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Desenvolvimento de um método alternativo ao uso de animais de laboratório para

avaliação da toxicidade de extratos vegetais

WILLIAN BRÁULIO LOPES1,2, FÁBIO TONISSI MORONI1 , MARIA INÊS HOMSI

BRANDEBURGO1 , AMÉLIA HAMAGUCHI1.

As normas éticas internacionais recomendam o uso criterioso de animais de

laboratório e o desenvolvimento de métodos experimentais alternativos. Artemia salina é

utilizada como indicador de toxicidade de substâncias químicas, pesticidas, poluentes e

outros. Utilizando-se a concentração letal média (CL 50) é possível determinar e avaliar a

atividade biológica (toxicidade) de um certo composto ou extrato natural. O presente trabalho

visa padronizar e implementar um método de avaliação da toxicidade de extratos vegetais,

utilizando-se larvas de Artemia salina Leach. Os cistos de Artemia salina foram incubados em

salina sintética (35ppm) a temperatura de 28oC e estado de saturação de O2. após 24 horas, os

náuplios foram separados e incubados em salina sintética por 24 horas nas mesmas condições.

Em uma placa multidisch nunc, as larvas metanáuplio (n=10), foram incubadas na presença

dos extratos, em volume final de 5ml (triplicata) e mantidas por 24hr no escuro. As plantas

coletadas na região de Uberlândia-MG, foram trituradas em água destilada, e os extratos

liofilizados e ressuspendidos em água deionizada (20mg/ml). A CL 50 dos extratos de Ginkgo

biloba, Casearia mariquitensis, Tabebuia ocracea, Moringa oleifera, Mandevilla velutina e

Casearia grandiflora foi determinada: >5,0; >4,0; >4,0; 4,0; 3,6 e 0,4mg/ml respectivamente.

Dentre os solventes testados, na concentração de 5% (v/v), tween 80=água <DMSO< etanol <

metanol. A.salina se apresentou como excelente indicador de toxicidade além de constituir um

teste simples de baixo custo. Apoio Finance iro : UFU, CAPES, FAPEMIG

Palavra chave: Artemia salina, brine shrimp, extratos naturais.

1
Instituto de Genética e Bioquímica/Universidade Federal de Uberlândia/Av. Pará,1720, Umuarama,
Uberlândia-MG, CEP:38400-662/ 2Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/UFU, a quem as correspondências
devem ser enviadas: wlopes@hotmail.com
 2

ABSTRACT

Development of a alternative method to uso laboratory animals for avaliation of toxicity

of natural extracts.

The international ethics law recommend the criterious use of laboratory animals and

development of alternative experimental methods. Artemia salina is a biological indicator of

toxicity of chemical substances, pesticides and poluents. Lethal median concentration (LC50)

is indicate to determine and evaluate toxicity of natural extracts. This work aim to standard

and implant a method of toxicity evaluation of natural extracts, using Artemia salina larvae

Leach. Artemia salina cysts were incubated in synthetic seawater (35ppm) for about 24hr, at

28oC, with continuous side ilumination (40W lamp) and low aeration. The nauplii produced

were separated and transferred to becker containing 100ml of synthetic seawater, and

maintained for another 24hr. For toxicity testing, samples of 10 larvae (metanauplii) each

were added to 5ml of synthetic seawater in plastic 3,5cm nunc multidish containing the

appropriate concentration on extract and maintained for 24hr in the dark (triplicate). The

plants colected from Uberlândia - Minas Gerais, were triturated in distille d water, liofilizated

and solubilized in water (20mg/ml). The LC50 of Ginkgo biloba, Casearia mariquitensis,

Tabebuia ocracea, Moringa oleifera, Mandevilla velutina e Casearia grandiflora extract is as

follow: > 5,0; > 4,0; 4,0; 3,6; and 0,4 mg/ml, respectively. The values of LC50 reflect the

toxicant effects these extracts in Artemia salina. The increasing order of solvents toxicity is as

follow: tween 80 = water < DMSO < ethanol < methanol. Financial Support: UFU, CAPES,

FAPEMIG, CNPq

Key words : Artemia salina , brine shrimp, natural extracts

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INTRODUÇÃO Essas “alternativas” ou modos de

As normas éticas internacionais reprodução se referem a oviparidade,

com relação ao uso de animais de viviparidade, partenogênese e

laboratório recomendam o uso criterioso encistamento (diapausa), quando as

destes animais, e o desenvolvimento de condições ambientais são impróprias. Os

métodos alternativos tem ganhado indivíduos adultos apresentam notável

evidência nestes últimos anos, Com este dimorfismo sexual e, em condições

propósito, a padronização e implantação do adequadas, é possível eclodir

bioensaio com Artemia salina foi objeto simultaneamente as larvas em cultura. O

deste trabalho, para posterior determinação custo da implantação e manutenção da

da toxicidade de extratos naturais cultura de Artemia salina é muito baixo, o

manipulados nos laboratórios de pesquisa que faz desta, um excelente modelo

da Universidade Federal de Uberlândia. experimental, utilizado nas mais diversas

Artemia salina, é um crustáceo da áreas da biologia. Artemia salina é

classe Anostracea, que vive em águas amplamente conhecida como indicador de

salinas e salobras de todo o mundo. Possui toxicidade em um bioensaio (Brine Shrimp

4 estágios de desenvolvimento (ovo, Test), utilizando-se a Concentração Letal

náuplio, metanáuplio e adulto) e alguns Média (CL50) como parâmetro de

mecanismos de adaptação que as tornam avaliação da atividade biológica.

cosmopolitas, como a osmorregulação, a É crescente a utilização de produtos

presença de pigmentos respiratórios como naturais pela população como alternativa

a hemoglobina e a disponibilidade de no tratamento de diversas enfermidades. O

alternativas reprodutivas que facilitam a estudo das possíveis propriedades

dispersão e a perpetuação dessa espécie. farmacológicas e seus efeitos tóxicos

correspondentes é imprescindível. A flora

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brasileira é composta por uma infinidade Trypanosoma cruzi também está sendo

de plantas detentoras de uma grande investigada (Oliveira et al, 2000). O

variedade de princípios ativos, objetivo deste trabalho é padronizar e

responsáveis pela atividade biológica. A implantar um método de avaliação da

Mandevilla velutina (Apocinaceae), toxicidade de extratos vegetais, utilizando-

proveniente do cerrado, possui se larvas de Artemia salina Leach.

componentes antiinflamatórios (Calixto et

al., 1988) e anti-Trypanosoma cruzi (Silva 2- MATERIAL E MÉTODOS

& Hamaguchi, 1996). O gênero Casearia I- Cultura de Artemia salina

(Flacourtiaceae), é conhecido por sua Os experimentos foram realizados

atividade antiofídica sobre peçonhas das no Laboratório de Produtos Naturais do

serpentes Bothrops moojeni (Caiçaca) e INGEB/UFU.

Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca Em um aquário de plástico, os

pintada) (Borges et al, 1998, cistos de Artemia salina (10mg/100ml)

Kashiwabuchi, 1999). Ginkgo biloba adquiridos no comércio local, foram

possui propriedades antagonistas de PAF incubados em solução marinha sintética

(Fator de Agregação Plaquetária), ação (60g sal marinho/litro água destilada), sob

antioxidante (proteção contra radicais iluminação artificial (lâmpada de 40W),

livres), antimicrobiana e temperatura constante de 28oC e estado de

imunoestimulante, além de apresentar saturação de oxigênio conseguido com o

propriedade tripanomicida promissora auxílio de uma bomba de ar conectada ao

( Silva et al, 2000). Moringa oleifera é fundo da garrafa (Fig 1). Após 24 horas, a

usada contra doenças de pele, sistema válvula de oxigênio foi fechada e a bomba

digestivo e respiratório e antimalárica desligada. O aquário foi recoberto por

(Silva & Kerr, 1999), sua ação anti- papel alumínio deixando-se um pequeno
 5

espaço no fundo, onde era iluminado. água destilada, dimetilsulfóxido (DMSO).

Como as larvas (náuplio) tem afinidade Tween 80, metanol, etanol, à concentração

pela luz, ou seja, apresentam fototropismo de 5% (v/v).

positivo, foi possível separa-las dos cistos, III- Bioensaio (BST)

abrindo-se a válvula de controle de O bioensaio envolvendo Artemia

oxigênio. As mesmas foram colocadas em salina consiste em avaliar a exposição de

um becker contendo solução marinha um determinado composto frente a esse

sintética (100ml) e mantidas em incubação crustáceo. A análise é feita mediante o

por mais 24 horas, nas mesmas condições cálculo da Concentração Letal Média

de luz e temperatura acima mencionadas. (CL50), ou seja, a concentração que dizima

Após este procedimento têm-se apenas o metade de uma população (Dolabela,

estágio de metanáuplio (cultura pura) 1997).

(Vinatea, 1994). O teste foi realizado O efeito tóxico dos extratos

apenas em cultura pura devido a maior naturais foi testado pelo método de Meyer

sensibilidade aos tratamentos. (1982) modificado para se adequar às

II- Extratos vegetais condições de nosso laboratório. Consistiu

Foram utilizados extratos de plantas em dissolver as amostras em determinado

coletadas na região de Uberlândia -MG, solvente e aplica -las conforme

sendo o representante herborizado e as concentração desejada nas placas de

excicatas armazenadas no Herbarium tratamento onde também foram colocadas

Uberlandensis- UFU. As plantas foram 10 larvas de Artemia salina , em volume

trituradas, maceradas em água destilada e, final de 5ml. O controle continha somente

o extrato obtido, liofilizado e o solvente e as larvas. As placas contendo

ressuspendido em água à concentração de os grupos contr ole e tratamento, foram

20mg/ml. Os solventes testados foram: incubados no escuro a 25o C, sendo feita

 6

após 24 horas a leitura do número de dentre outras a solução descrita por

indivíduos sobreviventes. Os valores de Dolabela (1997), composta por Cloreto de

CL50- 24hr, cm limite de confiança de Sódio, Bicarbonato de Sódio, Sulfato de

95%, foram calculados de acordo com o Magnésio em água destilada. Nesta

método de Litchifield e Wilcoxon (1949). solução, a taxa de eclosão dos cistos foi

muito baixa (em torno de 10%), os

melhores resultados foram obtidos com a

solução descrita por Meyer (1982), que

consiste em utilizar sal marinho sintético

(35ppm) e cistos e alta eclosão (adquiridos

da empresa Maramar). Com iluminação,

temperatura e oxigenação adequadas, foi

possível reproduzir as condições

Fig 1: Esquema do aquário utilizado para
ambientais ótimas para Artemia salina
eclosão dos cistos de Artemia salina
obtendo-se altos índices de eclosão e
(Reproduzido de Lindefelser, 1999).
sobrevivência. Uma vez padronizado o

método de cultivo da Artemia salina , a

RESULTADOS E DISCUSSÃO
toxicidade de alguns extratos vegetais
A primeira etapa deste trabalho
utilizados em nosso laboratório, foi
envolveu a escolha de uma solução de
determinada.
cultivo das larvas de Artemia salina que
A extração de princípios ativos de
possibilitasse maior taxa de eclosão dos
várias origens pode ser realizada
cistos e que viabilizasse a sobrevivência de
utilizando-se diferentes solvente s. Dentre
pelo menos 95% dessas larvas nas
os solventes testados em Artemia salina
condições do bioensio. Foram testadas
(Fig 2), água e tween 80 se comportaram
 7

como atóxicos (100% de sobrevivência), de A. salina enquanto o tween 80 exibiu

DMSO foi moderadamente tóxico e etanol, 100% sobrevivência.

seguido pelo metanol foram altamente Dolabela (1997) em seus estudos,

tóxicos, chegando a 100% de mortalidade estabeleceu critério de classificação dos

á concentração de 5% (v/v). Dolabela extratos hidroetanólicos com base nos

(1997) encontrou resultados semelhantes níveis de CL50 em Artemia salina, a saber:

para toxicidade de etanol e metanol, CL 50<80µg/ml, altamente tóxicos; CL50

reforçando a credibilidade do método e de entre 80µg/ml e 250µg/ml,

nossas condições experimentais. moderadamente tóxicos; e CL50>250/ml,

com baixa toxicidade ou não tóxicos.

% larvas sobreviventes

100
80 Dos extratos vegetais investigados
60
40 no presente trabalho, grande parte
20
0
apresentou CL50 entre 4 e 5 mg/ml (Tabela
1 2 3 4 5
1) portanto, de acordo com a classificação
Concentração (%v/v)
DMSO ETANOL METANOL
ÁGUA TWEEN 80 anteriormente citada, seriam considerados

pouco tóxicos ou atóxicos.

Fig 2: Toxicidade aguda de alguns Dolabela (1997) ainda estabeleceu

solventes em larvas (metanáuplio) de uma correlação entre o limite de toxicidade

Artemia salina. para Artemia salina com a ação anti-

Os solventes tween 80 e água não Trypanosoma cruzi, onde a maioria dos

causaram letalidade em larvas de A. salina extratos com esta ação, exibiam toxicida de

na concentração de 5% (v/v). No entanto, moderada. Não foram encontrados

em outro experimento realizado, à entretanto, para Mandevilla velutina,

concentração de 20% (v/v), água provocou Ginkgo biloba e Moringa oleifera, valores

a mortalidade de cerca de 30% das larvas dentro deste limite. Dentre os extratos
 8

testados, o de Moringa oleifera manifestou presente trabalho (CL50 > 4mg/ml), com o

menor toxicidade, enquanto o de Casearia extrato hidroetanólico de Tabebuia áurea

grandiflora foi o mais tóxico (Fig 3). (CL50 = 0,012mg/ml), estabelecida pó

Dolabela (1997) reforçam-se os resultados

100
que sugerem variações de toxicidade
% larvas sobreviventes

75
dentro de um mesmo gênero.
50

25 Tabela 1: Toxicidade aguda de extratos

0
GW GA GB
Tratamentos vegetais em Artemia salina.

Fig 3: Perfil tóxico do extrato aquoso de

Nome Família Nome Estágio Parte CL50
Casearia grandiflora em larvas científico comum larval usada (mg/ml)

(metanáuplio) de Artemia salina. Casearia Flacourtiace Limão Náuplio Folha >4,0

mariquitensis zinho
GW: Controle; GA: Tratamento com Ginkgo Ginkgoacera Ginkgo Náuplio Folha >5,0
biloba biloba
0,4mg/ml de extrato aquoso de Casearia Mandevilla. Apocinaceae Batata- Náuplio Raiz 3,6
velutina brava
grandiflora; GB: Tratamento com 1,25 Casearia Flacourtiace ... Náuplio Folha > 0,4
grandiflora
mg/ml de extrato aquoso de Casearia Tabebuia Bignoniacea Ipê- Meta Folha >4,0
ocracea amarelo
grandiflora. Moringa Moringaceae Moringa Meta Folha 4,0
oleifera
O gênero Casearia apresentou diferença de

toxicidade entre as espécies testadas,

Casearia mariquitensis (CL50: > 4,0 Estes resultados refletem a

mg/ml) e Casearia grandiflora (CL 50: importância da utilização desse crustáceo

0,4mg/ml). Por sua vez, Jamal et al (1998) na detecção de substâncias bioativas.

determinaram a toxicidade de Casearia Extratos vegetais são amplamente

sylvestris em Artemia salina (CL50 = 10,7 utilizados pela população e, portanto, o

mg/ml). Comparando-se a toxicidade do estudo da letalidade destes extratos sobre

extrato aquoso de Tabebuia ocracea do

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bioindicadores como Artemia salina é substâncias sem rigor, nem critério

indiscutivelmente necessário. científico.

CONCLUSÃO

Artemia salina se apresentou como AGRADECIMENTOS

excelente indicador de toxicidade além de Agradecemos a Profa Dra. Ana Angélica

constituir um teste simples e de baixo Almeida Barbosa do INBIO/UFU pela

custo. Os diversos extratos vegetais identificação e classificação da maioria das

testados exibiram diferente grau de espécies utilizadas.

toxicidade, provavelmente relacionado à

composição química dos extratos REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

biologicamente ativos. A escala crescente BORGES, H.M., et al. Effects of aqueous

de toxicidade dos extratos é relacionada a extract of Casearia sylvestris

seguir: Ginkgo biloba < Casearia (Flacourtiaceae) on action of snake

mariquitensis < Moringa oleifera < and bee venoms and on activity of

Tabebuia ocracea<Mandevilla velutina< phospholipases A2. Comparative

Casearia grandiflora. Dentre os solventes, Biochemistry and Phisiology , in

Tween 80 = Água < DMSO < Etanol < press, 2000.

Metanol, à concentração de 5%. As CALIXTO, J.B., ZANINI, J.C., CRUZ Jr,

propriedades farmacológicas desses A.B., YUNES, R.A. Extract and

extratos devem ser compreendidas e seus compounds obtained from

efeitos tóxicos correspondentes Mandevilla velutina inhibit

determinados, a fim de se evitar a Arachidonic Acid induce ear oedema

utilização indiscriminada destas im mice, but not rat stomach

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