TRATAMENTO QUMICO DE HORTALIAS POLUDAS

Renato Baruffaldi* Thereza Christina Vessoni Penna* Irene Alexeevna Machoshvili* Lucia Eiko Abe*

BARUFFALDI, R. et al. Tratamento qumico de hortalias poludas, Rev. Sade pbl., S. Paulo, 1 8 : 2 2 5 - 3 4 , 1984. RESUMO: Das amostras de hortalias em folhas coletadas no perodo de abril a agosto de 1981, no Entreposto Comercial da Cidade de So Paulo, SP (Brasil), 75% e 57% apresentaram contagens de coliformes fecais e de Escherichia coli, por grama de produto, superiores a 2 x 102 respectivamente; e em 85% constatou-se a presena de parasitas protozorios ou/e helmintos. O tratamento qumico das folhas de alface (Lactuca sativa), com soluo de hipoclorito de sdio, por um perodo de exposio de 10 min concentrao de 40 ppm de cloro livre, mostrou-se eficaz do ponto de vista parasitolgico. UNITERMOS: Hortalias. Coliformes fecais. Escherichia coli. Hipoclorito de sdio.

INTRODUO Hortalias in natura so muito consumidas na forma de saladas. Apesar de seu elevado valor nutritivo, conforme as condies higinico-sanitrias que apresentem, podem tornar-se veculos transmissveis ao homem de microrganismos patognicos. Baruffaldi e col.2 constataram a presena de salmonelas em 27% das amostras de hortalias analisadas e encontraram contagens superiores a 2 x 102 coliformes fecais, por grama do produto, em 62% das mesmas. Gelli e col.8, estudando as condies higinico-sanitrias de hortalias comercializadas na cidade de So Paulo, isolou Escherichia coli de 74,40% das amostras pesquisadas e no constatou a presena de salmonelas em 125 amostras de hortalias, incluindo alface, escarola, rcula e agrio. Christovo5 estudou exaustivamente a presena de bactrias de origem fecal em alface, encontrando, com baixa freqncia, a

presena de salmonelas em algumas das amostras examinadas. Leito11, estudando a intensidade de contaminantes de origem fecal, em alface, no isolou salmonelas, porm constatou a presena de contagens de coliformes totais superiores a 11.000 NMP/g em 75,5% das amostras examinadas e NMP de coliformes fecais insadas feriores a 30 g em 50,9% das amostras pesquiAssim como as bactrias, os parasitas, os protozorios e os helmintos so responsveis pelo estado insalubre dos alimentos. Causadores das mais variadas doenas tornam-se, por vezes, em algumas regies geogrficas, de maior relevncia do que as prprias bactrias (Pessoa14). Os alimentos de origem animal e vegetal, quando ingeridos "in natura" ou semi-cozidos, constituem-se em timos vetores das parasitoses. Gelli e col.8 verificaram a presena de ovos e/ou larvas semelhantes s de ancilostomdeo e de Strongyloides em 59% e 5%

* Do Departamento de Tecnologia Bioqumico-Farmacutica da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP - Caixa Postal 30.786 - 01000 - So Paulo, SP - Brasil.

das amostras de hortalias examinadas, respectivamente. Os fatores principais que determinam a distribuio de contaminantes de origem fecal nas hortalias so as condies ecolgicas, as prticas de agricultura, transporte, acondicionamento e comercializao. Num sentido amplo, a parasitologia inclui o estudo das bactrias, das espiroquetas, dos virus filtrveis e dos cogumelos parasitos, ao lado dos protozorios, helmintos e artrpodes6. A identificao dos protozorios e dos helmintos realizada, na maioria dos casos, com base na morfologia 6,14 . Essa tcnica encontra dificuldades na diferenciao de alguns helmintos, isolados do solo e de hortalias, causadores de parasitoses humanas, como os ancilostomdeos, cujos ovos so muito semelhantes aos de certos nematides parasitas de animais. A identificao adequada, atravs de larvas, demanda o cultivo dos ovos, que dificultado pela pequena quantidade dos mesmos, encontrados em hortalias8. Para se constatar a viabilidade de ovos de ancilostomdeos e de amebas na forma cstica, haver a necessidade de inocul-los em animais. A metodologia custosa, demandando tcnicas elaboradas, intervalos longos de tempo e, na maioria dos casos, exigindo um nvel de especificidade de hospedeiro, que torna invivel o seu procedimento6. A prtica da inoculao animal de material parastico, encontrado em alimentos, no realizada rotineiramente. Apenas o protozorio Toxoplasma gondii pesquisado em carne suspeita pela inoculao animal1. H uma necessidade enorme de melhorar os mtodos de exames parasitolgicos em alimentos. Tcnicas de identificao merecem ser reestudadas e simplificadas do ponto de vista de tempo e de execuo. Os critrios morfolgicos de identificao devem ser suplementados de testes eficientes e rpidos, sorolgicos ou fisiolgicos. O emprego de meios seletivos, semelhantes aqueles existentes para a pesquisa de bactrias, trariam maior certeza de identificao1, 6, 8, 14.

Os parasitas, em geral, so mais resistentes s condies ambientes adversas ao seu habitat, do que as bactrias patognicas ao homem. Sobrevivem, por vezes, durante um ms em guas pobres de bactrias, e uma mdia de 9 a 10 dias, em guas poludas; porm apresentam pequena resistncia aos desinfetantes14. Leito e col.12 estudaram a eficincia de desinfetantes de hipoclorito de sdio, iodo orgnico, compostos de clorobromo e de vinagre na reduo da contaminao bacteriana em folhas de alface. O presente trabalho objetivou realizar um estudo da presena de bactrias de origem fecal, de protozorios e de helmintos em amostras de hortalias em folhas. Pesquisou-se, igualmente, a validade do tratamento qumico na reduo da contaminao de parasitas presentes em folhas de alface. MATERIAL E MTODOS Coleta e preparo das amostras Durante um perodo aproximado de 5 meses (abril a agosto de 1981), foram examinadas cinco amostras de alface (Lactuca sativa), de agrio (Nasturtium officinale) e de rcula (Eruca sativa); seis de salsa (Petroselinum sativum) e sete de catalonha (Taraxacum officinale), adquiridas no CEAGESP (Companhia Estadual de Armazns Gerais do Estado de So Paulo). Cada amostra era representada por cinco unidades de ps, ou maos, acondicionadas, individualmente, em sacos plsticos estreis, transportadas ao laboratrio em caixas de isopor e analisadas at duas horas aps a sua coleta. Exames bacteriolgicos a) Preparao e diluio dos homogeneizados Pores de 25 g de cada uma das amostras foram homogeneizadas diretamente em liquidificador contendo 225 ml de soluo salina peptonada (0,1%) esterelizada, obtendo-se diluies a 10-1, A partir destas foram pre-

paradas diluies decimais a 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7, usando-se soluo salina peptonada (0,1%) como diluente. b) Pesquisa de bactrias coliformes As estimativas dos nmeros de bactrias coliformes fecais e de Escherichia coli por grama de produto analisado foram levadas a efeito utilizando-se da tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP)10. Inoculou-se 1,0 ml de diluies apropriadas em um tubo de fermentao contendo caldo de verde-brilhante-lactose-bile e que foi incubado a 44,5C durante 48 h em banho-maria, termostaticamente controlado (FANEN, Mod. 112). O tubo que apresentou formao de gs no tubo de Duhran invertido teve seu material semeado na superfcie de agar EMB (TEAGUE), incubado a 35C por 24 h. Colnias caractersticas foram isoladas e repicadas em agar TSI inclinado, incubado a 35C durante 24 h. Em seguida essas colnias foram submetidas s provas bioqumicas da International Comission on Microbiological Specification for foods10, para identificao de E. coli. Os meios de cultura utilizados procederam do laboratrio DIFCO. Exames parasitolgicos Os mtodos de flotao, sedimentao e centrifugao foram adaptados s pesquisas de cistos de protozorios, ovos ou larvas de helmintos nas hortalias referidas anteriormente. As folhas das 5 unidades de ps ou maos de cada vegetal foram misturados; e amostras de 100 g destas foram adicionadas a 200 ml de, soluo salina peptonada (0,1%), reduzidas a pequenos pedaos com tesoura, e aquecidas a 40C. Aps um contato de 20 h, temperatura de 32C, retirou-se a hortalia da soluo, que foi centrifugada a 2.500 rpm durante 10 min. Desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em gua destilada. As operaes de centrifugao e ressuspenso foram repetidas 3 a 4 vezes, at que o sobrenadante se tornasse lmpido.

Os sedimentos resultantes, transferidos s superfcies de lminas, com o auxlio de pipetas Pasteur, foram examinados microscopicamente, a fresco ou adicionados e misturados tintura de iodo-lugol. Tratamentos qumicos a) Hortalia As pesquisas foram conduzidas em folhas de alface (Lactuca sativa), variedade crespa americana. b) Agentes qumicos avaliados Os vegetais foram tratados com solues aquosas de permanganato de potssio s concentraes de 1 : 5000 e 1 : 10.000; e, de hipoclorito de sdio s concentraes de 10, 15, 20, 25, 30 e 40 ppm de cloro livre e ao valor de pH = 6,0, corrigido com soluo de cido actico. c) Anlises qumicas As dosagens de cloro foram realizadas por titulao com tiossulfato de sdio, usando-se amido como indicador12. d) Tratamento qumico -Parte experimental Cada p de alface foi desfolhado e suas folhas misturadas. Cinco amostras de 100 g destas foram individualmente adicionadas a 700 ml de uma soluo de hipoclorito de sdio, ou permanganato de potssio, tomando-se o cuidado para que ficassem totalmente submersas. Aps um intervalo de tempo de exposio de 5,10, 20 e 40 min, as folhas foram lavadas, em gua corrente, por 10 segundos e transferidas para 200 ml de soluo salina peptonada (0,1%), aquecida a 40C e adicionada, no caso dos tratamentos com hipoclorito de sdio, de 0,5% de tiossulfato de sdio como neutralizante do cloro12. As solues de lavagem com hipoclorito de sdio foram submetidas s determinaes qumicas antes e depois do tratamento. Os vegetais controles no sofreram lava-

gem prvia; apenas foram pesados e adicionados a 200 ml de soluo salina peptonada (0,1%), aquecida a 40C. Em seguida procedeu-se ao exame parasitolgico segundo mtodos no item anterior. RESULTADOS E DISCUSSO A Tabela 1 mostra o tipo e o nmero de hortalias analisadas, os resultados das determinaes bacteriolgicas e das observaes microscpicas de protozorios e helmintos. Na Tabela 2 encontram-se as concentraes de cloro livre antes e aps o tratamento; o tempo de exposio de folhas de alface cortadas as solues do desinfetante; o resultado das observaes microscpicas de protozorios e helmintos, originalmente e pstratamento, presentes na hortalia. Verificou-se que os locais de procedncia das hortalias distam do CEAGESP cerca de, aproximadamente, duas horas. Em vista das condies climticas, da exposio das hortalias ao sol ou chuva, do acondicionamento das mesmas nos engradados de madeira e disposio destes nos carregamentos, no se pode afirmar, porm sugerir ou supor, que tal percursso tenha contribudo no incremento do teor bacteriolgico e parasitolgico das hortalias. A Tabela 1 mostra contagens de 106 coliformes fecais por grama de amostra III de rcula (Eruca sativa); de 103 Escherichia coli por grama de amostra I de alface (Lactuca sativa), de amostras III e IV de rcula (Eruca sativa) e de catalonha (Taraxacum officinale); resultados que confirmam as observaes de outros autores 5, 8, 11 . Considerando-se Escherichia coli parmetro indicativo de contaminao fecal recente1, 8, 10, verifica-se, pelos resultados obtidos na Tabela 1, que as amostras de salsa (Petroselinum sativum) e de agrio (Nasturtium officinale) apresentaram maior positividade para a presena da bactria, comparativamente, as de alface (Lactuca sativa), as de rcula (Eruca sativa) e as de catalonha (Taraxacum officinale), em ordem decres-

cente confirmando a pesquisa realizada por Gelli e col.8. Contagens superiores a 2 x 102 coliformes fecais por grama de produto, limite estabelecido pelo Cdigo Sanitrio7, foram constatadas em 75% das amostras analisadas e, em 64% das mesmas confirmou-se a presena de Escherichia coli. As hortalias podem veicular outra classe de agentes etiolgicos, prejudiciais sade humana, disseminados por fezes, provenientes do solo, de esgotos, de guas de irrigao, os parasitas intestinais do homem e de animais14. Salientou-se, na introduo, as limitaes existentes na metodologia de sua identificao que dificultam a diferenciao entre ovos e larvas de parasitas animais e humanos8. Apenas na amostra I de agrio (Nasturtium officinale) coincidiu a presena de uma populao bastante diferenciada de parasitas: protozorios ciliados, cistos de ameba de vida livre e ovos de helmintos, incluindo ovos de ancilostomdeos, e contagens insignificantes de coliformes fecais, confirman10, do,14 11 observaes feitas por outros autores . Dos protozorios mais importantes medicina humana, por sua patogenicidade, o mais comumente observado Entamoeba histolytica, que pode ocorrer nas hortalias3,4 , principalmente em reas tropicais e subtropicais. Cistos de Entamoeba histolytica foram identificados nas folhas das amostras I e II de catalonha (Taraxacum officinale). A ameba ativa ou trofozoita, que se instala no intestino do hospedeiro, causandolhe disturbios do tipo disenteria, colite e enterocolite amebiana, no transmissvel. A forma infestante do parasita o cisto, veiculado e disseminado por hortalias e guas contaminadas por fezes humanas, permanecendo vivel por um intervalo de tempo de 5 min nas mos e um perodo maior do que 45 min sob as unhas10, 14. Entamoeba coli aloja-se no intestino grosso do hospedeiro, fagocita bactrias, grnulos alimentares, fungos, cistos de Giardia lamblia e de Entamoeba histolytica e nunca glbulos vermelhos, como esta ltima. Amebas

saprfitas, Entamoeba coli e amebas patognicas, Entamoeba histolytica, podem coexistir10, 14. A presena de cistos de Entamoeba coli foi constatada em folhas da amostra III de rcula (Eruca sativa). As amebas de vida livre da famlia Amoebidae desenvolvem-se bem em matria orgnica em decomposio, como esterco, gua estagnada, lama ou esgoto, onde se alimentam de bactrias e de substncias solveis absorvidas saprozoicamente. Crescem com facilidade em meios artificiais contendo matria fecal. Podem ocorrer em fezes humanas quando os cistos so ingeridos e atravessam inalterados o tubo gastrintestinal. Uma vez no meio externo, perdem a forma de cisto e multiplicam-se ativamente10. Podem ser considerados bons indicadores de contaminao fecal parasitria, visto o seu nmero ser facilmente detectvel e apresentarem por habitat o mesmo dos parasitas patognicos de constatao difcil e, s vezes, inexequvel 6 ' 8 ' 1 4 . Da mesma forma que as amebas de vida livre, a maioria das espcies dos protozorios ciliados, pertinentes ao subfilo Ciliophora, que vivem nas guas ricas em matrias orgnicas, onde pululam as bactrias, seu alimento habitual9, 13, foram considerados, pelas razes enumeradas acima, tambm indicadores de contaminao fecal parasitria6, 8, 10, 14. O objetivo de estudar a eficincia de desinfetantes na reduo de protozorios e helmintos, originalmente presentes nas folhas de hortalias, no pretere o emprego de Escherichia coli e de enterococos como parmetros indicativos da ocorrncia de outros contaminantes fecais8, visto haver maior facilidade no isolamento e identificao das bactrias do que de parasitas, de uma maneira geral. As helmintoses intestinais somticas no Brasil so alvos de preocupao constante, devido s numerosas espcies de helmintos que parasitam o homem, pelos distrbios que provocam, e pela vasta disseminao destes entre os habitantes das vrias regies do pas. Pessoa14 estimou que cerca de 93% dos brasileiros acham-se parasitados por quaisquer das espcies de helmintos intestinais,

sendo que 70% por Ascaris lumbricoides e 14% por Enterobius vermicularis, cujos ovos so ingeridos com gua ou vegetais poludos. Todavia, a maioria dos indivduos so portadores de vermes intestinais. Ovos de helmintos foram isolados nas amostras I e III de agrio (Nasturtium officinale); II de rcula (Eruca sativa); V e VII de catalonha (Taraxacum officinale). Constatou-se a presena de ovos de Enterobius vermicularis nas folhas da amostra VI de catalonha (Taraxacum officinale). O ancilostomdeo predominante no Brasil o Necator americanus, responsvel por anemia progressiva, de evoluo lenta, acompanhada de perturbaes gastrintestinais, de presso fsica e mental, localizando-se no intestino delgado do homem10, 14. Ovos de ancilostomdeos foram encontrados nas amostras I de agrio (Nasturtium officinale), III e IV de rcula (Eruca sativa). Os nematides de vida livre na natureza ocorrem na gua pura ou poluda, no solo ou no barro. Numerosas espcies de hbito parasitrio passam parte de sua vida livres, e parte parasitas de vegetais ou animais; outras espcies o so durante toda a existncia6, 10, 14. Sugere-se considerar tambm os vermes nematides de vida livre, isolados nas amostras IV e V de alface (Lactuca sativa), III de agrio (Nasturtium officinale) e I, IV e VI de salsa (Petroselinum sativum) como possveis indicadores de contaminao fecal e da presena de helmintos patognicos ao homen, pelas mesmas razes expostas para amebas de vida livre e protozorios ciliados. A profilaxia de amebiase e helmintoses intestinais de difcil execuo prtica e depende da constncia da aplicao conjunta de uma srie de medidas, quais sejam: a) tratamento e destino de material fecal do lixo; b) extenso da rede de esgoto a todas as cidades; c) proteo dos alimentos e das bebidas contra as moscas e material fecal; d) campanha de educao sanitria de carcter permanente.

Devido s dificuldades impostas pelas condies ambientes, sociais e econmicas de se implantar todas essas medidas de profilaxia, de maneira contnua e eficiente, propem-se, alternativamente, praticar a limpeza e a desinfeco qumica das hortalias. Antes de receberem quaisquer tipos de tratamento, as hortalias foram analisadas para a presena de parasitas, que se revelou abundante e freqente para protozorios ciliados, amebas e nematides de vida livre, indicadores da possvel coexistncia de representantes de protozorios do gnero Entamoeba e de helmintos. Reafirmando-se, trabalhou-se com a flora original apresentada pelos prprios vegetais, no estudo da eficincia dos tratamentos qumicos das folhas de alface. Deve-se destacar que um simples tratamento com gua das folhas de alface (Lactuca sativa) no se mostrou eficiente quanto reduo de parasitas do vegetal, confirmando os dados obtidos por Mahmoud e col.13 e Leito e col.12. Foram observadas queimaduras leves no vegetal tratado com soluo de permanganato de potssio, s diluies de 1 : 10.000 e 1: 5.000, aos intervalos de tempo de exposio de 10 e 5 min, respectivamente, que se intensificaram no decorrer dos tratamentos, devendo-se possivelmente oxidao do vegetal (Mahmoud e col.13). Os procedimentos de desinfeco das folhas de alface (Lactuca sativa), com solues de permanganato de potssio, no garantiram uma reduo significativa de parasitas originalmente presentes na hortalia. Entretanto, Mahmoud e col.13 constatou que solues de permanganato de potssio concentrao de 0,3% mostraram-se altamente bactericidas, provocando um decrscimo de 98% a 100% no nmero inicial de coliformes, estreptococos e Clostridium welchii, inoculados nas amostras de hortalias pesquisadas. A Tabela 2 mostra que o mesmo quadro parasitolgico, verificado para a hortalia sem tratamento, repetiu-se para as concentraes de 10, 15 e 20 ppm de cloro livre nas solues aquosas de lavagem. Os tratamentos que causaram redues significativas

dos protozorios e helmintos, em decorrncia ao efeito conjugado da lavagem e desinfeco, exigiram intervalos de exposio de 40 min para as solues aquosas contendo 30 ppm de cloro livre disponvel, e iguais ou superiores a 10 min s concentraes de 40 ppm de cloro livre disponvel. As recomendaes de Hobbs e Gilbert9, na desinfeco de hortalias, com hipoclorito de sdio, s concentraes de 60 - 80 mg/L, para intervalos de tempo no inferiores a 30 segundos, visando minimizar os riscos da presena de Shigella sp, S. typhi e Entamoeba sp, so compatveis aos dados obtidos no presente trabalho. Christovo5 utilizou soluo de hipoclorito de sdio concentrao de 50 mg/L na higienizao de folhas de alface (Lactuca sativa) e perodos de exposio de 40, 80 segundos e 12 minutos. Observou que a reduo na populao de Escherichia coli oscilou de 35,73% a 73,45%. Concluiu que para haver uma reduo do nmero inicial de E. coli, para 1%, o perodo de exposio do vegetal ao cloro deveria ser de no mnimo 6 h e 56 min. Leito e col.12 constataram reduo de 60% na contagem inicial de coliformes presentes em folhas de alface tratadas com soluo de hipoclorito de sdio concentrao de 200 mg/L. Christovo e Leito e col.12 concordam que a lavagem e desinfeco de folhas de alface com compostos a base de halogenios no conduzem obteno de um alimento seguro quanto ao aspecto de Sade Pblica, do ponto de vista bacteriolgico. Tamminga e col.15 sugerem que os resultados obtidos por diferentes fontes de pesquisa nem sempre podem ser comparados, principalmente quando o material analisado, a metodologia empregada e os parmetros de estudo diferem5. Porm, os resultados de cada um dos trabalhos, respeitando-se a metodologia, o material, a poca e a regio devem ser considerados e no podem ser invalidados8 . As alteraes sensveis nas concentraes de cloro livre residuais, aps 5, 10, 20 e 40 min de tratamento, com redues de, no

mximo, 33% do teor inicial, evidenciam possvel presena de materiais orgnicos nas folhas da hortalia responsveis pela inativao parcial, por vezes total, do cloro livre, comprometendo-lhe a ao germicida12. Pretende-se dar continuidade linha de trabalho iniciada, explorando tanto os efei-

tos de outros desinfetantes como, tambm, empregar diferentes parmetros microbiolgicos. Objetiva-se, igualmente, rever os mtodos existentes na pesquisa de parasitas em hortalias, cuja metodologia s primitiva em comparao quela para a anlise bacteriolgica em alimentos.

CONCLUSES 1. Verificaram-se contagens de coliformes fecais e de Escherichia coli por grama de amostra analisada at o teor de 106 e 103, respectivamente. 2. Constatou-se que 75% das amostras apresentaram contagens de coliformes fecais, por grama de produto, superiores a 2 x 102; 64% apresentaram positividade para Escherichia coli. 3. Constatou-se presena de protozorios e/ou helmintos em 85% das hortalias analisadas. 4. Constatou-se a presena de cistos de Entamoeba histolytica e de ovos de Enterobius vermiculares em amostras de catalonha (Taraxacum officinale). 5. A exposio de folhas de alface durante 10 min soluo desinfetante de hipoclorito de sdio, concentrao de 40 ppm de cloro livre, mostrou-se altamente eficiente do ponto de vista parasitolgico.

BARUFFALDI, R. et al. [Chemical treatment of polluted vegetables]. Rev. Sade pbl., S. Paulo, 1 8 : 2 2 5 - 3 4 , 1984. ABSTRACT: The effectiveness of chemicals as desinfectants for reducing the parasite contamination of lettuce leaves (Lactuca sativa, L.) was investigated. Potassium permanganate at 1: 5000 and 1: 10000 was employed, while sodium hypochlorite compound was used in concentrations of 10, 15, 20, 25, 30 and 40 ppm. In all experiments the contact time was 5,10, 20 and 40 minutes. The expousure of lettuce leaves to sodium hypochlorite 40 ppm of free cloro for 10 minutes was found to be highly effective. UNITERMS: Vegetables. Fecal coliforms. Escherichia coli. Sodium hypochlorite.

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