CENTRO UNIVERSITRIO METODISTA IZABELA HENDRIX

Alexandre Gurgel Martins Priscilla Rosemary Cludio Thasa Henriques de Arajo

CITOMETRIA DE FLUXO

Belo Horizonte 2011

Alexandre Gurgel Martins Priscilla Rosemary Cludio Thasa Henriques de Arajo

CITOMETRIA DE FLUXO

Trabalho elaborado como exigncia parcial da disciplina Imunologia Clnica no Centro Universitrio Metodista Izabela Hendrix, sob a orientao da prof Ana Tereza Chaves no 6 perodo do curso de Biomedicina.

Belo Horizonte 2011

SUMRIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. INTRODUO ..................................................................................................... 3 CITMETRO DE FLUXO ..................................................................................... 4 FUNDAMENTOS DA TCNICA DA CITOMETRIA DE FLUXO ........................... 5 PREPARAO DA AMOSTRA............................................................................ 6 ANLISE DOS DADOS........................................................................................ 6 CONCLUSO ...................................................................................................... 8

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 9

1. INTRODUO A citometria de fluxo um recurso emergente na rea de sade (humana e veterinria) que permite uma anlise rpida, objetiva e quantitativa de clulas em suspenso. As clulas da amostra em suspenso so marcadas com anticorpos monoclonais especficos ligados a fluorocromos, que permitem a identificao e a quantificao de clulas pelo tamanho, granulosidade e intensidade de fluorescncia (ROITT et al., 1999). Apesar de ter um alto custo e a necessidade de realizao por tcnicos especializados para realizao dos procedimentos, esta tcnica tem uma ampla aplicao em hematologia e imunologia por exemplo. (CRTE-REAL, 2002) Os citmetros de uxo tornam possvel medir simultaneamente mltiplos parmetros em cada clula individualmente e/ou num nmero mais elevado de clulas de uma populao celular pura. De fato, com os citmetros atuais pode-se realizar medies multidimensionais globais em populaes de clulas eucariticas ou procariticas, ou mesmo de partculas biolgicas sub-celulares. Medir vrios parmetros estruturais e/ou funcionais em populaes de clulas vivas, sem as invadir sicamente e sem afetar a sua integridade ou afetando-a minimamente e com a possibilidade de observao, ao longo do tempo, outra vantagem do uso de citometria de fluxo. (CRTE-REAL, 2002)

2. CITMETRO DE FLUXO O citmetro de fluxo um aparelho utilizado para avaliao da emisso de fluorescncia das clulas (FACS Fluorescence Activated Cell Sorter). Alguns aparelhos so capazes de separar fisicamente as clulas, de acordo com as caractersticas citomtricas (ROITT et al., 1999). As clulas da amostra em suspenso so marcadas com reagentes fluorescentes especficos para deteco de molculas de superfcie e so introduzidas numa cmara de fluxo vibratria. O fluxo de clulas que atravessa a cmara envolvido por uma soluo tampo, sendo que milhares de clulas ou partculas podem passar em fila simples por segundo por meio do sensor eletrnico. O fluxo iluminado por um laser, que tem uma energia de luz incidente especfica. Cada clula avaliada com relao ao tamanho (dispersor de luz anterior); granulosidade (dispersor de 90) e intensidade de fluorescncia para deteco de antgenos de superfcie diferentes (imunofenotipagem). A vibrao do fluxo celular provoca o rompimento em gotculas que podem ser carregadas eletricamente e, a partir da, dirigidas por placas de deflexo eletromagntica para serem coletadas em diferentes populaes celulares de acordo com os parmetros medidos, sob controle de um computador (ROITT et al., 1999). O aparelho composto basicamente das seguintes partes: fonte de luz, cmara de fluxo, sistema ptico, sensores de luz e computador. A cmara de fluxo est no centro do instrumento. Ela projetada para entregar as clulas em fila no ponto de medio. A amostra em anlise injetada no centro de um fluxo de lquido (gua ou tampo), chamado de fluido bainha. H duas possibilidades para construo da cmara. A primeira utiliza sistemas com microscpio, em que fluorescncia medida em linha com o feixe de luz incidente. J o segundo tipo usa cmaras que utilizam sistemas com laser, em que a fluorescncia medida em ngulos retos em relao ao feixe de iluminao. (ORMEROD, 2008) A fonte de luz pode ser um laser, uma lmpada de arco ou at mesmo um LED. Hoje, a maioria dos instrumentos usa o laser. Lmpadas de arco necessitam de filtros pticos para selecionar o comprimento de onda adequado. Eles no do a sensibilidade necessria para observar fluorescncia fraca, mas oferecem uma

alternativa mais barata para a observao de fluorescncias fortes, por exemplo, na anlise de DNA. (ORMEROD, 2008) Lasers so escolhidos porque produzem um feixe de alta intensidade de luz monocromtica. Eles tambm so pequenos, o que importante, uma vez que a luz precisa ser focada em um volume pequeno para a obteno de excitao mxima de uma nica clula e para minimizar a probabilidade de haver mais de uma clula no feixe de laser. (ORMEROD, 2008) O laser mais comum primrio o de on-argnio, produzindo luz azul a 488 nm. Este comprimento de onda mais conveniente para a excitao de fluorescena, o primeiro marcador de imunofluorescncia a ser utilizado. Outros lasers de uso geral incluem He-Ne (633 nm) e He-CD (325 nm). (ORMEROD, 2008) Enquanto uma maior potncia melhora a sensibilidade, h uma desvantagem em termos de aumento de custo de manuteno e tamanho. Alguns aplicativos especializados necessitam de lasers mais potentes, tais como para anlise cromossmica. (ORMEROD, 2008) 3. FUNDAMENTOS DA TCNICA DA CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo pode ser usada para identificao de determinadas clulas em suspenso, promovendo a identificao e a quantificao de clulas pelo tamanho, granulosidade e intensidade de fluorescncia destas clulas (ROITT et al., 1999). A avaliao do tamanho relativo da clula (Forward scatter FSC) e da granulosidade ou complexidade interna da clula (Side Scatter SSC) permite a classificao dos leuccitos em linfcitos, moncitos e granulcitos (NAKAGE, 2005). A imunofenotipagem consiste no isolamento de populaes de clulas distintas com diferentes antgenos de superfcie marcados com anticorpos fluorescentes especficos. A avaliao da intensidade de fluorescncia ocorre para deteco de antgenos de superfcie diferentes marcados com anticorpos monoclonais especficos ligados a compostos qumicos fluorescentes (fluorocromos). Os anticorpos monoclonais so os reagentes de escolha devido sua especificidade, reao cruzada mnima e reprodutibilidade O termo CD (Cluster Designation) utilizado para denominar os anticorpos monoclonais criados em

diferentes laboratrios de todo o mundo contra antgenos leucocitrios humanos (ROITT, 1999). 4. PREPARAO DA AMOSTRA A coleta e o processamento da amostra variam de acordo com o tipo celular a ser analisado, o local de onde proveniente e o mtodo de ensaio. Vrios anticoagulantes como o EDTA, citrato de sdio e heparina tm sido utilizados com sucesso. O volume de amostra necessrio para anlise, geralmente, de 100L de sangue perifrico ou medula ssea. Clulas danificadas ou mortas alteram as propriedades de tamanho e granulosidade nos grficos e ligao inespecfica de anticorpos monoclonais. Portanto, o sangue deve ser refrigerado e processado at 24 horas aps a coleta da amostra (NAKAGE, 2005). O mtodo bsico do processamento de amostras por meio da citometria de fluxo comum na maioria dos ensaios. Geralmente, as clulas so incubadas por 30 a 60 minutos com um anticorpo marcado com fluorocromo ou somente com um anticorpo monoclonal especfico. Se o anticorpo monoclonal marcado com o fluorocromo, a suspenso celular lavada, ressuspendida em soluo tampo e analisada. Se o anticorpo primrio no marcado, aps lavar a suspenso celular, adicionado um anticorpo anticamundongo. Os anticorpos secundrios se ligam proporcionalmente quantidade de anticorpo primrio que ligado. Aps a remoo do anticorpo secundrio em excesso, pela lavagem, a amostra analisada (NAKAGE, 2005). 5. ANLISE DOS DADOS Os dados de cada clula que passa pelo fluxo no citmetro so coletados por sensores eletrnico, que os envia para o computador. O computador de certa forma a pea chave para a realizao da tcnica, pois responsvel pela possibilidade de se fazer a anlise de dados do estudo em questo. Os dados podem ser armazenados em dois tipos de grficos: os histogramas monoparamtricos e os histogramas multiparamtricos. Os grficos monoparamtricos exibem dados de um nico parmetro. J os multiparamtricos

pode-se mostrar a correlao entre dois parmetros usando um histograma bivariado. No entanto, praticamente impossvel visualizar as correlaes de dados multiparamtricos, geralmente compostas por at 12 fluorescncias medidas em cada clula. Dessa forma, deve-se adotar uma estratgia em que se utilizam as chamadas regies e gates. (ORMEROD, 2008) Tendo em mos o histograma multiparamrico, as regies consistem em formas que so desenhados em torno de uma populao de interesse em um lote de um ou dois parmetros. Quando uma regio usada para limitar as clulas que so extradas em um espao, chamado de gate. (ORMEROD, 2008) A partir do gate, possvel determinar-se quadrantes em que a anlise das clulas contidas naquele espao ficar mais apurada e exata.

6. CONCLUSO A metodologia da citometria de fluxo, apesar do alto custo e da necessidade de tcnicos especializados, permite uma anlise rpida, eficiente e quantitativa de clulas em suspenso. Esta tcnica emergente tem ampla aplicao na hematologia e imunologia, sendo que a rea de pesquisa que mais se beneficia dessa ferramenta que possibilita que se obtenham dados muito exatos e imprescindveis para o desenvolvimento da cincia.

BIBLIOGRAFIA
CRTE-REAL, Manuela et.al. Contributos da citologia analtica para estudos de biologia de leveduras. Boletim de Biotecnologia, n. 71, Abr. 2002. Disponvel em: <http://deqb.ist.utl.pt/bbio/71/pdf/citolanalitica.pdf>. Acesso em: 01 dez. 2011 NAKAGE, Ana Paula Massae et al . Metodologia e aplicao da citometria de fluxo na hematologia veterinria. Cienc. Rural, Santa Maria, v. 35, n. 4, Ago. 2005. Disponvel em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-84782005000400040>. Acesso em: 01 dez. 2011. ORMEROD, Michael. Flow Cytometry - A Basic Introduction. Oxford, 2008. Disponvel em: <http://flowbook.denovosoftware.com>. Acesso em: 28 nov. 2011. ROITT, I. et al. Imunologia. So Paulo: Manole, 1999. 424p.