Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Ditulis oleh Jim Clark pada 06-10-2007 HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. Pelaksanaan HPLC Pengantar HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka. Kolom dan pelarut Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai normal , ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui

pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses Diagram alir HPLC

Injeksi sampel Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya). Waktu retensi Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut

sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
y y y y

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa. Detektor Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X. Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak

yang kecil. Rangkaian HPLC pada spektrometer massa Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY

HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening. Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi. Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4

0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit. Rumus perhitungannya adalah y = b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar. Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai fungsi dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam. Hal ini sesuai dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai dengan prinsip tersebut maka komponen yang hidrofob dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan komponen yang hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah. Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruangan pembuangan dari HPLC ini dicuci dengan asam asetat. Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu : 1. Lebih teliti 2. Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu : 1. 2. 3. 4. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu Hanya bisa digunakan untuk asam organik Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

Diameter internal dari kolom HPLC adalah aspek yang penting yang menentukan kapasitas analit yang dapat dimasukkan dan dapat mempengaruhi sensitivitas. Kolom yang lebih lebar dijumpai di aplikasi industri seperti pemurnian obat-obatan, sedangkan kolom yang lebih sempit menaikkan sensitivitas dan hanya membutuhkan sedikit solven. Ukuran partikel juga berpengaruh. HPLC tradisional kebanyakan fase diamnya melekat pada partikel silika. Ukuran partikel yang paling umum adalah 5 m. Ukuran yang lebih kecil menyediakan luas area lebih besar dan separasi yang lebih baik, namun tekanan yang dibutuhkan untuk kecepatan linear optimum berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel. Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan sekarang ada UHPLC (Ultra HPLC) yang dapat bekerja pada tekanan sangat tinggi (1000 atm).

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Kerja HPLC pada prinsipnya adalahpemisahan setiap komponen dalam sample (analit-analit) berdasarkan kepolarannya, untukselanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponentersebut (kuantitatif). Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagaifasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLCdigunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (padakolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2 SiCl dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8.Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya air:asetonitril (80:20), dll, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan.Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, halini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yangdibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukurberdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggianpuncak yangmaksimum dari senyawa itu.Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: y tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) y kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuranpartikel) y komposisi yang tepat dari pelarut y temperatur pada kolom Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut (fasegerak) dan fase diam. Fase normal HPLC I ni secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis ataukromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polarmisalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurangdari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yangpolar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polarkemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatanrantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalamcampuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantaihidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul

polar dalam larutan. Olehkarena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerakbersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugushidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kuranglarut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnyasenyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Olehkarenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergeraklambat dalam kolom. I ni berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melaluikolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC B eberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan : y HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi, seperti analisakontaminasi melamin dalam pembuatan atau persiapan produk obat. y Z at- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkandengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. y Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikandengan kolom butiran berlapis zat berpori. y Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Z ipax-SAX. y Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air. HPLC juga dapat digunakanpenentuan kadar vitamin dalam bahan pangan. Selain itu, yang juga banyak dilakukan adalahpenggunaan HPLC untuk melihat komposisi asam amino dalam protein. y Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. y Aplikasi HPLC pada analisa pangan sangat beragam. Untuk karbohidrat, HPLC bisa digunakanuntuk gula dengan titik leleh rendah serta oligosakarida. Penentuan secara kuantitatif karbohidrat dalam bahan pangan dengan HPLC juga sudah menjadi standar baku. Untuk lipidyang kompleks, yang memiliki volatilitas rendah serta yang struktur kimianya sensitif terhadap suhu tinggi, HPLC juga menjadi pilihan terbaik. Selain itu, bisa diapakai untukanalisa kandungan nutrisi dalam makanan dan minuman, contoh : analisa kandunganpolifenol dalam teh

Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. I dentifikasidapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.Contoh :Analisa carotenoid dalam yeast.Pertama-tama sel yeast dipecahkan dengan DMSO agar carotenoid yang tersekap di dalam sel dapatkeluar. Kemudian diekstrak dengan pelarut methanol hingga semua carotenoid terambil. Karenacarotenoid sangat peka terhadap cahaya dan panas, maka selama pekerjaan sebisa mungkin tidakterekspos langsung oleh cahaya. Pengerjaan dilakukan di dark room. Carotenoid terdapat dalambentuk esternya, metil ester atau di metil ester. Oleh karena itu perlu treatment khusus agarcarotenoid menjadi bentuk bebasnya. Hal ini dilakukan dengan penambahan larutan KOH jenuh.Baru kemudian carotenoid dalam bentuk bebas ini di ekstrak dengan penambahan dietileter. Pelarutdiuapkan dengan gas nitrogen dan dilarutkan kembali dalam fasa mobil yang akan digunakan untukHPLC. Dalam percobaan ini digunakan standard B-carotene, C-18 sebagai kolom, dan fasag geraknyacampuran acetonitril dan methanol dengan sistem isokratik, dengan pertimbangan ini adalah pelarutyang umum dan mudah ditemukan.Dengan sistem isokratik dan flow 0.5 ml/min, B-carotene terelusi pada menit ke 45. Signal samplemenunjukkan terdapat B-carotene Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secarakuantitatif adalah: y Parameter percobaan sama antara standar dan sampel y Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama y Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutanstandar seri pada waktu retensi tertentu. o Berdasarkan area kromatogram o Berdasarkan tinggi puncak kromatogramHasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapatpeak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram denganbanyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkandalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis inidilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLCsudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikitmengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atasbanyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa)kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untukmengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang samadengan standard umumnya akan langsung di

vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zatyang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankandengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakanzat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perludilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Z at yang sama akan mempunyai spektrum 3Dyang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut jugadipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama