Sciences & Technologie C-N26, dcembre 2007, pp.27-32.

REPONSE A LA CULTURE IN VITRO DE TROIS VARIETES DE LOLIVIER (Olea europaea L.)

Reu le 10/11/2005 - Accept le 03/05/2007

Rsum Lexprimentation entreprise dans le Laboratoire de Gntique, Biochimie et Biotechnologies Vgtales (LGBBV) de la Facult des Sciences de lUniversit Mentouri (Constantine) avait pour objectif ltude de la rponse de trois varits dolivier (Olea europaea L.) deux milieux de base de la culture in vitro additionn de diffrentes concentrations hormonales. Les boutures des varits Chemlal, Sigoise et Grosse de Hama ont t collectes de la Ferme Pilote Erkani sise Hama Bouziane. Aprs asepsie complte, des micro-boutures de 1 cm de long portant des bougeons axillaires sont ensemences sur milieux MS et B5 additionns des rgulateurs de croissance. Le milieu B5 sest rvl le plus intressant pour la multiplication in vitro des varits tudies. Sur la base du suivi de lmission foliaire, la croissance en hauteur et laccumulation de la matire frache des explants, Chemlal ragit nettement mieux la conduite in vitro. La rhizogense a t induite aprs formation de cals chez Chemlal sur milieu MS dilu de moiti (MS/2) additionn de 0.5 mg.l-1 de Kintine + 0.5 mg.l-1 dANA et sur milieu B5 additionn de 0.4 mg.l-1 de BAP + 1.33 mg.l-1 dAIB, et chez Siguoise sur milieu (MS/2) additionn de 0.5 mg.l-1 de Kinitine + 1 mg.l-1 dANA. Les pousses feuilles enracines de ces deux varits ont subi la phase dacclimatation avec succs et se sont adaptes la croissance sous serre. Mots cls Olea europaea L. culture in vitro milieu de base - rgulateurs de croissance. Abstract The experiment conducted in the Laboratory of Genetic, Biochmistry and plant Biotechnology (LGBBV), Faculty of Sciences, Mentouri University (Constantine) aimed to study the response of three olive cultivars (Olea europaea L.) response to two basic tissue culture media complemented with different concentrations of growth regulators. Cuttings of Chemlal, Siguoise and Grosse de Hamma cultivars were collected from the Erkani Pilot Farm located at Hamma Bouziane. Under complete aseptic conditions explants 1cm long holding lateral buds were subcultured in MS and B5 media complemented with growth regulators. B5 medium emerged as the best for tissue culture of the studied cultivars. Based on leaf proliferation, stem extension and accumulated fresh matter measurements, Chemlal showed a good response to in vitro culture. Root proliferation was induced after callus formation for Chemlal in the 1/2 diluted MS medium complemented with 0.5 mg.l-1 Kinetine + 0.5 mg.l-1 ANA and in B5 medium complemented with 0.4 mg.l-1 BAP + 1.33 mg.l-1 AIB. And for Sigoise in the 1/2 diluted MS medium complemented with 0.5mg.l-1 Kinetine + 1 mg.l-1 ANA. Leafed and rooted explants from the two cultivars have passed successfully the acclimation phase and fully adapted to grow under glasshouse conditions. Key words : Olea europaea L. in vitro culture Basic medium growth regulators.

L. BENDERRADJI H. BOUZERZOUR2 N. YKHLEF1 1 A. DJEKOUN K. KELLOU1

1

LGBBV Facult SNV. Universit Mentouri Constantine. Algrie.

2

Dpt. Biologie. Facult Sciences. Universit Ferhat Abbas. Stif. Algrie.

) ( . Olea) (europeae L. : . 1 . . B5 MS : . ) ( . 0.4 B5 ANA 1- + 5.0 . kin 1- ( 5.0 . MS) MS/2 ANA 1- + 1 . kin 1- 5.0 . MS/2 AIB 1- + 33.1 . BAP 1-. .
.(, , , , Olea europeae L.) :
Universit Mentouri Constantine, Algrie, Dcembre 2007

BENDERRADJI L., H. BOUZERZOUR, N.YKHLEF, A. DJEKOUN, K. KELLOU 'olivier constitue lchelle nationale une des principales essences fruitires. Le verger olicole occupe 164.103 ha et produit prs de 20.103 tonnes dhuile. La consommation moyenne nationale est de 13 kg/hab./an dont 12 kg sous forme de graines et 1 kg sous forme dhuile. Loliculture procure 11 millions de journes de travail, soit l'quivalent de 55 000 emplois permanents [1]. Le profil varital est constitu essentiellement de deux varits trs rpandues Chemlal et Sigoise. Cette faible diversit varitale contraste avec celle des milieux de production. Il existe des varits populations trs rustiques et trs adaptes aux conditions pdo-climatiques de leur milieu dimplantation mais qui ne sont pas multiplies. Une prise de conscience sest opre rcemment ce sujet pour amliorer la conduite du verger, rflchir son extension et sur des terres o lintensification de la production est possible. Ce regain dintrt pour larboriculture, dune manire gnrale et pour loliculture de faon particulire, risque dtre remis en cause par manque de plants sains, issus de varits adaptes et productives. Les nouvelles techniques de reproduction ou de multiplication, si elles sont matrises peuvent rendre de grands services dans ce domaine. Le micro bouturage permet de multiplier des espces difficiles reproduire naturellement, avoir des vitro plants facilement transportables sans risques sanitaires et reboiser trs rapidement avec une diminution du cot de production. La prsente tude est une contribution la matrise de la culture in vitro pour lamlioration agronomique de lolivier (Olea europaea L.), et d tudier linfluence de plusieurs facteurs dont la composition minrale (Bartolini et al. 1989) [2], Berenguer et al. 1989) [3] et hormonale (Leva et al. 1992) [4] des milieux de culture, le gnotype (Leva et al. 1992) [4] (Rugini et al. 1984) [5] et lage de lexplant (Porlongis et al. 1976) [6], Rugini, 1986) [7]

(Fll), lestimation de la croissance en hauteur (Ht, mm) de lexplant, faite laide dune rglette millimtre, mesures prises de lextrieur du tube ensemenc et la matire frache (Mf) accumule par lexplant qui est dtermine par la formule suivante: MF = PF75 PF0, do MF = matire frache de lexplant (g), PF75 = poids frais de lexplant aprs (75) jours de lensemencement (g) PF0 = poids frais de lexplant au dbut de lensemencement (g) Lorigine du matriel vgtal est la Ferme Pilote Erkani de lITAF (Institut Technique de lArboriculture Fruitire) situe Hama Bouziane (Constantine) o des boutures longues de 25 cm ont t collecte au mois de juillet, elles sont prleves des rgions mdianes des rameaux des piedsmres et portent plusieurs bourgeons axillaires. Les extrmits des boutures ont t obtures avec de la paraffine avant de les transporter au laboratoire o elles ont t essuyes avec du Cotton imbib de Tween 20 et laves pendant quelques minutes sous leau courante puis trois fois avec de lhypochlorite de sodium 6 % pendant cinq minutes chaque fois avant dtre rinces abondamment leau distille strile (Najiba. B et al.) [8]. Aprs chaque lavage, on rince avec de leau distille pour assurer une meilleure dsinfection, les boutures sont ensuite passes rapidement dans lalcool 70 et stockes sous la hotte pour une dcoupe en micro-boutures de 2 cm de long portant chacune deux bourgeons axillaires Lensemencement des explants est fait sous conditions dasepsie. Les microboutures, mises dans une boite de ptri contenant une solution filtre dantioxydant, sont lagues de leurs extrmits noircies. Cette opration est ralise sous bec bunsen dans les tubes de cultures contenant chacun 10 ml de milieu de base. Les tubes sont mis en place dans une chambre de culture une temprature variant entre 22 et 25C, une photopriode de 16heures sous une intensit lumineuse de 60 Mol m-s-.

Matriel et mthodes Ltude a t mene dans le Laboratoire de Gntique, Biochimie et Biotechnologies Vgtales (LGBBV) de Les explants qui prsentent un bon dveloppement lUniversit Mentouri, Constantine, le protocole vgtatif sur milieu de culture sont acclimats avant leur exprimental mis en place est constitu de trois facteurs transfert sous serre vitre. Ces explants sont transplants dans un dispositif en bloc avec trois rptitions, savoir, la dans un sol reconstitu de sable, de tourbe et de terre part varit avec trois modalits (Chemlal, Sigoise et Gosse de gale (1:1:1 volume). Le substrat sol reconstitu est strilis Hama), le milieu de culture avec deux modalits dans une tuve porte 200C pendant 30 minutes. (Murashigue et Skoog "MS" et Gamborg" B5") et les concentrations hormonales avec 5 modalits codes de C1 C5 (tableau 1). Tableau 1 : Les concentrations en Kintine et AIB codes de C1 C5 additionnes au milieu de culture MS et B5 Milieu Code C1 C2 Kintine (mg.l-1) 5 4 AIB (mg.l-1) 1 2 Milieu Code C1 C2 Kintine (mg.l-1) 1 2 AIB (mg.l-1) 0.25 1

3 3 MS tube C3 culture constitue lunit exprimentale sur Le de laquelle les mesures sont effectues. 75 jours aprs le dbut 2 4 C4 de lexprience, et portent sur le dnombrement des feuilles 1 5 C5

2 B5est mis C3 de pots de 3 Il dans dimensions 8,5 x 7,5 cm qui sont pralablement striliss avec de leau de Javel 12. La 4 3 C4 manipulation du remplissage des pots avec du substrat du 5 4 C5 28

Rponse la culture in vitro de trois varits de lolivier (Olea europaea L.) sol reconstitu est faite sous hotte. Lexplant est retir de son tube avec une pince strilise. On lave les racines avec de leau distille strilise, et on lague les feuilles les plus ges. On mouille le substrat sol avec de leau strilise et on transplante lexplant dans le pot. On irrigue avec une solution nutritive constitue de 5 ml de macro plus 2.5 micro-lments dans 200 ml deau distille. Les pots, ainsi traits, sont mis sous un dessiccateur nettoy leau de Javel, et remis dans la chambre de culture. Le transfert des explants dans des pots de dimensions plus grandes est fait 3 semaines plus tard. Aprs ce temps, on retire le dessiccateur pour les laisser lair ambiant de la salle de culture pendant trois autres semaines au bout desquelles les explants sont transfrs sous serre et irrigus avec leau ordinaire. Laugmentation relative permise par le milieu B5 comparativement au milieu MS, est de 223.3% pour lmission des feuilles, 143.9% pour lexpression de la hauteur et 263.8% pour la matire frache accumule par les micro-boutures au bout de 75 jours aprs ensemencement (Figure 1)
300 250 200 150 100 50 FLL HT MF

Rsultats et discussion
0

Effet milieu, varit et combinaison hormonale sur lexpression de lexplant Globalement il y a eu un bon dveloppement de tous les explants ensemencs avec un taux de contamination qui est rest dans les limites acceptables, variant entre 6.6 et 20%. A titre de comparaison Sadder [9] rapporte des taux de contamination allant jusqu 45% en culture in vitro de lolivier. Ignorant leffet varit, le milieu B5 se rvle comme tant celui qui satisfait le plus la demande nutritionnelle des explants ensemencs. Il convient mieux linitiation foliaire, au dveloppement en hauteur et laccumulation de la matire frache des explants (Tableau 2)

MS

B5

Effet de la nature du milieu sur lexpression des Figure1: variables mesures sur les micro boutures (valeurs du MS prises comme indice 100).

Les varits ne diffrent pas significativement pour les variables feuillage et hauteur des explants (Tableau 2). Ignorant leffet milieu de base, la varit Chemlal se dmarque, par contre, par une meilleure capacit intrinsque de production de la matire frache comparativement la varit Sigoise alors que Grosse de Hama est intermdiaire pour cette caractristique.

Tableau 2 : Moyennes du nombre de feuilles (fll), de la hauteur (ht) et de la matire frache (mf) des explants exprims au cours de lexprience, sous leffet des diffrents traitements. _________________________________________________________ Variables mesures Facteurs Fll Ht Mf Effet moyen milieu MS 6.04b 12.52b 125.34b a a B5 13.49 18.02 330.75a Effet moyen varit Chemlal 9.93a 16.40a 291.26a a a Sigoise 10.47 14.77 180.36c a a G. de H 8.90 14.80 214.02b Effet moyen hormone C1 12.06a 16.89a 276.13a b b c C2 8.06 14.00 204.06 C3 11.00a 16.22a 207.59c c b C4 7.89 14.28 225.83b b b C5 9.83 15.22 229.14b
** Moyennes suivies par la mme lettre ne sont pas diffrentes significativement selon le test NKS

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BENDERRADJI L., H. BOUZERZOUR, N.YKHLEF, A. DJEKOUN, K. KELLOU Sigoise a une forte capacit daccumulation de la matire frache quivalente 62% celle de Chemlal et Grosse de Hama a un quivalent de 73.5% (Tableau 2, Figure2) Les diffrentes combinaisons de kintine+AIB affectent diffremment les caractres mesurs. La combinaison C1 (1 mg.L-1 Kin + 0.25 mg.L-1 AIB) est, en moyenne des effets varit et milieu de base, favorable lexpression des variables mesures. La combinaison C2 est dfavorable lexpression du feuillage au mme titre que la C4, alors que la C3 vient en seconde position pour lexpression du feuillage et de llongation en hauteur des micro- boutures (Tableau 1, Figure 2.b). Certaines combinaisons ont un effet spcifique. Les combinaisons C3 et C5 favorisent nettement mieux lexpression du feuillage sur milieu MS. La combinaison C3 est plus avantageuse lexpression de la hauteur des explants sur milieu MS. Alors que les combinaisons C4 et C5 le sont pour la matire frache sur B5 et MS respectivement (Figure 2, B).
120 100 80 60 40 20 0 1

120 100 80 60 40 20 0 MS F ll B5 F ll MS Ht B5 Ht MS Mf B5 Mf C h e m la l S ig o is e G . de H

Figure 3 : Variation des valeurs moyennes des trois variables mesures en fonction de la varit et la nature du milieu de culture (valeurs en % du maximum observ par variable).

A
Chem S ig GH

Ces rsultats indiquent que globalement le milieu B5 est plus appropri pour la culture in vitro de lolivier. Cependant des diffrences trs marques apparaissent entre les varits selon la variable mesure pour valuer la rponse des micro-boutures. Ainsi si la rponse des microboutures est value de par lmission foliaire, la combinaison la plus intressante est Chemlal cultive sur milieu B5. Cette combinaison est suivie par la Sigoise sur milieu B5. Par contre si lvaluation est faite sur la matire frache accumule, la combinaison la plus intressante est la chemlal sur milieu B5. (Figure3) Linteraction des trois facteurs indique que la varit Chemlal produit plus de feuillage sur milieu B5 additionn de la combinaison hormonale C4 ou C5. La Sigoise montre un meilleur comportement sur milieu B5 mais additionn des combinaisons hormonales C1 ou C3. Grosse de Hama, produit des feuilles plus longues sur milieu B5 auquel on ajoute les combinaisons hormonales C1 et C3 (Figure 4, a). Pour la variable croissance en hauteur des micro-boutures, la varit Chemlal prsente une meilleure expression sur le milieu B5 additionn de la combinaison hormonale C4 ou C5. La Sigoise accrot plus vite et mieux sur milieu B5 plus la combinaison hormonale C1 et aussi C3. Pour la varit Grosse de Hama, la meilleure hauteur est observe sur le milieu B5 additionn des combinaisons hormonales C1 ou C4 (Figure 4, b) Chemlal produit plus de matire frache sur milieu B5 plus la combinaison hormonale C4 et C5.La Sigoise fait mieux sur milieu B5 additionn de la combinaison hormonale C1.Grosse de Hama saccommode mieux au milieu B5 plus la combinaison hormonale C1 (Figure4, c). Ces rsultats indiquent quen ce qui concerne la partie arienne, le milieu le plus intressant pour la multiplication in vitro de lolivier reprsent par trois varits trs diffrentes est le B5.

120 100 80 60 40 20 0 c1 c2 c3 c4 c5

B
F ll Ht Mf

Figure 2 : (A et B) : Effet varit et combinaison hormonale sur laccumulation de la matire frache sur les trois variables mesures (valeur en % du maximum observ par variable).

Chemlal et Grosse de Hama mettent plus de feuilles que la Sigoise sur milieu B5 (Figure 3), les microboutures de Chemlal sont plus hautes que celle de Sigoise et Grosse de Hama sur milieu B5. Sur milieu MS, par contre, lordre est, Grosse de Hama, chemlal et puis Sigoise (Figure3) Pour la matire frache accumule, la chemlal accumule plus sur milieu B5, suivie de grosse de hamma et puis Siguoise. Sur milieu MS, cest Grosse de Hama qui est plus apte accumuler plus de matire frache suivie de Chemlal et enfin de Sigoise (Figure 3)

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Rponse la culture in vitro de trois varits de lolivier (Olea europaea L.) et que mettent profit les bourgeons pour se dvelopper, une fois mis dans les conditions adquates comme celles quils trouvent in vitro. Sadder [2] rapporte aussi des diffrences de comportement des microboutures issues de diffrentes parties de la plante. Il explique le bon comportement des boutures issues de la collecte de lt par le fait quelles contiennent plus de rserves nutritives qui permettent aux explants de sadapter peu peu aux conditions de la culture in vitro. Induction racinaire et acclimatation
Figure4a: Variation du feuillage des explants en fonction des varits, milieux et combinaisons hormonales
120 100 80 60 40 20 0 C1 MS C2 MS C3 MS C4 MS C5 MS C1 B5 C2 B5 C3 B5 C4 B5 C5 B5 Chem S ig G .H .

120 100 80 60 40 20 0 C1 MS C2 MS C3 MS C4 MS C5 MS C1 B5 C2 B5 C3 B5 C4 B5 C5 B5 Chem S ig G .H .

Une fois la relation entre le type de milieu, la varit et la combinaison hormonale est prcise pour le dveloppement des pousses feuilles des micro boutures, linduction racinaire a t recherche pour assurer le transfert des plantules en plein champs, aprs leur acclimatation progressive dans la chambre de culture puis sous serre. Le dveloppement racinaire a t induit chez la varit Chemlal sur milieu MS/2 additionn de 0.5 mg.l-1 Kin+ 0.5 mg.l-1 dANA et aussi sur milieu B5 additionn de 0.4 mg.l-1 BAP + 1.33 mg.l-1 AIB et chez la varit Sigoise sur le milieu MS/2 additionn de 0.5 mg.l-1 Kin +1mg.l-1 ANA. La dilution de moiti du milieu MS est souvent avantageuse pour induire la formation des racines. En effet selon Kulchetschi et al. [11], Un faible concentration ionique du milieu de base stimule mieux la formation des bourgeons et la prolifration des tiges chez lexplant. Elle conduit aussi une plus grande capacit de formation des racines chez les tiges (rootable explants). Une faible prolifration racinaire peut avoir comme origine, la production par lexplant ; ou la prsence dans le milieu de base, des substances chimiques inhibitrices de la morphogense. Ce phnomne est rduit par ajout du charbon actif qui exerce son effet par labsorption des substances toxiques produites et rejetes par lexplant dans le milieu. La production de telles substances a t dmontre dans la culture in vitro de Allium et Daucus [12]. Un second effet est que le charbon absorbe les substances nocives associes aux minraux entrant dans la composition du milieu. Sanchez et al. [13] rapportent que lajout du charbon actif tait bnfique pour le dveloppement du systme racinaire et de lorganogense. Leffet du charbon est similaire a celui de lobscurit car ce dernier noircit le milieu. Les effets stimulateurs du charbon actif, en culture in vitro, ont t rapports par Rugini et al. [14] pour lolivier et par Rugini et al. [15] pour lamandier et le noyer. Saborio et al. [16] mentionnent que la concentration de lazote dans le milieu est un autre facteur qui peut tre lorigine des diffrences de prolifration de la morphogense des explants ensemencs dans diffrents milieux. Le rapport entre les diffrents lments intervient aussi comme facteurs pouvant promouvoir ou rduire la rponse de lorganogense. La formation des cals est un pralable linduction de la rhizogense. Les racines sont,

Figure 4b: Variation de la hauteur en fonction des varits, milieux et combinaisons Hormonales
120 100 80 60 40 20 0 C1 MS C2 Ms C3 MS C4 MS C5 MS C1 B5 C2 B5 C3 B5 C4 B5 C5 B5 Chem S ig G .H .

.
Figure 4c: Variation de la matire frache accumule en fonction des varits, milieux et combinaisons hormonales.

Ces rsultats sont conforment ceux rapports dans la littrature pour ce qui est des rponses diffrentes des varits au type de milieux de culture et aux hormones. Rokba et al. [10] rapportent des rponses varitales trs diffrentes aux milieux de culture utiliss ainsi quaux diffrentes concentrations des hormones. Ils mentionnent que la variabilit des rponses des varits est aussi lie au stade vgtatif de rcolte des boutures ensemencer. Dans la prsente tude le matriel vgtal collect au cours de la priode qui stend de juin aot rpondait le mieux la conduite in vitro. Ceci sexplique par le fait quen t les oliviers sont en pleine priode de croissance active. Les tissus vgtaux collects au cours de cette priode contiennent plus de rserves facilement utilisables

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BENDERRADJI L., H. BOUZERZOUR, N.YKHLEF, A. DJEKOUN, K. KELLOU en effet, dveloppes uniquement chez la varit Chemlal et Sigoise o la caulogense sest initie. La ncessit du passage par la phase de caulogense pour avoir un dveloppement racinaire est mentionne par Rama et Pontikis [17]. Sur bl tendre (Triticum aestivum L.), Rashid et Quraishi [18] mentionnent que linduction des cals est dpendante du gnotype et quelle est favorise par laddition du 2.4-D au milieu basal. Ils rapportent aussi que la prsence de lIAA dirige la morphogense vers un excs de prolifration racinaire. Selon Bouharmont et Desseyrs [19], chez le riz (Oriza sativa L.), 1 mg.l-1 d'AIA ajout au milieu de base (LS), induit la rhizogense aprs une incubation de 10 jours lobscurit. La varit Chemlal a dveloppe des racines sur MS/2 additionn de 0.5 mg.l-1 Kin + 0.5 mg.l-1 ANA. Le dveloppement racinaire a t not aussi pour la mme varit sur milieu B5 additionn de 0.4 mg.l-1 BAP + 1.33 mg.l-1 dAIB. Sigoise dveloppe des racines sur milieu B5 additionn de 0.5 mg.l-1 Kin + 1 mg.l-1 ANA. Les explants des varits Chemlal et Sigoise dveloppant des racines, se sont facilement acclimats et ont t transfrs sous serre o leur croissance sest maintenue. Conclusion La rponse des varits tudies de par les mesures faites sur llongation foliaire, la croissance en hauteur et la matire frache accumule par les explants indique que le milieu B5 est nettement meilleur comparativement au milieu MS pour lexpression des variables mesures sur la partie feuille des explants ensemencs. Sur ce mme milieu les trois varits diffrent peu pour lexpression du feuillage et de la croissance en hauteur des microboutures mais elles diffrent significativement pour la matire frache accumule. Chemlal a la meilleure capacit daccumulation de la matire frache. Les diffrentes combinaisons de lassociation kintine + AIB affectent diffremment les variables mesures. La combinaison 0.25 mg.l-1 Kin + 1 mg.l-1 AIB est relativement plus favorable lexpression des caractres tudis. La rhizogense des varits Chemlal et Sigoise a t initie aprs caulogense induite par la kintine et l'AIB. Les explants ayant dvelopps des racines ont subi lacclimatation avec succs et ont t transfrs la serre. REFERENCES
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