Caracterizao Molecular Pesquisadores americanos identificaram um gene em uma espcie norte americana de aranha que codifica uma protena

que tem ao anticoagulante, com potencial de uso na medicina. Estes pesquisadores, usando diversas tcnicas moleculares obtiveram a seqncia genmica deste gene. Pesquisadores brasileiros tm interesse de verificar se este gene est presente em espcies de aranhas ocorrentes aqui no Brasil. Voc uma consultora em biologia molecular e o grupo de pesquisadores encomendou a voc duas estratgias utilizando tcnicas moleculares para verificar se este gene est presente em espcies de aranhas brasileiras. Quais as duas estratgias voc recomendaria? Por qu? Diversas tcnicas da gentica reversa tem sido usadas para determinar as sequncias de um gene e sua funo (Alberts, 2004). Portanto, similaridade estrutural de protenas entre diferentes espcies resultante da evoluo de um ancestral comum, por isso as protenas podem apresentar homologia sendo de indivduos de espcies ou regies diferentes. A evoluo das protenas, pode ser por mutaes, inseres, duplicao, deleo, bem como acmulo de danos por falha no reparo em diferentes regies da sequncia, configurando alterao da funo. Assim, perfeitamente possvel que espcimes possam compartilhar da mesma sequncia estando geograficamente separadas. Logo, a problemtica de identificar se a sequncia gnica da aranha norte americana que codifica a tal protena a mesma da aranha brasileira, necessita de tcnicas que viabilizem a confirmao desta hiptese. Primeiramente, deve realizar a purificao da protena da aranha norte americana, depender se a protena est restrita a uma organela, como ncleo, mitocndria ou ligada a membrana plasmtica. Acontece, a partir do isolamento dessas estruturas celulares por centrifugao diferencial em gradiente de sacarose, percoll, etc. Alm, do uso detergentes no inicos (triton X, tween, etc.) que facilita a liberao das protenas, especialmente quando estas se encontram no interior de organelas. Durante a obteno do extrato bruto, com o intuito de evitar a degradao qumica ou enzimtica da protena de interesse, so liberados vrios compostos

altamente oxidantes como o perxido de hidrognio (H2O2) ou enzimas proteolticas. Por meio da membrana com porosidade inferior ao tamanho da protena de interesse possvel filtr-la. Ainda, pode ser induzida a precipitao fracionada das protenas presentes no extrato bruto adicionando-se sais para concentraes finais, separando o o precipitado protico formado em cada concentrao de sal do sobrenadante que contm aquelas com maior capacidade de solvatao. O sulfato de amnio um dos agentes precipitantes amplamente usados nessa etapa. Apresenta como caractersticas a capacidade de precipitar irreversivelmente as protenas sem aumento considervel de temperatura. Alm disso, a soluo final no apresenta alta densidade, facilitando a obteno do precipitado protico aps centrifugao. Esse primeiro passo na purificao de protenas tem como vantagem aumentar a concentrao de protena na amostra e/ou preparar a amostra para cromatografia. Outra fase importante a filtrao em gel consiste na passagem de uma soluo proteca em uma coluna preenchida com uma resina (o tipo de resina especifica a resoluo) a velocidade do processo e, principalmente, a faixa de peso molecular a ser separado,que apresenta poros de uma determinada faixa de tamanho. Fase concluinte, a retirada dos contaminantes presentes na amostra . Pode ser uma liofilizao que permita a retirada de contaminantes volteis sob baixas presses (em torno de 15 bar); uma dilise para excluir sais ou outras molculas no volteis da soluo protica, ultrafiltrao, que encerra o mesmo propsito que a dilise, porm tem como princpio a filtrao da soluo de protena por uma membrana com poros de pequeno dimetro (por exemplo,20 ), forada por presso, entre outras tcnicas. Utilizando, a eletroforese unidimensional ou bidimensional em gel de poliacrilamida. Cdna com a aranha brasileira Microarray purificao da protena da seqenciamento de peptdeos

definio de primers amplificao de mRNA ou DNA genmico por PCR Sntese de cDNA escrever p. 503 Screening Differential ou macroarray Anlises genmicas empregando macroarranjos Os arranjos em nilon so uma opo interessante aos arranjos em vidro, tanto pelo custo como pela facilidade de implementao. A seguir esto descritas as diversas etapas que realizamos em nosso laboratrio para implementao dessa metodologia. 1. Confeco dos macroarranjos As amostras de DNA so preparadas a partir de bactrias contendo os plasmdeos de bibliotecas de EST, empregando lise alcalina em placas de 96 poos, prtica comum nos laboratrios de seqenciamento em larga escala. O DNA fixado s membranas manualmente, com o auxlio de um replicador composto por 96 pinos (V&P Scientific, EUA, http://www.vpscientific. com), que possibilita a transfer ncia simultnea de ~0,1mL de DNA de cada posio de uma placa de 96 poos, equivalente a 10 ng de DNA em cada spot. Com esse procedimento, o DNA de

dezesseis placas (1.536 amostras de DNA) pode ser transferido para uma membrana de 12 x 8 cm (Fig. 1.1). Normalmente cada EST depositado em duplicata, para maior confiabilidade da anlise, com o qual os macroar-ranjos produzidos com o replicador manual contm 768 ESTs (aproximadamente 8 ESTs/cm2). A confeco de membranas de maior densidade pode ser conseguida com o auxlio de robs, podendo-se obter uma densidade de genes dez vezes maior. O BCCCenter (http://www.bcccenter.fcav.unesp.br), que gerencia os clones do projeto SUCEST, tem previso de disponibilizar para a comunidade cientfica membranas de 22,2 x 22,2 cm contendo 27.648 ESTs em duplicata. 2. Sntese de sonda e hibridao das membranas de nilon As sondas so produzidas a partir de RNA total atravs de reao de transcrio reversa, na presena a33-dCTP (Fig. 1.2). Os cDNAs marcados radioativamente so hibridados contra as membranas de alta densidade (Fig. 1.3) em fornos de hibridao comuns, empregando um protocolo muito similar ao de Southern blot, tcnica robusta e de uso corrente na maioria dos laboratrios de biologia molecular.

3. Obteno das imagens Aps as lavagens para eliminar a hibridao inespecfica, a membrana de nilon posta em contato com uma placa composta por material sensvel radioatividade (imaging plate). Aps 96 h, a placa lida em um aparelho do tipo Phosphorimager que a armazena na forma de uma imagem digitalizada (Fig. 1.4). Esse aparelho o equipamento mais custoso da metodologia (preo ao redor de U$ 40.000). A imagem ento quantificada utilizandose programas especficos (veja Tabela 1) que geram tabelas de dados nas quais cada spot (regio da membrana contendo um gene) recebe um valor numrico de acordo com a sua intensidade na imagem. A inspeo visual em filmes de raio-X tambm possvel, porm indicada apenas em ensaios qualitativos, uma vez que a quantificao das intensidades dos spots fica muito prejudicada. 4. Anlise de dados Cada gene est representado por dois spots no macroarranjo e a mdia desses dois dados considerada a expresso do gene no macroarranjo, na condio experimental testada. Com a tecnologia disponvel hoje para os arranjos em nilon e vidro, em boas

condies experimentais, geralmente toma-se como genes induzidos aqueles que apresentaram um sinal pelo menos duas vezes maior no tratamento comparado ao controle, enquanto os reprimidos possuem uma intensidade de sinal no tratamento menor que a metade do controle. No entanto, essa premissa pode no ser verdadeira, sendo necessrio avaliar a variabilidade dos dados obtidos nos diversos tratamentos. As metodologias para anlise estatstica dos dados de arranjos de DNA esto em franco desenvolvimento, Mtodo de anlise As molculas de DNA de fita simples utilizadas para detectar sequncias complementares so conhecidas como sondas,que carregam marcadores radioativos ou qumicos para facilitar sua deteco, podem ter de 15 at milhares de nucleotdeos de extenso. Os microarranjos de DNa nada mais so do que lminas de microscpio crivadas com uma grande quantidade de fragmentos de DNA, cada um contendo uma seq. De nucleotdeos que serve como uma sonda para um gene especfico. Para utilizar um microarranjo de dNa para monitorar a expresso gnica, o mRNa das clulas que esto sendo estudadas primeiro extrado e convertido para cDNA. O cDNA ento marcado com uma sonda fluorescente. O microarranjo incubado com esta amostra de cDNa marcada e realizada a hibridizao. O arranjo ento lavado, para remover o cDNA que no est ligado firmemente , e as posies no microarranjo, as quais os fragmentos de DNA marcados se ligaram, so identificadas por um microscpio

automtico de varredura a lazer. As posies dos arranjos so ento comparadas com a do gene especfico, do qual amostra. Tipicamente o DNa fluorescente das amostras experimentais (marcadas por exemplo,com corantes fluorescentes vermelho) misturado com amostra-referncia de fragmentos de cDNA marcados com corante fluorescente de cor diferente, verde por exemplo. Desse modo, se a quantidade de RNA expressado em gene particular, nas clulas de interesse esta aumentando em relao ao da amostra referncia, o ponto resultante vermelho. Ao contrrio, se a expresso do gene est diminuda em relao ao da amostra, o ponto verde. Utilizando uma referncia interna os perfis da expresso gn. Pode ser tabelados com grande preciso. (Alberts, 2004).

ALBERTS, B. Biologia Molecular da Clula. 4 .Porto Alegre. 2004.