Esterilización

Fundamento
La esterilización es el proceso físico o químico que destruye todas las formas de vida:
esterilidad es la condición de estar libre de microorganismos. La esterilización es un
procedimiento esencial de la microbiología, ya que la preparación de medios, el aislamiento y
mantenimiento de cultivos puros depende de la esterilidad de recipientes, artículos de vidrio
o instrumentación.
Hay dos métodos principales de esterilización: químicos y físicos.

Métodos químicos:
Se cree que diversos productos químicos sirven para esterilizar pero realmente son
desinfectantes o antisépticos. Los desinfectantes son los que comúnmente se utilizan para
limpiar material de laboratorio, como son mesas de trabajo, pisos e instrumentos y los
antisépticos se utilizan para desinfección de los tejidos corporales aunque la mayoría son
tóxicos.
Los desinfectantes y antisépticos solo matan las células vegetativas y no afectas a las
formas como las esporas por lo que no se pueden utilizar confiablemente como
esterilizadores.

Métodos físicos

Los métodos físicos más utilizados para la esterilización son: la radiación. Filtración y calor.

Radiación.- la luz ultravioleta es bactericida desde la longitud de onda de 633 nm y su

actividad bactericida aumenta a menores longitudes.
La radiación ionizante, como los rayos x son mortales para todas las células, incluso
bacterias y esporas, cuando se usa en dosis y tiempo suficientes.

Filtración.- este método se utiliza en soluciones que no toleran temperaturas altas,

en este método se utilizan filtros de poros de 1.0 nm o menos y por ellos retinen las
bacterias. En el comercio se encuentran diferentes tipos de filtros de diversos materiales, por
ejemplo: tierra infusoriales, porcelana no glaseada, vidrio molido y membranas de celulosa.
Se debe tener en cuenta que los líquidos no pasan fácilmente a través de los filtros
por gravedad y por estos es necesarios aplicar presión.

Calor.- Este método pude ser seco o húmedo. El calor seco requiere generalmente
más tiempo y mas temperatura de esterilización que el calor húmedo y por esto se usa para
materiales que se carbonizarían o destruirían, como pueden ser los medios de cultivo.

Calor seco
El calor seco se puede aplicar de diferentes maneras:

Flameado: se usa para esterilizar las bocas de los frascos y tubos ce cultivos, porta
objetos, cubreobjetos y varios instrumentos.
Quemado: Se usa para esterilizar espátulas y asas de inoculación manteniendo en la llama
del mechero de gas hasta que tomen un color al rojo vivo.
Calor húmedo: La esterilización completa por medio de calor húmedo se logar
aplicándolo con temperaturas mayores de 100°C usando vapor saturado bajo presión en la
autoclave durante un tiempo fijado a una temperatura determinada. El vapor a presión
atmosférica tiene una temperatura de 121°C, hasta las esporas mas resistentes mueren,
mientras que en el horno de calor seco requieren una hora a 160°C. Este tipo de
esterilización es el mas utilizado en el laboratorio de microbiología.

Manejo de la autoclave
1. Verificar que el nivel del agua sea el adecuado.
2. El material a esterilizar se debe colocar en la canastilla de la autoclave y se introduce
en ella.
3. Se enciende el autoclave, las llaves se cierran en parejas, una sola persona debe
realizar esta operación para que la fuerza sea la miasma en cada una de las llaves, y
se debe dejar abierta la válvula de escape.
4. Cuando el vapor comience a salir por la válvula, esta se cierra y la presion y
temperatura comenzara a aumentar. Debe verificarse frecuentemente de que el
autoclave no rebase las condiciones adecuadas.
5. Cuando se ha llegado a las condiciones de presión, temperatura y tiempo adecuados,
el autoclave se desconecta y se abre lentamente
la válvula para que el vapor escape lentamente.
Solo se puede abrir la tapa cuando ya se haya
bajado por completo la presión.

Control de calidad de la autoclave

El autoclave es un aparato que requiere de gran cuidado, es recomendable que
siempre este en prefectas condiciones, pues de esto depende en gran parte de obtener
resultados confiadles.
Debe estar en lugar protegido, limpio y completamente plano para evitar algún
accidente.
El agua que se utiliza para el aparato debe ser limpia, se debe verificar después de
su utilización que el agua permanezca transparente ya que si no esta puede indicar que
hubo un derrame dentro de la autoclave que puede tapar o dañar su interior.
Se recomienda que una vez por semana se añada en la carga para esterilizar, cintas
indicadoras, esto es para observar el funcionamiento del autoclave, aunque no indica que se
este realizando una buena esterilización.

Observaciones

Al terminar de realizar esta practica creo que aprendimos como se debe utilizar la
autoclave, aunque sea algo nuevo para nosotros, creo que entendimos y llevamos acabo
la esterilización lo mejor que nos fue posible para ser nuestra primera vez.
Aprendimos a colocar en la boca de un matraz un sombrerito de papel Manila para
evitar que el tapón de algodón se dispare cuando este dentro de la autoclave.
Aprendimos hacer hisopos que también colocamos en el autoclave para su
esterilización.
Resultados
Obtuvimos el material esterilizado un poco húmedo, para ser utilizado después
Conclusiones
Ese día aprendimos las técnicas asépticas que debemos seguir al momento de entrar en el
laboratorio, como es:
♣ El manejo de la autoclave
♣ Manejo del horno de calor seco
♣ Manejo del mechero
♣ Satanización del área de trabajo
♣ Manejo de los desinfectantes.
La plática que nos dio la maestra nos impartió el sentido de responsabilizarnos de cuidar
nuestra área de trabajo, ya que de esto dependerá nuestro desempeño en este laboratorio,
y de la capacidad de cuidarnos a nosotros mismo y al medio ambiente lo mejor que sea
posible. Realmente aprendimos a usar la autoclave bien, a usar la cinta testigo c en los
utensilios que vamos a utilizar.

Actividades

Comparar la eficacia entre calor seco y húmedo.

Las dos son igualmente efectivas, lo que varia en realidad es el tipo de material que
es especifico para cada tipo de calor.

¿Qué es autoclave?
Es un aparto que realiza una esterilización completa por medio de calor húmedo y se
logar aplicando temperaturas mayores a los 100°C usando vapor saturado.

Elabora una lista de materiales que se deben esterilizar en un horno de calor seco en
vez de autoclave.

♣ Frascos ♣ Espátulas
♣ Asa bacteriológica ♣ pinzas
Fundamento
Los patrones de calor, a través del reino animal, son otra indicación de la importancia
de la relación entre el receptor y la luz; y están relacionados con funciones de protección y
de apareamiento.

Los colorantes vitales penetran en las células y dan color a sus estructuras, sin
causar un gran daño. El verde B Janus tiñe las mitocondrias selectivamente, y el azul de
metileno tiñe el aparato de golgi. Los colorantes vitales no son totalmente inocuos, pero solo
matan después de la exposición prolongada. Aunque útil, la técnica de coloración vital tiene
poca aplicación, por que muchos organelos son tan pequeños que no se tiñen. Los agentes
fijadores, como formol, alcohol, ácidos, sales de metales pesados o mezclas de estos,
vuelven insolubles las proteínas.

A continuación, se extrae el agua de los tejidos fijados mediante agentes

deshidratantes, como el alcohol, y los tejidos se sumergen en parafina y se cortan con el
micrótomo. Los cortes se fijan en laminillas y estas se lavan con xilol y alcohol. Mediante a
lavados con concentraciones decrecientes de alcohol hidratan en parte los cortes y luego la
materia proteica de la célula se tiñe de manera diferencial para distinguir la estructuras
presentes. Los colorantes naturales (hematoxilina), o los básicos de analina (safranina y
fucsina básica) tiñen el núcleo de manera selectiva y los colorantes ácidos (anaranjado G,
eosina y verde rápido) tiñen el citoplasma. Se deshidratan los cortes con alcohol, después se
le agrega xilol. Al final la preparación se monta en bálsamo.

La forma mas simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es

hacer una preparación en fresco. Y existen dos tipos de técnicas, una preparación en
fresco simple consiste en colocar una gota de liquido con la muestra y poner el cubre
objetos. Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en
un cubreobjetos y cubriéndolo con el portaobjetos. Estas preparaciones se utilizan para
observar microorganismos vivos.

Si embargo el inconveniente de la preparación en fresco es que no permite aumentar

el constaste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro,
esta bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza otros
microscopios ópticos.

Existen tres técnicas de tinción: simple, diferenciales y específicas.

En las tinciones simples se utiliza un solo colorante que siempre es de tipo básico.

Las tinciones diferenciales se utilizan par distinguir entre tipos de microorganismos; esta
técnica consta de dos partes: tinción primaria y tinción de contraste. Y entre estas se
encuentran las siguientes tinciones:

1. Tinción de Gram, esta utiliza dos colorantes y distingue las bacteria gram positivas y
gram negativas.
2. La tinción de acido-alcohol resistencia.- actualmente se utiliza la tinción de Ziel-
Nieelsen, esta sirve para teñir bacterias del genero Mycobacterium, el resto de las
 bacterias se tiñen de azul por el colorante de contraste. Aquí todas las bacterias se
tiñen de rojo y se decolora brevemente con HCl. Después se tratan con le colorante
de contraste azul de metileno.

Tinciones especificas.- esta incrementa el contraste en las células microbianas y revelan

estructuras particulares, entre las que se incluyen las endoesporas, los flagelos y las
capsulas.

1. Tinción de esporas de Wirtz-Conclink.- esta tiñe selectivamente las endoesporas y

ocupa verde de malaquita.
2. Tinción de flagelos de Leifson.- esta permite observar los flagelos; ocupa una
mezcla de acido tanico (mordiente) y del colorante rosalinina.
3. Tinción negativa.- esta revela la presencia de capsulas, y se utiliza tinta china o
nigrosina para teñir una preparación en fresco del espécimen. Las partículas de
colorante no pueden penetrar en la capsula, que se observa como una región clara
alrededor de la célula.
4. Tinción de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se
sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos de las células.

Observaciones

Oxiuros en Cocos gram +

Trichuris trichura hembra
ratas 40 X

Taenia saginata 4X Gram – 100x

 Oxiuros C+ en rata Mycobacterium Tuberculosis

Cocos lanciolados
Estreptococo neumonae Gram + 100 X
Gram +

Resultados

Observamos que las tinciones son muy útiles para identificar los microorganismos,
como bacterias, parásitos, helmintos, protozoos, en fin; una gran gama de organismos
patógenos para el hombre. Pero también se han descubierto microorganismos que son
benéficos para el hombre.

Conclusiones

Nos dimos cuenta de la importancia de las tinciones en la microbiología, ya que se

observan mejor las formas de los microorganismos, es sumamente importante e
interesante que sepamos para que nos sirven exactamente las tinciones, y nos abre la
mente a otro pequeño mundo que nos rodea, nos afecta, nos benefician, nos mata.