantis como a creche, o isolamento de mais de um caso de Shigella spp. em crianas menores de cinco anos de idade, dentro de um perodo de uma semana, poder sugerir um surto de shigelose. A diarria de origem hospitalar descrita na literatura como um episdio que ocorreu aps trs dias de internao. Esta definio razovel quando se reconhece que certos pacientes, sero admitidos no hospital devido a sintomas de diarria (especialmente em crianas pequenas) ou pode ter episdio de diarria auto-limitada, geralmente induzida por vrus durante ou prximo ao momento da internao. Em crianas, o Rotavrus a causa principal de infeco hospitalar sendo este o nico agente para o qual as fezes de crianas com diarria desenvolvida no hospital devem ser rotineiramente
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pesquisadas. Em adultos, os estudos tm mostrado que o Clostridium difficile o nico agente bacteriano confiavelmente detectado em fezes de pacientes com diarria de origem hospitalar. Deve-se entender tambm que alguns pacientes, particularmente os imunocomprometidos e em destaque os portadores de HIV, podem estar infectados com mais que um agente e que o encontro de um agente infeccioso no exclui a possibilidade da presena de outros; assim, o exame deve ser realizado de forma completa.
Desinteria bacilar: Shigella spp., E. coli (EIEC) Campylobacter jejuni Desinteria amebiana: Entamoeba histolytica Outros protozorios: Balantidium coli, Giardia lamblia Parasitas: Schistosoma mansoni, Strongyloides stercoralis, Trichinella spiralis, Cyclospora spp., Microsporidium spp. Vibrio cholerae e Vibrio parahaemolyticus Febre tifide: Salmonella typhi e outras Salmoneloses Yersiniose - Yersinia enterocoltica Proctite gonorreica, sifiltica, por Chlamydia e herptica
Diarria
- Intoxicao alimentar por Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum - E. coli enterotoxigenica (ETEC) - E. coli enterohemorrgica (EHEC) - E. coli enteropatognica (EPEC) - E. coli entero-agregativa (EaggEC) - E. coli difusamente aderente (DAEC) - Enterocolite necrotizante do recm-nascido, enterocolite pseudomembranosa (Clostridium difficile), diverticulite, tiflite ou enterocolite do neutropnico/ imunossuprimido - Helicobacter pylori - Rotavirus - Norwalk vrus
Nas ltimas duas dcadas o conhecimento sobre agentes virais, bacterianos e protozorios e os mecanismos pelos quais a diarria produzida (induzida) expandiu-se bastante. Por exemplo: Retocolite ulcerativa e doena de Crohn. Diarria crnica causada por Cryptosporidium spp. e por Isospora spp., reconhecidos como um dos maiores problemas em pacientes aidticos Surtos de diarria devido contaminao da rede de gua pblica com Giardia lamblia. A deteco do patgenos entricos bacterianos complicada pela presena de microflora fecal normal abundante e complexa. Tal flora aparece logo aps o nascimento, envolvendo o intestino grosso durante o primeiro ms de vida, principalmente em resposta mudana da dieta alimentar. Por volta do primeiro aniversrio, a microflora intestinal totalmente estabelecida e permanece durante a vida inteira, a menos que seja induzida uma grande mudana pela terapia antimicrobiana. A flora fecal obtida de adulto normal contm entre 1011 -1012 microrganismos por grama de fezes, das quais 99% so anaerbios estritos, predominantemente os pertencentes aos gneros: Bacteroides, Fusobacterium, Bifidobacterium, Eubacterium e Propionibacterium. Quando comparados com a microflora fecal facultativa, esta mais modesta em nmero e variedade, com 108 - 109 organismos por grama de fezes. O desafio para o microbiologista clnico a tentativa de detectar vrios enteropatgenos em meio incrivelmente complexo. As infeces intestinais ocorrem em funo de fatores ligados ao hospedeiro, como baixa acidez gstrica que reduz significativamente a dose infectante, como sua microbiota, imunidade, motilidade, etc. E fatores ligados ao agente, destacando-se os fatores de virulncia e inculo.
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ESCHERICHIA COLI
As cepas mais importantes com potencial de causar diarria so: E. coli enterohemorrgica (EHEC) ou produtora de toxina Shiga, E. coli enterotoxinognica (ETEC), E. coli enteropatognica (EPEC) e E. coli enteroinvasora (EIEC). Outras E. coli produtoras de toxina e outros fatores de virulncia, como a E.coli enteroagregativa (EaggEC) foram descritas, mas de importncia clnica ainda no bem definida. EHEC - E. coli produtoras de toxina Shiga (verocitotoxina) caractersticas so a O157:H7, mas mais de uma centena de outros sorotipos podem produzir esta toxina. A E. coli O157:H7 a mais bem estudada e esta relacionada a sndrome hemoltico urmica, caracterizada por trombocitopenia, anemia hemoltica einsuficincia renal aguda. Em geral encontrada em produtos de origem animal como carne, leite e derivados, mas pode tambm ser disseminada atravs de gua no clorada, alimentos, etc. Dose infectante baixa, por isso pode ser transmitida de pessoa a pessoa. A sorotipagem o mtodo de triagem mais comum, existindo antisoro especfico para O:157 (simples) ou teste com partculas de latex, devendo a cepa ser enviada ao laboratrio de referncia para confirmao. ETEC - E. coli produtoras e enterotoxinas LT e ST, no so distinguidas de outras E. coli por mtodos bioqumicos e sua caracterizao somente realizada por laboratrios de referncia, o que dificulta seu diagnstico. comum em crianas e uma das causas da diarria dos viajantes. Raramente encontrada em surtos. EPEC - As E. coli enteropatognicas conhecidas como clssicas, so dezenas de sorotipos de E. coli no produtoras de enterotoxina e no invasoras, que so causa freqente de diarria em crianas em pases em desenvolvimento, podendo ocorrer em surtos hospitalares. O quadro clnico caracterstico a diarria severa, no sanguinolenta, prolongada, associada m-absoro e desnutrio. O diagnstico realizado por triagem com soros polivalentes contendo anticorpos contra antgenos somticos (O) e capsulares (K) especficos para os sorotipos prevalentes. Existem comercialmente soros monovalentes para caracterizao especfica. A sorotipagem pode dar resultado falso positivo, que pode ser reduzido com sorologia para antigenos H ou provas de virulncia em Laboratrios de referncia . EIEC - So E. coli que invadem as clulas epitelias do clon, causando sndrome semelhante causada pela Shigella com diarria aquosa, clica e eventualmente diarria sanguinolenta. So menos freqentemente isoladas que as E. coli anteriormente descritas. Em geral as cepas so lisina desaminase negativas e imveis. Existem comercialmente soros polivalentes e monovalentes contra os sorotipos prevalentes. A durao do perodo de incubao pode sugerir alguma etiologia especfica principalmente quando h surtos.
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A procura do agente etiolgico de diarria, desenteria ou dor abdominal, deve-se contar com a colaborao importante do mdico, dando informaes clnicas e se possvel a suspeita clnica para orientar quais os agentes a serem pesquisados. Constituem informaes importantes: Idade do paciente Principais sintomas: diarria, presena de sangue, pus ou muco, tenesmo, dor abdominal, freqncia e volume das evacuaes, febre, quadro simultneo em outras pessoas do convvio. imunossuprimido? Diarria aps uso de antibiticos? etc. Pedido especfico quando suspeitar de agentes como clera e campylobacter. No exame proto-parasitolgico necessrio especificar a pesquisa de Cryptosporidium spp. e Isospora belli.
Disenteria (muco, sangue e pus, com dor a evacuao): amebase, shigelose, E. coli (EIEC). Fezes com sangue, sem leuccitos fecais: deve-se suspeitar de EHEC (O157:H7), pode estar acompanhada de sndrome hemoltico-urmica, principalmente em crianas. Existe a possibilidade de amebase. Diarria sanguinolenta com leuccitos: salmonelose, campilobacteriose, shigelose e E.coli (EIEC). Diarria secretria, cujo quadro importante a desidratao podendo evoluir para o choque e cujas fezes apresentam aspecto de gua de arroz, sugerindo o diagnstico de clera. Diarria e vmito significativo, em crianas pequenas sugere Rotavirus. Diarria crnica ou subaguda, com ou sem flatulncia, pode-se direcionar o exame para o diagnstico de giardase. Outras causas de (>10 dias), com perda de peso, lembrar de ciclosporiase e criptosporidiose. Ou na suspeita de uma sndrome apendicular pode-se sugerir uma yersiniose.
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Intoxicao com incubao de curta durao, acompanhado de vmito, pode-se sugerir uma intoxicao de origem alimentar causada por toxina de Staphylococcus aureus ou Bacillus cereus. Dor abdominal sugerindo apendicite, lembrar de Yersinia enterocoltica. Diarria acompanhada de artrite: Yersinia enterocolitica Em pacientes imunossuprimidos considerar: Vrus: Citomegalovirus, Herpes simplex virus, virus Coxsackie, Rotavirus, Bactrias: Salmonella spp., complexo Mycobacterium avium Parasitas: Cryptosporidium spp., Isospora belli, Strongyloides stercoralis, Entamoeba coli, e Giardia lamblia.
Em surtos de gastroenterocolite, deve ser considerada a presena dos seguintes patgenos: S. aureus, B. cereus, C. perfringens, Cryptosporidium spp., ETEC, Vibrio spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp., EIEC e Cyclospora spp. Na toxi-infeco alimentar, a doena resulta da ingesto direta de enterotoxinas pr-formadas no alimento contaminado, sendo os exemplos mais comuns o Staphylococcus aureus enterotoxignico, B. cereus e C. perfringens. Gastroenterite viral a segunda maior causa de doena em pases desenvolvidos, aps as infeces virais do trato respiratrio; e o Rotavirus a maior causa de gastroenterite viral em pases desenvolvidos e em desenvolvimento. Mecanismos de patogenicidade dos principais agentes de diarria
Produo de Toxina Aeromonas, Bacilus cereus Clostridium difficile, C. perfringens E. coli enterotoxinogenica ETEC E coli enterohemorrgica EHEC Staphylococcus aureus Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus Invaso Campylobacter spp. E. coli enteroinvasora Plesiomonas shigeloides Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia enterocolitica Adeso E. coli enteropatognica E. coli enteroaderente E. coli enterohemorragica
Isolamento nas fezes ou no alimento: 105 UFC/g. Bacillus cereus (Seletive Medium Oxoid). Idem
6-24 h
2-5 at 10 d
Diarria geralmente sanguinolenta, dor abdominal e febre. Disturbios visuais, fraqueza progressiva, com paralisia descendente e bilateral. Sem diarria. Diarria, clicas abdominais.
Clostridium botulinum
Clostridium perfringens
6-24 h
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6% das crianas com sindrome hemoltico-urmica, adultos. Prpura trombocitopnica e insuficincia renal aguda; diarria sanguinolenta caracterstica , fortes clicas abdominais. Diarria, naseas, clicas abdominais.
Isolamento de E.coli O157:H7 nas fezes e/ou alimento (soroaglutinao) CHROmagar O157.
6-48 h
Coprocultura para isolamento e testes p/ enterotoxina ST/LT. Coprocultura para isolamento e sorotipagem. Coprocultura para isolamento e sorotipagem.
Varivel
Diarria, febre, clicas abdominais. Diarria que pode se sanguinolenta, febre, clicas abdominais. Diarria, febre, clicas abdominais.
Varivel
9-32 h
Coprocultura em caldo de enriquecimento (caldo Fraser, caldo Listeria-Oxoid) e meio seletivo (Listeria Seletive Medium / Oxoid). Coprocultura em caldo de enriquecimento e meios seletivos; titulos de anticorpos especficos. Coprocultura em caldo de enriquecimento e meios seletivos Salmonella-Shigella, Hektoen. Coprocultura com caldo de enriquecimento e meios seletivos (SalmonellaShigella). Coprocultura em meio seletivo (Baird-Parker, Vogel-Johnson ou gar manitol sal) e demonstrao de toxina. Coprocultura em meio seletivo (gar TCBS) e isolamento de cepa produtora de toxina. Coprocultura em meio TCBS. Isolamento em meio seletivo ou Salmonella-Shigella com incubao em geladeira.
Salmonella typhi
Outras salmoneloses
Shigella spp.
12 h a 6 d mdia: 2-4 d
Diarria com tenesmo, muco, mltiplas evacuaes de pequeno volume, clicas e febre.
Staphylococcus aureus
1-5 d
Vrus
Agente etiolgico Incio dos sintomas 15-77 h mdia: 1-2 d Dados clnicos mais comuns Diagnstico
Rota vrus
Inicio sbito, com vmitos e diarria, principalmente em crianas, ocasionalmente dor abdominal e sintomas respiratrios. Surtos hospitalares.
Testes por aglutinao com particulas de ltex ou Elisa Imunoensaio (EIA) com anticorpos poli ou monoclonais.
Mod - 26
Parasitas
Agente etiolgico Incio dos sintomas 2-28 d mdia: 7 d 1- 11 d mdia: 7 d 3-25 d mdia: 7 d Dados clnicos mais comuns Diagnstico
Cryptosporidium parvum
Cyclospora cayetanensis
Giardia lamblia
DIAGNSTICO LABORATORIAL
Uma histria de emprego recente de antibioticoterapia prolongada deve ser considerada para direcionar a pesquisa de toxina de Clostridium difficile como uma das etiologias. Outras possibilidades so o S. aureus, Candida spp. e P. aeruginosa. Os antibiticos mais frequentemente associados diarria por C. difficile so: cefalosporinas, ampicilina, amoxicilina, outros derivados de penicilinas, macroldeos, tetraciclinas e sulfazotrim. Quando possvel selecionar pores de fezes contendo muco, e/ou sangue e/ou ps. A pesquisa de eosinfilos no muco positiva sugestiva de diarria de causa alrgica. Diarria por toxina tem curta durao, pesquisa de leuccitos, sangue e presena de muco negativa. Diagnstico laboratorial difcil, pois o agente costuma no estar presente. Para cultura de Campylobacter h necessidade de meio de cultura especfico. Pesquisa de leuccitos e eosinfilos: deve-se enviar fezes frescas para exame (no swab) ou em meio de transporte.
MEIOS DE TRANSPORTE
Salina glicerinada e tamponada indicada para Salmonella e Shigella. Cary Blair indicado para todos os patgenos bacterianos intestinais, exceto Shigella. No caso do Clostridium difficile, as fezes devem ser congeladas a menos 20oC ou submetidas ao teste rapidamente. Fezes e aspirados gastrointestinais podem ser transportados sob refrigerao em frascos estreis, e bipsias podem ser conservadas com um pouco de salina em frasco estril. Em geral o meio de transporte inviabiliza a pesquisa de leuccitos nas fezes, sugestivo de agente invasor. Materiais inapropriados para processamento: fezes ou material do trato digestivo transportado a temperatura ambiente sem meio de transporte, swab seco ou sem sinais de fezes, bipsias secas. Quando no houver informaes clnicas ou pedido especfico, a rotina recomendada a pesquisa dos seguintes agentes: Salmonella, Shigella, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia: podem ser isolados em Mac Conkey e Salmonella-Shigella. Recomenda-se tambm incluir a cultura para Campylobacter, que exige meio especfico. No caso de fezes com sangue, pesquisar EHEC. Em coprocultura de crianas at 1 ano considera-se rotina a pesquisa de Salmonella, Shigella, EPEC, (E. coli enteropatognica), EIEC (E. coli enteroinvasora) e EHEC (E. coli enterohemorrgica). Deve-se incluir tambm a pesquisa de Yersinia enterocoltica, Aeromonas e Plesiomonas.
Mod - 27
RELATRIO DE RESULTADOS
Com o reconhecimento do nmero crescente de agentes bacterianos causadores de diarria, tornou-se importante a identificao especfica de microrganismos para o qual as amostras fecais so examinadas. incorreto emitir o resultado como no foram isolados patgenos, se as fezes foram cultivadas somente para recuperar alguns patgenos. Ao invs disso o relatrio deve afirmar no foram isoladas Salmonella, Shigella e Campylobacter ou para algum outro patgeno efetivamente pesquisado. O protocolo dever prever tambm laudos relatando a ausncia da flora fecal Gram negativa e a presena de quantidade significativa de microrganismos como S. aureus, leveduras e Pseudomonas aeruginosa. Se as amostras fecais ou as cepas isoladas forem enviadas ao Laboratrio de Referncia para trabalho posterior, tais como pesquisa da presena de toxina de C. difficile ou sorotipagem de cepas de Salmonella, o relatrio para os referidos exames deve incluir o nome do laboratrio de referncia e as provas realizadas (sorotipagem determinao das toxinas, etc.) Procedimentos Gerais para o Isolamento dos principais Agentes Bacterianos de Infeco Intestinal
Microrganismo Mecanismo de Patogenicidade Invaso Tcnica Enriquecimento Meios de cultura
Campylobacter, C. jejuni
no
gar p/ Campylobacter com suplementos de antibiticos como o meio de Skirrow, CampyBAP(Blaser), etc.
No
Mod - 28
no
gar diferencial: gar Mac Conkey sorbitol (SMAC) ou gar Mac Conkey gar Salmonella-Shigella, Mac Conkey ou gar xilose-lisinadesoxicolato (XLD) ou gar Hektoen enterico (HE) gar TCBS, cresce em Mac Conkey.
Selenito F *, Caldo tetrationato *, Caldo GN *. gua peptonada alcalina por 6-12 h. Salina glicerinada tamponada 45C por trs semanas, no recomendado.
Yersinia enterocolitica
Invaso
gar Salmonella-Shigella, gar Mac Conkey e meio seletivo: gar cefsulodina- irgasannovobiocina
* atualmente questiona-se a necessidade do uso de caldos de enriquecimento, ficando a critrio de cada usurio.
Mod - 29
5. INFECES ABDOMINAIS
AGENTES MICROBIANOS MAIS FREQUENTES
Intrabdominais (peritonite ps-trauma de vsceras ocas): Enterobactrias (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp.), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Anaerbios (Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., Peptostreptococcus spp., Propionibacterium spp.). Abscesso intrabdominal: incluindo apendicite, diverticulite. As mesmas bactrias do tem anterior, e ainda: Clostridium spp., Eubacterium spp., S. pyogenes e Streptococcus spp. Peritonite Bacteriana Espontnea Primria: Enterobactrias (2/3), S. pneumoniae (15%), enterococos (6-10%) e anaerbios < 1%. Peritonite associada a dilise peritonial crnica: S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, enterobactrias e 20% estril. Infeces hepticas, incluindo abscessos: Streptococcus spp., Escherichia coli, Proteus spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Enterococcus spp., Entamoeba histolytica, Leishmania donovani (kalazar), microsporidiose. Granuloma heptico: M. tuberculosis, Mycobacterium spp., Brucella spp., Histoplasma capsulatum, Coxiella burnetii, T. pallidum (sfilis secundria), Echinococcus spp., Schistosoma spp., Citomegalovrus, vrus Epstein-Barr. Pacientes da America do Norte ou outros continentes pode-se incluir a Francisella tularensis e Coccidioides immitis. Infeces pancreticas: E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Trulopsis glabrata, Haemophilus spp., Corynebacterium spp., Serratia marcescens. Abscesso esplnico: os anteriores, e ainda Salmonella spp., Shigella spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Propionibacterium spp., Clostridium spp., Fusobacterium spp., Aspergillus spp., Leishmania donovani, microsporidiose.
Mod - 30
gar chocolate suplementado - incubar a 35C em jarra com 5% CO2 durante 18 a 24 horas, verificando o crescimento bacteriano; se negativo, reincubar; se positivo, proceder a identificao do microrganismo. Meios de cultura para bactrias anaerbias estritas: gar infuso de crebro corao ou Brucella gar acrescido de vitamina K e hemina - incubar a 35C em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 hs; verificar crescimento; se negativo, repicar a amostra do tioglicolato suplementado com hemina e vitamina K a cada 48 h at completar 7 dias; se positivo, proceder identificao da bactria. Pode-se semear em paralelo em meio seletivo e enriquecido para anaerbios como o gar sangue com hemcias rompidas, adicionado de Kanamicina e Vancomicina (LKV) seletivo para Bacteroides e Prevotella. Se houver suspeita clnica de micobactrias, semear tambm em meios especiais (Lowenstein Jensen ou Middlebrook); aguardar 60 dias para diagnosticar a cultura como negativa. Se houver suspeita clnica de fungos, semear tambm em gar Sabouraud glicose; incubar a temperatura ambiente durante 4 semanas.
Mod - 31
Via de acesso dos agentes infecciosos ao SNC Via hematognica (principal) Via direta, atravs de trauma e procedimentos invasivos (cirrgicos) Por contiguidade (rinofaringe, mediastino posterior, espao retroperitonial, etc.) Ascenso de vrus por nervos perifricos Principais causas de meningite aguda infecciosa Bacteriana: bacterioscopia positiva (Gram), cultura e/ou pesquisa de antgenos positiva. S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, Enterobactrias, Streptococcus agalactiae (grupo B), Listeria monocytogenes, Staphylococcus spp., M. tuberculosis Meningite por outros agentes ou no determinada Foco supurativo para-menngeo (abscesso cerebral, sinusite paranasal, empiema subdural, abscesso epidural, etc.) Espiroquetas: T. pallidum, Borrelia burgdorferi (doena de Lyme, Leptospira spp.) Rickettsias Protozorios: Naegleria fowleri, Strongiloides stercoralis Vrus: Echovirus e Coxackievirus, Sarampo, Arbovrus, Herpesvrus, Coriomeningite linfoctica, HIV, Adenovrus, Poliovrus Fungos: Cryptococcus spp., Candida spp., Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. e outros fungos filamentososos oportunistas Pneumocistis carinii e Paracoccidioides brasiliensis Causas mais frequentes de meningite infecciosa crnica Meninges tuberculose cryptococose histoplasmose candidase sfilis brucelose Leses Focais actinomicose blastomicose cisticercose aspergilose nocardiose esquistossomose toxoplasmose Encefalite citomegalovrus enterovrus sarampo outras encefalites a vrus
Mod - 32
Principais agentes etiolgicos do Abscesso Cerebral Streptococcus spp. (viridans) Bacteroides spp. Enterobactrias Staphylococcus aureus Fungos S. pneumoniae H. influenzae Nocardia spp., Listeria spp. Protozorios e helmintos 60-70% 20-40% 23-33% 10-15% 10-15% <1% <1% <1% <1%
Em populaes de pacientes imunocomprometidos e distribuies regionais podem evidenciar predomnio diferente dos seguintes agentes etiolgicos: Bactrias: M. tuberculosis e Nocardia spp. Fungos: Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp. e outros fungos oportunistas Parasitas: estrongiloidase, Entamoeba histolytica, cisticercose e toxoplasmose
Idade
0 a 4 semanas - E. coli, S. agalactiae (grupo B), L. monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus spp. e Herpes simplex virus 2 4-12 semanas - S. agalactiae, E. coli, L. monocytogenes, H. influenzae 3 meses a 10 anos - vrus, pneumococo, H. influenzae e meningococo, enterovirus, herpes vrus 1. Adulto jovem - vrus e meningococo Adulto - pneumococo e meningococo Idosos - pneumococo, Gram negativos, Listeria monocytogenes.
INFECO HOSPITALAR
Enterobactrias, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Candida spp., Staphylococcus spp.
Mod - 33
Pneumococo, hemfilos Pneumococo, Haemophilus, anaerbios Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Anaerbios (Actinomyces spp. e outros), Nocardia spp. Fechado - pneumococo, Gram negativos Aberto - Gram negativos, Staphylococcus spp. Pneumococo, Gram negativos, Staphylococcus spp., Haemophilus influenzae Pneumococo, Gram negativos, Staphylococcus spp., Cryptococcus spp. Pneumococo Streptococcus spp. e outros Gram positivos Meningococo, sarampo, echovrus, leptospirose S. Epidermidis, S. aureus e outros gram positivos, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., enterobactrias Pneumococo, Gram negativos, Cryptococcus spp., M. tuberculosis Cryptococcus spp., M. tuberculosis, Aspergillus spp. e outros fungos filamentosos, Pneumocistis carinii
Sepse dental Trauma craniano penetrante infeco pscirurgica Doena cardaca congnita
Mod - 34
Fusobacterium spp., Actinomyces spp., Bacteroides spp., Streptococcus spp, Nocardia spp Staphylococcus aureus, Streptoccoccus spp. Toxoplasma gondii, Fungos, Enterobactrias, Nocardia spp.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
DADOS LABORATORIAIS RELEVANTES
Gram do sedimento pode revelar a etiologia: bacteriana, fngica (fungos leveduriformes ou filamentosos), tendo uma sensibilidade de 60 a 90% e especificidade prxima de 100% quando realizada por profissionais bem treinados. A positividade depende da concentrao bacteriana, variando de 25% quando a concentrao de UFC (unidades formadoras de colonias) for 103 ou menos, at 97% quando a concentrao for igual ou superior a 105 UFC. A positividade do Gram tambm varia conforme o agente etiolgico, sendo de 90% para o pneumococo, 86% para o hemfilos, 75% para o meningococo, menos de 50% para Listeria monocytogenes e 50% para outros Gram negativos. A colorao de Gram no cora bactrias como os micoplasmas e, evidentemente, no detecta os vrus. Chances de se obter informaes sobre a etiologia pelo Gram ou pela cultura se reduzem a menos de 50% quando h uso prvio de antimicrobianos, podendo o LCR ficar estril em 90-100% dos casos aps 24 a 36 horas de antibioticoterapia adequada. Tinta da china e calcofluor: detecta Cryptococcus ou presena de movimentos amebides (amebas) Colorao de Ziehl Neelsen e auramina: micobactrias Aglutinao com partculas de ltex (sensibilidade de 70 a 90%): existem testes disponveis para detectar meningococo (A e C), hemfilos tipo B, pneumococo (polivalente), Streptococcus do grupo B, E. coli K1 e Cryptococcus spp. Alguns kits no incluem o meningococo B ou podem ter uma sensibilidade inferior para este antgeno. Existem tambm testes baseados em coaglutinao de Staphylococcus, que tem uma sensibilidade um pouco inferior aglutinao pelo ltex. Estes testes vem sendo cada vez menos utilizados pelo elevado custo. Teste do Limulus pode ser utilizado para detectar endotoxina de bactrias Gram negativas, tendo alta sensibilidade e especificidade para concentraes 103 UFC/ml. Cultura em gar chocolate pode confirmar a etiologia bacteriana e permitir o estudo das sensibilidades aos antimicrobianos. Os vrus podem ser pesquisados por mtodos diretos ou cultura para vrus com tipagem. A pesquisa monoclonal e o PCR representam os mtodos de maior praticidade, especificidade e sensibildade que se dispe na atualidade.
Mod - 35
um tubo com gar sangue (base Mueller Hinton ou gar brucella) e um tubo com caldo tioglicolato caso haja suspeita de anaerbios 2 ml para exame direto e cultura para fungos (se indicado) 2 ml para colorao de Ziehl e cultura para micobactrias (se indicado) 2-3 ml para provas virolgicas (se indicado)
Exame da cultura Durante 72 horas observe diariamente a presena de crescimento nas placas e tubos com gar chocolate. Pode-se prolongar a incubao para o total de sete dias. No tubo com caldo deve ser observada turvao diariamente e descartado aps 7 dias. Caso haja crescimento, fazer um Gram e semear em placa de gar chocolate para isolamento, identificao e antibiograma. Em casos de hemfilos e neisserias fazer o teste da beta-lactamase com discos de nitrocefina (Cefinase) Se positivo, comunicar o mdico imediatamente. Em caso de pneumococos, testar a penicilina usando discos de oxacilina 1 micrograma. Se halo para oxacilina 20mm, a cepa sensvel penicilina. Halo 19 mm encaminhar a cepa a um Laboratrio de Referncia ou fazer teste da Concentrao Inibitria Mnima (CIM), podendo ser usado o E-test: Penicilina 0,06 microgramos/ml = cepa sensvel Penicilina 0,12 a 1 microgramos/ml = cepa de sensibilidade intermediaria. Penicilina 2,0 microgramos/ml = cepa resistente Interpretao do exame Contagem de glbulos brancos = > 1.200 mm3 sugere meningite bacteriana (valores menores no excluem). Predomnio de mononucleares (< 50% de neutrfilos) sugere meninigite no bacteriana ou parcialmente tratada. Glicose < 30 mg/100 ml sugere meningite bacteriana, por micobactria ou fngica. Protenas >150 mg/100 ml sugere meningite bacteriana. Cloretos < 110 mEq/L sugere meningite por tuberculose se afastada outra etiologia bacteriana. Atualmente pouco utilizado devido a disponiblidade de testes mais especficos. Lactato no LCR > 35 mg/100 ml sugestivo de meningite bacteriana.
PESQUISA DE ANTGENOS
Pode detectar a presena de microrganismos, mesmo na vigncia de antibioticoterapia. Os testes detectam polissacrides em suspenso, por isso deve-se usar o sobrenadante. Alguns testes solicitam prvia colocao da amostra para teste em banho-maria (fervente) por 5 minutos. Consulte e siga as orientaes do produto adquirido. Colocar as gotas de ltex no carto, orientando-se conforme a indicao de cada teste. A seguir depositar uma gota do sobrenadante do LCR ao lado da gota de latex. Usar um basto ou ala flambada para cada teste. Observar a aglutinao conforme padro e no tempo descrito por cada fabricante. Aglutinaes que ocorrerem com mais de um anticorpo devem ser relatadas como indeterminadas ou no interpretvel. Pode-se tentar diluir o LCR em salina 1:2 ou 1:4. Repetir os testes e observar os resultados. Rotina de Planto Se no for possvel encaminhar ao Laboratrio de Microbiologia (planto de fim de semana) ou porque sua rotina lenta, o LCR deve ser processado pelo laboratrio de urgncia (planto) ou por mdicos ou analistas treinados para os seguintes procedimentos: Colher 5 a 10 gotas do LCR diretamente da puno em 1 tubo de gar chocolate de preparao recente e previamente aquecido a 35oC ou: Mod - 36
Centrifugar 1 a 2mL do LCR entre 2.500 a 3.000 rpm, por 15 minutos. Cuidadosamente, flambar a boca do tubo e em condies asspticas (fluxo laminar ou atrs de um bico de Bunsen), e, para os testes de aglutinao aspirar 0,5 a 1mL do sobrenadante com ponteira estril (ou pipeta plstica estril ou pipeta Pasteur com ponta fina de vidro, conectada a um bulbo de borracha ou pra de aspirao). Deixar 0,5 a 1mL para cultura e Gram. Flambar novamente. Agitar no vortex o tubo com o resto do sobrenadante e sedimento. Em condies asspticas (vide acima), semear 3-4 gotas do material em placa de gar-chocolate e, se disponvel, tambm em placa de gar-sangue e em tubo com caldo tioglicolato sem indicador. Colocar as placas e tubo na estufa entre 35 a 37oC, sendo a placa de gar chocolate em jarra com vela e umidade (CO2 e umidade). Depositar 1 gota do material no centro de uma lmina de vidro previamente desengordurada em lcool, para fazer o esfregao. no caso de amostras lmpidas, pode-se depositar duas gotas e fazer esfregao menos extenso, quando mais purulento, fazer esfregao mais espalhado. deixar secar e fixar rapidamente no calor fazer a colorao de Gram e anotar o resultado
Mod - 37
7. INFECES SISTMICAS
INTRODUO
A presena de microrganismos viveis no sangue do paciente pode levar a um considervel aumento da morbidade e da mortalidade. Devemos tambm lembrar que este fato representa uma das mais importantes complicaes do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame de significativo valor preditivo de infeco. A maioria dos episdios spticos de origem hospitalar e, s vezes, resultado de microrganismos que apresentam grande resistncia aos antimicrobianos, com uma mortalidade bem superior aos episdios que ocorrem na comunidade. A invaso do sangue por microrganismos geralmente ocorre por um dos seguintes mecanismos: 1. 2. Penetrao a partir de um foco primrio de infeco, atravs de vasos linfticos e da at o sangue. Entrada direta na corrente sangunea, via agulhas ou outros dispositivos vasculares, como catteres.
A presena de bacteremia ou fungemia representa tambm uma falha nas defesas do hospedeiro em localizar e neutralizar uma determinada infeco em seu foco inicial, ou tambm numa eventual falha mdica em remover ou drenar um foco infeccioso. Geralmente, num paciente imunocompetente, as defesas naturais respondem prontamente presena de microrganismos estranhos. Esta eliminao pode ser menos eficiente quando os microrganismos so encapsulados, ou mais eficiente quando o paciente j apresenta anticorpos contra o organismo infectante. Existem tambm situaes em que esta eliminao no eficaz, como nos casos de infeces com focos intravasculares ou em endocardites. Conceitualmente, ainda se classificam as bacteremias em transitria, intermitentes ou contnuas. A do tipo transitria, que em geral rpida com durao de alguns minutos a poucas horas, a mais comum e ocorre aps uma manipulao de algum tecido infectado (abscessos e furnculos), durante algum procedimento cirrgico que envolve algum tecido contaminado ou colonizado (cavidade oral, cistoscopia, endoscopia) ou ocorre em algumas infeces agudas como pneumonia, meningite, artrite e osteomielite. Quando a bacteremia se manifesta, com intervalos variveis de tempo (com o mesmo microrganismo) denominada de intermitente. Geralmente este tipo de bacteremia ocorre em processos infecciosos relacionados a abscessos intra-abdominais, pneumonias e outras. A bacteremia contnua caracterstica da endocardite infecciosa e de outras infeces intravasculares. As bacteremias na grande maioria das vezes so causadas por um nico microrganismo, porm em algumas situaes so de etiologia polimicrobiana. Embora qualquer infeco localizada possa se disseminar para o sangue, a bacteremia e/ou fungemia geralmente so mais freqentemente devidas dispositivos intra-vasculares (catteres), infeces abdominais, infeces dos tratos respiratrio e urinrio. Bacteremia e fungemia so termos que simplesmente identificam a presena de bactrias ou fungos no sangue. Sepse a presena de sintomas clnicos de infeco na presena ou no de hemocultura positiva.
Mod - 38
Destacam-se as prevalncias de S. aureus e de E. coli, sendo que na ltima dcada nota-se um significativo aumento na incidncia de casos devidos a estafilococos coagulase negativos, o que pode causar dificuldade na interpretao dos resultados microbiolgicos, pois cerca de 85% destes isolamentos podem representar contaminao ao invs de uma bacteremia verdadeira. Entre os agentes que na ltima dcada se tornaram prevalentes, destacam-se os enterococos, os fungos e as micobactrias relacionadas aos pacientes portadores do HIV. As bacteremias causadas por bactrias anaerbias so muito raras. Em crianas, o perfil de microrganismos assemelha-se ao da populao adulta (os microrganismos so similares aos que ocorrem na populao adulta), mas h uma maior prevalncia de bacteremias por estafilococos, e , principalmente, por S. pneumoniae, meningococos e hemfilos. A identificao do microrganismo isolado fornece um valor preditivo importante. Alguns microrganismos em cerca de 90% dos casos sugerem uma infeco verdadeira como S. aureus, E. coli e outras enterobactrias, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae e Candida albicans. Outros agentes como Corynebacterium spp., Bacillus spp. e Propionibacterium acnes, raramente representam uma verdadeira bacteremia (menos de 5% dos casos so verdadeiros). Os S. viridans, Enterococos e Staphylococcus coagulase negativos representam em mdia respectivamente 38%, 78% e 15% de bacteremias verdadeiras. Considera-se aceitvel um percentual entre 3 a 5% de hemoculturas contaminadas. Patgenos raros relacionados imunossupresso causada por cncer ou leucemia Aeromonas hydrophila Bacillus spp. Campylobacter spp. Capnocytophaga spp. C. septicum Corynebacterium jeikeium L. monocytogenes Mycobacterium fortuitum/chelonei Rhodococcus equii S. typhimurium Streptococcus do grupo G Streptococcus bovis
VOLUME DE SANGUE
uma das variveis mais crticas para a positividade do exame. Quanto maior o volume coletado, maior ser a positividade do mesmo. Temos que respeitar a idade do paciente (adulto ou criana) e o volume recomendado de acordo com os tipos de frascos aerbios e anaerbios utilizados na realizao dos exames. O volume recomendado para coleta de cada puno de adulto de 20 a 30 ml, distribudos pelo nmero de frascos indicados pela sua capacidade e respeitando a proporo de 1 ml de sangue para cada 10 ml ou no mnimo 5 ml de caldo.
Mod - 39
Como as bacteremias em crianas tem cerca de 100 a 1000 bactrias/ml em comparao com < 1 a 10 bactrias/ml nos adultos, o volume pode ser menor (3 a 5ml), respeitando-se tambm a proporo de no mnimo 1:5 at 1:10 de sangue e meio de cultura ou orientao do fabricante.
Mod - 40
No necessrio repicar amostra negativa Economia de tempo, material (agulha e seringa) e menor risco de manipulao. A principal desvantagem o maior custo.
MEIOS DE CULTURA
Atualmente os laboratrios que ainda utilizam metodologias manuais, em sua grande maioria utilizam meios de cultura comerciais, aerbios e anaerbios, para a realizao de hemoculturas. Trata-se geralmente de caldo infuso cerebro-corao (BHI) ou caldo casena digerida da soja, para aerbios e facultativos e leveduras e caldo Columbia para anaerbios que devem favorecer o crescimento da maioria dos microrganismos, inclusive dos considerados fastidiosos. A maioria destes meios tem na sua composio o anticoagulante SPS (0,025 a 0,05%), o qual apresenta ao inibidora para lisozimas, apresenta certa ao inibitria frente a determinadas concentraes de aminoglicosdeos e polimixinas, pode ter ao inibitria para algumas fraes do complemento e inibe parcialmente a fagocitose. Por outro lado este anticoagulante pode apresentar certa ao inibidora para o isolamento de determinados microrganismos, como por exemplo, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Peptostreptococcus spp., Moraxella catarrhalis e outros. Da a recomendao de se acrescentar gelatina na concentrao de 1,2% na composio destes meios para inibir parcialmente o efeito nocivo do SPS quando h suspeita de um dos agentes acima citados. Para os laboratrios que dispe de metodologias automatizadas, h possibilidade do uso de meios de cultura com resinas que apresentam ao inibitria para antimicrobianos, til pacientes que receberam antibioticoterapia prvia. Os frascos aerbios devem manter rea suficiente de volume de ar para permitir crescimento de bactrias aerbias estritas como Pseudomonas aeruginosa e leveduras, enquanto os frascos para anaerbios estritos devem ter uma mistura de gases livres de oxignio, evitando-se a introduo de ar durante a coleta. Agitao do meio um fator importante para facilitar a multiplicao bacteriana, principalmente dos aerbios estritos e facultativos. No h evidencias que indiquem o uso rotineiro de frascos de hemocultura para anaerbios, associados aos frascos para aerbios, exceto se este for o objetivo principal ou em patologias freqentemente associadas aos anaerbios como processos infecciosos plvicos, sepse de origem abdominal, etc. Em geral os meios para aerbios suportam o crescimento dos anaerbios mais comuns e a incubao no necessita ser superior a 7 dias. Para fungos filamentosos a temperatura melhor entre 27 a 30oC, podendo crescer tambm 37oC. Para leveduras 5 a 7 dias 35oC pode ser suficiente, enquanto que para fungos dimrficos (Histoplasma, Paracoccidioides) pode ser necessrio 4 a 6 semanas, sendo o caldo BHI o melhor. Pacientes com infeco avanada pelo HIV tem risco elevado de infeces por M. tuberculosis e pelo complexo Mycobacterium avium, podendo tambm apresentar bacteremia, bem como outros imunossuprimidos. A inoculao do sangue concentrado pode ser feita em gar Lowenstein-Jensen ou Middlebrook 7H11 ou usar os frascos especficos para Mycobacterium de sistemas automatizados como Bactec. A concentrao pode ser feita pelo sistema Isolator (lise-centrifugao).
Mod - 41
durante 18-24 horas 37oC, realizada uma anlise quantitativa e a deteco de 15 ou mais colnias correlacionada com o fato do cateter constituir a fonte de infeco. Tcnicas quantitativas pareadas ou no com hemocultura perifrica so mais especficas que as tcnicas semi-quantitativas.
TCNICAS QUANTITATIVAS
Segmento de cateter (lumen e/ou superfcie externa) Cultura do lumen: o lumen do cateter pode ser cultivado injetando-se salina no seu interior com uma agulha. Cultura da superfcie externa: agita-se no mixer o segmento do cateter em salina. Faz-se cultura quantitativa (semea-se 100 l do lavado em gar sangue). considerado significativo quando a contagem for 102 UFC pelo segmento de cateter analisado.
Mod - 42
8. INFECES GENITAIS
INTRODUO
Os microrganismos que colonizam o trato genital feminino incluem lactobacilos, difterides, Gardnerella vaginalis, estafilococos coagulase negativos, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp., estreptococos alfa e gama hemolticos, Escherichia coli e leveduras. A uretra masculina normalmente contm relativamente poucos microrganismos encontrados na pele, tais como: estafilococos, micrococos, corynebactrias e estreptococos alfa hemolticos. Muitas infeces do trato genital feminino tm origem em microrganismos endgenos. A patogenicidade deles pode ser facilitada por fatores do hospedeiro, como por infeces primrias causadas por outros microrganismos como: herpes simplex vrus (HSV), o vrus papiloma humano (HPV), Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, ou ainda com infeces especficas como aquelas causadas pela Neisseria gonorrhoeae. O Laboratrio de Microbiologia deve estar capacitado para detectar os principais agentes das doenas sexualmente transmissveis: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis.
PRINCIPAIS SNDROMES INFECCIOSAS DO TRATO GENITAL Vaginite Infecciosa Vaginose bacteriana (polimicrobiana) candidase vulvo-vaginal tricomonase Gardnerella vaginalis Mobilluncus spp Mycoplasma hominis Anaerbios (Bacteroides no fragilis, Peptococcus spp) Enterobacteriaceae Streptococcus pyogenes outros betahemolticos
Vulvo-vaginites em crianas
Vaginite no-infecciosa
irritantes qumicos ou outros; alergia, hipersensibilidade e dermatite de contato; vaginite traumtica; vaginite atrfica; vaginite atrfica ps-puerperal; doena vascular do colgeno; vaginite idioptica
Menos comuns: vaginite atrfica com infeco bacteriana secundria corpo estranho com infeco secundria vaginite inflamatria descamativa vaginite ulcerativa associada com S. aureus (sndrome do choque txico)
CANDIDASE VULVO-VAGINAL
Os dados epidemiolgicos da vulvovaginite por Cndida so incompletos. A candidase vulvovaginal rara em mulheres antes da menarca. Em mulheres at os 25 anos, pelo menos um episdio de candidase freqentemente encontrado. Nas mulheres na pr-menopausa, em pelo menos 75% delas, observa-se um episdio de candidase vulvovaginal. Nas mulheres ps-menopausa, a incidncia mais rara. Parece que o mecanismo imune local da vagina responsvel pela freqncia dos episdios e a susceptibilidade associada a uma condio de mucosa no-secretora, o que facilitaria a implantao da levedura. A candidase vulvovaginal no tradicionalmente considerada como doena sexualmente transmitida, pois ocorre em mulheres celibatrias e a Candida spp. tambm faz parte da microbiota vaginal normal. Episdio individual de candidase vulvovaginal parece no estar relacionado faixa etria nem ao nmero de parceiros ou freqncia de relaes sexuais.
Mod - 43
A candidase vulvovaginal recorrente definida como quatro ou mais episdios da infeco por ano e ocorre em menos de 5% de mulheres sadias. Entretanto ela importante em pacientes diabticas no controladas e nas que fazem uso de drogas imunossupressoras. A Candida albicans a responsvel por 80-92% dos episdios de candidase vulvo-vaginal. Mais recentemente outras espcies como Candida (Torulopsis) glabrata e Candida krusei tambm foram consideradas patognicas.
FATORES PREDISPONENTES
Incluem gravidez, diabetes, antimicrobianos de amplo espectro e contraceptivo oral com altas taxas de estrgenos.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
O diagnstico laboratorial facilmente realizado no laboratrio de microbiologia, a partir do contedo vaginal ou secreo uretral. Podem ser utilizados os seguintes mtodos: Exame direto a fresco e/ou aps colorao pelo mtodo de Gram. Exame colpocitolgico pelo Papanicolaou. Isolamento em meios de cultura comuns (gar Sangue, gar Sabouraud). Identificao das leveduras por mtodos automatizados ou atravs de provas clssicas como: auxonograma, zimograma e pesquisa de tubo germinativo. Antifungigrama com drogas clotrimazol e nistatina. especficas: miconazol, fluconazol, ketoconazol, itraconazol,
TRICOMONASE
A Trichomonas vaginalis afeta aproximadamente 180 milhes de mulheres em todo o mundo. Em muitos pases industrializados a prevalncia da tricomonase tem diminudo. A Trichomonas vaginalis identificada em 30-40% dos homens, parceiros sexuais de mulheres infectadas. Ela tambm est associada com outras doenas sexualmente transmitidas. Na mulher, a tricomonase varia de portadora assintomtica at doena aguda inflamatria. Em mulheres grvidas, sem tratamento, est associada com ruptura de membranas, nascimento prematuro e celulite ps-histerectomia.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
O diagnstico laboratorial da tricomonase pode ser realizado atravs de exames diretos, cultura ou tcnicas moleculares. O pH vaginal est marcadamente elevado e h aumento do nmero de leuccitos polimorfonucleares. A visualizao de Trichomonas mveis pelo exame direto a fresco positiva em cerca de 50-70% dos casos confirmados em cultura. Embora os Trichomonas possam ser visualizadas atravs de esfregaos pelo Papanicolaou, a sensibilidade de apenas 60-70%. Microbiologistas experientes visualizam facilmente estas estruturas pelo mtodo de Gram que detecta tambm as formas imveis. As tcnicas de cultura possuem alta sensibilidade (95%) e devem ser realizadas quando os exames diretos so negativos e o pH est aumentado na presena de numerosos leuccitos polimorfoncleares. Um diagnstico rpido pode ser realizado atravs de Kits usando sondas de DNA e anticorpos monoclonais com sensibilidade de 90% e especificidade de 99,8%. Os testes mais freqentemente utilizados so: Exame direto a fresco e/ou aps colorao pelo Gram Exame colpocitolgico pelo Papanicolaou Isolamento em meios de cultura especficos (Roiron, Kupferberg, Diamond) Pesquisa pela metodologia de sondas de DNA
Mod - 44
VAGINOSE BACTERIANA
a mais frequente causa de vaginite em mulheres sexualmente ativas. Alm da Gardnerella vaginalis outras bactrias esto envolvidas, tais como: Mobilluncus spp., Bacteroides spp. e Mycoplasma hominis. Vrios estudos tm demonstrado um aumento de 2 a 7% na taxa de risco de nascimentos prematuros em mulheres com vaginose bacteriana. A vaginose bacteriana representa uma mudana complexa na microbiota vaginal, caracterizada pela reduo na prevalncia e concentrao de lactobacilos produtores de perxido de hidrognio e um aumento na prevalncia e concentrao de Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp., Mycoplasma hominis, bacilos Gram negativos anaerbios principalmente dos gneros Prevotella, Porphyromonas e Bacteroides. A transmissibilidade da vaginose bacteriana foi demonstrada por Gardner e Dukes (1955) e a doena pode ser considerada uma DST. A transmisso no suficiente para explicar todos os casos, pois o microrganismo encontrado normalmente em algumas mulheres sadias e tambm em jovens sem atividade sexual. Os fatores de risco para vaginose bacteriana incluem o uso de dispositivo intrauterino e gravidez.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
Os critrios para se estabelecer o diagnstico de vaginose bacteriana so simples e podem ser usados na clnica e no Laboratrio com bastante sucesso. A presena de clue cells, clulas escamosas do epitlio vaginal cobertas com bactrias de modo que os bordos da clula perdem a definio, o achado de melhor valor preditivo de vaginose bacteriana. O exame pelo Gram de secreo vaginal o mtodo de escolha para visualizao de clue cells com sensibilidade de 93% e especificidade de 70%. A cultura para G. vaginalis positiva em todos os casos de vaginose bacteriana, e pode ser detectada em 50-60% de mulheres sadias assintomticas. Desta maneira a cultura vaginal, isoladamente, no deve fazer parte do diagnstico de vaginose bacteriana. O uso de metodologia de sondas de DNA, possui sensibilidade e especificidade semelhantes cultura, mas o seu custo muito elevado. No diagnstico laboratorial os seguintes testes so freqentemente utilizados: pH vaginal > 4,5; odor desagradvel aps a adio de KOH 10% secreo Bacterioscpico pelo Gram: ausncia ou diminuio de leuccitos e de lactobacilo, presena de clue-cells, grande quantidade de bacilos Gram-variveis (lbeis) Cultura: isolamento em meio seletivo (gar vaginalis) Pesquisa pelo uso de metodologia de sondas de DNA Incidncia relativa de vaginite/vaginose em mulheres com sintomas
Vaginose bacteriana Incidncia relativa 35% a 50% Populao dependente: - 20%: clnicas de planejamento familiar. - 35%: clinicas de DST - 10-30%: em mulheres grvidas Candidase 20% a 25% Fatores de risco: diabetes, gravidez, contraceptivo oral, baixa imunidade. Trichomonase 5% a 15% Transmitida sexualmente, alta incidncia com outras DST.
Fatores demogrficos
Incidncia de co-infeco nas vaginites/vaginoses Tipos de vaginites Vaginose bacteriana Patgenos Associados Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Bacterides spp., Mycoplasma hominis, Mobiluncus spp. Incidncia de co-infeco - 5 a 10% com leveduras - > 15 % com Trichomonas tambm com Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae
Mod - 45
Candidase
Candida spp.
- 15 a 25% com vaginose bacteriana - > 15% com Trichomonas - > 10% com vaginose bacteriana - > 15% com leveduras tambm com Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae
Tricomonase
Trichomonas vaginalis
INFECO GONOCCICA
A gonorria uma doena antiga e o agente, Neisseria gonorrhoeae, foi descrito por Neisser em 1879. Apesar de ser uma doena bem documentada de longa data, continua sendo de difcil controle. O sucesso e a persistncia histrica do gonococo como patgeno amplamente distribudo se deve ao fato de que o homem o nico hospedeiro natural e a forma de transmisso mais comum a via sexual. A doena envolve primariamente o trato genito-urinrio podendo ocorrer vrias complicaes, entre as quais, endocardite, meningite, artrite e pielonefrite. A orofaringe do reto e a conjuntiva podem tambm ser primariamente infectadas. As infeces causadas por Neisseria gonorrhoeae na mulher incluem uretrite, cervicite, podendo invadir as glndulas de Bartholin e de Skene. A partir destas estruturas, a infeco pode disseminar-se para o endomtrio, trompas ovarianas, ovrios, superfcie peritoneal e estruturas contguas, causando a Doena Inflamatria Plvica (DIP). Muitos casos de DIP esto primariamente associados com outros patgenos, como Chlamydia trachomatis e uma gama variada de bactrias anaerbias e facultativas. A oftalmia neonatorum ocorre em recm-nascidos, de mes portadoras, havendo contaminao no canal do parto. A infeco no homem se apresenta usualmente sob a forma de uretrite aguda. Entre os sintomas precoces esto: a sensao de desconforto e dor uretral. A resposta inflamatria inicial um corrimento mucide, seguido por um exudato purulento que aparece 2 a 5 dias aps a relao suspeita. A infeco pode progredir da uretra anterior para a uretra posterior em 10 a 14 dias. Os sintomas incluem aumento da disria, poliria e ocasionalmente febre e dor de cabea. As glndulas, dutos e vesculas do trato genito-urinrio podem tornar-se stios de complicaes locais. Infeco crnica da prstata, vescula seminal e epiddimo, bem como estreitamento uretral, podem ocorrer. Dentre os fatores que contribuem para o aumento da incidncia da gonorria esto: a bactria, o hospedeiro e as caractersticas clnicas da doena.
Mod - 46
Aumento de mobilidade populacional - altas taxas de deslocamentos geogrficos e sociais acompanhados de solido e privao de direitos aumentam a freqncia de relaes sexuais e leva a altas taxas de revalncia da gonorria nessas populaes. Homossexualidade - a gonorria altamente prevalente entre os homossexuais. Em centros urbanos os homossexuais masculinos contribuem de forma acentuada para a propagao da gonorria. Recidivas - pacientes com infeces gonoccicas repetidas contribuem de forma intensa para o aumento da incidncia de gonorria. Assim, pacientes que continuam a ter relao sexual sob as mesmas condies e com o mesmo tipo de populao, possuem alto risco de contrair uma segunda infeco. A recidiva um problema significativo em pacientes jovens.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
O gonococo uma bactria frgil. As amostras clnicas submetidas a cultura devem ser semeadas imediatamente, pois a bactria se auto-lisa com muita facilidade e sensvel a variaes de temperatura. As amostras devem ser obtidas sempre antes do incio do uso de antimicrobianos. Quando necessrio transportar a amostra at o laboratrio, medidas adequadas devem ser tomadas, como o uso de meios de transporte adequados ao gonococo. Para amostras obtidas de articulaes, a cultura deve ser realizada em meio hipertnico contendo 20% de sacarose ou 20% de soro de cavalo, pois nestas amostras, o gonococo se encontra na forma L, desprovida de parede celular e no cresce nos meios habituais. A no observncia dessas recomendaes implica na obteno de culturas negativas. Os seguintes exames podem ser utilizados: Exame direto pelo mtodo de Gram: esfregaos de amostras genitais femininas so muito menos confiveis para fins diagnsticos do que as do sexo masculino. A sensibilidade do mtodo de Gram neste caso de apenas 50%, quando comparado cultura. Deteco de antgenos por enzima-imunoensaio. Isolamento em meios de cultura especficos (Thayer-Martin ou similar). Identificao das colnias atravs de provas imunofluorescncia direta ou co-aglutinao. bioqumicas manuais ou automatizadas,
Tcnicas moleculares como pesquisa pela metodologia de sondas de DNA ou por tcnicas de amplificao (PCR). Pesquisa de beta-lactamase. Diagnstico Laboratorial das Infeces por N. gonorrhoeae
Paciente Feminino Masculino heterossexual Masculino homossexual DIP feminino DIP masculino
a
Local das amostras Primrios Secundrios Endocrvice Uretra uretra, reto, faringe sangue, endocrvice, reto sangue, uretra faringe a, leso pele b, fluido de articulao b, uretra faringe a, leso pele b, fluido de articulao b, reto c reto, uretra, faringe
Exames Gram, Cultura e/ou tcnicas moleculares Gram Gram, Cultura e/ou tcnicas moleculares Cultura e/ou tcnicas moleculares Cultura e/ou tcnicas moleculares
Mod - 47
A Chlamydia , do ponto de vista metablico, incapaz de produzir sua prpria energia e, desta maneira, retira ATP da clula hospedeira, sendo denominada de parasita energtica. A Chlamydia trachomatis infecta somente o homem e usualmente transmitida por contato pessoal, isto , sexualmente ou atravs do canal do parto. No tracoma, a bactria transmitida por contato dos olhos com os dedos ou com fmites contaminados. A infeco por clamdia tornou-se altamente prevalente, mas devido sua natureza mais branda, ela no tem sido reconhecida e, muitas vezes, permanece sem tratamento. Os estudos epidemiolgicos de infeco por clamdia tm documentado uma prevalncia substancial do microrganismo em adultos jovens e ativos sexualmente. Estes estudos relatam taxas de prevalncia na faixa de 5% a 20% entre mulheres que freqentam clnicas de planejamento familiar; freqncias mais altas de 20-40% foram notadas entre mulheres e jovens adolescentes sexualmente ativas que freqentavam clinicas de DST e em cerca de 25% de todas as mulheres atendidas em clnicas ginecolgicas. Aproximadamente 8% de todas as mulheres jovens atendidas em maternidades, sem sintomas de infeco urogenital, so portadoras de C. trachomatis. Da mesma maneira, pelo menos 3% dos homens atendidos em clnicas de DST, sem sintomas genito-urinrios, so portadores de C. trachomatis. Aproximadamente 50% das uretrites no gonoccicas (UNG) so causadas por esse agente. As infeces por clamdia coexistem freqentemente com a gonorria. Nos Estados Unidos e regies da Europa, 35-50% das mulheres com gonorria apresentam infeco simultnea por clamdia; alm disto, os estudos mostram tambm que 20-25% dos homens heterossexuais com gonorria esto infectados tambm por C. trachomatis. A uretrite a manifestao mais comum da infeco por clamdia, no homem. Ela duas vezes mais freqente que a gonorria em algumas populaes e sua incidncia tem aumentado. C. trachomatis virtualmente responsvel por todas as complicaes da uretrite no gonoccica. Na mulher as infeces causadas por Chlamydia trachomatis incluem cervicite mucopurulenta, sndrome uretral, endometrite e salpingite. As infeces do trato genital superior causam esterilidade ou predispem gravidez ectpica. As complicaes na mulher so as mais graves de todas que ocorrem com doenas por clamdias. Alm disso, na mulher, o risco duplo, para ela e para seu recm-nascido.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
Tanto Chlamydia como gonococo, graas s recentes utilizaes dos testes moleculares, apresentam atualmente uma alta possibilidade de diagnstico. Anteriormente, o teste mais confivel capaz de
Mod - 48
identificar Chlamydia era o isolamento em cultura de clulas, que tem sensibilidade no mximo de 8090%. Embora as culturas sirvam como padro ouro, elas so tecnicamente complicadas e demoradas. O transporte de amostras laboratoriais para cultura requer meios especiais e temperaturas especficas de estocagem. Por outro lado, as amostras para testes moleculares podem ser coletadas em gua ou salina estreis e transportadas temperatura ambiente ou congeladas. Os testes moleculares para diagnstico de C. trachomatis produzem resultados rpidos, confiveis e custo com tendncia a cair, atualmente j se encontrando prximo ao da cultura. A amostra adequada deve ser coletada da forma tradicional com swab ou escova endocervical. O exame pode ser realizado partir de urina de primeiro jato o que pode reduzir sua sensibilidade no diagnstico da cervicite, endometrite e salpingite. Os testes moleculares so mais complexos e mais caros que do que outros anteriormente utilizados, mas produzem resultados rpidos (horas ao invs de dias) e, pela primeira vez, espcimes podem ser coletados sem a introduo de swabs ou escovas no canal endocervical ou na uretra, pois sua sensibilidade permite tambm encontrar traos do microrganismo em amostras de urina. Os exames para o diagnstico de Chlamydia incluem: Exame direto, de raspado de mucosa cervical, pelo mtodo da Imunofluorescncia Direta ou por tcnica Imunoenzimtica. Isolamento em cultura de clulas MacCoy e identificao por tcnica de Imunofluorescncia. Pesquisa por metodologia molecular: Hibridizao ou captura hbrida; PCR com deteco por hibridizao; Testes sorolgicos. RFC, IF-IgG, IF-IgM.
Testes laboratoriais no diagnstico das infeces genitais por Chlamydia Citologia Cultura Giemsa No recomendada IFD Positiva EIA Positiva RFC Negativa ou positiva ttulo baixo 1 Sorologia IF-IgG Positiva soros pareados IF-IgM Eventualmente positiva 2 Tc. Moleculares PCR Positiva Sondas DNA Positiva
- consideram-se ttulos baixos at 1:16 e ttulos altos de 1:32 ou mais. Maior valor diagnstico que ttulos altos a elevao de 4x o ttulo entre amostras de soro no incio da doena e 2 semanas aps. 2 - positiva nas primeiras semanas da infeco. IFD: imunofluorescncia direta EIA: mtodo imuno-enzimtico RFC: reao de fixao do complemento
Mod - 49
contraram o microrganismo durante o nascimento. Existe evidncia de associao entre o Ureaplasma urealyticum e infertilidade.
DIAGNSTICO LABORATORIAL
Os micoplasmas so bactrias desprovidas de parede celular, so pleomrficas e somente crescem em meios hipertnicos, contendo 20% de soro de cavalo e extrato de levedura. O mtodo de Gram no tem valor na pesquisa desta bactria. Como fazem parte da microbiota genital normal, as culturas para seu isolamento necessitam ser quantitativas. Ttulos iguais ou superiores a 103 UTC (unidades trocadoras de cor) so considerados clinicamente significativos. Em alguns casos pode ser necessria a realizao do antibiograma que feito em meio slido ou lquido, utilizando-se pelo menos duas concentraes de cada antibitico. Os antibiticos freqentemente utilizados incluem: tetraciclina, eritromicina, roxitromicina, ofloxacina e tianfenicol. Testes sorolgicos no so utilizados na rotina, para infeces genitais por micoplasmas. Os principais testes utilizados no diagnstico de infeces genitais por micoplasmas incluem: Cultura quantitativa de materiais, tais como: secreo vaginal, uretral, cervical, urina de 1. jato, esperma e lquido prosttico em meios U-9, M-42 e A-7. Ttulos iguais ou maiores que 103 UTC (unidades trocadoras de cor) so clinicamente significativos. Testes sorolgicos: utilizados somente para infeces pulmonares ou articulares. Antibiograma: tetraciclina, eritromicina, roxitromicina, ofloxacina e tianfenicol so testados rotineiramente.
Amnionite
Streptococcus agalactiae (grupo B) principal patgeno, Capnocytophaga spp., E. coli, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus spp., Streptococcus pyogenes N. gonorrhoeae, U. urealyticum, Enterobacterias. Agentes mais raramente relacionados: Anaerbios, C. trachomatis, S. aureus. Bacteroides spp., C. trachomatis, N. gonorrhoeae (importante em salpingite), Enterococcus spp., S. agalactiae, Enterobactrias, L. monocytogenes, Actinomyces spp. (associado ao uso de DIU) Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Enterobacterias, Pseudomonas spp. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Enterobactrias, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., S. aureus (abscesso) Cancro mole - Haemophilus ducreyi Cancro duro - Treponema pallidum (sfilis) Herpes genital - Herpes simplex vrus. Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, Herpes simplex virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Haemophilus spp. (no homem).
Bartolinite
Endometrite/salpingite
Epididimite/orquite
Prostatite
lceras genitais
Uretrites e cervicites
Mod - 50
Faringite *
O agente mais freqente de faringite bacteriana o Streptococcus pyogenes. Em pacientes hospitalizados o trato respiratrio superior pode ser colonizado por Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Klebsiella pneumoniae e outras enterobactrias. Esses microrganismos no so patgenos de faringe e no devem ser reportados nos resultados de rotina. Porm se o paciente for imunocomprometido, e houver solicitao do mdico, essas bactrias sero consideradas para laudo e teste de sensibilidade. Alguns vrus tais como: adenovrus, herpes simplex, influenza, parainfluenza, coxsackie A e EBV (mononucleose infecciosa), produzem faringite acompanhada de rinorria, tosse, exantema e s vezes febre, sendo o diagnstico sorolgico ou atravs de provas moleculares. A laringite aguda, na grande maioria das vezes, de etiologia viral. Culturas para pesquisa de agentes bacterianos so indicadas apenas na suspeita de difteria. A epiglotite, tambm chamada de crupe, geralmente tem etiologia bacteriana (Haemophilus influenzae tipo B). Mas a coleta com swab diretamente da epiglote contra-indicada por duas razes: em primeiro lugar, a manipulao ou irritao da epiglote edemaciada pode provocar quadro de obstruo; em segundo lugar, o isolamento de H. influenzae b pode no ocorrer. O diagnstico fundamentalmente clnico, porm hemoculturas (> 50% dos casos so bactermicos) podem confirmar a etiologia. O meio de cultura deve ser enriquecido com fatores X e V ou adicionado de sangue de cavalo aquecido, sendo importante realizar teste de suscetibilidade com pesquisa de beta lactamases. Os seios paranasais comunicam-se com a cavidade nasal, sendo ento susceptveis a infeces por microrganismos habitantes do trato respiratrio superior. A sinusite aguda freqentemente secundria infeco viral de vias areas superiores. Outros fatores predisponentes so: alergia, desvio do septo nasal, plipos, e em pacientes hospitalizados, entubao orotraqueal prolongada. A infeco de seios paranasais pode se propagar a tecidos adjacentes, como clulas etmoidais (levando a celulite periorbital), abscessos cerebrais e meningites. Os microrganismos mais comumente identificados so Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no b, anaerbios estritos, Streptococcus spp., e Branhamella catarrhalis. Em sinusites de origem intra-hospitalar, os agentes mais freqentes so: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, e fungos como Candida spp.
Laringite e Epiglotite
Sinusites
Mod - 51
Otites
Otite Mdia: infeco do ouvido mdio, geralmente acomete crianas entre 3 meses e 3 anos de idade. O diagnstico etiolgico s pode ser feito atravs de cultura do fluido do ouvido mdio, mas como a obteno deste material implica em realizao de timpanocentese, no realizado a no ser que haja indicao clnica de drenagem. Os agentes mais comumente isolados so Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Streptococcus pyogenes. Otite Externa: infeco do canal auditivo externo, geralmente causada por Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp. e Staphylococcus aureus. Nasofaringe: o material coletado para diagnstico da infeco deve ser aspirado atravs do nariz; utilizado para o diagnstico de coqueluche, Mycoplasma e alguns casos de difteria. Para deteco de meningococo a amostra deve ser coletada com swab ou por aspirao e semeada imediatamente em meios adequados. Deve ser lembrado que para deteco de portadores de meningococo, deve ser coletado material com zaragatoa de arame, e semeado imediatamente em meios adequados. Nariz: 20 a 25% dos indivduos sadios so portadores de Staphylococcus aureus no nariz, e no ambiente hospitalar esta taxa pode aumentar. Alguns autores associam a colonizao nasal por este microrganismo com o aumento do risco de infeco hospitalar em pacientes submetidos a cirurgias (cardaca, por exemplo) e a programas de dilise peritoneal contnua (CADP). Nestes casos de risco, colher material das narinas para pesquisa de Staphylococcus aureus, com teste de susceptibilidade mupirocina (antibitico de uso tpico utilizado para erradicao do microrganismo da mucosa nasal). Comum em neonatos e pacientes imunocomprometidos, principalmente aps utilizao de antibiticos de largo espectro. O diagnstico direto, feito atravs de esfregao em lmina do exudato corado pelo Gram ou KOH, onde so visualizadas leveduras.
Candidase oral
Os meios de cultura mais utilizados para semeadura, de materiais obtidos das vias areas superiores so o gar Chocolate (com sangue de cavalo) e gar Sangue incubados em atmosfera de 5% de CO2, e gar Mac Conkey. Na rotina no se recomenda fazer enriquecimento, nem fazer uso de meios seletivos. Na suspeita de infeces por anaerbios usar meios e condices apropriadas para o cultivo destas bactrias. Para cultura do bacilo diftrico recomendvel encaminhar a Laboratrio de Sade Pblica. O meio seletivo o meio de gar Sangue cistina-telurito. O bacilo tambm cresce em gar Sangue, sendo opcional fazer enriquecimento em gar Loeffler azul de metileno.
* Principais agentes etiolgicos de faringites Agente Rhinovirus Coronavrus Adenovirus Herpes simplex vrus Outros vrus Influenza vrus Parainfluenza vrus Streptococcus pyogenes Streptococcus beta hemoltico do grupo C C. diphtheriae Neisseriae gonorrhoeae Arcanobacterium haemolyticum Mycoplasma pneumoniae Manifestao clnica Resfriado Resfriado Doena respiratria aguda ou febre faringo-conjuntival Gengivite, estomatite e faringite Herpangina, mononucleose, etc gripe resfriado Faringite, amigdalite e escarlatina Faringite e amigdalite Difteria Faringite Faringite Faringite, pneumonia Estimativa de casos (%) 20 5 5 4 1 2 2 15-30 5 raramente raramente raramente raramente
Mod - 52
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Anaerbios da cavidade oral Moraxella catarrhalis Outros Gram negativos Chlamydia pneumoniae Legionella pneumophila Vrus respiratrios
- doena pulmonar obstrutiva crnica - diabetes - alcoolismo - crises convulsivas - insuficincia cardaca congestiva - anemia falciforme - imunossupresso - idade avanada - doena respiratria prvia (em geral viral) - ventilao mecnica - etc
As amplas variaes ocorrem em diferentes populaes e outros fatores epidemiolgicos (poca do ano, surtos, faixa etria, etc.). Nas crianas a distribuio tem particulariedades marcantes com diferentes faixas etrias em funo da experincia imunolgica com os potenciais agentes infecciosos, o que reduziu a frequncia nas comunidades vacinadas. Existe uma interessante associao entre fatores predisponentes e agentes etiolgicos que podem facilitar a pesquisa ou interpretao de achados microbiolgicos. Associao entre fatores predisponentes e agentes etiolgicos
Fator Alcoolismo Agente Etiolgico Streptococcus pneumoniae, Anaerbios, Enterobactrias Fator Exposio a animais da rea rural ou gata recm-parida Infeco por HIV precoce Agente Etiolgico Coxiella burnetii (febre Q - reas endmicas)
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Legionella spp. Streptococcus pneumoniae, Enterobactrias, Haemophilus influenzae, S. aureus, Anaerbios, Chlamydia pneumoniae
Coccidioides immitis
Mod - 53
M higiene dentria
Anaerbios
Surtos de gripe
Influenzavirus, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (A), Haemophilus influenzae Anaerbios e pneumonia qumica Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Staphylococcus aureus
Pnemonia de aspirao Doena pulmonar crnica, fibrose cstica ou bronquiectasia Usurio de drogas
Exposio a coelhos
Distribuio da freqncia de agentes etiolgicos em funo da idade Idade Do nascimento at 20 dias Agente por ordem de freqncia Streptococcus agalactiae (B), Enterobactrias, Citomegalovirus, Listeria monocytogenes Chlamydia trachomatis, Vrus respiratrio sincicial, Parainfluenza virus 3, S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus Vrus respiratrio sincicial, Parainfluenza virus, influenza virus, adenovirus, rhinovirus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis
3 semanas a 3 meses
4 meses a 4 anos
5 a 15 anos
Outras causas mais raras de pneumonia Agentes associados a pneumonia Anthrax (Bacillus anthracis) Brucelose (Brucella spp.) Leptospirose (Leptospira spp.) Exposio Animais em rea rural ou suas fezes Animais, leite no pasteurizado, cuidados veterinrios Roedores silvestres; gua contaminada com urina de animal doente; animais domsticos doentes Ces e gatos contaminados Ratos, esquilos, coelhos e outros roedores silvestres Urina, fezes e saliva de roedores silvestres
PNEUMONIA HOSPITALAR
Considerando-se as diferentes topografias associadas s infeces hospitalares, as localizadas no trato respiratrio inferior, tm grande importncia pela freqncia em que ocorrem e pela morbidade associada. Estas infeces so classificadas basicamente em quadros de traqueobronquite e pneumonia. A pneumonia de origem hospitalar definida como aquela que aparece aps um perodo maior ou igual a 48 horas de admisso e no est incubada no momento da hospitalizao. Segundo dados da literatura, ocorre entre 6 a 10 casos a cada 1000 admisses hospitalares.
Mod - 54
Entre as pneumonias, aquelas associadas com ventilao mecnica atravs de entubao orotraqueal ou traqueostomia, so as mais freqentes. So definidas para pacientes sob ventilao mecnica em um perodo igual ou superior a 48 horas. Nesta situao a incidncia de infeco de 7 a 21 vezes maior que ocorre em pacientes que no necessitam de respirador. Dentre as infeces hospitalares, a infeco pulmonar a que leva a morte com maior freqncia, com um risco maior na Unidade de Terapia Intensiva. A prevalncia de pneumonias varia entre 10 e 65%, com 13 a 55% de casos fatais. Neste mesmo tipo de Unidade, dados do National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) mostram a taxa de infeco respiratria associada ventilao mecnica por 1000 procedimentos-dia, variando de 5 casos em UTI peditrica a 13 casos em UTI cirrgica. De uma maneira geral os microrganismos podem alcanar o trato respiratrio pela aspirao de secrees da orofaringe, pela inalao de aerossis contendo bactrias, pela translocao de microrganismos do trato gastrointestinal ou pela disseminao hematognica de um foco a distncia. Ainda, para que a infeco respiratria ocorra necessrio existir a perda das defesas do hospedeiro, um inculo suficiente para alcanar o trato respiratrio ou a presena de um microrganismo altamente virulento. Os agentes mais freqentemente isolados so: Bacilos Gram negativos Enterobactrias: Klebsiella spp., E. coli, Enterobacter spp. Bacilos Gram negativos no fermentadores: P. aeruginosa, Acinetobacter baumanii e outras espcies, etc. Cocos Gram positivos, principalmente Staphylococcus aureus. Outros agentes, tais como Legionella pneumophila e Vrus Respiratrio Sincicial (VRS) aparecem em casos de surto e em pacientes imunodeprimidos, assim como Aspergillus spp. e Pneumocystis carinii. Patgenos isolados em 4.389 pneumonias em UTI nos Estados Unidos de 199297 NNIS
Patgenos Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterobacter spp. Klebsiella pneumoniae Acinetobacter spp. Candida albicans Escherichia coli Enterococcus spp. Outras enterobactrias Outros fungos % 21 20 9 8 6 5 4 2 8 2,8
Vrios critrios utilizados para definio de pneumonia hospitalar foram propostos. Em geral, incluem a presena de um novo ou progressivo infiltrado pulmonar, febre, leucocitose e secreo traqueobrnquica purulenta. Muitos destes achados so inespecficos j que febre pode ser causada por diversos fatores como: reao a drogas, infeco em outro foco, transfuso sangunea e resposta inflamatria extrapulmonar.
Mod - 55
O mesmo ocorre com a congesto, presente em embolia pulmonar, atelectasia, insuficincia cardaca, hemorragia pulmonar, trauma pulmonar, tumor, aspirao qumica e reao drogas.
ESCARRO
Apesar de poder ser til em pacientes com tosse produtiva e com capacidade de expectorar e a presena de escarro purulento encontrar-se na maioria dos critrios utilizados para o diagnstico de pneumonias, a anlise desta secreo bastante controvertida do ponto de vista de sensibilidade e especificidade. Aspectos da anlise macroscpica do escarro que podem ser teis para sugesto de agentes ou patologias: Cor, quantidade, consistncia e cheiro. Escarro purulento pneumonia bacteriana (embora nas pneumonias por vrus ou micoplasma a infeco secundria pode oferecer os mesmos achados em cerca de 30 a 50% dos casos) Expectorao matinal, abundante e ftida - bronquiectasia Expectorao escassa ou aquosa (mucide) - pneumonias atpicas Escarro avermelhado, mucide - Klebsiella pneumonia Escarro ftido associado a pneumonia aspirativa - anaerbios Bacterioscopia A bacterioscopia do escarro pela colorao de Gram um recurso simples, rpido e barato, podendo ser muito til para orientao teraputica quando so atendidos os seguintes itens: Um material purulento e representativo analisado; Os analistas so experientes; Informaes clnicas e/ou o clnico participam da interpretao;
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Os achados so bem definidos, como por exemplo, o predomnio ou presena de mais de 10 cocobacilos Gram positivos em forma de chama de vela, caractersticos de pneumococo em imerso (X1000) - a especificidade nesse caso de 85%. Algumas medidas relacionadas coleta e processamento da amostra podem tornar os resultados obtidos com este espcime de maior utilidade. A remoo de prteses e gargarejo com gua imediatamente antes da coleta pode reduzir substancialmente a contaminao da amostra. O nico cuidado impedir o uso de substncias com contedo bactericida. Prefere-se colher a primeira amostra de escarro da manh por ser um material mais concentrado, utilizando-se a poro mais purulenta para anlise. A coleta por um perodo de 24 horas inadequada, j que durante o dia passa a ocorrer diluio da amostra, morte de alguns agentes fastidiosos, e em contrapartida, o crescimento bacteriano de outros microrganismos. Segundo os achados de LENTINO e LUCKS, relatados por KONEMAN et al (1997), a interpretao do resultado das culturas de escarro em relao s pneumonias foi de que: 26,5% de amostras de escarro purulento eram de pacientes mostrando nenhum sinal clnico ou radiolgico de pneumonia. 40% das amostras de escarro provenientes de pacientes com profundamente expectorados, refletindo a presena de secreo oral. pneumonia no eram
Somente 10% de pacientes produzindo escarro no purulento tinham pneumonia. Somente 56,8% dos pacientes com pneumonia produziam escarro purulento. Ainda em casos comprovados de pneumonia pneumoccica, com bacteremia e escarro revelando o pneumococo na colorao de Gram podem apresentar cerca de 50% de culturas de escarro negativas, o mesmo podendo ocorrer com pneumonias por Haemophylus. A presena de enterobactrias em culturas de escarro deve ser interpretada com muita cautela, pois em cerca de 1/3 das culturas estas bactrias provenientes da orofaringe podem contaminar o material obtido para anlise. A avaliao da qualidade do escarro, considerando a proporo entre o nmero de clulas epiteliais e leuccitos, um procedimento que deve ser considerado de rotina, para caracterizar a aceitabilidade da amostra ou no. Atravs da colorao de Gram (observao de pelo menos 10 campos com aumento de 10X), as amostras devem ser classificadas em grupos de acordo com as tabelas abaixo. So significativos os materiais do grupo 5 ou quando a quantidade de clulas epiteliais, neutrfilos e muco resultarem em somatria positiva. Recomenda-se que escarros no qualificados, no sejam semeados e que o fato seja reportado ao requisitante do exame. Avaliao da qualidade do escarro
Grupos Clulas epiteliais 25 25 25 10-25 <10 Leuccitos Neutrfilos Score Clulas Epiteliais 10-25 > 25 Score
10 10-25 25 25 25
0 +1 +2 +1
-1 -2
No caso da necessidade do processamento da amostra nestas condies, recomendvel uma observao no laudo final do exame, dizendo que o material coletado est contaminado com material de orofaringe. Faz-se exceo a esta regra, escarro com o objetivo de diagnosticar presena de micobactrias, vrus, fungos (Paracocidioidis brasiliensis, Histoplasma spp., etc.) e aqueles provenientes de pacientes imunodeprimidos. Pneumocistis carinii - para diagnstico de pneumonia por Pneumocistis carinii em pacientes com HIV ou imunossuprimidos, o escarro pode ser til em mais de 50% dos casos, pelo uso da colorao de Giemsa ou Gomori methenamina prata ou azul de toluidina ou ainda de
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imunofluorescncia com anticorpos monoclonais que apresentam uma sensibilidade de 80% e especificidade de 90%. Legionella pneumophilia - para diagnstico de legionelose (Legionella pneumophlia) o escarro ou outros materiais, obtidos por vias invasivas ou no, podem ser teis no diagnstico pela imunofluorescncia direta com anticorpos monoclonais. Chlamydia pneumoniae - os recursos imunolgicos para teste no escarro (Elisa e imunofluorescncia) oferecem baixa sensibilidade e especificidade para caracterizao da pneumonia por Chlamydia pneumoniae. Quando agentes como Mycobacterium tuberculosis, Legionella spp., e Pneumocistis carinii so encontrados no escarro, devem ser considerados patognicos, independente da avaliao de qualidade do escarro. A amostra deve ser encaminhada diretamente ao laboratrio e se no processada no prazo de 1-2 horas pode resultar em perda de patgenos fastidiosos e em proliferao de bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores). Indicao de outras tcnicas para obteno de material para diagnstico de pneumonia: m resposta teraputica gravidade do quadro ou paciente imunossuprimido falta de produo de escarro exames realizados no foram conclusivos (no isolou nada ou isolou enterobactrias, ou Candida ou mais de um agente) possibilidade de superinfeco As tcnicas broncoscpicas caracterizam-se pela possibilidade de visualizar diretamente a rvore respiratria levando a menor risco de dano e direcionamento do fibroscpio ao local desejado, enquanto as no broncoscpicas podem ser realizadas mais rapidamente com menor risco de desaturao de oxignio.
ASPIRADO TRANSTRAQUEAL
Trata-se de uma tcnica bastante utilizada na dcada de 70, mas que atualmente devido aos riscos que leva para o paciente (enfisema subcutneo, estmulo vaso-vagal, hemoptise), est preterido em funo do aparecimento de procedimentos mais promissores. Outro fato relevante o elevado nmero de resultados falso-positivos, pelo isolamento de flora colonizadora do trato respiratrio superior.
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progressiva deteriorao clnica, para os quais no existiu queda significativa na contagem de colnias.
ESCOVADO PROTEGIDO
O volume recuperado de secreo pulmonar por um escovado aproximadamente de 0,001ml. O escovado diludo em 1 ml de meio, resultando na diluio da bactria em 100 a 1000 vezes. Portanto o crescimento de pelo menos 103 UFC/ml em placas indica uma concentrao inicial de 105 a 106 bactrias na secreo pulmonar.
BIPSIAS
Podem ser feitas de formas variadas: percutnea, atravs de broncoscopia, por meio do fibroscpio, pela toracoscopia e a cu aberto. Indicado nos casos de imunocomprometidos e crianas com m evoluo teraputica emprica. Puno bipsia pulmonar - trata-se de um procedimento, que quando resulta em cultura positiva, bastante fidedigno, j que os problemas com contaminao com a flora do trato respiratrio superior inexistem. Os relatos da literatura revelam que em situaes variadas, o diagnstico etiolgico das infeces, com esta tcnica, ocorreu entre 30% a 82% dos casos estudados e falso-negativos de cerca de 18%. Complicaes mais importantes so pneumotrax e sangramento em casusticas que variam de 5 a 39%. Bipsia transbrnquica - os resultados diagnsticos so semelhantes puno pulmonar aspirativa, mas revelaram menor ndices de complicaes. Bipsia pulmonar - a bipsia a cu aberto, mtodo definitivo para o diagnstico das pneumonias, um procedimento pouco realizado. Est indicada em casos sem melhora clnica, em que no foi possvel isolar o microrganismo por outras tcnicas ou que h necessidade de diagnstico especfico com maior rapidez. Convm salientar que de nada adianta obter boas amostras para estudo microbiolgico quando se emprega tcnica laboratorial convencional, isto , morosa e de baixa sensibilidade.
TORACOSCOPIA
A toracoscopia tem sido pouco utilizada, embora resultados sejam muito favorveis, com achados diagnsticos superiores a 90% e baixa taxa de complicaes.
DERRAME PLEURAL
O derrame pleural costuma ocorrer, aproximadamente, em pneumonias causadas por Pneumococo 10%, Bacilos Gram negativos 50-70% e Streptococcus pyogenes (grupo A) 95%. Alm da bacterioscopia, baciloscopia (Micobacterias) e culturas (bactria, micobactrias, fungos), o material Mod - 59
dever ser reservado para estudo citolgico e bioqumico para afastar outras causas de derrame com infiltrados pulmonares: Infarto pulmonar Insuficincia cardaca Tumor Doenas do colgeno, etc.
HEMOCULTURA
Atravs da hemocultura tambm pode se isolar o microrganismo de um processo respiratrio considerando-se que isto ocorre entre 1 a 16 % dos casos, no entanto no deve ser utilizada de forma isolada para o diagnstico de pneumonia. altamente especfico e indicada em pacientes com pneumonia que necessita de hospitalizao.
Meios recomendados para a cultura das amostras do trato respiratrio: gar sangue gar Mac conkey gar chocolate gar sangue suplementado para anaerbios, para amostras clnicas para as quais recomenda-se fazer o isolamento de anaerbios. Quando indicada cultura para Legionella spp., fungos, micobactrias, Chlamydia e vrus, acrescentam-se os meios necessrios a estas rotinas especficas. A pesquisa por imunofluorescncia com anticorpos monoclonais, e os mtodos moleculares so mais recomendados para a deteco desses microrganismos. A semeadura da amostra e interpretao do nmero de colnias no caso da utilizao de tcnicas quantitativas, poder ser feita de uma das formas abaixo: Aps homogeneizao da amostra, semear 10 l, diretamente nas placas, utilizando-se alas calibradas descartveis ou pipeta com ponteiras estreis. Mod - 60
Observao: Para o Lavado broncoalveolar considerar a diluio pelo volume injetado e multiplicar por 100. P.ex., se a leitura for 50 colonias, multiplicar por 100 (volume da ala) e multiplicar por 100 (diluio da coleta). Resultado final = 5x10x 10 2x10 2 = 5 x 105 UFC/ml Usar diluies de: 1/10: 10 l com ala calibrada semeada no gar Chocolate 1/100: 1 ml do material diludo em 9 ml de soluo salina e semeando-se 10 L desta soluo com ala calibrada na placa de gar Chocolate 1/1000: usar a soluo anterior e semear 1 L com ala calibrada na placa de gar Mac Conkey.
Para expresso do resultado em ml o nmero de colnias obtido dever ser corrigido pelo fator da diluio e correlacionado com a quantidade de amostra semeada. prepara-se uma diluio de 1:20 (0,5 ml de fluido em 9,5mL de soluo salina estril). Deste caldo semeia-se 50 l em cada um dos meios selecionados.
N de colnias na placa aps incubao overnight 2-24 25-249 250 Interpretao em UFC/ml
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Mdulo II
NDICE 1. Regulamento Tcnico para laboratrios Clnicos.............................................................1 Consulta Pblica n 50, de 05 de agosto de 2004..................................................................... 1 D.O.U de 06/08/2004 .......................................................................................................... 1 Resoluo da Diretoria Colegiada - RDC N. 302, de 13 de Outubro de 2005................................ 1 Anexo - Regulamento tcnico para funcionamento de laboratrios clnicos................................... 2 Histrico ............................................................................................................................ 2 Objetivo ............................................................................................................................ 2 Abrangncia ....................................................................................................................... 2 Definies .......................................................................................................................... 2 Condies gerais ................................................................................................................. 5 Processos operacionais ........................................................................................................ 8 Registros ......................................................................................................................... 11 Garantia da qualidade........................................................................................................ 12 Controle da qualidade ........................................................................................................ 12 Disposies transitrias...................................................................................................... 13 Referncias normativas e bibliogrficas ................................................................................ 13 2. Requisitos bsicos para laboratrio de MICROBIOLOGIA..............................................16 Introduo ....................................................................................................................... 16 Infra-Estrutura Fsica ......................................................................................................... 16 Biossegurana e controle de Qualidade................................................................................. 17 3. classificao dos laboratrios segundo o nvel de biossegurana .................................19 Nvel 1 de Biossegurana (NB-1) ou proteo bsica (P1)........................................................ 19 Nvel 2 de Biossegurana (NB-2) ou (P2) .............................................................................. 19 Nvel 3 de Biossegurana (NB-3) ou (P3) .............................................................................. 19 Nvel 4 de Biossegurana (NB-4) ou (P4) .............................................................................. 20 Classificao do organismo segundo seu potencial patognico.................................................. 20 Classificao dos Organismos Geneticamente Modificados ....................................................... 21 4. Laboratrios NB-1, NB-2 e NB-3 ...................................................................................22 Design e infra-estrutura laboratoriais ................................................................................... 22 Accesso ........................................................................................................................... 23 Equipamentos e acessrios laboratoriais ............................................................................... 23 Gesto de segurana ......................................................................................................... 25 Sade Ocupacional ............................................................................................................ 26 reas de trabalho.............................................................................................................. 27 Proteao Pessoal ............................................................................................................... 27 Segurana nos procedimentos laboratoriais........................................................................... 28 Descontaminao e descarte de resduos .............................................................................. 30 MEDIDAS RELATIVAS ACIDENTE e derramamento............................................................... 31 5. Precaues quanto contaminao ..............................................................................32 Cuidados relativos aos riscos de contaminao biolgica ......................................................... 32 Cuidados relativos aos riscos de contaminao qumica........................................................... 33 6. Controle de qualidade no laboratrio............................................................................35 Introduo ....................................................................................................................... 35 Objetivo .......................................................................................................................... 35 Ensaios de Proficincia ....................................................................................................... 35 Parmetros do controle de qualidade.................................................................................... 35 Controle de qualidade de Equipamentos ............................................................................... 36 Controle de qualidade de meio de cultura, REAGENTES e kits comerciais ................................... 38 Controle de Qualidade de Funcionrios ................................................................................. 40 7. Referncias Bibliogrficas.............................................................................................41
Mod II - 1
Art. 4 O descumprimento das determinaes deste Regulamento Tcnico constitui infrao de natureza sanitria sujeitando o infrator a processo e penalidades previstas na Lei n. 6437, de 20 de agosto de 1977, suas atualizaes, ou instrumento legal que venha a substitu-la, sem prejuzo das responsabilidades penal e civil cabveis. Art. 5 Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao. FRANKLIN RUBINSTEIN
2 OBJETIVO
Definir os requisitos para o funcionamento dos laboratrios clnicos e postos de coleta laboratorial pblicos ou privados que realizam atividades na rea de anlises clnicas, patologia clnica e citologia.
3 ABRANGNCIA
Esta Resoluo de Diretoria Colegiada aplicvel a todos os servios pblicos ou privados, que realizam atividades laboratoriais na rea de anlises clnicas, patologia clnica e citologia.
4 DEFINIES
4.1 Alvar sanitrio/Licena de funcionamento/Licena sanitria: Documento expedido pelo rgo sanitrio competente Estadual, Municipal ou do Distrito Federal, que libera o funcionamento dos estabelecimentos que exeram atividades sob regime de vigilncia sanitria. 4.2 Amostra do paciente: Parte do material biolgico de origem humana utilizada para anlises laboratoriais. 4.3 Amostra laboratorial com restrio: Amostra do paciente fora das especificaes, mas que ainda pode ser utilizada para algumas anlises laboratoriais. 4.4 Amostra controle: Material usado com a finalidade principal de monitorar a estabilidade e a reprodutibilidade de um sistema analtico nas condies de uso na rotina. 4.5 Analito: Componente ou constituinte de material biolgico ou amostra de paciente, passvel de pesquisa ou anlise por meio de sistema analtico de laboratrio clnico. Mod II - 2
4.6 Biossegurana: Condio de segurana alcanada por um conjunto de aes destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s atividades que possam comprometer a sade humana, animal e o meio ambiente. 4.7 Calibrao: Conjunto de operaes que estabelece, sob condies especificadas, a
correspondncia entre valores indicados por um instrumento, sistema de medio ou material de referncia, e os valores correspondentes estabelecidos por padres. 4.8 Coleta laboratorial domiciliar: Realizao da coleta de amostra de paciente em sua residncia. 4.9 Coleta laboratorial em empresa: Realizao da coleta de amostra de paciente no mbito de uma empresa. 4.10 Coleta laboratorial em unidade mvel: Realizao da coleta de amostra de paciente em unidade mvel. 4.11 Controle da qualidade: Tcnicas e atividades operacionais utilizadas para monitorar o cumprimento dos requisitos da qualidade especificados. 4.12 Controle externo da qualidade - CEQ: Atividade de avaliao do desempenho de sistemas analticos atravs de ensaios de proficincia, anlise de padres certificados e comparaes interlaboratoriais.Tambm chamada Avaliao Externa da Qualidade. 4.13 Controle interno da qualidade - CIQ: Procedimentos conduzidos em associao com o exame de amostras de pacientes para avaliar se o sistema analtico est operando dentro dos limites de tolerncia pr-definidos. 4.14 Desinfeco: Processo fsico ou qumico que destri ou inativa a maioria dos microrganismos patognicos de objetos inanimados e superfcies, com exceo de esporos bacterianos. 4.15 Ensaio de proficincia: Determinao do desempenho analtico por meio de comparaes interlaboratoriais conduzidas por provedores de ensaio de proficincia. 4.16 Equipamento laboratorial: Designao genrica para um dispositivo empregado pelo laboratrio clnico como parte integrante do processo de realizao de anlises laboratoriais. 4.17 Esterilizao: Processo fsico ou qumico que destri todas as formas de vida microbiana, ou seja, bactrias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e vrus. 4.18 Fase pr-analtica: Fase que se inicia com a solicitao da anlise, passando pela obteno da amostra e finda ao se iniciar a anlise propriamente dita. 4.19 Fase analtica: Conjunto de operaes, com descrio especifica, utilizada na realizao das anlises de acordo com determinado mtodo. 4.20 Fase ps-analtica: Fase que se inicia aps a obteno de resultados vlidos das anlises e finda com a emisso do laudo, para a interpretao pelo solicitante. 4.21 Garantia da qualidade: Conjunto de atividades planejadas, sistematizadas e implementadas com o objetivo de cumprir os requisitos da qualidade especificados. 4.22 Inspeo sanitria: Conjunto de procedimentos tcnicos e administrativos, de competncia da autoridade sanitria local, que previnem e controlam o risco sanitrio em estabelecimentos sujeitos a este controle.
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4.23 Instruo escrita: Toda e qualquer forma escrita de documentar as atividades realizadas pelo estabelecimento e ou servio. 4.24Instrumento laboratorial: Designao genrica para dispositivos empregados pelo laboratrio clnico que auxiliam na execuo de uma tarefa analtica. 4.25 Insumo: Designao genrica do conjunto dos meios ou materiais utilizados em um processo para gerao de um produto ou servio. 4.26 Laboratrio clnico: Servio destinado anlise de amostras de paciente, com a finalidade de oferecer apoio ao diagnstico e teraputico, compreendendo as fases pr-analtica, analtica e psanaltica. 4.27 Laboratrio de apoio: Laboratrio clnico que realiza anlises em amostras enviadas por outros laboratrios clnicos. 4.28 Laudo laboratorial: Documento que contm os resultados das anlises laboratoriais, validados e autorizados pelo responsvel tcnico do laboratrio ou seu substituto. 4.29 Limpeza: Processo sistemtico e contnuo para a manuteno do asseio ou, quando necessrio, para a retirada de sujidade de uma superfcie. 4.30 Material biolgico humano: Tecido ou fluido constituinte do organismo humano. 4.31 Metodologia prpria em laboratrio clnico (in house): Reagentes ou sistemas analticos produzidos e validados pelo prprio laboratrio clnico, exclusivamente para uso prprio, em pesquisa ou em apoio diagnstico. 4.32 Paciente de laboratrio: Pessoa da qual coletado o material ou amostra biolgica para ser submetida anlise laboratorial. 4.33 Posto de coleta laboratorial: Servio vinculado a um laboratrio clnico, que realiza atividade laboratorial, mas no executa a fase analtica dos processos operacionais, exceto os exames presenciais, cuja realizao ocorre no ato da coleta. 4.34 Produto para diagnstico de uso in vitro: Reagentes, padres, calibradores, controles, materiais, artigos e instrumentos, junto com as instrues para seu uso, que contribuem para realizar uma determinao qualitativa, quantitativa ou semi-quantitativa de uma amostra biolgica e que no estejam destinados a cumprir funo anatmica, fsica ou teraputica alguma, que no sejam ingeridos, injetados ou inoculados em seres humanos e que so utilizados unicamente para provar informao sobre amostras obtidas do organismo humano. 4.35 Profissional legalmente habilitado: Profissional com formao superior inscrito no respectivo Conselho de Classe, com suas competncias atribudas por Lei. 4.36 Rastreabilidade: Capacidade de recuperao do histrico, da aplicao ou da localizao daquilo que est sendo considerado, por meio de identificaes registradas. 4.37 Responsvel Tcnico - RT: Profissional legalmente habilitado que assume perante a Vigilncia Sanitria a Responsabilidade Tcnica do laboratrio clnico ou do posto de coleta laboratorial. 4.38 Saneante: Substncia ou preparao destinada higienizao, desinfeco, esterilizao ou desinfestao domiciliar, em ambientes coletivos, pblicos e privados, em lugares de uso comum e no tratamento da gua.
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4.39 Superviso: Atividade realizada com a finalidade de verificar o cumprimento das especificaes estabelecidas nos processos operacionais. 4.40 Teste Laboratorial Remoto-TLR: Teste realizado por meio de um equipamento laboratorial situado fisicamente fora da rea de um laboratrio clnico. Tambm chamado Teste Laboratorial Porttil -TLP, do ingls Point-of-care testing -POCT. 4.41 Validao: Procedimento que fornece evidncias de que um sistema apresenta desempenho dentro das especificaes da qualidade, de maneira a fornecer resultados vlidos. 4.42 Verificao da calibrao: Ato de demonstrar que um equipamento de medio apresenta desempenho dentro dos limites de aceitabilidade, em situao de uso.
5 CONDIES GERAIS
51 Organizao 51.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem possuir alvar atualizado, expedido pelo rgo sanitrio competente. 51.2 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem possuir um profissional legalmente habilitado como responsvel tcnico. 5.1.2.1 O profissional legalmente habilitado pode assumir, perante a vigilncia sanitria, a responsabilidade tcnica por no mximo: 02 (dois) laboratrios clnicos ou 02 (dois) postos de coleta laboratorial ou 01 (um) laboratrio clnico e 01 (um) posto de coleta laboratorial. 51.2.2 Em caso de impedimento do responsvel tcnico, o laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem contar com um profissional legalmente habilitado para substitu-lo. 51.3 Todo laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial, pblico e privado devem estar inscritos no Cadastro Nacional de Estabelecimentos de Sade - CNES. 5.1.4 A direo e o responsvel tcnico do laboratrio clnico e do posto de coleta laboratorial tm a responsabilidade de planejar, implementar e garantir a qualidade dos processos, incluindo: a) a equipe tcnica e os recursos necessrios para o desempenho de suas atribuies; b) a proteo das informaes confidenciais dos pacientes; c) a superviso do pessoal tcnico por profissional de nvel superior legalmente habilitado durante o seu perodo de funcionamento; d) os equipamentos, reagentes, insumos e produtos utilizados para diagnstico de uso in vitro, em conformidade com a legislao vigente; e) a utilizao de tcnicas conforme recomendaes do fabricante (equipamentos e produtos) ou com base cientfica comprovada; f) a rastreabilidade de todos os seus processos. 5.1.5 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instrues escritas e atualizadas das rotinas tcnicas implantadas. 5.1.6 O posto de coleta laboratorial deve possuir vnculo com apenas um laboratrio clnico. 5.1.6.1 Os postos de coleta laboratorial localizados em unidades pblicas de sade devem ter seu vnculo definido formalmente pelo gestor local. Mod II - 5
5.1.7 O laboratrio clnico deve possuir estrutura organizacional documentada. 5.1.8 As atividades de coleta domiciliar, em empresa ou em unidade mvel devem estar vinculadas a um laboratrio clnico e devem seguir os requisitos aplicveis definidos neste Regulamento Tcnico. 5.2.Recursos Humanos 5.2.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem manter disponveis registros de formao e qualificao de seus profissionais compatveis com as funes desempenhadas. 5.2.2 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem promover treinamento e educao permanente aos seus funcionrios mantendo disponveis os registros dos mesmos. 5.2.3 Todos os profissionais do laboratrio clnico e do posto de coleta laboratorial devem ser vacinados em conformidade com a legislao vigente. 5.2.4 A admisso de funcionrios deve ser precedida de exames mdicos em conformidade com o PCMSO da NR-7 da Portaria MTE n 3214 de 08/06/1978 e Lei n 6514 de 22/12/1977, suas atualizaes ou outro instrumento legal que venha substitu-la. 5.3 Infra-Estrutura 5.3.1 A infra-estrutura fsica do laboratrio clnico e do posto de coleta devem atender aos requisitos da RDC/ANVISA n. 50 de 21/02/2002, suas atualizaes, ou outro instrumento legal que venha substitu-la. 5.4 Equipamentos e Instrumentos Laboratoriais 5.4.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem: a) possuir equipamentos e instrumentos de acordo com a complexidade do servio e necessrios ao atendimento de sua demanda; b) manter instrues escritas referentes a equipamento ou instrumento, as quais podem ser substitudas ou complementadas por manuais do fabricante em lngua portuguesa; c) realizar e manter registros das manutenes preventivas e corretivas; d) verificar ou calibrar os instrumentos a intervalos regulares, em conformidade com o uso, mantendo os registros dos mesmos; e) verificar a calibrao de equipamentos de medio mantendo registro das mesmas. 5.4.2 Os equipamentos e instrumentos utilizados, nacionais e importados, devem estar regularizados junto a ANVISA/MS, de acordo com a legislao vigente. 5.4.3 Os equipamentos que necessitam funcionar com temperatura controlada devem possuir registro da verificao da mesma. 5.5 Produtos para diagnstico de uso in vitro 5.5.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem registrar a aquisio dos produtos para diagnstico de uso in vitro, reagentes e insumos, de forma a garantir a rastreabilidade. 5.5.2 Os produtos para diagnstico de uso in vitro, reagentes e insumos adquiridos devem estar regularizados junto a ANVISA/MS de acordo com a legislao vigente.
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5.5.3 O reagente ou insumo preparado ou aliquotado pelo prprio laboratrio deve ser identificado com rtulo contendo: nome, concentrao, nmero do lote (se aplicvel), data de preparao, identificao de quem preparou (quando aplicvel), data de validade, condies de armazenamento, alm de informaes referentes a riscos potenciais. 5.5.3.1 Devem ser mantidos registros dos processos de preparo e do controle da qualidade dos reagentes e insumos preparados. 5.5.4 A utilizao dos reagentes e insumos deve respeitar as recomendaes de uso do fabricante, condies de preservao, armazenamento e os prazos de validade, no sendo permitida a sua revalidao depois de expirada a validade. 5.5.5 O laboratrio clnico que utilizar metodologias prprias - In House, deve document-las incluindo, no mnimo: a) descrio das etapas do processo; b) especificao e sistemtica de aprovao de insumos, reagentes e equipamentos e instrumentos. c) sistemtica de validao. 5.5.5.1 O laboratrio clnico deve manter registro de todo o processo e especificar no laudo que o teste preparado e validado pelo prprio laboratrio. 5.6 Descarte de Resduos e Rejeitos 5.6.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem implantar o Plano de Gerenciamento de Resduos de Servios de Sade (PGRSS) atendendo aos requisitos da RDC/ANVISA n 306 de 07/12/2004, suas atualizaes, ou outro instrumento legal que venha substitu-la. 5.7 Biossegurana 5.7.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem manter atualizados e disponibilizar, a todos os funcionrios, instrues escritas de biossegurana, contemplando no mnimo os seguintes itens: a) normas e condutas de segurana biolgica, qumica, fsica, ocupacional e ambiental; b) instrues de uso para os equipamentos de proteo individual (EPI) e de proteo coletiva (EPC); c) procedimentos em caso de acidentes; d) manuseio e transporte de material e amostra biolgica. 5.7.2 O Responsvel Tcnico pelo laboratrio clnico e pelo posto de coleta laboratorial deve documentar o nvel de biossegurana dos ambientes e/ou reas, baseado nos procedimentos realizados, equipamentos e microorganismos envolvidos, adotando as medidas de segurana compatveis. 5.8 Limpeza, Desinfeco e Esterilizao 5.8.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instrues de limpeza, desinfeco e esterilizao, quando aplicvel, das superfcies, instalaes, equipamentos, artigos e materiais.
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5.8.2 Os saneantes e os produtos usados nos processos de limpeza e desinfeco devem ser utilizados segundo as especificaes do fabricante e estarem regularizados junto a ANVISA/MS, de acordo com a legislao vigente.
6 PROCESSOS OPERACIONAIS
6.1 Fase pr-analtica 6.1.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem disponibilizar ao paciente ou responsvel, instrues escritas e ou verbais, em linguagem acessvel, orientando sobre o preparo e coleta de amostras tendo como objetivo o entendimento do paciente. 6.1.2 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem solicitar ao paciente documento que comprove a sua identificao para o cadastro. 6.1.2.1 Para pacientes em atendimento de urgncia ou submetidos a regime de internao, a comprovao dos dados de identificao tambm poder ser obtida no pronturio mdico. 6.1.3 Os critrios de aceitao e rejeio de amostras, assim como a realizao de exames em amostras com restries devem estar definidos em instrues escritas. 6.1.4 O cadastro do paciente deve incluir as seguintes informaes: a) nmero de registro de identificao do paciente gerado pelo laboratrio; b) nome do paciente; c) idade, sexo e procedncia do paciente; d) telefone e/ou endereo do paciente, quando aplicvel; e) nome e contato do responsvel em caso de menor de idade ou incapacitado; f) nome do solicitante; g) data e hora do atendimento; h) horrio da coleta, quando aplicvel; i) exames solicitados e tipo de amostra; j) quando necessrio: informaes adicionais, em conformidade com o exame (medicamento em uso, dados do ciclo menstrual, indicao/observao clnica, dentre outros de relevncia); k) data prevista para a entrega do laudo; l) indicao de urgncia, quando aplicvel. 6.1.5 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem fornecer ao paciente ambulatorial ou ao seu responsvel, um comprovante de atendimento com: nmero de registro, nome do paciente, data do atendimento, data prevista de entrega do laudo, relao de exames solicitados e dados para contato com o laboratrio. 6.1.6. O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de meios que permitam a rastreabilidade da hora do recebimento e/ou coleta da amostra. 6.1.7 A amostra deve ser identificada no momento da coleta ou da sua entrega quando coletada pelo paciente.
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6.1.7.1 Deve ser identificado o nome do funcionrio que efetuou a coleta ou que recebeu a amostra de forma a garantir a rastreabilidade. 6.1.8 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instrues escritas que orientem o recebimento, coleta e identificao de amostra. 6.1.9 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instrues escritas para o transporte da amostra de paciente, estabelecendo prazo, condies de temperatura e padro tcnico para garantir a sua integridade e estabilidade. 6.1.10 A amostra de paciente deve ser transportada e preservada em recipiente isotrmico, quando requerido, higienizvel, impermevel, garantindo a sua estabilidade desde a coleta at a realizao do exame, identificado com a simbologia de risco biolgico, com os dizeres Espcimes para Diagnstico e com nome do laboratrio responsvel pelo envio. 6.1.11 O transporte da amostra de paciente, em reas comuns a outros servios ou de circulao de pessoas, deve ser feito em condies de segurana conforme item 5.7. 6.1.12 Quando da terceirizao do transporte da amostra, deve existir contrato formal obedecendo aos critrios estabelecidos neste Regulamento. 6.1.13 Quando da importao ou exportao de Espcimes para Diagnstico, devem ser seguidas a RDC/ANVISA n 01, de 06 de dezembro de 2002 e a Portaria MS n 1985, de 25 de outubro de 2001, suas atualizaes ou outro instrumento legal que venha substitu-las. 6.2. Fase Analtica 6.2.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem dispor de instrues escritas, disponveis e atualizadas para todos os processos analticos, podendo ser utilizadas as instrues do fabricante. 6.2.2 O processo analtico deve ser o referenciado nas instrues de uso do fabricante, em referncias bibliogrficas ou em pesquisa cientificamente vlida conduzida pelo laboratrio. 6.2.3 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem disponibilizar por escrito, uma relao que identifique os exames realizados no local, em outras unidades do prprio laboratrio e os que so terceirizados. 6.2.4 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem definir mecanismos que possibilitem a agilizao da liberao dos resultados em situaes de urgncia. 6.2.5 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem definir limites de risco, valores crticos ou de alerta, para os analitos com resultado que necessita tomada imediata de deciso. 6.2.5.1 O laboratrio e o posto de coleta laboratorial devem definir o fluxo de comunicao ao mdico, responsvel ou paciente quando houver necessidade de deciso imediata. 6.2.6 O laboratrio clnico deve monitorar a fase analtica por meio de controle interno e externo da qualidade. 6.2.7 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem definir o grau de pureza da gua reagente utilizada nas suas anlises, a forma de obteno, o controle da qualidade. 6.2.8 O laboratrio clnico pode contar com laboratrios de apoio para realizao de exames. 6.2.8.1 O laboratrio de apoio deve seguir o estabelecido neste regulamento tcnico.
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6.2.9 O laboratrio clnico deve: a) manter um cadastro atualizado dos laboratrios de apoio; b) possuir contrato formal de prestao destes servios; c) avaliar a qualidade dos servios prestados pelo laboratrio de apoio. 6.2.10 O laudo emitido pelo laboratrio de apoio deve estar disponvel e arquivado pelo prazo de 5 (cinco) anos. 6.2.11 Os servios que realizam testes laboratoriais para deteco de anticorpos anti-HIV devem seguir, o disposto neste Regulamento Tcnico, alm do disposto na Portaria MS n. 59 de 28 de janeiro de 2003 e na Portaria SVS n. 34 de 28 de julho de 2005, suas atualizaes ou outro instrumento legal que venha substitu-la. 6.2.12 Os resultados laboratoriais que indiquem suspeita de doena de notificao compulsria devem ser notificados conforme o estabelecido no Decreto no 49.974-A, de 21 de janeiro de 1961, e na Portaria no 2325, de 08 de dezembro de 2003, suas atualizaes, ou outro instrumento legal que venha a substitu-la. 6.2.13 A execuo dos Testes Laboratoriais Remotos - TLR (Point-of-care) e de testes rpidos, deve estar vinculada a um laboratrio clnico, posto de coleta ou servio de sade pblica ambulatorial ou hospitalar. 6.2.14 O Responsvel Tcnico pelo laboratrio clnico responsvel por todos os TLR realizados dentro da instituio, ou em qualquer local, incluindo, entre outros, atendimentos em hospital-dia, domiclios e coleta laboratorial em unidade mvel. 6.2.15 A relao dos TLR que o laboratrio clnico executa deve estar disponvel para a autoridade sanitria local. 6.2.15.1 O laboratrio clnico deve disponibilizar nos locais de realizao de TLR procedimentos documentados orientando com relao s suas fases pr-analtica, analtica e ps-analtica, incluindo: a) sistemtica de registro e liberao de resultados provisrios; b) procedimento para resultados potencialmente crticos; c) sistemtica de reviso de resultados e liberao de laudos por profissional habilitado. 6.2.15.2 A realizao de TRL e dos testes rpidos est condicionada a emisso de laudos que determine suas limitaes diagnsticas e demais indicaes estabelecidos no item 6.3. 6.2.15.3 O laboratrio clnico deve manter registros dos controles da qualidade, bem como procedimentos para a realizao dos mesmos. 6.2.15.4 O laboratrio clnico deve promover e manter registros de seu processo de educao permanente para os usurios dos equipamentos de TLR. 6.3 Fase ps-analtica 6.3.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem possuir instrues escritas para emisso de laudos, que contemplem as situaes de rotina, plantes e urgncias. 6.3.2 O laudo deve ser legvel, sem rasuras de transcrio, escrito em lngua portuguesa, datado e assinado por profissional de nvel superior legalmente habilitado. Mod II - 10
6.3.3 O laudo deve conter no mnimo os seguintes itens: a) identificao do laboratrio; b) endereo e telefone do laboratrio; c) identificao do Responsvel Tcnico (RT); d) n. de registro do RT no respectivo conselho de classe profissional; e) identificao do profissional que liberou o exame; f) n. registro do profissional que liberou o exame no respectivo conselho de classe do profissional g) n. de registro do Laboratrio Clnico no respectivo conselho de classe profissional; h) nome e registro de identificao do cliente no laboratrio; i) data da coleta da amostra; j) data de emisso do laudo; k) nome do exame, tipo de amostra e mtodo analtico; l) resultado do exame e unidade de medio; m) valores de referncia, limitaes tcnicas da metodologia e dados para interpretao; n) observaes pertinentes. 6.3.4 Quando for aceita amostra de paciente com restrio, esta condio deve constar no laudo. 6.3.5 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial que optarem pela transcrio do laudo emitido pelo laboratrio de apoio, devem garantir a fidedignidade do mesmo, sem alteraes que possam comprometer a interpretao clnica. 6.3.6 O responsvel pela liberao do laudo pode adicionar comentrios de interpretao ao texto do laboratrio de apoio, considerando o estado do paciente e o contexto global dos exames do mesmo. 6.3.7 O laudo de anlise do diagnstico sorolgico de Anticorpos Anti-HIV deve estar de acordo com a Portaria MS n 59/2003, suas atualizaes ou outro instrumento legal que venha a substitu-la. 6.3.8 As cpias dos laudos de anlise bem como dados brutos devem ser arquivados pelo prazo de 5 (cinco) anos, facilmente recuperveis e de forma a garantir a sua rastreabilidade. 6.3.8.1 Caso haja necessidade de retificao em qualquer dado constante do laudo j emitido, a mesma dever ser feita em um novo laudo onde fica clara a retificao realizada.
7 REGISTROS
7.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial devem garantir a recuperao e disponibilidade de seus registros crticos, de modo a permitir a rastreabilidade do laudo liberado. 7.2 As alteraes feitas nos registros crticos devem conter data, nome ou assinatura legvel do responsvel pela alterao, preservando o dado original.
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8 GARANTIA DA QUALIDADE
8.1 O laboratrio clnico deve assegurar a confiabilidade dos servios laboratoriais prestados, por meio de, no mnimo: a) controle interno da qualidade; b) controle externo da qualidade (ensaios de proficincia).
9 CONTROLE DA QUALIDADE
9.1 Os programas de Controle Interno da Qualidade (CIQ) e Controle Externo da Qualidade (CEQ) devem ser documentados, contemplando: a) lista de analitos; b) forma de controle e freqncia de utilizao; c) limites e critrios de aceitabilidade para os resultados dos controles; d) avaliao e registro dos resultados dos controles. 9.2 Controle Interno da Qualidade - CIQ 9.2.1 O laboratrio clnico deve realizar Controle Interno da Qualidade contemplando: a) monitoramento do processo analtico pela anlise das amostras controle, com registro dos resultados obtidos e anlise dos dados; b) definio dos critrios de aceitao dos resultados por tipo de analito e de acordo com a metodologia utilizada; c) liberao ou rejeio das anlises aps avaliao dos resultados das amostras controle. 9.2.2 Para o CIQ, o laboratrio clnico deve utilizar amostras controle comerciais, regularizados junto a ANVISA/MS de acordo com a legislao vigente. 9.2.2.1 Formas alternativas descritas na literatura podem ser utilizadas desde que permitam a avaliao da preciso do sistema analtico. 9.2.3 O laboratrio clnico deve registrar as aes adotadas decorrentes de rejeies de resultados de amostras controle. 9.2.4 As amostras controle devem ser analisadas da mesma forma que amostras dos pacientes. 9.3 Controle Externo da Qualidade - CEQ 9.3.1 O laboratrio clnico deve participar de Ensaios de Proficincia para todos os exames realizados na sua rotina. 9.3.1.1 Para os exames no contemplados por programas de Ensaios de Proficincia, o laboratrio clnico deve adotar formas alternativas de Controle Externo da Qualidade descritas em literatura cientfica. 9.3.2 A participao em Ensaios de Proficincia deve ser individual para cada unidade do laboratrio clnico que realiza as anlises. 9.3.3 A normalizao sobre o funcionamento dos Provedores de Ensaios de Proficincia ser definida em resoluo especfica, desta ANVISA .
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9.3.4 O laboratrio clnico deve registrar os resultados do Controle Externo da Qualidade, inadequaes, investigao de causas e aes tomadas para os resultados rejeitados ou nos quais a proficincia no foi obtida. 9.3.5 As amostras controle devem ser analisadas da mesma forma que as amostras dos pacientes.
10 DISPOSIES TRANSITRIAS
10.1 O laboratrio clnico e o posto de coleta laboratorial tm o prazo de 180 (cento e oitenta) dias para se adequarem ao estabelecido neste Regulamento Tcnico a partir da data de sua publicao.
Administrativos.Vocabulrio da Sade em Qualidade e Melhoria da Gesto / Secretaria Executiva, Subsecretaria de Assuntos Administrativos; elaborao de Jeov Dias Martins. -Braslia: Ministrio da Sade, 2002. 98 p. (Srie F. Comunicao e Educao em Sade). 11.9 BRASIL. Ministrio da Sade. Glossrio do Ministrio da Sade: projeto terminologia em sade / Ministrio da Sade - Braslia. Ministrio da Sade, 2004. 11.10 BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia Sanitria. Portaria n. 8, de 23 de janeiro de 1996. Dispe sobre o registro de produtos para diagnstico de uso in vitro na Secretaria de Vigilncia Sanitria. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 24 jan. 1996.
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11.11 BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n. 1985, de 25 de outubro de 2001. Aprova o Regulamento Tcnico MERCOSUL para Transporte no MERCOSUL de Substncias Infecciosas e Amostras para Diagnstico, no MERCOSUL que consta como Anexo e faz parte da presente Portaria. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 06 nov. 2001. 11.12. BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n. 1.943, de 18 de outubro de 2001 Define a relao de doenas de notificao compulsria para todo territrio nacional. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 24 out. 2001. 11.13 BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n. 787, de 23 de outubro de 2002 - parte 1. Manual de Apoio aos Gestores do SUS - Organizao da Rede de Laboratrios Clnicos. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 24 out. 2002. 11.14 BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n. 788, de 23 de outubro de 2002. Manual de Apoio aos Gestores do Sistema nico de Sade - SUS para a Organizao dos Postos de Coleta da Rede de Laboratrios Clnicos. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 24 out. 2002. 11.15 BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n. 59, de 28 de janeiro de 2003. Dispe sobre a subrede de laboratrios do Programa Nacional de DST e Aids. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, Edio Extra, 30 jan. 2003. 11.16 BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n.34 de 28 de julho de 2005 Regulamenta o uso de testes rpidos para diagnstico da infeco pelo HIV em situaes especiais. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, Edio de 29 jul. 2005. 11.17 BRASIL. Ministrio do Trabalho. Gabinete do Ministro. Portaria n. 3.214, de 08 de junho de 1978. Dispe sobre a Aprovao das Normas Regulamentadoras -NR- do Captulo V, Ttulo II, da Consolidao das Leis do Trabalho, relativas Segurana e Medicina do TrabaIho. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 06 jul. 1978. 11.18 BRASIL. Ministrio do Trabalho. Portaria n. 8, de 08 de maio de 1996- NR 07. Altera Norma Regulamentadora NR-7- Programa de Controle Mdico de Sade Ocupacional. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, v. 134, n. 91, p. 8202, 13 mai. 1996. 11.19 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n. 185, de 22 de outubro de 2001. Aprova o Regulamento Tcnico que consta no anexo desta Resoluo, que trata do registro, alterao, revalidao e cancelamento do registro de produtos mdicos na Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 24 out. 2001. 11.20 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n. 50, de 21 de fevereiro de 2002. Dispe sobre o Regulamento Tcnico para planejamento, programao, elaborao e avaliao de projetos fsicos de estabelecimentos assistenciais de sade. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil. Braslia, 20 mar. 2002. 12.20 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n. 260, de 23 de setembro de 2002. Regula os produtos para a sade. Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 03 out. 2002. 11.21 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n. 01, de 06 dezembro de 2002. Aprovar, conforme Anexo, o Regulamento Tcnico para fins de vigilncia sanitria de mercadorias importadas. Retificao - Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 10 jan. 2003 - Prorrogada pela Resoluo RDC n. 20, de 30 de janeiro de 2003.
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11.22 BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n. 33, de 25 de fevereiro de 2003. Dispe sobre o Regulamento Tcnico para o gerenciamento de resduos de servios de sade Dirio Oficial da Unio da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, 05 mar. 2003. 11.23 IATA - Dangerous Good Regulations (DGR) 44. Edicion, 2003. 11.24 ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas - Gesto da qualidade no laboratrio clnico NBR 14500 - jun 2000. 11.25 ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas - Glossrio de termos para uso no laboratrio clnico e no diagnstico in vitro - NBR - 14501 - mar 2001. 11.26 ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas - Diagnstico in vitro - Recomendaes e critrios para aquisio, recepo, transporte e armazenamento de produtos - NBR 14711 - jun 2001. 11.27 ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas - Laboratrio Clnico - NBR 14785 - dez de 2001. 11.28 ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas - Laboratrio Clnico - Requisitos de segurana - NBR 14785 - dez 2001. 11.29 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Guideline for the Safe Transport of Infectious Substances and Diagnostic Specimens, Who/EMC/97.3. [online]. Available from World Wide Web: http://www.who.int/emc/pdfs/emc97_3.pdf
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Fornecer periodicamente dados relacionados com a etiologia das infeces hospitalares e da resistncia s drogas; Executar outras atividades afins de natureza no rotineira e de relevncia em determinadas situaes como, por exemplo, estudos microbiolgicos de materiais inanimados, portadores, desinfetantes, etc.
Alm desse equipamento mnimo, o laboratrio poder contar com outros aparelhos opcionais: microscpio estereoscpico congelador (-20oC ou -70oC) bomba de vcuo para filtrao com membranas potencimetro balana analtica
RECURSOS HUMANOS
recomendvel que a superviso tcnico-cientfica do laboratrio esteja a cargo de mdico ou profissional de nvel superior, especializado em microbiologia, e, se possvel, em tempo integral.
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SEGURANA LABORATORIAL
Pode ser definida como sendo um conjunto de aes voltadas para a preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes a estas atividades e que podem comprometer a sade do homem, dos animais, do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. A rotina do Laboratrio de Microbiologia envolve exposio tanto com material clnico e reagentes qumicos como com potenciais agentes patognicos concentrados em meio de cultura. Assim profissionais da rea de sade e outros trabalhadores que exercem suas atividades em laboratrios, esto sob risco de desenvolver doena por exposio a agentes infecciosos, produtos qumicos txicos e inflamveis, entre outros. Atualmente, com a sofisticao das novas tcnicas de diagnstico, observamos profissionais de outras reas, tais como fsicos, qumicos, analistas de sistemas, etc, envolvidos em atividades com exposio a agentes infecciosos e por outro lado, microbiologistas manipulando substncias qumicas ou materiais radioativos. A responsabilidade legal pela segurana em ambientes de trabalho cabe aos administradores de hospitais e laboratrios. No entanto, os funcionrios tambm so responsveis pela sua adeso s tcnicas microbiolgicas seguras e da incorporao das normas de biossegurana ao seu trabalho dirio delineadas no Manual de Segurana de Laboratrio. Deve-se designar um encarregado ou uma comisso de segurana cujas atribuies incluem a redao, publicao e implementao das normas e instrues de segurana. Dentre os regulamentos de segurana inclui-se medidas de proteo pessoal; manuseio de equipamentos, amostras e materiais; e outras precaues. Os funcionrios devem ser informados destas normas e instrues atravs de cursos e treinamentos regularmente programados. Cabe tambm ao encarregado/comisso de segurana juntamente com os administradores/supervisores dos hospitais e laboratrios de ajustar e corrigir falhas ou irregularidades de conduta.
CONTROLE DE QUALIDADE
Para o programa bsico de controle de qualidade em microbiologia, deve-se incluir, alm de uma lista de itens especficos, o senso comum, o bom julgamento e uma constante ateno aos detalhes. Para o controle de qualidade deve-se estabelecer o padro mnimo e delinear as diversas etapas que devem ser seguidas para o controle dirio e vigilncia de todas as facetas do programa. As diretrizes para o controle de qualidade devem constar em um manual, no qual estejam detalhadas prticas tais como procedimentos para monitorar o funcionamento dos equipamentos, o controle da reatividade dos meios e reagentes, os prazos de validade, os resultados de todos os testes, etc. Devem ser elaborados formulrios adequados para coletar dados, de modo que qualquer anormalidade possa ser facilmente detectada. O encarregado tambm deve revisar todos os registros de controle e verificar que sejam anotadas todas as incidncias fora do controle e as respectivas aes corretivas tomadas. Os laboratrios devem tambm dispor de uma lista de inspeo para realizar avaliaes pontuais dos controles de qualidade um requerimento para credenciamento de laboratrios e/ou auditoria e fiscalizao sanitria. Procedimento Operacional Padro (POP)
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Para melhoria na qualidade dentro do laboratrio recomenda-se a elaborao de POPs, ou seja, protocolos que descrevem detalhadamente cada atividade realizada no laboratrio, desde a coleta at a emisso do resultado final, incluindo utilizao de equipamentos, procedimentos tcnicos e inclusive cuidados de biossegurana e condutas a serem adotadas em acidentes. Os POPs tm como objetivo padronizar todas as aes para que diferentes tcnicos possam compreender e executar, da mesma maneira, uma determinada tarefa, garantindo assim qualidade. Esses protocolos devem estar escritos de forma clara e completa possibilitando a compreenso e adeso de todos. Os POPs devem estar disponveis em local de acesso e conhecido de todos os profissionais que atuam no ambiente laboratorial, revisados e atualizados periodicamente e devem ser assinados pelo responsvel do laboratrio.
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agentes patognicos e potencialmente letais devendo ser supervisionados por competentes cientistas que possuam vasta experincia com estes agentes. Todos os procedimentos que envolverem a manipulao de material infeccioso devem ser conduzidos dentro de cabines de segurana biolgica ou outro sistema de conteno fsica. Os manipuladores devem usar roupas de proteo individual. O laboratrio dever ter instalaes compatveis para o NB-3. Para alguns casos, quando no existirem as condies especficas para o NB-3, particularmente em instalaes laboratoriais sem rea de acesso especfica, com ambientes selados ou fluxo de ar unidirecional, as atividades de rotina e operaes repetitivas podem ser realizadas em laboratrio com instalaes NB-2, desde que acrescidas das prticas recomendadas para NB-3 e do uso de equipamentos de conteno para NB-3. Cabe ao Pesquisador Principal a deciso de implementar essas modificaes, comunicando-as a CIBio e CTNBio.
Classe de Risco 1
(baixo risco individual e baixo risco para a comunidade) - organismo que no causa doena ao homem ou animal. Ex: microrganismos usados na produo de cerveja, vinho, po e queijo. (Lactobacillus casei, Penicillium camembertii, S. cerevisiae, etc). (risco individual moderado e risco limitado para a comunidade) - patgeno que causa doena ao homem ou aos animais, mas que no consiste em srio risco, a quem o manipula em condies de conteno, comunidade, aos seres vivos e ao meio ambiente. As exposies laboratoriais podem causar infeco, mas a existncia de medidas eficazes de tratamento e preveno limita o risco. Exemplo: bactrias - Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; vrus - EBV, herpes; fungos - Candida albicans; parasitas - Plasmodium, Schistosoma
Classe de Risco 2
Classe de Risco 3
Classe de Risco 4
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OGM DO GRUPO I
Receptor ou parental
- deve ser adequadamente caracterizado quanto a todos os aspectos, destacando-se aqueles que
possam representar riscos ao homem e ao meio ambiente, e desprovido de seqncias nocivas conhecidas. a funo projetada.
- deve ser de tamanho limitado, no que for possvel, s seqncias genticas necessrias para realizar - no deve incrementar a estabilidade do organismo modificado no meio ambiente. - deve ser escassamente mobilizvel.
- no deve transmitir nenhum marcador de resistncia a organismos que, de acordo com os conhecimentos disponveis, no o adquira de forma natural. Microorganismos geneticamente modificados
- no-patognicos. - que ofeream a mesma segurana que o organismo receptor ou parental no reator ou fermentador,
mas com sobrevivncia e/ou multiplicao limitadas, sem efeitos negativos para o meio ambiente. Outros microorganismos geneticamente modificados que poderiam incluir-se no Grupo I, desde que renam as condies estipuladas no item anterior - microrganismos construdos inteiramente a partir de um nico receptor procaritico (incluindo plasmdeos e vrus endgenos) ou de um nico receptor eucaritico (incluindo cloroplastos, mitocndrias e plasmdeos, mas excluindo os vrus). - organismos compostos inteiramente por seqncias genticas de diferentes espcies que troquem tais seqncias mediante processos fisiolgicos conhecidos.
OGM DO GRUPO II
Todos aqueles no includos no grupo II, ou seja, qualquer organismo resultante de organismo receptor ou parental classificado como patognico para o homem e animais como classe de risco 2, 3, ou 4. Nota: Os laboratrios clnicos e de diagnsticos so geralmente classificados como Nvel 2 ou 3 de Biossegurana.
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As linhas de vcuo devero ser protegidas por sifes contendo desinfetantes lquidos e filtros HEPA, ou o equivalente. Os filtros devero ser substitudos quando necessrio. Uma alternativa usar uma bomba a vcuo porttil (tambm adequadamente protegida com sifes e filtros). As janelas devem ser fechadas, lacradas e resistentes a danos fsicos.
Deve haver suprimento de boa qualidade de gs, eletricidade assim como de luz de emergncia; o gerador aconselhvel para os equipamentos essenciais como estufas, cabine de segurana biolgica, refrigeradores, etc. A manuteno regular e eficiente desses servios obrigatria. A gua de torneira, no prpria para uso no Laboratrio Clnico; deve ser providenciado um sistema adequado de suprimento de gua purificada a fim de evitar interferncias nos testes ou ensaios. Segurana contra incndios e atos de vandalismo deve ser considerado; portanto portas e janelas apropriadas e chaves de uso restrito so fundamentais. Considere a construo de novos laboratrios longe de rea pblicas. Laboratrios NB-3 devem estar localizados isoladamente de reas que so abertas ao trfego interno irrestrito; deve ser projetado de modo a impedir a entrada de insetos e outros organismos indesejveis. O projeto da instalao e os procedimentos operacionais do NB-3 devem ser documentados. Os parmetros operacionais e das instalaes devero ser verificados quanto ao funcionamento ideal antes que o estabelecimento inicie suas atividades. As instalaes devero ser verificadas pelo menos uma vez ao ano.
ACCESSO
Para NB-1, o acesso ao laboratrio deve ser limitado ou restrito de acordo com a definio do chefe de laboratrio, quando estiver sendo realizado experimento ou trabalhos com amostras e culturas; alm dessas exigncias, nos laboratrios NB-2 e NB-3, o chefe de laboratrio tem a responsabilidade de limitar o acesso; cabe ao mesmo avaliar cada situao e autorizar quem poder entrar ou trabalhar no laboratrio. Menores de idade no devem ser autorizadas ou permitidas dentro do laboratrio. As pessoas que apresentarem um risco maior de contaminao ou que possam ter srias conseqncias caso sejam contaminadas, no devem ser permitidas dentro dos laboratrios NB-2 e NB-3 ou na sala de animais. NB-2 e NB-3: as portas devem ser mantidas fechadas e adequadamente identificadas: o smbolo de Risco Biolgico dever ser colocado na entrada do laboratrio onde agentes etiolgicos estiverem sendo utilizados. Este sinal de alerta dever conter informaes como o(s) nome(s) o(s) agente(s) manipulado(s), o nvel de biossegurana, as imunizaes necessrias, o nome e nmero do telefone do pesquisador, o tipo de equipamento de proteo individual que dever ser usado no laboratrio e os procedimentos necessrios para entrar e sair do laboratrio. proibida a admisso de plantas e animais que no estejam relacionados ao trabalho em execuo no laboratrio. Nos laboratrios NB-3 nenhum indivduo deve trabalhar sozinho; no mnimo duas pessoas devem estar nas instalaes do laboratrio.
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Especificaes devem ser consultadas para se certificar que o equipamento e/ou acessrio possui os dispositivos de segurana.
Para os laboratrios NB-1 no so exigidos equipamentos de conteno de agentes classificados no Grupo de Risco 1. Para os laboratrios NB-2, devem ser utilizadas Cabines de Segurana Biolgica Classe I ou II, conforme a classificao, ou outro dispositivo de conteno pessoal ou de conteno fsica sempre que: Sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criao de aerossis, como centrifugao, triturao, homogeneizao, agitao vigorosa, ruptura por sonicao, abertura de recipientes contendo material onde a presso interna possa ser diferente da presso ambiental, inoculao intranasal em animais e em cultura de tecidos infectados. Altas concentraes ou grandes volumes de organismos contendo DNA/RNA recombinante. Tais materiais s podero ser centrifugados fora de cabines de segurana se forem utilizadas centrfugas de segurana e frascos lacrados. Estes s devero ser abertos no interior da cabine de segurana biolgica. As cabines devem ser instaladas, de forma que a variao da entrada e sada de ar da sala, no provoque alterao nos padres de conteno de seu funcionamento. As cabines de segurana biolgica devem estar localizadas longe de portas, janelas que possam ser abertas, reas laboratoriais muito cheias e que possuam outros equipamentos potencialmente dilaceradores, de forma que sejam mantidos os parmetros de fluxo de ar nestas cabines de segurana biolgica. Para os laboratrios NB-3, devem ser utilizadas Cabines de Segurana Biolgica Classe I, II ou III conforme a classificao, ou outra combinao apropriada de dispositivos de proteo pessoal e conteno fsica sempre que: Houver manipulao de culturas e de material clnico ou ambiental, operaes de desafio de animais, cultivo de tecidos ou fluidos infectados de animais em experimentao ou ovos embrionados, e necropsia de animais em experimentao. Cabine de segurana biolgica classe III deve ser utilizada no caso de procedimentos de alto risco envolvendo microrganismo classificado na classe 3. Estas cabines devero estar localizadas distantes de passagens, portas, venezianas, almoxarifado sistemas de ventilao e reas do laboratrio que possuam um grande movimento. Cabine de segurana biolgica classe I uma modificao da cabine usada no laboratrio qumico. uma cabine ventilada com fluxo de ar do ambiente, podendo ter a frente totalmente aberta ou com painel frontal ou painel frontal fechado com luvas de borracha. Possui duto de exausto com filtro HEPA. No h proteo para o experimento somente para o operador e o ambiente. Dentro da cabine so colocadas lmpadas U.V. recomendada para trabalho com agentes de risco biolgico dos grupos 1, 2 e 3. Cabine de segurana biolgica classe II A cabine classe II conhecida com o nome de Cabine de Segurana Biolgica de Fluxo Laminar de Ar. O Princpio fundamental a proteo do operador, do meio ambiente e do experimento ou produto. Possui uma abertura frontal que permite o acesso a superfcie de trabalho. Altura de segurana da Mod II - 24
abertura do painel frontal de 20 cm, podendo ter um alarme que previne contra a abertura excessiva do painel. Possui filtro HEPA. Cabine de segurana biolgica classe II A Fluxo laminar de AR vertical com tiro frontal de ar de 75 ps/min. O ar contaminado aps filtragem pelo filtro HEPA do exaustor passa ao ambiente onde a cabine est instalada (a cabine deve ter pelo menos 20 cm de afastamento do teto). No se deve usar este tipo de cabine com substncias txicas, explosivas, inflamveis ou radioativas pela elevada percentagem de recirculao do ar (recircula 70 %). recomendada para trabalho com agentes de risco biolgico das classes 1 e 2. Cabine de segurana biolgica classe II B1 Esta cabine possui filtro. O ar que entra na cabine atravessa o filtro HEPA abaixo da rea de trabalho, 30 % do ar recirculam enquanto que 70% saem atravs do filtro exaustor. O tiro de ar no seu interior de 100 ps/min. Usada para agentes biolgicos tratados com mnimas quantidades de produtos qumicos txicos e traos de radionucleotdeos. recomendada para o trabalho com agentes de risco biolgico das classes 1, 2 e 3. Cabine de segurana biolgica classe II B2 uma cabine de total esgotamento de ar. O ar entra pelo topo da cabine atravessa o pr-filtro e o filtro HEPA sobre a rea de trabalho. O tiro frontal de ar no seu interior de 100 ps/min. O ar filtrado, atravessa somente uma vez a rea de trabalho. O esgotamento do ar deve ser realizado atravs do filtro HEPA conduzindo-o, por um duto, para o exterior. Pode ser usado para agentes biolgicos tratados com produtos qumicos e radionucleotdeos. recomendada para trabalho com agentes de risco biolgico das classes 1, 2 e 3. Cabine de segurana biolgica classe II B3 igual a Cabine de Segurana Biolgica Classe II. A velocidade de fluxo de ar no seu interior de 75 a 100 ps/min. O ar esgotado totalmente atravs de um filtro HEPA por um duto para o exterior. recomendada para o trabalho com agentes de risco biolgico das classes 1, 2 e 3. Cabine de segurana biolgica classe III uma cabine de conteno mxima. totalmente fechada com ventilao prpria, construda em ao inox prova de escape de ar e opera com presso negativa. O trabalho se efetua com luvas de borracha presas cabine. Para purificar o ar contaminado so instalados 2 filtros HEPA em srie ou um filtro HEPA e um incinerador. A introduo e retirada de materiais se efetuam por meio de autoclaves de porta dupla ou comporta de ar de porta dupla, recipiente de imerso com desinfetante. Pode conter todos os servios como: refrigeradores, estufas, freezers, centrfugas, banho-maria, microscpio e sistema de manuseio de animais. NO PODE CONTER GS. Os dejetos lquidos so recolhidos em um depsito para serem descontaminados antes de serem lanados ao sistema de esgoto. Mxima proteo ao pessoal, meio ambiente e produto. recomendada para o trabalho com agentes de risco biolgico da classe 4 e material de pesquisa de DNA de alto risco.
GESTO DE SEGURANA
O chefe de laboratrio deve estabelecer polticas e procedimentos com ampla informao a todos que trabalhem no laboratrio sobre o potencial de risco relacionado ao trabalho, bem como sobre os requisitos especficos para entrada e sada do laboratrio e das salas onde ocorra manipulao de animais. Caber ao diretor o responsvel imediato do laboratrio assegurar que antes que o trabalho com os organismos designados para o NB-3 se inicie, toda a equipe do laboratrio demonstre estar apto para as prticas e tcnicas padro de microbiologia e demonstrar habilidade tambm nas prticas e operaes especficas do laboratrio. Podendo estar includo uma experincia anterior em manipulao de patgenos humanos ou culturas de clulas, ou um treinamento especfico proporcionado por peritos em tcnicas microbiolgicas seguras. O responsvel imediato pelo laboratrio deve assegurar o desenvolvimento e implementao de um plano de gesto de segurana assim como um manual de operao; os procedimentos devem ser preparados de acordo com as especificidades das atividades realizadas e incorporados aos
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procedimentos operacionais padres (POP) ou a um manual de biossegurana especfico do laboratrio. O chefe de laboratrio (subordinado ao diretor ou ao responsvel imediato) deve assegurar o treinamento regular em segurana em laboratrio. Todo o pessoal deve ser orientado para a necessidade de ler seguir as especificaes de cada rotina de trabalho, procedimentos de biossegurana e prticas estabelecidas no Manual. Uma cpia do manual deve estar disponvel e acessvel no laboratrio Quando necessrio, deve ser providenciado um programa rotineiro de controle de insetos e roedores. Uma falha na conteno de organismos patognicos pode ser resultado de acidentes causados por produtos qumicos, radiao, incndio e por mal funcionamento do sistema eltrico. Portanto de extrema importncia que se mantenha uma segurana de alto padro nessas reas em qualquer laboratrio de microbiologia. O desenvolvimento, implementao e treinamento de um plano de emergncia necessrio nos laboratrios NB-2 e NB-3.
SADE OCUPACIONAL
O administrador e/ou diretor juntamente com o chefe de laboratrio responsvel em assegurar a implementao de um programa de controle mdico de sade ocupacional. As seguintes medidas so recomendadas: avaliao mdica e subseqente tratamento; todos os registros mdicos devem ser registrados. Imunizao ou exame quanto aos agentes manipulados ou potencialmente presentes no laboratrio (por exemplo, vacina contra a hepatite B ou teste cutneo para a tuberculose). Excluso de indivduos altamente susceptveis (P.ex. grvidas) de reas de trabalho com alto risco biolgico. O uso de equipamentos e acessrios de proteo pessoal assim como a adeso aos procedimentos recomendados. NB-1 Embora os microrganismos de classe 1 no sejam patognicos, o trabalhador deve fazer um exame mdico e seu histrico mdico deve ser registrado. Doenas ou acidentes laboratoriais devem ser registrados e todos os trabalhadores devem ser informados e conscientes da importncia das boas prticas no laboratrio de microbiologia. NB-2 Avaliao mdica antes da contratao do trabalhador necessria; o histrico mdico deve ser registrado. Amostras referncia de soro do pessoal do laboratrio ou de outras pessoas possivelmente expostas ao risco, inclusive pessoal de limpeza e de manuteno devem ser coletada; amostras adicionais devem ser obtidas periodicamente dependendo do agente manipulado e das atividades exercidas nas das instalaes laboratoriais. Registros de doenas e ausncias devem ser mantidos pela gerncia do laboratrio; de responsabilidade do trabalhador informar o chefe de laboratrio de todas as ausncias resultantes de problemas de sade. Mulheres devem tomar conhecimento do risco que existe para o feto da exposio ocupacional a certos microrganismos como, por exemplo, o vrus da rubola. NB-3 Alm das exigncias citadas no NB-2: Invivduos que so imunocomprometidos no devem ser contratados para trabalhar nas instalaes do laboratrio.
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Aps uma avaliao clnica satisfatria, deve-se providenciar para o trabalhador uma notificao com a foto do mesmo e que descreva que este um funcionrio de um laboratrio de nvel 3 de biossegurana. A notificao pode incluir informaes para contato, inclusive do chefe ou diretor do laboratrio, mdico ou encarregado da biossegurana do laboratrio. Deve-se realizar anualmente radiografia de trax para os funcionrios que se dedicam rotina de tuberculose (seguir as orientaes do Programa Nacional de Controle de Infeco Hospitalar) Os trabalhadores devem ser apropriadamente imunizados ou examinados quanto aos agentes manipulados ou potencialmente presentes no laboratrio (por exemplo, vacina para hepatite B ou teste cutneo para tuberculose); exames peridicos so recomendados.
REAS DE TRABALHO
O laboratrio deve ser mantido limpo, arrumado e livre de materiais que no so pertinentes ao trabalho. As superfcies das bancadas devem ser desinfetadas no final do trabalho ou ao fim do dia ou sempre que ocorrer derramamento ou borrifada de material potencialmente perigoso. Todos os materiais, espcimes e culturas devem ser desinfetados antes do descarte ou da lavagem para a reutilizao. proibido comer, beber, fumar e aplicar cosmticos nas reas de trabalho; alimentos devem ser guardados em reas especficas para este fim, fora do laboratrio. Avisos como no comer, no beber e no fumar devem ser expostos claramente nas instalaes do laboratrio.
PROTEAO PESSOAL
No interior do laboratrio, os freqentadores devem utilizar roupas apropriadas como aventais, gorros, mscaras etc. Antes de sair do laboratrio para reas externas (biblioteca, cantina, escritrio administrativo), a roupa protetora deve ser retirada e deixada no laboratrio e guardados em locais diferentemente do vesturio pessoal. Avental para proteo deve ser usado abotoados durante os procedimentos de rotina; deve ser de mangas longas e, se possvel, de tecido sanfonado (tipo avental cirrgico). NB-3: as roupas de proteo devem incluir aventais com uma frente inteira ou macaco, gorros e proteo ps quando apropriado; antes de ser lavada a roupa dever ser descontaminada e dever ser trocada depois de contaminada. As mscaras cirrgicas e protetores oculares (culos com proteo lateral) so obrigatrios para evitar a exposio das mucosas da boca e dos olhos e impedir o risco de inalao nos procedimentos que possam produzir aerossis ou causar borrifamento de sangue; tambm devem ser usados no manuseio de material biolgico e diante de fontes de radiao de ultravioleta artificial. NB-3: quando apropriado, equipamentos respiratrios devem ser utilizados em salas que contenham animais infectados Devem ser usadas luvas quando houver um contato direto com materiais e superfcies potencialmente infecciosas ou equipamentos contaminados. O mais adequado usar dois pares de luvas. Essas luvas devem ser desprezadas quando estiverem contaminadas, quando o trabalho com materiais infecciosos for concludo ou quando a integridade da luva estiver comprometida. Luvas descartveis no podero ser lavadas, reutilizadas ou usadas para tocar superfcies limpas (teclado, telefones, etc.), e no devem ser usadas fora do laboratrio. Alternativas como luvas de ltex com talco devero estar disponveis. 1. Luva plstica descartvel, deve ser desprezada aps cada uso. Indicaes: para proteo exclusiva do usurio em situaes como colheita de sangue, recebimento ou entrega de material biolgico, etc. Luva domstica que pode ser antiderrapante; no descartvel. Seu uso indicado para lavagem e desinfeco de materiais e superfcies. Aps o uso, lavar as mos enluvadas com gua e sabo e descontaminar as luvas em soluo de hipoclorito a 0,5%, por 30 a 60 minutos.
2.
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3. Luva cirrgica (ltex) de preferncia descartvel, mas pode ser reprocessada, embora com restries. Indicada para uso em tcnicas asspticas (para proteo do paciente e do usurio), tais como cateterizao vesical, exames endoscpicos, puno para obteno de liquor, lquido articular, lquido pleural, etc. Lavar as mos freqentemente: Fazendo-se ou no do uso de luvas, lavar as mos sempre que houver mudana de atividade, aps a manipulao de materiais infecciosos, aps a remoo das luvas, antes de sarem do laboratrio e antes de comer, beber e mesmo fumar. A lavagem deve envolver mos e antebraos, usando-se gua e sabo lquido. Friccionar com lcool a 70% contendo 1% a 2% de glicerina. Outra opo o uso de soluo degermante base de iodeto de polivinilpirrolidona (PVP-I) a 10%. Usar de preferncia toalhas descartveis. No comer e beber no local de trabalho, assim como no armazenar bebidas e comidas nas instalaes do laboratrio. No fumar, pois h um aumento do risco de contaminao com microrganismos potencialmente patognicos ou com produtos qumicos; risco de incndio e inconvenincia com relao aos colegas de trabalho. Prender os cabelos; evitar o uso de anis, pulseiras e o uso de roupa social de mangas compridas. No passar cosmticos nas instalaes do laboratrio. No manusear lentes de contato e quando utilizados, proteger com culos de segurana. As lentes de contato absorvem certos solventes e podem ser perigosas em casos de respingo e derramamentos. No usar calados abertos no laboratrio como sandlias, chinelos.
Mod II - 28
MANUSEIO DE AMOSTRAS
As amostras devem ser colhidas em recipientes resistentes, com vedao adequada para evitar derramamento e perdas. Todas as mostras devem ser consideradas potencialmente perigosas. Usar luvas descartveis sempre que o trabalho envolver contato com material bilgico. Se for evidenciada ruptura, escoamento ou mancha no recipiente com a amostra, transferir a maior quantidade possvel da amostra para outro recipiente esterilizado e propriamente identificado.
SEGURANA ELTRICA
Todos os trabalhadores devem conhecer a localizao dos interruptores principais e de circuitos. Nenhum instrumento deve ser reparado enquanto o mesmo estiver conectado tomada. As sadas no devem ser sobrecarregadas; nunca utilizar tomadas de tipo mltiplo. Todos os equipamentos devem ser providos de fio terra Todas as descargas, incluindo os pequenos zumbidos, devem ser imediatamente investigadas Os fios de extenso devem ser utilizados apenas em concordncia com conjunto de polticas e procedimentos gerais do estabelecimento.
Mod II - 29
Todos os recipientes devem estar claramente rotulados com indicao de: contedo, aviso de perigo, precaues especiais, data de recebimento e preparao, data de abertura para uso, data de vencimento, fabricante
DESINFETANTES E QUMICOS
O manual de segurana deve incluir quais e as finalidades dos desinfetantes a serem utilizados e as instrues de diluio recomendadas para cada desinfetante. O fabricante deve providenciar todas especificaes relevantes. Hipoclorito de sdio e desinfetantes fenlicos so os mais recomendados para fins laboratoriais. Para casos especiais, lcool, iodo e outros oxidantes podem ser efetivos desde que comprovado que o agente a ser destrudo no seja resistente ao procedimento. Microonda, ultravioleta e radiao ionizante no so apropriadas.
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O descarte de solventes orgnicos solveis em gua com volumes < 500 ml e de orgnicos insolveis em gua com volumes < 100 ml pode ser na pia: Retirar todos os objetos da pia designada especialmente para descarte. Deixar escorrer, sem respingos, uma corrente de gua fria dentro da pia. Verter lentamente o lquido, o mais prximo possvel do ralo, sem produzir respingos. Manter a corrente de gua fria por vrios minutos aps a eliminao do lquido.
Dependendo do volume gerado e o tempo de acondicionamento para o tratamento ou disposio final, o laboratrio deve tambm possuir local especfico para o abrigo de resduos, fora da unidade geradora e fora da edificao do estabelecimento.
Respingos, derramamento e acidentes resultantes de uma exposio de produtos qumicos e materiais infecciosos aos organismos devero ser imediatamente notificados ao diretor do laboratrio. A avaliao mdica, a vigilncia e o tratamento devero ser providenciados e registros do acidente e das providncias adotadas devero ser mantidos por escrito.
Mod II - 31
PRODUO DE AEROSSIS
O uso incorreto de equipamento de laboratrio como pipetas, alas de inoculao, agulhas,seringas, centrfugas e homogeneizadores, pode produzir grandes quantidades de aerossis potencialmente infectantes. Exemplos de procedimentos que produzem aerossis: destampar frascos que foram fechados com tampa de presso. esvaziar seringas, eliminar o ar das seringas. quebrar frascos que contenham cultura de microrganismos. centrifugar tubos ou frascos sem tampa adequada. Quando houver risco de contaminao por aerossis, recomenda-se o emprego de cabines de segurana biolgica (fluxo laminar), juntamente com o uso de luvas, mscaras e culos de proteo. Nestas condies, manusear frascos e seringas envolvendo-os com gaze ou algodo, embebidos em lcool a 70% ou hipoclorito a 0,5%.
Mod II - 32
contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clnico (sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspenses bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que possvel, pipetas automticas ou bulbos de borracha.
2. ter e acetona: altamente inflamveis. A conservao implica a aplicao das normas de segurana quanto ao risco de exploso. Gases txicos: 1. Monxido de carbono: concentraes at 1% no ar so perigosas se respiradas por uma hora ou mais. Acima de 1% podem ser fatais. Mod II - 33
2.
Dixido de carbono (gelo-seco): concentraes perigosas podem ser atingidas em salas mal ventiladas.
Mod II - 34
OBJETIVO
O laboratrio clnico de microbiologia responsvel em providenciar informao precisa e relevante quanto ao diagnstico do paciente. O valor e a preciso clnica das anlises do material clnico e o respectivo isolamento do microrganismo so dependentes do programa de qualidade, que por sua vez, avalia a qualidade do material; documenta a validade do mtodo aplicado; monitora a performance dos procedimentos, reagentes, meios, instrumentos e do indivduo que executou a anlise; e verifica os resultados do teste quanto aos erros e relevncia clnica. Um programa de qualidade efetivo depende de um processo de avaliao contnuo e do seu aprimoramento.
ENSAIOS DE PROFICINCIA
O desempenho dos exames de laboratrio clnico realizado atravs de ensaios de proficincia. Este programa consiste na avaliao de amostras por evento. H um nmero estabelecido de eventos anuais de testes em cada rea de atividade: bacteriologia, micologia, parasitologia e virologia. As amostras de proficincia devem ser analisadas pelos trabalhadores que habitualmente realizam as anlises em questo, de acordo com os procedimentos de rotina e juntamente com as amostras de pacientes. O laboratrio que no atender os requisitos dos ensaios de proficincia deve documentar a fonte do problema, revisar o programa em vigor e tomar medidas corretivas.
Mod II - 35
Diretrizes - Descreve as instrues de coleta e transporte - Estabelece o critrio de aceitao e rejeio das amostras - Documenta a verificao do funcionamento do equipamento e uso freqente que assegura o funcionamento apropriado - documenta a manuteno regular - documenta os registros de manuteno do equipamento - Mantm o protocolo de controle de qualidade do fabricante
- Obtm a garantia por escrito quanto aos padres de embalagem, rotulagem e protocolo - Inspeciona as condies dos meios, placas de petri, hemlises, excesso de bolhas, contaminao, volume, temperatura - Documenta as falhas e as medidas corretivas, e informa o fabricante - Executa teste de CQ at a falha ser corrigida - Registra a quantidade, o nmero do lote, mtodo de esterilizao, a data de preparo, prazo de validade, pH e nome do preparador - Avalia quanto a colorao, consistncia, inclinao, hemlise, excesso de bolhas e contaminao - Executa o teste de CQ com os microrganismos de propriedades fisiolgicas e bioqumicas conhecidas - Rotula os frascos quanto ao contedo, concentrao, requerimentos para estoque, data de fabricao e de recebimento, prazo de validade nmero do lote, volume - Armazena de acordo com as recomendaes do fabricante - Executa o teste de controle negativo e positivo antes do uso - Descarta aqueles que falharam na performance
Reagentes e suplementos
Kits comerciais
- Testa cada lote novo ou em cada entrega - Segue as recomendaes do fabricante para teste de CQ - Utiliza funcionrios suficientemente qualificados para trabalho complexo e volumoso
Funcionrios
- Documenta as atividades de treinamento contnuo - Providencia aos funcionrios por escrito padres de performance - Avalia funcionrios anualmente - Registra todos os resultados em um formulrio de CQ
Registro de CQ
- Relata ao chefe e/ou responsvel resultados anormais e as medidas de correo no formulrio de CQ - Mantm os registros por pelo menos dois anos - Define os procedimentos, limites de tolerncia, aceitao da amostra, preparo do reagente, CQ, clculos e laudos - Revisa anualmente - Aprova e data todas as mudanas - Torna disponvel na rea de trabalho
Manual de Procedimento
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As peas devem ser trocadas aps um perodo especfico de uso, mesmo que no paream alteradas. A manuteno pode ser executada tanto pelo fabricante como pelo setor de servios de engenharia do laboratrio, quando existente. Os trabalhadores do laboratrio devem realizar todos os controles e registrar conforme instrudos em impressos ou manual de manuteno; isto permite a deteco imediata de desvios e portanto a adoo de medidas corretivas apropriadas antes que comprometam os resultados. As temperaturas dos equipamentos devem ser medidas diariamente com termmetros calibrados. Qualquer leitura que resulte em valores fora dos limites de tolerncia definidos pelo s controle de qualidade, deve-se determinar a causa e corrigir o problema. Procedimentos para o controle de qualidade de alguns equipamentos
Equipamento Refrigeradores Congeladores Procedimento Registro de temperatura * Registro de temperatura * Intervalo Dirio ou contnuo Dirio ou contnuo Limites de Tolerncia 2oC a 8oC -8oC a -20oC -60oC a -75oC 35,5oC 1oC 5 a 10%
Registro de temperatura * Medida do contedo de CO2: - Usar analisador de gases sanguneos ou dispositivo Fyrite 1
Banhos
Registro de temperatura *
Dirio
36oC a 38oC 55oC a 57oC 1oC do estabelecido O no crescimento de esporos indica corrida estril. 0,1 unidade de pH do pado em uso. A conversp da tira de azul para branco indica baixa tenso de CO2. O crescimento indica baixa tenso de O2. Utilizada apenas quando preciso uma tenso de O2 extremamente baixa. A soluo permanece incolor se a tenso de O2 for baixa. 180 rpm 10 rpm Dentro de 5% do estabelecido no indicador. Fluxo de 1,52m de fluxo de ar/minuto 0,152 m/minuto.
Aquecedores Autoclaves
Registro de temperatura * Teste com tiras de esporos (Bacillus stearothermophilus Testes com solues para calibrar pH Tira indicadora com azul de metileno Cultivo de Clostridium novyi tipo B Soluo indicadora de azul de metileno
Medidor de pH
A cada uso
Jarras de anaerobiose
A cada uso
Peridico
Contagem de rpm Controlar revolues com tacmetro Medir a velocidade do ar atravs da abertura para o rosto 2
Cabines de segurana
Semestral ou trimestralmente
* cada termmetro de controle deve ser calibrado contra um termmetro padro. - Bacharach Instrument Co, Pittsburgh, PA. 2 - Velometer Jr., Alnor Instrument Co., Chicago, IL.
1
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ALGUMAS RECOMENDAES
Cada bateria de meios deve ser controlada com os quesitos mais exigentes para o crescimento ou para a produo de atividade bioqumica. A disponibilidade de cepas do laboratrio pode ser necessria para suplementar aquelas comercialmente disponveis. Cada tubo de cultura, placa de meio e reagente deve ter uma etiqueta que identifique claramente o contedo e as datas de preparo e vencimento. Cada bateria de tubos e placas deve ser tambm controlada quanto esterilidade, principalmente aqueles nos quais so adicionados suplementos aps a esterilizao. As provas de esterilidade devem ser feitas visualmente e por meio de subcultivos. Determinados meios seletivos, por exemplo, podem surpimir o crescimento visvel de bactrias, mas as clulas viveis podem aparecer nos subcultivos. Os meios preparados devem ser visualmente avaliados para sinais de deteriorao como descolorao, turvao, mudana de cor e desidratao. Os reagentes e testes usados para identificao de micobactria devem ser verificados uma vez ao dia, quando utilizados, com uma espcie de micobactria que resulte uma reao positiva. Para verificao de fixao de ferro, o teste deve ser monitorado para controle negativo e positivo. Os reagentes e testes utilizados para identificao de fungos devem ser examinados uma vez por semana, quando utilizados, para controle positivo. O reagente nitrato que determina sua assimilao monitorado com peptona. Todos os discos para susceptibilidade antimicrobiana devem estar avaliados ao menos uma vez por semana com microrganismo padro de qualidade, de sensibilidade conhecida como E. coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923), S. fecalis (ATCC 29212) e P. Aeruginosa (ATCC 27853). Os kits comerciais devem ser examinados a cada entrega e a cada lote, conforme as recomendaes do fabricante. Os componentes de um kit no devem ser utilizados com um kit de lote diferente, a no ser quando especificado pelo fabricante. Ateno: A freqncia das provas de controle de qualidade dos produtos comerciais utilizados no laboratrio deve ser determinado pelo chefe ou responsvel imediato do laboratrio, conforme as instrues dos respectivos fabricantes ou referncias em literatura. Microrganismo-controle e reaes para o controle de qualidade dos meios de cultura
Meio gar Sangue Microrganismo Streptococcus do Grupo A Streptococcus pneumoniae Espcies de Enterococcus Streptococcus alfa-hemoltico no do grupo D Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Reaes Bom crescimento, beta-hemlise Bom crescimento, alfa-hemlise Bom crescimento, cor negra Nenhum crescimento, sem colorao do meio Bom crescimento Bom crescimento Toda a superfcie de cor rosa (positivo) Inclinao do meio rosa (positivo parcial) Cor amarela (negativo)
gar bile-esculina
gar chocolate
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gar cistina-tripticase (ACT) Dextrose Sacarose Maltose Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Espcies de Salmonella ou Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamicus Neisseria gonorrhoeae Cor amarela (positivo) No modifica a cor (negativo) Cor amarela (positivo) No modifica a cor (negativo) Cor amarela (positivo) No modifica a cor (negativo) Cor amarela (positivo) No modifica a cor (negativo)
Lactose
Descarboxilases Lisina Arginina Ornitina Klebsiella pneumoniae Enterobacter sakasakii Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Proteu mirabilis Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens Enterobacter cloacae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Shigella flexneri Cor azulada (positivo) Cor amarela (negativo) Cor azulada (positivo) Cor amarela (negativo) Cor azulada (positivo) Cor amarela (negativo) Zona de clarificao (adicionar HCl 1 N) Sem zona de clarificao Bom crescimento, brilho verde metlico Bom crescimento, prpuras, sem brilho Bom crescimento, transparentes (lactosenegativas) Verdes com centro negro Verdes transparentes Crescimento algo inibido, alaranjadas Cor vermelha (positivo) Ausncia de cor vermelha (negativo) Profundidade e inclinao prpura + H2S Inclinao prpura/profundidade amarela Inclinao vermelha/profundidade amarela Colnias vermelhas (lactose-positivas) Colnias incolores, sem disseminao Sem crescimento Sem crescimento Bom crescimento, cor azul (positivo) Meio turvo (positivo) Sem borda plumosa em estria (negativo) Cor vermelha ao adicionar reativos Ausncia de cor vermelha (negativo) Bom crescimento Sem crescimento Cor amarela (positivo) Incolor (negativo) Cor verde (adicionar FeCl3 a 10%) Ausncia de cor verde (negativo) Colnias incolores, centro negro
DNAse
gar de Hecktoen
Salmonella typhimurium Shigella flexneri Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Shigella flexneri Proteus mirabilis Escherichia coli Proteus mirabilis Espcies de Enterococcus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Acinetobacter lwoffi Espcies de Streptococcus Escherichia coli Serratia marcescens Salmonella typhimurium Proteus mirabilis Escherichia coli Salmonella typhimurium
Indol
gar lisina-ferro
gar MacConkey
Malonato
Motilidade
gar Salmonella-Shigella
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Escherichia coli Voges-Proskauer Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Espcies de Salmonella Escherichia coli Espcies de Shigella
Sem crescimento Cor vermelha (adicionar reativos) No desenvolve cor (negativo) Colnias vermelhas (lisina-positivas) Colnias amarelas (positiva para acares) Colnia transparentes (negativo)
Procedimentos adicionais quanto ao controle de qualidade esto especificadas nos dos mdulos seguintes.
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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. August, M.J., Hindler, J.A., Huber, T.W., Sewel, D.L. e Cumitech A. Quality control and quality assurance practices in clinical microbiology. Coord. Ed. A.S. Wessfeld, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1990. Isenberg, H.D. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. Ministrio da Sade. Biossegurana em laboratrios biomdicos e de microbiologia. Fundao Nacional da Sade, Braslia, 2001. Ministrio da Sade. Manual de Conduta - Exposio Ocupacional a Material Biolgico: Hepatite e HIV. Coordenao Nacional de DST e AIDS, Ministrio da Sade, Braslia, 1999. Ministrio da Sade. Manual de condutas em exposio ocupacional a material biolgico. Secretaria de Polticas de Sade, Braslia, 1999. Ministrio da Sade. Manual de procedimentos bsicos em microbiologia clnica para o controle da infeco hospitalar. Secretaria Nacional de Assistncia Sade, Braslia, 1991. Ministrio da Sade. Manual de Processamento de Artigos e Superfcies Estabelecimentos de Sade. 2 Edio, Centro de Documentao Braslia, 1994. World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 2nd. Ed., WHO, Genebra, 2003. em
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
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Mdulo III
NDICE 1. Requisio de Exames Microbiolgicos ............................................................................1 Modelos para Requisio de exames Microbiolgicos ................................................................. 1 Exames especiais de interesse da CCIH .................................................................................. 4 2. Coleta, Transporte e Conservao de Amostra.................................................................5 Introduo ......................................................................................................................... 5 Aspectos bsicos da coleta e do transporte de amostra ............................................................. 5 Instrues para Hemoculturas ............................................................................................... 7 Instrues para Ponta de Cateter Intravascular........................................................................ 9 Instrues para Ponta de Sonda Vesical .................................................................................. 9 Instrues para Escarro...................................................................................................... 10 Instrues para Secreo Traqueal....................................................................................... 10 Instrues para Aspirado Transtraquial (ATT) ........................................................................ 10 Instrues para Lavado Bronco-Alveolar (BAL)....................................................................... 10 Instrues para Secreo de Orofaringe................................................................................ 11 Instrues para Fluidos Orgnicos Estreis ............................................................................ 11 Instrues para Feridas, Abscessos e Exsudatos..................................................................... 12 Instrues para Amostras de Tecido Subcutneo e Amostras de Pele ........................................ 12 Instrues para Bipsia da Pele ........................................................................................... 13 Instrues para Tecido sseo .............................................................................................. 13 Instrues para Leses Superficiais - coleta para fungos - micolgico direto ............................... 13 Instrues para Secreo de Ouvido..................................................................................... 13 Instrues para Secreo Ocular.......................................................................................... 13 Instrues para Material Genital .......................................................................................... 14 Instrues para Secreo Anal............................................................................................. 16 Instrues para Fezes ........................................................................................................ 17 Instrues para Urina......................................................................................................... 17 Instrues para Anaerbios................................................................................................. 18 3. Microscopia e colorao .................................................................................................20 Direto sem Colorao ......................................................................................................... 20 Colorao de GRAM ........................................................................................................... 21 Outras Coloraes ............................................................................................................. 25 4. Semeadura em meios de cultura....................................................................................28 Material Clnico e os respectivos meios de cultura e microscopia ............................................... 28 Procedimentos para SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA ....................................................... 30 5. Identificao..................................................................................................................35 Meios de cultura ................................................................................................................ 35 Colorao de Gram ............................................................................................................ 35 Esquema geral de identificao bacteriana ............................................................................ 36 6. Manuteno e estoque de culturas.................................................................................38 Manunteno das culturas .................................................................................................. 38 Estoque de culturas Bacterianas por 1 ano ......................................................................... 39 Estoque de culturas Bacterianas por < 1 ano ......................................................................... 40 Estoque de micobactrias por 1 ano .................................................................................. 40 Estoque de micobactrias por < 6 meses .............................................................................. 41 Estoque de cultura de fungos por 1 ano ............................................................................. 41 Estoque de cultura de fungos por < 6 meses ......................................................................... 42 Colees de cultura............................................................................................................ 42 7. Referncias bibliogrficas..............................................................................................43
Registro n. (do hospital ou servio) ___________________________________________________________ Data de nascimento ____/____/____ Sexo: M( ) F( ) (evitar confuso com homnimos e com a faixa etria)
(por exemplo, a interpretao de bacteriria pode ser diferente para a mulher) Ambulatrio ( )
Clnica ( )
Leito ( )
Campo para identificao do exame no Laboratrio (nmero da anlise microbiolgica e seo do laboratrio) _____________________________________________________________________________
mod III - 1
MODELO 2
Hiptese diagnstica _____________________________________________________________ Dados clnicos (descrever objetivamente os achados clnicos mais significativos, leses cutneas ou de mucosas, local e caractersticas do stio de infeco, etc.) __________________________________________ Dados epidemiolgicos relevantes (viagem ou excurso, se vive em rea endmica de alguma doena infecciosa como malria, riquetsioses, clera, etc.; doena ocupacional, por exemplo, contato com animais; acidentes - mordida, trauma, picada de carrapato, enchentes, etc.; envolvimento em surto de infeco hospitalar, etc.) ___________________________________________________________________________ Outros dados laboratoriais importantes (dados laboratoriais que evidenciem o stio do processo infeccioso: RX, tomografia, urina rotina, hemograma, etc.) ____________________________________________ Provvel origem do processo infeccioso: comunitrio ( ) hospitalar ( )
Relacionado ao procedimento invasivo? Qual? (se hospitalar e se relacionado ao procedimento invasivo sonda vesical, cateter, traqueostomia, dilise, alimentao parenteral, cirurgia) ________________________ Cirurgia? Qual? __________________________________________________________________ Existe infeco em outra topografia? Qual? _________________________________________________ Fez uso nos ltimos dez dias de antibiticos? Quais? (descrever os motivos do uso) ________________ Existe comprometimento imunolgico? Sim ( ) No ( ) (prematuridade, transplante de rgos, uso de imunossupressores, diabetes, cncer, aids, leucemia, anemia falciforme, talassemia, hemofilia, esplenectomia, cirrose, etc.; doena oportunista? Qual?) paciente transferido ou de alta de outro hospital nos ltimos 30 dias? Sim ( ) No ( )
portador, colonizado ou infectado de bactrias multirresistentes? Sim ( ) Para urocultura informar: sintomtico ( ) Data do pedido ____/____/____ assintomtico ( )
No ( )
Nome legvel do mdico/CRM, carimbo e/ou telefone de contato (facilita a comunicao para situaes emergenciais. Por exemplo, isolamento de M. tuberculosis, isolamento de nova cepa multirresistente, etc) Data ____/____/____ hora da coleta ___________________
Nome e identificao de quem colheu o material (permite reavaliao de procedimentos e reciclagem, por exemplo, quando se detecta excesso de contaminao em uroculturas, etc) ___________________________ Observaes (comentrios, quando necessrios, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou dificuldades para obteno do material, condies do paciente, quantidade, etc) _______________________
mod III - 2
MODELO 3
Hemocultura: Urocultura: Sangue perifrico ( ) Jato mdio ( ) Puno suprapbica ( ) Sangue colhido de cateter ( ) Sonda de alvio ( ) Saco coletor ( ) Sonda vesical de demora ( )
Trato Respiratrio:
Leses, secrees, abscessos ( ) Descrever topografia: Nvel da coleta: ____________________________________________________________ profunda ( ) Puno ( ) Drenagem ( ) Swab ( ) Fstula( ) Raspado ( ) Outros ( ) ___________ Pericrdico ( )
superficial ( )
Lquor ( ) Sinovial ( )
Pontas de cateter ( )
Outros: ________________________________________________________________________
MODELO 4
Exame microscpico: A fresco ( ) Campo escuro ( ) Direto ( ) Gram ( ) Ziehl ( ) Giemsa ( ) Outro ( ) Pneumocistis carinii ( ) Rotina Rotina Rotina Rotina Cryptosporidium ( ) Isospora belli ( )
Com colorao:
Pesquisa de:
Cultura:
Especficos:
mod III - 3
TESTES ESPECIAIS
Aglutinao com ltex para meningite. Testes imunolgicos diretamente no material clnico: Chlamydia trachomatis (genital), Streptococcus pyogenes (orofaringe). Pesquisa de toxinas (S. aureus, Limulus teste para endotoxinas de Gram (-) Clostridium difficile etc.) Tipagem para fins epidemiolgicos em investigao de surtos ou fontes de infeco hospitalar. PCR (polimerase chain reaction) para micobactrias, etc. Exames quantitativos (exceto os de rotina, como urina, cateter vascular e lavado broncoalveolar). Por exemplo, hemocultura de sangue perifrico ou de cateter, bipsia de tecidos, lquido de dilise peritoneal, etc.
mod III - 4
Consideraes de segurana Utilizar as barreiras de proteo necessrias a cada procedimento. Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patognica. Usar frascos e meios de transporte apropriados. No manusear a amostra em trnsito: paciente e laboratrio.
mod III - 5
No contaminar a superfcie externa do frasco de coleta e verificar se ele est firmemente vedado.
(caso ocorram respingos ou contaminao na parte externa do frasco, fazer descontaminao com lcool 70% ou outra soluo descontaminante disponvel)
No contaminar a requisio mdica que acompanha o material. As amostras devero ser transportadas em sacos plsticos fechados. Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessrios. Colocar a identificao no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rtulos. Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratrio.
Consultar o laboratrio para verificar a disponibilidade dos meios de transporte. Tempo crtico para entrega da amostra ao laboratrio e meios de transporte
Amostra Liquor Lquido pleural Swab Tempo Crtico Imediatamente (nao refrigerar) Imediatamente (nao refrigerar) Imediatamente (nao refrigerar) Frascos e Meios de Transporte Tubo seco estril Tubo seco estril Tubo seco estril ou meio semi-solido (Stuart, Amies) Meio de transporte apropriado Evitar o transporte em seringa com agulha Meio de transporte apropriado
30 minutos
Hemocultura
Frascos com meios de cultura para rotina manual ou automatizada Tubo seco estril Tubo seco estril Pote seco estril Cary Blair meio modificado para transporte de fezes, com pH 8,4. Boa recuperao tambm para Vibrio sp e Campylobacter sp
mod III - 6
Principais erros de identificao Discrepncia entre a identificao da amostra e o pedido mdico. Falta de identificao da amostra. Origem da amostra ou tipo de amostra no identificada. Teste a ser realizado no especificado. Amostras Inadequadas Material clnico recebido em soluo de fixao (formalina). Ponta de cateter de Foley. Material conservado inadequadamente com relao a temperatura (urinas colhidas h mais de 24 horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas h mais de duas horas, sem refrigerao). Frascos no estreis. Presena de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminao na superfcie externa. Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem. Swab nico com mltiplas requisies de testes microbiolgicos. Swab seco. Culturas para anaerbios recebidas em condies no apropriadas. Amostras com as caractersticas acima descritas so inadequadas e demandam um contato prvio com o mdico solicitante para melhores esclarecimentos. Amostras no recomendadas para o exame microbiolgico por fornecerem resultados questionveis
Amostra Swab de amostra de queimadura Swab de lcera de decbito Swab de abscesso perirretal Swab de leso de gangrena Swab de leso periodontal Swab de lcera varicosa Vmito Material de colostomia Ponta de cateter de Foley Aspirado gstrico de recm-nascido Procedimento processar bipsia ou aspirado processar bipsia ou aspirado processar bipsia ou aspirado processar bipsia ou aspirado processar bipsia ou aspirado processar bipsia ou aspirado no processar no processar no processar no processar
mod III - 7
Garrotear o brao do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta rea no dever mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com lcool 70% de forma circular e de dentro para fora. Aplicar soluo de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) tambm com movimentos circulares e de dentro para fora. Para ao adequada do iodo, deixar secar por um a dois minutos antes de efetuar a coleta. Coletar a quantidade de sangue e o nmero de amostras recomendados de acordo com as orientaes descritas ou se discriminadas no pedido mdico. Remover o iodo do brao do paciente com lcool 70% para evitar reao alrgica. Identificar cada frasco com todas as informaes padronizadas e enviar ao laboratrio juntamente com a solicitao mdica devidamente preenchida. Observaes: No recomendada a tcnica de coleta atravs de cateteres ou cnulas quando se podem utilizar punes venosas. Punes arteriais no trazem benefcios na recuperao dos microrganismos quando comparadas com punes venosas. No se recomenda a troca de agulhas entre a puno de coleta e distribuio do sangue no frasco de hemocultura. Mtodo de coleta do sangue e o volume coletado influenciam diretamente no sucesso de recuperao de microrganismos e uma interpretao adequada dos resultados. Cada instituio dever ter suas normas de coleta particularizadas de acordo com o tipo de sistema utilizado (manual x automatizado) e do tipo de paciente. Fatores que influenciam diretamente os resultados de hemoculturas: Volume de sangue coletado por frasco: O volume ideal corresponde a 10% do volume total do frasco de coleta. Quanto maior o volume de sangue inoculado no meio de cultura, por amostra, melhor recuperao do microrganismo, respeitando-se a proporo sangue/meio citada, pois o sangue em desproporo com o meio pode inibir o crescimento de microrganismos. Frascos que possibilitem uma coleta de at 10 ml so os mais indicados. Exemplo: frascos com 40 ml coletar de 4 ml a 5 ml de sangue. O anticoagulante recomendado o SPS (Polianetolsulfonato sdico). Mtodo de anti-sepsia: A execuo de tcnica de anti-sepsia para reduzir os riscos de contaminao de hemocultura.
TRANSPORTE
Nunca refrigerar o frasco. Manter o frasco em temperatura ambiente e encaminhar o mais rpido possvel para o laboratrio.
NMERO DE FRASCOS
Dever ser considerado de acordo com a condio clnica do paciente. Um total de trs culturas em 24 horas costuma ser suficiente para descartar bacteremia ou endocardite (Coletas acima de quatro amostras no trouxeram maior ndice de recuperao microbiana em diferentes trabalhos clnicos). Dados recentes sugerem que o nmero de frascos anaerbios coletados deve ser adaptado de acordo com a patologia.
mod III - 8
Adultos e Adolescentes Endocardite bacteriana aguda: coletar trs amostras de punes venosas diferentes (brao direito e esquerdo), com intervalo de 15 a 30 minutos, 1 a 2 horas antes da antibioticoterapia Endocardite bacteriana subaguda: coletar trs amostras, nas primeiras 24 horas, com intervalo mnimo de 15 minutos, com punes venosas diferentes. Colher, de preferncia, as duas primeiras antes do incio da febre. Se, aps 24 horas de cultivo, no apresentarem crescimento bacteriano, colher mais trs amostras. Infeces sistmicas e localizadas como sepsis aguda, meningite, osteomielite, artrite ou pneumonia bacteriana aguda: coletar duas amostras de punes venosas diferentes, antes da antibioticoterapia, com intervalos de cinco minutos entre as punes. Se possvel, 10 ml a 20 ml por amostra. Bacteremia de origem indeterminada: coletar quatro a seis amostras de punes venosas diferentes em 48 horas. Se, aps 24 horas de cultivo, no apresentarem crescimento bacteriano, colher mais duas amostras. Paciente com picos febris regulares: coletar no mais que trs amostras antes do incio da febre (1 hora); evitar o pico febril. Crianas Coletar amostras com 0,5 ml a 3 ml. Duas culturas so recomendadas para diagnstico de bacteremias em recm-nascidos.
mod III - 9
mod III - 10
A primeira alquota dever ser colocada em frasco identificado como primeira amostra (utilizada para esfregaos microbiolgicos). Todas as outras amostras podero ser coletadas em um nico frasco estril (POOL). Somente estas amostras devero ser utilizadas para a cultura quantitativa, evitando falsas contagens.
LIQUOR
Procedimento realizado por equipe mdica especializada. Recomenda-se jejum. Caso a coleta permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratrio de microbiologia dever ser o primeiro a manipul-lo. Caso haja coleta de dois ou mais tubos, o Laboratrio de Microbiologia dever ficar com o tubo que contiver menos sangue. Ao transportar a amostra, nunca refrigerar. Transportar a amostra imediatamente ao laboratrio, acompanhada adequadamente preenchido, nos casos de paciente com idade crtica. de pedido mdico
Os exames a serem realizados devem ser especificados e priorizados de acordo com o volume coletado.
mod III - 11
Procedimento
Aspirado ou amostra de bipsia so preferveis ao invs de swab No comum para queimaduras, lceras, ndulos ou infeces superficiais da pele; usado para mordeduras e traumas
mod III - 12
Fungo
Usada para diagnosticar dermatfitos, leveduras, filamentos e fungos dimrficos til no diagnstico de M. marimum, M. fortuitum e M. chelonei
Micobactria
INSTRUES PARA SECREO DE OUVIDO CONDUTO AUDITIVO EXTERNO E MDIO (AT A MEMBRANA TIMPNICA).
Remover secreo superficial com um swab umedecido em salina estril e com outro swab obter material fazendo rotao no canal. Inserir ,em seguida, no meio de transporte (Stuart).
mod III - 13
As culturas devero ser coletadas antes da aplicao de antibiticos, solues, colrios ou outros medicamentos. Desprezar a secreo purulenta superficial e, com swab colher o material da parte interna da plpebra inferior. Identificar corretamente a amostra e enviar imediatamente ao laboratrio, evitando a excessiva secagem do material.
TRATO FEMININO
TRATO MASCULINO
Observaes: A seleo de materiais genitais, bem como sua coleta adequada, so fatores importantes na interpretao das culturas deste tipo de material, uma vez que estes possuem uma quantidade grande de microrganismos comensais. Culturas vaginais de rotina no so indicadas pelo motivo acima exposto. Culturas anaerbias so limitadas a certos materiais, conforme tabela anterior. Muitos agentes de infeco genital em mulheres so limitados a certos stios anatmicos, conforme tabela a seguir. Nos casos de suspeita de infeco por Chlamydia trachomatis dever ser solicitado exame por imunofluorescncia ou por biologia molecular (PCR). Pode ocorrer associao entre infeces por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae. Material purulento, proveniente da glndula de Bartholin, poder ser obtido diretamente do ducto, aps massagem digital ou colhida atravs de seringa. Endomtrio: este tipo de material melhor coletado por curetagem. Recomenda-se o uso de swabs protegidos para coleta via crvix, para evitar contaminao com a flora vaginal. DIP (Doena Inflamatria Plvica):o material coletado por tcnica invasiva. O lquido peritoneal pode ser coletado por aspirao do fundo de saco vaginal (culdocentese). Material retirado diretamente dos ovrios ou trompas coletado cirurgicamente. Vulva: raspados, aspirados ou bipsia no tm muito valor para cultura a no ser em casos de suspeita de sfilis. Nos casos de suspeita de sfilis, a leso dever sofrer uma abraso cuidadosa com gaze seca at que um fluido seroso comece a fluir, tomando cuidado para evitar sangramento, o que acarreta interferncia no exame em campo escuro. Aps o acmulo de fluido seroso, colocar uma gota em uma lmina limpa e examinar imediatamente. DIU (Dispositivo Intra-Uterino): deve ser removido pelo mdico evitando-se contaminao cervical ou vaginal. Coloque todo o DIU dentro de um recipiente estril para ser transportado para o laboratrio. Cultura semi-quantitativa para Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum podem realizadas com kits comercializados. Consultar a bula para maiores informaes. Infeces Chlamydia trachomatis: no aceitar secreo vaginal para pesquisa de Chlamydia, uma vez este microrganismo no pode crescer nas clulas epiteliais escamosas da vagina Chlamydia ser por que so
mod III - 14
parasitas intracelulares obrigatrios do epitlio colunar do crvix. Realizar coleta de material endocervical, raspando-se o endocrvix para obter clulas e secreo. O swab dever ser inoculado imediatamente em meio de transporte especial ou preparar as lminas para colorao especial. Deteco de estreptococos do grupo B em mulheres: culturas cervicais no so aceitveis e no se devem utilizar espculos. Sugere-se coleta com swab do intrito vaginal e outro do orifcio anorretal. Os swabs devem ser colocados em meios de transporte. Secreo prosttica: poder ser coletada aps massagem digital pelo reto, podendo ser acompanhada de amostras de urina pr e ps-massagem. O material ejaculado tambm poder ser submetido anlise. Na suspeita de Neisseria gonorrhoeae em mulheres, a cultura o mtodo de escolha, sendo o material coletado do endocrvix. O encaminhamento deve ser feito em meio de transporte ou plaqueado imediatamente.
SECREO ENDOCERVICAL
Preparo da paciente Recomenda-se: No estar menstruada Evitar ducha e cremes vaginais na vspera da coleta Trs dias de abstinncia sexual Coleta Vaginal Inserir um espculo (sem lubrificante; usar gua morna) na vagina. Retirar o excesso de muco cervical com swab de algodo. Inserir os swabs indicados, rodar por alguns segundos sobre o fundo do saco, retirar e voltar aos meios indicados no kit: Swab seco: realizar as lminas para bacterioscopia da secreo fresca. Swab do meio de transporte para cultura aerbia/fungos. Coleta endocervical Inserir um espculo (sem lubrificante) na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab de algodo. Inserir os swabs indicados no canal endocervical at a ponta do swab no ser mais visvel, rodar por alguns segundos, retirar evitando o contato com a parede vaginal, e voltar aos meios indicados no kit: Swab seco: realizar as lminas para bacterioscopia da secreo fresca. Swab seco: Mycoplasma/Ureaplasma - mergulhar o swab dentro da soluo do tubo fornecido e agitar. Remover o swab e identificar o tubo. Swab do meio de transporte especfico para Chlamydia trachomatis - mergulhar o swab dentro da soluo do tubo fornecido e agitar vigorosamente. Comprimir o swab contra a parede do tubo. Qualquer excesso de muco deve ser retirado da amostra. Remover o swab e identificar o tubo.
mod III - 15
Cultura para anaerbios do trato genital feminino Descontaminar o canal cervical com swab embebido de PVPI aquoso a 10%. Coletar amostra do trato genital superior de forma a obter material celular da parede uterina. Amostras coletadas por laparoscopia, culdocenteses ou cirurgia, tambm so apropriadas para cultura de anaerbios. Cultura de dispositivo intra-uterino (DIU) tem valor estratgico para cultivo anaerbio de Actinomyces sp.
SECREO URETRAL
A rapidez na entrega da amostra ao laboratrio depende do sucesso da cultura. N. gonorrhoeae uma bactria muito sensvel e pode morrer rapidamente se no for semeada imediatamente aps a coleta. Desprezar as primeiras gotas da secreo. Coletar a secreo purulenta, de preferncia pela manh, antes da primeira mico ou h pelo menos duas horas ou mais, sem ter urinado. Coletar com ala bacteriolgica descartvel ou swab estril fino. Colocar a amostra em meio de transporte e realizar as lminas para bacterioscopia da secreo fresca. Encaminhar imediatamente para o laboratrio. Em pacientes assintomticos, deve-se coletar a amostra atravs de massagem prosttica ou com pequeno swab inserido alguns centmetros na uretra.
Inserir o swab cerca de 1 cm do canal anal e fazer movimentos de lado a lado para coletar material das criptas anais. Colocar a amostra em meio de transporte e enviar o swab imediatamente ao laboratrio.
mod III - 16
INSTRUES PARA FEZES Devem ser coletadas no incio ou fase aguda da doena, quando os patgenos esto usualmente presentes em maior nmero e, preferencialmente, antes da antibioticoterapia. Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (Cary Blair ou salina glicerinada tamponada), fornecido pelo laboratrio, em quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as pores mucosas e sanguinolentas. Fechar bem o frasco e agitar o material. Se a amostra no for entregue no laboratrio em uma hora, conservar em geladeira a 4C, no mximo por um perodo de 12 horas. Marcar o horrio da coleta.
SWAB RETAL
Usar swab de algodo, certificando-se de que a ponta da haste que suporta o algodo est bem revestida. Umedecer o swab em salina estril (no usar gel lubrificante) e inserir no esfncter retal, fazendo movimentos rotatrios. Ao retirar, certifique-se que existe colorao fecal no algodo. O nmero de swabs depende das investigaes solicitadas. Identificar a amostra e enviar ao laboratrio no intervalo de 30 minutos ou utilizar o meio de transporte fornecido. INSTRUES PARA URINA A coleta deve ser feita pela manh, preferencialmente da primeira mico do dia, ou ento aps reteno vesical de duas a trs horas.
CRIANAS
Assepsia rigorosa prvia dos genitais com gua e sabo neutro, e posterior secagem com gaze estril. Modo de coleta: O Ideal jato intermedirio (jato mdio) espontneo. Bem indicado em crianas que urinam sob comando, usado tambm em lactentes. Em lactentes em que no se consegue coletar atravs do jato mdio, pode-se usar o saco coletor de urina, porm a troca deve ser realizada de 30 em 30 minutos e, ao trocar o coletor, refazer a assepsia. Em casos especiais (RN, lactentes de baixo peso, resultados repetidamente duvidosos) indicar puno vesical suprapbica, que dever ser realizada por mdico.
Fechar bem o frasco e caso haja algum respingo na parte externa do frasco, lave-o e enxugue-o.
CABEA E PESCOO
Aspirado do abscesso coletado com agulha e seringa aps descontaminao da superfcie Material de bipsia coletado por cirurgia Swab obtido por cirurgia quando for impraticvel a aspirao Aspirado transtraqueal Material obtido de puno pulmonar percutnea Material de bipsia obtido cirurgicamente Amostra broncoscpica obtida com cateter double-lumenevitando
Swab de orofaringe e nasofaringe Swab gengival Material superficial coletado com swab
PULMO
Escarro expectorado Escarro induzido Aspirado endotraqueal Material broncoscpico no coletado adequadamente
mod III - 18
contaminao SNC
Liquor Aspirado de abscesso obtido com agulha e seringa Material de bipsia obtido por cirurgia Fluido peritoneal obtido com agulha e seringa Aspirado de abscesso obtido com agulha e seringa Bile Material de bipsia obtido por cirurgia Aspirado suprapbico Material de laparoscopia Aspirado endometrial obtido por suco ou curetagem aps descontaminao Material de bipsia obtido por cirurgia DIU (Dispositivo intrauterino), somente para Actinomyces sp Aspirado obtido com agulha e seringa Material de bipsia obtido por cirurgia Aspirado obtido com agulha e seringa Material de bipsia obtido por cirurgia Aspirado do trato sinusal obtido com cateter plstico Aspirado profundo de ferida aberta obtido aps descontaminao da pele Somente na Sndrome de Ala Cega ou Sndrome de M Absoro Somente para cultura ou pesquisa de toxinas quando houver suspeita de C. difficile ou C. botulinum
Swab aerbio
ABDMEN
Swab aerbio
OSSOS E ARTICULAES
Material de superfcie coletado com Swab Material de superfcie coletado da pele ou bordos da ferida Material coletado com Swab
TECIDOS MOLES
Swabs anaerbios em tubo com atmosfera anaerbia em meio de transporte anaerbio 1 hora temperatura ambiente 2 horas temperatura ambiente
mod III - 19
3. MICROSCOPIA E COLORAO
DIRETO SEM COLORAO SALINA
Material Indicao Tcnica
Permite observar a morfologia bacteriana e avaliar a existncia de motilidade Usada para pesquisa a fresco de Trichomonas em secrees, fungos (leveduri-formes ou filamentosos) e em diferentes materiais, etc.
Gotejar a salina (uma gota) no centro de uma lmina de microscopia e nela suspender uma colnia ou uma alada do material a ser investigado Cobrir com uma lamnula e examinar ao microscpio, com objetiva de 40X ou 100X (leo de imerso)
HIDRXIDO DE POTSSIO
Material Indicao Tcnica
Usado para pesquisa de fungos (leveduriformes e particularmente filamentosos) em material biolgico na presena de muco, restos celulares, plos, unhas, etc. Facilita a microscopia por dissolver a queratina e o muco, destacando as estruturas fngicas, quando presentes.
Colocar uma pequena amostra do material a ser pesquisado no centro da lmina Suspender o material com uma a duas gotas de KOH Cobrir com lamnula e aguardar 30 minutos ou Aquecer ligeiramente a lmina para acelerar o clareamento Examinar com objetiva de 10X ou 40X, fechando o diafragma As lminas podero ser colocadas em cmara mida e, aps 24 horas, realizar uma segunda leitura microscpica
Microscpio com condensador de campo escuro e, quando possvel, objetiva de 100X com ris Lmina Lamnula Salina leo de imerso.
Para observar a motilidade de bactrias dificilmente observadas em microscopia direta com salina, como o caso do Treponema pallidum e da Leptospira sp Pode ser usada tambm para observar a motilidade do Campylobacter sp e outras bactrias
Atritar as bordas da leso suspeita com um swab ou ala bacteriolgica Colher o exsudato com a prpria ala ou fazer um imprint com a lmina Cobrir com a lamnula (utilizar uma gota de salina) Realizar a pesquisa rapidamente
Para o Leptospira: Utilizar a urina recm-emitida, centrifugada e examinado o sedimento Em campo escuro, colocar leo de imerso entre o condensador e a parte inferior da lmina (encostar o condensador na lmina) Observar com objetiva de 40X para obter o foco Avaliar as condies do material, fazendo-se, a seguir, a bacterioscopia por imerso, com objetiva de 100X.
mod III - 20
TINTA DA CHINA
Material Indicao Tcnica
Principalmente para pesquisa de criptococos em liquor ou outros materiais, permitindo destacar a cpsula deste fungo contra um fundo negro
Suspender o sedimento do liquor ou uma colnia do meio de cultura em uma gota de tinta da China, fazendo-se um filme bem delgado entre a lmina e a lamnula Observar com objetivas de 10X e 40X Caso esteja muito espesso, adicionar uma pequena gota de salina esterilizada na suspenso para facilitar a observao Erro comum: confundir linfcitos com criptococos. A diferenciao feita atravs da observao do ncleo refringente e gemulao do fungo.
COLORAO DE GRAM
A colorao de Gram usada para classificar bactrias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratrio de microbiologia clnica um teste adicional rpido para o diagnstico de agentes infecciosos, sendo tambm utilizado para avaliar a qualidade da amostra clnica analisada. As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tamanho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser influenciadas por vrios fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubao e a presena de substncias inibidoras. No se pode deixar de destacar que a colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til quando for corretamente realizada (do ponto de vista tcnico) e interpretada por profissionais experientes.
UTILIZAO
Para bacterioscopia da maioria dos materiais biolgicos ou culturas de microrganismos em meios slidos ou lquidos. Nas amostras analisadas de culturas jovens (<< 24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clnicas recm-coletadas (so as que fornecem melhores resultados). Na verificao da morfologia bacteriana a partir de esfregaos de cultura em caldo.
mod III - 21
* Observao: Os materiais citados acima so opcionais, dependendo da amostra clnica coletada e da rotina laboratorial.
ESFREGAOS
Os esfregaos devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualizao, mas, tambm, bastante esparso para revelar as caractersticas do agrupamento. Utilizar, de preferncia, lminas limpas e novas (no oxidadas). Os melhores resultados sero obtidos se as mesmas permanecerem no lcool at o momento do uso. Tcnica para preparo do esfregao: Identificar a lmina de maneira segura. Rolar toda a superfcie do swab sobre a lmina para no destruir as clulas. Fixar rapidamente na chama. Quando material escasso, demarcar a rea do esfregao. Proceder o mtodo de colorao mais apropriado. Material Clnico
Rodar o swab suavemente pela lmina limpa, evitando a destruio dos elementos celulares e dos grupamentos Quando somente um swab for coletado, coloc-lo em um tubo estril contendo uma pequena quantidade de salina estril (0,4 ml) e agitar (vortex) Comprimir o swab contra as paredes do tubo e utiliz-lo para fazer o esfregao. O restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura. Observao: materiais clnicos coletados com swab so menos recomendados para cultura. Coletar, sempre que possvel, dois swabs: um ser utilizado para fazer o esfregao e o outro para cultura. Materiais recebidos em seringas sero transferidos para um tubo estril e agitados (vortex), quando necessrio Selecionar a poro mais purulenta ou mucosa com pipeta ou ala bacteriolgica Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diludas com uma gota de salina estril e espalhadas sobre uma grande rea da lmina formando um esfregao delgado Com auxlio de ala bacteriolgica ou um palito de madeira, pescar uma poro purulenta do escarro que seja representativa Rolar esta poro na parede do frasco para separar do material salivar Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lmina limpa confeccionando um esfregao delgado Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas pores purulentas forem visveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do material representativo Alguns laboratrios utilizam a citocentrfuga (cytospin) para concentrar os lquidos orgnicos e fazer os esfregaos. Este mtodo tem sido utilizado para aumentar a sensibilidade da colorao de Gram, diminuir o tempo de centrifugao e agilizar o resultado. Materiais aparentemente lmpidos devem ser previamente centrifugados a 2.000-5.000 rpm /15 minutos e o esfregao feito a partir do sedimento Aps a centrifugao, remover o sobrenadante com uma pipeta estril, deixando, aproximadamente, 0,5 ml de sedimento Colocar uma gota do sedimento numa lmina limpa, sem espalhar e deixar secar Para aumentar a concentrao do fluido a ser examinado, adicionar uma segunda gota na mesma rea da lmina, anteriormente utilizada Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugao
Escarro
Colocar o material em uma placa de Petri estril Triturar com auxlio de um bisturi Preparar os esfregaos fazendo vrios imprints numa lmina limpa, de preferncia, estril
mod III - 22
Cultura em caldo Transferir uma a duas gotas para uma lmina limpa utilizando ala bacteriolgica ou pipeta; Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregao delgado. Meio slido Utilizar uma gota de salina estril em uma lmina limpa; Transferir uma pequena poro da colnia com ala bacteriolgica; Misturar suavemente para obter um esfregao levemente turvo e homogneo. Observao: para evitar a formao de aerossis, nunca misturar o material vigorosamente. Fixao do Esfregao Calor Todo o esfregao, antes de ser submetido a colorao, dever estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando (50C). A fixao excessiva e o superaquecimento iro distorcer a morfologia celular e a fixao insuficiente permitir a sada do material durante o processo de colorao. Deixar a lmina esfriar antes de iniciar a colorao. Metanol ou Etanol A fixao pelo metanol ou etanol tambm pode ser utilizada. Alm de prevenir a lise das hemcias, evita que os esfregaos, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da colorao. Deixar o esfregao secar numa superfcie plana; aps, colocar uma a duas gotas de lcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. No aquecer a lmina antes da colorao.
Validade das solues A e B: 1 ano em temperatura ambiente Cristal-violeta - soluo de uso: Soluo A Soluo B 40 ml 160 ml
Misturar as duas solues. Deixar em repouso e filtrar aps 24 horas. Lugol (mordente): Iodo metlico Iodeto de potssio gua destilada 1g 2g 300 ml
Validade: seis meses em temperatura ambiente Misturar o iodo e o iodeto de potssio em um graal, at que estejam bem homogeneizados; Acrescentar gua lentamente para dissoluo completa. Guardar em frasco de mbar. Precaues: a soluo de iodo/iodeto de potssio corrosiva. Evitar inalao, ingesto ou contato com a pele.
mod III - 23
Descolorantes: lcool etlico a 95% agente descolorante lento ou lcool etlico a 95% e acetona (v/v) agente descolorante intermedirio. Exige maior habilidade por parte do operador para que no ocorra hiperdescolorao. Validade: um ano armazenado em frasco de mbar a temperatura ambiente. Precaues: etanol e acetona so inflamveis. Contracorante: Soluo de reserva safranina lcool etlico a 95% Soluo de trabalho soluo de reserva gua reagente 5g 500 ml 10 ml 90 ml
Validade: um ano em temperatura ambiente ou fucsina bsica a 0,1% ou 0,2% em gua reagente; e seis meses em temperatura ambiente frasco de mbar. Misturar suavemente at a dissoluo.
COLORAO
Cobrir a rea com a soluo de cristal-violeta por cerca de um minuto. Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a prpria soluo de iodo ou gua da torneira.(Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das clulas Gram-positivas). Cobrir a rea do esfregao com a soluo de iodo durante cerca de um minuto. Descorar a lmina com a mistura lcool-acetona (1:1), at que o solvente escorra incolor. Alternar com gua corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nesta etapa de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das clulas Gram-positivas, assim como, a pouca descolorao pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactrias Gram-negativas). Cobrir o esfregao com a soluo de safranina (ou Fucsina bsica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30 segundos. Lavar com gua corrente. Deixar secar ao ar, em temperatura branda (50C).
LEITURA DO GRAM
Utilizando a objetiva de menor aumento (10X), fazer uma anlise do esfregao como um todo, avaliando: a qualidade da colorao e a espessura do esfregao; se o material clnico coletado apropriado para cultura, observando a quantidade relativa de leuccitos, hemcias, clulas epiteliais; a presena de bactrias pertencentes a microbiota normal, indicando uma coleta inadequada da amostra clnica; localizao e agrupamento bacteriano; filamentos, pseudo-hifas e leveduras.
mod III - 24
Passar para a objetiva de imerso (100X) e examinar vrias reas para melhor avaliao da colorao e dos diferentes tipos de microrganismos presentes, principalmente perto de clulas inflamatrias. Sistema de Quantificao Clulas e Polimorfonucleares (PMN) Mdia em 10 campos (10X de aumento) Microrganismos Mdia em 15 a 20 campos (100 X aumento)
Neg. Neg. 0 + Raras 1-9 ++ Pouca 10-24 +++ Muitas >>25 + Raros <<1 ++ Poucos 1-5 +++ Muitos 6-19 ++++ Numerosos >>20
CONTROLE DE QUALIDADE
Verificar diariamente a aparncia dos reagentes. Se a soluo de cristal-violeta precipitar, refiltre antes de usar. A evaporao pode afetar a eficcia dos reagentes. Recomenda-seque as solues de trabalho sejam trocadas regularmente, dependen-do da demanda. Diariamente e quando novos reagentes forem preparados, corar, juntamente com os esfregaos da rotina, lminas controles. Esfregaos de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) ou Staphylococcus aureus (ATCC 25922) so preparados e fixados. Resultados esperados: bacilos Gram-negativos, colorao rsea. cocos Gram-positivos, colorao violeta. Sistema de reviso dos resultados do Gram: a reviso diria de lminas de Gram, selecionadas pelo supervisor, pode ajudar a determinar a necessidade de treinamento e adicionar informaes de relevncia clnica. comparar resultados da cultura com a leitura do Gram. Fazer manuteno preventiva e limpeza dos microscpios.
OUTRAS COLORAES
mod III - 25
COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN
Soluo de carbolfucsina Fucsina bsica lcool etlico a 95% Cristais de fenol derretidos gua destilada 0,3 g 10 ml 5 ml 95 ml
Dissolver a fucsina bsica no lcool e o fenol na gua. Misturar as duas solues. Deixar repousar por vrios dias antes de usar.
mod III - 26
Colorao de fundo (azul-de-metileno) Azul-de-metileno gua destilada Execuo Cobrir a superfcie da lmina com a soluo de carbolfucsina. Aquecer a lmina coberta com o corante, lentamente com auxlio de um bico de Bunsen, at a emisso de vapores, tomando o cuidado para no deixar ferver. Aquecer com calor baixo ou intermitente por um perodo de trs a cinco minutos. Deixar a lmina esfriar. Lavar a lmina com gua corrente. Cobrir a lmina com soluo de alcool - cido a 3% e descorar o esfregao at que o corante no drene mais da lmina. Lavar a lmina com gua corrente e esgotando todo resduo da mesma. Cobrir a lmina com o corante de contraste (azul de metileno), por 20 a 30 segundos. Lavar a lmina com gua corrente e deixar secar naturalmente sem forar com papel de filtro. Examinar o esfregao com objetiva de imerso no aumento de 100x. 0,3 ml 100 ml
mod III - 27
Lmina LJ SAB MYC uma X X X X X X uma duas duas duas no uma uma duas X uma uma no
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
duas uma duas no uma duas uma uma uma duas no uma
TM CLED
TM
- AC = gar chocolate; AS = gar sangue; MC = gar Mac Conkey; TIO = caldo tioglicolato; LJ = gar Lowenstein Jensen; SAB = gar Sabouraud; MYC = Mycosel; SS = gar Salmonella-Shigella; TM = gar Thayer Martin (opcional); CLED = gar CLED
mod III - 28
Cultura para fungos ou micobactrias Para fungos: Sabouraud e Mycosel, ver orientao especfica para semeadura Para micobactrias: Lowenstein Jensen, materiais contaminados com flora devem ser previamente descontaminados (escarro, urina, lavado bronquio-alveolar, fezes) Coprocultura Recomendava-se semear em caldo enriquecedor do tipo Selenito, Tetrationato, etc., que tem valor duvidoso, sendo atualmente indicado para pesquisa de portadores. Escarro para tuberculose Deve ser conservado em geladeira ou tratado para descontaminao, antes de semear em Lowenstein Jensen. Lavado brnquico Homogeneizar o material em vortex; Centrifugar parte do material e fazer duas lminas com o sedimento; Se houver pedido de pesquisa de micobactrias e fungos, fazer quatro lminas; Semear 10 L com ala descartvel ou calibrada e semear em gar Chocolate para contagem de colnias (1/100); Diluir 1 ml da amostra em 9,0 ml de salina estril, homogeneizar e semear 10 L em gar Chocolate para contagem de colnias (1/1.000); Semear desta mesma diluio com a ala de 1 L em gar Mac Conkey para contagem de colnias (1/10.000). Lquido Cfalo Raquidiano (LCR) Centrifugar por 10 minutos/ 2.000 rpm (rotaes por minuto), quando purulento, semear sem centrifugar; Semear em gar Chocolate + gar Sangue + Caldo Tioglicolato. Quando solicitado, pesquisar Criptococos, usando colorao com Tinta da China. Ponta de cateter Cinco cm da ponta do cateter deve ser rolada 5 vezes sobre a placa de gar Sangue, utilizando a tcnica semi-quantitativa de Maki. Quando enviado pedao maior de cateter pode-se injetar 1 ml de salina cultivando separadamente (lmen); a superfcie externa pode ser semeada pela tcnica de Maki. Hemoculturas positivas Semear em gar Chocolate e fazer bacterioscopia (Gram). Frascos para micobactrias, fazer bacterioscopia (Ziehl). Urina Dever ser semeada com ala calibrada de 10 L em gar CLED (Brolacin). Se houver pedido de bacterioscopia: colocar 10 L da urina sobre uma lmina nova e deixar secar, corar pelo Gram, e verificar a presena de bactrias. Para diagnstico da tuberculose: deve ser guardada em geladeira ou descontaminada antes de semear. Secreo vaginal, endocervical, uretral e urina Fazer exame fresco de secreo vaginal para pesquisa de Trichomonas; Centrifugar a urina para pesquisa de Trichomonas; Na cultura para Neisseria gonorrhoeae suficiente gar-Chocolate; para melhorar o isolamento, semear material endocervical e uretral, utilizando o meio seletivo de Thayer Martin. Mycoplasma e Ureaplasma swab uretral ou endocervical, removendo previamente a secreo e colhendo as clulas da mucosa por rotao do swab no canal; usar meio de transporte especfico. Para amostras slidas: bipsias, gnglios, amostras de tecidos, etc
mod III - 29
Fragmentar o material com um gral e pistilo de porcelana ou vidro estreis contendo 1-2 ml de salina estril ou caldo BHI (Brain Heart Infusion) ou TSB (Tripticase Soy Broth); Semear os fragmentos ou a poro lquida, e guardar o restante do material na geladeira para eventual uso. Estudos quantitativos so trabalhosos pois dependem de pesar o material slido, tritur-lo, diluir em volume definido de caldo (BHI, TSB ou Tioglicolato), bem como semear volume definido (10 ou 100mL com pipeta calibrada, usando ponteira estril). O clculo para a contagem de colnias deve levar em conta o nmero de gramas de tecido usado e a diluio do caldo (UFC/grama de tecido). Lquido de dilise Recomenda-se fazer cultura quantitativa semeando-se como urina, com ala calibrada e contagem de colnias, usando ala de 10 L e liberando o resultado em UFC/ml (multiplicando por 100). Paralelamente faz-se cultura qualitativa semeando 2 a 3 ml em 5 ml de caldo (TSB, BHI ou Tioglicolato). No caso de cultura quantitativa negativa e qualitativa positiva, relatar: cultura positiva para (nome da bactria isolada), menor que 102 UFC/ml. Casos especiais No caso de secreo prosttica, em que o material bastante escasso, e existe contaminao uretral, recomenda-se semear rapidamente aps a coleta com ala calibrada de 10 ml, e o resultado deve-se relatar em UFC/ml (multiplicando o nmero de colnias significativas do mesmo agente por 100), como para uroculturas. Para outros materiais escassos colhidos com swab em meio de transporte (material de vesculas, swab de crnea ou conjuntiva, uretral, etc.), pode-se semear diretamente o swab nos meios de cultura indicados, ou tentar obter uma concentrao do material do swab colocando-o em tubo estril com 0,5 ml de salina estril. Em seguida, agitar no vortex (mixer), centrifugar e utilizar o sedimento como inculo, ou fazer esfregao para bacterioscopia. Escolha de meios de cultura seletivos em relao ao agente
Agente Bordetella pertussis Brucella spp Campylobacter jejuni Corynebacterium diphtheriae Legionella spp Listeria monocytogenes Mycoplasma/ureaplasma Neisseria Neisseria meningitidis Vibrio spp Obs: existem meios cromognicos especficos para diferentes patgenos Meio especfico de acordo com manuais de fabricantes gar sangue Bordet-Gengou Brucella agar Campylobacter agar gar cisitina-telurito gar carvo-extrato de levedura tamponado gar Listeria McBride Transporte: Meio B10 Shepard Cultura: Meio A7 Shepard Thayer Martin Thayer Martin TCBS Salmonella spp. e S. typhi, E. coli O 157. Para algumas espcies de Candida, Listeria monocytogenes, etc.
mod III - 30
Separar as lminas correspondentes cada exame, a serem preparadas e identific-las. Homogenizar o material, quando lquido (urina, LCR, sangue, pleural, etc.). Escolher a poro mais purulenta no caso de secrees, ou no caso de fezes, a parte com sangue, muco ou pus. Os swabs devero ser rolados sobre os meios de cultura, seguindo a sequncia dos mais ricos para os mais seletivos (gar Chocolate, gar Sangue, Mac Conkey). Com material muito lquido (LCR, pleural no purulento) concentrar o material por centrifugao a 2.500 rpm (1500 g) por 10-15 minutos e semear o sedimento. Na semeadura de rotina pode-se utilizar placas com divises de dois e trs compartimentos para racionalizao de gastos, mas seu uso exige maior habilidade na semeadura a fim de se obter colnias isoladas. Ex.:
hemocultura em placa trplice: gar sangue, gar chocolate e gar Mac Conkey. secrees em placa dupla: gar sangue e gar Mac Conkey, proceder uma semeadura que permita o crescimento de colnias isoladas, etc.
Tcnica de Semeadura Qualitativa A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o prprio swab (do meio de transporte), ou amostra do material removida com ala (estril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentrao do inculo, que permita o isolamento de todas as colnias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a tcnica de semeadura e isolamento de colnias.
Descarregar o material num canto da placa; Flambar a ala; Esfriar a ala em um canto do gar; Semear partindo da ponta da primeira semeadura. A cada mudana de direo flambar a ala e esfri-la.
SEMEADURA QUANTITATIVA
Materiais indicados ou recomendados Urina BAL (lavado bronco alveolar) Aspirado traqueal Bipsia de tecido Lquido de dilise Secreo prosttica Cateter (tcnica de Maki e outras) Tcnica de Semeadura Quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de UFC (unidades formadoras de colnia) obtidas aps incubao. Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material: Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 L. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 ml, relativo ao volume inoculado; 1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada ou pipeta com ponteira estril. Tcnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto , 1:10, 1:100, 1:1.000 O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 ml, relativo diluio utilizada; 10, 100, 1.000 ..., respectivamente. Procedimentos gerais
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Homogeneizar o material com agitao manual em diferentes direes ou em vortex (mixer). Obter o volume definido pela tcnica com o auxlio de uma pipeta com ponteira estril ou ala calibrada. No caso da ala, observar a integridade da pelcula formada at deposit-la na parte superior da placa. Ainda com a ala, sem flambar at o final da semeadura, distribuir o material em linha reta at a outra extremidade. Perpendicularmente, distribuir o material por toda a superfcie de maneira uniforme. Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes, ou at que a superfcie da placa esteja seca, alterando a direo da estria (vide figura abaixo). Evitar o uso de placas midas e, aps semeada, no incubar caso haja umidade na superfcie do gar. Evitar o rompimento do gar, estriando o material suavemente. Uma suspenso com 105 UFC/ml deve resultar em um tapete de colnias que cubra toda a superfcie do gar de maneira uniforme, com colnias confluentes.
a) Inculo Inicial
b) Espalhamento
INCUBAO
A incubao deve seguir alguns parmetros determinados. Atmosfera Para bactrias no exigentes em secrees, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. Para bactrias exigentes tais como: pneumococos, hemfilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO2). Para Campylobacter necessrio tenso de 5 a 10% de CO2 e restrio de O2 sendo conveniente o uso de geradores especficos. Para bactrias anaerbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita. Temperatura 36oC +/- 1oC a temperatura para a grande maioria das bactrias da rotina, incluindo os anaerbios e micobactrias. Fungos podem ser cultivados a 30oC ou 25 e 35oC. Temperatura 42oC pode ser necessrio para isolar espcies de Campylobacter, Acinetobacter aumannii, e algumas espcies de Pseudomonas. Umidade Bactrias fastidiosas e exigentes (neisserias patognicas e hemfilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tenso de 5% de CO2 com um chumao de algodo embebido em gua estril. Tempo Em geral a primeira leitura realizada com 18 a 24 horas de incubao ou em casos de urgncia para iniciar a identificao e antibiograma, a partir de 6 horas possvel visualizar crescimento de algumas enterobactrias. Para anaerbios recomendvel a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubao.
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Para bactrias exigentes ou de crescimento lento o perodo de incubao pode ser bastante prolongado: Micobactrias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas at 45 dias). Leitura Alguns aspectos so fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnstico presuntivo e direcionar o exame.
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Produo de vu Proteus, Comamonas, Pseudomonas Filamentosas fungos filamentosos Formando pontas, como estrelas Cndida Com depresso no centro Pneumococo Cerebriforme Pseudomonas stutzeri Elevada Klebsiella, Bacillus Chata Enterobacter, Pseudomonas Consistncia Frivel, quebradia - Moraxella Mucide Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus Seca E. coli, Citrobacter, S. aureus Butirosa (manteiga) Candida Densidade Opaca: E. coli, Candida, S. aureus Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo Cheiro Eikenella corrodens cheiro de cloro Pseudomonas cheiro adocicado Anaerbios cheiro ftido
mod III - 34
5. IDENTIFICAO
MEIOS DE CULTURA
O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. gar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos gar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas gar Mac Conkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. Lactose positiva colorao avermelhada Lactose negativa colorao inalterada Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra) gar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao alaranjada) e produo de H2S (colorao negra) gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae
COLORAO DE GRAM
Deve-se realizar a colorao de Gram para todas as colnias crescidas em meios no seletivos quando o aspecto deixar dvidas quanto a sua classificao. Com uma agulha microbiolgica estril, pegar pequena poro de uma colnia isolada e passar para uma lmina limpa e identificada. Para facilitar a leitura, pode-se homogeneizar o material com uma gota de soluo salina estril em movimentos centrfugos. Aguardar para que seque e fixar rapidamente sobre a chama. Correlao entre as principais bactrias de importncia clnica e os tipos morfotinturiais:
GRAM POSITIVOS
Cadeias longas - estreptococos aerbios e anaerbios Cocos Cachos estafilococos e peptococos (anaerbio). Cachos e ttrades Micrococcus, Stomatococcus, Aerococcus spp Aos pares Enterococcus Coco-bacilo (podem formar cadeias curtas) Gram varivel Gardnerella Em chama de vela S. pneumoniae Retos e curtos Lactobacillus, Erisipelotrix, Listeria, Rhodococcus
mod III - 35
Bacilos
Ramificados Nocardia, Streptomyces, Actinomyces, Propionibacterium (anaerbico) Difterides Corynebacterium Esporulados Bacillus, Clostridium
GRAM NEGATIVOS
Cocos (visualizados aos pares) Coco-bacilo Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter, Veillonella (anaerbio) Haemophillus (pleomrfico, ora coco-bacilo, ora bacilo), Brucella, Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Bacteridesa (anaerbicos), Enterobactrias Curvos Campylobacter, Helicobacter, Vibrio Helicoidais Arcobacter e Borrelia. Leptospira e Treponema (no visveis ao Gram) Retos Enterobactrias, no fermentadores Extremidades afiladas Fusobacterium (anaerbio) Extremidade bifurcada Bifidobacterium (anaerbio)
Bacilos
Observar as caractersticas das diferentes colnias crescidas em cada meio de cultura utilizado. Lembrar que o tamanho das colnias de um mesmo agente pode ser varivel, conforme a proximidade com outras colnias. Por exemplo, semeadura em gar sangue (AS) e Mac Conkey (MC): Observar quantos tipos de colnia cresceram em cada gar. As colnias que cresceram somente em AS devem ser de microrganismo Gram positivo ou mais exigente. Todas as colnias presentes no MC, microrganismos Gram negativo, devem apresentar correspondente no AS. A escolha dos meios utilizados para cada material deve estar relacionada aos agentes esperados. Crescimento dos microrganismos nos principais meios de cultura utilizados na rotina
Mais provvel gar Chocolate + + + + neg gar Sangue + + + neg neg CLED Mac Conkey + neg neg neg neg Salm.Shigella + neg neg neg neg Caldo TIO + + neg neg +*
Gram negativo, leveduras e enterococo Gram positivo Gram negativos exigentes Haemophilus Anaerbios + Meio d suporte ao crescimento - Meio no d suporte ao crescimento * Principalmente em coluna alta
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Optar entre o crescimento a ser valorizado e o que dever ser ignorado Muitas vezes impossvel definir o significado clnico de um isolado sem conhecer sua identificao. Todo crescimento deve ser classificado como patgeno em potencial ou mero contaminante. Para tanto, deve-se reunir evidncias microbiolgicas, clnicas e epidemiolgicas: Conhecer os principais patgenos esperados para cada material biolgico Obter o mximo de informaes sobre o quadro clnico apresentado Os componentes da microbiota residente (Micrococcus, Estafilococos coagulase negativo, S. viridans...) apresentam menor valor preditivo positivo como agentes infecciosos, sendo de fcil interpretao na maioria dos casos. Entretanto, em condies especficas podem participar como agentes patognicos. Por exemplo: Duas ou mais hemoculturas perifricas com S. viridans podem ser consideradas como possvel diagnstico de bacteremia por este agente, devendo ser investigada a possibilidade de endocardite Observar se a cultura pura ou se existem diferentes tipo de colnias, neste caso, se h predomnio de um tipo. As culturas puras apresentam maior valor preditivo positivo para diagnstico, especialmente em stios intensamente colonizados. Por exemplo: cultura pura de Pseudomonas aeruginosa ou Candida em coprocultura. Entretanto, podem ocorrer tambm como contaminantes. Por exemplo: cultura pura de S. viridans em swab de orofaringe Sempre que possvel, deve-se traar um paralelo entre os achados da bacterioscopia direta do material e o resultado da cultura, buscando: Valorizar achados de cultura bacterioscopia com predomnio de cocobacilos pleomrficos em BAL e isolamento de Haemophillus em cultura, ainda que em baixas contagens por dificuldades de crescimento Definir contaminantes presena de abundantes clulas epiteliais na bacterioscopia da urina no centrifugada ou em escarro, denotando a contaminao com a microbiota local Detectar falhas nas condies de coleta e/ou processamento laboratorial e uso de antimicrobianos Bacterioscopia de liquor, lquido articular ou secreo conjuntival com diplococos Gram negativo aos pares intracelulares e cultura negativa Caracterizao de infeco por anaerbios cultura negativa com bacterioscopia revelando microrganismos com caractersticas morfolgicas de anaerbios Quantificao em culturas quantitativas os achados da bacterioscopia direta devem coincidir com as contagens obtidas em cultura (urocultura, BAL, aspirado traqueal ...)
DIRECIONAMENTO DA IDENTIFICAO
De acordo com o crescimento em meio seletivo e o resultado da bacterioscopia, seguir a rotina especfica.
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transferir periodicamente a cultura em um meio de cultura adequado; incubar at que a cultura atinja a fase estacionria mxima de crescimento; e estocar em temperatura apropriada para impedir maior crescimento.
A cultura preparada usualmente a partir de uma cutura anterior ou originalmente do estoque. Ao cultivar a cultura desejada procura-se obter uma cultura que contenha somente o microrgansimo desejado, um nmero uniforme da populao, que seja vivel e que apresente resistncia a condies desfavorveis. O sucesso no preparo da cultura est tambm relacionado com o preparo e esterilizao do meio de cultura, da inoculao e do tempo e temperatura de incubao. A temperatura de incubao geralmente prxima da temperatura tima para aquela espcie. Tanto a temperatura quanto o tempo de incubao so freqentemente ajustadas de modo que a cultura esteja pronta na hora em que ela for utilizada. Do contrrio, a cultura deve ser esfriada para impedir um desenvolvimento superior ao desejado. As culturas podem preservadas em tubos e ento tranferidas periodicamente para meios de preparo recente. Os intervalos de tempo em que so feitas as transferncias variam de acordo com o microrganismo. Quando este procedimento adotado na manuteno de uma coleo de culturas, considerar o meio prprio de cada espcie, a temperatura adequada de armazenamento e o tempo de tranferncia. Observar que a transferncia frequente de uma cultura instvel pode levar a mudanas indesejveis nas suas caractersticas.
VIABILIDADE DA CULTURA
A viabilidade avaliada pela taxa de crescimento e atividade metablica. A deteriorao das culturas pode resultar do manuseio incorreto, do cultivo inadequado, de transferncias freqentes por um longo perodo, meio de cultura imprpio, mutao e ataque da bactria por um bacterifago.
ESTOQUE DE CULTURAS
O estoque de culturas deve ser preparado de modo que as culturas sejam armazenadas e preservadas por um longo perodo sem transferncia. Tais culturas tendem a permanecerem estveis e so utilizadas como fonte de cultura caso a cultura ativa seja perdida e/ou deteriorada. As culturas podem ser estocadas pelos seguintes mtodos:
refrigerao em nitrognio lquido (-196oC) vedao com parafina ou camada de leo mineral em gar inclinado
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INOCLULAO
Identificar os tubos. Inocular com uma cepa cultivada no respectivo meio. Incubar overnight, vedar e armazenar em temperatura ambiente ou 5oC.
Neisseria spp. Bacillus spp. Pseudomonas spp. Clostridium spp. Mycobacterium spp.
gar cistina-tripticase gar nutritivo gar nutritivo Meio com carne cozida gar glicerina
mod III - 40
Para recuperao da cepa: descongelar rapidamente em banho-maria a 37oC. a suspenso estoque pode ser descongelada e novamente refrigerada vrias vezes sem perda da viabilidade das clulas.
CONSERVAO A 4OC
Semear a espcie em gar inclinado base de ovo. Armazenar a 4oC at 1 ano.
retirar do refrigerador; Remover imediatamente parte do crescimento do gar; inocular em gar batata dextrose; retornar o tubo original (estoque) ao refrigerador; caso descongele, preparar uma nova cultura.
mod III - 41
COLEES DE CULTURA
Em todo mundo h organizaes que mantm culturas puras autnticas de microrganismos. Estas esto disponveis para diversas finalidades e assim desempenham um papel fundamental para os microbiologistas tanto nos servios prestados quanto nas pesquisas experimentais. Para informaes sobre colees de cultura no mundo e os respectivos pases registrados no WDCM (World Data Center for Microorganism), acessar www.wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html
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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. 2. 3. Ballows, A.J., Hausler, W.J., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of clinical microbiology, 5 th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991. Baron, F.J., and Finegold, S.M. Diagnostic Microbiology, 8 th ed., CV Mosby, St. Louis, 1990. Bartlett, J.G., Ruan, K.J., Smith, T.F. and Wilson, W.R. Laboratory diagnosis of lower respiratory tract infections. CUMITECH 7A, Coordinating ed., J.A. Washington II, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987. Clarridge, J.E., Pezzlo, M.T. and Vosti, K.L. Laboratory Diagnosis of urinary tract infections. CUMITECH 2A, Coordinating ed., A.S. Weissfeld, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987. Forbes, B.A. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 10th Ed., CV Mosby, St. Louis, 1998. Gilligan, P.H., Janda, J.M., Karmali, M.A and Miller, J.M. Laboratory Diagnosis of Bacterial Diarrhea. CUMITECH 12A, Coordinating ed., F.S. Nolte. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. Isenberg, H.D. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. Isenberg, H.D. Essential procedures for Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. Isenberg, H.D., Schoenknecht, F.D. and A. VON. G., Collection and processing of bacteriological specimens. CUMITECH 9, Coordinating ed., S.J. Rubin. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1979.
4.
5. 6.
7. 8. 9.
10. Koneman, E.W. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed., Lippincot, Philadelphia, 1997. 11. Miller, J.M. A Guide to Specimen Management in Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C.,1996. 12. MINISTRIO DA SADE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTNCIA SADE. Manual de procedimentos bsicos em microbiologia clnica para o controle da infeco hospitalar. Braslia, 1991. 13. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C. and Yolken, R.H. Manual of Clinical Microbiology, 6th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1995. 14. NCCLS. Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals, 2nd. Ed., Approved Guide-line. NCCLS document GP2-A2 (ISBN 1-56238-156-3) NCCLS, Villanova, 1992. 15. Reller, L.B., MURRAY, P.R. and Mac Lowry, J.D. Blood Cultures II. CUMITECH 1A, Coordinating ed., J.A. Washington II, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1982. 16. Rodloff, A.C., Appelbaum, P.C. and Zabransky, R.F., Practical Anaerobic Bacteriology. CUMITECH 5A, Coordinating ed., A.C. Rodloff, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991.
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Mdulo IV
NDICE 1. Introduo ........................................................................................................................1 Procedimentos gerais ........................................................................................................... 1 2. Meios de cultura para transporte e conservao ...............................................................2 Cary Blair ........................................................................................................................... 2 Salina Tamponada ............................................................................................................... 2 Meio Stuart ........................................................................................................................ 3 gar nutriente .................................................................................................................... 4 3. Meios para crescimento e isolamento................................................................................6 gar Chocolate.................................................................................................................... 6 gar Thayer-Martin Chocolate ............................................................................................... 7 gar Salmonella-Shigella (ss)................................................................................................ 7 Caldo Selenito..................................................................................................................... 8 Caldo Tetrationato ............................................................................................................... 9 Caldo Tioglicolato com indicador .......................................................................................... 10 Caldo Tioglicolato sem indicador .......................................................................................... 11 gar Mac Conkey .............................................................................................................. 12 gar Sangue..................................................................................................................... 13 gar CLED cystine lactose electrolyte deficient .................................................................... 14 Caldo BHI brain heart infusion .......................................................................................... 15 Lwenstein Jensen............................................................................................................. 16 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook ............................................................................... 18 gar Mycosel .................................................................................................................... 19 gar Sabouraud ................................................................................................................ 20 4. Meios comerciais para provas de identificao ................................................................22 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base ........................................................ 22 gar Citrato Simmons ........................................................................................................ 23 gar Blis-Esculina ............................................................................................................. 24 gar Sangue - CAMP .......................................................................................................... 25 Caldo base de Moeller ........................................................................................................ 26 gar Dnase ...................................................................................................................... 28 gar Esculina.................................................................................................................... 30 gar Fenilalanina............................................................................................................... 31 CTA Cystine Tryticase Agar .............................................................................................. 32 Caldo Triptona e SIM ......................................................................................................... 33 Meio Caldo Triptona ........................................................................................................... 34 Caldo Malonato ................................................................................................................. 35 Caldo Nitrato .................................................................................................................... 36 Meio base para oxidao e fermentao - OF ......................................................................... 38 gar TSI triplo acar ferro .............................................................................................. 40 gar base uria (christensen).............................................................................................. 41 5. Frmulas e produtos para provas de identificao ..........................................................43 Para prova de catalase ....................................................................................................... 43 Para prova de coagulase..................................................................................................... 43 Para prova de gelatinase .................................................................................................... 45 Para prova de lecitinase ..................................................................................................... 46 Para prova de oxidase ........................................................................................................ 47 Para fermentao de carboidratos ........................................................................................ 48 Para a prova de hidrlise .................................................................................................... 49 Para crescimento a 42 e 44c.............................................................................................. 50 Para teste de motilidade ..................................................................................................... 51 Para prova de tolerncia ao NaCl 6,5% ................................................................................. 55 6. Discos para identificao.................................................................................................57 Bacitracina ....................................................................................................................... 57 Novobiocina...................................................................................................................... 57 Optoquina ........................................................................................................................ 58 7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos ...................................................60 HTM haemophilus test mdium ......................................................................................... 60 gar Mueller Hinton ........................................................................................................... 61 gar Mueller Hinton Sangue ................................................................................................ 62 8. Referncias bibliogrficas ...............................................................................................64
1. INTRODUO
PROCEDIMENTOS GERAIS
RECOMENDAES GERAIS
Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle de crescimento de que realmente est funcionando. No usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados. Observar com ateno para as instrues de alguns inculos que so especficos para alguns meios de cultura. Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rpido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente so de 11 por 100 mm). As placas de Petri so de 50, 90 ou 150 mm de dimetro. Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricao, data de validade e tipo de armazenamento. Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plstico PVC transparente para evitar o ressecamento. Evitar o uso de sacos plsticos para embalar as placas, pois a gua de condensao formada facilita a proliferao de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plsticos, procurando tirar o excesso de ar.
Mod IV - 1
PRINCPIO
meio de Cary Blair foi formulado partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patognicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio. A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente microrganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. a multiplicao de
O que difere este meio do meio de Stuart, a adio de uma soluo salina balanceada de tampo fosfato inorgnico e omitindo da frmula o azul de metileno.
UTILIDADE
Transporte de material fecal e conseqente conservao dos microrganismos.
FRMULA/ PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte Cary Blair.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 7 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para solidificar. pH: 7,4 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri ATCC 12022.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas.
INOCULAO
Introduzir um "swab" estril de madeira nas fezes recm coletadas; Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; Fechar o tubo; Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Branco opalescente. Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano.
RECOMENDAES
No deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta aps a semeadura. No semear fezes coletadas com mais de 6 horas. SALINA TAMPONADA
Mod IV - 2
PRINCPIO
Meio lquido tamponado que mantm a bactria vivel.
UTILIDADE
Meio de transporte de fezes.
FRMULA /PRODUTO
PROCEDIMENTOS
Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 mm; Esterilizar em autoclave.
CONTROLE DE QUALIDADE
Shigella flexneri ATCC 12022
INOCULAO
Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C por at 3 meses. MEIO STUART
PRINCPIO
A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente microorganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. a multiplicao de
UTILIDADE
Transporte de diversos materiais e conseqente conservao dos microorganismos. Conservao de microorganismos patognicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
FRMULA / PRODUTO
Meios comercial: Meio de transporte STUART
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 7 ml por tubo;
Mod IV - 3
Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para que solidifiquem. pH: 7,4 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Haemophilus influenzae ATCC 10211 Shigella flexneri ATCC 12022 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bordetella pertussis ATCC 9340
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por 1 a 2 semanas.
INOCULAO
O material biolgico deve ser coletado com auxlio de um "swab" estril com haste de madeira; Aps a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura; Fechar o tubo; Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Branco opalescente. Como este um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano.
RECOMENDAES
No deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta aps a semeadura. GAR NUTRIENTE
PRINCPIO
O Nutriente gar um meio relativamente simples, de fcil preparao e barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de Microbiologia.
UTILIDADE
nutriente gar tem vrias aplicaes no laboratrio de Microbiologia, e pode ser utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas exames bacteriolgicos e isolamento de organismos para culturas puras. uso mais freqente para a conservao e manuteno de culturas em temperatura ambiente neste gar, como mtodo opcional para os laboratrios que no dispem do mtodo da crioconservao (congelamento das cepas em freezer - 70C). Usado para observar esporulao de espcies de bacilos Gram positivos.
FRMULA / PRODUTO
Produto: Nutriente gar Frmula: Extrato de carne Peptona gar gar gua destilada pH: 6,8 +/- 0,2
3g 5g 15 g 1000 ml
Mod IV - 4
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar os componentes; Fundir; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45).
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie inclinada do meio; Incubar.
INTERPRETAO
Cor original do meio: branco opalescente Positivo: Crescimento na superfcie do gar; Negativo: Ausncia de crescimento.
RECOMENDAES
Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do gar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses. Conservar as cepas aps o crescimento no meio em temperatura ambiente. Por ser um meio nutritivo, a ausncia de crescimento no dever ocorrer.
Mod IV - 5
PRINCPIO
Meio de gar Chocolate amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. base do meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Observao: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cistena aps resfriar a base achocolatada aproximadamente 50C.
UTILIDADE
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
FRMULA / PRODUTO
Meios comerciais: BHI gar *, Columbia gar Base, Blood gar Base, Mueller Hinton gar. Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado. Recomenda-se o uso da base de BHI gar, por apresentar melhor crescimento das cepas exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base temperatura de aproximadamente 80C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escuro (chocolate); Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C por 4 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; Incubar a 35C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias de tamanho pequeno a mdio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. Colnias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
RECOMENDAES
Lembrar que um meio rico e crescem vrios tipos de microrganismos.
Mod IV - 6
Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata-se ou no de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomrficos). No usar sangue de cavalo vencido. Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. GAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE
PRINCPIO
um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contm em sua frmula antibiticos que inibem o crescimento de Neisserias saprfitas e outras bactrias, quando em amostras colhidas de stios contaminados.
UTILIDADE
Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigao.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Thayer-Martin gar Base. Sangue desfibrinado de carneiro. Suplemento I: mistura de inibidores (antibiticos). Suplemento II: mistura de fatores de crescimento.
PROCEDIMENTOS
Dissolver os suplementos liofilizados conforme instrues do fabricante (normalmente em gua destilada estril que j acompanha o kit) e reservar; Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante (normalmente prepara-se 200 ml de base para cada frasco de suplementos I e II ); Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a 80C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar bem at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escura (chocolate); Deixar resfriar a base a 50C; Adicionar assepticamente base resfriada os suplementos previamente dissolvidos; Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm ou 4 ml por tubos e inclinar para a superfcie ficar em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45). GAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
PRINCPIO
gar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos. A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. Tissulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de HS evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.
Mod IV - 7
UTILIDADE
Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar SS.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer o meio at fundir o gar; No autoclavar; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella. Colnias incolores: suspeita de Shigella spp. Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores. As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por 3 meses.
RECOMENDAES
Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio. CALDO SELENITO
PRINCPIO
Tem propriedades que inibem coliformes e outras espcies da flora intestinal como estreptococos.
UTILIDADE
Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Selenito Novobiocina
PROCEDIMENTOS
Mod IV - 8
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer at levantar fervura, homogeneizando de vez em quando; No autoclavar; Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o vu de Proteus spp.); Distribuir 7 ml em tubos estreis de 15x150 mm com tampa de rosca.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspenso na placa de SS; Incubar a placa a 35 1C por 12 a 18 horas.
INOCULAO
Inocular 3 a 4 aladas da amostra de fezes no meio de cultura; Incubar a 351C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho tijolo. Aps incubao, semear com o auxlio de uma ala bacteriolgica em meios seletivos e enriquecidos (SS, Mac Conkey, XLD, Hectoen). CALDO TETRATIONATO
PRINCPIO
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adio da soluo de iodo inibe a flora intestinal normal de espcies fecais.
UTILIDADE
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Tetrationato. Soluo de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra de fezes. Iodo metlico 6,0 g Iodeto de potssio 5,0 g gua destilada 20,0 ml
PROCEDIMENTOS
Caldo tetrationato Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante; Aquecer at ferver; Distribuir 10 ml em tubos estreis com tampa de rosca; No autoclavar. Soluo de iodeto de potssio Macerar o iodeto de potssio e o iodo em um graal; Adicionar gua aos poucos at dissolver completamente; Colocar em frasco mbar.
Mod IV - 9
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspenso de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspenso em uma placa de SS; Se houver crescimento de Salmonella e inibio de Escherichia coli, liberar o lote para uso.
INOCULAO
Adicionar 0,2 ml da soluo de iodo no tubo; Inocular 1a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente; Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: lmpido com precipitado branco. O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao, semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey.
CONSERVAO E VALIDADE
Tetrationato: Conservar de 4 a 8C por at 4 meses. Soluo de iodo: Conservar em frasco mbar a temperatura ambiente por at 12 meses.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAAO
Usar a tcnica de semeadura por esgotamento; Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumao de algodo embebido em gua); Incubao por 48 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata-se ou no de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificao com testes de oxidase e provas de fermentao.
RECOMENDAES
Antes de semear o material biolgico aquecer o meio de cultura em estufa 35C, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisserias; No usar meio, suplementos e sangue vencidos; Se no for incubado em CO2 e no houver crescimento, pode ser um resultado falso - negativo, pois as Neisserias necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento; Se no houver crescimento, incubar at 5 dias. CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR
Mod IV - 10
PRINCPIO
O meio de Tioglicolato d suporte para o crescimento de vrios microrganismos. O potencial de oxidao e reduo baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espcies preservadas com mercrio. A resazurina e o azul de metileno so indicadores da posio de oxidao de aerbios e a dextrose includa na frmula para os microrganismos que tem crescimento vigoroso na presena do carboidrato.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos aerbios, microaerfilos e anaerbios. Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo com indicador
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Bacillus subtilis ATCC 6633, Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
CONSERVAO E VALIDADE
Temperatura ambiente: 3 meses. Entre 4 a 8C: 6 meses.
INOCULAO
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at a metade do tubo; Retirar a ala sem agitar o tubo; Incubar 35 =/- 1C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio. Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. Crescimento de microrganismos anaerbios: crescimento na profundidade do meio. Crescimento de microrganismos aerbios: crescimento na superfcie do meio.
RECOMENDAES
No usar o meio quando estiver com cor rosa ou esverdeado na superfcie, pois indica a presena de oxignio no meio. Recomenda-se o uso do meio recm preparado, porm, se no houver a presena de oxignio, pode-se usar um perodo maior. No usar meios que estejam turvos. No utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio. CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR
Mod IV - 11
PRINCPIO
As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem uma anaerobiose suficiente para microrganismos anaerbios exigentes.
UTILIDADE
Usado para o cultivo de microrganismos anaerbios.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Tioglicolato caldo sem indicador.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente; Distribuir 5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543.
CONSERVAO E VALIDADE
Temperatura ambiente: 18 meses.
INOCULAO
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at o fundo do tubo; Retirar a ala sem agitar o tubo; Incubar 35 =/- 1C em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas.
INTERPRETAO
Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio. Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado.
RECOMENDAES
No usar meios que estejam turvos. Se necessrio, incubar um perodo superior 48 horas. GAR MAC CONKEY
PRINCPIO
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com outros meios, por isso no to seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o gar SS.
UTILIDADE
Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose.
Mod IV - 12
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: gar MacConkey.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao at fundir o gar completamente; Esterilizar em autoclave; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (no fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
INOCULAO
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram negativos. Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colnias incolores: no fermentadoras de lactose. No h crescimento de cocos Gram positivos.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar as placas embaladas de 4 a 8C por at 3 meses. GAR SANGUE
PRINCPIO
O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservao dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
UTILIDADE
Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Blood gar Base, Columbia gar Base, BHI gar, Mueller Hinton gar; Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 ml para cada 100 ml de meio base. pH: 6,8 +/- 0,2
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante;
Mod IV - 13
Esterilizar em autoclave; Esfriar a base +/- 50C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro.
CONTROLE DE QUALIDADE
Hemlise beta hemoltica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemlise alfa hemoltica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Hemlise gama (sem hemlise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C por 4 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; No final da semeadura, picar o meio com a ala para verificar hemlise em profundidade; Incubar 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho. Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas (lise total dos eritrcitos). Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros).
RECOMENDAES
No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise; No usar sangue humano, pois alguns microrganismos no apresentam hemlise; No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estude de hemlise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. GAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
PRINCPIO
Usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. A
UTILIDADE
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Cled.
Mod IV - 14
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colnias mdias ou grandes amareladas, aps 48 horas de incubao. Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colnias azuis translcidas. Negativo: ausncia de crescimento
INOCULAO
Verificar tcnica de semeadura quantitativa.
INTERPRETAO
Cor original do meio: azul claro. Colnias lactose positiva: cor amarela. Colnias lactose negativa: cor azul. Caractersticas de crescimento: Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo a branco azulado Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que E.coli Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de dimetro Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas Corynebacterium: colnias pequenas e cinza Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e periferia rugosa
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
RECOMENDAES
Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo lactose negativa ou positiva; Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos. CALDO BHI BRAIN HEART INFUSION
PRINCPIO
um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas. Mod IV - 15
UTILIDADE
Meio para cultivo de estreptococcos, fermentadores, leveduras e fungos. pneumococos, meningococos, enterobactrias, no
Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44C e para teste de motilidade em lmina.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231. Negativo: meio sem inocular.
INOCULAO
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia ou o material a ser testado realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas; Incubar a 35C 2 por 24 a 48 horas; Para isolamento de fungos incubar por at 5 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro, lmpido. Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C por 6 meses.
RECOMENDAES
Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar. Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X). LWENSTEIN JENSEN
PRINCPIO
A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis).
UTILIDADE
Isolamento primrio das micobactrias.
Mod IV - 16
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base Ovos de galinha frescos Meio base - frmula: Fosfato monopotssico Sulfato de magnsio Citrato de magnsio L-asparagina Fcula de batata Glicerol Ovos totais Soluo de Verde de malaquita a 2% 1,2 g 0,12 g 0,3 g 1,8 g 15,0 g 6,0 ml 500 ml 10 ml
PROCEDIMENTOS
Preparao dos ovos: Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias; Deixar os ovos submersos em gua e detergente comum, durante 30 minutos; Enxaguar com gua corrente cuidadosamente um a um; Deixar os ovos submersos em lcool etlico a 70% durante 30 minutos; Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estril; Reservar os ovos. Soluo de Verde de malaquita a 2%: Pesar o verde de malaquita e adicionar a gua; Homogeneizar bem at dissolver o corante; Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos; Reservar a soluo. Meio comercial: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente at ferver; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base 45 - 50C; Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de bquer estril e transferir, um a um, para uma proveta estril de 500 ml; Completar a proveta com ovos at completar 500 ml; Transferir os ovos para um copo de liqidificador estril - se no tiver liqidificador prprio para laboratrio, transferir os ovos para um balo de 1000 ml contendo prolas de vidro de tamanho mdio, ambos estreis; Homogeneizar os ovos; Passar os ovos para o balo que contm a base fria, filtrando em funil e gaze estril; Adicionar o verde de malaquita; Homogeneizar bem; Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfcie estourarem; Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estril; Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45) durante 50 minutos a 85C - se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50 minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. Meio no comercial: Diluir a L-asparagina em pouca gua e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen; Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita; Esterilizar em autoclave; Seguir os passos 4 ao 14 listados acima.
Mod IV - 17
CONTROLE DE QUALIDADE
Esterilizao: colocar todos os tubos em estufa; Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 Mycobacterium avium ATCC 25291
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar entre 4 a 8C por 3 meses.
INOCULAO
Para materiais biolgicos de stios contaminados, fazer descontaminao prvia pelas tcnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sdio, Corper & Stoner modificado); Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfcie do meio; Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta at secar bem o inculo; Depois de seco o inculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias 35C; Semanalmente, abrir as tampas prximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presena ou no de crescimento.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde claro Positivo: Crescimento de colnias amarelas Negativo: ausncia de crescimento.
RECOMENDAES
Como um meio rico em protenas, bactrias proteolticas contaminam o meio, liqefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubao para tirar as culturas que possam ter contaminado; No usar ovos velhos; No quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais; Manter sempre mais que um bquer estril para o caso de haver algum ovo estragado; No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. MEIO BIFSICO: LWENSTEIN E MIDDLEBROOK
PRINCPIO
O meio constitudo de duas fases, uma slida que o meio de Lwenstein Jensen e uma lquida, que o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessrios para o desenvolvimento das micobactrias isoladas de materiais nobres.
UTILIDADE
Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactrias do sangue e de materiais paucibacilares, como lquor, lquido pleural, bipsias, entre outros.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento). Ovos de galinha frescos
Mod IV - 18
PROCEDIMENTOS
Meio de Lwenstein Jensen: procedimento igual ao j descrito, distribuindo 12 ml do meio em frascos estreis com capacidade para 100 ml (usar tampo de algodo e depois do meio pronto parte slida e lquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumnio) e coagulando os frascos bem inclinados. Meio Middlebrook 7H-9 broth: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Adicionar o glicerol, conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base - 50C; Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instrues do fabricante; Homogeneizar bem; Distribuir 15 ml em cada frasco de Lwenstein Jensen inclinado; Fazer o controle de qualidade de esterilidade; Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em lcool etlico 70% durante 30 minutos) e lacre de alumnio. pH: 6,6 +/- 0,2
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar os frascos embalados de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAO
Por serem materiais estreis, no necessrio a descontaminao; Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ; Se for outro material, inocular at 5 ml de material; Incubar durante 60 dias 35 /- 0,2; Banhar o meio slido semanalmente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: parte slida: verde clara, parte lquida: mbar claro. Positivo: turvao do meio lquido e crescimento de colnias amarelas no meio slido. Negativo: ausncia de turvao e crescimento nos meios lquido e slido.
RECOMENDAES
No usar frascos com meio lquido turvo; Volumes de inculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas; No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. GAR MYCOSEL
PRINCPIO
Mod IV - 19
A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatfitos o cloranfenicol inibe o crescimento de bactrias e alguns fungos filamentosos.
UTILIDADE
Isolamento de fungos patognicos, principalmente dermatfitos, a partir de material de investigao contaminado.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Mycosel gar, Mycobiotic gar ou gar seletivo para fungos patognicos.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 6,9 +/- 0,1
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231. Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
INOCULAO
Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: estriar na superfcie inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37C; Observar diariamente a presena ou no de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAES
A ausncia de crescimento no indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido neste meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. GAR SABOURAUD
PRINCPIO
Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e filamentosos.
UTILIDADE
Mod IV - 20
Cultivo e crescimento de espcies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infeces superficiais. Caracterizao macroscpica do fungo filamentoso (colnia gigante).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Sabouraud Dextrose gar.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 5,6 +/- 0,1
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 6 meses.
INOCULAO
Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: semear na superfcie inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro 37C; Observar diariamente a presena ou no de crescimento; Incubar 40 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que cresceu.
RECOMENDAES
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. No usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI gar.
Mod IV - 21
PRINCPIO
Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de nitrognio livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observase o crescimento ao redor, aps um perodo de incubao.
UTILIDADE
Identificar as espcies de leveduras atravs da prova de assimilao de carboidratos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrognio para leveduras. Discos comerciais de carboidratos. Discos preparados no laboratrio, impregnados com solues de carboidratos a 1%: - Carboidrato 1g - gua destilada 100 ml
PROCEDIMENTOS
Para os discos de carboidratos: Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio; Usar discos estreis disponveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de dimetro em autoclave; Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar gua, homogeneizar bem at completa dissoluo - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol; Esterilizar por filtrao (cada um em frasco separado); Impregnar os discos previamente estreis (embeber totalmente os discos); Deixar os discos em estufa 37C at secarem totalmente . Para o meio base de nitrognio: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
CONTROLE DE QUALIDADE
CARBOIDRATOS Glicose Maltose Sacarose Lactose Galactose Melibiose Celobiose Inositol Xilose Rafinose Trealose Dulcitol POSITIVO Candida albicans Candida albicans Candida tropicalis Candida kefyr Candida albicans Candida guilliermondii Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Candida albicans Candida guilliermondii Candida albicans Candida guilliermondii Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei NEGATIVO
Mod IV - 22
CONSERVAO E VALIDADE
Meio base: 4 a 10C por 6 meses. Discos: refrigerado e se possvel em dessecador durante 1 ano ou mais.
INOCULAO
Aquecer o tubo contendo 20 ml de meio base de nitrognio at fundir totalmente; Resfriar a base 47 - 48C; Fazer uma suspenso das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 ml de gua destilada estril, , usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas; Despejar a suspenso de leveduras no tubo contendo a base de nitrognio; Homogeneizar bem; Despejar o contedo homogeneizado (meio base + suspenso de leveduras) em placa de Petri de estril de 150 mm de dimetro; Esperar solidificar em temperatura ambiente; Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxlio de uma pina flambada; Incubar 30C durante 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilao do acar pela levedura. Negativo: Ausncia de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.
RECOMENDAES
No usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas; No usar inculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso - negativa; No adicionar a suspenso de leveduras base com temperatura superior a 48C, pois pode inativar as clulas e resultar em prova falso - negativa; Aps homogeneizar o meio base e suspenso de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente. GAR CITRATO SIMMONS
PRINCPIO
Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Citrato Simmons.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante; Ajustar o pH para 6,9 0,2; Aquecer sob agitao at fundir o gar; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Mod IV - 23
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Com o auxlio de um fio bacteriolgico, inocular na superfcie a colnia, no furar a base; Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde Positivo: cor azul ou crescimento no local do inculo. Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada. Se houver crescimento visual na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino (azul). Leitura inicial com 24 horas: Se resultado positivo: encerrar o teste. Se resultado negativo ou houver dvida: reincubar por mais 24/48 horas. Leitura com 48 horas: Se houver crescimento visvel na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste). Se resultado negativo ou houver dvida, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino(azul).
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas; Aps este perodo realizar controles negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxignio. No se devem transportar colnias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo. Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25C) por at 7 dias. No usar repiques de caldo. Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactria. Para fazer o inculo flambar o fio bacteriolgico. No fazer inculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo). GAR BLIS-ESCULINA
PRINCPIO
A prova de Bile-Esculina baseada na capacidade de algumas bactrias hidrolisarem esculina em presena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio. Aa esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares. As bactrias Bile-Esculina POSITIVAS, so capazes de crescer em presena de sais biliares. A hidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e esculetina. A esculetina reage com ons frricos (fornecidos pelo composto inorgnico do meio - o citrato frrico), formando um complexo negro. Mod IV - 24
UTILIDADE
Separao dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. Identificao dos Enterococcus spp., que so Bile-Esculina positiva. Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores e enterobactrias, usar o meio sem blis (vide prova de esculina).
FRMULA/ PRODUTO
Meio comercial: gar Blis-Esculina Frmula: Peptona Extrato de carne Blis Esculina Citrato frrico gar gua destilada pH = 7,0 5g 3g 40 g 1g 0,5 g 15 g 1000 ml
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Fundir o meio; Distribuir 2,5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45).
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C por 4 meses.
INOCULAO
Estriar a superfcie inclinada do meio; Incubar a 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: acinzentado Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio. Negativo: Ausncia de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio aps 72 horas de incubao.
RECOMENDAES
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas). Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presena de blis se incubados em atmosfera de CO2. GAR SANGUE - CAMP
Mod IV - 25
PRINCPIO
Consiste na interao da beta hemlise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma protena, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemlise no local da inoculao.
UTILIDADE
Separao do Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolticos e espcies de Listeria.
FRMULA/ PRODUTO
Para esta prova utiliza-se: Placa de meio gar Sangue. Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAO
Com auxlio do fio bacteriolgico, semear na superfcie de meio gar Sangue a cepa Staphylococcus aureus com uma nica linha reta; Novamente com o fio bacteriolgico (flambado), tocar nas colnias em estudo; Semear uma nica linha reta na superfcie do meio gar Sangue, perpendicularmente linha semeadura do S. aureus, sem tocar no inculo do S. aureus; Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio gar Sangue duas vezes, uma de cada lado semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inculo j feitos (a do S. aureus e cepa em estudo); Incubar 35C 24 horas. (a) Inculo do S. aureus (b) Inculo da cepa em estudo de de da da
INTERPRETAO
Positivo: Aumento da rea de hemlise em forma de flecha no local onde esto mais prximas as duas estrias de crescimento. Negativo: Ausncia de aumento da hemlise. Observa-se nitidamente a hemlise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.
RECOMENDAO
No utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem no produzir beta hemolisina. No tocar as estrias da semeadura das cepas, para no dar um resultado falso negativo. No utilizar placas de gar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, j que baseada na hemlise das cepas. CALDO BASE DE MOELLER
PRINCPIO
As descarboxilases so um grupo de enzimas com substrato especfico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminocidos para formarem aminas alcalinas. Essa reao, conhecida como descarboxilao, origina dixido de carbono como produto secundrio. Emprega-se normalmente trs aminocidos para identificao dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller a mais utilizada. Os produtos aminados especficos, so:
Mod IV - 26
A converso da arginina em citrulina uma atividade de diidrolase, e no descarboxilase, na qual o grupo NH2 retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina convertida em ornitina, que sofre descarboxilao para formar putrescina. A incubao deve ser em anaerobiose e para isso, adicionado 1 ml de leo mineral estril aps a inoculao. No incio da incubao, a glicose contida no meio fermentada e ocorre viragem de cor prpura para o amarelo. Quando o aminocido descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para prpura original.
UTILIDADE
Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificao. Utilizado principalmente para identificaes de enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores, estafilococos.
FRMULA / PRODUTO
Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase. Aminocidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina.
PROCEDIMENTOS
Preparar os meios com a Base de Moeller e aminocidos; Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminocidos, que ser usada como controle; Seguir as recomendaes do fabricante para pesar o meio Base de Moeller; Se usar aminocido L (levgiro), adicionar 1 grama do aminocido para cada 100 ml de meio base; Se usar aminocido DL (dextrgiro), adicionar 2 gramas do aminocido para cada 100 ml de meio base; Homogeneizar bem o meio; Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N ; Distribuir 2 ml por tubo (usar tubos de rosca); Esterilizar em autoclave.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047. Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Enterobacter sakazakii. Negativo: Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.
INOCULAO
A partir de crescimento recente, inocular a colnia em estudo no tubo contendo o aminocido e no tubo controle; Colocar aproximadamente 1 ml de leo mineral estril em cada tubo; Incubar 35 +/- 1C em aerobiose.
INTERPRETAO
Mod IV - 27
Tubo controle (sem aminocido) : amarelo e turvo - indica que o microrganismo vivel e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase. Tubo com aminocido: prpura e turvo- indica a formao de aminas a partir da reao de descarboxilao.
RECOMENDAES
Verificar se o inculo foi satisfatrio para o crescimento, pois a cor original do meio - prpura, sem apresentar turvao no significa positividade e sim, ausncia de crescimento bacteriano. Como a reao ocorre em anaerobiose, imprescindvel a adio de leo mineral. Pode-se autoclavar o meio j com o leo mineral ou adicionar aps a inoculao do microrganismo. Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos no fermentadores, necessrio um perodo de incubao prolongado (24 a 72 horas). GAR DNASE
PRINCPIO
Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestvel. Estas enzimas hidrolisam cido desoxirribonuclico (DNA) contido no meio de cultura aps um perodo de incubao. Posteriormente este meio acidificado com HCl 1N para a revelao da prova.
UTILIDADE
Prova de identificao que separa os principais microrganismos de importncia clnica, entre eles: DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis. DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactrias, Gram negativos no fermentadores. demais bacilos
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: DNase gar.
PROCEDIMENTOS
Pode-se revelar a prova de duas maneiras: Com uma soluo de cido clordrico 1 N Adicionando base do meio de cultura azul de Toluidina O. Para a revelao com cido clordrico 1N:
Preparar e esterilizar o meio conforme instrues do fabricante; Esfriar o meio aproximadamente 50C; Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.
Preparar uma soluo de HCl 1N, seguindo a frmula abaixo: N= C1 V (nmero de equivalentes grama de soluto) (volume da soluo)
Mod IV - 28
C1 = M1 E E=M x
(peso molecular do soluto) (volume da soluo) x: para para para para bases: OH desprendido na reao cidos: H+ ionizveis oxidantes / redutores: variao do NOX sais normais: valncia do ction ou nion
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acrescentar para cada 1000 ml de base 0,1g de azul de Toluidina O; Esterilizar em autoclave; Esfriar o meio aproximadamente 50C; Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ou Escherichia coli ATCC 25922.
CONSERVAO E VALIDADE
Meio: 4 a 10 C por 3 meses. cido Clordrico 1N: Guardar em frasco mbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade. Validade: 6 meses.
INOCULAO
Para as duas tcnicas de preparao, a inoculao a mesma: Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso na placa de DNase ; Incubar 35 +/- 1C 24 horas.
INTERPRETAO
Revelao com HCl 1 N: Cor original do meio: amarelo claro Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N at banhar totalmente a superfcie do meio; Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco. Positivo: Presena ntida de halo claro na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de halo claro em volta da colnia. revelao com azul de toluidina o: Cor original do meio: azul claro Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.
RECOMENDAES
Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova; Em uma mesma placa, pode-se fazer at 4 testes (placas de 50 mm de dimetro); armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N negativas; pode dar leituras falso
Para a deteco da atividade de DNase no necessrio que haja crescimento, por isso que a semeadura deve ser de forma circular densa e no de estria;
Mod IV - 29
Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um perodo maior de incubao (at 48 horas) para produzirem DNase; Usar cultura jovem (at 24 horas). GAR ESCULINA
PRINCPIO
Verifica se a bactria capaz de hidrolisar a esculina. A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores; Para identificao de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com blis, vide prova de BileEsculina.
FRMULA /PRODUTO
gar trptico de soja (TSA) ou base de gar sangue Citrato frrico Esculina gua destilada 4g 0,05 g 0,1 g 100 ml
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSA ou a base de gar sangue, o citrato frrico e a esculina e colocar tudo no mesmo Erlenmeyer; Colocar gua destilada; Ajustar o pH para 7,0; Aquecer lentamente at fundir o gar e dissolver o citrato frrico (lentamente porque o citrato frrico demora a dissolver); Distribuir 3 ml do meio em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
INOCULAO
Inocular colnias de crescimento recente (18 24 hs); Picar o meio e semear na superfcie do gar; Incubar a 35 C por 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: palha. Positivo: marrom escuro ou preto. Negativo: inalterado (palha).
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C, de 6 a 8 semanas. Aps este perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
Mod IV - 30
A enzima glicosidase responsvel pela hidrlise da esculina em todas as enterobactrias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli no possue a enzima glicosidase sendo necessrio usar a lactose, outro dissacardeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inculo leve com agulha bacteriolgica e interpretar aps 18-24 horas. A produo de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso no uma reao positiva. Resultado falso positivo pode ocorrer pela produo de HS em no fermentadores, semelhante ao bacilo da bactria Shewanella putrefaciens. GAR FENILALANINA
PRINCPIO
Verifica a capacidade da bactria de produzir cido fenilpirvico a partir da fenilalanina por ao enzimtica.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Fenilalanina Soluo de cloreto frrico: Cloreto frrico 10 g Adicionar 100 ml de gua destilada Colocar em frasco mbar. Validade: 6 meses A soluo de cloreto frrico 10% utilizada para revelar a atividade da enzima fenilalanina desaminase no meio de fenilalanina.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob constante agitao at fundir o meio; Ajustar o pH para 7,3 0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427 ou Proteus mirabilis ATCC 12453. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Fazer um inculo denso; Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 35C por 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado e distribuir o reagente sobre a superfcie do meio. Cor original do meio: amarelo palha.
Mod IV - 31
Positivo: formao de uma colorao esverdeada na superfcie do meio aps a adio do cloreto frrico. Negativo: o meio permanece inalterado.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C, de seis a oito semanas.
RECOMENDAES
Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretao deve ser feita em at 5 minutos. CTA CYSTINE TRYTICASE AGAR
PRINCPIO
CTA um meio semi-slido, recomendado para o estudo de fermentao de carboidratos de microrganismos exigentes.
UTILIDADE
Usado para diferenciar espcies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Corynebacterium spp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial Cystine Tryticase agar Medium. Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose, mannose. Carboidrato gua destilada pH: 7,3 +/- 0,2 10 g 100 ml
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar; Pesar o CTA conforme instrues do fabricante, acrescentar 900 ml de gua e homogeneizar bem; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a aproximadamente 50C; Adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao; Distribuir em 3 ml por tubo; Deixar os tubos esfriar na posio vertical.
CONTROLE DE QUALIDADE
POSITIVO Glicose Maltose Lactose Sacarose Frutose Manose Neisseria sicca Neisseria sicca Neisseria lactamica Neisseria sicca Neisseria sicca Haemophilus parainfluenzae NEGATIVO Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Neisseria sicca Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Haemophilus influenzae
CONSERVAO E VALIDADE
Temperatura ambiente por 3 meses.
Mod IV - 32
INOCULAO
Fazer um inculo bem denso, no centro do meio; Incubar 35C em jarra com vela acesa e gaze embebida em gua de torneira para manter a umidade da atmosfera.
INTERPRETAO
Cor original do meio: alaranjado Positivo: cor amarela, indicando acidificao (fermentao) do meio e turvao. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem turvao.
RECOMENDAES
Para provas negativas, incubar um perodo maior (72 horas); No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato; Fazer inculo denso, pois inculos fracos podem dar resultado falso negativo. CALDO TRIPTONA E SIM
PRINCPIO
Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano um aminocido que pode ser oxidado por certas bactrias resultando na produo de indol, aps a adio de reagentes de Erlich ou Kovacs.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, Haemophilus e anaerbios.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Triptona. Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade gar). Reativo Erlich Paradimetilaminobenzaldedo lcool etlico (95%) cido clordrico concentrado 1g 95 ml 20 ml
Guardar em frasco mbar em temperatura ambiente (22-25C). Cor original do reativo de Erlich: amarelo Ou Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso) ou ser preparado no laboratrio: lcool isoamlico Paradimetilaminobenzaldedo cido clordrico concentrado 150 ml 10,0 g 50 ml
Dissolver o aldedo em lcool e adicionar lentamente o cido clordrico; Guardar em frasco mbar e no refrigerador quando no estiver em uso. Obs: No conservar em temperatura ambiente por longo perodo a cor pode ser alterada de amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade. Xilol : pode ser adquirido comercialmente pronto para uso.
Mod IV - 33
PROCEDIMENTOS
Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio SIM Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
CONTROLE DE QUALIDADE
Controle qualidade para meio Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Controle qualidade para meio SIM:
Microrganismo Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli H2S + neg neg INDOL + neg + MOTILIDADE + neg +
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAO
Meio Caldo Triptona Fazer um inculo leve com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios); Fazer um inculo denso com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus); Incubar a 35C por 24 horas (enterobactrias) ou at 48 horas (bacilos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente. Meio SIM Com o auxlio da agulha, inocular uma colnia no meio na posio vertical, lentamente at a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inculo; Incubar a 35C por 18-24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: Aps incubao, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs. A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferncia dos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios, que podem produzir mnima quantidade de indol. Revelao com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e aguardar 1 minuto; Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura.
Mod IV - 34
Indol positivo: aparecer um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol. Indol negativo: permanecer um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM Realizar a leitura da motilidade e do HS. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.
Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido. HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra. HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada. Indol positivo aparecer um anel vermelho. Indol for negativo aparecer um anel amarelo.
CONSERVAO E VALIDADE
Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8C. Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampo de algodo o meio pode ressecar antes deste prazo.
RECOMENDAES
Um timo pH para triptofanase levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH cido pode baixar a produo do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco. Cultura para ser testada produo de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tenso de oxignio baixa a produo de indol. Indol positivo se perde aps 96 horas de incubao. Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produo, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espcies de Clostridium spp. Pequenas modificaes podem ser necessrias para testar a produo de indol em no fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilizao de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. Na extrao de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluio do indol tornando-o fraco positivo ou negativo. Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inculo denso no caldo de triptona, incubao de 48 horas, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. CALDO MALONATO
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sdio como nica fonte de carbono, resultando em alcalinizao do meio.
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
Mod IV - 35
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo Malonato.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Ajustar o pH 6,7 0,2; Distribuir 1,5 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Inocular colnias puras de 18 a 24 horas; Inculo leve; Incubar a 35C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde. Positivo: azul. Negativo: inalterado (verde).
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. Aps este perodo realizar controle positivo e negativo semanalmente.
RECOMENDAES
Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentao da glicose aumenta a acidez. Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinizao, dificultando a interpretao. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inculo para comparao, junto com o teste em questo, se no aparecer nenhum trao azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo aps incubao de 48 horas. Cuidado ao interpretar resultados aps incubao prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reao fraca positivo podendo ser ignorado. CALDO NITRATO
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO) a nitrito (NO) ou gs nitrognio (N) (denitrificao).
UTILIDADE
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, anaerbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Caldo Nitrato. Reagentes para revelao da reao.
Mod IV - 36
Soluo B N,N-dimetil-l-naftilamina cido actico 5N* * cido actico 5N cido actico glacial gua destilada
PROCEDIMENTOS
Caldo nitrato Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH 7,0; Distribuir 3 ml do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido; Esterilizar em autoclave; Deixar o tubo esfriar na posio vertical Reagentes para revelao da reao.
Soluo A Dissolver o cido sulfanlico em uma parte do cido e depois completar com o restante do cido actico q.s.p. 100 ml.
Soluo B Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do cido e completar o restante do cido actico q.s.p. 100 ml.
CONTROLE DE QUALIDADE
Resultado Nitrato reduzido a nitrito Nitrato a gs Nitrato no reduzido Cepa Enterobactrias Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Resultado esperado Colorao vermelha Bolhas no tubo de Durhan Colorao vermelha somente aps adio de p de zinco
INOCULAO
Fazer um inculo denso, com colnias recentes (18 24 horas) no meio com ala bacteriolgica; No agitar o tubo aps inoculao; Incubar 351C por 24 a 48 horas, sendo necessrio algumas vezes at 5 dias; Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a reao; Verificar a presena de bolhas dentro do tubo de Durhan.
INTERPRETAO
Cor original do meio: incolor a palha. Verificar se h bolhas de gs dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactria reduziu nitrato a gs = denitrificao. Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria reduziu nitrato a nitrito. Se aps a adio dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de p de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria no reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio.
Mod IV - 37
IMPORTANTE: algumas bactrias no conseguem reduzir nitrato a nitrito e s conseguem reduzir nitrito, como por exemplo alcaligenes faecalis e oligella uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para este fim.
REAGENTES A e B +
neg
pos
neg
neg
neg
CONSERVAO E VALIDADE
Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8C por at 6 meses. Solues A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8C) por at 12 meses. cido actico 5N: Conservar de 4 a 8C por at 12 meses.
RECOMENDAES
Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo, devido alta sensibilidade do teste. Quando for adicionado o p de zinco, no colocar em excesso, pode resultar em falso negativo (incolor). MEIO BASE PARA OXIDAO E FERMENTAO - OF
PRINCPIO
Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Meio base de OF Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc). Vaselina lquida estril.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer o meio at dissolver todo o gar; Separar volumes iguais em diferentes Beckers, dependendo do nmero de carboidratos que sero preparados; Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 ml de meio base e homogeneizar; Distribuir 2 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a vlvula de presso da autoclave aberta e, quando estiver saindo bastante vapor, comear marcar o tempo. Vapor fluente s pode ser feito
Mod IV - 38
em autoclave com tampas regulveis para sada de vapor. Autoclaves horizontais no possuem controle de sada de vapor, so automticas); Pode-se tambm esterilizar a base e adicionar os acares esterilizados por filtrao em filtros Millipore 0,45 m (90 ml de base autoclavada e 10 ml de acar (esterilizado por filtrao); Deixar esfriar a temperatura ambiente na posio vertical.
CONTROLE DE QUALIDADE
Resultado OF-GLICOSE Cepa Resultado esperado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F- amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F- inalterado
Oxidador Pseudomonas aeruginosa Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-FRUTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-LACTOSE Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-MALTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-MANITOL Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-SACAROSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* OF-XILOSE Oxidador Burkolderia cepacia Fermentador Klebsiella pneumoniae Inalterado Alcaligenes faecalis* A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina lquida Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 * Alcaligenes faecalis ATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238
INOCULAO
Inocular densamente at o fundo do tubo com a agulha bacteriolgica, colnias provenientes de uma placa de crescimento de 18 a 24 hs.; Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 ml de vaselina lquida estril, no outro tubo no colocar vaselina; Incubar temperatura de 35C por 48 horas ou mais; Se resultado negativo, pode ser necessrio at 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando diariamente.
INTERPRETAO
Cor original do meio: verde Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela tubo fechado - inalterado (verde) Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela Assacaroltico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde)
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses.
RECOMENDAES
Sempre antes de interpretar a reao verificar se h crescimento nos tubos, porque algumas bactrias no crescem no meio OF, sendo necessrio enriquecimento do meio, acrescentando 2 % de soro de coelho ou cavalo. Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.
Mod IV - 39
PRINCPIO
Este meio contm trs acares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para deteco da fermentao de carboidratos e sulfato de ferro para deteco da produo de sulfato de hidrognio (indicado pela cor preta na base do tubo). A fermentao indicada pela mudana da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O gar fundido deixado solidificar, formando uma superfcie inclinada. Essa configurao origina duas cmaras de reao dentro do mesmo tubo. A poro inclinada ou bico, exposta em toda sua superfcie ao oxignio atmosfrico, aerbia. A poro inferior, denominada profundidade ou fundo, est protegida do ar e relativamente anaerbia. Quando se prepara o meio, importante que o bico e a profundidade tenham o comprimento igual ao redor de 3 cm cada um, de modo que o efeito das duas cmaras seja conservado.
UTILIDADE
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentao de carboidratos, produo de sulfato de hidrognio e gs.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: TSI (trplice acar ferro).
PROCEDIMENTOS
Pesar o TSI conforme instrues do fabricante; Ajustar o pH para 7,3 0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Microrganismo Escherichia coli Shigella flexneri Edwardsiella tarda Pseudomonas aeruginosa ATCC 25922 12022 15947 27853 Superfcie cido Alcalino Alcalino Alcalino Base cido, gs cido cido Alcalino HS neg neg + +
INOCULAO
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Semear por picada at o fundo e na superfcie do meio; Incubar 24 hs a 35C, com a tampa semi aberta.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente. Leitura: entre 18 e 24hs. Cor prpura = alcalino. Cor amarelo = cido. Reaes pice/base: Prpura/amarelo = fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos). Amarelo/amarelo = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 aucares). Mod IV - 40
INTERPRETAO MAIS PROVVEL Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) ou esquecimento de picar a base Enterobactrias ou Aeromonas Lac (neg) Samonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter
Amarelo Amarelo
Amarelo Amarelo
neg +
varia varia
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
RECOMENDAES
Quando h produo de HS significa que a base sempre cida. No realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar em falsas reaes. No utilizar alas bacteriolgicas para no fragmentar o meio, ocasionando falsa reao de gs, utilizar fio bacteriolgico. Qualquer trao de escurecimento no meio deve ser indicado com HS positivo. GAR BASE URIA (CHRISTENSEN)
PRINCPIO
Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uria em duas molculas de amnia pela ao da enzima urease, resultando na alcalinizao do meio.
UTILIDADE
Bacilos Gram negativos fermentadores e no fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus.
FRMULA /PRODUTO
Meio comercial: Uria. Soluo de uria a 40% (40 g uria + 100 ml de gua destilada).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio de uria conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar at 50C e adicionar assepticamente 5 ml da soluo de uria a 40% em 95 ml do meio base; Homogeneizar e distribuir 3 ml do meio assepticamente em tubos estreis com tampa de rosca; Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Obs: A soluo de uria a 40% uma soluo hipertnica e o risco de contaminao baixo, porm, pode-se esterilizar a soluo por filtrao (filtro Millipore de 0,45 m).
CONTROLE DE QUALIDADE
Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 1C por 24 horas. mudana de cor liberar para uso. Se no houver
Mod IV - 41
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315 Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
INOCULAO
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Fazer um inculo denso; Semear na superfcie do meio, no picar a base, pois a base pode servir como controle; Incubar 35C de 6 a 24 horas, podendo ser necessrio at 6 dias.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: alterao do meio para cor de rosa, pink. Negativo: sem alterao de cor do meio. Diferentes graus de hidrlise da uria podem ocorrer: Tubo inteiro cor pink. Superfcie do tubo cor pink, base no muda de cor. Fracamente positivo: pice cor pink, restante do tubo no muda de cor. Positivo rpido: 1 6 horas para Proteus spp. Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubao. Ex: algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses. Aps este perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAES
No aquecer a soluo base da uria, pois a uria pode se decompor se aquecida. No utilizar a uria de Stuart porque menos sensvel para detectar a presena de urease. No deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrlise.
Mod IV - 42
PRINCPIO
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio.
UTILIDADE
Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis.
FRMULA/ PRODUTO
Perxido de Hidrognio (H2O2) 3%.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
CONSERVAO E VALIDADE
perxido de hidrognio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3% sobre uma lmina; Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo na gota de perxido de hidrognio.
INTERPRETAO
Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo de efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio gasoso. Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia.
RECOMENDAES
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos podem produzir reao fraca de catalase. Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, no usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois so catalase negativos. PARA PROVA DE COAGULASE
PRINCPIO
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um cogulo, uma vez que a coagulase uma protena com atividade similar protombrina, capaz de converter o fibrinognio em fibrina, que resulta na formao de um cogulo visvel. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre. A coagulase conjugada (prova em lmina), tambm conhecida como fator de aglutinao, encontra-se unida parede celular bacteriana e no est presente em filtrados de cultivos.
Mod IV - 43
Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma (fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visveis. A coagulase livre (prova em tubo), uma substncia similar trombina e est presente em filtrados de cultivos. secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio, formando fibrina (cogulos). Quando uma suspenso em plasma do microrganismo produtor de coagulase preparada em tubo de ensaio, forma-se um cogulo visvel aps o perodo de incubao.
UTILIDADE
Separar as espcies de Staphylococcus de importncia clnica, S. aureus coagulase positiva, das demais espcies coagulase negativa.
FRMULA / PRODUTO
Plasma de coelho com EDTA liofilizado.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
CONSERVAO E VALIDADE
plasma antes e depois de reconstitudo, deve ser mantido refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Coagulase conjugada: Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro; Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis dentro de cada crculo; Com auxlio de um fio bacteriolgico agregar a colnia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada crculo; Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos; No outro crculo, adicionar outra gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis, como controle; Homogeneizar com palito de madeira; Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs; Observar presena de aglutinao. Coagulase livre: Com auxlio do fio bacteriolgico, estufa 37C at que turve; suspender colnias em estudo em caldo BHI e colocar em
Se necessrio, acertar a turbidez at 0,5 da escala de MacFarland; Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5 ml de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recm turvado; Incubar em estufa 35C 4 horas; Verificar se h presena de cogulo; Se no houver presena de cogulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubao.
Mod IV - 44
INTERPRETAO
Coagulase conjugada: Positiva: formao de precipitado branco e aglutinao dos microrganismos da suspenso, aps 15 segundos, no crculo que contm o plasma. Negativa: ausncia de aglutinao no crculo que contm o plasma. Controle sem plasma: dever ser leitoso e uniforme, sem presena de precipitado ou aglutinao. A presena de precipitado ou aglutinao, torna a prova inespecfica, devendo ser repetida a prova em tubo. Coagulase livre: Positiva: presena de qualquer grau de cogulo. Negativa: ausncia de cogulo.
RECOMENDAES
Para a coagulase em tubo, as provas negativas aps 4 horas a 37C, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubao prolongada a 37C podem produzir fibronolisinas, o que causa dissoluo do cogulo durante a incubao. Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e no agitar, pois a agitao pode desmanchar os cogulos parcialmente formados. Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA. No utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), daro resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos. Plasma humano no recomendado, pois contm quantidades variadas de Fator de Reao com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa. PARA PROVA DE GELATINASE
PRINCPIO
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina.
UTILIDADE
Identificar e classificar bactrias fermentadoras, no fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
FRMULA / PRODUTO
Filme no revelado de Raio X. Salina 0,9 % estril ou gua destilada estril.
PROCEDIMENTOS
Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm; Armazenar em frasco estril.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAO
Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estril ou gua destilada estril.; Com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazer um inculo denso da bactria a ser testada, adicionar uma fita de raio x. Fazer o inculo de colnias de crescimento de 18 a 24 horas; Mod IV - 45
Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estril ou gua destilada estril e a fita de Raio X, sem inculo.
INTERPRETAO
Positivo: emulso de gelatina (cor verde) na poro submersa do filme torna-se transparente (clara). Negativo: fita permanece verde, emulso esverdeada permanece na poro submersa do filme.
CONSERVAO E VALIDADE
Fitas: seguir instrues do fabricante.
RECOMENDAES
Utilizar filme de Raio X no revelado. PARA PROVA DE LECITINASE
PRINCPIO
Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inculo.
UTILIDADE
Diferenciao de espcies de Bacillus e Clostridium.
FRMULA / PRODUTO
Frmula - meio base: Gema de ovo de galinha Proteose de peptona n 2 Fosfato dissdico Fosfato de potssio Cloreto de sdio Sulfato de magnsio Glicose Soluo de hemina (5 mg/ ml) gar gua destilada pH: 7,6 Soluo de gema de ovo 50%: Gema de ovo Soluo fisiolgica estril 1 ml 1 ml depende do volume de meio base ser utilizado 40 g 5g 1g 2g 0,1 g 2g 1 ml 20 g 1000 ml
PROCEDIMENTOS
Meio base: Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a soluo de gema de ovo; Aquecer em bico de Bunsen at fundir o gar; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave. Meio para uso: Resfriar a 50C e adicionar 1 ml da soluo de gema de ovo a 50%; Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124. Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689. Mod IV - 46
CONSERVAO E VALIDADE
Meio base (para estoque): 4 a 8C fechado, durante 6 meses. Meio para uso: 4 a 8C, embalado, durante 1 semana.
INOCULAO
Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso sobre a superfcie do meio. Incubar 37C 24 horas em aerobiose - para cepas de Bacillus spp.; Incubar 37C 48 horas em anaerobiose - para cepas de Clostridium spp.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo. Positivo: formao de halo branco ao redor das colnias. Negativo: ausncia de halo, meio fica inalterado.
RECOMENDAES
No usar ovos velhos. No usar meio vencido. PARA PROVA DE OXIDASE
PRINCPIO
O teste de oxidase baseado na produo intracelular da enzima oxidase pela bactria.
UTILIDADE
Ajuda caracterizar espcies de Neisseria, distingui no fermentadores (oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactrias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
FRMULA / PRODUTO
Reativo para teste de oxidade preparado no laboratrio: N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato gua destilada
1g 100 ml
Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso). Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro.
PROCEDIMENTOS
Reativo para teste de oxidase: Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Becker e adicionar 100 ml gua destilada, vagarosamente para no oxidar a soluo; Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Becker com o reativo; Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou; Colocar o papel na estufa a 35 1C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Becker para juntar o excesso de reativo; Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro. Obs: No utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor roxa). Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alterao da cor). Mod IV - 47
INOCULAO
Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a ser testada sobre a fita de oxidase. Observar se h formao de cor roxa de imediato.
INTERPRETAO
Cor original: branca ou levemente azulada Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria. Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao da bactria. No considerar alterao de cor tardia.
CONSERVAO E VALIDADE
Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8C. Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas.
RECOMENDAES
No fazer o teste de colnias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentao inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo. No fazer teste de oxidase de colnias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB). No usar ala ou agulha porque pode conter traos de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em falso positivo. Utilizar colnias de meios no seletivos tais como: gar sangue e gar chocolate. Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade. No cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traos de ferro. PARA FERMENTAO DE CARBOIDRATOS
PRINCPIO
A fermentao de carboidratos amplamente utilizada para a diferenciao de gneros e identificao de espcies bacterianas. A prova consiste em verificar a capacidade do microrganismo fermentar ou no um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas caractersticas que auxiliaram na identificao.
UTILIDADE
Identificar e separar espcies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus coagulase negativa.
FRMULA/ PRODUTO
Produto: Caldo para fermentao de carboidratos. Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros. Frmula (base): BHI caldo 22,5 g Carboidrato 10 g Indicador * 1 ml gua destilada 200 ml gua destilada 900 ml * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol Etanol a 95% 1,6 g 100 ml
Mod IV - 48
PROCEDIMENTOS
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar; Pesar o BHI em bquer, acrescentar a gua e homogeneizar bem; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Esterilizar em autoclave; Aps esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao; Distribuir 3 ml por tubo.
CONTROLE DE QUALIDADE
CARBOIDRATOS Arabinose Rafinose Sorbitol Maltose Trealose POSITIVO Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus lugdunensis NEGATIVO Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum Staphylococcus schleiferi Staphylococcus epidermidis
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo; Incubar 35C 24 horas.
INTERPRETAO
Cor original do meio: prpura Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo; Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
RECOMENDAES
Para provas negativas, incubar um perodo maior (48 horas); No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato. PARA A PROVA DE HIDRLISE
PRINCPIO
A prova de hidrlise PYR um teste enzimtico que consiste na hidrlise do substrato Lpyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrlise do substrato libera -naphtylamide, que detectada com a adio do reagente, o N,Ndimetilaminocinamaldedo, que forma uma base de Schiff, de colorao vermelha.
UTILIDADE
Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp. Identificao de algumas espcies Staphylococcus coagulase negativa. Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Teste comercial : PYR test Frmula - Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt):
Mod IV - 49
BHI caldo Neopeptona Dextrose Cloreto de sdio Fosfato dissdico Carbonato de sdio gua destilada
Para cada 100 ml de caldo base, adicionar 0,01 ml de L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide. Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldedo a 0,01%
PROCEDIMENTOS
Pesar os componentes em bquer; Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo; Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente; Distribuir 0,2 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes ATCC 19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212 . Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. Comercial: ver instrues do fabricante
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo OU; No caso de usar kits comerciais, com auxlio de uma pina flambada, colocar um disco impregnado com o substrato de PYR sobre as colnias em estudo recm isoladas; Incubar 37C por 4 horas; Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU; Retirar o disco e colocar sobre uma lmina e adicionar 1 gota do reagente PYR.
INTERPRETAO
Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (aps adicionar o reagente de PYR). Negativo: Sem alterao de cor (permanece amarela ou alaranjada).
RECOMENDAES
Para identificaes presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente so cocos Gram positivos/ catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como blis esculina) tratar de enterococo ou no; No utilizar colnias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso - negativo; No exceder o tempo de leitura. PARA CRESCIMENTO A 42 E 44C
Mod IV - 50
PRINCPIO
Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas temperaturas.
UTILIDADE
Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao). Indicador prpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 ml de lcool etlico 95%).
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Acrescentar o indicador prpura de bromotimol (1 ml de indicador em 1000 ml de meio); Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Temperatura 42C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Temperatura 44C: Acinetobacter baumannii.
INOCULAO
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia a ser testada; Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas; Incubar em banho Maria na temperatura a ser testada, 42C ou 44C.
INTERPRETAO
Cor original do meio: prpura. Positivo: presena de turvao e viragem do indicador de cor prpura para amarelo = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao e permanncia da cor prpura = ausncia de crescimento bacteriano.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
RECOMENDAES
No fazer inculo muito denso, pode resultar em falsa turvao. Importante o controle da temperatura do banho, com termmetro de mxima e mnima. PARA TESTE DE MOTILIDADE
PRINCPIO
A bactria mvel atravs do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos so mveis. A bactria pode conter um ou muitos flagelos e sua localizao varia com a espcie da bactria e as condies de cultura.
UTILIDADE
Determinar se o microrganismo o no mvel; Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol, Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactrias; Mod IV - 51
Meio motilidade em caldo utilizado para no fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dvidas).
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: Motilidade Meio comercial: SIM Meio comercial: MILI Meio comercial: MIO Meio Comercial: BHI (brain heart infusion) Meio Comercial: Triptona Soluo de Vermelho de Tetrazlio.
PROCEDIMENTOS
Meio Motilidade: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio Motilidade com adio da soluo de Vermelho de Tetrazlio: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Adicionar 0,1 ml para cada 100 ml de base de soluo de vermelho de tetrazlio 0,1% e homogeneizar bem; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Meio SIM /Meio MILI/Meio MIO Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. Caldo BHI (motilidade em caldo) Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente. Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao, at fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Meio Motilidade: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Meio SIM:
Mod IV - 52
HS + neg neg
Indol + neg +
Motilidade + neg +
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922
Meio MIO:
Microrganismo Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Motilidade + neg neg Indol + neg + Ornitina + neg +
Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Meio MILI:
Microrganismo E. coli K. pneum. P. alcalifaciens S. enteritidis S. flexneri Crescimento denso denso denso denso denso Lisina + + neg + neg Motilidade + neg + + neg Indol neg neg neg neg neg
E.coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022
Meio BHI/Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Negativo: meio sem inocular.
INOCULAO
Meio Motilidade / Meio SIM / Meio MILI / Meio MIO Com o auxlio de um fio bacteriolgico inocular uma colnia pura de 18 24 horas, no meio na posio vertical, lentamente at a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubao; Incubar a 35C por 18-24 horas. Meio Caldo BHI / Meio Caldo Triptona Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular colnia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 352C por 24 a 48 horas.
INTERPRETAO
Meio de Motilidade: Motilidade positiva: organismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio, causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inculo, em volta continua lmpido. Meio de Motilidade com Tetrazlio: Motilidade positiva: organismos mveis produzem uma nuvem cor pink e difundem-se completamente no meio. Motilidade negativa: h crescimento da bactria e produo de cor vermelho claro na linha do inculo e em volta do meio continua lmpido. Se resultado for negativo incubar a 21-25C por at 5 dias. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM: Realizar a leitura da motilidade e do H2S. Mod IV - 53
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar otubo suavemente e proceder a leitura do indol.
Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez; Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido; HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra; HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada; Indol positivo aparecer um anel vermelho; Indol negativo permanecer um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs);
Meio MILI Interpretar as reaes da motilidade e lisina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio (essa cor pode variar de intensa ou mais leve, de acordo com a reduo do indicador). Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo desenvolvimento de cor amarela.
Meio MIO Interpretar as reaes da motilidade e ornitina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio. Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo aparecimento da cor amarela.
Meio caldo BHI/ Meio Caldo Triptona Colocar uma gota do meio entre lmina e lamnula e observar ao microscpio com objetiva de 40 X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento browniano, verificando que o microrganismo se desloca em vrias direes.
Motilidade positiva: bactrias se movendo de um lado para outro. Motilidade negativa: bactria apresenta somente movimento browniano.
CONSERVAO E VALIDADE
Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8 C por at 6 meses.
RECOMENDAES
A temperatura de incubao extremamente crtica, porque muitos microrganismos so mveis a 15-25C e no mveis a 37C. Se houver suspeita que o microrganismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35C e outro a temperatura ambiente 22-25C. Uso do sal de tetrazlio no meio de motilidade desejvel, mas pode inibir certos microrganismos fastidiosos.
Mod IV - 54
Flagelo o rgo locomotor e composto de protena, essa protena pode se desnaturar com excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de motilidade pode fornecer um resultado falso negativo. Flagelo pode ser destrudo tambm sob agitao violenta do tubo de cultura da bactria, podendo produzir um resultado de motilidade fraco positivo ou falso negativo. Microrganismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais por longos perodos tendem a perdem sua motilidade. Os testes de motilidade em anerbios so difceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos. PARA PROVA DE TOLERNCIA AO NaCl 6,5%
PRINCPIO
A tolerncia ao NaCl a 6,5% uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presena do sal. Meio base utilizado o BHI caldo, que um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactrias. Este meio normalmente contm 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentrao para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.
UTILIDADE
Separa Enterococcus spp., que so NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que so NaCl 6,5% negativos. Na identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
FRMULA / PRODUTO
No h meio pronto para uso. Frmula: BHI caldo 25 g NaCl 60 g Indicador * 1 ml Glicose 1g gua destilada 1000 ml * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 ml Observao: o uso de indicador opcional.
PROCEDIMENTOS
Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um bquer; Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
Mod IV - 55
INOCULAO
Dissolver as colnias no caldo; Incubar.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo. Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com ou sem viragem do indicador. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
RECOMENDAES
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas); Verificar a quantidade de NaCl contido na frmula do meio de BHI, pois a concentrao poder ser outra, dependendo do fabricante do meio, e a concentrao final do meio de NaCl a 6,5 % poder ser superior ou inferior concentrao desejada; No carregar no inculo, pois o excesso poder ser interpretado como crescimento e dar resultados falso - positivos (para os meios utilizados sem o indicador); Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentao das clulas bacterianas formadas; Os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificao destas espcies.
Mod IV - 56
PRINCPIO
Streptococcus beta hemoltico do grupo A so sensveis a concentraes baixas de bacitracina.
UTILIDADE
Identificao presuntiva de Streptococcus beta hemoltico do grupo A (S. pyogenes).
PRODUTO
Discos de bacitracina de 0,04 unidades/ disco.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo (Sensvel): Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
CONSERVAO E VALIDADE
Manter 4C. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
partir de caldo BHI ou TSB recm turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do "swab"; Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente; Incubar 35C 18 a 24 horas.
INTERPRETAO
Positivo (Sensvel): Presena de qualquer halo ao redor do disco. Negativo (Resistente): ausncia de halo ao redor do disco.
RECOMENDAES
Streptococcus alfa hemolticos so sensveis a baixas concentraes de bacitracina. No existem dados disponveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibio. O inculo bacteriano deve ser confluente, inculo muito diludo pode permitir que os Streptococcus no pertencentes ao grupo A paream sensveis bacitracina. NOVOBIOCINA
PRINCPIO
Separa espcies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensveis ou no a Novobiocina.
UTILIDADE
Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importncia clnica; Staphylococcus saprophyticcus a nica espcie isolada em humanos como causadora de infeces urinrias.
Mod IV - 57
FRMULA / PRODUTO
Discos de Novobiocina de 5 g.
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
CONSERVAO E VALIDADE
Refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
Preparar uma suspenso do microrganismo em estudo com crescimento recente (at 24 horas) em caldo BHI, TSA ou soluo fisiolgica estril, acertando a turvao na escala 0,5 de MacFarland; Com auxlio de um "swab", semear na superfcie de uma placa de gar Mueller Hinton; Com uma pina previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na superfcie do meio e pressionar delicadamente; Incubar.
INTERPRETAO
Resistente: Ausncia de halo de inibio ou halos <= 15 mm. Sensvel: Presena de halo de inibio igual ou superior a 16 mm.
RECOMENDAES
No usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a suspenso; Se necessrio usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar 37C at turvar, acertar a turvao na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste; Cepas isoladas de outros materiais biolgicos que no urina, fazer identificao complementar com fermentao de acares para confirmar espcie. OPTOQUINA
PRINCPIO
Cloridrato de etil-hidroxicuprena (optoquina), um derivado da quinina, inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentraes muito baixas (5 g/ ml ou menores). As clulas do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido variao da tenso superficial, e produzida uma rea de inibio.
UTILIDADE
Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolticos.
FRMULA / PRODUTO
Discos de optoquina de 5 g
CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo (Sensvel): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Mod IV - 58
CONSERVAO E VALIDADE
Manter 4C. Validade: ver recomendaes do fabricante.
INOCULAO
partir de caldo BHI ou TSB recm turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do "swab"; Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente; Incubar 35C 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7 de CO2.
INTERPRETAO
Positivo (Sensvel): Disco de 6 mm: halo de inibio de 14 mm ou mais. Disco de 10 mm: halo de inibio de 16 mm ou mais. Negativo (Resistente): Disco de 6 mm: halo de inibio inferior 14 mm ou ausncia de halo. Disco de 10 mm: halo de inibio inferior 16 mm ouausncia de halo.
RECOMENDAES
A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentraes muito elevadas.
Mod IV - 59
PRINCPIO
um meio suplementado que permite o crescimento das espcies mais exigentes de Haemophilus, pois contm em sua frmula suplementos base de NAD e cistena.
UTILIDADE
Meio padronizado pelo NCCLS para realizao do teste de sensibilidade aos antimicrobianos de Haemophilus influenzae.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial HTM Suplemento VX: NAD (Coenzima I) e cistena.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante em um balo de fundo chato; Esterilizar em autoclave; Resfriar o meio a 50C e adicionar o suplemento previamente reidratado; Distribuir 50 a 60 ml em placas estreis de 150 mm (o meio deve ficar com uma espessura homognea de 3 a 4 mm); Deixar esfriar temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspenso de Haemophilus influenzae ATCC 10211 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa; Incubar a placa 35 2C por 24 horas em estufa com 5% de CO. Se a bactria crescer em 24 horas, liberar o lote para uso. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: castanho escuro. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros padronizados pelo NCCLS, que determina cada organismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
Mod IV - 60
PRINCPIO
gar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condies de crescimento das principais bactrias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realizao do teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos de difuso em disco e E-test para enterobactrias, no fermentadores, Staphylococcus, Enterococcus sp.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Muller Hinton.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH (7,2 7,4); Retirar da autoclave e medir novamente o pH; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;. Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira (4 a 8C). Obs: extremamente importante que o meio tenha espessura homognea de 3 a 4 mm.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa. Incubar a placa 35C por 24 horas. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina, de clcio e magnsio s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: amarelo palha. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros padronizados pelo NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
RECOMENDAES
Principais variveis que podem interferir no resultado do antibiograma:
Mod IV - 61
Nveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentraes levam a diminuio na atividade de aminoglicosdeos diante de Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes diminudas levam a resultados contrrios. Concentrao de timidina ou timina: concentraes em excesso levam falsa resistncia para sulfonamidas e trimetropima. pH: em pH baixo vamos observar halos de inibio reduzidos para aminoglicosdeos, quinolonas, macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores. Espessura do meio: < de 3 mm leva falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva falsa resistncia. GAR MUELLER HINTON SANGUE
PRINCPIO
gar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condies de crescimento das principais bactrias.
UTILIDADE
Meio utilizado para a realizao do teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos de difuso em disco e E-test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos beta-hemolticos dos grupos A,B,C e G conforme instrues do NCCLS.
FRMULA / PRODUTO
Meio comercial: gar Muller Hinton. Sangue de carneiro desfibrinado.
PROCEDIMENTOS
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Acertar o pH (7,2 7,4); Retirar da autoclave e resfriar a 50C; Adicionar 50 ml de sangue de carneiro desfibrinado por litro de meio de cultura de forma assptica; Homogeneizar bem sem formar espuma; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm; Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C. Obs: extremamente importante que o meio tenha espessura homognea de 3 a 4 mm.
CONTROLE DE QUALIDADE
Crescimento: Preparar uma suspenso de Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1 ml em 9,9 ml de soluo fisiolgica); Semear 0,01 ml da suspenso na placa; Incubar a placa 35C por 20 a 24 horas com 5% de CO. Se a bactria crescer em 24 horas, o lote est pronto para uso. Obs: A aprovao final do meio deve ser feita aps os testes com antibiticos, uma vez que inmeras variveis como nveis de timina, timidina, de clcio e magnsio s podem ser verificadas aps o teste com os antibiticos ter sido realizado.
INOCULAO
Preparar uma suspenso da bactria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac Farland; Embeber o swab na suspenso, comprim-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e semear na placa;
Mod IV - 62
Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instrues do NCCLS para a bactria a ser testada.
INTERPRETAO
Cor original do meio: vermelho. A zona do dimetro particular para cada droga e organismo, sendo comparado com dimetros do NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensvel, intermedirio ou resistente.
CONSERVAO E VALIDADE
Conservar de 4 a 8C por at 3 meses.
RECOMENDAES
Principais variveis que podem interferir no resultado do antibiograma: Nveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentraes levam a diminuio na atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes diminudas levam a resultados contrrios. Concentrao de timidina ou timina: concentraes em excesso levam falsa resistncia para sulfonamidas e trimetropima. pH: em pH baixo vamos observar halos de inibio reduzidos para quinolonas, macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores. Espessura do meio: < de 3 mm leva falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva falsa resistncia.
Mod IV - 63
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Balows A., Hausler, W.J. Jr., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991. Becton Dickinson and Company. Manual of BBL products and laboratory procedures. 6th. Ed., United States of America, 1988. Becton Dickinson and Company. Product catalog for microbiology 1996/ 1997, Canada, 1997. Becton Dickinson and Company. DIFCO manual. 10th. Ed. Detroit, 1984. Konemen, E.W. Trad. Cury, A.E. Diagnstico microbiolgico: texto e atlas colorido. 5a. Ed., MEDSI, Rio de Janeiro, 2001. Larone, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identification. 3rd. Ed., Washington, American Society for Microbiology, 1994. Mc Faddin, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Ed. William & Wilkins Co., Baltimore, 1980. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, 1990. Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade, Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de bacteriologia da tuberculose. 2a. Ed., Rio de Janeiro, 1994.
10. Murray, P.R., Baron, J.E., Pfaller, A.M., Tenover, C.F. and Yolken, H.R. Manual of clinical microbiology. American Society for Microbiology, 7th ed., Washington. DC, 1999. 11. Oplustil, C.P., Zoccoli, C.M., Tobouti, N.R., e Sinto, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica, Sarvier, So Paulo, 2000. 12. Oxoid. Manual Oxoid. Espan, Unipath Espaa, 1995.
Mod IV - 64
Mdulo V
NDICE
Estafilococos, estreptococos, enterococos e outros cocos gram positivos ........................................ 1 Introduo..............................................................................................................................................1 Identificao preliminar ............................................................................................................................1 Identificao de estafilococos ....................................................................................................................3 Identificao dos staphylococcus aureus.....................................................................................................4 Identificao dos estreptococos .................................................................................................................5 2. Neisserias......................................................................................................................................... 9 Introduo..............................................................................................................................................9 Isolamento ........................................................................................................................................... 10 Transporte e semeadura do material........................................................................................................ 11 Bacterioscopia e identificao.................................................................................................................. 11 3. Enterobactrias .............................................................................................................................. 14 introduo ............................................................................................................................................ 14 tipos de testes utilizados para identificao............................................................................................... 15 etapas da identificao de enterobactrias................................................................................................ 18 identificao das enterobactrias de importncia clnica ............................................................................. 19 identificao sorolgica .......................................................................................................................... 27 4. Bastonetes no fermentadores....................................................................................................... 31 Introduo............................................................................................................................................ 31 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao ................................................................... 31 Procedimentos para a identificao .......................................................................................................... 33 5. Bacilos curvos ou espiralados......................................................................................................... 41 Introduo............................................................................................................................................ 41 Campylobacter ...................................................................................................................................... 42 Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas........................................................................................................... 43 6. Bacilos gram positivos.................................................................................................................... 45 Introduo............................................................................................................................................ 45 Corineformes ........................................................................................................................................ 46 Bacilos gram positivo ............................................................................................................................. 50 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos............................................................................... 52 Actinomicetos ....................................................................................................................................... 54 7. Fastidiosos ..................................................................................................................................... 56 Introduo............................................................................................................................................ 56 Bartonella............................................................................................................................................. 58 Bordetella............................................................................................................................................. 59 Brucella................................................................................................................................................ 60 Francisella tularensis.............................................................................................................................. 61 Haemophylus ........................................................................................................................................ 62 Legionella ............................................................................................................................................. 64 Pasteurella ........................................................................................................................................... 65 Actinobacillus ........................................................................................................................................ 66 Capnocytophaga.................................................................................................................................... 68 Eikenella .............................................................................................................................................. 68 Kingella................................................................................................................................................ 68 Cardiobacterium hominis ........................................................................................................................ 69 Chromobacterium violaceum................................................................................................................... 69 Streptobacillus moniliformis .................................................................................................................... 70 8. Bactrias anaerbias estritas ......................................................................................................... 71 Introduo............................................................................................................................................ 71 Coleta de material ................................................................................................................................. 73 Transporte do material........................................................................................................................... 73 Processamento do material ..................................................................................................................... 73 Identificao bacteriana ......................................................................................................................... 74 Provas de sensibilidade a antimicrobianos................................................................................................. 77 9. Interpretao de Resultados e laudos ............................................................................................ 78 Introduo............................................................................................................................................ 78 Laudo para o trato respiratrio superior ................................................................................................... 79 Laudo para escarro ................................................................................................................................ 81 Laudo para secreo endotraqueal, lavado traqueal, e lavado brnquico ...................................................... 81 Laudo para lavado brocoalveolar ou escovado brnquico ............................................................................ 82 Laudo para pleural................................................................................................................................. 84 Laudo para abscesso pulmonar ............................................................................................................... 84 Laudo para ocular.................................................................................................................................. 84 Laudo para lquido cfalo raquidiano (LCR) ............................................................................................... 85 Laudo para fezes ................................................................................................................................... 85 Laudo para pele, abscessos e feridas ....................................................................................................... 86 Laudo para genital................................................................................................................................. 88 Laudo para urina ................................................................................................................................... 89 Laudo para sangue ................................................................................................................................ 92 10. Referncias Bibliogrficas .............................................................................................................. 93 1.
PROVA DA CATALASE
Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de bolhas. Para a famlia Microccocacea (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto que para a famlia Streptococcacea (estreptococos) negativa.
Mod V - 1
Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode acarretar resultados falsopositivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer Gram e ver disposio em cadeias curtas ou aos pares). Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica
Gnero Catalase Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + varivel no no no no Ttrade
+ + + + varivel + neg
PYR + neg
2
E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos S. pyogenes positivo alguns S. viridans podem ser positivos
Mod V - 2
IDENTIFICAO DE ESTAFILOCOCOS O teste mais importante na identificao da famlia Micrococcaceae a prova da catalase, e esta famlia composta de quatro gneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. O gnero Staphylococcus apresenta 32 espcies, 14 subnegespcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prtica, os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. Provas diferenciais dos generos Catalase positivos
Gnero Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + + no Ttrade
+ + + neg
Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqentes so: Staphylococcus epidermidis - causador de infeces de cateteres e prteses e o mais freqente microrganismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus - causador de infeco urinria em mulheres jovens. Staphylococcus haemolyticus - importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue de carneiro.
Mod V - 3
IDENTIFICAO DOS STAPHYLOCOCCUS AUREUS A forma mais simples de identifica o Staphylococcus aureus a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lamina.
TESTE DA DNASE
Este teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%; o meio adquire uma colorao azul intensa; Incubar a 35C por 24 horas; Uma colorao rsea caracterstica ao redor das colnias produtoras de DNAse indica a positividade da prova.
Mod V - 4
O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre as colnias esto bem isoladas.
TESTE DA ENDONUCLEASE
Teste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA. Fever o caldo de cultura com a bactria suspeita por 15 minutos; Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colnia suspeita; Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante; A leitura do teste semelhante ao da DNAse. Note que este mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o crescimento de cocos Gram positivos agrupados.
TESTE DA BACITRACINA
importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue sem tenso de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; Incubar por uma noite a 35C sem CO2; Observar qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.
Mod V - 5
Linhas verticais cepas teste Linha horizontal estria com cepa beta hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
TESTE DO PYR
Este teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias puras para o teste, pois podem surgir resultados errneos. Seguir as instrues do fabricante, uma vez que se encontra disponvel comercialmente. Esse teste tecnicamente, equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, tendo a vantagem de ser mais rpido. Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realizao de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.
Mod V - 6
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos so positivos. Identificao de estreptococos beta hemolticos
Identificao Sensibilidade a Bacitracina CAMP /Hidrlise de hipurato Sensibilidade a SXT Bile Esculina e Tolerncia a NaCl 6,5% negativos
S. pyogenes
sensvel
negativo
negativo
S. agalactiae
resistente
positivo
negativo
negativos
Enterococcus sp Estreptococo No A, B ou D.
resistente resistente
negativo negativo
negativo positivo
positivos negativos
Mod V - 7
TESTE DA OPTOQUINA
Semear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada; Aplicar um disco de optoquina; Incubar a 35oC em tenso aumentada de CO2 - mtodo da vela; Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.
Caldo: Inocular gotas de desoxicolato de Sdio a 2% sobre as colnias suspeitas; Incubar a 35C por 30 minutos; As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana. Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus destes microrganismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue. Semear o repique em gar sangue; Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus influenzae; Incubar a 35C em atmosfera com CO2. Identificao dos enterococos mais importantes clinicamente
Espcie Arabinos Sorbitol Crescimento Telurito 0,04% positivo negativo negativo negativo Motilidade Pigmento Vancomicina
Mod V - 8
2. NEISSERIAS
INTRODUO As espcies de Neisseria tem como caracterstica morfolgica serem diplococos Gram negativos mais achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois gros de feijo unidos por uma ponte. Apenas a espcie N. elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. Todas neisserias so oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e no fermentativa, sendo baixa a acidez, de modo que podem acontecer reaes duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase Agar) com indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. As diferentes espcies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp e Alcaligenes spp. pelas caractersticas morfolgicas de serem cocos ou cocides ao Gram e pela possibilidade de haver confuso na sua identificao. Quanto a sua importncia clnica, a maioria das neisserias comensal vivendo em mucosas de humanos e animais. Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gram negativo
Bactria Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp. Moraxella catharralis Kingella spp. Moraxella spp. Acinetobacter spp. Alcaligenes faecalis Morfol. diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo cocobacilo cocobacilo cocobacilo Cocobacilo / bacilo OXI + + + + + + neg + CAT + + varivel + neg + + + OF Gli no cresce no cresce varivel (oxidativo) inerte fermentador inerte varivel (oxidativo) inerte CTA Gli + + varivel neg + neg varivel neg DNAse neg neg neg + neg neg neg neg AS + neg + + + + + + MOT neg neg neg neg varivel neg neg +
OXI = oxidase CAT=catalase OFGli=OF Glicose CTAGli= utilizao da glicose em base gar cistina tripticase AS = cescimento em gar Sangue MOT = motilidade
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Mod V - 9
Potencial patgeno de vias areas, principalmente em crianas e adultos jovens. Causa com maior freqencia otite, sinusite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite e meningite. Em idosos, aps o Haemophylus influenzae e o Pneumococo, constitui a terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. Em adultos raramente isolada em pacientes assintomticos. Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase, e so detectadas atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Outras espcies de Neisseria raramente so isoladas em casos de endocardite
ISOLAMENTO
NEISSERIA GONORRHOEAE
Material clnico para isolamento (escolha depende dos sintomas): Uretral Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas) Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo tipo Thayer Martin) Orofaringe Conjuntiva Recomenda-se: Utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron. Semear o mais rpido possvel nos meios slidos, e usar placas aquecidas prviamente em estufa. Urina pode ser utilizada, aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento. Em meio seletivo, deve-se, no entanto, preferir outros materiais com maior chance de isolamento. Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS que inibidor para as N. Gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina). Em leses de pele preferir a bipsia que o swab. Incubar em jarra com umidade e vela. Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram. Glndula de Bartholin Trompas Endomtrio Lquido sinovial Leses de pele Sangue
NEISSERIA MENINGITIDIS
Materiais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos: LCR Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante) Aspirado de petquias Sufuses hemorrgicas ou bipsias Liqudo sinovial Swab de conjuntiva Aspirado traqueal, ou transtraqueal ou escarro Swab de nasofaringe (prefervel a swab de orofaringe)
Mod V - 10
TRANSPORTE E SEMEADURA DO MATERIAL O ideal semear imediatamente aps a coleta em meio slido, levar para a estufa 36oC em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerada uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte so adequados.
NEISSERIA GONORRHOEAE
sensvel a variaes de temperatura acima de 37oC ou abaixo de 35oC, de modo que a amostra no pode ser refrigerada. Recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento com l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar), embora seja possvel obter crescimento de algumas cepas em gar sangue. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Secreo retal, swab de orofaringe, ou outros materiais com maior microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).
NEISSERIA MENINGITIDIS
um pouco mais tolerante a variaes de temperatura, mas recomenda-se para transporte ambientes com CO2. Cresce bem em gar sangue, mas por precauo, deve-se semear tambm em gar chocolate. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Materiais com maior flora contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC). Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a maioria das outras espcies de Neisserias (7,5 g/ml de colistina), Gram positivos (Vancomicina 3 g/ml) e fungos (13,5 g/ml de nistatina); e contm suplementos para suportar crescimento das Neisserias meningitidis e N. gonorrhoeae.
MORAXELLA CATHARRALIS
Tolera temperatura ambiente e cresce bem em gar sangue. Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe). Pode usar meio no seletivo BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO A partir das amostras genitais, LCR, bipsia, etc., deve-se sempre reservar material para a bacterioscopia, fazendo o esfregao no momento da coleta, ou colhendo dois swabs, ou material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. Quando o swab nico, no caso das Neisserias d-se preferncia semeadura imediata e posteriormente: Ressuspender o swab em 1 ml de salina; Agitar no Vortex; Centrifugar; Fazer um esfregao do sedimento.
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de diplococos Gram negativos com caractersticas de neisserias em: raros (+) poucos (++) moderados (+++) muitos (++++)
importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual fundamental o isolamento e identificao completa, considerando que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp. podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae.
IDENTIFICAO
As N. gonorrhoeae crescem em gar chocolate formando colnias pequenas, sendo em geral menores que as de neisserias saprfitas. A cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia da M. catarrhalis de cor cinza rseo-acinzentado, sendo comumente frivel, saindo inteira quando removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis A e C capsuladas apresentam mucides. Testes imunolgicos no substituem a cultura e a bacterioscopia, e para o diagnstico da gonorria existem no comrcio recursos do tipo ELISA, sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, de elevado custo e indicado em levantamentos epidemiolgicos, ou quando no se dispe dos recursos tradicionais. Para LCR e outros fludos estreis e mesmo urina, a caracterizao de Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex que rpida, com boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser positivo nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo elevado. Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura.
BACTERIOLOGIA
A identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser feita em dois nveis: presuntivo e confirmatrio. Em servios de Sade Pblica (DST) onde a prevalncia da gonorria significativa, para fins prticos de tratamento pode-se fazer o diagnstico utilizando-se aspectos clnicos associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram negativos intra-celulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmao e monitoramento da resistncia destas bactrias. Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento, tambm pode basear-se na clnica e na bacterioscopia do LCR ou de leses (petquias e prpuras). As culturas devem sempre ser colhidas para confirmao, identificao de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos atravs dos seguintes procedimentos: Fazer bacterioscopia das colonias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram negativos com forma de dois feijes. Fazer o teste de oxidase das colonias sugestivas. Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e Moraxella spp. que so morfologicamente parecidos. Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter spp. e Kingella spp. como Neisserias : Semear o agente suspeito em gar chocolate. Colocar um disco de penicilina de 10 ui. Aps 24h fazer um gram das colnias que crescerem prximas a zona de inibio. Se permanecerem cocides com aspecto de neisserias confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no de Neisseria.
Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (gar chocolate suplementado). A identificao das espcies de neisseria baseia-se na utilizao de acares: glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carboidratos por via oxidativa, a base gar Cistina Tripticase (CTA) adicionada de 1% de cada um dos aucares e com indicador vermelho de fenol tem sido utilizado. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer, por falha na deteco da acidez produzida pela bacteria, dificultando a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de Referncia para confirmao.
Mod V - 12
DNAse
GLI
MAL
LAC
SAC
FRU
neg neg + + v
+ + varivel neg +
Mod V - 13
3. ENTEROBACTRIAS
INTRODUO a maior e mais heterognea famlia de bactrias Gram negativas de importncia mdica. So considerados atualmente: 27 gneros / 102 espcies / 08 grupos indefinidos. Independente da complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clnicos so colocadas em 25 espcies, sendo possivel o isolamento de enterobactrias de qualquer amostra clnica.
IMPORTNCIA CLNICA
A maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na gua, solo e vegetais. Alguns tambm so considerados enteropatgenos por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e vrios sorotipos de Escherichia coli, embora possam tambm causar infeco em outros locais. As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica So responsveis por de cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias.
Nas infeces da comunidade: Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.
Mod V - 14
Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica 1. Fermentao da glicose 2. Fermentao da lactose 3. Motilidade 4. Utilizao de citrato 5. Descarboxilao da lisina 6. Produo de sulfeto de hidrognio (H2S) 7. 8. 9. Produo de gs (CO2) Oxidase Produo de indol
10. Produo de urease 11. Produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase 12. Produo de gelatinase ou opo DNAse
Provas complementares de Identificao Fermentao de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. Utilizao de aminocidos: arginina e ornitina Hidrlise da esculina, etc. ONPG Utilizao de acetato Provas teis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer, crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase. Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, baseado em alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc. TIPOS DE TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAO Podem ser utilizados testes preparados no laboratrio, desde que submetidos a controle de qualidade. Adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits acompanhados dos respectivos esquemas de identificao. Mtodos automatizados em geral utilizam estas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao de gneros e espcies no comuns. Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao. Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90%, podem ser perfeitamente identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas.
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Vantagens e limitaes O meio IAL tem a vantagem de ser prtico para inoculao e de baixo custo. Sua desvantagem a dificuldade de interpretao de tantas provas, exigindo muita experincia prvia com o meio. Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrios. Para caracterizar corretamente as espcies de Enterobacter, gnero Serratia, gnero e espcies de Pseudomonas h necessidade de realizar provas complementares. Pelas limitaes do poder discriminatrio de gneros e espcies de enterobactrias no se recomenda este meio, como nica opo, na identificao de bactrias envolvidas em infeces hospitalares. Uma alternativa seria utilizar os resultados obtidos do meio IAL como triagem e adicionar os testes complementares, como Citrato e a fermentao da lactose verificada no crescimento em gar Mac Conkey. Variantes do meio IAL Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da glicose, gs, H2S, uria MIO (Motilidade Indol Ornitina) lisina citrato rhamnose
Tubo EPM
Tubo MILI
Citrato
Mod V - 16
=
=
= =
Amarelo Vermelho
Vermelho Amarelo
neg neg
neg varivel
Amarelo Amarelo
Amarelo Amarelo
neg +
varivel varivel
Obs. A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente, pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)
Mod V - 17
Nvel de complexidade 1
citrato,
lactose
(Mac
Conkey),
Nvel de complexidade 2
Mod V - 18
Fenilalanina
CONSIDERAES
Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio; para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral. PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo; apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal #). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia)= 92%. PB baixo significa ter outro padro mais frequente. Os padres bioqumicos pouco freqentes tero menor probabilidade de isolamento. No aplicado quando se considera gnero, pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp.). Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (neg) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positiva. V = valores >20% e <80% de reaes positivas ou negativas; estas provas podem ser teis para diferenciar duas espcies ou dois gneros quando a reao s ocorre para uma delas. Ex.: uria em relao a E. coli e Citrobacter. E. coli negativa e Citrobacter varivel. Se a reao encontrada for positiva, exclui-se E. coli. Pela importncia clnica e epidemiolgica, padres no comuns de Yersinia e Salmonella spp. foram considerados, pois na prtica a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falsonegativo. As provas destacadas com fundo cinza tm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na diferenciao bacteriana. Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nvel 1 que, para a maioria das bactrias da rotina, permite uma caracterizao adequada. Quando houver necessidade usar as de nvel 2.
Mod V - 19
varivel
neg
neg
52%
Mod V - 20
Lisina + neg +
Gs + + varivel
PB# 97%
- oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio) Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa - Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva
Urease neg
Citrato neg
Lisina neg
Gs neg
Lactose neg
Comentrio sorotipagem
PB# 50%
+ 75%+ neg
+ neg varivel
+ neg neg
+ neg neg
+ neg varivel
1 - cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato varivel, lisina varivel), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis 2 - motilidade positiva temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-solido e positiva em caldo
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e gelatinase negativas
Bactrias Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Salmonellla typhi Lisina + neg + Urease neg v neg Lactose + + neg Gs ++ ++ neg Sorotipagem neg neg + PB# 95% 95% 12%
Mod V - 21
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e gelatinase positivas, Serratia spp.
Bactrias Lisina Urease Lactose Gs Pigmento vermelho varivel neg varivel PB#
+ + 55% +
- raramente isolada
Ornitina +
PB# 94%
Proteus penneri
neg
30%
Citrato neg +
Mod V - 22
44%+
78%+
neg
neg
89%+
89%+
neg
Sorotip. + + NI invasora
2
Citrato neg +
1
16%
- C. koseri = malonato positivo C. amalonaticus = malonato negativo - motilidade negativa a 35oC e positiva temperatura ambiente
Mod V - 23
3 4
- oxidase positiva: Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides Dnase negativa - Aeromonas caviae lisina negativa e lactose positiva
Urease neg
Citrato neg
Lisina neg
Gs neg
Lactose neg
Comentrio Sorotipagem +
PB# >50%
+ neg v
2
Colnia Mucide Mucide 11% motil. neg Sorotipagem + 15% motil. neg
100%
75%+ neg
1 - cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato v, lisina v), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis 2 - motilidade + temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-slido e positiva em caldo)
PB# 76%
25%
- H2S pode ser positivo no TSI com 48h - motilidade negativa 35oC e positiva a 25oC
H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa, Citrato positivo, DNAse e gelatina negativas
Bactrias C. freundii E. aerogenes E. cloacae E. agglomerans E. gergoviae E. sakazakii Uria 44%+ 2%+ 65%+ 20%+ 93%+ 1%+ Fenil. 0 0 0 20%+ 0 50%+ Lisina 0 98%+ 0 0 90%+ 0 Argin. 67%+ 0 97%+ 0 0 99%+ Ornit. 0 98%+ 96%+ 0 100%+ 91%+ Malon. 11%+ 95%+ 75%+ 65%+ 96%+ 18%+ Gs 89%+ 100%+ 100%+ 20%+ 98%+ 98%+ Lactose 78%+ 95%+ 93%+ 40%+ 55%+ 99%+ Escul. 0 98%+ 30%+ 60%+ 97%+ 100%+
Mod V - 24
Esculina 30% + +
H2S negativo, FA negativa, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, Dnase e Gelatina positivas
Bactrias Serratia marcescens S. marcescens biog
1
Motibilidade + neg + +
Mod V - 25
Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica
45 50 25 0 0 0 99 0 0 95 2 98 0 99 98 99 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 50
0 0 0 0 10 98 95 30 0 0 65 15 0 95 93 98 95 0 25 0 0 0 90 98 30 90 95 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 98 95 30 0 0 0 95 97 50 10 100 90 100 0 0 0 0 0
0 0 0 0 4 95 90 10 0 95 98 95 100 98 30 0 1 0 0 0 0 0 0 15 0 3 2 75
0 0 0 0 0 0 1 0 0 95 98 99 99 98 95 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 100 98 99 40 0 v 0 0 0 0 0 0 98 98 95 0 90 100 99 99 55 95 55 0
2 5 18 2 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 70 3 55 15 10 10 70 0 4 0 0 0
0 0 2 98 98 0 0 3 0 95 99 0 0 0 0 0 97 0 100 95 1 95 99 99 65 95 0 95
0 0 0 0 85 0 0 0 0 v 95 95 85 94 85 96 95 97 95 95 0 0 99 97 17 95 85 2
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Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 91 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 90 30 90 90 0
96 18 0 0 0 0 0 0 50 93 98 3 95 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V 3 0 2 94 0
98 98 95 5 0 3 0 0 98 97 97 50 0 90 96 85 45 10 0 85 96 0 95 99 0 90 100 55 0 75 30 5
55 99 95 25 0 1 1 2 5 98 100 30 0 1 2 2 1 5 2 0 1 1 0 0 0 0 V 2 4 10 100 5
97 100 35 5 0 0 0 0 7 99 100 80 30 0 0 50 0 35 0 0 5 0 0 0 0 0 0 ou 15 95 96 97 94 25
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 80 40 0 10 0 2 0 0 0 10 0 1 98 82 85 99 5
IDENTIFICAO SOROLGICA Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas bioquimicamente homogneas e, sorologicamente relacionadas, que constituem os gneros e, segundo alguns critrios, podem se dividir em espcies. As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos: somtico (O), flagelar (H) e de envoltrio ou Mod V - 27
cpsula (K). Desse modo, os sorotipos so divises baseadas no relacionamento antignico, enquanto os biotipos so amostras do mesmo sorotipo que diferem em caractersticas bioqumicas. Em atividades de rotina de Bacteriologia Clnica, a identificao ou confirmao sorolgica feita apenas com germes comprovadamente patognicos e de importncia epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli Yersina enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas simplificados, atravs do seguinte procedimento tcnico: Preparar uma suspenso bastante densa (aspecto leitoso), da bactria a ser testada, utilizando soluo salina a 0,85%. A massa bacteriana proveniente do gar TSI usado na identificao bioqumica ou, de preferncia, em gar nutriente inclinado aps repique para obteno de massa de germes.
Colocar a salina sobre o crescimento bacteriano ocorrido na superfcie inclinada do meio; Agitar o tubo aps alguns minutos de modo a obter a suspenso bacteriana; Bactrias em fase rugosa tendem a se auto-aglutinar, e no devem ser utilizadas na classificao sorolgica.
Sobre uma lmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspenso bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante homognea continuando o movimento durante um ou no mximo dois minutos. O aparecimento de aglutinao, nesse intervalo de tempo, indica positividade da reao. Algumas vezes, necessrio o aquecimento da suspenso bacteriana em banho-maria fervente, durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais externas da clula que tm ao interferente na reao. Aps o resfriamento da suspenso, repetir o teste. Caso ocorra a aglutinao, confirmar a prova.
IDENTIFICAO DE SALMONELLA
No gnero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que no so mais considerados como espcies, e sua identificao sorolgica completa e detalhada uma tarefa restrita aos denominados Laboratrios de Referncia. Para identificao rotineira no laboratrio clnico utilizam-se basicamente trs antisoros: a) Anti-Salmonella polivalente somtico (Grupos A,B,C,D,E) b) Anti-Salmonella somtico, Grupo D (S. typhi) c) Anti-Salmonella, anti Vi Quando o denominado antgeno de virulncia (Vi) est presente, poder bloquear a aglutinao do antgeno somtico do grupo D (Salmonella typhi). Desse modo, a suspenso dever ser aquecida em banho-maria fervente e testada novamente com os trs anti-soros citados, dando o resultado abaixo no caso de Salmonella typhi. A partir de uma reao positiva feita apenas com o antgeno somtico polivalente, existe condio de confirmar a amostra como sendo do gnero Salmonella, sem especificar o sorotipo ou sorovar. Antisoros Anti-soro poli somtico Grupo D somtico Anti Vi Antgeno vivo + neg + Antgeno aquecido + + neg
Aps a identificao bioqumica e aglutinao com soro polivalente, as amostras podero ser testadas com os soros A,B,C,D,E monovalentes. A bactria pertencer ao sorogrupo em cujo soro houver aglutinao. Se a reao for negativa deve-se aquecer a metade da suspenso em banho-maria fervente e repetir o teste. A metade no aquecida dever ser utilizada para determinao de antgenos flagelares. A identificao at sorotipos poder ser feita com auxlio dos soros flagelares (a,b,c,d,i,1,2,5), e atravs de sua utilizao possvel identificar as seguintes amostras:
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Grupo Sorolgico Grupo O2 (A) Grupo O4 (B) Grupo O7 (C1) Grupo O5 (D1)
Espcie Bacteriana Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B e S. typhimurium Salmonella paratyphi C e S. cholerae suis Salmonella typhi
IDENTIFICAO DE SHIGELLA
O gnero Shigella est constitudo de apenas quatro sorogrupos, que so identificados sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilizao de anti-soros polivalentes. Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de Shiga), por ser o mais patognico. Grupo Sorolgico Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Espcie Bacteriana Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Sorotipos 13 sorotipos 06 sorotipos 18 sorotipos 01 sorotipo
As culturas suspeitas devero ser testadas primeiramente com os soros contra Shigella flexneri e Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras de Shigella isoladas em nosso meio. Caso no haja aglutinao, prosseguir com os outros soros. No ocorrendo aglutinao, possvel que a cultura seja rica em antgenos de superfcie que geralmente impedem o contato do soro com o antgeno somtico O. Estes antgenos devem ser destrudos pelo aquecimento da suspenso bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente, procedimento que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gnero.
A sorotipificao pode ser feita, utilizando-se a mesma tcnica descrita para outras enterobactrias. Um melhor resultado obtido, repicando cerca de cinco colnias caractersticas a partir do gar BEM ou Mac Conkey, para um tubo contendo gar Nutriente Inclinado, com finalidade de obter massa de
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germes. feita ento uma suspenso bacteriana em soluo salina, a qual ser testada utilizando anti-soros polivalentes, abrangendo os sorotipos mais prevalentes na populao. Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC) Polivalente A Polivalente B anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152 anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167
Observaes importantes: Bactrias isoladas com o mesmo padro de provas de materiais nobres em surtos de infeco hospitalar, ou isoladas de infeces da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela gravidade da doena, ou por um padro no esperado de resistncia, devem ser remetidas ao Laboratrio de Referncia (LACEN/Adolfo Lutz) para melhor caracterizao. Bactrias que no se enquadram nos padres definidos acima, recorrer a testes suplementares ou usar kits com maior nmero de provas ou em caso de importncia clnica (descritos acima) enviar ao Laboratrio de Referncia.
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4. BASTONETES NO FERMENTADORES
INTRODUO Os bacilos Gram negativos classificados como no fermentadores (BNFs) so microrganismos aerbios, no esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia atravs de fermentao, degradando-os pela via oxidativa. A identificao dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratrios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles no realiza este tipo de identificao, ou o faz de maneira elementar em virtude da pouca incidncia em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de identificao. A caracterizao deste grupo de bactrias de grande importncia nos casos de infeco hospitalar. Embora a sua incidncia, mesmo em hospitais, seja pequena quando comparada a outros agentes etiolgicos, geralmente eles apresentam resistncia elevada a vrios antibiticos e so capazes de causar infeces graves. Estas bactrias colonizam e causam infeces, em especial, em pacientes graves oriundos de CTI e submetidos procedimentos invasivos, sendo importante classific-los at o nvel de gnero e espcie. O nmero de bactrias no fermentadoras conhecidas muito grande. Foram selecionadas aquelas consideradas na atualidade de maior importncia clnica (*) e as demais para diagnstico diferencial entre si. BNFs de importncia clnica consideradas neste captulo*: Acinetobacter spp.* Achromobacter spp. Burkholderia cepacia * Methylobacterium spp. Pseudomonas aeruginosa * Pseudomonas luteola Pseudomanas putida Pseudomanas pseudomallei * Stenotrophomonas spp.* Sphingobacterium spp. Alcaligenes spp.* Bordetella bronchyseptica Chryseobacterium (Flavobacterium) spp.* Moraxella spp.* Pseudomanas fluorescens Pseudomanas oryzihabitans Pseudomonas stutzeri Roseomonas spp. Shewanella spp. Sphingomonas paucimobilis
Testes necessrios para a identificao de rotina dos BNFs Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo de OFglicose (com vaselina) de OFglicose (sem vaselina) com lisina controle de aminocidos gar citrato gar uria com gar esculina com TSI com gelatina com caldo NaCl 6,5% Disco de oxidase Disco de PYR Tubo com arginina Caldo TSB para motilidade em lmina Caldo TSB crescimento 42oc Tubo de caldo indol Disco de polimixina Placa de Mac Conkey Placa de DNAse
SEMEADURA, LEITURA E INTERPRETAO DAS PROVAS DE IDENTIFICAO A partir de colnias isoladas em cultura pura com 24 horas de crescimento, nos meios de inoculao primria, deve-se proceder a realizao das tcnicas de identificao e diferenciao dos BNFs:
PROVAS
Disco de oxidase
SEMEADURAS
- Retirar 2-3 colnias com ala. - Esfregar sobre a fita ou disco teste; pode umedecer o papel com 1 gota de salina estril.
LEITURA E INTERPRETAO
- A leitura feita em 15 a 20 segundos. - A cor violeta forte aparece rapidamente. Aps este intervalo, cores violeta-plido so falso positivos. A Burkholderia cepacia pode dar reao fraca.
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- Fermentador: dois tubos ficam amarelos (cido) - Oxidativo: tubo sem vaselina amarelo tubo com vaselina verde - Inerte ou alcalino: dois tubos no mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino). Aguardar, no mnimo, 72h para definir como inerte, pois pode ocorre a oxidao tardia ou lenta. - Incubar 30oC, se negativo, aguardar no mnimo 72h. Se positivo, ocorre precipitado cinza no fundo do tubo. - Adicionar cido clordrico e aguardar 5 minutos. - Observar a presena de halo transparente em volta do inoculo positivo enquanto o restante do meio fica leitoso. - Se negativo, repetir o teste com leitura em 72h. - Comparar os tubos testes dos aminocidos com o controle negativo. - tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado plido e as provas positivas ficam de cor prpura. - Se negativo, aguardar at 5 dias. - A cor rosa forte aparece em todo o meio aps 24 a 72 h de incubao; uma ligeira mudana de cor rsea no pice, que no progride com maior tempo de incubao, considerado negativo. - Bordetella bronchiseptica: reao positiva em 4 h. - A cor azul forte aparece no pico, e com maior incubao estende-se a todo o meio. - Ocorre turbidez no meio ou ntido o aumento da densidade bacteriana. - Ideal comparar com controle mantido a temperatura ambiente. - Agitar o tubo e com uma pipeta com ponteira estril ou ala bacteriolgica estril. - retirar uma gota e depositar sobre uma lmina. - Cobrir a gota com uma lamnula e levar ao microscpio. Observar com aumento de 400 vezes (ocular 10x e objetiva 40). - A presena de bactrias cruzando o campo em diferentes direes significativo de motilidade positiva; movimentos vibratrios fracos = negativo (movimento browniano). Quando o movimento de todas as bactrias numa mesma direo, provavelmente o movimento do lquido entre a lmina e a lamnula. - Verificar a motilidade em temperaturas de 37oC e 20oC (ambiente). - A presena de turbidez e mudana de cor indicam crescimento - Ocorre precipitado negro intenso nas provas positivas a partir de 6 horas de incubao at 48 h - Cor castanho escuro prova negativa. - Colocar 5 gotas de xilol e agitar bem o tubo. - Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs. - Observar a presena de anel prpura-plido ou intenso que revelam prova positiva. - Qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade.
Placa de DNAse
- Usar inculo denso; pode adicionar 2 ml de vaselina lquida no tubo com lisina.
Uria
Citrato
Disco de polimixina
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Disco de PYR
- Colocar o disco sobre colnias de crescimento recente ou fazer suspenso densa. - Depositar 3 a 4 gotas sobre o disco de PYR. - Incubar durante 4 horas numa placa vazia com umidade.
- Colocar o disco teste em contato com o crescimento bacteriano. - Coloc-lo sobre uma lmina. - Depositar uma gota do reagente que acompanha o teste. - A presena de cor alaranjada prova positiva; mantendo a cor amarela prova negativa. - Recomenda-se testar controles positivo e negativo. - Crescimento deve ocorrer entre 1 a 3 dias.
- Semear com ala 1 colnia isolada. - Semear com agulha picando at o fundo do tubo e na superfcie do gar inclinado.
TSI
- Fermentador: presena de cor amarela apenas na base ou no pice e na base - Com ou sem H2S e gs: precipitado preto e bolhas. - No fermentador: permanece vermelho (alcalino) no pice e na base.
PROCEDIMENTOS PARA A IDENTIFICAO No caso de isolar uma bactria que no foi ainda comprovada como no fermentadora da glicose, seguir as seguintes etapas com a colnia isolada: Gram e Oxidase: observar se h pigmento da colnia crescida (amarelo, rseo, cor metlica).
RESULTADO DO OF
1. Bacilo (cocobacilo) Gram negativo oxidase negativo OF Glicose fermentador: Fazer a identificao com as provas realizadas, visto ser uma enterobactria. Vide captulo enterobactrias para interpretao dos resultados. OF no fermentador: motilidade negativa: Tabela 1 motilidade positiva: Tabela 3 2. Bacilo Gram negativo oxidase positiva: OF Glicose fermentador: pesquisar Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio OF Glicose no fermentador: se pigmento rosa, seguir Tabela 7 motilidade negativa e pigmento amarelo, seguir Tabela 4 motilidade positiva: se TSI com H2S segue Tabela 5a e 5b; se OF glicose Oxidativo segue Tabela 5; se OF glicose Inerte, seguir Tabela 6
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Prova opcional
Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii * hemlise em gar sangue Hemlise * neg neg + neg
Tabela 2. Cocos Gram negativo, Oxidase positivo, Motilidade negativa, OF-Gli inerte
Microrganismos Moraxella(B) catarrhalis Moraxella canis M. fenilpiruvica/ureolytica Moraxella lacunata Moraxella spp. * Urease neg neg + neg neg Gelatina neg neg neg + neg DNAse + + neg neg neg Mac Conkey neg + + neg varivel
Tabela 3. Bacilos Gram negativo, Oxidase negativa, Motilidade positiva, OF-Gli oxidativo ou inerte
Microrganismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia Arginina + neg (14+) neg neg DNAse neg neg neg + Lisina neg neg 80%+ 93%+ Polimixina * sensvel sensvel resistente resistente
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Provas opcionais
Microrganismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia * Fazer antibiograma com Imipenem Esculina + neg varivel varivel PYR + + neg neg Imipenem * sensvel sensvel varivel resistente
Tabela 4. Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos com pigmento amarelo e Crescimento em MC varivel
Microrganismos Chryseobacterium meningosepticum C. indologenes Sphingomonas paucimobilis Sphingobacterium spp. * * S. multivorum, S. spiritivorum Indol + + neg neg DNAse + neg neg varivel Polimixina resistente resistente sensvel resistente Uria neg neg neg +
Tabela 5a. Bacilos Gram negativo, Oxidase positiva, Motilidade positiva, OF GLI oxidativo vide fluxograma para facilitar interpretao
Microrganismos Polimixina Lisina Arginina NaCl 6,5% neg Gelatina 42C Caracterstica
A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri B. pseudomallei B. cepacia S. paucimobilis * Shewanella spp.
neg 82 + neg
+ 86 + neg neg varivel + 83%+ neg varivel pigm. amarelo seca pigmento
varivel
varivel
Provas complementares
Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri
1, 2
* provas da esculina e PYR teis apenas para diferenciar as bactrias lisina e arginina negativas
Mod V - 35
Tabela 5b. Bacilos Gram negativos no fermentadores, Oxidase positiva, Motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose varivel, DNAse positiva
Bactria Shewanella putrefaciens Shewanella alga Cresc. 42oC neg + NaCl 6,5% neg +
Lisina
positiva
negativa
negativa
arginina
positiva
polimixina
polimixina
B. cepacia
esculina
B. pseudomallei
crescimento a 42oC
positiva
negativa
positivo
negativo
S. paucimobilis
NaCl 6,5%
P. aeruginosa
gelatina
positivo
negativo
positiva
negativa
DNAse
P.stutzeri
P. putida
P. fluorescens
positivo
negativo
S. putrefaciens
A. Xylosoxidans
Mod V - 36
Tabela 7. Bacilos e coco-bacilos Gram negativos no fermentadores, Oxidase positiva, OF Glicose varivel, com pigmento rseo (1)
Microrganismos Motilidade Morfologia Urease Mac Conkey neg Cresc. 42oC neg Obs.
Methylobacterium spp.
bacilos
Roseomonas spp.
varivel
Coco-bacilos
+ + +
+ + neg
neg neg +
neg neg +
neg neg
neg neg
coco coco
neg neg
neg +
neg varivel
neg varivel
neg varivel
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson
GEL = gelatina
Mod V - 37
Mac Conkey + + + +
C. indologenes
neg
bacilo
neg
neg
varivel
resistente
S. paucimobilis
+ +
Neg neg
bacilo bacilo
neg var
neg neg
neg varivel
varivel varivel
sensvel resistente
Sphingobacterium spp.
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson 1 pode ser motilidade positiva a 20oC 2 a 37oC
MC = Mac Conkey
Poli = polimixina
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson
MC = Mac Conkey
GEL = gelatina
Mod V - 38
+ + + + + + +
+ + + + + + +
+ + + + + + +
OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson nt= no testado (no citado na literatura)
MC = Mac Conkey
CIT = citrato
nt= no testado (no citado na literatura) Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. mendocina (rara) P. putida P. stutzeri S. paucimobilis B. cepacia B pseudomallei S. putrefaciens Gelatina nt 82% + + neg neg neg nt 20% + 79% + varivel Esculina neg neg neg neg neg neg + 63% + 59% + neg Polimixina sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel resistente resistente sensvel Mac Conkey + + + + + + varivel + + + Lisina nt neg neg neg neg neg nt 80% + neg neg Arginina varivel + + + + neg neg neg + neg
Mod V - 39
Methylobacterium spp.
bacilo
varivel
Colnia seca coral, bacilos com vacolos Colnias mucides rosadas cocobacilos
Roseomonas spp.
varivel
cocobacilo
varivel
OXI = oxidase
MOT = motilidade
Morf = morfologia
Mod V - 40
Alimentos contaminados
Alimentos
Bacteremia, infeco extranegintestinal Gastrite, lcera pptica Gastroenterite, bacteremia, etc. Leptospirose Sfilis Gastroenterite
Humanos
Fecal-oral
- Ingesto de alimentos e gua contaminados - Alimentos ou gua contaminados com urina de animal infectado
RECURSOS DIAGNSTICOS
Agente Arcobacter spp. Borrelia burgdorferi (doena de Lyme) Borrelia spp. Campylobacter coli e C. jejuni Campylobacter fetus Testes * Microscopia: bacilos Gram negativos curvos ou helicoidais Cultura: cresce entre 15 a 30oC em ambiente especfico de combinao de gases em CAMPY-CVA. Sorologia: No disponvel Microscopia: espiroquetas coradas por colorao de prata de Warthinneg Starry ou anticorpos marcados por fluorescena em tecidos Cultura: meio BSK II em microaerofilia entre 30-37oC por 6 semanas Sorologia; Imunofluorescncia e ELISA Microscopia: espiroquetas coradas pelo Giemsa, Wright de amostras de sangue Cultura igual de B. burgdorferi Microscopia: bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram. Cultura: cresce a 37 e 42oC em em ambiente especfico de cambinao de gases em Campy-CVA Microscopia:bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram Cultura: cresce em gar sangue a 37oC, mas no a 42oC em ambiente especfico de cambinao de gases
Mod V - 41
Helicobacter pylori
Microscopia: bipsia gstrica corada por H&E, Giemsa ou colorao pela prata de Warthin-Starry. Recurso rpido; teste da urease em bipsia gstrica (sensibilidade>90%) Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37oC por 5-7dias Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade) ou por imunofluorescncia direta Cultura: primeiros 10 dias de doena - LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos
Leptospira spp.
Treponema pallidum -
Linfa de leses observadas em campo escuro ou colorao pela prata (Fontana); presena de espiroquetas. Imunofluorescncia direta mais sensvel Sorologia: VDRL ou FTA-abs so muito teis para diagnstico * Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina.
CAMPYLOBACTER
MATERIAL
Em caso de gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais, estas podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior freqncia infeces extraintestinais.
MICROSCOPIA
A colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contra-indica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. Principais espcies de Campylobacter e Arcobacter
Bactria Catalase H2S-TSI Cresc. 15oC neg Cresc. 25oC neg Cresc. 42oC + Mac Conkey + cido Nalidixico sensvel ou resistente sensvel sensvel ou resistente sensvel ou resistente sensvel Cefalotina
C. jejuni
neg
resistente
C. coli C. fetus
+ +
neg neg
neg neg
neg +
+ neg
+ +
resistente sensvel
varivel
neg
neg
varivel
sensvel *
neg
varivel
varivel
varivel
ISOLAMENTO
A maioria das espcies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45 m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos, sendo na atualidade os mais recomendados o gar carvo desoxicolato cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Mod V - 42
Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC (todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel a presena de qualquer tamanho de halo. VIBRIOS, AEROMONAS E PLESIOMONAS A suspeita da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas evidenciada pelo: Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. Materiais clnicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas. Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos:
Bactria Diarria Infeces partes moles pouco comum Sepse Outros
Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Plesiomonas shigeloides Aeromonas hydrophila Aeromaonas caviae Aeromonas veronii
freqente
raro
raro
VIBRIO
As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, e oxidase positivas. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias. A clera, causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clssica e El Tor), responsvel por diarria secretria disseminada por via fecal-oral (gua e alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas falta de condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico a diarria aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e neste ltimo meio as colnias so semelhantes a de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivas, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%.
Mod V - 43
AEROMONAS E PLESIOMONAS
Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies. Aeromonas tm sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps-picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarria, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mac Conkey e Salmonella-Shigella). Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E.coli e Citrobacter spp.
Bactrias E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp.
1
Lisina + neg +
Gs + + varivel
Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio
Provas V. cholerae Outros vibrios neg + + +
2
Aeromonas spp.
Plesiomonas spp.
+
1
+ neg + +
+ neg + neg
+ + +
LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose ESC = esculina HEM * = hemlise / sangue carneiro
SAC = sacarose
Mod V - 44
Bactrias Gram positivas que so citadas no texto para fins de diagnstico diferencial, mas que foram abordadas em outros captulos so: Outros anaerbios: Mobiluncus spp. Actinomyces spp. (anaerbios) Propionibacterium spp. Clostridium spp. (anaerbios) Eubacterium Lactobacillus spp. (anaerbios) Bifidobacterium spp. Mycobacterium spp. (micobactrias) Os Actinomyces spp. e alguns Propionibacterium spp. embora anaerbios, podem ser aerotolerantes, e crescer em aerobiose.
ORIENTAO GERAL NA IDENTIFICAO DE BGPS
Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos, algumas observaes e provas so fundamentais: Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminao. Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso pede-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos. Procurar sempre ter bacterioscopia do material clnico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo (BGP) e verificar se h predomnio do agente em questo; relevante o achado dentro de macrfagos / neutrfilos. Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericrdico, etc.), bipsias, aspirados de abscessos, LBA, etc., desde que a bacterioscopia e o quadro clnico sejam compatveis. Cuidado com contaminao por bactrias da flora de mucosas. Em caso de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento de >104 UFC/ml. Em urina sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem >105 UFC/ml. Observar caractersticas da colnia: cor, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise, etc. Testar em quais meios cresce o BGP e suas condies de incubao. Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres.
Mod V - 45
sempre interessante semear em meio slido e em caldo para observar variao morfolgica; observar ramificaes em diferentes condies e meios de cultivo. Fazer colorao de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de lcool-cido resistente. Lembrar que este grupo de bactrias pode variar muito nas caractersticas morfolgicas quando observado no material clnico culturas jovens, culturas velhas, meios slido ou lquido, meio rico ou pobre, etc., sem que represente contaminao ou cultura mista. No entanto, algumas destas bactrias so habitantes de mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. CORINEFORMES So classificados como corineformes as seguintes bactrias: Corynebacterium spp. Arthrobacter spp. Brevibacterium spp. Curtobacterium spp. Exiguobacterium spp. Arcanobacterium spp. Microbacterium spp. Aureobacterium spp. Turicella spp. Dermabacter spp. Gardnerella spp. Rothia spp. Cellulomonas spp.
Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importncia clnica, sendo recomendvel a caracterizao e provas diferenciais apenas dos gneros: Corynebacterium spp. Arcanobacterium spp. Gardnerella spp. Rothia spp.
C. diphtheriae, C. ulcerans C. jeikeium C. pseudotuberculosis Erysipelotrix sp Gardnerella spp. Lactobacillus spp. Listeria spp. Nocardia spp.
Mod V - 46
importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo no homogneo de bactrias com poucas caractersticas em comum sendo tambm morfologicamente muito distintos:
CORYNEBACTERIUM SPP
O gnero Corynebacterium compreende cerca de 50 espcies, sendo cerca de 30 de algum interesse mdico. Estas espcies podem ser diferenciadas por provas como: OF glicose reduo de nitrato urease utilizao de diferentes carboidratos reao de CAMP Principais caractersticas: no se ramificam no so alcool-cido resistentes catalase positivas imveis esculina e gelatina negativas
MORFOLOGIA
Variam muito na morfologia das diferentes espcies, e mesmo mesmas culturas em diferentes condies de cultivo. So bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos caractersticos em paliada ou letras chinesas, podendo ou no apresentar grnulos metacromticos, que so melhores visualizados atravs da colorao de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactrias conhecidas como difterides. As corinebactrias de maior importncia clnica so catalase positivas, imveis podendo ser fermentadoras ou no. So muitas as corinebactrias que se pode isolar em material clnico, entretanto, de pouco interesse aprofundar na caracterizao destas espcies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiolgicos.
Mod V - 47
Ocorre dor de garganta, dificuldade de deglutio, presena de pseudomembrana purulenta, dor no corpo, cefalia, nuseas e febre. A morte pode ocorrer por obstruo respiratria ou por miocardite. Pode ocorrer difteria cutnea com leses necrticas e, eventualmente, presena de pseudomembrana.
O material de orofaringe ou nasofaringe deve ser colhido das bordas, abaixo da pseudomembrana purulenta.
A bacterioscopia do esfregado do material, bem como do crescimento no meio de Loeffler, aps colorao de Gram pode ser sugestiva caso sejam visualizados bacilos difterides, melhor caracterizados pela colorao de AlbertLaybourn. A identificao bioqumica das Corynebactrias potencialmente produtoras de toxina difcil em laboratrio no especializado. Recomenda-se, nestes casos, encaminhar o material ou contactar o Laboratrio de Referncia para orientao.
Motilidade
Uria
Esculina
Hemlise
Arcanobacterium spp. C. diphteriae C. jeikeium C.ulcerans /Pseudotuberculosis Corinebacterium spp. Gardnerella vaginalis Oerskovia spp. Rhotia spp.
1 2
neg + + +
F F O F
+ neg + varivel
F F F F
neg neg + +
Base CTA (cystine tripticase gar) O = oxidativo e F = fermentador gar sangue de coelho
Mod V - 48
C. PSEUDOTUBERCULOSIS
Importncia clnica Deve ser lembrado nos casos de veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadro de linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta espcie pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe a beta-hemlise do S. aureus em gar sangue com hemcias de carneiro).
Isolamento e Identificao
C. JEIKEIUM
Caractersticas gerais Importncia clnica Colnia pequena cinza ou translcida, a bacterioscopia um pequeno coco-bacilo gram positivo, resistente a vrios antibiticos (beta-lactmicos, gentamicina, etc). Associada a septicemia, endocardite, infeces de pele e tecido subcutneo. Infeces mais severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou associada a prteses e procedimentos invasivos. Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipoflica e no em caldo BHI sem Tween 80. Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium spp. de importncia clnica so fermentadoras. Oxida a glicose, uria negativa, esculina negativa, PYR positiva.
Isolamento e Identificao
ROTHIA * DENTICARIOSA
Caractersticas gerais Importncia clnica Isolamento e Identificao So bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados.
* Rhotia spp.: So pleomrficos podendo apresentar-se tanto na forma cocide como de bacilos. So catalase positiva, imvel e fermentador.
ARCANOBACTERIUM SPP.
Caractersticas gerais Importncia clnica So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes rudimentares. Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como agentes patognicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado com infeces de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite. Crescem em 24-48h como colnias pequenas e hemolticas. Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos. So bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imveis e fermentadores. Espcies A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae so hemolticas, tm a hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhores em CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise).
Isolamento e Identificao
GARDNERELLA SPP.
Mod V - 49
Caractersticas gerais
So pequenos bacilos ou coco-bacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta. A principal espcie a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificao taxonmica incerta, e portanto para fins didticos, estudada com os coryneformes. Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presena de Gardnerella esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Esta bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e ps-aborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta, mas sem hemlise no gar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou no Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. pleomrfica, Gram varivel (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram positiva), imvel, sem cpsula. um anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e oxidase negativas.
Importncia clnica
Isolamento e Identificao
OERSKOVIA SPP.
Caractersticas gerais So microrganismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios, apresentam ramificao, hifas vegetativas, sem hifas areas e penetrao no gar. Oerskovia turbata e O. xanthineolytica so bactrias do meio ambiente ou solo, com pouca importncia clinica, com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. Isolamento e Identificao Cresce bem em gar sangue de carneiro e no gar chocolate. Cresce mal no meio de Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, visvel aps 24-48h em anaerobiose ou 5% CO2. Apresentam colnias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa. Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina; motilidade varivel.
LISTERIA
Caractersticas gerais So bacilos uniformes, no ramificados, apresentando-se s ou em pequenas cadeias. A nica espcie importante para o homem entre as sete espcies conhecidas a L. monocytogenes. Mvel a temperatura ambiente (25 a 28oC) e imvel a 37oC. Encontrada na natureza no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne, etc. Sendo encontrada como microbiota de diversos mamferos, aves, peixes, e insetos. Tem importncia clnica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Na grvida a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em surtos, em geral relacionados a contaminao de alimentos. Crescem em gar sangue, gar Chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e gar Mueller Hinton, mas no em Mac Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em trs a quatro dias. A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, gua, etc., semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Bacilo Gram positivo anaerbio facultativo, catalase positiva, oxidase negativa, que produz cido de glicose. Hemlise beta em gar sangue de carneiro, CAMP positivo, motilidade positiva temperatura ambiente, hidrlise da esculina positiva e NaCl 6,5% positiva. Alm disso, verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uria, gelatina, indol e H2S negativas.
Importncia clnica
Isolamento e Identificao
Mod V - 50
ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAE
Caractersticas gerais Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas, anaerbio facultativo, no esporulado, no alcool-cido resistente, ocorre s em cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Existe na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Vive em animais, peixes e pssaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose (doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais) caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou mses, com possibilidade de recada. Material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swab da leso em geral negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Cresce em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% de CO2. Cresce entre 5 a 42oC e em caldo NaCL 6,5%. No gar sangue cresce em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, s vezes corando-se mal pelo Gram Catalase negativa, imvel, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir gs, uria e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S; lactose positiva e sacarose negativa.
Importncia clnica
KURTHIA
Caractersticas gerais So bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos no ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocides ou bacilos curtos. Vivem no meio ambiente, na gua, solo, animais, sua carne e seus derivados. Seu papel clnico questionado, pois no h relatos recentes de isolamento em casos significativos. Crescem em gar sangue como colnias de cor creme no hemolticas, podendo ser confundidas com Bacillus spp. So aerbios estritos, no esporulados, no lcool-cido resistentes; so mveis, catalase positiva e no fermentadores.
Gram bacilo curto ou coco-bacilo regular e largo cocos ou coco-bacilos em cadeias cocos em cadeias coco-bacilos e cadeias longas bacilo grande, cadeias, cocide em cultura velha bacilos e coco-bacilos pleomrficos coco-bacilo ou filamentos longos
NaCl 6,5% Esculina +/+ +/+ neg / neg neg / neg neg / neg varivel / neg neg / neg
- No usa glicose
- H2S positivo
Mod V - 51
Bacilos Gram positivos anaerbios que devem ser diferenciados: Lactobacillus spp. - flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). So anerbios estritos mas crescem em gar sangue e gar chocolate como colnias muito pequenas. So imveis e catalase negativa. Sem valor patognico. Mobilluncus - bacilos Gram positivos anaerbios estritos, curvos, mveis que vivem na trato genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a Gardnerella. Propionibacterium spp., Eubacterium spp. e Bifidobacterium spp. anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios. BACILOS ESPORULADOS AERBIOS E ANAERBIOS FACULTATIVOS Gnero Bacillus compreende cerca de 50 espcies de bacilos anaerbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colnia mais velhas. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localizao dos endosporos so teis para sua classificao: podem ser cilndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijo posio central, sub-terminal, terminal dilatando ou no a clula me Todos so mveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria catalase positiva. Na presena de on bicarbonato (HCO3 -) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium apresentam cpsula polipeptdica. Habitat e importncia clnica - Os Bacillus spp. encontram-se basicamente no solo, gua, matria orgnica animal e vegetal nas condies mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc. As duas espcies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. antrhacis e B. cereus. Principais espcies de Bacillus relacionadas infeco
Espcie de Bacillus Antrhacis Quadro clnico Frequncia de relatos
Antrhax cutneo Anthrax intestinal Anthrax pulmonar Necrose ou gangrena em partes moles Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Infeces pulmonares, endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite Infeces de partes moles, abscessos, bacteremia e sepse Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar
Bastante frequente Raro Raro Bastante frequente Frequente Muito frequente Frequente
Cereus
Circulans
Frequente
Licheniformis
Subtilis
Caracterizado por diarria, dor abdominal, que aparecem 8 a 16 h aps a ingesto do alimento contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos). Caracterizado por nuseas e vmitos que aparecem 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima. Bacillus anthracis
Caractersticas gerais
No passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbvoros altamente suscetveis, sendo reduzida pela vacinao e melhores condies de higiene. O homem pode adquirir a doena em contato com animais doentes (trabalhadores rea rural e veterinrios), no manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais e de forma eventual, sendo a forma cutnea quase a totalidade dos casos, com raros episdios intestinais pela ingesto de carne contaminada. Potencial risco elevado na comunidade quando usado como arma biolgica. A forma cutnea no tratada pode ser fatal (menos de 20% dos casos), principalmente quando a leso prxima a cabea ou pescoo. As formas pulmonares e intestinais so mais graves pela dificuldade de diagnstico. No local de inoculao da forma cutnea aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula, seguida no dia seguinte de um anel de vesculas em torno da ppula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a caracterstica de ser indolor e sem pus. A forma intestinal semelhante forma cutnea atingindo a mucosa com leses e eventualmente gastroenterite. No antraz pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal. Ateno ao fato de que evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas, quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao, falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas. Em geral a bacteremia importante.
Quadro clnico
Coleta de material
Swab do exudato de leses podem ser teis; na escara, remover a crosta e colher material com swab ou com tubo capilar, usando luvas. Na forma intestinal, fezes podem ser colhidas. Ps-mortem, sangue venoso ou de sangramento de mucosas (sangue no coagula) pode evidenciar o bacilo na bacterioscopia. No antraz pulmonar a hemocultura til nos casos graves, mas o material pulmonar oferece menor chance de isolamento. Em casos clnicos os Bacillus esto na forma vegetativa, mas em alimentos, produtos secos de animais (ossos, crina, pelo) o Bacillus dever estar em forma esporulada e haver necessidade de ativ-los a 62,5oC por 15 minutos (choque trmico). Os Bacillus crescem com facilidade em meios pobres ou ricos. Dependendo do material (ex: fezes) poder haver necessidade de usar meio seletivo com adio de polimixina (100.000U/L). Colnias grandes de cor creme crescem no gar sangue.
Isolamento e Identificao
Diferenas entre Bacillus spp. e Clostridium spp. Bacillus spp. Clostridium spp.
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O B. antrhacis virulento pode ser testado para produo de cpsula semeando-se em gar nutriente com 0,7% de bicarbonato de sdio em jarra com vela. O crescimento ser mucide e a cpsula poder ser evidenciada com a tinta da china. ACTINOMICETOS Grupo de bactrias Gram positivo que apresentam como caractersticas em comum a produo de filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas de composio de parede e padro de cidos graxos celulares. Neste grupo sero abordados os seguintes gneros: Nocardia spp. Rhodococcus spp. Streptomyces spp. O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas, analisado juntamente com os corineformes. Outros actinomicetos raros ou de menor importncia clnica no considerados so: Gordona spp., Tsukamurella spp., Actinomadura spp., Nocardiopsis spp. Informaes importantes sobre Actinomicetos Para a adequada caracterizao dos Actinomicetos, que apresentam alguma semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar: A origem do material, valorizando os abscessos. A quantidade de microrganismos isolados e correlao com a bacterioscopia do material. Possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral. Pigmento da colnia. Anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina idntico ao utilizado na seco de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC. Identificao presuntiva de actinomicetos
Gnero Nocardia Rhodococcus Oerskovia Rhotia Miclio areo + neg neg neg neg neg neg Condio Metabolismo glicose oxidativo oxidativo fermentativo fermentativo
NOCARDIA SPP.
Caractersticas gerais So bacilos Gram positivo ramificados e filamentosos, aerbios estritos, catalase positivo, imveis, que se fragmenta em bacilos e cocos irregulares. Produz hifas areas medida que o cultivo envelhece. Existem 12 espcies sendo as mais importantes N. asteroides e N. brasiliensis. Importncia clnica Est associada ao solo e vegetais. As formas clnicas podem ser bem distintas: pulmonar (abscessos), extra-pulmonar localizada, sistmica, sistema nervoso central (abscessos), partes moles e micetoma. considerada uma bactria oportunista, pois a maioria dos casos no cutneos e micetomas ocorrem em pacientes imunocomprometidos. Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, deve ser processado rapidamente; existe uma caracterstica do material descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas.
Coleta de material
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Isolamento e Identificao
No bactria exigente, crescendo em gar sangue, gar chocolate, gar Sabouraud dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen. Cresce entre 72h a 14 dias. Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresentam beta-hemlise em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Em microcultivo possvel visualizar as hifas ramificando-se em angulo reto, podendo apresentar ramificaes secundrias, bem como hifas areas. Em cultura mais velhas em gar tornam-se visveis as hifas areas nas colnias rugosas. As micobactrias de crescimento rpido podem apresentar ramificaes bem curtas em ngulo agudo e sem ramificaes secundrias. Uma caracterstica importante a cor das colnias em Sabourad dextrose gar ou mesmo em outros meios: salmo ou laranja claro N. asteroides laranja escuro N. brasiliensis
A Nocardia brasiliensis uria positivo, citrato positivo e gelatina positiva. A Nocardia asteroides uria positivo, citrato varivel e gelatina negativa.
Bacterioscopia e Histologia
A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou colorao de Kinyoun. Cortes histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de Gomori so teis.
RHODOCOCCUS SPP.
Caractersticas gerais O R. equi uma bactria oportunista, causando pneumonia em imunocomprometidos, apresentando uma evoluo lenta e granulomatosa, com infiltrados que evoluem para cavitao. Pode causar tambm abscessos no sistema nervoso central, tecido subcutneo, linfadenite, etc. Diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos, nocardia e actinomyces. Hemoculturas com elevada frequncia podem ser positivas. Coleta de Material Lavado bronco-alveolar (LBA), bipsias, hemocultura e mesmo escarro. Em material clnico o Rhodococcus pode ser visualizado no interior de macrfagos e extra-celular, na forma de cocos ou coco-bacilos. Em hemoculturas, LBA e escarro eventualmente pode ser observado na forma filamentosa. Em microcultivo o R. equi cresce de forma tpica como coco-bacilo ou bacilo em zig-zag. Em Heart Infusion gar (HIA) cresce em 6 horas a 35oC como bacilo Gram positivo e em 24 horas apresenta-se cocide. A forma de ramificaes rudimentares a partir dos filamentos pode ocorrer em culturas jovens em meio lquido. Em HIA cresce entre 28 e 35oC, entre 2 a 4 dias, mas no a 45oC. Pode crescer na forma de colnias rugosas (com hifas areas) ou lisas ou mucides. Pode apresentar a cor coral ou rosa plido que so mais freqentes, mas pode ser amarela ou incolor. A colorao pelo Ziehl ou Kinyoun pode revelar a fraca alcool-cido resistncia.
Isolamento e Identificao
STREPTOMYCES SPP.
Caractersticas gerais Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus). O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O Gram vai revelar uma massa de bacilos Gram positivo finos. No fastidioso, cresce em Sabouraud dextrose melhor incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e condios (via assexuada de propagao com forma arredondada). No alcool-cido resistente, e apenas os condios podem apresentar esta propriedade; metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas com, diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc) e presena ou no de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra molhada.
Isolamento e Identificao
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7. FASTIDIOSOS
INTRODUO
Este grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum exigncias especiais de condies de cultivo, em relao as enterobactrias e a maioria dos no fermentadores. Estas condies variam para cada microrganismo, podendo ser a necessidade de CO2, crescimento lento com a necessidade de at 30 dias de incubao (Brucella), adio de fatores especiais de crescimento, etc. Pontos-chave para classificao So bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina). Muitos, mas no todos so coco-bacilos e oxidase positivos; no crescem em Mac Conkey. Para teste de fermentao de carboidratos exigem uma base mais rica como o CTA (vide captulo meios de cultura). O inculo deve ser bem denso e muitas vezes necessrio a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicos. Exceto as Capnocytophaga spp. que crescem formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os demais fastidiosos crescem lentamente e exigem 48 a 72 horas para as colnias ficarem bem visveis, embora diminutas. Alguns destes potenciais patgenos esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes como a brucelose, tularemia, etc. importante nestes casos obter informaes adicionais com o mdico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao microbiolgica. Sempre valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrer em mais de uma amostra, ou materiais de bom valor preditivo de infeco como o LCR, lquido pleural, pericrdico, sinovial, BAL, etc. Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemoculturas e a bacterioscopia pode ser aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria como pela m colorao pela safranina. A topografia da fonte de isolamento uma pista importante, pois diferentes espcies de Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium podem ser encontrados em pele e mucosas, a Gardnerella e Cardiobacterium no trato genital, etc. Como a alguns exigem tratamento com drogas no habituais, extremamente importante chegar a definio de gnero ou encaminhar a Laboratrio de Referncia. Outro motivo relevante para a correta identificao a importncia epidemiolgica que o agente possa ter em surtos ou mesmo em casos isolados, como o caso da brucelose, legionelose e Bordetella pertussis. A Pasteurella spp. embora includa neste grupo, cresce com facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, comportando-se no TSI como fermentador, mas no cresce em Mac Conkey . oxidase positiva. Alguns dos fastidiosos esto relacionados a contato com saliva, sangue, fezes, atravs de acidente perfuro-cortante ou mordida de animais domsticos ou silvestres (Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella). Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns destes agentes pelo potencial patognico (Brucella e Francisella). Com base na importncia clnica e epidemiolgica, este grupo de bactrias ser dividido em dois grupos: Grupo A: maior interesse clnico e epidemiolgico Grupo B: casos clnicos espordicos / microbiota oral humana
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Mordida ou arranho de gato; picada de piolho infectado Leite e derivados, carne, sangue, secrees de animais doentes Picada de carrapato ou mosquito infectado em zona endmica Secrees de vias areas Inalao de gua contaminada Mordida e secrees de animais domsticos e silvestres
Brucella spp.
Francisella spp.
Animais silvestres
As caractersticas deste grupo heterogeneo so: Dificuldade ou ausncia de crescimento em meios ricos como gar Sangue e gar Chocolate. Exigncia de incubao em diferentes tenses de CO2. Dificuldade em caracteriz-los, pois exigem meios enriquecidos. Crescimento lento e pouca importncia clnica, talvez pela dificuldade do seu isolamento e caracterizao. Os gneros Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tem em comum o fato de pertencerem microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados doenas gengivais e, a partir deste foco, doenas sistmicas. Kingella e Cardiobacterium esto associadas ao trato respiratrio humano. Diferem deste grupo a Chromobacterium que encontrada na natureza em gua e solo e Streptobacillus na orofaringe e nasofaringe de camundongos selvagens e de laboratrio.
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Brucella spp.
Sangue, aspirado de medula Gnglios, bipsias Sangue, LCR, etc. Secrees ou aspirados de trato respiratrio inferior Sangue, LCR, leses
At 30 dias
Pasteurella spp.
24 a 72 h
varivel neg neg neg neg + neg neg neg neg + fraco neg neg
+ neg + + + + + + + + neg +
BARTONELLA A classificao taxonmica dos membros do gnero Bartonella ainda no definitiva e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis.
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B. bacilliformis - o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena restrita aos Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade. B quintana - causa de doena febril que atacou soldados na I Guerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras e relacionado a picada de piolhos e baixa higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel e ainda no bem conhecida. Casos associados infeco por HIV foram relatados. B. henselea - pode apresentar quadro de bacteremia principalmente em imunossuprimidos bem como relacionada doena da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e com febre progressiva. A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente com uma ppula ou pstula cerca de uma semana no local de contato com animal (gato ou co novo que arranha ou morde). Aps 1 a 7 semanas aparece adenopatia regional e 1/3 dos pacientes apresentam febre e em 1/6 ocorre supurao do gnglio, sendo que a maioria evolui sem outros sintomas. A cura espontnea ocorre entre 2 a 4 meses. B. quintanae e B. henselae podem causar quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. B. elizabethae ainda pouco conhecida. Afipia felis - foi considerada h alguns anos como o agente etiolgico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuida B. henselae. Seu papel patognico no est bem esclarecido. Isolamento
As bartonellas podem ser isoladas de hemoculturas, leses cutneas bipsias e gnglios. O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante usado nas hemoculturas inibidor das bartonellas, por sso deve-se usar outro anticoagulante. Quando h suspeita clinica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias. Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das bartonellas. O caldo infuso corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo so adequados, como tambm o gar chocolate. No Bactec pode crescer, mas no aciona o alarme de CO2. Exigem umidade a 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC.
Identificao
Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material. So bacilos Gram negativos pequenos, s vezes curvos. As espcies quintana e henselae, que so mais isoladas, so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente e que no devida a flagelos (no tem), mas a fmbrias, percebendo-se a agitao da clula. O perodo de incubao longo (> que sete dias) e a B. henselae bem aderente ao meio.
BORDETELLA
Caractersticas gerais
O gnero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela coqueluche ou tosse comprida, e B. parapertussis, com quadro clnico semelhante a coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas so patgenos exclusivos dos humanos. A B. bronchiseptica e B. avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando infeces em ces (tosse dos
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canis) e a B. avium rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com estes animais. Foram classificadas mais recentemente para o gnero bordetella as espcies holmesii e hinzii. Importncia clnica A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com clnica bastante caracterstica: Perodo prodrmico, que inicia 5 a 10 dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Fase altamente contagiosa e com sintomas inespecficos. Segue-se o perodo paroxstico com quadro de tosse convulsiva, persistente e caracterstica seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vmito e vrias complicaes como convulses, insuficincia respiratria, encefalopatia, infeces secundrias, etc. A convalescena ocorre cerca de quatro semanas aps inicio dos primeiros sintomas. So adequados o swab ou aspirado de nasofaringe e semeadura imediata em meios especficos e em gar sangue para afastar B. pertussis. Na atualidade no se justifica dispor de meio de Bordet & Gengou ou outro, mas em caso de suspeita solicitar auxlio de Laboratrio de Referncia. Para frmula de meios de cultura vide manuais de fabricantes de meios de cultura. A prova de imunofluorescncia deve ser utilizada em material de nasofaringe juntamente com a cultura que mais especfica. So, cocobacilos Gram negativos pequenos e aerbios estritos. A safranina deve ser corada pelo Gram durante 2 minutos para melhorar a colorao. Para B. pertussis e parapertussis os Laboratrios de Referncia devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao.
Isolamento e Identificao
B. pertussis 1 + neg neg B. para pertussis neg neg + em 24h B. bronchiseptica + + + em 4h B. avium + +2 neg B. holmesii neg neg neg B. hinzii + + varivel 1 - necessita de meio especfico: Bordet & Gengou (infuso de Lowe. 2 - mais evidente a 25oC
BRUCELLA A brucelose uma doena de sintomas vagos, que cursa de forma insidiosa com febre baixa, calafrios, sudorese noturna, cefalia, mialgia e artralgia. Pode ser acompanhada na forma crnica de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia, anemia hemoltica, etc.
Importncia clnica Est associado ingesto de leite e derivados e carne de mamferos, veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue destes animais e acidentes em laboratrios. A hemocultura exige tempo superior de 5-7 dias de incubao. importante a informao mdica de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente. Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao, LCR, etc. A partir do segundo dia de febre as hemoculturas podem ser positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o mtodo de lise-centrifugao: Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sdio a 4% Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril Centrifugar 2.000g por 30 minutos Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear. Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula. - Incubar 35oC em estufa entre 5 a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada). Isolamento e Identificao As brucellas crescem bem em gar sangue, gar chocolate, Tripticase Soy gar e Brucella gar. O crescimento visvel com 48 a 72 horas. Colnias so pequenas, brancas a creme, e ao Gram visualizam-se coco-bacilos bem finos e pequenos. So aerbios OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chocolate,
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mas no no Mc Conkey. Espcies mais importantes so: - melitensis, abortus, suis e canis. - Uria positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h) no meio uria de Christensen. - H2S com tira de acetato positivo: B.abortus e de B.suis (biotipo 1). - CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis.
Considerando que a Brucella de dificil caracterizao em laboratrio no especializado, encaminhar a laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, obtendo-se isolado de sangue ou medula, crescimento de coco-bacilos finos pouco corados, oxidase e catalase positivas, que crescem lentamente em gar sangue ou chocolate. Soroaglutinao til como elemento da caracterizao. FRANCISELLA TULARENSIS um coco-bacilo pequeno, Gram negativo, imvel e pleomrfico, aerbio estrito e capsulado. Apresenta grande resistncia no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios midos, carcaas de animais, gua, lama, etc. Constitui o agente da tularemia, uma doena de animais selvagens e com vrios vetores hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos. Nos Estados Unidos prevalece o biovar A, mais grave, enquanto que no hemisfrio sul prevalece o biovar B que apresenta a forma clnica mais leve, sendo pouco diagnosticada principalmente por desconhecimento do agente.
Fontes de transmisso Centenas de animais silvestres, incluindo alguns domsticos (incluindo ces, gatos e pssaros), podem ser portadores deste agente. Cerca de uma dezena de diferentes insetos servem de vetores. A transmisso pode ocorrer tambm em contato direto com animais pela mordida, sangue, carne contaminada e eventualmente gua e inalao de aerossis. extremamente infectante, devendo ser manipulado em cabine de segurana nivel 2 para material clnico e nvel 3 para culturas positivas. Bastam 10 microrganismos injetados por via subcutnea ou 25 inaladas para causar a doena. Logo aps a penetrao do agente, em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes da gripe: febre, tremores, cefalia e dor generalizada. Aps perodo de incubao de 2 a 10 dias forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode durar meses. Os gnglios regionais aumentam e ocorre necrose. Se ocorrer invaso sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se manifesta. Estes casos so pouco frequentes e ocorrem quando h grande inoculao ou paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%, ocorrendo toxemia, cefalia intensa, febre elevada e contnua, com delrios, prostrao e choque. A forma lcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A lcera endurada, eritematosa, que no cicatriza. Outras formas relatadas so oculo-ganglionar, em orofaringe, ganglionar sem lcera, pleuropulmonar e gastrointestinal.
Quadro clnico
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Os materiais que oferecem maior chance de positividade so a partir de raspados de lceras, biopsias e escarro. A Francisella cresce em gar chocolate suplementado com Isovitalex . Laboratrio de Referncia deve ser consultado sobre recursos disponveis ou encaminhamento de cepas suspeitas. A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda, pois o microrganismo muito pequeno e cora mal pelo mtodo de Gram. Este agente deve ser lembrado sempre que houver doena associada a picada de carrapato e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diagnstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e congeladas a - 20oC.
Isolamento e Identificao
HAEMOPHYLUS Diferentes espcies pertencentes ao gnero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da populao, geralmente cepas no capsuladas, embora tambm cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonizao (rara nos adultos e cerca de 5% nas crianas). Para considerar o isolamento de Haemophilus fundamental associar o papel patognico ao da clnica. Vrias so as infeces causadas por H. influenzae, sendo H. influenzae do tipo b as cepas mais virulentas. Entretanto a partir da dcada passada, com a disponibilidade de vacinao, houve uma drstica reduo na importncia desta bactria nas populaes vacinadas. Doenas causadas pelo H. influenzae b principalmente na infncia: Meningite, Epiglotite, Pericardite, Pneumonia, Artrite sptica, Osteomielite, Celulite facial. Mais raramente: peritonite e infeco urinria em crianas menores que cinco anos. Doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC, etc.): Traqueobronquite e pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Ootite (segunda causa depois do pneumococo), Sinusite.
HAEMOPHILUS APHROPHILUS
Microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e sulco gengival; endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia esto associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunolgico. A endocardite no est necessariamente relacionada leso valvular prvia, mas a associao com embolia arterial freqente nestes casos. Existem relatos tambm de isolamento em otites, sinusites e epiglotites, etc. Crescem bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo tem a caracterstica de aderir as paredes do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. No crescem em Mac Conkey. Para todos os hemfilos fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistncia penicilina
HAEMOPHILUS DUCREY
o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidncia da doena, da contaminao das leses com flora genital e pelo frequente uso prvio de antibiticos. Colhido de lceras genitais removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando com salina estril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregao a ser corado pelo Gram. Em geral de difcil cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocao de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. Na bacterioscopia aparecem coco-bacilos Gram lbeis agrupados e em cadeias como cardumes.
ISOLAMENTO
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No isolamento primrio no gar chocolate as colnias costumam ser pequenas de cor beje claro, com odor caracterstico. No gar sangue ocasionalmente pode-se detectar o crescimento em torno de colnias de Staphylococcus aureus , que produz o fator V e utilizada como prova alternativa utilizao dos discos e denominada prova do satelitismo.
neg + + neg +
* Verificar hemlise em gar sangue de cavalo GLI = glicose SAC = sacarose LAC = lactose Obs.: Fermentao de aucares com base CTA e 1% de acar adicionado de fator X e V (vide cap. meios de cultura); vide leitura de fatores X e V
Tcnica para testar fatores X e V: Usar meio gar tripticase soja ou BHI gar. Discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I. Semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5 cm um disco do outro. Flambar a pina antes e aps a retirada de cada disco. Aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos: Haemophilus influenzae: Crescimento entre os discos (exige X e V)
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Prova do satelitismo Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala Mac Farland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro. Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC 23922). Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2. Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise do estafilococo. Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de Referncia para confirmao e sorotipagem. LEGIONELLA
IMPORTNCIA CLNICA
Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clinica mais importante, podendo ocorrer infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com este agente. Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e ocasionalmente em chuveiros. Est associada a presena de outras bactrias e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do gnero Legionella em material clnico humano est invariavelmente associada doena clnica.
MATERIAIS RECOMENDADOS
Escarro Aspirado traqueal e outros que neste caso especfico esto indicados como teis Lavado/escovado bronco-alveolar. Bipsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autpsia. LCR e outros lquidos de derrame. Urina (pesquisa de antgenos) conservar a - 20oC. Para transporte: usar frasco estril com gua destilada estril, mas no salina que pode inibir o cultivo. Sempre que possvel concentrar os materiais por centrifugao, evitando formar aerossis.
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Cresce em meio suplementado com extrato de levedura, l-cisteina, sais de ferro e alfacetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE, e seu crescimento favorecido pela incubao em 5% de CO2. Para materiais com microbiota, como para secreo traqueal e escarro, acidificar o meio por 15 minutos a pH 2,0 com tampo cido (0,2M HCl e 0,2M KCl) e em seguida neutralizao a pH 7,0 com KOH 0,1N. Recomenda-se uso de meio seletivo, adicionando ao meio BCYE os antibiticos: polimixina B, cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e anfotericina B. Colnias azuladas ou esverdeadas Adicionado de glicina, vancomicina, prpura de bromocresol e azul de bromotimol apresenta as seguintes caractersticas: L. pneumophila (branco esverdeado), L. micdadei (colnias azul claro ou acinzentadas), outras legionelas (colnias verde bem claro). Crescem bem no frasco utilizado pelo BACTEC.
IDENTIFICAO
So bacilos Gram negativos finos que se coram fracamente pela fucsina e safranina do Gram. Em repiques tornam-se filamentosos.
PROVAS
Aerbio estrito No primo isolamento a l-cystena imprescindvel. No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5 dia a 35oC. Semear o material em gar sangue como controle, pois a Legionella no dever crescer. Aguardar 14 dias para descartar as culturas quando negativas.
CARACTERSTICAS DA L. PNEUMOPHILA
oxidase positiva fraca catalase positiva no sacaroltico (no oxida nem fermenta os acares) motilidade positiva A identificao com base em testes difcil. O suspeita deve ser baseada na clnica, no aspecto da colnia, crescimento em meio BCYEa, dependncia da l-cysteina, ausncia de crescimento em gar sangue e gar chocolate no suplementados. A imunofluorescncia direta, com amostras clnicas utilizadas para cultura, um mtodo complementar para diagnstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas a Laboratrio de referncia para confirmao. PASTEURELLA A infeco pela Pasteurella constitui uma zoonose, pois se trata de bactria microbiota de boca e trato respiratrio superior de mamferos e aves. As diferentes espcies esto associadas a infeces humanas relacionadas a mordida dos animais descritos abaixo ou outros tipos de contato com sangue, carne, carcaa, etc. A P. multocida a espcie mais comumente isolada em material clnico humano, em geral associada a mordida ou arranhadura de ces e gatos. Caracteriza-se pela formao de abscessos ou celulite e eventualmente osteomielite. Infeces respiratrias podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose, neoplasias, podem apresentar bacteremia e septicemia. gelatinase positiva hidrlise do hipurato positivo sensvel a macroldeos, rifampicina, sulfatrim e quinolonas
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DIAGNSTICO DE ZOONOSES
Para facilitar o isolamento e identificao da Pasteurella muito importante a descrio clnica, pois na suspeita de zoonoses importante lembrar de: brucelose, pasteurella, micobacterioses, tularemia, leptospirose, yersiniose, etc. Caracterizao microbiolgica Coco-bacilo Gram negativo ou bacilos podem ser capsulados Anaerbio facultativo (fermentador) TSI cido/cido Oxidase positiva em colnias isoladas em gar sangue ou gar chocolate Catalase positiva Motilidade negativa Indol positivo Sacarose positiva Muitas espcies so ornitina positivas Provas diferenciais das espcies de Pasteurella spp. de importncia clnica
Espcie * P. multocida P. pneumotropica Hemlise neg neg Mac Conkey neg varivel Indol + + Uria neg + Ornitina + + OF Glicose F sem gs F gs varivel F sem gs F sem gs F com gs
varivel + neg
neg neg +
neg + +
varivel varivel +
* Todas so oxidase positiva, catalase positiva e fermentadoras da glicose Obs.: a P. multocida cresce bem em gar sangue de carneiro e gar chocolate, formando pequenas colnias acinzentadas. No cresce em gar Mac Conkey. Tem odor forte caracterstico e podem ser diferenciadas entre si por poucas provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal-fonte, outras espcies menos frequentes podem estar envolvidas. ACTINOBACILLUS So habitantes das mucosas do trato respiratrio e urinrio de humanos e animais. As trs espcies mais importantes so: A. actinomycetemcomitans, A. urea e A. hominis.
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O primeiro est relacionado doena periodontal e particularmente periodontite juvenil localizada, bem como com endocardite e abscesso cerebral, oriundos da boca. A doena periodontal est associada endocardite pelos seguintes agentes: A. actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis E. corrodens Kingella spp.
As outras espcies de Actinobacillus so patgenos oportunistas e causam raramente infeces do trato respiratrio e bacteremia.
Cardiobacterium Eikenella
Actinobacilus
neg
neg
ac / ac
neg
+ + + + + neg
+ neg + + + +
neg varivel
neg +
n cresce alc / ac
positivo ou neg = 80% ou mais das provas positivas ou negativas ac= cido 1 - A. actinomycetemcomitans 2 - origem humana. As de origem animal so oxidade e catalase positivas. 3 - pode acidificar lentamente
alc = alcalino
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CAPNOCYTOPHAGA As espcies de Capnocytophaga gingivalis, granulosa, haemolitica, ochracea e sputigena fazem parte da microbiota da cavidade oral humana, enquanto outras espcies podem ser encontradas na boca de animais domsticos. O isolamento de Capnocytophaga ocorre com maior freqncia em bacteremias nos pacientes neutropnicos com mucosite, mas esto tambm implicadas na doena periodontal juvenil (gengivalis e ochracea), periodontite em adultos (sputigena) e isoladas em placas dentais supragengivais em adultos (granulosa e haemolytica). As doenas localizadas (ceratites, abscessos e endoftalmites), bem como doenas sistmicas (septicemia, endocardite, osteomielite, etc.) ocorrem em pacientes imunocomprometidos ou no.
MORFOLOGIA E CULTIVO
A morfologia da Capnocytophaga bem caracterstica, facilitando a sua suspeita, pois lembra um Fusobacterium aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser encurvada e eventualmente cocide. Para cultivo, crescem melhores com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que pode confundir com o anaerbio estrito, se no for feita a prova de crescimento em aerobiose com CO2. Chama a ateno o fato de crescer melhor em gar sangue de carneiro que no gar chocolate sem suplemento de vitaminas. No crescem em Mac Conkey. O crescimento pode ocorrer com 24 a 72 h. A colnia chata e sua borda irregular; com maior incubao nota-se o espalhamento em torno da colnia, semelhante ao Proteus, mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de dimetro. A espcie haemolytica apresenta hemlise discreta, e a espcie ochracea tem cheiro de amndoas.
IDENTIFICAO
Capnocytophaga de origem humana so oxidase e catalase negativas, produzem cido a partir da glicose em caldo enriquecido com soro de coelho e inculo denso. Motilidade negativa; indol negativo; lisina, ornitina e arginina negativas. A maioria esculina positiva (gengivalis varivel e granulosa negativa). A diferenciao das espcies dificil. As amostras de origem animal (C. canimorsus e cynodegmi) so oxidase, catalase e arginina positivas. EIKENELLA Tambm bactria da microbiota da cavidade oral humana e atribuinegse participao em infeces periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana subgengival em adultos com periodontite. Isolada em material de trato respiratrio inferior, abscessos de partes moles, sangue e fludos estreis infectados em casos de infeces pleuronegpulmonares, infeces psnegcirrgicas de parede, artrite, meningite, endocardite e septicemia.
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maior frequncia em crianas menores de 5 anos. Os quadros spticos podem ser semelhantes doena meningoccica.
So coco-bacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria spp. e, bioquimicamente, so oxidase positiva, motilidade e catalase negativas, e acidificam a glicose lentamente. Provas diferenciais entre os fastidiosos oxidase positivas e catalase negativas: Fastidiosos oxidase positivas e catalase, uria e esculina negativas
Bactrias C. hominis E. corrodens K. kingae Hemlise neg neg + Indol + neg neg Ornitina neg + neg Glicose + neg +
CARDIOBACTERIUM HOMINIS Cardiobacterium flora do trato respiratrio humano e ocasionalmente do trato urogenital. Est associado quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulao dentria.
CULTIVO E BACTERIOSCOPIA
Bacilo Gram negativo anaerbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou em cadeias curtas. Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce alm do gar sangue e chocolate, tambm em Mac Conkey. Caracterstica de colnia convexa, lisa e de cor violeta forte, embora algumas variantes sem cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser levemente hemolticas no gar sangue.
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STREPTOBACILLUS MONILIFORMIS Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores domsticos como a cobaia. As infeces esto relacionadas a mordida destes roedores ou ingesto de leite ou alimentos contaminados. A febre por mordedura do rato apresenta quadro clnico bem definido com perodo de incubao de cerca de 10 dias, incio abrupto com febre elevada, tremores, cefalia intensa, vmitos e artralgia migratria. Rash semelhante ao sarampo com erupes maculopapulares podendo ser pustulosa, com petquias ou prpuras nas extremidades, incluindo regio palmar e plantar. Complicaes graves podem ocorrer como endocardite, pericardite, septicemia, abscesso cerebral, etc. Sem tratamento pode evoluir favoravelmente em 2 semanas ou pode se tornar crnica; a mortalidade chega a 10%.
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Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias favorecem a mutiplicao dos anaerbios, por consumirem o oxignio existente no local e talvez por produzirem alguns fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo, a maior parte das infeces por bactrias anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so freqentes as infeces conjuntas com Enterobactrias, Pseudomonas e Staphylococcus aureus. Alguns aspectos clnicos fazem suspeitar uma infeco com envolvimento de bactrias anaerbias, sendo os principais estes abaixo relacionados: Secreo ftida Infeco nas proximidades de superfcie mucosa Tecido necrtico Presena de gs em tecidos ou secrees Tromboflebite sptica Colorao negra em secreo com sangue Infeco decorrente de mordida humana ou de animal Presena de grnulos de enxofre nas secrees Teraputica prvia com aminoglicosdeos Gangrena gasosa Uma leso com aspecto de um micetoma e a observao de grnulos de enxofre no pus obtido so caracterstica de uma infeco por Actinomyces. A infeco por anaerbios secundria a uma mordida de animal ou do ser humano explicada pela existncia de um grande nmero destas bactrias na cavidade oral destes hospedeiros. Associados a estes elementos clnicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infeco por anaerbios estritos: Ocorrncia de formas pleomrficas na colorao de Gram (como regra geral, os anaerbios so mais pleomrficos que os aerbios e anaerbios facultativos). Observao no material, de bacilos gram positivos esporulados que fazem pensar em Clostridium. Presena de bactrias no Gram direto, que no crescem nos meios mantidos em atmosferas de aerobiose. Crescimento de bactrias somente na parte inferior de tubos com meios de cultura lquido ou semi-slido.
FATORES PREDISPONENTES
Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Podemos generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a quantidade de oxignio nos tecidos, e, portanto, o potencial de oxi-reduo dos mesmos, favorecem a infeco por anaerbios estritos. Entre estes fatores podemos assinalar como mais frequentes os seguintes: Diminuio do fluxo sangneo. Presena de reas necrticas. Corpos estranhos. Acmulo de sais endgenos (por exemplo, pontos de calcificao). Infeco por bactrias aerbias ou anaerbias facultativas. Manipulaes cirrgicas. Esterilizao intestinal pr-operatria. Tumores, processos orgnicos ou caseosos. Um baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de bactrias anaerbias e a causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante de leso vascular, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies levando m perfuso. Quanto s doenas sistmicas ou condies gerais como corticoterapia, teraputica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenectomias, embora relacionadas
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como predisponentes, no h evidncia concreta de que realmente estejam associadas maior incidncia de infeco por anaerbios. COLETA DE MATERIAL As amostras devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se contaminem com bactrias anaerbias da flora normal. Por este motivo devem ser aspiradas com seringa, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. O material no pode ser colhido com zaragatoa (swab). Para evitar a contaminao pelos anaerbios da flora normal, no devem ser semeados escarro, secreo farngea ou nasal, secrees vaginais, fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre tm bactrias anaerbias. Idealmente, as bactrias anaerbias estritas so pesquisadas em lquidos aspirados de cavidades fechadas, material obtido por aspirao profunda de feridas, puno de traquia ou pulmonar e sangue para hemocultura. Em resumo, serve qualquer material que no esteja normalmente contaminado com as bactrias anaerbias da flora normal. TRANSPORTE DO MATERIAL O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. Obviamente que este transporte deve ser o mais rpido possvel. O melhor que a mesmo profissional que colheu leve imediatamente a seringa ao laboratrio. Tambm pode ser empregado, com este fim, um vidro do tipo de penicilina, que contm meio de tioglicolato de sdio ( 7 ml). O tioglicolato um sal redutor, de forma que no interior do meio existem condies de anaerobiose. A este meio lquido pode acrescentar uma pequena quantidade de gar (0,5%) para transform-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difuso de oxignio. O meio tem um indicador de oxigenao que a rezarsurina, de modo que se por algum motivo existe oxigenao do mesmo, o indicador adquire cor rosa. O material aspirado inoculado no interior do meio de cultura, atravs da tampa de borracha. Especial cuidado deve ter-se para no agitar o meio, antes e depois da inoculao, para evitar sua oxigenao. As amostras colhidas neste meio podem ser encaminhadas ao laboratrio vrias horas aps sua inoculao (at 24 horas). PROCESSAMENTO DO MATERIAL Sempre feita uma colorao de Gram e de esporos, quando necessrio, da amostra recebida, o que pode orientar o clnico para o diagnstico e a teraputica precoce. Por exemplo, a observao num processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos gram positivos, grandes esporulados, quase confirmao do diagnstico de Clostridium e de gangrena gasosa. A existncia de poucas ou muitas bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando o material vem numa seringa, a semeadura feita em tioglicolato e em placa. Quando o material j vem no meio de tioglicolato, feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.
PRODUO DE ANAEROBIOSE
Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias produtoras de patologia no ser humano. Por exemplo: Uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos.
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Cmaras anaerbias (glove box), nas quais o manipulador introduz somente as mos, sendo o ar eliminado, colocando-se uma mistura de gazes (H2, CO2, N2); nestas cmaras existem todos os elementos necessrios para o trabalho bacteriolgico, incluindo estufas de incubao. Sistema mais empregado o sistema das jarras de anaerobiose com geradores qumicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicao destas bactrias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados so os que provocam um consumo do oxignio com substncias redutoras como ferro reduzido ou cido ascrbico.
Dentro da jarra colocado, alm dos geradores qumicos, uma fita de papel filtro impregnada de azul de metileno, que um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies adequadas de anaerobiose, o azul de metileno altera para uma cor branca. Numa jarra de tamanho mdio 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e muitos tubos. Com estes sistemas o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%, em aproximadamente 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias esto presentes bem antes da transformao do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas. Observar uma jarra com placas semeadas, um gerador de anaerobiose sobre a ltima placa, e o indicador de anaerobiose reduzido de cor branca. Comparar esta cor com a cor azul do indicador nos geradores localizados fora da jarra em sua parte inferior.
Os mtodos citados acima do resultados semelhantes quanto eficcia do isolamento de bactrias anaerbias em amostras clnicas, porm, o sistema das jarras o mais prtico e menos complicado.
SEMEADURA EM PLACA
As amostras so semeadas em trs placas de gar sangue preparadas com gar Brucella, adicionadas com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas incubada a 37C em atmosfera aerbia, e uma segunda incubada a 37C em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactrias microaerfilas. Para este fim colocamos a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produzindo aproximadamente 5% de CO2. A terceira placa a que se inocula em atmosfera de anaerobiose. O meio de cultura desta terceira placa enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina K (10 mg/ml) e extrato de levedura (0,5%). Neste meio acrescenta-se tambm um antibitico aminoglicosdeo (geralmente amicacina, 100 mcg/ml). A adio do antibitico cria um meio seletivo porque os anaerbios estritos so resistentes a estes antimicrobianos e a maior parte das cepas de aerbios e anaerbios facultativos sensvel. Como a maior parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, este meio seletivo ajuda o isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaerbios. Estas placas so incubadas dentro da jarra a 37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser abertas aps 18 a 24 horas de incubao. Por outro lado, bactrias de crescimento mais lento, como os actinomices, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis. IDENTIFICAO BACTERIANA
Aps a incubao, as placas so examinadas e agora o passo mais importante a comprovao de que as bactrias desenvolvidas nas placas de anaerobiose so anaerbios estritos. Para este fim, so feitas coloraes de Gram, de todos os diferentes tipos de colnias observadas nas trs placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semea-se as diversas bactrias obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose.
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S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando, aps 24 a 48 horas da nova incubao, a bactria apenas crescer na placa de anaerobiose. O Gram das colnias j orienta para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado. Agrupamento das bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram Cocos Gram positivos Staphylococcus Peptostreptococcus Streptococcus Propionibacterium Bifidobacterium Actinomyces Eubacterium Lactobacillus Bacterides Fusobacterium Prevotella Porphyromonas Cocos Gram negativos Veillonella Acidaminococcus Megasphaera Clostridium
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Para o diagnstico diferencial das outras espcies de Clostridium devem ser feitas provas bioqumicas como hidrlise da gelatina, fermentao da glicose, lecitinase, lipase, produo de indol, uria, nitratos, e motilidade. Na presena de bacilos Gram positivos no esporulados recomendamos fazer a prova de catalase, reduo de nitratos, hidrlise de esculina, urease, e produo de pigmento. Para o diagnstico definitivo, deve ser feita a pesquisa da produo de cidos graxos. Se a colorao de Gram mostrar bacilos Gram negativos, recomendamos semear a colnia em gar sangue (Brucella gar), colocando um disco de Rifampicina (15 mcg) e um disco de Kanamicina (1.000 mcg); a bactria deve tambm ser semeada num meio que contm bile a 20%, e num meio rico em triptofano para determinar a produo de indol, com as placas incubadas por 48 horas a 37C. Estas provas junto com a produo de pigmento permitem fazer o diagnstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium. Frente aos discos de antibiticos, a bactria considerada sensvel se o halo de inibio de 12 mm ou maior; considerada resistente com halos menores de 12 mm. Como inculo para a semeadura utiliza-se uma suspenso com turvao semelhante ao nmero 3 de escala de MC Farland ou uma turvao semelhante aps incubao em meio de tioglicolato. A prova da bile considerada positiva, se existir crescimento bacteriano no quadrante respectivo. Para a produo de pigmento, recomendamos a observao direta das colnias, e, em caso de no existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta ( 360 nm de comprimento de onda). Colnias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo avermelhado. Para a prova de indol, recomendamos passar uma colnia, a partir do meio com triptofano, com ajuda de uma ala de platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em cido clordrico 10%). Uma reao positiva produz imediatamente uma cor azul. O diagnstico presuntivo feito de acordo seguinte tabela: Bacilos Gram negativos anaerbios estritos
Bactrias Rifampicin a 15 mcg sensvel sensvel sensvel sensvel Kanamicin a 1.000 mcg resistente resistente resistente sensvelresistente sensvel sensvel sensvel Bile 20% Indol Pigmento
neg + + neg
+ + neg
neg + +
Para Rifampicina e Kanamicina: Sensvel = halo de inibio com 12 mm ou mais de dimetro Resistente = ausncia de halo ou menor que 12 mm de dimetro.
A diferenciao dos gneros Prevotella e Porphyromonas realizada atravs da capacidade de fermentar glicose que positiva para o primeiro gnero e negativa para o segundo. Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o diagnstico das diferentes espcies de anaerbios utilizando numerosas provas bioqumicas. Algns utilizando a ao de enzimas bacterianas pr-formadas podem fazer este diagnstico aps 4 horas de incubao. Destes os mais freqentemente utilizados so:
API, Vitek e Microscan. Estes sistemas mais caros no so fundamentais para o diagnstico dos grupos bacterianos e para uma orientao teraputica adequada. Mod V - 76
Em algumas infeces importante, para o diagnstico, determinar a presena de toxinas como acontece nas infeces intestinais por Clostridium difficile. Esta determinao feita com provas sorolgicas disponveis comercialmente. PROVAS DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS O estudo da sensibilidade destas bactrias importante pelo aumento permanente de sua resistncia frente aos diferentes antimicrobianos. Esta resistncia mais comum nos gneros Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente tambm nos gneros Clostridium, Porphyromonas e Fusobacterium. Mtodo do Disco O mtodo do disco difuso no adequado para estudar a sensibilidade das bactrias anaerbias estritas. O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratories Standards) dos EUA recomenda um mtodo de diluio em gar: as concentraes de antimicrobianos so incorporadas no meio de Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentrao de um antimicrobiano. As bactrias so semeadas utilizando o inoculador mltiplo de Steers e as placas colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura feita aps 48 horas de incubao na estufa, determinando-se a CIM (concentrao inibitria mnima). Mtodo da Fita Um mtodo alternativo mais prtico a determinao da sensibilidade utilizando fitas de plstico impregnadas com um gradiente de concentrao de antimicrobianos como no mtodo do E test. As bactrias so semeadas em forma similar empregada no mtodo do disco para aerbios. So colocados duas fitas cada uma com um antibitico diferente em cada placa de 9 cm de dimetro. Em geral necessrio testar 6 antibiticos (3 placas). Os antimicrobianos com maior atividade in vitro e in vivo frente aos anaerbios estritos so: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina e amoxicilinanegcido clavulnico. As placas so incubadas dentro de jarra com gerador a 37 graus de temperatura. A leitura feita aps 48 horas de incubao, e a sensibilidade interpretada nos dois mtodos seguindo as tabelas publicadas pelo NCCLS. Salientamos que existe uma boa correlao nos resultados obtidos com as duas metodologias descritas.
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Cabe ao microbiologista elaborar um laudo claro e objetivo, facilitando a comunicao: Diretamente (telefone ou pessoalmente), indo ao encontro do clnico ou encorajando-o a procurar o laboratrio para discutir casos ou participar de reunies, visitas de enfermaria, etc. Elaborando manuais de coleta, informes sobre perfil de bactrias mais isoladas e padres de sensibilidade (por exemplo em hemoculturas, em urina, ferida cirrgica por especialidade, etc.). Esclarecendo novos padres de relatrios, novos agentes, seu potencial patognico, mudanas de padres (p. Ex. de antibiograma), disponibilidade de recursos diagnstico e orientao teraputica (ex. E-test, testes rpidos com ltex para pesquisa de antgenos, etc.). Microbiologista deve ter em mente os principais agentes etiolgicos correspondentes a cada material enviado, bem como da respectiva flora normal, para adequada interpretao do resultado. Cabe ao microbiologista como membro nato da Comisso de controle de infeco hospitalar: Tomar iniciativa de procurar o mdico ou o paciente para esclarecer dvidas sobre exames e materiais. Estimular e envolver a enfermeira e o infectologista da CCIH ou clnico para a comunicao rpida dos resultados de bactrias resistentes, dos exames relacionados com diagnstico de infeco hospitalar, dos exames de urgncia como de LCR, hemocultura, etc., do diagnstico de doenas de notificao compulsria ou que exijam isolamento, etc. Em resumo, mais do que um retrato do crescimento nas placas de Petri, o laudo microbiolgico deve ser o resultado de uma leitura interpretativa e crtica utilizado como um instrumento de comunicao e interao entre o laboratrio de microbiologia e o mdico.
ANLISE MICROBIOLGICA
O microbiologista na sua rotina diria para decidir a importncia das bactrias ou fungos isolados deve considerar o potencial patognico do agente, a bacterioscopia e o pedido mdico. Bactrias como S. pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Mycobacterium tuberculosis, independente do material que foram isoladas so de importncia clinica e epidemiolgica. Bactrias como Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae, se forem isolado no LCR ou sangue so de importncia indiscutvel, mas quando isolados em mucosas costumam representar flora e seu relato discutvel.
Estudos quantitativos so sempre que possvel mais teis que exames qualitativos, usando ou diluio do material ou semeando com ala calibrada Relatrio quantitativo de bacterioscopia: nmero mdio de bactrias anotadas no mnimo em 10 campos observados. Relatrio qualitativo de bacterioscopia quantificando a presena de: do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e
grupos morfolgicos de bactrias (cocos/bacilos/ Gram positivos ou negativos) e predomnio; quando o microbiologista for experiente recomenda-se adicionar o comentrio sugestivo de pneumococo ou haemophilus, etc. bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) fungos leveduriformes em brotamento e hifas, etc.
Finalmente a discusso sobre os materiais provenientes de tecido cutneo-mucosos, o que devemos relatar com antibiograma e o que entender como flora so muito relativos, no havendo unnimidade para padres definitivos de relatrios. sempre conveniente entender que as sugestes que se seguem esto sujeitas a revises conceituais, atualizaes e pequenas adaptaes locais. Como microbiologia uma soma de evidncias (microbiolgicas, clnicas, epidemiolgicas), torna-se impossvel esgotar todas as possibilidades. O que pode e deve ser feito buscar traar linhas mestras para a orientao do raciocnio, deixando que cada caso seja analisado como um exerccio constante do bom senso e cientificamente embasado. Relatrio quantitativo de exame microscpico pela colorao de Gram
Descritivo Classificao nmerica 0 + ++ +++ ++++ Nr. mdio de bactrias, clulas epiteliais, leveduras, neutrfilos /campo 1.000x 0 1-5 6-15 16-30 >30
OROFARINGE
importante relatar os achados de bacterioscopia do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e quantificando a presena de: Clulas epiteliais Polimorfonucleares (neutrfilos) e/ou mononucleares (linfcitos) Principais grupos morfolgicos de bactrias Presena de bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) Presena de fungos leveduriformes / hifas Associao fuso-espirilar, quando presente Patgenos a serem relatados em isolados de cultura: Streptococcus pyogenes (beta hemoltico do grupo A) Arcanobacterium haemolyticum Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae
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No caso da Corynebacterium diphtheriae quando solicitado, realizar ou encaminhar para Laboratrio de Referncia: Resultado sem patgenos: Presena de bactrias da microbiota da orofaringe No caso de paciente imunossuprimido, quando solicitado, cultura de vigilncia e se houver predominncia de bactria ou fungo, relatar predomnio de: P. aerginosa, Candida spp., S. aureus, Enterococcus spp., etc.; nestes casos o antibiograma ser feito apenas quando solicitado pela CCIH. Obs: Embora seja um tema polmico na literatura e na prtica microbiolgica, relatar o isolamento de pneumococo, Haemophilus, N. meningitidis, Moraxella catarrhalis em orofaringe, nos casos em que: a bacterioscopia revelar predomnio de neutrfilos (ressalva em imunossuprimidos), presena do agente em neutrfilos/macrfagos e crescimento abundante (ntido predomnio) em relao ao restante da microbiota. a pedido mdico, colocar a seguinte observao: A(s) bactria(s) isolada(s) fazem parte da microbita da orofaringe, no sendo recomendvel uso de antimicrobianos. Consultar infectologista para orientao.
SWAB NASAL
O swab nasal ou de nasofaringe no tem valor diagnstico para sinusite, otite ou infeces do trato respiratrio inferior, no devendo ser processada para estes fins. Pode ser til apenas para pesquisar portadores de S. aureus e Streptococcus pyogenes (beta hemolitico do grupo A).
EPIGLOTE/NASOFARINGE
No caso de epiglotite, no material de nasofaringe ou do local, podem ser isolados o Haemophilus influenzae, o pneumococo e o Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus como agente etiolgico. No caso de coqueluche deve-se pesquisar a Bordetella pertussis. Relatar o resultado positivo ou negativo para Haemophilus influenzae, pneumococo, Streptococcus pyogenes, S. aureus e Bordetella pertussis quando pesquisados.
SEIOS DA FACE
Culturas de aspirados intra-operatrios ou obtidas por puno devem ser relatadas: Bacterioscopia - relato quantitativo de bactrias, fungos, neutrfilos e clulas epiteliais. Cultura dos agentes isolados e se houver predomnio de algum (so esperados o pneumococo, H. influenzae, M. catarrhalis, Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus). Caso seja sugestivo de contaminao com secreo de nasofaringe (muitas clulas epiteliais, poucos neutrfilos) relatar: sugestivo de contaminao com microbiota de nasofaringe. aconselhavel em sinusite subaguda e crnica a cultura para anaerbios. Quando realizada relatar o resultado. Quando no realizada, comparar a bacterioscopia com o resultado da cultura e relatar sobre a possibilidade de participao de bactrias anaerbias (observadas no Gram, mas que no crescem em aerobiose). A rino-sinusite infecciosa aguda e no complicada na maioria das vezes de etiologia viral. Ressaltando-se os seguintes casos: Em imunossuprimidos e diabticos valorizar o achado de fungos filamentosos do tipo Aspergillus spp. Em pacientes com entubao nasotraqueal ou nasogstrica > que 48h, o material pode revelar presena de enterobactrias, bactrias no fermentadoras, S. aureus, leveduras e polimicrobiana. Devem ser relatados, mas para serem valorizados deve haver clnica ou evidncia radiolgica e material representativo.
OUVIDO
Otite externa: relatar o resultado da bacterioscopia e fazer identificao e antibiograma caso a bacterioscopia de respaldo (abundantes neutrfilos e predomnio do tipo morfolgico isolado na cultura de potencial patgeno) ao isolamento de uma enterobactria ou Pseudomonas ou eventualmente fungo. Mod V - 80
Otite mdia:
Culturas de materiais obtidos por timpanocentese (miringotomia) so ideais, mas raros e devem ser relatados os achados de bacterioscopia e cultura. Swabs, ou aspirados de conduto auditivo em membranas previamente rompidas tem pouco ou nenhum valor diagnstico. Sugerir no coletar este tipo de material. Quando realizada a cultura, havendo crescimento de bactrias da microbiota (Gram positivos, Neisserias, enterobactrias, etc.) relatar: presena de bactrias da flora do conduto externo. No caso da bacterioscopia revelar predomnio de um tipo morfolgico, com abundantes neutrfilos e predomnio na cultura de um agente, relatar: microscopia do esfregao corado pelo Gram com relatrio quantitativo dos elementos celulares (clulas, bactrias e neutrfilos) e qualitativa. Resultado da cultura, quando o agente isolado for Haemophilus, Pneumococo ou M. catarrhalis, relatar o agente isolado e o antibiograma Quando o agente for uma enterobacteria ou Pseudomonas relatar que a bactria isolada sugestiva de contaminao, exceto se for em paciente com entubao nasotraqueal h mais de 48h. A pedido mdico fazer antibiograma. No caso de mastoidite a indicao obteno cirrgica de fragmentos sseos para cultivo e no cultura de secreo de ouvido externo/mdio. Poder se relatado o cultivo deste material quando a bacterioscopia for concordante e a bactria isolada for: Aguda: Haemophilus, pneumococo, S. pyogenes e S. aureus fazer antibiograma Crnica: Enterobactrias, Pseudomonas, S. aureus. Quando isolar Staphylococus coagulase negativa, S. viridans, Corynebactrias, etc, em flora mista, relatar: presena de bactrias da flora do conduto auditivo externo e no fazer antibiograma.
LAUDO PARA ESCARRO O escarro til para diagnstico de tuberculose e para os agentes de algumas micoses pulmonares (blastomicose sul-americana, histoplasmose, criptococose). Pode ser valorizado o agente isolado quando houver correspondncia na bacterioscopia e quando houver poucas clulas epiteliais e numerosos leuccitos. Quando a bacterioscopia revelar mais de 10 clulas epiteliais por campo de pequeno aumento (objetiva de 10x), havendo predomnio sobre leuccitos e sem um tipo morfolgico predominante, relatar: material com sugestiva contaminao de flora de orofaringe. Exame de valor diagnstico prejudicado. No processar o material e solicitar nova amostra. Processar o material que revele menos de 10 clulas epiteliais, quando houver predomnio de leuccitos e predomnio de um tipo morfolgico de bactria. Este critrio mais rigoroso, pois o anterior, para mais de 25 clulas epiteliais, revelou ser mais fidedigno. Os agentes bacterianos esperados em pneumonia aguda da comunidade so: S. pneumoniae, M. catarrhalis, H. influenzae e S. aureus. LAUDO PARA SECREO ENDOTRAQUEAL, LAVADO TRAQUEAL, E LAVADO BRNQUICO
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Observar ao Gram (imerso) a presena de bactrias intracelulares que devem ser reportadas caso ultrapassem 7%. Verificar a presena de clulas estratificadas epiteliais. Mais de 1 clula para cada 10 leuccitos ou mais de 10 clulas em campo de pequeno aumento contra indicam a realizao de cultura, e portanto reportar como Material Inadequado. Confeccionar tambm lminas para colorao de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessrio. Plaquear volume de 1 l (ala calibrada) em meios de Mac Conkey, MN, gar Sangue e gar Chocolate (atmosfera CO2). Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1 C e realizar a primeira leitura quantitativa. Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. Multiplicar o nmero de cada tipo de colnia identificada pelo fator 103. Interpretar como significativo as contagens > 105 UFC do lavado brnquico, escarro ou secreo traqueal. Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para microrganismos em contagens inferiores a 105 UFC.
RELATRIO
Quando usar tcnica qualitativa: Quando o material for adequado, mas mais de trs bactrias isoladas, sem predomnio, relatar microbiota mista, presena de (nmero) Gram positivos e (nmero) de Gram negativos. No fazer antibiograma e guardar a placa por sete dias. Quando houver predomnio de uma bactria relatar: predomnio do agente e antibiograma. Presena de outros microrganismos: Gram positivos e/ou Gram negativos, no mximo identificados a nvel de gnero, sem antibiograma. Quando usar tcnica quantitativa: Se houver contagem significativa, com predomnio de um microrganismo e eventualmente 2, relatar o(s) agente(s) isolado(s) e fazer antibiograma. Se a contagem no for significativa ou vrias bactrias da microbiota do trato respiratrio superior foram isoladas relatar: presena de bactrias da flora do trato respiratrio superior sem valor diagnstico. No identificar nem fazer antibiograma. LAUDO PARA LAVADO BROCOALVEOLAR OU ESCOVADO BRNQUICO So considerados junto com a bipsia pulmonar os materiais de melhor valor preditivo de isolamento do agente patognico. imprescindvel a semeadura quantitativa para posterior contagem do nmero de colnias.
Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. Multiplicar a contagem dos tipos de colnias identificadas pelo fator, de acordo com o volume plaqueado. Multiplicar pelo fator 102 quando o volume plaqueado foi 10 l. Multiplicar pelo fator 103 quando o volume plaqueado foi 1l. Quando for conhecido o valor de soluo fisiolgica utilizado na tcnica do BAL, deve-se consideralo como mais um fator de correo. Por exemplo: se forem utilizados 10, 20 ou 100 ml; multiplicar por 10, 20 ou 100, respectivamente. Interpretar como significativo para o diagnstico de pneumonia contagens: 301 UFC para Escovado Brnquico Protegido 401 UFC para BAL Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para os microrganismos em contagens inferiores significativa. Exemplo de clculo: Cultura quantitativa de BAL, colhido com 10 ml de soluo fisiolgica estril, apresentou crescimento de 80 colonias de Pseudomonas aeruginosa com a ala de 10 L e 8 com a ala de 1 L, alm de 5 colonias de Streptococcus viridans apenas na semeadura com 10 L. Clculo: Pseudomonas aeruginosa
10 (sol. Fisiolgica) x 80 (no de colnias) x 100 (ala de 10L) = 80.000 (ou 8.104 UFC/ml) 10 (sol. Fisiolgica) x 8 (no de col.) x 1000 (ala de 1L)= 80.000 (ou 8.104 UFC/ml)
Streptococcus viridans
10 (sol. Fisiolgica) x 5 (no de col.) x 100 (ala de 10 L) = 5.000 (ou 5.103 UFC/ml)
Relatar: Pseudomonas aeruginosa - 8.104 UFC/ml / com antibiograma Streptococcus viridans - 5.103 UFC/ml / sem antibiograma
RELATRIO DA BACTERIOSCOPIA
Descrever os achados da bacterioscopia do centrifugado, lembrando que ser melhor quando feita em citocentrfuga. Relatar: Relao clulas epiteliais/neutrfilos. Descrever presena de bactrias e, particularmente, se houver presena de microrganismos fagocitados, quanto ao seu padro morfo-tintorial (forma e reao ao gram) e se h predomnio de algum tipo.
RELATRIO DA CULTURA
Culturas quantitativas de amostras do trato respiratrio inferior, relatar: Contagem final do(s) microrganismo(s) isolado(s) Quando isolar um ou at dois microrganismos em contagens significativas (vide parmetros), fazer antibiograma Comentar: contagem bacteriana significativa bom valor preditivo de infeco se a clnica for concordante.
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Quando as contagens no forem significativas ou mais de dois microrganismos isolados e bacterioscopia com predomnio de clulas epiteliais sobre os leuccitos, relatar: Presena de bactrias do trato respiratrio superior - sem valor diagnstico. Contagens bacterianas consideradas significativas Escarro, aspirado endotraqueal, lavado brnquico Escovado brnquico protegido Lavado broncoalveolar (BAL) = = = 105 106 Ufc/ml 103 Ufc/ml 104 Ufc/ml
uma suspenso do swab em salina e centrifugado em cito-centrfuga. No entanto comum a bacterioscopia ser inconclusiva, tanto pela dificuldade de caracterizar a bactria como pelas outras etiologias (viral, Chlamydia trachomatis, alrgica, qumica, uso prvio de colrios com antibiticos, etc.). Infeces de glndula lacrimal, ordolo e blefarite podem involver amostras de S. aureus. Conjuntivite bacteriana pode ser atribuda N. gonorrhoeae em recm-nascidos. A presena de S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus so outras possibilidades etiolgicas. Isolamento de bactrias como S. aureus ou os outros agentes relacionados, concordantes ou no com a bacterioscopia, desde que no descrito como rarssimas colnias, deve ser relatado e realizado o antibiograma. lcera de crnea pode envolver P. aeruginosa e outros oportunistas inclusive protozorios (Acanthamoeba). Cautela no caso de isolamento de Neisserias saprofitas, Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. e outros potenciais habitantes de mucosas. Comparar sempre o resultado da bacterioscopia, com a quantidade de bactrias isoladas, se houve crescimento puro ou quase puro. Relatar: cultura positiva para bactria da microbiota de mucosas sem valor diagnstico. Sugerir nova coleta. Endoftalmite envolve bactrias potencialmente patognicas como S. aureus, P. aeruginosa, pneumococo, Haemophilus spp., N. meningitidis, e outros agentes relacionados a fatores predisponentes como imunossupresso, diabetes, trauma, cirurgia, endocardite, bacteremia, etc. O material dever ser obtido por puno e evitar contaminao. Eventualmente anaerbios e fungos podem estar presentes. O exame microscpico poder ajudar a evidenciar o agente e orientar o meio de cultura mais adequado ou apenas o resultado da cultura poder revelar o agente, que poder ser um dos listados acima. No caso de potenciais contaminantes que crescem em pequena quantidade, sem respaldo da bacterioscopia, identificar o agente e relatar: bacteria da flora de mucosas, papel patognico duvidoso. Guardar a bactria por sete dias para eventual teste de sensibilidade. LAUDO PARA LQUIDO CFALO RAQUIDIANO (LCR) Os agentes clssicos das meningites devem ser relatados bem o antibiograma. A bacterioscopia pode ser relatada sem resultado positivo de cultura quando o microbiologista sentir confiana no diagnstico. No caso de isolamento na cultura de potenciais contaminantes de pele, em caso de meningite bacteriana sem fator predisponente (imunossupresso, cirurgia, etc) e bacterioscopia discordante ou negativa, relatar: O agente isolado com o comentrio: potencial contaminante de coleta. O antibiograma ser realizado apenas a pedido mdico. No cultivar LCR em caldo de cultura, pois aumenta muito a chance de isolamento de contaminantes. LCR obtido pelo shunt: a maioria das infeces em pacientes com shunts, ou derivaes so bactrias da flora cutnea como Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. , Neisserias saprofitas e Acinetobacter spp. Neste caso devem ser considerados e relatados. Eventualmente Propionibacterium spp. podem estar envolvidos. Na dvida solicitar novo material para confirmao. Bactria que cresce no caldo e no cresce no gar, se no for fastidioso ou anaerbio em geral contaminante. LAUDO PARA FEZES Os potenciais agentes de diarria so muitos. laboratrio deve listar apenas os agentes pesquisados na sua rotina ou quando especificado pelo clnico relatar o resultado sobre os agentes solicitados. Relatar: Cultura negativa para os seguintes enteropatgenos pesquisados: E. coli clssica, E. coli invasora, E. coli O 147 EHEC, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp. (opcional), Plesiomonas shigelloides (opcional).
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Relatar pesquisa de leuccitos quando realizada pois d suporte a infeces por Salmonella, Shigella e Campylobacter. No caso de realizar cultura para Campylobacter de rotina, inclu-lo no relatrio. Lembrar que diarria/enterocolite em pacientes com mais de 3 dias de hospitalizao e fazendo uso de antimicrobianos pode ser Clostridium difficile, devendo pesquisar a toxina com kits especficos. Diarria com mais de 7 dias de durao em imunocomprometidos pode ser por parasitas (Giardia, Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora belli e em paciente com HIV, complexo do Mycobacterium avium. LAUDO PARA PELE, ABSCESSOS E FERIDAS Abscesso tecido subcutneo Abscesso cerebral Abscesso intranegabdominal Embora sejam os trs materiais abscesso, o microbiologista deve ter em mente expectativa de isolamento de diferentes agentes. Os abscessos fechado e puncionados com tcnica assptica so considerados materiais de bom valor preditivo diagnstico quando revelam bactrias ou fungos. Deve-se, portanto, orientar o mdico para obter material nas melhores condies de assepsia possvel. Encaminhar rapidamente o material para o laboratrio. Para abscessos considerar a possvel participao de anaerbios estritos ou microaerfilos. Quando disponvel fornecer meio de transporte adequado ou orientar para enviar o material na seringa sem agulha. Fazer lmina para bacterioscopia, e, se indicado, exame direto com KOH 10% para pesquisa de fungos, asssim como pesquisa de BAAR para micobactrias. Nos abscessos de tecido subcutneo e cerebral a bacterioscopia pode dar orientao til para escolha dos meios de semeadura ou ajudar no resultado. S. aureus a causa mais importante em abcesso subcutneo, mas em caso de associao com mordida, os fastidiosos devem ser lembrados. No caso de abscesso cerebral, o diagnstico correto e rpido de extrema valia. O exame microscpico pode ser muito til se revelar algum agente. Pode haver participao dos mais variados agentes como bactrias comuns, fastidiosos, fungos, nocardia, micobactrias, etc. Devese procurar semear no maior nmero de meios diferentes, inclusive em caldo tioglicolato. No caso de abscesso abdominal a associao de enterobactrias com anaerbios esperada. Dependendo da histria clnica lembrar de Salmonella e Yersinia. No caso de abscesso de tecido subcutneo o resultado ideal quando concordante com a bacterioscopia e revelando agente potencialmente patognico. O S. aureus e Streptococcus beta hemolticos causam mais celulite, mas podem ser isolados em abscessos, sendo as enterobactrias raras. No caso da cultura revelar bactrias da microbiota, mas concordante com a bacterioscopia (S. viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc,); liberar o resultado com o antibiograma. No caso de bacterioscopia negativa ou discordante e, principalmente em abscesso drenando h alguns dias, liberar o resultado fazendo restries sobre a possibilidade de contaminao; a bactria isolada possivelmente representa contaminao pela microbiota da pele, assim, guardar a bactria por sete dias e no fazer o antibiograma. No caso de abscesso cerebral se o exame microscpico revelar possvel agente, o clnico deve ser imediatamente comunicado e informado do andamento dos exames de cultura. Tanto bactrias potencialmente patognicas como possveis contaminantes de pele ou mucosas podem ser isoladas, mas o clnico deve estar informado e o teste de sensibilidade poder ser feito de qualquer destas bactrias.
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Os abscessos abdominais polimicrobianos da comunidade em geral respondem teraputica emprica e no exigem a identificao de todas as bactrias anerbias facultativas e anaerbias estritas. Importante relatar quando isolar enterococcus ou enteropatgenos ou bactrias no comuns ou nos casos de insucesso teraputico; indica-se identificar os agentes isolados e fazer o antibiograma.
D respaldo a possibilidade de isolamento de agente patognico quando so atendidos os seguintes requisitos: Coleta bem feita. Bacterioscopia concordante com a cultura e Ocorrem muitas colnias de uma mesma bactria, isoladas em cultura pura ou em ntido predomnio.
FERIDA CIRRGICA
So esperadas bactrias endgenas ou tipicamente de origem hospitalar (Enterobacterias, S. aureus, Pseudomonas, etc). Para o relatrio de cultura e indicao de antibiograma deve-se contar com coleta bem feita, e os resultados devem ser comunicados a CCIH. Neste caso infeces polimicrobianas so comuns, devendo-se considerar os gneros predominantes. Deve-se guardar as cepas isoladas por perodo maior (mnimo 30 dias) para eventual investigao de surto e fazer antibiograma com ateno para pesquisa de bactrias multiresistentes.
DRENO / FSTULA
So materiais que no deveriam ser coletados, pois na maioria das vezes representam colonizao dos drenos. Mesmo fstulas de osteomielite no so adequadas. Nos casos em que a bactria encontrada j tenha sido isolada de procedimento com menor risco de contaminao (bipsia, puno, etc.) e persiste, relatar o achado e fazer antibiograma. Para os demais casos relatar os gneros que predominaram na cultura, sem antibiograma e que representam possvel contaminao. Guardar as bactrias por sete dias. Considerar que fstulas expontneas podem revelar presena de micobacteriose, micoses, actinomicose, etc.
BIPSIA
As bipsias devem seguir critrios cirrgicos de antissepsia. Assim representam material de bom valor preditivo diagnstico. O material dever em condies asspticas ser triturado em gral e semeado qualitativa e quantitativamente para posterior clculo aproximado do contedo bacteriano por grama de material. Utilizam-se as seguintes amostras: tecido, material de queimadura, material sseo. Condies que do segurana para liberao do resultado e antibiograma:
Condies adequadas de coleta, transporte e processamento preliminar. Bacterioscopia concordante com achados de cultura. Cultura pura ou predomnio de algum germe em particular. Contagens >104 UFC/g tecido
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Culturas polimicrobianas Isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa (Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, corineformes, Neisseria spp., etc) Baixas contagens < 104 UFC/g de tecido; relatar o(s) agente(s) isolado(s), sua contagem sem antibiograma e guardar a(s) bactria(s) por sete dias.
GNGLIO
O gnglio quando infectado pode revelar agentes importantes de doenas localizadas ou sistmicas, de origem: bacteriana (incluindo os fastidiosos), raramente anaerbios; e micobacteriose, fungos, protozorios e vrus. Cabe ao laboratrio aproveitar ao mximo. Uma parte ser enviada para estudo histolgico e o restante do material dever ser triturado e realizado exame microscpico (Gram, direto com KOH 10%, Giemsa) e culturas para bactrias (em meios ricos), fungos e micobactrias; caldo BHI com suplemento (pode ser o balo de hemocultura) e tioglicolato com suplemento. Procurar identificar o gnero e espcie com segurana e na dvida encaminhar a laboratrio de referncia. No caso de isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa e sem correlao com a bacterioscopia relatar o achado sem antibiograma e guardar a bactria por sete dias. Contactar o clnico e o patologista, e se persistir a suspeita de etiologia bacteriana, quando possvel, solicitar nova amostra. LAUDO PARA GENITAL
URETRAL
Os principais agentes etiolgicos das uretrites esto bem estabelecidos: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma spp. Ureaplasma spp. Herpes simplex (vrus) Colher sempre lmina para bacterioscopia: Trichomonas: colher urina e centrifugar para fazer pesquisa no sedimento imediatamente aps a coleta. Chlamydia: o diagnstico melhor imunolgico (Imunofluorescncia) Mycoplasma e Ureaplasma: existem meios especficos e kits muito prticos com cultura semiquantitativa por avaliao visual de mudana de cor. No resultado da cultura importante comparar com a bacterioscopia e estar alerta para no dar falsos resultados de N. gonorrhoeae confundindo com Neisserias saprfitas e Acinetobacter. Quando isolar Staphylococcus coagulase negativo ou outras bactrias da flora genital relatar: Presena de bactrias da flora genital, no fazer antibiograma. Sugerir, quando no realizado, a pesquisa de Chlamydia e Micoplasma. Quando isolar enterobactrias, Enterococcus em cultura pura ou em grande quantidade e for concordante com a bacterioscopia, relatar o isolamento com antibiograma e concluir: Bacteria raramente isolada como agente de uretrite; sugerimos investigar outras causas como Chlamydia, Micoplasmas, Trichomonas etc. Mais raramente: Trichomonas vaginalis Haemophilus spp. outros
VAGINAL
As principais causas de vaginite so: vaginose, Candida spp. e Trichomonas vaginalis. Em meninas e pacientes na menopausa ou deficientes hormonais, enterobactrias, S. aureus e mesmo bactrias da flora podem eventualmente estar relacionadas com a sintomatologia. A bacterioscopia sempre til para observar: Mod V - 88
presena de leveduras presena e quantidade de neutrfilos presena e predomnio de bactrias presena de Gardnerella spp. e Mobiluncus spp., e outros anaerbios que caracterizam a vaginose, associados s clue cells (clulas caractersticas do epitlio vaginal abarrotadas de bactrias). A bacterioscopia tambm til: Quando isolar Candida spp. e for caso de doena recidivante interessante (quando disponvel) a identificao de espcie, podendo ser necessrio tambm o teste de sensibilidade (mais fidedigno e prtico) Quando isolar Streptococcus beta hemoltico do grupo A, Streptococcus agalactiae , enterococos, Listeria spp. Quando a bacterioscopia for normal, com raros neutrfilos, presena de clulas epitelias e bacilos de Doderlein, e houver crescimento de raros Gram positivos e/ou raras enterobactria, relatar: Presena de bactrias da flora vaginal normal Se isolar numerosas colnias de enterobactrias ou S. aureus e a bacteriocopia sugerir alterao de flora, relatar: Presena de bactrias da flora vaginal com predomnio de: por exemplo, E. coli, Enterococcus spp, S. aureus, etc.
ENDOCERVICAL
A cultura de secreo endocervical pode ser til para isolamento de N. gonorrhoeae quando houver suspeita. Deve-se recomendar a pesquisa de Chlamydia trachomatis nos casos de cervicite. O isolamento de enterobactrias, enterococcus, etc. pode significar alterao de microbiota por diferentes causas, mas o achado deve ser relatado, para considerao do mdico. No caso da bacterioscopia revelar presena de freqentes, numerosos ou incontveis neutrfilos (++ a ++++) e presena de bactrias com a morfologia e Gram concordantes com as bactrias encontradas na cultura, relatar: Alterao da flora endocervical/vaginal com a presena das bactrias isoladas com antibiograma - lembrando que outras causas devem ser investigadas e/ou afastadas antes de iniciar o tratamento especfico No caso de material endometrial e amnitico, fazer cultura para anaerbios e bacterioscopia. No caso de no realizar cultura para anaerbios, relatar a bacterioscopia e o resultado da cultura. Destacar a possibilidade de anaerbios se visualizar bactrias no Gram sem correspondente crescimento.
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Identificar ao nvel de espcie. Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). Solicitar nova amostra para confirmao.
Descreva o microrganismo presente entre 104 e 105 UFC/ml, com base na morfologia. Entre em contato com o paciente e/ou mdico. Solicite informaes e/ou a coleta de nova amostra. Caso o contato no seja possvel, mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para possvel retomada de identificao, se requerido pelo mdico do paciente.
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Fornecer uma descrio dos tipos morfolgicos. Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura.
Contagem de colnias <104 UFC/ml: Para pacientes sob antibioticoterapia, mulheres sintomticas, homens sintomticos, realizar identificao e teste de sensibilidade. Para todos os outros pacientes, fornea uma descrio do(s) tipo(s) morfolgico(s) presente(s) e requeira nova amostra. Mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para se necessrio retomar o processamento de identificao se requerido pelo mdico do paciente. Obs.: Uroculturas com candida provenientes de pacientes sondados so utilizadas como critrio para a troca da sonda. Sugere-se nova coleta de urocultura aps 24 horas. Caso o isolamento de Candida seja mantido, deve-se relatar, pois poder haver necessidade de instituir terapia especfica.
OBSERVAES
No realizar cultura de ponta de sonda vesical. Critrio de positividade pode ser aplicado sempre que isolar 105 UFC/ml de um s agente, devendo a presena de sintomas caracterizar a infeco do trato urinrio e a ausncia como bacteriria assintomtica. Realize pesquisa para anaerbios somente em punes supra-pbicas, quando solicitado. No realize de rotina o teste de sensibilidade diretamente da amostra de urina, embora em situaes de urgncia da disponibilidade do antibiograma isto possa ser feito. Em caso de dvida na interpretao da urocultura, se possvel, entre em contato com o paciente e/ou mdico para maiores informaes, conferindo as condies de coleta. Isto no sendo possvel, relate o numero de diferentes microrganismos encontrados e sua contagem e solicite nova amostra. Mod V - 91
LAUDO PARA SANGUE Em caso de bacteremia, septicemia, ou febre a esclarecer, deve-se sempre que possvel colher duas amostras de sangue venoso (perifrico) de locais diferentes. Se o paciente tiver cateter, colher mais uma amostra obtida do cateter. Bactrias isoladas no sangue perifrico do tipo S. aureus, Streptococcus pneumoniae, enterobactrias, P. aeruginosa e Candida albicans, tem elevado valor preditivo de infeco. Enterococos tem significncia clnica em 80% dos casos Streptococcus viridans entre 40 a 60%:
1 cultura positiva em duas obtidas muito provvel uma contaminao 2 ou mais culturas positivas muito provvel a infeco 1 colhida e positiva. Colher nova amostra 2 amostras colhidas e positivas verificar se so da mesma espcie ou se tem mesmo antibiograma. Se diferirem na espcie e/ou nitidamente no antibiograma provvel que houve contaminao de coleta. No liberar antibiograma. 2 amostras colhidas e 1 positiva solicitar nova amostra provvel contaminao. No fazer antibiograma. 2 amostras colhidas e identificadas como da mesma espcie e com mesmo antibiograma Liberar resultado da cultura e antibiograma e destacar: Bactria da flora cutnea. Instituir tratamento especfico se evidncias clnicas de infeco. Se o paciente estiver com cateter, possvel colonizao.
Outras bactrias isoladas de em uma nica amostra e sugestivas de contaminao: Micrococcus spp., corineformes, Propionibacterium spp., Bacillus spp. Hemoculturas positivas e repetidas para bactrias potencialmente contaminantes podem ser consideradas patognicas quando afastada a contaminao por cateter. Considerar a hiptese de endocardite. Quando houver suspeita de fastidiosos ou fungos ou micobactrias conservar as hemoculturas por 30 a 40 dias. Relao entre idade e volume ideal de sangue a ser coletado
Idade < 1 ms 1 ms a 2 anos > 2 anos a 10 anos Adolescente Adulto volume 1-2 ml 2-3 ml 3-5 ml 10-20 ml 40 ml
PONTA DE CATETER
Fazer cultura qualitativa no se justifica para diagnstico de bacteremia. Deve-se relatar o nmero de colnias isoladas e a(s) bactrias isolada(s) pela tcnica semi-quantitativa de Maki. Quando maior que 15 colnias, identificar, mas no fazer antibiograma. Se a hemocultura for positiva fazer antibiograma da hemocultura. No caso de bacteremia, a remoo do cateter e envio da ponta para cultura se justifica quando a amostra de hemocultura for colhida no prazo de 24 h. Considerando que a colonizao de cateter muito comum, se no houver bacteremia no se se justifica identificar bactrias do cateter e fazer antibiograma, exceto se houver indicao de monitoramento dos cateteres pela CCIH. Caso a hemocultura seja negativa, no se justifica trabalhar com bactrias do cateter. As tcnicas de investigao de contaminao da luz do cateter justificam-se quando se deseja descobrir fonte de bacteremia, fungemia, abscessos em mltiplos orgos, etc.
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4.
5. 6. 7. 8. 9.
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Mod V - 93
Mdulo VI
NDICE 1. Introduo............................................................................................................................1 2. Coleta de amostras ...............................................................................................................2 Amostras respiratrias .............................................................................................................. 2 Sangue ................................................................................................................................... 2 Urina ...................................................................................................................................... 3 Fezes...................................................................................................................................... 3 Bipsias ou amostras de tecido................................................................................................... 3 Lavado gstrico........................................................................................................................ 3 Outros materiais: medula ssea, lquor, lquido pleural .................................................................. 4 3. Processamento de amostras .................................................................................................5 Exame microscpico e colorao ................................................................................................. 5 Mtodos para tratamento das amostras para cultura...................................................................... 7 4. Cultura para isolamento de micobactrias ..........................................................................10 Meios slidos ......................................................................................................................... 10 Meios Lquidos ....................................................................................................................... 10 Controle de Qualidade ............................................................................................................. 12 5. Identificao das diferentes espcies de micobactrias......................................................14 Testes bioqumicos tradicionais................................................................................................. 14 Testes automatizados e moleculares para identificao ................................................................ 20 6. Anexos................................................................................................................................ 24 7. Referncias Bibliogrficas................................................................................................... 27
1. INTRODUO
Com a crescente preocupao mundial com a tuberculose, os laboratrios de Microbiologia tm sido cada vez mas exigidos em relao rapidez do diagnstico. Um nmero maior de amostras processado no laboratrio para realizar este diagnstico, exigindo que medidas de segurana sejam tomadas e que os tcnicos tenham um treinamento adequado nessas tcnicas. Uma variedade de tcnicas est sendo implantada nos laboratrios para acelerar o diagnstico, mas as tcnicas convencionais ainda ocupam um espao importante na rotina laboratorial. Um importante evento mudou um pouco a viso do que era necessrio para o diagnstico em termos laboratoriais, que foi o aparecimento da AIDS. O perfil de sensibilidade das cepas de M. tuberculosis passou a ter um papel extremamente importante para o clnico j que a sensibilidade s drogas tradicionais tinha sofrido algumas mudanas o que ocasionava srias dificuldades no tratamento. Alm do aparecimento de cepas multi-resistentes de M. tuberculosis, aparecerem as infeces por outras espcies de micobactrias nestes pacientes, levando a quadros graves (como por exemplo M. avium). Diante deste fato os laboratrios necessitam estar sempre atualizados. Nos captulos adiante citamos alguns dos procedimentos mais utilizados para o diagnstico das infeces por micobactrias. Manipulao do material clnico Uma parte importante que deve ser considerada pelo laboratrio quando trabalhando com micobactrias, a segurana empregada na manipulao do material clnico destas cepas. grande o nmero de casos de tcnicos infectados devido ao descaso dos laboratrios com a manipulao deste tipo de patgeno. Algumas medidas mnimas devem ser tomadas quando o laboratrio vai no intuito de diagnosticar este agente. Se o laboratrio for realizar apenas a pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes no material clnico, sem tratamento (laboratrio Nvel-1), as seguintes medidas devem ser observadas: Colocar na amostra clnica a mesma quantidade de hipoclorito de sdio a 5% e deixar 15 minutos a fim de inviabilizar os eventuais bacilos presentes na amostra. Centrifugar a amostra e do sedimento preparar as lminas. Treinar os tcnicos e orientar para os riscos da manipulao inadequada do material clnico. Utilizar luvas e aventais descartveis. Se o laboratrio for realizar tambm a cultura, alm da pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes no material clnico direto e aps tratamento (Laboratrio Nvel 2), alm das medidas j citadas, o laboratrio deve : Processar todas as amostras em uma capela biolgica classe I ou II que possuem filtros HEPA. Utilizar respiradores descartveis (tipo N95). Limitar a entrada de pessoas na rea reservada para a manipulao dos materiais. Treinamento dos tcnicos nas tcnicas de cultura e identificao de M. tuberculosis. Se o laboratrio for realizar todas as tcnicas descritas acima e, alm disso, for trabalhar com testes de avaliao da sensibilidade (Laboratrio nvel 3), deve possuir: uma rea com ante-sala e uma sala separada onde as amostras so processadas e os testes de sensibilidade so realizados. um sistema de exausto prprio que crie uma presso negativa nas duas salas. uma autoclave deve ser instalada dentro desta rea para que todo material seja autoclavado antes de deixar esta rea. treinamento especfico dos tcnicos nas tcnicas de cultura, identificao e testes de avaliao da sensibilidade das diferentes espcies de micobactrias.
mod VI - 1
2. COLETA DE AMOSTRAS
AMOSTRAS RESPIRATRIAS COLETA ARMAZENAMENTO AMOSTRAS REJEITADAS TRATAMENTO
boca larga com tampa de rosca. amostras antes da administrao de antibiticos, mas no excluir a coleta por causa do uso de antibiticos j que na maioria dos casos o paciente em tratamento para tuberculose no vai suspender a terapia para realizar o exame. primeiro escarro da manh. Coletar a amostra aps expectorao profunda e evitar colher saliva. mnimo de 3 amostras de escarro em dias consecutivos. escrito para uma coleta adequada da amostra. paciente, data da coleta) as amostras aps a coleta
Se a amostra no for
processada dentro de 1 hora aps a coleta, armazenar em geladeira (2 a 8C) por at 24 horas. geladeira at ter sido examinada por algum mtodo de colorao.
Amostras de escarro
Manter as amostras em
colhidas durante um perodo de 24 horas. Estas amostras possuem alta possibilidade de contaminao por outras bactrias e fungos o que prejudica o processamento correto da amostra. estiverem devidamente identificadas frascos no estreis e com conservantes. swabs de coleta
NALC-NaOH (NALC=NAcetil-cistena)
Amostras que no
Orientar a coleta do
exame direto positivo em geladeira para eventuais exame posteriores (no mximo 30 dias)
recomendado um
Seguir as orientaes
utilizadas no seu laboratrio para a assepsia antes da coleta das amostras de sangue para cultura. sangue e inocular diretamente meios de cultura apropriados ou no tubo isolator.
No refrigerar as
amostras. 13, manter a amostra em estufa a 37C.
meios que sero lidos em aparelhos automatizados (bactec myco/f lytic, mb/bact), manter os frascos em temperatura ambiente aps a coleta. isolator manter em temperatura ambiente.
2
mod VI - 2
URINA COLETA
- Coletar a 1a urina da manh (mnimo 40 ml) aps assepsia genital adequada com gua e sabo - Coletar em um frasco estril de boca larga com tampa de rosca. - recomendado a coleta de 3 amostras em dias consecutivos
ARMAZENAMENTO
- Se a amostra no for processada dentro de 3 hora aps a coleta, armazenar em geladeira (2 a 8C) por at 24 horas.
AMOSTRAS REJEITADAS
- Urina colhida durante um perodo de 24 horas. O elevado nmero de microrganismos contaminantes presentes nestas amostras prejudica a descontaminao da amostra. - Amostras colhidas em frascos no estreis. - As 3 amostras colhidas no mesmo dia em horrios diferentes.
TRATAMENTO
- Colocar a urina em um tubo cnico estril com tampa de rosca e centrifugar a 3000 xg por 15 min. - Desprezar o sobrenadante e tratar a amostra com NALC-NaOH ou NaOH 4%, conforme descrito no anexo A.
FEZES * COLETA
- Coletar em frascos de boca larga sem conservantes.
ARMAZENAMENTO
- Manter as amostras em geladeira at o processamento.
AMOSTRAS REJEITADAS
- Amostras congeladas.
TRATAMENTO
- Suspender 1 g de fezes em 5 ml de middlebrook 7h9. - Agitar vigorosamente e tratar pelo mtodo de NaOH 4%.
* Apenas as amostras com pesquisa positiva deveriam ser processadas para cultura.
ARMAZENAMENTO
- Processar a amostra assim que for recebida no laboratrio. - Manter o material depois de processado na geladeira.
AMOSTRAS REJEITADAS
- Amostras colhidas em swabs. - Amostras colhidas em formol.
TRATAMENTO
- Macerar o material com pistilo estril dentro do prprio tubo cnico ou em um cadinho estril adicionando caldo 7H9. - Tratar a amostra pelo mtodo NALC-NaOH ou NaOH 4% e proceder conforme descrito no anexo A.
* Temperaturas diferentes devem ser usadas para incubar os meios inoculados com amostras de pele.
ARMAZENAMENTO
- Manter as amostras em geladeira at serem processadas. - Se na amostra no for adicionado carbonato de sdio esta deve ser processada dentro de 4 horas aps a coleta.
AMOSTRAS REJEITADAS
- Amostras colhidas sem carbonato de sdio.
TRATAMENTO
- Se a amostra for muito mucide, adicionar 50 a 100 mg de NALC - Centrifugar a 3000 xg por 15 min. - Suspender o sedimento em gua destilada estril e processar pelo mtodo de NALC ou NaOH 4%.
mod VI - 3
ARMAZENAMENTO
- Manter a amostra na geladeira se no for processada dentro de 24 horas. - Manter as amostras na geladeira aps o processamento, por vrios dias em caso de haver contaminao da cultura.
AMOSTRAS REJEITADAS
- Amostras enviadas em tubos no estreis. - No caso de medula ssea, amostras colhidas sem anticoagulante.
TRATAMENTO
- Normalmente estas amostras no tm bactrias contaminantes, portanto no so tratadas previamente; so inoculadas diretamente nos meios de cultura. - Meios que podem ser usados para a coleta de amostras: Bactec 13 A Bactec Myco/F Lytic MB/BacT * ESP Myco *
mod VI - 4
3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
EXAME MICROSCPICO E COLORAO
Todos as amostras clnicas, exceto sangue e medula ssea, devem ser examinadas por algum mtodo de colorao, para a presena ou no de bacilos lcool-cido resistentes. Preparar o esfregao com no mximo 1 a 2 cm de dimetro.
MTODOS DE COLORAO
Ziehl-Neelsen
Corantes - Fucsina dissolver 3 g de fucsina bsica em 10 ml de etanol 90%-95% adicionar 90 ml de uma soluo aquosa de fenol a 5% - lcool-cido adicionar 3 ml de HCl concentrado em 97 ml de etanol a 90%-95%. - Azul de Metileno dissolver 0,3 g de cloreto de azul de metileno em 100 ml de gua destilada Procedimento Resultado
Negativo: no so observados
A interpretao segue descrita na Tabela 1.
Lavar com gua. Descorar com o lcool-cido at Cobrir o esfregao com azul de
metileno - 2 min.
ao ar (se for usado papel de filtro para secar a lmina, desprezar em lixo apropriado e usar um papel para cada lmina). em objetiva de imerso de 100x.
Auramina
Corantes Procedimento Resultado
Auramina fenlica
dissolver 0,1 g de auramina O em 10 ml de etanol 90%-95% adicionar em uma soluo de 3g de fenol em 87 ml de gua destilada estril (estocar a soluo em frasco escuro)
lcool-cido
adicionar 0,5 ml de HCl concentrado em 100 ml de lcool 70%
Lavar com gua. Descorar com lcool-cido - 2 min. Lavar com gua. Cobrir o esfregao com Lavar com gu Ler em microscpio de
Negativo: no h presena de
A interpretao segue descrita na Tabela 1.
Permanganato de potssio
dissolver 0,5g de permanganato de potssio em 100 ml de gua destilada
mod VI - 5
Kinyoun Indicado para micobactrias, Nocardia spp. e outros bacilos Gram positivos ramificados que se coram fracamente pela colorao de Ziehl-Neelsen.
Corantes - Fucsina dissolver 4 g de fucsina bsica em 20 ml de etanol 90%-95% adicionar 100 ml de uma soluo aquosa de fenol a 5% - lcool-cido adicionar 3 ml de HCl concentrado em 97 ml de etanol a 90%-95%. - Azul de Metileno dissolver 0,3 g de cloreto de azul de metileno em 100 ml de gua destilada Procedimento Resultado *
Fixar o esfregao na lmina. Cobrir o esfregao com a fucsina - 5 min. Lavar com gua. Descorar com lcool-cido at remover todo o corante - 2 min. Cobrir o esfregao com azul de metileno - 2 min. Lavar com gua. Deixar a lmina secar no ar (se for usado papel de filtro para secar a lmina, desprezar em lixo apropriado e usar um papel para cada lmina). Ler em microscpio ptico comum em objetiva de imerso de 100x.
Negativo: no so observados
* Um resultado negativo no exame direto do material clnico no exclui a possibilidade de infeco por M. tuberculosis. A cultura necessria para confirmao do diagnstico.
A sensibilidade dos mtodos est em torno de 22 a 81%. Os mtodos no possuem boa especificidade j que outros microrganismos que no micobactrias podem aparecer corados (ex: Nocardia, Rodococcus, entre outros). Se apenas 1 a 2 bacilos so observados em toda a lmina este resultado no deve ser reportado antes de ser realizado uma outra lmina. Se o resultado persistir ligar para o mdico responsvel pelo paciente para discutir o caso.
CONTROLE DE QUALIDADE
Lminas positivas e negativas devem ser includas toda vez que se fizer a colorao e quando novos lotes de corantes so preparados. Controle negativo: Escherichia coli Controle positivo: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177
mod VI - 6
N-ACETIL-L-CISTEINA/NAOH 2% (NALC-NAOH)
O NALC um potente agente mucoltico e favorece a utilizao de concentraes baixas do descontaminante sem prejudicar a recuperao de micobactrias. A desvantagem que a soluo deve ser preparada diariamente por que ela perde a atividade aps 24 horas.
Reagentes Procedimento
N-acetil-L-cisteina Soluo de NaOH/ citrato de sdio: volume 1/1 (autoclavar e estocar em frascos com tampa de rosca) NaOH 4% (40 g pastilhas de NaOH em 1000mL de gua destilada) Citrato de sdio 0,1M (26 g de citrato de sdio (anidro) em 1000 ml de gua destilada). Tampo fosfato 0,067M, pH 6,8 (pode ser substitudo por gua)
Preparar a quantidade necessria da soluo de NALC de acordo com a tabela 3. Colocar 5 ml da amostra em um tubo cnico estril com tampa de rosca de 50 ml. Homogeneizar vigorosamente. Deixar 15 - 20 minutos temperatura ambiente. Adicionar o mesmo volume de tampo fosfato. Centrifugar a 3.000 xg por 15 minutos. Desprezar o sobrenadante em frasco apropriado evitando ao mximo espirros do material. Limpar a borda do tubo com hipoclorito. Ressuspender o sedimento com tampo fosfato; ressuspender com um volume suficiente para inocular os meios que sero utilizados. Preparar lminas para colorao. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado ou em frascos prprios contendo hipoclorito.
mod VI - 7
NAOH 4% (PETROFF)
Esta soluo tem atividade descontaminante e para ter atividade mucoltica deve ser usada em concentraes altas (4%). Nessa concentrao o NaOH txico para algumas micobactrias o que torna o tempo de exposio do material a esta substncia crucial para se obter um bom resultado.
Reagentes Procedimento
Soluo de 2% ou 4% de NaOH (1N) Tampo fosfato de 0,067 M , pH 6,8 Soluo de HCl Indicador vermelho de fenol gua destilada estril
Colocar 5 ml da amostra em um tubo cnico estril com tampa de rosca de 50 ml. Colocar o mesmo volume da soluo de NaOH. Homogeneizar vigorosamente. Deixar 15 - 20 minutos temperatura ambiente Adicionar o mesmo volume de tampo fosfato (ou gua). Centrifugar a 3.000 xg por 15 minutos. Desprezar o sobrenadante em frasco apropriado evitando a formao de aerosis. Limpar o tubo com uma soluo de hipoclorito. Adicionar uma gota de vermelho de fenol no sedimento e adicionar aos poucos a soluo de hcl at o indicador mudar de vermelho para amarelo. Homogeneizar o sedimento. Inocular a amostra no meio apropriado. Preparar lminas para colorao. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado ou em frascos prprios contendo hipoclorito.
CIDO OXLICO
o mtodo de escolha para processar amostras contaminadas com Pseudomonas aeruginosa.
Reagentes 5% cido oxlico cido oxlico gua destilada 50g 1000 ml Procedimento
Adicionar um volume de 5% de cido oxlico. equivalente ao da amostra em um tubo cnico de 50 ml. Homogeneizar vigorosamente por 30 segundos. Deixar a temperatura ambiente por 30 minutos agitando o tubo ocasionalmente. Adicionar nacl 0,85% at a marca de 50 ml do frasco. Inverter o tubo vrias vezes para mistura. Centrifugar por 15 a 20 minutos a 3000xg.
Dissolver o cido em um pouco da gua destilada Completar para 1000 ml Esterilizar a 121C por 15 minutos Estocar a temperatura ambiente
mod VI - 8
Desprezar o sobrenadante. Adicionar ao sedimento algumas gotas de vermelho de fenol. Neutralizar o sedimento com 4% naoh at obter uma cor rosa claro. Preparar as lminas e semear nos meios apropriados.
Dissolver o NaOH em um pouco de gua Manter o frasco resfriado para evitar aquecimento Completar para 1000 ml com gua destilada. Esterilizar
a 121C por 15 min. Estocar a temperatura ambiente NaCl 0.85% estril
mod VI - 9
mod VI - 10
BACTEC 12B
Antes de serem inoculados com amostras clnicas ou cepas bacterianas os frascos devem ser colocados no equipamento Bactec 460TB para que sejam inoculados com uma quantidade determinada de C02. a) Composio (Middlebrook 7H12): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de casena, catalase, substrato marcado com 14C(1Ci/ml). b) Inoculao: inocular 0,5 ml do sedimento tratado pelo mtodo de NALC, com uma seringa tipo insulina. Adicionar 0,1 ml de uma soluo de antibiticos (PANTA, Becton Dickinson) nas amostras que podem apresentam alguma contaminao bacteriana. c) Incubao: 37C; amostras de tecidos ou fragmentos de pele devem ser incubados tambm a 30C (preparar 2 frascos). No necessrio incubar no escuro. d) Leituras: ler 2 vezes nas duas primeiras semanas de incubao e uma vez nas semanas seguintes at completar 6 semanas. Frascos com ndices de crescimento (GI) maior que 10 devem ser separadas e testadas diariamente. Frascos que apresentarem GI superiores a 10 devem ser considerados como suspeitos de serem positivos, quando o GI chegar a 50 preparar uma lmina e corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Algumas vezes pode ser difcil visualizar as micobactrias com um GI to baixo; aguardar para fazer outra lmina quando o frasco apresentar um GI maior. Algumas vezes o meio 12B no adere bem lmina e solta do esfregao, adicionar uma gota de albumina na lmina antes de colocar a gota do 12B para fixar o esfregao. Se o frasco apresenta alm de bacilos lcool-cido outras bactrias, descontaminar a amostra diretamente do 12B removendo todo o contedo e processando pelo mtodo de 4% de NaOH. Inocular o sedimento tratado novamente em um novo 12B.
BACTEC 13A
a) Composio (Middlebrook 7H13): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de casena, catalase, substrato marcado com 14C(1Ci/ml), Tween 80, polianetolsulfonato de sdio (SPS). b) Inoculao: colocar at 5 ml de sangue diretamente no frasco. Adicionar no laboratrio 0,5 ml da soluo de enriquecimento que vem junto com os frascos Bactec 13A. c) Incubao: 37C por at 6 semanas. d) Leituras: ler os frascos duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 6 semanas. Os frascos 13A no necessitam ser passados no Bactec 460 para colocar C02, pois estes j vem preparados com a quantidade certa de C02.
MGIT
a) Composio: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente embebido em silicone sensvel ao oxignio. b) Inoculao: 0,5 ml do material tratado, adicionar 0,5 ml de OADC (acompanha o kit) e PANTA (soluo de antibiticos, Becton Dickinson). c) Incubao: 37C. d) Leituras: realizar a primeira leitura aps 48 horas de incubao. Ler duas vezes nas duas primeiras
mod VI - 11
semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 8 semanas. A leitura feita com uma luz ultravioleta e a fluorescncia emitida comparada com um controle positivo e negativo. Amostras de sangue no devem ser colocadas neste meio. Existe disponvel um equipamento automatizado (MGIT 960) que realiza as leituras automaticamente.
ESP MYCO
a) Composio: caldo Middlebrook 7H9 e esponjas de celulose. b) Inoculao: 0,5 ml da amostra clnica. So adicionados OADC e uma mistura de antibiticos (MycoPVNA). c) Incubao: Os frascos so incubados no aparelho ESP Difco por um perodo de 6 semanas. d) Leituras: O equipamento automatizado vai realizar as leituras continuamente e medir o consumo e produo de gases. Este sistema permite o processamento de qualquer amostra clnica inclusive sangue.
MB/BACT
a) Composio: Middlebrook 7H9, casena pancretica digerida, catalase, albumina bovina. b) Inoculao: 0,5 ml do material clnico tratado. Uma mistura de antibiticos adicionada. c) Incubao: 37C no equipamento automatizado MB BacT/Alert por 6 semanas. d) Leituras: os frascos so lidos automaticamente e constantemente pelo equipamento.
CONTROLE DE QUALIDADE
Controle positivo: apresenta crescimento abundante no meio - Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 25177 - Mycobacterium kansasii ATCC 12478 - Mycobacterium scrofulaceum ATCC 19981 - Mycobacterium intracellulare ATCC 13950 - Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.
mod VI - 12
Sugesto de meios de cultura, temperatura de incubao e mtodo de processamento de diferentes amostras para isolamento de micobactrias.
Amostra Inoculao direta Tratamento da amostra Meio para isolamento Lowen 7H10/ Jensen 7H11 Sangue Medula ssea Amostras respiratrias Lquidos X X X X X X X Outro Bactec 13A, Isolator, Bactec Myco/F Lytic, MB/BacT Bactec 12B, ESP Myco/F Lytic, MGIT, MB/BacT Bactec 12B , ESP Myco/F Lytic, MGIT, MBBacT Bactec 12B, ESP Myco/F Lytic, MGIT, MB/BacT Bactec 12B, MGIT, 7H9 X Temperatura de incubao 25 a 37C 30C X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
Bactec 12B, MGIT, ESP Myco/F Lytic, MB/BacT Bactec 12B, ESP Myco/F Lytic, MGIT, MB/BacT 7H11
X X X
Linfonodos
mod VI - 13
Considerar crescimento quando existem colnias bem formadas ou um crescimento confluente. importante fazer uma diluio do inculo, para visualizar colnias isoladas.
mod VI - 14
0 - nenhuma colnia visvel no meio - algumas poucas colnias muito pequenas ou uma pequena mancha de pigmento visvel no meio + - vrias colnias bem desenvolvidas ou uma fina camada confluente visvel de crescimento no meio, podendo ser visto o meio de LJ embaixo ou entre as colnias ++ - muitas colnias bem desenvolvidas formando uma camada grossa e confluente de crescimento ( colnias tocando umas nas outras ou prximas) sem que se possa ver o meio de LJ embaixo ou entre as colnias.
Pigmento Variaes na produo de pigmento levam a classificar as micobactrias em 3 grupos: fotocromognicas - micobactrias que produzem pigmento somente aps a exposio luz. scotocromognicas - micobactrias que produzem pigmento tanto no escuro quanto no claro. no fotocromognicas - micobactrias que no produzem pigmento em qualquer situao. a) Procedimento: Quando houver crescimento no tubo descoberto retirar o papel de alumnio do tubo coberto e verificar se as colnias so pigmentadas. Se no for observado pigmento expor luz (lmpada de 60W) por 3 horas (distncia do tubo para a lmpada deve ser de 20 a 25 cm) com a tampa desrosqueada Incubar por mais 3 dias. Manter as tampas desrosqueadas. b) Resultado: No pigmentada - cor creme Pigmentada laranja cor amarelo, laranja claro,
(no deve ser observada a intensidade da cor produzida e sim apenas se produz ou no pigmento).
TEMPERATURA
A temperatura de incubao geral de 37C. Incubar em diferentes temperaturas quando o material clnico for amostras de pele (25C a 30C). Algumas micobactrias (M. xenopi) crescem melhor quando incubadas 42C.
TESTE DA CATALASE
A enzima catalase separa o perxido de hidrognio em gua e oxignio, e o oxignio aparece na forma de bolhas. Quase todas as micobactrias produzem catalase, o que vai mudar a quantidade de catalase produzida ou a perda ou no da capacidade de produzir catalase a 68C.
mod VI - 15
Reagentes: 10% Tween 80 Aquecer o Tween 80 e 90 ml de gua destilada estril em banho 50C. Pipetar 10 ml de Tween 80 aquecido nos 90 ml de gua destilada estril aquecida (lavar a pipeta vrias vezes para retirar todo o Tween). Deixar o frasco no banho at dissolver todo o Tween 80. Estocar de 2 a 8C. 10% Tween 80 / 30% H2O2 (soluo de uso) Misturar partes iguais dos dois reagentes. Preparar no momento do uso (1,0 ml/teste). No deixar este reagente cair na pele. Em caso de acidente lavar com gua corrente.
TESTE SEMI-QUANTITATIVO
a) Meios: 7H9 Lowenstein Jensen sem inclinao (tubos de 150 mm) b) Materias e Equipamentos: ala descartvel estufa 37C rgua c) Procedimento: Inocular um caldo 7H9 com uma alada cheia de micobactrias. Incubar por 7 dias a 37C Homogeneizar vigorosamente por 10 segundos Inocular 0,1 ml do caldo com crescimento em um tubo de LJ preparado sem inclinao. Incubar a 37C por 14 dias com as tampas desrosqueadas. Adicionar 1 ml do reagente preparado (Tween 80/H2O2) . Deixar a temperatura ambiente por 5 minutos e medir a altura das bolhas a partir da superfcie do meio de cultura com uma rgua. d) Resultado: >45 mm - alta catalase ( Ex: M. fortuitum, M. kansasii, M.simiae, etc.) < 45mm - baixa catalase (Ex: M. tuberculosis, M.marinum, M.avium, etc.) e) Controles de Qualidade: Controle negativo: tubo de LJ no inoculado Controle Positivo:
catalase alta - M. fortuitum ATCC 6841 catalase baixa - M. tuberculosis ATCC 25177
TESTE A 68C
a) Reagentes: tampo fosfato (0,067M) b) Materiais e Equipamentos: 2 tubos com tampa de rosca ala descartvel banho maria 68C c) Procedimento: Inocular um tubo de tampa de rosca com 1,0 ml de tampo fosfato (0,067M) com uma alada cheia de crescimento de micobactrias. Transferir 0,5 ml do inculo para um segundo tubo de tampa de rosca. Incubar um tubo em banho maria a 68C por 20 min e o outro a temperatura ambiente. Adicionar 0,5 ml da soluo de Tween 80/H2O2 nos dois tubos. Deixar a temperatura ambiente por 20 minutos antes de ler. (No agitar os tubos) d) Controle de Qualidade: M.tuberculosis ATCC 25177 - forma bolhas a temperatura ambiente mas no a 68C. M. fortuitum ATCC 6841- forma bolhas a temperatura ambiente e a 68C.
mod VI - 16
TESTE DA URIA
Mtodo Wayne Teste utilizado para identificar as micobactrias que tm a capacidade de hidrolisar a uria. a) Reagentes: Caldo Uria Adicionar 10 g de Bacto Uria gar base concentrado (Difco) em 90 ml de H20 destilada estril. Homogeneizar bem. Colocar assepticamente 3 ml em tubos com tampa de rosca. Estocar de 2 a 8C. (validade 1 ms) b) Materias e Equipamentos: ala descartvel estufa 37C c) Procedimento: Inocular o caldo uria com uma alada cheia de um crescimento de micobactrias. Homogeneizar. Incubar por 3 a 5 dias a 37C (no passar de 5 dias para fazer a leitura). d) Resultado: Positivo: rosa forte ou vermelho Negativo: sem mudana de cor. Se ficar levemente rosado repetir o teste, se o resultado persistir, reportar como negativo.
Mtodo Murphy-Hawkins a) Materiais e Equipamentos: gua estril ala descartvel disco de uria vermelho de fenol estufa 37C vermelho de fenol b) Procedimento: Colocar um disco de uria em um tubo contendo 0,5 ml de H2O estril. Inocular uma alada cheia de micobactrias com 2 a 4 semanas de incubao no tubo contendo o disco de uria. Incubar a 37C por 3 dias. Pingar 1 gota de vermelho de fenol. c) Resultados: Positivo: rosa forte Negativo: laranja
d) Controle de Qualidade: Positivo: M. kansasii ATCC 12478 Negativo: M. intracellulare ATCC 13950 ou um tubo apenas com meio
mod VI - 17
a) Meios: placa com meio de Mac Conkey sem cristal violeta caldo 7H9 b) Materiais e Equipamentos: ala descartvel pipeta Pastuer descartvel estufa 37C estufa 30C c) Procedimento: Inocular em um tubo com 7H9 uma alada do crescimento bacteriano. Incubar a 37C por 1 semana. Inocular 3 a 4 gotas do inculo do caldo 7H9 no gar MC. Estriar a placa. Incubar a 28- 30C por 11 dias.
d) Resultado: Positivo: colnias nas estrias Negativo: sem crescimento e) Controle de Qualidade: Controle Positivo: M. fortuitum Controle Negativo: M. chelonae
TESTE DA ARILSULFATASE
Verificar as micobactrias que em diferentes condies produzem a enzima arilsulfatase. Teste de 3 dias a) Meios: caldo de arilsulfatase (3 dias) b) Reagentes: Na2CO3 2N padres de leitura c) Materiais e Equipamentos: ala descartvel vortex estufa 35C estufa 45C pipeta Pasteur descartvel d) Procedimento: Inocular um caldo de 3 dias de Arilsulfatase com uma alada cheia de micobactrias de uma cultura de 2 a 4 semanas de crescimento. Homogeneizar. Incubar por 3 dias a 35 - 37C para micobactrias de crescimento rpido (sem CO2) e a 45C quando a suspeita for de M. xenopi. Aps 3 dias colocar 6 gotas de Na2CO3 2N (no mais) com uma pipeta Pasteur. Ler comparando com os padres. e) Resultado: Positivo: produo imediata da cor pink ou vermelha. (Leitura equivalente a +++ do padro) Negativo : incolor f) Controle de qualidade: Positivo: M. fortuitum Negativo: caldo sem inocular
Teste de 2 semanas
mod VI - 18
a) Meios: caldo de arilsulfatase (2 semanas) b) Reagentes: Na2CO3 2N padres de leitura c) Materiais e Equipamentos: ala descartvel vortex estufa 35C estufa 45C pipeta Pasteur descartvel d) Procedimento: Inocular o tubo de arilsulfatase de 2 semanas com uma alada cheia de micobactrias de uma cultura de 2 a 4 semanas de crescimento. Homogeneizar.
Incubar por 2 semanas a 37C. Colocar 6 gotas de Na2CO3 2N com uma pipeta Pasteur. Ler comparando com os padres. e) Resultado: Positivo: produo imediata de cor rosa forte ou vermelha. (Leitura equivalente a ++++ do padro) Se o resultado for de +++ (borderline) repetir o teste. f) Controle de qualidade: Positivo: M. triviale Negativo: caldo no inoculado ou caldo inoculado com M. tuberculosis.
UTILIZAO DE FERRO
Verificar se a micobactria capaz de converter citrato de ferro amoniacal em xido de ferro.
mod VI - 19
a) Reagentes: citrato frrico amoniacal (soluo estril) b) Materiais e Equipamentos: pipeta Pastuer descartvel c) Procedimento: Inocular 2 LJ com uma suspenso de micobactrias. Incubar at obter crescimento visvel (2 semanas). Colocar tantas gotas de citrato frrico amoniacal quantos forem os mililitros de meio em um dos LJ. Ex: para 8 ml de meio LJ, colocar 8 gotas da soluo.
O outro tubo ser o controle negativo. Reincubar o LJ a temperatura ambiente de 28 - 30C por at 3 semanas. d) Resultado: Positivo: colnias se tornam escuras-oxidadas Negativo: as colnias permanecem com a mesma cor que as do LJ em que no foi colocada a soluo. e) Controle de Qualidade: Positivo: M.fortuitum Negativo: M. chelonae
HIDRLISE DO TWEEN 80
Esta prova utilizada verificar a hidrlise enzimtica do Tween 80 pelas micobactrias. a) Reagentes: reagente de hidrlise do Tween 80 b) Materiais e Equipamentos: ala descartvel estufa 37C c) Procedimento: Inocular uma alada cheia de micobactrias com 2 a 4 semanas de crescimento, em um tubo com o reagente de hidrlise do Tween 80. Homogeneizar. Incubar a 37C no escuro com as tampas bem fechadas. Ler aps 5 e 10 dias de incubao. No agitar os tubos. Examinar o lquido e no o sedimento. Se o lquido ficar sem cor repetir o teste, se persistir o resultado reportar como negativo. d) Resultado: Positivo: mudana de cor do meio, de mbar para pink ou vermelho e) Controle de Qualidade: Positivo: M. kansasii Negativo: M. avium
mod VI - 20
a) Materiais e Equipamentos:
Luminmetro sonicador de banho maria banho seco 95C seringa de tuberculina pipetas automticas de 100 L e 300 L banho 60C b) Procedimento 1. Se for utilizado crescimento de micobactrias em frasco 12B: Utilizar a cultura quando o crescimento atingir um GI de 999. Adicionar 100 L do reagente 1 e 100 L do reagente 2 em um tubo de lise. Ligar todos os banhos para que possam atingir a temperatura adequada antes de comear o teste. Retirar 1 ml do crescimento bacteriano e colocar no tubo de lise. Votexar o tubo vigorosamente por 5 minutos Sonicar o tubo por 15 minutos a temperatura ambiente. Colocar o tubo no banho a 95C por 15 minutos. Deixar o tubo esfriar a temperatura ambiente Retirar 100L do lisado e transferir para um tubo com a sonda. Incubar 15 minutos a 60C. Pipetar 300 L do reagente 3 (que vem no kit) no tubo. Tampar e vortexar. Colocar no banho a 60C * por 5 minutos. Retirar do banho, deixar chegar a temperatura ambiente e colocar no luminmetro para fazer a leitura. * A temperatura do banho de 60C crucial para ocorrer o anelamento da sonda com o rRNA da amostra.
colocar 100L do reagente 1 e 100L do reagente 2 no tubo de lise inocular uma alada cheia do crescimento no tubo de lise. proceder como descrito acima no item 1. 3. Se for utilizado crescimento de micobactrias em meio lquido: somente fazer o teste quando o caldo apresentar uma boa turvao. colocar 100 L do reagente 1 e 100 L do reagente 2 no tubo de lise colocar 1 ml da amostra no tubo de lise proceder como descrito acima no item 1. Nota: O passo mais importante no processo a lise das clulas. Aps colocar a amostra no tubo de lise, agitar no vortex vigorosamente por aproximadamente 5 minutos para que o processo seja adequando. d) Resultado: Positivo: > 30,000 RLU (Relative Light Units) Negativo: < 30,000 RLU A sonda para o complexo M. tuberculosis no identifica as diferentes espcies de micobactrias pertencentes ao complexo.
mod VI - 22
Princpio
um sistema semi-automtico de amplificao do DNA in vitro por uma srie de incubaes sucessivas em diferentes temperaturas usando uma enzima estvel a temperatura e dependente de DNA (Taq polimerase). termociclador pipetas automticas kit Amplicor
um sistema semi-automtico de amplificao de RNA que utiliza uma nica temperatura de amplificao e duas enzimas uma que converte o rRNA em DNA e outra que transcreve o DNA em RNA. pipetas automticas sonicador banho 42C banho seco 95C banho 60C luminmetro As amostras devem ser digeridas e descontaminadas pelo mtodo de NALC-NaOH As clulas devem ser lisadas e o DNA extrado A tcnica de amplificao aplicada no DNA extrado Kit possui as solues e instrues para realizar os passos de lise, extrao e amplificao do DNA A deteco do produto amplificado feita com sondas especficas para o fragmento do DNA amplificado, marcadas com um ster de acridina e a leitura feita em um luminmetro.
Materiais e Equipamentos
A amostra deve ser digerida e descontaminada utilizando o mtodo de NALC-naoh As clulas devem ser lisadas e o DNA extrado O DNA deve ser purificado e concentrado A tcnica de amplificao aplicada nesse concentrado O kit possui as solues e instrues para realizar os passos de extrao e amplificao A deteco do produto amplificado feita com sondas especficas para o fragmento do DNA amplificado, marcadas com digoxigenina e biotina no formato de uma reao imunoenzimtica colorimtrica.
Procedimento
mod VI - 23
6. ANEXOS
ANEXO A. ESQUEMA DE ISOLAMENTO PRIMRIO
Material
Repouso 15
3000xg 15
0,5
0,1
mod VI - 24
L J 350C
No pigmentado
Expor Luz
Nitrato
+
Fotocromognico No fotocromognico M. szulgai M. flavesnens M. thermoresistibile
Hidrlise do Tween
M. M. M. M.
M. scrofulaceum M. xenopi
+
M. gordonae
mod VI - 25
Diluies: Transferir os seguintes volumes para um novo 12B 50-100 nenhum 101-200 0,8 mL 201-400 0,6 mL 401-600 0,4 mL 601-800 0,3 mL 801-999 0,2 mL 999 por mais de 1 dia 0,1 mL Ziehl positivo
12B GI > 10
Ziehl negativo
Complexo M. tuberculosis
Micobactria no do complexo
mod VI - 26
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. 2. Della-Latta, P., Weitzman, I. Mycobacteriology. In: Isenberg, H. D. Essential Procedures for Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 169-203, 1998. Heifits, L.B. Clinical Mycobacteriology. In: Clinical in Laboratory Medicine.W.B. Saunders, Philadelphia, vol 16, no. 3, 1996.
3. Koneman, E.W. Allen, A.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C., Winn Jr., W.C. Mycobacteria. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott, Philadelphia, 5a ed, 1997. 4. Master, R.N. Mycobacteriology. In: Isenberg, H.D. Procedures in Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1996.
mod VI - 27
Mdulo VII
NDICE Introduo ......................................................................................................................1 Fungos e infeco hospitalar ................................................................................................. 1 2. Coleta e transporte de amostras ....................................................................................4 Procedimentos para coleta de amostras.................................................................................. 4 3. Processamento de amostras ..........................................................................................6 Exame microscpico de amostras .......................................................................................... 6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos ........................................................ 8 4. Identificao de fungos.................................................................................................12 Identificao de leveduras .................................................................................................. 12 Identificao de fungos filamentosos.................................................................................... 16 Identificao de fungos dimrficos ....................................................................................... 18 5. Descrio das principais micoses ..................................................................................20 6. Referncias bibliogrficas .............................................................................................24 1.
GLOSSRIO Artrsporo ou artrocondio = esporo formado pela desarticulao da hifa de fungos filamentosos ou leveduras. Blastosporo ou blastocondio = esporos formados por brotamento ou gemulao. Bolor = fungo filamentoso, multicelular, constitudo de hifas. Brotamento ou gemulao = reproduo com diviso de citoplasma atravs de estrangulamento. Cenoctica = hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contnua. Clamidsporo = estruturas de resistncia, constitudas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos esporos. Condio = esporo assexuado externo. Dimrfico = que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa. Esporngio = rgo de reproduo assexuada interna, geralmente em forma de vescula e contm inmeros esporos denominados de esporangiosporos. Hialino = que no tem cor, translcido, assumindo a cor do corante utilizado. Hifa = reunio de clulas justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que compe o corpo vegetativo dos bolores e de alguns gneros de leveduras (por ex, Candida spp.). Demcio ou demaciceo = fungos negros que tm pigmento melanide (acastanhado), na parede celular. Levedura = fungo em regra, unicelular que se reproduz geralmente por brotamento. Tuberculado = com granulaes ou nodosidades.
1. INTRODUO
FUNGOS E INFECO HOSPITALAR
Fungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico, solo e gua e, embora sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150 foram descritos como patgenos aos seres humanos. Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente perda do equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clnicas localizadas ou disseminadas. De modo contrrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no fazem parte da microbiota animal e portanto o homem no um reservatrio importante para esse grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias areas superiores ou quebra na barreira epidrmica aps traumatismos com objetos perfuro-cortantes. Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candida so os maiores agentes de infeco hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenas graves e aqueles em perodo ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia operante, notificaram Candida como 6o patgeno nosocomial e a 4a causa mais comum de infeces de corrente sangunea, adquiridas em hospitais. A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. Candidemia pode ser definida como a ocorrncia de 2, ou mais,culturas positivas para a mesma espcie de Candida, provenientes de amostras diferentes, coletadas aps 72 h da admisso. Infeco invasiva por Candida pode ser tambm considerada quando h isolamento de Candida a partir de stio normalmente, estril associado a pelo menos, um outro sinal de infeco. A sensibilidade de hemocultura para Candida baixa; aproximadamente, 50% dos pacientes com infeco invasiva por Candida podem ter culturas negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, pode diminuir a chance do isolamento de Candida. Os fatores reconhecidos de risco para infeco invasiva por Candida so: Permanncia > 4 dias em UTI Antibioticoterapia de largo espectro Cirurgia abdominal Cateterizao venosa central Nutrio parenteral total Imunodepresso ndice APACHE II > 10 Ventilao mecnica > 48h Neutropenia Quimioterapia citotxica Frente a estas condies recomenda-se monitorao com exames micolgicos sangue de amostras biolgicas dos pacientes, tais como, sangue, escarro, pontas de catteres intravasculares, lquido peritoneal e urina. Culturas positivas para leveduras podem significar apenas colonizao mas, podem conduzir doena invasiva subsequente. Estudo prospectivo, em pacientes cirrgicos de UTI, mostrou que 38% de 29 pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser demonstrada por anlise de 3 ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de stios diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos. Diferentes espcies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber: Candida glabrata (Torulopsis glabrata), Candida tropicalis; Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um estudo multicntrico e, por anlise univariada, concluiram ser C. glabrata, a espcie associada maior taxa de mortalidade e que bito estava relacionado com maior idade e severidade da doena de base do paciente.
Mod VII - 1
O gnero Candida , sem dvida o mais importante mas, existem outras leveduras no ambiente hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua, quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionrios, que podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia sp (Hansenula sp), Rhodotorula sp e Trichosporon sp. Fungos filamentosos presentes no meio ambiente hospitalar, tambm podem causar infeco em pacientes suscetveis. O gnero Aspergillus sp (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes transplantados de medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via mais comum de transmisso e os surtos de aspergilose so associados a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais. Doena pulmonar e, mais raramente, sinusite, so as manifestaes de aspergilose. Outros gneros, tais como Fusarium sp, Acremonium sp e Penicillium sp so capazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infeco hospitalar. Estes gneros que so dispersos pelo ar atmosfrico, pertencem ao grupo dos hialohifomicetos, pois tm hifas hialinas e septadas. Outros grupos de fungos filamentosos, como zigomicetos (Rhizopus sp, Mucor sp), caracterizados por hifas no-septadas (cenocticas) e alguns feo-hifomicetos (fungos negros ou demcios) que tm hifas amarronzadas, podem tambm ser agentes de infeco hospitalar.
Mod VII - 2
Mod VII - 3
Escarro
Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejo com gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deve conter saliva. Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica, pela manh, em jejum. Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve ser colocado em recipiente estril. Fazer assepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 ml de sangue venoso, que dever ser injetado diretamente, em frasco contendo meio de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de material deve ser distendida em uma lmina de microscopia, para colorao de Giemsa.
Aspirado gstrico Aspirado traqueal e secreo obtida por broncoscopia Sangue e aspirado de medula ssea
Mod VII - 4
Lquor
Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 ml ou mais, para exame microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar, devem ser usados na seguinte sequncia: 1 exame bioqumico, 2 exame de celularidade, 3 microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos especficos para cada um desses exames, aumenta a sensibilidade do exame micolgico e, por isso, deve ser recomendada. Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o material em recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum liquido fixador. A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do trato urinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, e para evitar contaminao com microrganismos presentes nas reas vizinhas, fazer limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar o primeiro jato de urina da manh, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio estril. Colees de 24 horas, no tm valor para diagnstico micolgico. Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores de fezes em recipiente estril com tampa ou swab anal, mergulhar o swab em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Colher material por curetagem da leso ou com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.
Urina
Fezes
O melhor mtodo para recuperao de fungos, requer raspado de crnea, Material de micose aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swab no ocular indicada em local de drenagem. Leso de nariz e seios paranasais Mucosa oral e orofaringe Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em recipiente estril. Coletar com swab estril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguais ou regio tonsilar. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de saco vaginal com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.
Secreo vaginal
Liqudos corporais Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL de (pleural, asctico, lquido em tubo de ensaio estril. pericrdico, sinovial) Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados, com seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local, com gaze esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatos superfciais que so altamente, contaminados com bactrias. A seguir, colher o material com swab. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Raspar com lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses . Pode-se utilizar tambm, uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duas lminas limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas das lminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou em potes, de preferncia esterilizados. Fazer limpeza prvia das unhas, escovando com gua e sabo. Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi, raspar as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lminas e ved-las com fita adesiva.
Pele e pelos
Unhas
Mod VII - 5
3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da coleta e transporte adequados e volume suficiente da amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico. As seguintes recomendaes devem ser cuidadosamente, seguidas para boa resoluo diagnstica: Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscpico e cultura pois, para exame so clarificadas com soluo aquosa de KOH a 20% e, para cultura, no podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfcie do meio de cultura. Lquor, secrees e fludos corporais (lquido pleural, asctico, sinovial, pericrdico, aspirado transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar [BAL]) devem ser concentrados por centrifugao (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser eluidos em soluo salina e tambm devem ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado para o exame microscpico e semeadura em meios de cultura. Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por esgotamento, sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colnias (UFC). A outra alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo (cultura qualitativa). Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima dissolvidas em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica e facilita a manipulao da amostra e formao de sedimento aps centrifugao. Porm, no foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperao de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se utilizar, como alternativa, para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da amostra prefervel e pores liqefeitas no so adequadas para isolamento do agente. A poro da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame microscpico, pois a potassa destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando seu isolamento em meio de cultura. Neste caso, outra poro da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura. Tecidos obtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturi estril ou macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estril. Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e expor o microrganismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura. Sangue e aspirado de medula ssea no necessitam preparao, sendo que o exame microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura importante para identificao do agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediatamente, aps a coleta, em frascos contendo meio de cultura. O meio pode ser bifsico (15 ml de gar inclinado sob 50 ml de caldo) composto de infuso de crebro-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para lise e posterior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura bacteriolgica (simples ou automatizada), proporcionam isolamento adequado de fungos, desde que respeitado os perodos necessrios ao seu desenvolvimento. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram o mtodo de lise-centrifugao o mais sensvel. O sangue e medula ssea no devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois esta substncia se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do exame. Um dos procedimentos recomendados para a inoculao de 5 a 6 ml da amostra no frasco com meio bifsico sendo, uma parte para 10 partes do meio liqudo, que deve ser ento, incubado temperatura de 30C.
Mod VII - 6
Cpsula Polissacardica
Clulas em brotamento
Incluses citoplasmticas
Tinta da China
Mod VII - 7
morfolgicos
encontrados
em
exames
microscpicos
de
Aspecto Morfolgico a. Hifas hialinas e/ou artrosporos (1) a. Hifas regulares, septadas, ramificadas, hialinas, artrosporadas (1) b. Leveduras e pseudohifas c. Grupo de leveduras e/ou pequenas hifas tortuosas, hialinas (1)
Interpretao a. Dermatfitos a. Dermatfitos b. Candida spp c. Malassezia sp a. CRYPTOCOCCUS SP a. Fungos filamentosos hialinos (5) b. CRYPTOCOCCUS SP c. Candida spp d. Paracoccidioides brasiliensis
a. Levedura capsulada (2) a. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (3) b. Levedura capsulada (2) c. Levedura e pseudohifa (1,3) d. Leveduras globosas ou multiformes, de parede espessa, incluses citoplasmticas, com mltiplos brotamentos (1) a. Hifas irregulares, largas, cenocticas (1,3) b. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (1,3)
a. Zigomicetos b. Fungos filamentosos hialinos(5) d. Cromomicetos (agentes de cromomicose) e. Candida spp f. CRYPTOCOCCUS SP
c. Hifas septadas de cor castanha ou marrom (1,3) c. Feohifomicetos (fungos demcios) Tecidos, pus e aspirados (subcutneo, ganglionar, cerebral, pulmonar, mucosa ou outro) d. Estruturas ovaladas, com ou sem septos, de cor castanha (estruturas muriformes) (1) e. Levedura e pseudohifa (1,2) f. Levedura capsulada (2)
g. Levedura globosa ou ovide, de parede espessa, g. Paracoccidioides brasiliensis incluses citoplasmticas, com brotamento nico ou mltiplos (1) h. Leveduras pequenas, tipo charuto (achado muito raro) (3) i. Leveduras pequenas em macrfagos (4) h. Sporothrix schenckii i. Histoplasma capsulatum a. Fungos filamentosos hialinos (5) b. Candida spp a. Fungos filamentosos (5) b. CRYPTOCOCCUS SP c. Leveduras (6) d. Histoplasma capsulatum
Fludos oculares
a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas (1,3) b. Leveduras e pseudohifas (1,3) a. Fragmentos de hifas ramificadas, hialinas, septadas (3,4) b. Levedura capsulada (2) c. Leveduras em brotamento (3,4) d. Leveduras pequenas em macrfagos (4)
Exame microscpico com KOH Exame microscpico com tinta nanquim Exame microscpico com colorao de Gram Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por ex. Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja identificao s possvel pela cultura. (6) No sangue, leveduras do genero Candida no formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie possvel somente, aps isolamento em meio de cultura.
Mod VII - 8
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos, a partir de amostras biolgicas, podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma desidratada, no precisando ser formulados no laboratrio. Aps a hidratao, conforme instrues do fabricante, o meio deve ser distribudo, de preferncia, em tubos e esterilizados por autoclavao. Para gar, recomenda-se a solidificao com tubo inclinado, deixando espao de 3 cm do final do meio at o tampo, para evitar contaminao via meio externo. Todos estes meios de cultura so distribudos e esterilizados, de preferncia em tubos de ensaio pois, desta forma, h maior resistncia desidratao e contaminao, alm de oferecer menor bio-risco na manipulao da cultura. O armazenamento dos tubos, contendo meios de cultura, deve ser em saco plstico fechado, dentro de armrios, temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminao durante o tempo de armazenamento, as colnias de fungos contaminantes sero facilmente observadas, ao contrrio do que ocorre, quando se armazena sob refrigerao. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias, temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura. Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios no seletivos, que permitam crescimento de fungos patognicos e bolores de crescimento rpido (< de 7dias). Estes fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente, oportunistas. O isolamento desses fungos, em meio de cultura est sendo, cada vez mais, importante para diagnstico laboratorial das infeces ditas oportunsticas. O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose (ASD), chamado simplesmente, gar Sabouraud. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o crescimento de bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol o mais indicado, pois resiste autoclavao. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos. Meios ditos seletivos para fungos patognicos, contm cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemfilos. Estes meios so indicados para cultivo de materiais coletados de leses com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos. Mas, deve-se ressaltar que esta substncia poder inibir o isolamento de fungos oportunistas, como Aspergillus sp, alm de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patognicas dos gneros Candida e Cryptococcus. Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos ou determinados gneros, como por ex., gar contendo compostos fenlicos para Cryptococcus sp (gar contendo sementes de niger ou Guizzotia abssinica), ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test Medium). Existem ainda, meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de espcies de Candida spp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy Agar, etc). So meios mais caros que ASD e alm disso, sua maior aplicao no isolamento primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas muito contaminadas, tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feita somente, aps anlise morfolgica e fisiolgica. Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata, encontrado no comrcio, sob forma desidratada, para aumentar a esporulao e facilitar a identificao do gnero e espcie do fungo. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o uso de meios enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI) para obteno, em menor tempo, de culturas melhor desenvolvidas. Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos (de preferncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina). O meio de cultura pode ser selecionado segundo: tipo de amostra e agente etiolgico, conforme a suspeita clnica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscpico da amostra, pode-se ainda, redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados temperatura de 30C, usada atualmente, para todos os tipos de amostras.
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Dissolver os componentes na gua destilada. Acertar o ph em 5,6 . Aquecer at a completa dissoluo. Distribuir cerca de 10 ml por tubo. Esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.
Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 ml de acetona. Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C. Misturar as solues e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao. pH= 7,0
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saponina, que lisa as clulas liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se realizar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do tubo que j contem o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e, desta forma, a cultura foi realizada, evitandose subcultivos, que so necessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias. Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor rendimento no isolamento primrio de fungos, de acordo com tipo de amostra biolgica. Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra biolgica
AMOSTRA BIOLGICA PROCESSAMENTO - Fluidificao (recomendada) - Centrifugao - Uso do sedimento EXAME MICROSCPICO a fresco KOH a 20% Giemsa Tinta nanquim MEIO DE CULTURA* - ASD - BHI
Secreo respiratria
Lquor
- Centrifugao - Uso de sedimento - Centrifugao - Uso de sedimento - Centrifugao - Uso de sedimento - Nenhum
- Tinta nanquim - Gram - a fresco - Gram - KOH a 20% - Giemsa - KOH a 20% - Giemsa - Gram
- ASD
- ASD
swab embebido em salina - Centrifugao (mucosa oral, nasal, - Uso de sedimento vaginal, anal, olhos, conduto auditivo) Pele, pelos e escamas Tecidos e peas - Nenhum - Fragmentao ou macerao - Imprint em lmina - Semeadura em meio de cultura - Esfregao ou distenso em lmina
* Todos os meios slidos, para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol. ** Para contagem de colnias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de centrifugar.
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4. IDENTIFICAO DE FUNGOS
O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpico da amostra suficiente para medidas de controle da infeco, outras vezes somente o isolamento e identificao do fungo pode orientar a conduta clnica. A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie; porm, muitas vezes, isso no possvel, pelo grau de dificuldade e complexidade do exame. Nestes casos a identificao do grupo de fungos, suficiente para o diagnstico de micose, por ex., zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc. O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que ele o agente etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) de pacientes, por ex. Candida sp e no meio ambiente, por ex. Aspergillus sp, pode resultar em cultura positiva. Isto explica o grande nmero de culturas positivas para fungos, a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo isolado em meio de cultura e sinais e sintomas, critrio clnico-epidemiolgico. No entanto, deve-se sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de: Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microscpico Micose cutnea Fludos corporais normalmente estreis Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colnias Raspado de crnea Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids) Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou submetido a ventilao, cateterismo ou outras manipulao Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doena infecciosa independente do tipo de amostra clnica Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos: Dimrficos Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.)
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As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida albicans e Candida sp so: tubo germinativo e filamentao em cultivo em lmina. No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios. Estas hifas ocorrem nos gneros Geotrichum e Trichosporon. Caso a levedura forme hifas hialinas ramificadas sem fragmentao, provavelmente pertence ao gnero Candida e se houver formao de clamidsporos caracteristicos, Candida albicans. A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus feita com uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos blastocondios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lmina. A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia muito utilizada em micologia. A reao positiva para urease, junto com anlise morfolgica permite identificao presuntiva de Cryptococcus sp. Leveduras do gnero Rhodotorula so tambm urease positiva mas, como em regra, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so facilmente distinguidas de Cryptococcus sp. Outros gneros incluindo Candida sp, produzem urease, mas tem outras caractersticas para sua identificao. O esquema abaixo prope um fluxo para identificao das principais leveduras de interesse mdico. Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste captulo. Um exemplo simplificado a Tabela 1. Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras
Tubo Germinativo
Negativo
Cultivo em lmina
Hifas
Somente blastocondios
Artrosporadas
Prova da Urease
Positiva
Negativa
Positiva Cryptococcus sp
Negativa
Auxanograma e Zimograma
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Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudo-hifas de Candida albicans
Adicionar o fub em 250 ml de gua e ferver at borbulhar. Filtrar o fub em gaze dobrada em quatro. Dissolver o gar em 250 ml de gua. Restaurar o volume da infuso de fub para 250 ml, com gua quente, juntar as suspenses, ajustar o pH para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir volumes de 5 ml em tubos e esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.
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Lmina
Basto de vidro
Lamnula
gar fub
PROVA DA UREASE
Semear uma alada da levedura na superficie do meio de urease (gar uria de Christensen). Incubar temperatura de 37C. A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 h, indica reao positiva.
C. albicans C. tropicalis C. parapsilosis C. krusei C.guilliermondii C. glabrata C. neoformans Geotrichum Trichosporon Rhodotorula sp Saccharomyces
+ -
Tg = tubo germinativo, Ar = artrsporo, Ur= urease, Sa = sacarose, Ma=maltose,La = lactose, Ce = celubiose, Tr = trealose, Ra = rafinose, X = xilose, I = inositol,NO3 = nitrato, Gl = glicose, + = pos, - = neg, V= varivel
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Azul de lactofenol-algodo cido ltico Cristais de fenol Glicerina Azul algodo gua destilada
Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar Esperar 24 h e filtrar O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno. Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos
Lmina
Basto de vidro
Lamnula
Cubo de gar
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Cladosporium
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X X
X X
DERMATOFITOSES (TINEAS)
So infeces fngicas limitadas s camadas superfciais queratinizadas da pele, pelos e unhas, popularmente, conhecida como epinge ou frieira, dependendo da localizao das leses que so extremamente pruriginosas. Em imunodeprimidos podem acometem tecidos subcutneos. Agentes etiolgicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermophyton floccosum Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexo ou raa. Fontes de infeco: contgio direto com animais, solo ou indivduo infectado. Procedimento laboratorial: Amostra: escamas de pele, unha e cabelos Exame da amostra com KOH a 20%, revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes, frequentemente artrosporadas. Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala em L, de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura. As colnias de dermatfitos geralmente, crescem a partir do 10 dia de incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela sua morfologia macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfitos mais freqentes so T. rubrum e M. canis. Mod VII - 20
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
Doena granulomatosa, crnica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratrio, trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC. Apresenta grande variabilidade de manifestaes clnicas, desde formas localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia da resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicose-infeco, em que o indivduo no apresenta sinais e sintomas mas, demonstra por testes intradrmicos positivos, que entrou anteriormente, em contato com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose. Agente etiolgico: Paracoccidioides brasiliensis Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil. Procedimento laboratorial: Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio, aspirado de linfonodos, tecido obtido por bipsia. Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduriforme constituda de clulas grandes (10m a 60 m), globosas, com parede celular dupla e refringente e com mltiplos brotamentos, semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas entrelaadas. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30C so filamentosas, de cor branca, cotonosa, com sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas, septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C so de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as formas caractersticas leveduriformes que permitem a identificao do agente.
HISTOPLASMOSE
Doena que acomete primariamente o sistema retculoendotelial. A infeco pode ser localizada ou generalizada. A histoplasmose primria afeta o sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva atinge fgado, bao, linfonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tem bom prognstico porm atualmente, importante infeco oportunista associada Aids, nos quais ocorre a forma grave e disseminada. Agente etiolgico: Histoplasma capsulatum Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de clima temperado. Fontes de infeco: inalao de esporos presentes em aerossis formados por solos contaminados com excretas de galinhas e morcgos. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula ssea, tecido obtido por bipsia de mucosas e outros. Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade do tcnico. Recomenda-se colorao por Giemsa, para melhor visualizao do agente em de cortes histolgicos, onde se evidencia sob imerso, pequenas leveduras (2-5 m), intracelulares, dentro de clulas mononucleares. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo que no primo-isolamento mais fcil obter a forma filamentosa de cor branca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura < 30C. A confirmao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e incubao entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa ou miceliana fase leveduriforme, vista com a formao de pequenas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao porm, feita pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de esporos grandemacrocondios- arredondados e com inmeras espculas ou granulaes na parede celular, chamados hipnsporos ou esporos tuberculados.
ESPOROTRICOSE
Infeco crnica cuja forma clnica mais freqente em nosso meio a forma linfangtica nodular ascendente. Atinge em geral, uma das extremidades sob forma de leso ulcerada no ponto de inoculao e acomete a drenagem linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas disseminadas so raras, em paciente imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.
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Agente etiolgico: Sporothrix schenckii Ocorrncia: doena de distribuio universal que acomete principalmente, trabalhadores rurais e floristas. Procedimento laboratorial: Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo. Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade mas, exame de cortes de tecido corados, pode revelar leveduras em forma de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso em brotamento (blastocondios). Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD, entre 7 a 12 dias e cuja forma filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e septadas com esporos disposto em arranjo semelhante flor "margarida". A forma leveduriforme (> 30C), no caracterstica do gnero e requer meios ricos acrescidos de sangue, cisteina e submetidos a tenso de CO2. O interesse na obteno da fase leveduriforme para a diferenciar o agente da esporotricose, do gnero Sporothricum, fungo filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificao do agente.
ASPERGILOSE
A aspergilose pode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como leses localizadas em unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alrgica. Em pacientes imunocomprometidos, tende forma disseminada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente, associada a neutropenia ou doenas debilitantes. Agente etiolgico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado) Ocorrncia: tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos desta doena como infeco secundria em pacientes em tratamento prolongado com antibitico e corticosterides, doenas debilitantes como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de tecidos subcutneos, da pele ou da crnea. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado brnquico. O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m de dimetro e que se ramificam em ngulo de at 45. Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada doena em humanos, podem ser facilmente, isoladas em ASD, em at 7 dias (crescimento rpido) com desenvolvimento, na superfcie do meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a verde-acinzentado, com a formao de esporos.
CRIPTOCOCOSE
A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primariamente, os pulmes, com tropismo pelo sistema nervoso central -meninges-, podendo atingir pele e outros tecidos. Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal. Procedimento laboratorial: Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, aspirado de formao tumoral subcutnea e tecidos obtidos por bipsia. O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia aps massagem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que constitui seu rgo de reserva. Exame obrigatoriamente, com tinta nanquim para observao de clulas capsuladas, com dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que sugerem Cryptococcus sp. Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer outro meio, desde que no contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce rpido (< 7 dias) entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme parda. A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumicas, como: teste da urease e auxanograma.
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CANDIDASE
Candidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces aguda e crnica mostram leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente, endocardite, meningite, fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas. Agentes etiolgicos: Candida albicans e outras espcies, que esto freqentemente, envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados. So os principais agentes etiolgicos de Infeces hospitalares. As espcies de Candida podem ser isoladas de vrios locais do corpo humano, como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vagina, regio perianal e trato gastrointestinal. Ocorrncia: - universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para desenvolvimento da doena, tais como: desnutrio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, quimioterapia e uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neoplasias e outras doenas debilitantes. Procedimento laboratorial: Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e unhas; raspados da mucosa oral, vaginal ou anal; secreo do trato respiratrio, sangue, liquor, urina e fezes. Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo de KOH 20%. Secreo do trato respiratrio ou material de mucosa podem ser examinados pela colorao de Gram. A levedura aparece como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so tambm observadas. Cultura: o crescimento rpido (24-72h) entre 25C e 37C. O aparecimento ocorre em torno de 3 a 4 dias, com formao de colnias com colorao branca bege. A habilidade de formar tubo germinativo e/ou clamidsporos na prova de cultivo em lmina, permite a identificao de C.albicans. Para a identificao das outras espcies do gnero Candida deve-se, alm do cultivo em lmina, procecer-se assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de fontes de carbono (zimograma) .
ZIGOMICOSE
Infeco geralmente, subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos debilitados, transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids. Pode acometer seios paranasais, tecido subcutneo, pulmo e vasos sanguneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose, em indivduos imunodeficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento especfico no for prontamente, estabelecido. Agentes etiolgicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gneros Mucor, Rhizopus e Absidia, entre outros. Ocorrncia: distribuio universal. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia de seios paranasais ou leses subcutneas. Exame com KOH a 20%, revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja caracterstica principal a ausncia de septos, que caracterizam as hifas cenocticas, desse grupo de fungos. Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, com hifas ereas abundantes. A identificao feita pela microscopia da colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos dentro de estruturas fechadas denominads esporngios.
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