Revista Mdica del Hospital Nacional de Nios Dr. Carlos Senz Herrera Versin impresa ISSN 1017-8546 Rev.

md. Hosp. Nac. Nios (Costa Rica) v.30 n.1-2 San Jos 1995

Utilidad de la prueba de antigenemia cuantitativa (en leucocitos) en el diagnstico de infeccin activa por citomegalovirus
Dr. Wilbert Alfaro*

Introduccin El citomegalovirus (HHV-4) es un virus perteneciente a la familia Herpetoviridae, subfamilia Betaherpesvirinae, presenta simetra icosahdrica con 162 capsmeros y envoltura lipdica. Su ADN es de doble banda, de 235 Kb y codifica aproximadamente 200 protenas (16). La viremia por CMV es un marcador de infeccin diseminada, la cual es de difcil diagnstico clnico. Los mtodos de deteccin de la viremia incluyen el aislamiento viral, la deteccin de cido nucleico y la determinacin de antgenos. Por ser los leucocitos los mejores portadores del virus (32), la deteccin rpida de antgenos tempranos del CMV por tcnicas inmunolgicas en stos, es un indicador de infeccin activa (6,34). Epidemiologa El CMV es uno de los parsitos humanos ms exitosos (17); la incidencia en la mayora de poblaciones en pases subdesarrollados es mayor del 90%; puede transmitirse en la poblacin va vertical u horizontal, y durante las infecciones primarias, reinfecciones y/o reactivaciones, estas ltimas producidas por su capacidad de permanecer latente en leucocitos y en algunas clulas epiteliales (18,25,32). En cuanto a los mecanismos ms comunes de transmisin (18), cabe citar: va intrauterina, perinatal, postnatal, post transfusin sangunea y post transplante (1, 7). Dada la terapia inmunosupresora, la reactivacin del CMV en transplantados es casi siempre un hecho (4,29,30). En transplante de rganos slidos en seropositivos, se detecta con mayor frecuencia la reactivacin del CMV en el rgano donado, mientras que en transplante de mdula sea (TMO), se detecta con mayor frecuencia la reactivacin del CMV del receptor (19, 16, 39). El CMV se ha asociado como agente causal de rechazos de rganos transplantados y de enfermedad de rechazo injerto contra husped en TMO (16, 24, 27, 36). En los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana, el CMV es la infeccin viral oportunista ms frecuente, se presentan casos severos de pneumonitis, coriorretinitis e

infeccin diseminada (12, 31). Se ha demostrado un alto porcentaje de transmisin por contacto sexual entre hombres homosexuales (16, 18). Del 20 al 60% de los receptores de transplantes y del 25 al 90% de los pacientes con sida, pueden desarrollar infeccin activa por CMV (24). Reinfeccin, reactivaciones y recurrencia. Reinfeccin: implica que el paciente se infecta de nuevo con una cepa diferente a la de la infeccin primaria. Reactivacin: el virus que se encuentra en estado latente y sin aplicarse (no se detecta ARm viral), inicia un nuevo ciclo de replicacin, con produccin de virus, aunque no necesariamente con sintomatologa. Persistencia: el virus se replica constantemente aunque en baja tasa, siempre se puede detectar ARm viral, se ha determinado este estado de persistencia principalmente en pacientes con sida. En cuanto a las reactivaciones, pueden darse en seropositivos, inclusive hasta de dos cepas latentes diferentes. Se ha observado que el proceso, es edad dependiente, as que la probabilidad de reactivaciones baja casi a cero despus de los 30 aos de edad (16). Estudios genticos han demostrado reinfeccin an con la misma cepa de la infeccin primaria, lo que corrobora que la seropositividad no implica proteccin. Clnicamente es imposible diferenciar una infeccin primaria, de una reinfeccin o de una reactivacin. Los cuadros clnicos ms importantes, se especifican en el Cuadro 1.

Cuadro 1 Cuadros clnicos ms frecuentemente asociados a CMV a- Mononucleosis infecciosa (nios, adultos, jvenes) b- Enfermedad citomeglica (infeccin intrauterina) c- Pneumonitis (infeccin perinatal) d- Corioretinitis (sida) e- Sndrome post-transfusin (neonatos)

El diagnstico de laboratorio del CMV puede realizarse por varias tcnicas (8, 16, 32, 36) entre ellas: 1. Aislamiento en cultivo celular a partir de muestras de orina, saliva o leucocitos; el mayor inconveniente de esta tcnica es el tiempo requerido, que puede llegar inclusive de 22 a 56 das. Este mtodo puede realizarse en nuetro pas, en laboratorios especializados. 2. Diagnstico histolgico: observando las inclusiones de "ojo de pjaro" en cortes de tejido, patognomnicas de infeccin citomeglica. Es un mtodo muy especfico, pero poco sensible. 3. Observacin del agente por microscopa electrnica o inmunomicroscopa: no es una tcnica que se puede utilizar de rutina en hospitales nacionales, adems morfolgicamente los herpetoviridae son similares.

4. Hibridacin o Reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR): sirve para identificar el ADN o el ARNm viral (37). Aunque es la tcnica ms utilizada en pases desarrollados, todava en los hospitales nacionales no contamos con esta tecnologa; adems, la interpretacin de demostracin de ADN de virus que producen infecciones latentes es conflictiva (13, 33). 5. Determinacin de antgenos virales por inmunofluorescencia (IFA) o ELISA de captura, en biopsia fludos o leucocitos (antigenemia). 6.Diagnstico serolgico: es quizs la tcnica que presenta mayores problemas de interpretacin (23), por los siguiente aspectos: 6.1 Una IgG positiva slo tiene inters epidemiolgico, ya que persiste de por vida luego de la infeccin primaria. 6.2 La IgM persiste por 3 o 4 meses post-infeccin primaria, pero no se eleva en reactivaciones en personas inmunocompetentes (16). 6.3 Las personas inmunodeficientes pueden dar falsos negativos por IgG, ya que presentan ttulos muy bajos. Contrario a lo observado en inmunocompetentes los inmunosuprimidos no elevan IgM en la primoinfeccin, pero s luego de reactivaciones; probablemente su sistema inmune necesite de un estmulo mayor (16). 6.4 Puede darse transferencia pasiva de IgG en transfusiones. 6.5 La seropositividad no implica proteccin ni de una reinfeccin ni de una reactivacin. 6.6 Es prcticamente imposible distinguir serolgicamente una reinfeccin de una reactivacin. La tcnica de determinacin de antgenos virales por inmunofluorescencia en leucocitos (antigenemia), es una tcnica propuesta por van der Bij y colaboradores a finales de los aos 80 (37); permite detectar antgenos tempranos virales en leucocitos, principalmente la pp65 (14, 22, 33). Es una tcnica con un 90% de sensibilidad y un 96% de especificidad, que correlaciona muy bien con las manifestaciones clnicas y con el pronstico del paciente (4, 37). Se han realizado varios estudios comparando la tcnica de antigenemia, con las tcnicas de "shell vial", PCR e hibridacin, y han demostrado que existe muy buena correlacin entre antigenemia y enfermedad activa por CMV, demostrada por cultivo o determinacin directa del ADN viral (9, 11, 13, 26, 33, 35). Quizs su mayor ventaja sea el tiempo necesario para obtener los resultados: de 4 a 6 horas. La tcnica cuantitativa en polimorfonucleares, se puede utilizar para monitorear pacientes antes, durante y despus del tratamiento con ganciclovir o foscamet (15, 22, 27, 36). El diagnstico por antigenemia es ideal para detectar citomegalovirus activo en receptores de transplantes y en individuos con infeccin o enfermedad por VIH (5,19). En pacientes post-transplante de rganos slidos se recomienda cada 2 semanas los primeros 3 meses y mensualmente por 6 a 12 meses (33).

En pacientes sidticos o bien post-transplante de mdula sea, se recomienda una vez por semana cuando se sospeche clnicamente la infeccin (fiebre por 3 das o ms, artralgia, leucopenia, trombocitopenia, aumento de enzimas hepticas o pneumonitis inexplicable) (22, 27). La muestra requerida para el anlisis, debe ser de 6 a 10 ml de sangre total heparinizada, y es necesario que el procedimiento de la muestra se lleve a cabo dentro de las 2 primeras horas postrecoleccin, el 80% de la tasa de deteccin puede disminuir si la muestra se procesa despus de 6 horas de la recoleccin (5, 28). En cuanto a la tcnica en s, se puede realizar tanto cuantitativa en polimorfonucleares separados con Dextran PM 70000 (21) o bien cualitativa en linfocitos separados con Ficoll-Hipaque (38). La determinacin de antgenos se puede llevar a cabo por inmunofluorescencia (IFA) o inmunoperoxidasa (IPA), si se usa la inmunoperoxidasa en leucocitos totales, hay que eliminar la actividad peroxidasa endgena producidas por los eosinfilos, con un pretratamiento con metanolH2O2 (14). Sin embargo, se obtienen mejores resultados con la IFA. Se puede utilizar adems el sistema avidina-biotina o fosfatasa alcalina para el marcaje. La interpretacin se basa en el conteo del nmero de leucocitos positivos por 200.000 leucocitos estudiados (20): a) Negativo: 0 (cero) leucocitos positivos. b) Positivo dbil: de 1 a 10 leucocitos positivos c) Positivo: de 10 a 49 leucocitos positivos d) Altamente positivo: 50 o ms leucocitos positivos. Los resultados positivos dbiles pueden esperarse durante etapas tempranas de las reactivaciones o durante el tratamiento antiviral (2, 5). Un aumento en la antigenemia implica infeccin activa; una disminucin correlaciona muy bien con eficacia del tratamiento y por el contrario, antigenemia altamente positivas an despus de tratamiento indican resistencia a ste (24). En el Hospital Nacional de Nios, hemos estado utilizando la tcnica de antigenemia para el diagnstico de infeccin aguda por CMV; hasta el momento hemos procesado 70 muestras, de las cuales 12 (17%) se reportaron altamente positivo, 13 (19%) como positivo, 7 (10%) positivo dbil y 38 (54%) negativo. En nuestro Hospital utilizamos la prueba de antigenemia nicamente en pacientes seropositivos por VIH, pacientes post transplante, principalmente de mdula sea y en pacientes cuya sintomatologa sugiera al mdico una posible infeccin aguda por CMV. De los resultados obtenidos, todos los casos reportados como altamente positivo, corresponden a pacientes seropositivos por VIH, con reactivaciones del CMV. Dentro de los reportados positivo, la mayora de casos (75%), corresponden a pacientes post transplante de mdula sea con reactivacin viral y el 25% restante a infecciones primarias por CMV, diagnosticados como tales por ser IgG e IgM anti-CMV negativas. Los casos dbil positivo, no mostraron ningn patrn epidemiolgico en especial, pero al 50% de estos pacientes, cuando se les repeta el examen una semana despus, estaban positivos o altamente positivos, lo que indica que los resultados obtenidos en la primera muestra, se deban probablemente a etapas tempranas de infeccin. Los resultados negativos se asociaron con no infeccin por CMV, no reactivacin del virus o tratamientos exitosos con ganciclovir. Es importante anotar que en aquellos casos altamente

positivos, tratados con ganciclovir, a partir del da 2 del tratamiento, el conteo del nmero de clulas positivas decae drsticamente hasta llegar a negativizarse. Conclusiones La tcnica de antigenemia cuantitativa para el diagnstico de infeccin activa por CMV, es altamente sensible y especfica, puede darnos un estimado de la carga viral y puede utilizarse para monitoreo del tratamiento antiviral. En pacientes con sida o transplantados, es una prueba ideal para el diagnstico de reactivaciones del CMV, incluso antes de la aparicin de sntomas, lo que permite instaurar la terapia antes de la reactivacin clnica. Ya que est demostrado que la serologa no la podemos utilizar para el diagnstico de reactivaciones o reinfecciones del citomegalovirus, la antigenemia es la prueba diagnstica de eleccin en estos casos; adems, correlaciona muy bien otras tcnicas moleculares por PCR e hibridacin y tiene la ventaja de no requerir equipo tan valioso y sofisticado, por lo que es posible realizarla en nuestros hospitales. Resumen Se discute en este trabajo la importancia de la prueba de antigenemia para el diagnstico de infeccin activa por citomegalovirus (CMV). Se presenta una revisin de los principales aspectos involucrados en la transmisin del virus, as como ventajas y desventajas de la mayora de tcnicas utilizadas en el diagnstico del CMV, especificando las ventajas que presenta la antigenemia en cuanto a especificidad, sensibilidad, tiempo y correlacin con la clnica del paciente; adems, la utilidad de la prueba en el monitoreo de la terapia antiviral. Abstract The importance of antigenemia assay for the diagnostic of active infection of cytomegalovirus (CMV) is discussed. A review of the main aspects related to virus transmission and the advantages and drawbacks of most common diagnostic test used for CMV, is also presented. The improvements that represent the antigenemia test acording to specificity, sensibility plus time and correlation to clinical patient features is analyzed, as well as the usefulness of this antiviral therapy follow-up.

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* Divisin Inmunologa-Laboratorio Clnico. Hospital Nacional de Nios "Dr. Carlos Senz Herrera". Caja Costarricense de Seguro Social, San Jos, Costa Rica.