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SERVIO PBLICO FEDERAL MINISTRIO DA EDUCAO INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO PAR CURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA

CLUDIA DA FONSECA GOMES RUBENS FERNANDO GONALVES RIBEIRO JNIOR

ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM ERITRCITOS DE TILPIAS Oreochromis niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTSSIO

BELM 2011

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO PAR CURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA

CLUDIA DA FONSECA GOMES RUBENS FERNANDO GONALVES RIBEIRO JNIOR

ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM ERITRCITOS DE TILPIAS Oreochromis niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTSSIO

Trabalho Acadmico de Concluso de Curso apresentado ao Colegiado Especfico de Biologia do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Par IFPA, como requisito para a obteno do Grau em Licenciatura Plena em Biologia, sob a orientao do Prof. Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha.

BELM 2011

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO PAR CURSO DE LICENCIATURA PLENA EM BIOLOGIA

Cludia da Fonseca Gomes Rubens Fernando Gonalves Ribeiro Jnior

ESTUDO DA GENOTOXICIDADE EM HEMCIAS DE TILPIAS Oreochromis

niloticus EXPOSTAS AO DICROMATO DE POTSSIO

Data de Defesa: ___/ ___/ ___ Conceito: ________________

Banca Examinadora

_____________________________________________ Prof. Orientador: Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, IFPA _____________________________________________ Prof. MsC. Carlos Manoel Fernandes - SEDUC _____________________________________________ Prof. MsC. Plnio Cerqueira dos Santos Cardoso - UFPA

A Deus pela fora em todos os momentos de nossas vidas, por meio da f para enfrentarmos o desafio de alcanar um sonho; A todos os nossos familiares que direta ou indiretamente ajudaram nessa conquista na concluso de mais uma etapa de nossa formao profissional.

AGRADECIMENTOS CLUDIA GOMES A Deus pela vida, pela oportunidade de estudar Biologia e pelos melhores 3 anos de minha vida. Aos meus pais, Carlos Alberto e Maria de Nazar, pelo apoio, demonstrao de amor e pelo incentivo ao longo de minha vida. Aos meus filhos, Christian e Carlinhos, pela compreenso devido ausncia nesses anos de formao acadmica e amor a mim dedicado. A toda minha famlia, em especial meu irmo, Rodrigo, pelo incentivo e apoio nesse perodo de minha vida. Ao meu namorado, Rubens, pelo seu companheirismo, pacincia, apoio e o amor a mim dedicado. minha segunda me, Ray, pelo fundamental apoio, pacincia e dedicao durante o curso. Ao meu professor orientador Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, pela ateno na orientao, apoio, confiana e pelos valiosos ensinamentos durante o desenvolvimento deste trabalho durante a graduao. Ao professor Laudemir Arajo, pelo apoio, ateno e ensinamentos transmitidos. Aos colegas de coordenao de recursos pesqueiros do IFPA, Henrique e Sntia que muito me ajudaram na realizao deste trabalho. A todos os professores do curso de Licenciatura Plena em Biologia que colaboraram com a minha formao. Aos colegas de turma do curso, especialmente a Bixinho, Camila, Dani, Jeh, Brbara, Fernando, Brenna e Augusto, pelos melhores momentos de alegria e descontrao. Aos amigos, em especial Airton, Lili e Seu Luiz, que direta ou indiretamente contriburam nessa conquista.

AGRADECIMENTOS RUBENS FERNANDO JNIOR A Deus pela vida, pela oportunidade de estudar Biologia e pelos melhores 3 anos de minha vida. Aos meus pais, Rubens Fernando e Ray, pelo apoio, demonstrao de amor e pelo incentivo ao longo de minha vida. toda minha famlia, em especial minha av Maria das Dores, meus tios Reinaldo (in memorian), Ronaldo, Wilton, Wilson (in memorian) e, principalmente, tio Washington, pela grande ajuda e incentivo nesses 3 anos de curso. Ao meu segundo pai, tio Zeca, por participar da minha criao de vida, por ter pacincia e amor por mim. minha namorada, Cludia, pelo seu companheirismo, pacincia, apoio e o amor a mim dedicado. Ao meu professor orientador Dr. Carlos Alberto Machado da Rocha, pela ateno na orientao, apoio, confiana e pelos valiosos ensinamentos durante o desenvolvimento deste trabalho durante a graduao. Ao professor Laudemir Arajo, pelo apoio, ateno e ensinamentos transmitidos. Aos colegas de coordenao de recursos pesqueiros do IFPA, Henrique e Sntia que muito me ajudaram na realizao deste trabalho. aluna do 5 semestre de biologia do IFPA, Tassia Fernanda da Silva, pela grande ajuda na coleta do sangue e biometria dos peixes. A todos os professores do curso de Licenciatura Plena em Biologia que colaboraram com a minha formao. Aos amigos, em especial der Moreira e Moiss Jnior, que direta ou indiretamente contriburam nessa conquista, atravs de incentivo e companheirismo. Aos colegas de turma do curso, especialmente a Bixinho, Camila, Dani, Jeh, Brbara, Fernando, Brenna, Augusto e Werena pelos melhores momentos de alegria e descontrao.

Nunca se afaste dos seus sonhos, pois se eles se forem, voc continuar vivendo, mas ter deixado de existir. Charles Chaplin

RESUMO O crescimento urbano e industrial um dos principais fatores responsveis pelo aumento da quantidade e complexidade dos resduos que so lanados no meio ambiente aqutico, os quais provocam srios problemas, ecolgicos e toxicolgicos. O dicromato de potssio (K2Cr2O7) um composto com diversas aplicaes na indstria, como: componente de cimento, objetos cromados, tintura de tecidos e curtimento de couro. Diferentes organismos aquticos como moluscos, bivalves, peixes e anfbios tm sido usados para investigao da genotoxicidade na gua, atravs de bioensaios. O objetivo deste trabalho avaliar os efeitos genotxicos e mutagnicos do composto dicromato de potssio em tilpias do Nilo (Oreochromis niloticus), atravs do Teste do Microncleo. O grupo (n = 7), primeiramente no exposto, serviu de controle e aps isso, foram submetidos concentrao de 12 mg.L-1 (n = 7). Para cada 2.000 eritrcitos do sangue dos peixes no foram encontrados microncleos no grupo controle. J no grupo exposto ao composto genotxico durante 24h, a frequncia foi 0.5 0.94 e no grupo exposto por 48h foi 1.21 1.42. Quanto s alteraes morfonucleares, a frequncia do grupo controle, exposto 24h e exposto 48h foi de 2.14 2.77, 2.93 2.02 e 5.5 5.98, respectivamente. O resultado do teste paramtrico ANOVA: um critrio mostrou diferena significativa entre os grupos controle e expostos durante 48h para microncleos e diferena estatisticamente no significativa para as anormalidades morfonucleares. Os resultados confirmam o poder mutagnico do dicromato de potssio e mostram que a espcie Oreochromis niloticus um modelo experimental adequado para monitorar a poluio de ecossistemas aquticos. PALAVRAS-CHAVE: Teste do Microncleo; Oreochromis niloticus; Dicromato de potssio; Genotoxicidade.

ABSTRACT The urban and industrial growth is a major factor behind the increased volume and complexity of waste being released into the aquatic environment, which cause serious ecological and toxicological investigations. Potassium dichromate (K2Cr2O7) is a compound with several applications in industry, such as: a component of cement, chrome objects, dyeing cloth and leather tanning. Different aquatic organisms such as mollusks, bivalves, fish and amphibians have been used for investigation of genotoxicity in water, through the method. The aim of this study is to evaluate the genotoxic and mutagenic effects of the compound potassium dichromate in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) through the micronucleus test. The group (n = 7), first non-exposed was the control and after it underwent a concentration of 12 mg.L-1 (n = 7). For every 2,000 blood erythrocytes of fish micronuclei were not found in the control group. In the group exposed to the genotoxic compound for 24 hours, the frequency was 0.5 0.94 in the group exposed for 48 hours was 1.21 1.42. For amendments morfonucleares, the frequency of the control group, exposed and exposed 24 hours 48 hours was 2.14 2.77, 2.93 2.02 and 05.05 5.98, respectively. The outcome of the ANOVA: a significant difference between test and control groups were exposed for 48h to micronuclei and statistically not significant abnormalities morfonucleares. The results confirm the mutagenic power of potassium dichromate and show that the species Oreochromis niloticus is an adequate experimental model to monitor pollution of aquatic ecosystems. KEY-WORDS: Micronucleus test; Oreochromis niloticus; Potassium dichromate, Genotoxicity.

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LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 Figura 2 Espcime de Oreochromis niloticus......................................................... Aqurios do Laboratrio de Biologia Aqutica do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Par................................................ Aqurios contaminados com dicromato de potssio (K2Cr2O7) na concentrao de 12 mg.L-1...................................................................... Biometria dos peixes da espcie Oreochromis niloticus. (A) Medida do Figura 4 Peso (g). (B) Medida do Comprimento (cm)............................................ Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Coleta do sangue atravs da puno da veia caudal.............................. Esfregao do sangue na lmina............................................................... Preparao de duas lminas para cada peixe......................................... Lminas coradas com Giemsa 5% secando ao ar................................... Eritrcitos de O. niloticus corados com Giemsa 5%, em ampliao de 1.000X. A seta indica um microncleo..................................................... Anormalidade Morfolgica Nuclear (AMN) encontrada em eritrcito de O. niloticus. A seta indica uma invaginao do ncleo............................ Resultado do Teste ANOVA: um critrio evidenciando diferena significativa entre o controle e o grupo exposto no tempo de 48h........... Representao das frequncias de microncleos tpicos (por 2.000 eritrcitos) em Oreochromis niloticus....................................................... Resultado do Teste ANOVA: um critrio evidenciando diferena significativa entre o grupo controle e os expostos (p = 0,0765)............... Representao das frequncias de AMN (por 2.000 eritrcitos) em Oreochromis niloticus............................................................................... 43 43 42 42 40 40 34 34 35 35 36 33 32 31

Figura 3

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

SUMRIO 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. INTRODUO............................................................................................... REVISO DA LITERATURA......................................................................... Genotoxicidade em Organismos Aquticos................................................... Teste do microncleo (TMN).......................................................................... Oreochromis niloticus..................................................................................... Dicromato de Potssio................................................................................... 12 18 18 21 24 28

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3. 3.1. 3.2. 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 5. 5.1. 5.2. 6. 6.1. 6.2. 7.

OBJETIVOS................................................................................................... Objetivo Geral................................................................................................. Objetivos Especficos..................................................................................... MATERIAIS E MTODOS............................................................................. Materiais......................................................................................................... Organismos Utilizados Como Bioindicadores................................................ Coleta e Aclimatao Dos Animais................................................................ Mtodos.......................................................................................................... Tratamento Dos Animais e Obteno Do Sangue Para o Bioensaio......... Teste do Microncleo..................................................................................... Bioensaio com Oreochromis niloticus............................................................ Anlises Estatsticas....................................................................................... RESULTADOS............................................................................................... Teste do Microncleo..................................................................................... Anormalidades Morfonucleares (AMN).......................................................... DISCUSSO.................................................................................................. Teste do Microncleo..................................................................................... Alteraes Morfolgicas Nucleares................................................................ CONCLUSO................................................................................................ REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................. APNDICES...................................................................................................

31 31 31 32 32 31 33 34 34 35 39 40 41 43 44 45 48 49 50 51 62

1. INTRODUO Com o advento da revoluo industrial, a capacidade do homem para modificar o ambiente tem se tornado ampla e profunda. Assim, aps esse perodo, um grande nmero de substncias qumicas tem sido lanado nos ecossistemas aquticos, terrestres e na atmosfera (Bertoletti, 2001). Durante as ltimas trs dcadas, a comunidade cientfica e agncias regulatrias tm tomado conscincia a cerca dos impactos ambientais sobre a sade humana e a sustentabilidade dos ecossistemas (Bickham et al., 2000). Devido ao processo industrial, a descarga de efluentes com elevados nveis de resduos metlicos nos corpos dgua torna-se cada vez mais preocupante. A verificao do

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impacto destes materiais nas populaes naturais um alerta quanto ao estado de contaminao de seres vivos (Campana et al., 2003). A grande variedade de compostos produzidos pela atividade humana ao longo de sua evoluo e principalmente com o avano tecnolgico, onde os resduos dessas atividades passaram a ser prejudicial ao meio ambiente e aos seres que o habitam, criou-se a necessidade de uma cincia que estudasse os efeitos txicos nos organismos expostos a essas substncias. Essa cincia denominada de toxicologia e pode ser definida como: a cincia que define os limites de segurana dos agentes qumicos, entendendo-se por segurana a probabilidade de uma substncia no produzir danos em uma situao especfica (Schvartsman, 1985). O risco que um agente qumico impe ao ambiente aqutico avaliado atravs do julgamento cientfico da probabilidade dos danos que suas concentraes ambientais podem causar (Panhota & Rocha, 2005). Testes de toxicidade so experimentos, nos quais organismos vivos so colocados frente compostos ou substncias qumicas e suas reaes so observadas, sendo seus efeitos crnicos ou agudos (Harmel, 2004). Segundo Goldstein (1990), os testes de toxicidade tm como objetivo avaliar os efeitos deletrios causados a organismos aquticos representativos do ambiente em vrias concentraes de uma ou mais substncias, durante um determinado perodo de tempo. Eles visam exatamente a determinar os efeitos deletrios para a comunidade aqutica, causados pela emisso de agentes txicos (Bassoi, 1990). Metais pesados, tambm denominados elementos trao, podem ser essenciais ao metabolismo de organismos vivos, e, ao mesmo tempo, dependendo

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de suas concentraes, altamente txicos (Porto, 2009). Neste caso, eles podem apresentar potencial genotxico, citotxico e carcinognico, uma vez que elementos metlicos (como por exemplo, o cromo) apresentam resultados positivos relacionados toxicidade gentica (Westphalen, 2006). Os impactos ambientais provenientes dos metais pesados so mais preocupantes do que as excessivas cargas orgnicas degradveis (Oliveira & Pasqual, 2004). Vrias substncias so indicadas para serem utilizadas como substncia de referncia em testes de sensibilidade, entre elas sulfato de cobre (CuSO 4.5H2O), cloreto de cdmio (CdCl2), cloreto de potssio (KCl), sulfato de zinco (ZnSO 4.7H2O), dodecil sulfato de sdio (C12H25NaSO4), cloreto de sdio (NaCl) e dicromato de potssio (K2Cr2O7) (EPA, 1989; Lewis, 1995;Alves,2002). O cromo um metal de transio com trs estados de oxidao: +2, +3 e +6, formando diversos compostos coloridos. O cromo trivalente essencial na nutrio humana, com atuao no metabolismo da glicose, mas o cromo hexavalente a forma menos estvel e mais biologicamente reativa, altamente txica, genotxica e carcinognica (Templeton, 2000; Csuros & Csuros, 2002). A contaminao ambiental com os compostos txicos, produzidos por atividades industriais, domsticas e agrcolas, resulta em alteraes no equilbrio biolgico e ecolgico das populaes de animais e vegetais presentes nos ambientes aquticos (Nakagome et al., 2007). Uma vez carreados para dentro dos corpos dgua, os compostos txicos podem interagir diretamente com a biota por ingesto e contato, ou se depositar nos sedimentos (Magalhes & Filho, 2008).

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Essas interaes podem afetar o crescimento, desenvolvimento, a reproduo e favorecer a ocorrncia de doenas, mudanas bioqumicas, fisiolgicas e comportamentais nos organismos aquticos (Markaverich et al., 2002). Alm disso, esses poluentes podem tambm agir indiretamente alterando os ciclos naturais de matria e energia, provocando a desestabilizao dos ecossistemas aquticos e, reduzindo significativamente a capacidade de reestruturao desses sistemas (Rand & Petrocelli, 1985). As substncias qumicas tm um potencial txico que depende da concentrao no ponto de contato dos organismos no ambiente. baseado neste ponto que os seres vivos desencadeiam sua capacidade de proteo, que consiste principalmente na habilidade do organismo de metabolizao e excreo dos agentes agressores (Knie & Lopes, 2004). A exposio a metais pesados conhecida por causar alterao nos parmetros hematolgicos em peixes (Heath, 1995). Um parmetro utilizado na bioindicao a gerao de fragmentos de material gentico, conhecidos como microncleos (MN), devido atividade de agentes clastognicos que provocam quebras cromossmicas. Esses fragmentos surgem no citoplasma quando uma parte dos cromossomos, cromtides ou cromossomos inteiros no so incorporados nos ncleos das clulas filhas na mitose, frequentemente, porque estes fragmentos no tm centrmeros; estas partes deixadas para trs so incorporadas nos ncleos secundrios, conhecidos como microncleos (Schmid, 1975; Heddle et al., 1983; Ribeiro et al., 2003). O interesse crescente em genotoxicidade causados por poluentes ambientais conduziu ao desenvolvimento de testes para detectar e identificar

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genotoxicantes no ar, gua e terra (Grisolia & Cordeiro, 2000). Embora haja um nmero grande de ensaios para avaliar a genotoxicidade, apenas um nmero relativamente pequeno empregado na avaliao de misturas complexas (Claxton et al., 1998). Alguns mtodos so empregados de forma isolada ou combinados, para verificar a habilidade de medir genotoxicidade, particularmente em guas de superfcie naturais (Reifferscheid & Grummt, 2000), tais como: SMART (Karekar et al., 2000; Amaral et al., 2005; 2006; Pantaleo et al., 2007); Microncleos (Ma et al., 1995; Wang, 1999; Moraes & Jordo, 2001; avas & Ergene-Gzkara, 2003; 2005; Andrade et al., 2004; Buschini et al., 2004; Pantaleo et al., 2006); Cometa (Andrade et al., 2004); Ames (Karekar et al., 2000; Ohe et al., 2003). Neste trabalho foi utilizado o Teste do Microncleo que, quando comparado com outras tcnicas de deteco de danos no DNA, tem algumas vantagens: (1) feito rapidamente; (2) no complexo; (3) apresenta baixo custo; (4) sua preparao e anlise so simples e mais fceis que o teste de aberraes cromossmicas (Rocha et al., 2009a). Os microncleos so, estruturalmente, ncleos representando o material gentico que foi perdido pelo ncleo principal, como conseqncia de um dano gentico que pode ser causado por agentes fsicos, qumicos ou biolgicos, capazes de interferir no processo de ligao do cromossomo s fibras do fuso, ou que possam induzir a perda de material gentico (cromossomos inteiros ou fragmentos). O teste do microncleo, portanto, detecta mutagnese cromossmica em eucariotos do tipo clastognese, aneugnese e danos no fuso mittico (Silva et al., 2003). O teste do microncleo em eritrcitos e linfcitos pode ser utilizado como indicador dos efeitos txicos em determinadas populaes-alvo (Berces et al., 1993).

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Em peixes, os testes do microncleo psceo geralmente so feitos utilizando eritrcitos, embora os tecidos do fgado e das clulas branquiais tambm sejam usados (Ferraro, 2003; Beninc, 2006). Para biomonitorar esses elementos mutagnicos, a anlise de microncleos utilizando sangue perifrico, em vez de tecidos muito vantajosa, uma vez que clulas vermelhas de sangue perifrico so to sensveis quanto s clulas dos rins, principal rgo hematopoitico dos peixes e, muito mais fcil de obter uma amostra. Nos organismos com tamanho adequado, amostras de sangue perifrico tambm permitem o acompanhamento da reao do organismo ao poluente por meio de amostragens diferentes (Grisolia, 2002).

Neste sentido, utilizamos como bioindicadores de toxicidade as tilpias do Nilo: Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1757). Considerando que os peixes esto entre os organismos atualmente utilizados para a observao de microncleos nos ensaios de genotoxicidade (Grisolia, 2002).

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2. REVISO DA LITERATURA 2.1. Genotoxicidade em Organismos Aquticos A genotoxicidade o setor da gentica que estuda os processos que alteram a base gentica da vida, quer seja em sua estrutura fsico-qumica, o DNA (cido desoxirribonuclico), processo este classificado de mutagnese; quer seja na alterao do determinismo gentico ao nvel celular ou orgnico, identificados respectivamente como: carcinognese e teratognese. Tambm, a genotoxicidade estuda, sob o aspecto gentico, o que perturba a vida ou induz a morte tanto em nvel de clula como de organismo. Por ser uma especialidade relativamente recente, e se situa na interface entre toxicologia e gentica, por isto denominada, frequentemente, tambm, de gentica toxicolgica (Silva et al., 2003). Entre os contaminantes aquticos decorrentes das atividades

antropognicas, os agrotxicos so os mais perigosos, justamente pelo fato de

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terem sido concebidos para eliminar alguma forma de vida e, por isso, atingirem tambm de modo letal espcies no-alvo. No ambiente aqutico, os agrotxicos provocam impactos em mltiplos nveis, incluindo molculas, tecidos, rgos, indivduos, populaes e comunidades (Grisolia, 2005). Os efluentes domsticos geralmente contaminam a gua com patgenos, substncias orgnicas degradveis por bactrias e com detergentes. Os efluentes agropecurios apresentam alta carga de fertilizantes, praguicidas e detritos animais. J os efluentes industriais so constitudos por substncias txicas, que podem ser divididos em dois grupos, os compostos orgnicos (petrleo e derivados, fenis) e inorgnicos (metais pesados) (Felemberg, 1980). Os impactos ambientais provenientes dos metais pesados so mais preocupantes do que as excessivas cargas orgnicas degradveis (Oliveira & Pasqual, 2004). Metais txicos e suas combinaes tendem a se acumular nos organismos (Ferraro et al., 2004) e muitos so potentes mutgenos capazes de induzir tumores em humanos e animais experimentais (Matsumoto et al., 2006). Sem dvida, o crescimento urbano e industrial um dos principais fatores responsveis pelo aumento da quantidade e complexidade dos resduos que so lanados no meio ambiente, os quais provocam srios problemas ecolgicos e toxicolgicos para a maioria dos pases desenvolvidos e em desenvolvimento (Barbosa, 2000). Segundo Rand et al. (1995), txico um agente que produz efeito adverso no sistema biolgico, alterando sua estrutura ou funo, ou pode tambm provocar a morte. Pode ser introduzido deliberadamente ou acidentalmente nos ecossistemas

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aquticos, prejudicando a qualidade da gua e tornando-a desfavorvel preservao da vida aqutica e sade humana. Na avaliao do impacto de substncias txicas em sistemas aquticos, as anlises qumicas so muito importantes, mas so limitadas e insuficientes para a real compreenso dos processos e interaes com o meio e a biota, e na estimao dos efeitos na estrutura e funo ecolgica (Manrique, 2009). Para suprir estas limitaes os testes ecotoxicolgicos com organismos aquticos so utilizados, pois permitem testar hipteses mais abrangentes relativas sade dos sistemas hdricos submetidas s mais diversas formas de poluio qumica (Espndola et al., 2003). Assim, duas grandes preocupaes tm levado ao uso de testes de toxicidade gentica para identificar mutgenos qumicos e caracterizar seus efeitos. A primeira a induo de mutao em clulas germinativas, que pode, tanto afetar a desempenho reprodutivo do indivduo, como resultar em doenas genticas nas geraes futuras. A segunda preocupao baseada no papel da mutao em clulas somticas, na iniciao e progresso de doenas degenerativas como o cncer (Ribeiro, 2003).

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2.2. Teste do microncleo (TMN) O teste do microncleo (TMN), desenvolvido por Schmid (1975) utilizando clulas da medula ssea de mamferos, tem sido aplicado extensivamente para testar a genotoxicidade de produtos qumicos. O teste tem sido utilizado, com sucesso, em invertebrados, peixes e anfbios, sendo estes monitores biolgicos de reas contaminadas (ensaio in situ), e na anlise de compostos para determinar sua genotoxicidade, aps a exposio direta ou indireta em vivo (Jaylet et al., 1986; Hose et al., 1987; Brunetti et al., 1988; De Flora et al., 1993; Nepomuceno et al., 1997). Pelo teste dos microncleos podem-se detectar compostos que interferem na formao do fuso mittico, alterando a distribuio equitativa dos cromossomos durante a diviso celular, ou ao nvel de protenas diretamente envolvidas na segregao cromossmica, com a vantagem de ser mais rpido que a anlise de aberraes cromossmicas (Al-Sabti & Metcalfe, 1995). Assim, este teste detecta

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tanto eventos aneugnicos (alteraes no nmero de cromossomos do genoma, devido a erros na distribuio destes durante o processo de diviso celular), quanto eventos clastognicos (quebras que produzem alteraes na estrutura dos cromossomos). Microncleos resultam de leses no DNA ou cromossomos, ou em nvel de protenas direta ou indiretamente envolvidas na segregao cromossmica (como a tubulina, por exemplo). A formao de microncleos depende da perda de fragmentos cromossmicos ou de cromossomos inteiros, e requer diviso mittica ou meitica (Kirsch-Volders et al., 1998). Sabe-se que perdas cromossmicas e a no segregao de cromossomos (no disjuno), so importantes eventos no cncer e que eles so causados por defeitos no fuso, centrmero ou como uma conseqncia da no-condensao da estrutura cromossmica antes da metfase (Fenech, 2000). As vantagens do teste do microncleo incluem, alm da simplicidade e rapidez: (1) MN pode ser observado durante o ciclo celular, e o nmero de clulas contveis ilimitado; (2) A contagem pode ser feita por qualquer pessoa com pouco treinamento em citogentica; (3) no necessrio um caritipo favorvel; (4) o MN formado persiste pelo menos at a prxima intrfase; (5) no necessrio nenhum reagente para bloquear o fuso (Heddle et al., 1983). Uma das vantagens, tambm, que pode ser aplicado em qualquer populao de clulas em proliferao sem depender do caritipo envolvido. Devido aos peixes terem um grande nmero de cromossomos, e muitas vezes de pequeno tamanho, as anlises das metfases para avaliao de aberraes cromossmicas

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so dificultadas, enquanto que o estudo de microncleos fcil e possvel de ser realizado em eritrcitos, devido ao fato destes serem nucleados (Hayashi et al., 1998). Em avaliaes ecotoxicolgicas como as de Llorene et al. (2002), Porto et al. (2005) e Nigro et al. (2006), o teste do microncleo tambm vem ganhando importncia. Gauthier et al. (1999) propuseram o uso desse teste em golfinhos para monitorar populaes expostas a ambientes contaminados. Cavas et al. (2005) comprovaram em peixes os efeitos genotxico e citotxico de metais pesados, como cdmio e cobre, observados previamente em mamferos. Em estudo com animais de uma regio poluda por rejeitos industriais, verificaram que o nmero de microncleos em clulas sanguneas de tartarugas correlaciona-se positivamente com os nveis de mercrio e DDT nos tecidos dos animais. Ensaios envolvendo este tipo de abordagem so bons modelos para a avaliao dos riscos da exposio a fatores ambientais e fornecem subsdios para o potencial efeito sobre a sade das populaes residentes na mesma regio e para o manejo dos animais expostos (Swartz et al., 2003). Normann et al. (2008) investigaram a genotoxicidade do composto dicromato de potssio, utilizando o teste do microncleo, em Hypostomus plecotomus. Na bacia amaznica este teste j foi utilizado para avaliao mutagnica de altas concentraes de mercrio encontradas no Rio Madeira, examinando-se trs espcies comercialmente importantes da regio (Prochilodus nigricas, curimat; Mylossoma duriventris, pacu branco; e Hoplias malabaricus, trara) onde se mostrou

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ao genotxica significativa quando comparado ao controle negativo (rea no poluda) utilizando-se peixes do Rio Solimes (Porto et al., 2005).

2.3. Oreochromis niloticus Segundo Elder (1990), a seleo da espcie que dever ser utilizada como indicadora dos efeitos contaminantes uma caracterstica importante em um teste de toxicidade, pois a resposta do teste com um pequeno grupo de organismos, geralmente usada para representar uma comunidade inteira. Assim, a seleo do organismo-teste normalmente baseada em alguns critrios, tais como:

sensibilidade; fcil manuteno em laboratrio, biologia e ecologia da espcie, reprodutibilidade dos resultados; relevncia econmica da espcie, entre outros. No Brasil, os organismos-teste utilizados so geralmente espcies exticas, que, segundo Cairns (1993), so frequentemente utilizadas para determinar a toxicidade de efluentes em ambientes aquticos nos quais elas no possuem nenhuma relevncia ecolgica, ou mesmo ocorrncia. Entretanto, o uso de espcies autctones nos testes de toxicidade dever gradualmente substituir as espcies

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alctones atualmente utilizadas nos testes j padronizados, Segundo Chapman (1995), ideal usar em testes laboratoriais as mesmas espcies que so encontradas em campo, j que so esses os organismos que se deseja proteger. Entre os peixes de gua doce do Brasil, as tilpias so espcies exticas invasoras que tm sido usadas como organismos bioindicadores de poluio por apresentarem ampla distribuio geogrfica e caractersticas ecolgicas conhecidas (Arias et al., 2007; Souza & Fontanetti, 2007). As tilpias so peixes sseos, Actinopterygii: Perciformes, Cichlidae, de corpo alto e comprimido e apresentam escamas drmicas implantadas, boca terminal e brnquias (Nelson, 2006). Intensamente usada na piscicultura mundial, a tilpia est entre as espcies mais indicadas para o cultivo intensivo em regies tropicais. Essa espcie apresenta qualidades interessantes para a produo pisccola como o curto ciclo de reproduo e rpido crescimento (Ribeiro & Caetano-Filho, 1995). So tambm peixes muito utilizados em estudos que unem a gentica toxicolgica e os estudos de biomonitoramento ambiental (Souza & Fontanetti, 2007). Tilpia um nome comum utilizado para denominar um grande nmero de espcies de cicldeos (Perciformes), provenientes da frica, pertencentes ao grupo Tilapiine, divididos em 3 gneros: Tilapia, Sarotherodon e Oreochromis, sendo este ltimo de grande importncia na aquicultura mundial (Mc Andrew, 2000). A ordem Perciformes engloba o maior nmero de vertebrados presentes no planeta. Tal nmero representativo de 18 subordens, 148 famlias,

aproximadamente 1500 gneros e 9300 espcies; podendo ser encontradas em habitats de gua salgada, salobra e doce (regies tropicais e subtropicais). Para a

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identificao

dessa

ordem,

os

taxonomistas

se

utilizam

das

seguintes

caractersticas: escamas ctenides ou ciclides; nadadeiras dorsal, ventral e anal quase sempre com espinhos; nadadeiras ventrais em posio anterior, logo abaixo das peitorais; nadadeira dorsal com 17 raios principais; pr-maxila protrtil; escamas na lateral da cabea; ausncia de nadadeira adiposa; ausncia de duto na bexiga natatria (Nelson, 1994). Segundo o mesmo autor, as principais famlias de Perciformes de gua doce da Amrica do Sul esto includas nas subordens: Percoidei (Scianidae) e Labroidei (Gobiidae e Cichlidae). A famlia Cichlidae representada na Amrica do Sul por 50 gneros e cerca de 450 espcies, equivalente a 10% de sua ictiofauna. Os representantes desta famlia como os Tucunars, Acars, Jacunds ou peixes-sabo e as tilpias apresentam as seguintes caractersticas em comum: um ocelo no corpo; uma narina de cada lado do focinho; linha lateral dividida em dois segmentos, sendo o primeiro, superior, entre o final do oprculo at a linha que passa pelo meio da nadadeira dorsal e o segundo, inferior, desse nvel at a extremidade do pednculo caudal; 16 ou excepcionalmente 14 raios caudais principais; raios, ductos e pungentes em nmero de 7 a 25 na nadadeira dorsal; 3 a 15 na anal e 1 na ventral; escamas ctenides, speras ao tato. (Kullander, 1986). As tilpias so naturais da frica, de Israel e da Jordnia e devido a seu potencial para a aquicultura, tiveram sua distribuio expandida para todos os continentes nos ltimos cinquenta anos. A motivao inicial deveu-se ao fato de ser uma espcie apropriada para a piscicultura de subsistncia em pases em desenvolvimento (Lovshin, 1997).

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A tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus) apresenta hbito alimentar onvoro e utiliza eficientemente os carboidratos da dieta (Viola & Arieli, 1983; Anderson et al., 1984; Degani & Revach, 1991; Shiau, 1997). A espcie Oreochromis niloticus (tilpia do Nilo), foi introduzida no Brasil em 1971, procedente da Costa do Marfim, frica (Castagnolli, 1992). uma espcie bastante rstica, de hbito alimentar fitoplanctfago que aceita, tambm, outros tipos de alimento, inclusive alimentos artificiais, em todos os estgios de vida (Santiago et al., 1987). Oreochromis niloticus apresenta sistema de determinao sexual de tipo XX/XY, demonstrado atravs da anlise do complexo sinaptonmico (Foresti et al., 1993; Carrasco; Penman; Bromage, 1999), neste caso o primeiro par cromossmico seria o responsvel pela determinao do sexo, apesar de no haver uma diferenciao morfolgica notvel entre os membros desse par, o que dificulta sua distino em preparaes cromossmicas mitticas. Segundo Leonhardt et al. (2006), a tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus) apresenta um caritipo com 44 cromossomos (2n = 44).

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2.4. Dicromato de Potssio A ocorrncia natural de sais de metais pesados muito rara. Quando estes compostos so encontrados no meio ambiente aqutico tm origem em atividades industriais. Estas substncias so introduzidas no meio ambiente atravs de efluentes no tratados de indstrias (Chepcanoff, 2001). O cromo definido como um elemento metlico de cor cinza. Classificado como um dos elementos de transio, seu nmero atmico 24 (Valko et al., 2005). Este metal pesado ocorre naturalmente e pode ser encontrado em rochas, animais, plantas, solo e gases, podendo tambm formar uma grande variedade de compostos altamente txicos. O grau de toxidade do cromo pode variar com seu estado de oxidao (Paulino, 1993).

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O cromo (VI) existente no meio ambiente quase todo proveniente das atividades humanas, originando-se de emisses das fabricaes de cimento, fundies, soldagem, minerao de cobre, lixos urbanos e industriais, incinerao, utilizao em curtumes e fertilizantes, entre outros. Nestas regies o solo pode apresentar teores acima do permitido, principalmente, devido ao mau descarte desse elemento pelas atividades industriais. Os resduos possuem alto poder de contaminao, quando no so convenientemente tratados e simplesmente abandonados em corpos dgua, aterros industriais ou mesmo lixeiras clandestinas. Com facilidade, o cromo atinge o lenol fretico ou mesmo reservatrios ou rios que so as fontes de abastecimento de gua das cidades (CETESB, 2005). Este metal tambm pode entrar no sistema de gua potvel, oriundo de inibidores de corroso usados nos tanques de gua (Visvanathan et al., 1989). O cromo metlico parece ser nocivo sade, o cromo hexavalente est classificado pela CERCLA The Comprehensive Environmental Response, Composion, and Liability (1997) em 18 lugar na lista das substncias perigosas (AZEVEDO & CHASIN,2003). Os compostos de cromo (VI) penetram atravs das membranas biolgicas e so reduzidos para cromo (III) causando danos estrutura celular. Neste caso tambm ocorre um aumento na concentrao de cromo (III) acima do normal, causando um desequilbrio e transformando o cromo (III) em txico (Paulino, 1993) O dicromato de potssio tem aparncia de cristais laranja avermelhados brilhantes, ponto de fuso a 398C, ponto de ebulio a 500C e densidade (g cm- 3) de 2.676. No ambiente so trs os nmeros de oxidao do metal: cromo(0), cromo(III) e cromo(VI). Cromo(III) tem ocorrncia natural no meio ambiente,

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enquanto cromo(VI) e cromo(0) so geralmente produzidos por processos industriais. Os compostos hexavalentes de Cromo so, geralmente, mais txicos do que os trivalentes, podendo chegar a ter efeito letal, se absorvido atravs da pele, ingerido ou inalado (Harmel, 2004). Essa substncia um composto qumico com diversas aplicaes na indstria, como componente de cimento, tintas de impresso, objetos cromados, tintura de tecidos, curtimento de couro, perfumes sintticos, borracha, vernizes e detergentes (Pecher & Fernandes, 1984). Segundo Felcman (1985), o dicromato de potssio um composto de cromo importante por sua utilizao industrial e, processos fotoqumicos, produo de pigmentos, formulaes para preservar madeiras, entre outras aplicaes. A concentrao total de um elemento qumico no um dado suficiente para avaliar seus efeitos sobre os seres vivos e meio ambiente, pois dependendo de sua forma fsico-qumica (especiao), tem-se diferentes graus de toxicidade, de solubilidade, taxa de absoro por seres vivos e reaes de complexao (Chepcanoff, 2001). Este trabalho visa analisar a frequncia de microncleos (MN) tpicos e anormalidades morfonucleares (AMN) em eritrcitos perifricos de tilpias do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas ao dicromato de potssio, substncia altamente genotxica, a fim de analisar os efeitos genotxicos e mutagnicos desse composto.

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3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Avaliar os efeitos genotxicos e mutagnicos do composto dicromato de potssio nas tilpias do Nilo Oreochromis niloticus. 3.2. Objetivos Especficos - Investigar a frequncia de microncleos e outras anormalidades nucleares em eritrcitos perifricos das tilpias do Nilo Oreochromis niloticus expostos ao dicromato de potssio; - Verificar (ou confirmar) se a tilpia do Nilo pode ser considerada um modelo experimental adequado para o biomonitoramento da poluio de ecossistemas aquticos por compostos de cromo.

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4. MATERIAIS E MTODOS 4.1. Materiais 4.1.1. Organismos Utilizados Como Bioindicadores Foram utilizados peixes da espcie Oreochromis niloticus (Figura 1) que so originalmente da frica, porm, foram introduzidos na bacia Amaznica para a piscicultura e j ocorrem naturalmente nessa regio ocupando diferentes nichos trficos. Essa espcie foi escolhida por ser de fcil adaptao e manuteno nas condies laboratoriais.

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Figura 1 Espcime de Oreochromis niloticus. Foto: Autores (2011).

4.1.2. Coleta e Aclimatao Dos Animais As tilpias utilizadas nos bioensaios foram adquiridas junto Empresa Pesque & Pague, no municpio de Belm. Os peixes foram mantidos em aqurios (Figura 2), sob manejo, no Laboratrio de Biologia Aqutica do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Par (IFPA), em Belm PA.

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Figura 2 Aqurios do Laboratrio de Biologia Aqutica do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Par. Foto: Autores (2011). Os aqurios funcionaram em sistema semi-esttico, com limpeza e troca de 1/3 da gua a cada 48 horas. Durante este perodo os peixes foram alimentados diariamente, com rao comercial (28% de protena bruta). Estas condies foram mantidas durante o perodo de aclimatao. Aps a contaminao, apenas foi suspensa a troca de gua. Os peixes foram mantidos em gua desclorificada, temperatura controlada (em torno de 28C), aerao constante e periodicidade luminosa (14/10 h) por um perodo de aclimatao de 15 dias. 4.2. Mtodos 4.2.1. Tratamento Dos Animais e Obteno Do Sangue Para o Bioensaio As tilpias foram submetidas ao tratamento com dicromato de potssio na concentrao de 12 mg.L-1 (Figura 3). Os espcimes foram expostos ao contaminante a partir da gua (via hdrica). Decorrido o perodo de aclimatao, o bioensaio teve incio.

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Figura 3 Aqurios contaminados com dicromato de potssio (K2Cr2O7) na concentrao de 12 mg.L-1. Foto: Autores (2011). Foi realizada a biometria dos organismos. Os peixes apresentaram comprimento mdio de 16.79 1.78 cm e peso mdio de 83.76 19.55 g (Figura 4). Os dados sobre a biometria encontram-se no apndice A.

Figura 4 Biometria dos peixes da espcie Oreochromis niloticus. (A) Medida do Peso (g). (B) Medida do Comprimento (cm). Foto: Autores (2011). Para a obteno do sangue, os peixes foram primeiramente anestesiados com gelo, por cerca de 3 minutos (Normann et al., 2008). Em seguida, com o auxlio

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de uma seringa heparinizada, uma gota de sangue foi coletada atravs da puno da veia caudal (Figura 5), sendo posteriormente, colocada em lmina e imediatamente feito o esfregao (Figura 6) para o Teste do microncleo, foram confeccionadas duas lminas de cada animal (Figura 7).

Figura 5 Coleta do sangue atravs da puno da veia caudal. Foto: Autores (2011).

Figura 6 Esfregao do sangue na lmina. Foto: Autores (2011).

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Figura 7 Preparao de duas lminas por peixe. Foto: Autores (2011).

4.2.2. Teste do Microncleo Para a anlise dos Microncleos (MN) foi empregada a tcnica descrita por Heddle (1973), com algumas modificaes. Assim, uma vez coletado o sangue do peixe, imediatamente foi pingada uma gota em lmina bem limpa; com o auxlio de uma lamnula, foi feito o esfregao, que secou ao ar, em temperatura ambiente. Aps a secagem, fez-se a fixao em etanol absoluto por 10 minutos e a lmina foi corada com soluo de Giemsa 5%, diluda em tampo fosfato a pH 6,8, por 10 minutos e lavada em gua corrente (Figura 8).

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Figura 8 Lminas coradas com Giemsa 5% secando ao ar. Foto: Autores (2011). Somente foram consideradas as clulas com a membrana citoplasmtica intacta. As lminas para o escore de MN e AMN foram observadas ao microscpio sob ampliao de 1000X, no Laboratrio de Biologia Aqutica do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Par. Foram analisados, em teste cego, 1.000 eritrcitos por lmina e, assim, 2.000 por animal. Em nosso estudo os MN foram definidos como corpos citoplasmticos esfricos ou ovais, no conectados ao ncleo principal, com dimetro de 1/30 1/10 do ncleo maior e no mesmo plano ptico deste (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000). Trs outras anormalidades nucleares foram tambm consideradas: brotos, lobos e invaginaes (Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000; Bolognesi et al., 2006).

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4.2.3. Bioensaio com Oreochromis niloticus Os espcimes de O. niloticus foram mantidos sob densidade de um indivduo por aqurio de 30 L. Para esse bioensaio foram utilizados 7 tilpias, as quais primeiramente, foram utilizadas como controle e depois contaminadas com o dicromato de potssio. Aps 24 horas (um dia) de exposio, foi coletado sangue e as lminas preparadas para a anlise de microncleos. O mesmo procedimento foi realizado depois de 48 horas (dois dias) de exposio. O Teste de microncleos foi realizado pela anlise de 2.000 eritrcitos por animal, incluindo aquelas com microncleos tpicos e alteraes na forma do ncleo. No total, foram averiguados 42.000 eritrcitos neste bioensaio.

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4.2.4. Anlises Estatsticas A normalidade dos dados foi avaliada por meio do teste de KolmogorovSmirnov. Para comparar diferenas entre grupos controle e tratados, os resultados foram avaliados por meio do teste paramtrico ANOVA: um critrio. Quando da presena de diferena significativa a ANOVA foi seguida do Teste de Tukey. Todas as anlises estatsticas foram efetuadas com o programa BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007) e o nvel mnimo de significncia considerado nas anlises foi de 0,05.

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5. RESULTADOS No Teste do Microncleo, foram analisadas 2.000 clulas por espcime. Do total de clulas contadas, o nmero de microncleos tpicos encontrados (Figura 9) foi bastante reduzido. Entretanto, de acordo com nossa proposta, as alteraes morfolgicas nucleares (Figura 10) tambm foram analisadas e apareceram com maior freqncia.

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Figura 9 Eritrcitos de O. niloticus corados com Giemsa 5%, em ampliao de 1.000X. A seta indica um microncleo. Foto: Autores (2011).

Figura 10 Anormalidade Morfolgica Nuclear (AMN) encontrada em eritrcito de O. niloticus. A seta indica uma invaginao do ncleo. Foto: Autores (2011).

Das 42.000 clulas analisadas, 14.000 foram para cada grupo: controle, exposto durante 24h e 48h de contaminao. No controle, 30 clulas se apresentaram alteradas (apenas com alteraes morfolgicas nucleares); no grupo exposto durante 24h foram encontradas 48 clulas alteradas (microncleos tpicos + alteraes morfonucleares) e no grupo exposto durante 48h foram encontradas 94 clulas alteradas (microncleos tpicos + alteraes morfonucleares). No total dos dois grupos (24h e 48h) expostos ao dicromato de potssio, foram encontradas 142 clulas alteradas (microncleos tpicos + alteraes morfonucleares). Os resultados encontrados so tambm apresentados na Tabela 1, onde esto disponibilizadas as mdias e os desvios padres de microncleos e alteraes morfolgicas nucleares.

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Tabela 1 - Mdias e desvios de microncleos (MN) e alteraes morfonucleares (AMN) de Oreochromis niloticus expostos ao dicromato de potssio em tempos diferentes. MDIA E DESVIO PADRO DE MN E AMN / 2000 CLULAS MN Controle 24h 48h 0 0.5 0.94 1.21 1.42 AMN 2.14 2.77 2.93 2.02 5.5 5.98 MN+AMN 1.07 2.21 1.71 1.98 3.36 4.79

5.1. Teste do Microncleo Os dados obtidos no Teste do Microncleo foram tratados estatisticamente com o teste de Anlise de Varincia (ANOVA: um critrio) e a diferena mostrou-se significativa apenas entre os grupos controle e tratado no tempo de 48h (Figura 11).

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Figura 11 - Resultado do Teste ANOVA: um critrio evidenciando diferena significativa entre o controle e o grupo exposto no tempo de 48h. Obtido no BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007). A frequncia de microncleos (MN) tpicos apresentou-se nula no grupo controle. Nos grupos expostos, com tempos distintos, foi observado um aumento significativo dessa ocorrncia (Figura 12).

Figura 12 Representao das frequncias de microncleos tpicos (por 2.000 eritrcitos) em Oreochromis niloticus. 5.2. Anormalidades Morfonucleares (AMN) Os valores das anormalidades morfonucleares encontradas, tambm foram avaliadas estatisticamente com o teste de Anlise de Varincia (ANOVA: um critrio) no apresentando diferena significativa entre os grupos controle, tratados 24h e 48h (Figuras 13 e 14)

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Figura 13 - Resultado do Teste ANOVA: um critrio evidenciando diferena significativa entre o grupo controle e os expostos (p = 0,0765).

Figura 14 Representao das frequncias de AMN (por 2.000 eritrcitos) em Oreochromis niloticus. 6. DISCUSSO O uso de diferentes ensaios e sistemas biolgicos garante uma triagem mais apurada dos efeitos causados por contaminantes no ambiente aqutico. Nesse sentido, vrios biomarcadores esto sendo desenvolvidos e dentre eles, os biomarcadores genticos vm alcanando grande aceitao (Ramsdorf, 2007). O desenvolvimento de novas metodologias e aplicao de tcnicas mais refinadas para a avaliao da genotoxicidade em ambientes aquticos so objetos de muitos estudos cientficos (Van der Oost et al., 2003).

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Os

resultados

obtidos

nesta

pesquisa

cientfica

demonstraram

primeiramente que os peixes da espcie Oreochromis niloticus podem desempenhar um bom modelo experimental, sendo indicadores de efeitos genotxicos de xenobiontes. No presente estudo observou-se tambm um ndice basal nulo para microncleos tpicos, o que no muito comum, apesar de no ser um resultado extraordinrio, j que outros trabalhos demonstram baixas frequncias para o ndice basal de microncleos em peixes (Tabela 2).

FREQUNCIA ESPCIES Astyanax bimaculatos Hoplias malabaricus Aequidens tetramerus Eigenmannia virescens Tilapia rendalli Oreochromis niloticus BASAL 0.6 0.7 0.33 0.52 0.5 1.15 0.1 0.31 0.2 0.3 0.4 0.4

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Silva, 2009. Ferraro et al., 2004. Rocha et al., No prelo 2011. Bcker et al.,2006 Palhares & Grisolia, 2002. Palhares & Grisolia, 2002.

Neste trabalho, os peixes O. niloticus foram expostos ao dicromato de potssio na concentrao de 12 mg.L-1, conforme valor encontrado na literatura (Palhares & Grisolia, 2002). Maximizando assim, as chances de observao de

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efeitos genotxicos e direcionando o foco de nossa pesquisa para as diferenas encontradas nos resultados entre os grupos estudados: controle, 24h e 48h. Neste sentido, foi observado um aumento na gerao de acidentes clastognicos, resultando na formao de microncleos tpicos e anormalidades morfolgicas nucleares. Havendo, portanto, uma relao direta entre bioabsoro de cromo e a formao de microncleos conjuntamente s alteraes morfolgicas nucleares. Confirmando os resultados obtidos nas diferentes literaturas Al-Sabti & Metcalfe (1995), Dillon et al. (1998) Kohlpoth et al. (1999) e Messer et al. (1999), Palhares & Grisolia, 2002. Um ponto favorvel ao uso de O. niloticus em bioensaios de genotoxicidade est relacionado a sua facilidade de manuteno em laboratrio, onde os efeitos antagnicos de substncias presentes no meio podem ser totalmente ou parcialmente eliminados. Por outro lado no teste de microncleo em peixes tm sido amplamente utilizado eritrcitos, por serem nucleados, de fcil manipulao e no exigirem a etapa de dissociao celular requerida por outros tipos celulares.

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6.1. Teste do Microncleo Em nossa pesquisa de microncleos e outras anormalidades nucleares, analisamos 2.000 eritrcitos por espcime, porm h na literatura uma grande divergncia quanto ao nmero de clulas que devem ser utilizadas: 1.000 (Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000; Gravato & Santos, 2002; Russo et al., 2004); 1.500 (Cavas, 2008); 2.000 (Palhares & Grisolia, 2002; Ramsdorf, 2007; Normann et al., 2008, Ferraro, 2009; Kirschbaum et al., 2009); 3.000 (Galindo & Moreira, 2009; Grisolia et al., 2005; Grisolia et al., 2009); 4.000 (Metcalfe, 1988; Ferraro et al., 2004; Bolognesi et al., 2006); 5.000 (Porto et al, 2005; Andreiknait et al., 2007). Percebemos que o aumento na gerao de microncleos nos animais tratados nesse bioensaio, apresentou diferena significativa apenas entre os grupos

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controle e exposto por 48h, o que foi demonstrado por meio do teste estatstico paramtrico ANOVA : um critrio (p < 0,01). Logo evidenciando que quanto maior o tempo de exposio maior a incidncia de MN.

6.2. Alteraes Morfolgicas Nucleares O registro de ocorrncia de outras anormalidades nucleares, alm dos microncleos, tambm tem sido considerado como um indicador verdadeiramente til na avaliao de efeitos genotxicos e citotxicos de contaminantes em organismos aquticos (Cavas & Ergene-Gozukara, 2003; Dailianis et al., 2003; Ferraro et al., 2004; Barien et al., 2006; Matsumoto et al., 2006). Do mesmo modo que em Ferraro (2003), As alteraes morfolgicas nucleares descritas em trabalhos anteriores foram encontradas e fotografadas no presente estudo. Embora, muitas destas pudessem ser facilmente identificadas dentro de um determinado tipo, outras mostraram-se dbias quanto sua

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caracterizao e, por este motivo, todas as alteraes morfolgicas nucleares foram computadas em conjunto. Foi verificado que para alteraes morfolgicas nucleares as diferenas no foram estatisticamente significativas quando comparados os grupos: controle, exposto 24h e 48h. Nossos resultados divergem dos resultados encontrados por Ferraro et al., (2004), que estudaram os efeitos mutagnicos do tributilestanho (TBT) e do chumbo inorgnico sobre peixes Hoplias malabaricus. Em todo o caso, os resultados que encontramos confirmam os efeitos clastognicos do dicromato de potssio. Portanto, necessrio a preveno de acidentes ambientais e industriais, por conta deste composto ser txico e tal qual muitos compostos de cromo devem ser tratados antes de sua liberao para o meio ambiente, evitando assim a contaminao ambiental (Stern, 1982; Langard & Vigander, 1983; Galvo & Corey, 1987; WHO, 1988; Bidstrup & Wagg, 1989). 7. CONCLUSO 1 As frequncias de microncleos aumentaram significativamente nos animais dos grupos submetidos ao dicromato de potssio em tempos de exposio diferentes.

2 Quando consideramos as anormalidades morfonucleares, a diferena no foi significativa entre os grupos: controle, tratados 24h e 48h.

3 Os resultados aqui obtidos com tilpias Oreochromis niloticus expostos ao dicromato de potssio confirmam o poder mutagnico desse composto e indicam maior efeito genotxico sobre os eritrcitos.

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4 A espcie Oreochromis niloticus representa um modelo experimental til de monitoramente da poluio em ambientes aquticos.

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WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Chromium. Geneva, Environmental Health Criteria, p. 61, 1988.

Apndice A Biometria dos peixes (Oreochromis niloticus). Tabela com os comprimentos e pesos dos peixes utilizados nos experimentos (comprimento mdio: 16.79 1.78 cm. Peso mdio: 83.76 19.55 g).

Peixe 01 02 03 04 05 06 07

Comprimento (cm) 17 19 17 17 14 18,5 15

Peso (g) 86,1 110,1 67,6 81,1 51,4 98,6 91,4

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Apndice B Dados da contagem de 2000 clulas (eritrcitos) por animal, de girinos, com o aumento de 1000x. Tabelas exibidas na ordem de contagem evidenciando os peixes, nmero de clulas normais, alteraes morfonucleares, microncleos e o total de clulas observadas. (1) Grupo controle, (2) Grupo exposto durante 24h e (3) Grupo exposto durante 48h. 1 Controle PEIXE 01 02 03 04 05 06 07 NORMAL 1999 1987 1993 1995 1998 1999 1999 ALTERAO MICRONCLEO MORFONUCLEAR 1 0 13 0 7 0 5 0 2 0 1 0 1 0 TOTAL 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

2 Exposto durante 24h PEIXE 01 02 NORMAL 1997 1994 ALTERAO MICRONCLEO MORFONUCLEAR 3 0 5 1 TOTAL 2000 2000

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03 04 05 06 07

1994 1988 1990 1995 1994

3 10 10 4 6

3 2 0 1 0

2000 2000 2000 2000 2000

3 Exposto durante 48h PEIXE 01 02 03 04 05 06 07 NORMAL 1989 1989 1989 1985 1988 1987 1979 ALTERAO MICRONCLEO MORFONUCLEAR 7 4 9 2 9 2 14 1 10 2 10 3 18 3 TOTAL 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

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Apndice C Dados da contagem de 2000 clulas (eritrcitos) por animal, de peixes, com o aumento de 100x. Tabelas evidenciando os peixes, nmero de clulas normais, clulas alteradas (microncleos + alteraes morfonucleares) e o total de clulas observadas. (1) Grupo Controle, (2) Grupo Exposto durante 24h e (3) Grupo Exposto durante 48h.

1 Controle PEIXE 01 02 03 04 05 06 07 NORMAL 1999 1987 1993 1995 1998 1999 1999 CLULAS ALTERADAS 1 13 7 5 2 1 1 TOTAL 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

2 Exposto durante 24h PEIXE 01 02 03 04 NORMAL 1997 1994 1994 1988 CLULAS ALTERADAS 3 6 6 12 TOTAL 2000 2000 2000 2000

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05 06 07

1990 1995 1994

10 5 6

2000 2000 2000

3 Exposto durante 48h PEIXE 01 02 03 04 05 06 07 NORMAL 1989 1989 1989 1985 1988 1987 1979 CLULAS ALTERADAS 11 11 11 15 12 13 21 TOTAL 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000