ENZIMOLOGA 2011-12

Tercera prctica (13 de enero de 2012)

Obtencin de parmetros cinticos y simulacin de procesos enzimticos. Durante la segunda prctica, se obtuvieron experimentalmente una serie de datos, correspondientes a una velocidad enzimtica obtenida a una determinada concentracin de sustrato, que se ajustaron manualmente utilizando Lineaweaver-Burk, obteniendo un valor de Km y vmax. Sin embargo, actualmente, dichos parmetros cinticos pueden obtenerse de forma mucho ms exacta y sencilla, utilizando una serie de programas que, a la vez, representan los datos experimentales. Del mismo modo, existen una serie de programas informticos que, con los datos de Km y vmax de una determinada enzima, permite simular una reaccin enzimtica determinada, lo que permite obtener los datos cinticos que se obtendran experimentalmente a una concentracin de sustrato determinada o, por ejemplo, en presencia de un determinado inhibidor. Objetivos de la prctica Obtener los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa, utilizando los datos de la segunda prctica, y comparndolos con los suministrados: [S] (mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 1.5 3 6 12 V ( M/min) 3.55 5.87 9.51 13.67 15.69 16.25 13.89 10.71

En primer lugar, utilizaremos un programa denominado Hyper32, que se encuentra en WebCT, en forma de archivo rar. Tras descomprimirlo, lo instalaremos en el ordenador. Hyper32 es un programa de fcil manejo, que permite introducir directamente los datos en dos columnas ([S] y velocity). Tras introducir los datos, hay que picar en el botn de calculate , obteniendo de esta manera los datos de Km y vmax mediante cuatro ajustes diferentes, lo que permite estimar ambos valores con un error mucho menor. Para visualizar los datos se pueden copiar los datos a un archivo de texto, obteniendo as los parmetros cinticos correspondientes a la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa. No obstante, qu datos creis que no deben usarse para realizar el ajuste? Son muy diferentes los datos de Km y vmax con respecto a los obtenidos por vosotros en la prctica?

Ahora, hagamos lo mismo analizando los datos obtenidos en el caso de la reaccin inhibida por el oxamato: [S] (mM) 0.1 0.2 0.4 0.8 1.5 V ( M/min) 1.25 2.37 4.33 6.89 9.83

Qu parmetro cambia? A qu tipo de inhibicin, por tanto, corresponde? Otro mtodo de tratamiento de los datos cinticos consiste en el programa Anmona, basado en Excel, y que permite, mediante modelos, ajustar los parmetros cinticos mediante regresin no lineal. Para utilizar este programa, utilizaremos la plantilla de excel anemona_esp , que contiene diferentes regresiones, para obtener modelos de Michaelis Menten, los diferentes tipos de inhibicin, as como para modelos de reacciones multisustrato. Para utilizar este programa, hay que asegurarse de que se dispone del complemento SOLVER instalado en Excel. De no ser as, simplemente hay que abrirlo desde Excel. Una vez dentro de anemona_esp, nos centraremos en dos de las opciones. En primer lugar, substrate inhibition , en el que sustituiremos los datos de [S] y de v. obs por los utilizados en el apartado anterior. Una vez hecho esto, se pueden modificar los parmetros cinticos iniciales, dado que conocemos, aproximadamente, los valores de Km y vmax, en base a los datos obtenidos en el programa Hyper32. El valor de Ksi, desconocido, lo podemos aproximar en base a la representacin que aparece a la derecha. De este modo, simplificaremos los clculos matemticos que realizar el programa. Del mismo modo, cambiaremos los lmites en los que se desarrollarn los clculos, estableciendo valores mximos y mnimos tanto para Km como para vmax. Una vez establecidas estas restricciones, se ejecutar el complemento SOLVER , modificando las opciones. Incrementaremos el nmero de iteraciones hasta 10.000, y el mtodo de resolucin ser el de gradientes conjugados . Tras esto, resolveremos el modelo, obteniendo una solucin que podremos mejorar modificando los valores de Km y vmax resultantes (aproximndolos a los experimentales), hasta obtener finalmente un valor de Ksi que permita el ajuste ptimo entre los valores experimentales y los que halla el programa. Una vez obtenidos tanto los valores de Km y Ksi, obtener la concentracin de sustrato a la que la velocidad es mxima (concentracin ptima).

[ S ptima ] ! K m K si
Es un valor similar al utilizado durante la prctica? De igual modo tambin podemos hacer una estimacin del valor de Ki, utilizando la hoja de Excel correspondiente a la inhibicin competitiva. Para hacer un ajuste, simplemente hay que

introducir los datos correspondientes en una de las tablas, y eliminar los datos que aparecen en las otras. Simulacin de procesos enzimticos. Aunque hasta ahora hemos trabajado con reacciones independientes (una enzima toma un sustrato y lo convierte en un producto determinado), en el interior celular esto no ocurre as. De este modo, utilizaremos un programa que nos permitir simular toda una ruta enzimtica, como la indicada en la siguiente imagen:

En esta cascada de seales existen hasta 9 reacciones enzimticas, que pueden ser activadas o inhibidas, de este modo, la llegada de una seal externa inhibira la reaccin 2 (llevada a cabo por ), mientras que activara la reaccin 1 (llevada a cabo por ). En este caso, la reaccin 8 es catalizada por una enzima que es regulada a travs de una cascada de fosforilaciones, mientras que la reaccin 9 es independiente y se producir tomando la parte de M que no se convierte en P1. El programa que utilizaremos para simular dicha ruta es el Gepasi 3, que podis descargar de la pgina web del autor, o accediendo a WebCT. Del mismo modo, utilizaremos un archivo predeterminado que contiene esta ruta, denominado signaltransduction.1.gps , que est disponible en WebCT. Tras instalar el programa, podris comprobar, en la opcin model definition , se muestran varios Kinetic Types , de forma que si pinchamos en cualquiera de ellos, se nos abrir una ventana que nos permitira editar la funcin seleccionada, aunque lo que nos interesa es que muestra la ecuacin correspondiente a cada uno de los ajustes cinticos (muestra, por ejemplo, la ecuacin de Michaelis Menten (E*s*kcat/(Km+s)), existiendo modelos ms complicados. Para cargar el modelo con el que trabajaremos, tras seleccionar File y open , buscaremos el archivo en el directorio en el que lo hayamos descargado.

Tras esto, notaremos que se han modificado la mayora de las ventanas que aparecen en model definition , adquiriendo esta configuracin: - Incluye hasta 9 reacciones; - Incluye 11 metabolitos, de los cuales, slo 3 estn fijados (Signal, S y P1), aunque podran modificarse; - En la opcin Kinetics , podemos seleccionar una amplia variedad de mecanismos enzimticos, aunque dejaremos seleccionados los que vienen indicados en el modelo (notad la presencia de modificadores de la actividad en algunos de ellos). - Tres relaciones de conservacin, de forma que las dos formas posibles de una enzima (activa e inactiva) sean el total (1). - Las unidades utilizadas son s, uM, uM/s, nl. Las reacciones que se ven afectadas por la seal (Signal), son las siguientes:
Reaction Kinase1 -> Kinase1-P Kinetics Catalytic activation (irreversible) Modifiers Signal (A) Kinetic Constants Kms = 1.E-003 V = 10 Ka = 0.5

Kinase1-P -> Kinase1

Uncompetitive inhibition

Signal (I)

Km = 1.E-3 V = 10 Ki = 0.5

En la pestaa tasks marcaremos los tiempos y nmero de puntos que queremos para las diferentes variables. Podemos dejar todas las que aparecen (algunas sern constantes y otras variables), obteniendo una matriz de resultados en la que se va modificando una o dos variables a la vez a lo largo del tiempo (salvo la reaccin S M, catalizada por 7, todas las dems estn relacionadas, de manera que al aumentar una, disminuye la otra). De este modo, crearemos un archivo en Time course (modificad el nombre que aparece), poniendo como tiempo total de la reaccin 5, con un total de 50 puntos. Podramos,

igualmente, hacer el anlisis de la reaccin en estado estacionario, introduciendo las mismas variables, pero no ser necesario. En la pestaa scan , tenemos que marcar la opcin Enable , en caso de que est seleccionada la opcin Disable . Una vez seleccionada, dentro de la opcin de Available tems , marcaremos la opcin de [Signal] en initial concentrations . Se pueden marcar muchas ms opciones, pero eso aumenta exponencialmente el nmero de simulaciones a ejecutar. En la opcin inferior (Scan Items), marcar lo siguiente: [Signal] Min 0.3 Max 0.7 Density 50 Una vez hecho esto, marcar la opcin logarithmic y dejar marcada la opcin regular grid . Seguidamente, marcar las siguientes opciones para el segundo de los Items: Kin2 inactivation (Km) Min 0.01 Max 1 Density 10 Una vez hecho esto, podemos simular la reaccin. Para ello, simplemente marcaremos la opcin run . Si queremos observar el desarrollo de la reaccin a lo largo del tiempo, podemos visualizar 4 condiciones diferentes, en time course , estando marcadas las concentraciones transitorias de las dos quinasas fosforiladas (Kinase1-P)t, (Kinase2-P)t, y de la enzima activa, [Enzyme-a]t, as como el flujo de formacin de P1, J(P1 formation). Una vez finaliza la simulacin, se genera un archivo txt que contiene toda la informacin del ensayo, as como el archivo que creamos en tasks, y que podremos abrir en Excel (hay que tener cuidado con la conversin de datos), teniendo en cuenta que cada una de las columnas representa una de las condiciones que aparecan en la ventana Tasks . Finalmente, podremos representar grficamente alguna de las condiciones, estudiando, por ejemplo, como se ajusta la activacin/desactivacin de las enzimas a la formacin de P1 o P2. El informe de esta prctica se entregar, por pdf o en el casillero del profesor en el Departamento de Bioqumica Vegetal y Fotosntesis, antes del prximo 30 de enero de 2011.