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FRACCIONAMIENTO BIOGUIADO EN PLANTAS MEDICINALES La fragmentacin es un proceso mecnico donde se reducen sustancias slidas a porciones menores o partculas.

El objeto principal de este paso es el de aumentar la superficie de contacto de un solvente adecuado con el material a extraer para facilitar la mejor y mayor disolucin de principios activos. El material seco puede ser fragmentado con tijeras, hachas, morteros o molido en molinos especiales o con solvente ( no muy voltiles) en licuadoras hechas a tal efecto. El material fresco puede ser fragmentado por corte y contusin: tijeras, hachas, etc.; por criofragmentacin: se congela el material en aire o nitrgeno lquido y se fragmenta por contusin; o el material fresco y arena lavada se morterean juntos y la mezcla semislida se extrae luego con el disolvente. Cuando se desee extraer principios voltiles o muy termosensibles se debe tener en cuenta que el calentamiento que producen los molinos durante el fraccionamiento puede disminuir el rendimiento del principio de inters por volatilizacin descomposicin. Se realiza el aislamiento biodirigido de los principios con actividad citotxica, antifngica y antioxidante presentes en extractos de plantas nativas utilizadas en medicina tradicional y plantas que taxonmicamente se encuentran estrechamente relacionadas con especies reconocidas por sus propiedades teraputicas. El fraccionamiento bioguiado se realiza utilizando el ensayo BST (Brine Srimp Test) para detectar citotoxicidad general. Para la actividad antifngica se realizan ensayos con hongos patgenos ya sea para el hombre o para cultivos de importancia regional (maz, soja, poroto, etc.). Los polifenoles totales se determinan utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu; el efecto depurador de radicales con el reactivo 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) y la capacidad antioxidante con el sistema micelar beta-caroteno/cido linolico. En todos los casos se emplean como controles positivos antioxidantes de uso comn tanto naturales (vitamina E, cido ascrbico, cido glico) como sintticos (BHT, BHA). Durante mucho tiempo, los mtodos ms comnmente usados para medir y caracterizar la materia orgnica del suelo (MOS) se han basado en el uso de extractantes qumicos que permiten determinar el C orgnico y las sustancias hmicas (SH); sin embargo, este tipo de fraccionamiento tiene como limitante el hecho que no permite establecer la relacin entre la dinmica de la MOS y la disponibilidad de nutrientes, debido a que no mide las fracciones de materia orgnica biolgicamente activas (Cambardella y Elliot, 1994; Barrios et al., 1996a). En consecuencia, a partir del fraccionamiento fsico de la MOS han podido ser definidas las fracciones de materia orgnica que estn directamente relacionadas con el ciclado de nutrientes. Este mtodo incluye tcnicas de separacin por tamao y/o densidad, y evita cambios qumicos de la MOS. stas tcnicas pueden ser menos destructivas y ms selectivas, y los resultados obtenidos de las fracciones de suelo fsicamente separadas pueden estar relacionados ms directamente con la estructura y funcin de la materia orgnica y de los

ecosistemas y agroecosistemas. El fraccionamiento de tamao se basa en que la MOS, en la fraccin del tamao de las arenas (>53 m), la cual recibe el nombre de materia orgnica particulada (POM), es por lo general ms lbil que la materia orgnica asociada a las partculas de limo y arcilla. Mientras que el fraccionamiento de densidad se fundamenta en que durante la humificacin parte de la materia orgnica se asocia ms con la fraccin mineral y, por lo tanto, ocurre la formacin de complejos orgnico-minerales de alta densidad. El fraccionamiento de densidad representa un mtodo til para separar la materia orgnica en componentes que son distintos qumica y fsicamente. Por este mtodo la POM es removida del suelo por flotacin en agua o en soluciones densas, cuyos valores de densidad pueden variar entre 1 . 2 g/cm3 (Cuadro 1). De esta forma, es posible separar la materia orgnica que no est firmemente unida a los componentes minerales del suelo. El fraccionamiento fsico del suelo que usa separacin por densidad puede ayudar a evaluar la dinmica de la MOS, debido a la posibilidad de separar desechos de plantas parcialmente descompuestas (fraccin ligera), materia orgnica que est adsorbida sobre superficies minerales o que est secuestrada dentro de los agregados del suelo. La fraccin ligera (FL) es un material relativamente inalterado y de origen ms reciente que la fraccin pesada (FP) caracterizada por una alta relacin C/N, tiene una rpida tasa de recambio, y su densidad especfica es menor que los minerales del suelo. En algunos casos, si la solucin usada para la separacin tiene una densidad cercana a 2 g/cm3, dentro de esta fraccin se puede incluir material amorfo ms pesado. Mientras que la FP incluye los complejos orgnico-minerales de la MOS, tiene baja relacin C/N, su tasa de recambio es ms lenta y su densidad especfica es ms alta debido a su ntima asociacin con los minerales del suelo. Cuadro 1. Soluciones usadas para el fraccionamiento fsico de la MOS Solucin Densidad (g/cm3 ) Agua Na(PO3)6 + NaHCO3 + MgSO4 Cloruro de calcio Tretracloruro de Carbono Ioduro de sodio Ioduro de sodio Bromuro de zinc Ioduro de sodio Ioduro de sodio Solucin de Toulet K2HgI4 Polytungstato de sodio Bromoformo/espritu de 1 1,2 1,5 1,59 1,59 1,6 1,6 1,65 1,7 1,8 1,8 2,00

petrleo Bromoformo/etanol Bromoformo/etanol + surfactante Tetrabromoetano/benceno dibromo 3 cloropropano + surfactante Ludox Fuente: Elaboracin propia

2,00 2,00 2,00 1,2; 2,06 1,13 y 1,37

Si bien el fraccionamiento fsico desde el punto de vista metodolgico y de informacin del comportamiento dinmico de la MOS pudiera ser ms adecuado, existen variaciones del mtodo en funcin del tipo de soluciones inorgnicas y los pretratamientos usados. Entre las soluciones inorgnicas usadas en la separacin de densidad (Cuadro 1) se incluyen politungstato de sodio (1,85 g/cm3), NaI (1,7 g/cm3) y, recientemente Meijboom et al., (1995) han desarrollado un nuevo mtodo en el que utilizan como medio de separacin una suspensin de slice (Ludox), ajustada a dos valores de densidad 1,13 y 1,37 g/cm3. Esta tcnica presenta ciertas ventajas con relacin a los otros medios utilizados, entre ellas: Es econmica, el medio usado no es txico y permite el fraccionamiento de muestras grandes de suelo (500 g). Adems, el mtodo permite recuperar tres fracciones de materia macroorgnica con diferentes grados de transformacin: 1. Fraccin ligera: Consistente de residuos de planta reconocibles (<1,13 g/cm3). 2. Fraccin intermedia: Material parcialmente humificado. (1,13 . 1,37 g/cm3). 3. Fraccin pesada: Material orgnico amorfo. (>1,37 g/cm3). Este fraccionamiento de densidad fue desarrollado en la fraccin del tamao de las arenas (materia macroorgnica, > 150 m), debido a que el C orgnico de esta fraccin es ms lbil que el C orgnico de las fracciones asociadas con arcilla y limo. En nuestro laboratorio usamos los siguientes mtodos de separacin: 1. Fraccionamiento fsico usando como medio de separacin el agua, densidad (1 g/cm3) (el ms sencillo y recomendado para EPES): se pesan 250 g de suelo secado al aire y pasado por un tamiz de 2 mm. En una ponchera o recipiente plstico grande, se mezcla el suelo con agua corriente o mejor destilada, si es posible, la cual es aadida con una manguerita a presin formando aproximadamente un ngulo de 45 de inclinacin de manera de romper los agregados de suelo sin salpicar. Tambin te puedes ayudar con la mano mezclando con el agua y apretando las pelotitas de suelo. Dejar sedimentar un rato, se observar material orgnico flotando en el agua (raicillas, semillitas, hifas, pedacitos de hojitas, cualquier material particulado), luego con cuidado verter el agua con el material particulado flotando (el suelo ha sedimentado en el fondo de la ponchera) en un envase plstico o beacker de 500 mL previamente pesado, pero pasando esa agua color amarillo o marrn (mientras mas clara mejor) por dos tamices de 2 mm (mesh 10) y 0.25 mm (mesh 60). Todo aquel material particulado flotando que pasa

por un tamiz de 2mm pero no de 0.25 mm es considerado fraccin ligera o mejor dicho fraccin macroorgnica, cuya densidad es menor de 1 g/cm3. Este procedimiento se repetir desde el paso de aadir agua y mezclar, tanta veces como sea necesario, para obtener todo el material particulado flotante. Se recomienda en cada lavada no usar mucha agua para que no se llenen potes y potes plsticos con el agua y la fraccin macroorgnica. El suelo que queda en el fondo de la ponchera sedimentado es donde est la fraccin pesada orgnica asociada a las partculas minerales, con agua nos ayudamos a transferir a un envase plstico previamente pesado. Si uno lo hace con cuidado es posible vaciar la fraccin ligera o macroorgnica en un envase, y el resto del agua con material mineral fino en suspensin, ponerlo en otro envase, este corresponde tambin a fraccin pesada pero fina, pues estaran los limos y las arcillas, sedimentada estara la fraccin de arena, la cual tambin sera fraccin pesada pero gruesa. Cuando el suelo es arenoso es fcil separar las fracciones pesadas finas y gruesas, pero cuando el suelo es arcilloso es ms difcil. Cada recipiente con la fraccin se pone en estufa para evaporar el agua a una temperatura mxima de 60, para acelerar el proceso puedes con una bombita aspirar el agua, si no dejarla secar por el tiempo necesario en estufa. Cuando se haya evaporado el agua y est bien seca la fraccin orgnica o mineral volver a pesar. Obtener el peso de la fraccin por diferencia. Luego se puede medir el C en las fracciones usando Walkely Black o si se tiene un TOC autoanalizador. La fraccin pesada orgnica es el C de la fraccin pesada mineral gruesa (fondo ponchera) y mineral fina (la que estaba en suspensin) del suelo. Tambin tienes el C de la Fraccin macroorgnica y el porcentaje de fraccin macroorgnica como tal. Se recomienda que el fraccionamiento, dada su objetividad, sea realizado siempre para una misma persona. Con el entrenamiento se logra hacer varias muestras al da. 2. Fraccionamiento de la fraccin macroorgnica en pesada, intermedia y ligera usando ludox. Ms complicado y largo. (Meijboom et al 1995) 3. Fraccionamiento usando politungstato de sodio y rompimiento de microagregados para obtener la MO libre, la particulada libre atrapada en los macroagregados, pero que est entre los microagregados y la particulada atrapada dentro de los microagregados. Tambin un procedimiento largo. (Sleutel et al 2004). Fraccionamiento fitoqumico Setenta gramos del extracto etanlico seco se destinaron al fraccionamiento fitoqumico. En la primera particin se emple una proporcin de CHCl3 - H2O (1:1), para obtener una fraccin clorofrmica y una acuosa. La primera se sec con sulfato de sodio y se concentr en evaporador rotatorio. La segunda se liofiliz. Ambas se evaluaron en la prueba de laberinto en cruz elevado para detectar posible actividad ansioltica. La fraccin clorofrmica (que arroj resultados positivos), se someti a una nueva particin con hexano y una mezcla de MeOH-H2O 9:1, obteniendo as una fraccin hexnica y una metanlica que se concentraron en evaporador rotatorio (figura 1). Adicionalmente la fraccin metanlica se someti a liofilizacin para eliminar completamente el agua remanente (7). Animales de experimentacin Se emplearon ratones machos ICR de 25 a 35 g de peso, criados y mantenidos en el Bioterio del Departamento de Farmacia, con ciclos de 12h luz/12h oscuridad,

temperatura 211 C, agua y comida a libre demanda. Condiciones de experimentacin En cada una de las pruebas se utilizaron 10 ratones por cada tratamiento. El extracto y/o las fracciones se administraron por va oral despus de 6 horas de ayuno, y una hora despus de administrados los tratamientos se procedi a la realizacin del ensayo. Una vez finalizadas las pruebas, los ratones se sacrificaron por dislocacin cervical. El vehculo utilizado para dispersar el extracto y las fracciones as como para la administracin de los animales del grupo control fue la mezcla de: glicerina 10%, propilenglicol-400 3%, polisorbato-80 2% y agua destilada 85%, con un volumen de 0.01 mL/g de peso. Estudio fitoqumico El anlisis fitoqumico preliminar aplicado al extracto etanlico permiti identificar mediante ensayos cualitativos, los grupos de metabolitos presentes en la especie. La presencia de stos se confirm realizando cromatografas en capa delgada. Dentro de estos metabolitos se destacan: cumarinas, flavonoides, esteroides y/o terpenos y saponinas. Con el fraccionamiento fitoqumico se obtuvieron 4 fracciones de diferente polaridad: acuosa, clorofrmica, metanlica y hexnica. Ensayos Biolgicos Realizados con las Fracciones Laberinto en cruz elevado Las fracciones primarias obtenidas en la proceso de particin del extracto etanlico fueron la fraccin acuosa y la fraccin clorofrmica. Esta ltima fraccin da origen a la fraccin metanlica y a la fraccin hexnica; las 4 fracciones fueron evaluadas en el LCE. Teniendo en cuenta los rendimientos obtenidos, la dosis empleada con las fracciones acuosa y clorofrmica fue 500 mg/Kg, mientras que con la metanlica y la hexnica se utilizaron 200 y 100 mg/Kg respectivamente, observndose efectos significativos con respecto al control, tanto en la variable tiempo de permanencia como frecuencia de ingreso a las zonas abiertas en el caso de las fracciones clorofrmica y metanlica, adems del patrn utilizado, diazepam. Modelo del electrochoque Tanto en el modelo del LCE como en el electrochoque la fraccin que presenta mayor actividad es la clorofrmica, no obstante la fraccin metanlica proveniente de la clorofrmica presenta resultados tambin interesantes. En el fraccionamiento fitoqumico se puede observar un incremento significativo en la respuesta, a diferencia de lo que se suele obtener con no pocas especies, cuya actividad decrece en la medida en que se avanza en su purificacin. Esto sugiere que la actividad de ciertas drogas se podra concentrarse en determinados metabolitos. Al momento de realizar una serie de estudios los resultados obtenidos con el extracto, las fracciones se evaluaron en los modelos de laberinto en cruz elevado y electrochoque obteniendo en los dos modelos resultados muy interesantes con la fraccin clorofrmica. Esto lleva a pensar que las molculas responsables de los efectos centrales podran estar

concentradas en esta fraccin y que corresponderan a compuestos de una polaridad mediana. Es necesario continuar con el estudio fitoqumico bioguiado para lograr aislar e identificar las molculas responsables de la actividad farmacolgica y posteriormente tener una aproximacin a su mecanismo de accin. La destilacin fraccionada se usa para separar componentes lquidos que difieren de en menos de 25 en su punto de ebullicin. Cada uno de los componentes separados se les denomina fracciones. Es un montaje similar a la destilacin simple en el que se ha intercalado entre el matraz y la cabeza de destilacin una columna que puede ser tener distinto diseo (columna vigreux, de relleno...). Al calentar la mezcla el vapor se va enriqueciendo en el componente ms voltil, conforme asciende en la columna.

Extraccin: consiste en separar varios solutos disueltos en un disolvente. Se utiliza la diferencia de solubilidad de cada soluto en diferentes disolventes. Se aade un disolvente inmiscible (que no se disuelve) con el disolvente de la mezcla, los solutos se distribuyen entre los dos disolventes: alguno de los solutos ser ms soluble en el primer disolvente y otro de los solutos en el segundo disolvente. Posteriormente las dos fases se separan como mezclas heterogneas, por decantacin en este caso.

Cromatografa: las sustancias a separar se distribuyen entre dos fases segn la tendencia que tengan a estar ms en una de las fases o en la otra. Una fase es la denominada mvil, la que avanza, y la otra es la fase fija. Los ms solubles o que retiene mejor la fase fija retrasan su avance y, de esta forma, se separan de los que retiene mejor la fase mvil.

A la luz de los modernos avances en botnica, fitoqumica, farmacologa, farmacocintica, farmacodinamia y toxicologa, el conocimiento tradicional y popular sobre las propiedades medicinales de las plantas deber ser constatado y validado para garantizar una terapia adecuada, eficaz y con la menor incidencia de ocasionar riesgos para el paciente. A nivel popular basta muchas veces con extraer los principios activos de la manera ms sencilla, como puede ser por medio de una infusin o decoccin. En cambio, para

analizar las propiedades medicinales de una droga vegetal, en muchos casos se recurrir a mtodos de extraccin ms complejos, que permitan obtener mtodos reproducibles, con cuantificacin de principios activos en lo posible. Entre los mtodos extractivos ms empleados para investigacin contamos con: 1. Extraccin para tamizaje: Se realiza por medio de una maceracin a temperatura ambiente con 1 a 3 disolventes de diferentes polaridades. Por lo general se emplean: diclorometano o hexano, ter o etanol, y agua. 2. Aislamiento y elucidacin estructural: Para aislar e identificar molculas con actividad teraputica se recurre a tcnicas de filtracin, extraccin selectiva, particin, intercambio inico, absorcin, filtracin en gel, cromatografa y cristalizacin. Ensayos Para Antimicrobiano Con ella se puede conocer la capacidad que tiene una droga vegetal para comprobar una eventual actividad antimicrobiana. Se emplean mtodos de difusin en placas o discos con agar o en tubos con caldo para cultivo. El mtodo consiste en impregnar discos de papel secante de 6 mm de dimetro y 0,6 mm de grosor con 50 l del extracto vegetal. Se aplican los discos en el cultivo y se incuba a 35C durante 24 horas. Al retirar debemos ver (en caso de actividad) halos de inhibicin que se miden en mm. Si el halo dio mayor a 9 mm. el resultado es positivo. Si el halo dio entre 6-9 mm. la actividad se considera intermedia o moderada. Si el halo fue inferior a 6 mm. se considera negativo (sin actividad). Con este mtodo se puede determinar la CIM (Concentracin Inhibitoria Mnima) que requiere la droga vegetal para matar al microorganismo. La CIM es la concentracin ms baja que requiere el extracto ensayado para que haya crecimiento visible. Los microorganismos ms frecuentemente utilizados son: Bacterias: Bacillus subtilis, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, S. paratyphi, S. typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae. Levaduras y Hongos: Aspergillus flavus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Epidermophyton floccosum, Microsporum spp., Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisae, Trichophytum mentagrophytes. Protozoarios y Parsitos: Ascaris lumbricoides, Entamoeba hystolitica, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium spp., Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi. Virus: Herpes simplex virus tipo I y II, virus de la estomatitis vesicular, Coxsakie virus, poliovirus, citomegalovirus, etc. En algunos casos hay que relacionar los resultados con el estudio etnobotnico. Por ejemplo, durante un screening de actividad antiherptica, el extracto acuoso de la especie Gamochaeta simplicicaulis present slo un 14% de inhibicin de crecimiento frente al virus HSV-1 (herpes simplex virus tipo 1) en cultivos de clulas VERO. Este resultado parcial hubiera desalentado estudios posteriores. Sin embargo los estudios etnobotnicos daban cuenta de un amplio empleo de esa planta como antiviral. Cambiando el mtodo, se observ que si el extracto era administrado al mismo tiempo que el inculo del virus en las clulas de cultivo, la inhibicin era del 99%. De ah se infiere que el extracto acta por inhibicin en la adsorcin del virus a la clula y no tanto

por ser txico viral directo. Los estudios posteriores determinaron el aislamiento de un polisacrido aninico con actividad antiherptica. Pruebas para Inhibicin de Tumores: La aplicacin de nuevas drogas en el campo de la teraputica resulta ser un proceso largo, costoso y no exento de dificultades, pudiendo llegar a los 10-20 aos de desarrollo y costos que pueden alcanzar 100-500 millones de dlares. En el caso del paclitaxel (agente antitumoral de origen vegetal presente en el gnero Taxus sp.), trascurrieron 29 aos desde que se descubri su actividad citotxica a travs del programa de "screening" del National Cancer Institute (NCI) de los Estados Unidos. Este programa comenz en 1955 y hasta la fecha ha evaluado ms de 120.000 extractos diferentes correspondientes a unas 35.000 especies vegetales. Por medio del Developmental Therapeutics Program (Programa de Desarrollo Teraputico) recibe muestras provenientes de diferentes universidades, centros de investigacin, agencias gubernamentales y compaas farmacuticas. Se ensayan tanto fracciones como compuestos puros y extractos totales de una planta, en principio sobre 3 lneas celulares in vitro. Si pasa esa prueba se contina con una batera de 60 lneas celulares adicionales para confirmar la actividad. Estos ensayos son sin costo para quien lo enva y se suscribe un contrato de confiabilidad entre las partes. Los ensayos in vivo sobre animales quedan limitados a aquellos casos donde sea necesario e imprescindible ese ensayo, ya que existen restricciones impuestas por las sociedades protectoras de animales. La investigacin pre-clnica puede ser llevada a cabo en cultivos de tejidos tumorales, tumores trasplantados (Ehrlich) o tumores inducidos por sustancias carcinogenticas (por ejemplo nitrosaminas, dimetilbenzantraceno = DMBA, acetato de 12-decanoilforbol, etc). Entre las lneas celulares de mayor estudio cuentan: y Carcinoma de clulas escamosas (A-431). y Carcinomas humanos de mama (U-373) y Carcinosarcoma de ratas (Walker 256) y Carcinoma de pulmn de ratn (Lewis) y Carcinoma humano de colon (COL_2). y Leucemia linfoctica de ratn (P-388). y Melanoma humano (MEL-2). En 1991 el prof. Mc Laughlin y colaboradores da comienzo a una nueva etapa en la investigacin fitoqumica con la introduccin de algunos bioensayos primarios como el test del disco de papa o el de la Artemia salina, comenzando as la poca caracterizada por los "screenings" y el "fraccionamiento guiado por bioensayo". Este fraccionamiento consiste en la aplicacin de tcnicas de separacin y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto de hacer un seguimiento de la actividad biolgica de las fracciones y compuestos puros obtenidos, para finalizar en la identificacin de o los Principios activos responsables de la actividad demostrada por el extracto original. Una secuencia estndard ha seguir en screenings antitumorales consiste en seleccionar Primero sustancias que acten por un determinado mecanismo, o mecanismo conocido. Luego se aplican ensayos celulares a efectos de observar si se afecta la divisin celular. Finalmente por medio de los ensayos in vivo se descartan aquellas sustancias que son inactivadas en el metabolismo animal.

BIBLIOGRAFIA
y Y.Sandra, Ariza, RincnJ., F Mario, Efectos sobre el sistema nervioso central del extracto etanlico y fracciones deHygrophila tytthaLeonard.Guerrero

Disponible en: http://www.icn.unal.edu.co/publicaciones/art/122/35-N1/V35N106.pdfhttp://www.icn.unal.edu.co/publicaciones/art/122/35-N1/V35N1-06.pdf