TP N 13 HEMOSTASIA SECUNDARIA OBTENCIN DE MUESTRAS INDICACIONES PARA EL PACIENTE: para realizar los estudios de coagulacin no es necesario un ayuno prolongado,

, pero es conveniente no ingerir alimentos grasos desde 4h antes de la extraccin .Debe tratar de evitarse situaciones de estrs o esfuerzo fsico durante horas previas a la toma de muestra ya que se producen variaciones importantes La extraccin de sangre debe realizarse por la maana (entre las 8 y las 10) y con el mnimo stasis venoso posible (idealmente menos de 1 minuto y sin lazo, esto ltimo raramente se efecta). La noche anterior del estudio el paciente no debe realizar actividad fsica ni comer en forma abundante debe recurrir al laboratorio realizando la menor actividad posible y en conocimiento que al llegar debe permanecer en reposo por lo menos 30min antes de la extraccin. ANTICOAGULANTE: El anticoagulante mas ampliamente utilizado es el citrato trisdico en cc. 0,109 o 0,129 M (3.2 o 3.8%) el comit de expertos de la Sociedad internacional de Hemostasia y Trombosis (ISHT) recomienda el citrato al 3.2% .Los plasmas patrones liofilizados con los cuales se calcula el ndice de sensibilidad internacional (ISI) se obtienen con citrato trisdico 3.2%. Se debe mantener la relacin anticoagulante /sangre 1+9 hay que tener presente que se deber ajustar la relacin de acuerdo al hematocrito sobre todo los por debajo de 25% y por arriba de 55%. EXTRACCIN: Para realizar la extraccin sangunea se debe utilizar jeringas plsticas de buena calidad. Las agujas descartarles de calibre entre 21 y 19 para adultos y 23 G para pediatra. Los tubos para recoger la sangre deben ser de material no reactivo como polipropileno o vidrio siliconado. No se aconseja utilizar sangre capilar para pruebas de coagulacin, si no es posible obtener una muestra de sangre venosa, la muestra puede ser obtenida del pulpejo del dedo en los adultos o del taln del pie en los neonatos. Es esencial que la puncin realizada permita que la sangre fluya espontneamente y forme una gota de volumen importante, la cual se deber recoger en tubos con la proporcin de anticoagulante ajustada. La puncin venosa debe ser rpida y precisa, sin dificultades, evitando la formacin de espuma, el stasis venoso y la contaminacin con tromboplastina tisular Cuando la extraccin es dificultosa se recomienda el cambio de jeringa luego de extraer 2 a 3 ml de sangre. La muestra extrada en la segunda jeringa ser utilizada para los estudios de coagulacin. En los pacientes canalizados se recomienda evitar la extraccin por catter, de ser ello indispensable, realizar la doble extraccin con jeringa y descartar los primeros 5 mL. Los pacientes canalizados, en ocasiones puede recibir heparina, para mantener la permeabilidad del catter y en el laboratorio de hemostasia la heparina es mala palabra prolonga todas las pruebas. Una vez realizada la extraccin se vierte suavemente la sangre por la pared de los tubos, hasta la marca prevista, evitando la formacin de espuma Todo el material utilizado en hemostasia es de plstico, para evitar que el vidrio active la cascada de la coagulacin. Es conveniente recoger la sangre en dos tubos, pues al tener la posibilidad de procesar en un segundo tubo se reducirn las posibilidades de error.

Descartar los plasmas con signos de hemlisis visibles. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Plasma citratado rico en plaquetas (prp): la sangre obtenida de acuerdo a las condiciones ya sealadas es centrifugada a 1000 r.p.m durante 5 minutos. Trasvasar el plasma rico a un tubo de plstico con pipeta plstica. Mantener a T ambiente hasta su uso (no mas de 2h). El plasma as obtenido es el plasma rico en plaquetas. Se utiliza fundamentalmente para el estudio de la funcin plaquetaria y para el tiempo de plasma recalcificado (Tiempo de Howell) Plasma citratado: Se obtiene centrifugando la sangre durante al menos 10 min. a 3000 r.p.m. El plasma as obtenido es relativamente pobre en plaquetas (menor de 10000/mm3). Se utiliza dentro de las 4 h de extraccin para los estudios pre- quirrgicos, control de anticoagulacin en los pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis. Plasma pobre en plaquetas: Se obtiene por doble centrifugacin (primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) de 15 minutos a 4000 rpm (idealmente en centrfuga refrigerada a 4C). El plasma as obtenido es pobre en plaquetas (menor de 5000/mm3) rene las condiciones para realizar todos los estudios. Puede ser fraccionado y congelado para estudios posteriores. En este caso se aconseja procesar de igual forma muestras normales. Pool de plasmas normales: Se debe extraer sangre de sujetos normales, sin historia previa de manifestaciones hemorrgicas, ni trombticas, ni hepticas, que no estn recibiendo ninguna medicacin. Se prepara plasma pobre en plaquetas de por lo menos 10 sujetos que tengan las pruebas bsicas de coagulacin normal. Se puede fraccionar y congelar a-70C mximo 6 meses y 1 mes si se conserva a -20C

Activacin intrnseca de la protrombina

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (APTT) Fundamento El APTT, es la prueba ms sensible para evaluar la va intrnseca de la coagulacin. Consiste en activar el plasma por contacto con superficies cargadas negativamente (caoln, slica, etc.). En esta prueba se fija la concentracin de fosfolpidos presentes en la reaccin, mediante el agregado de cefalina (tromboplastina parcial). La activacin por contacto se ve favorecida por el agregado de caoln (sustancia inerte, con cargas negativas) que aumenta la superficie de contacto. Expresin de resultados Los resultados se expresan en segundos. Interpretacin de resultados Valor normal: segn el reactivo utilizado y el mtodo de deteccin: 37-48 seg. Valores menores a 37 seg indican concentracin aumentada de factores o muestra activada. Valores prolongados revelan un defecto en la va intrnseca. El APTT es ms sensible al defecto de los factores VIII, IX, XI, XII o fase de contacto como precalicrena (PK), quiningenos de alto peso molecular (HMWK). Es menos sensible al defecto de factores de la va comn (X, V o II). En casos de deficiencias de fibringeno, el APTT se prolonga a partir de concentraciones menores a 100 mg/dL. Presencia de inhibidores, ya sean especficos contra un factor (neutralizantes) o inespecficos (interferencia) afectan la prueba del APTT (dependiendo de la sensibilidad del reactivo), que no corrige por el agregado de plasma normal. La heparina no fraccionada (UFH), que potencia la accin inhibitoria de la antitrombina frente a la trombina, puede afectar el resultado del APTT. FACTORES DE VIA INTRINSECA (VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK) Fundamento Este mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema. Expresin de resultados Los resultados se expresan en por ciento de actividad. Para la construccin de la curva de calibracin, en papel doble logartmico, se transportan las concentraciones de factor (%) sobre la abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la ordenada. Se interpola la concentracin del factor en el plasma problema en la curva obtenida. Interpretacin de resultados Valores normales: 50-150 % El descenso de los niveles plasmticos de cualquiera de estos factores puede deberse a un dficit congnito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Activacin extrnseca de la protrombina

TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA Fundamento Se utiliza como reactivo tromboplastina clcica (comercial) que, en contacto con el plasma citratado, genera la activacin del mecanismo extrnseco y la produccin de fibrina. El tiempo de coagulacin de la prueba depende de la concentracin de los factores plasmticos que participan en el mecanismo extrnseco de la coagulacin. Expresin de resultados Los resultados se expresan en por ciento de actividad y/o tiempo en segundos. Se realiza el tiempo de protrombina y se interpola el tiempo en la curva de Quick o curva de tasa de protrombina. Interpretacin de resultados Valor normal: 70-100% Resultados de tiempo de protrombina menores a 70% evidencian una anormalidad del mecanismo extrnseco debida a un defecto o a la inhibicin de uno o ms de los factores intervinientes en la va extrnseca. Se deber corregir la prueba con plasma normal para descartar un efecto inhibitorio y realizar la determinacin individual de cada uno de los factores para identificar el o los factores deficientes. El general, tiempo de Quick es ms sensible al defecto de los factores VII, X y V que a la deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibringeno, pero se ve afectado por concentraciones menores a 100 mg/dL. FACTORES DE VIA EXTRINSECA (II, V, VII y X). METODO EN UNA ETAPA Fundamento El mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema. Expresin de resultados Los resultados se expresan en por ciento de actividad. Curva de calibracin: graficar en papel doble logartmico la concentracin del factor sobre la abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la ordenada. De la recta resultante, se interpola la concentracin del factor presente en el plasma problema. Interpretacin de resultados Valores normales: 70-120 % El descenso de los niveles plasmticos de los factores puede deberse a un dficit congnito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Las deficiencias adquiridas pueden ser causadas por consumo, alteraciones en la funcin heptica, aumento en la actividad fibrinoltica o presencia de inhibidores.

Transformacin fibringeno-fibrina

TIEMPO DE TROMBINA (TT) Fundamento Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado en presencia de trombina. Permite evaluar la transformacin de fibringeno a fibrina. Expresin de resultados Se informa el tiempo de coagulacin de la muestra (TT) expresado en segundos, junto con el tiempo de trombina del plasma normal. Interpretacin de resultados Valores prolongados del TT pueden deberse a: -Baja concentracin de fibringeno (menor 200 mg/dL.), o ausencia del mismo (hipo o afibrinogenemia). Puede ser de origen congnito o adquirido. Los niveles de fibringeno plasmtico pueden disminuir en hepatopatas severas, CID, por efecto del tratamiento con estreptoquinasa, r-tPA o L-asparaginasa, o tambin en respuesta a la actividad fsica. -Presencia de un fibringeno anmalo (disfibrinogenemias congnitas o adquiridas) -Inhibidores de la polimerizacin de los monmeros de fibrina, productos de degradacin del fibringeno/fibrina o protenas plasmticas anormales. -Tratamiento o contaminacin con heparina -Prolongaciones inespecficas (hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, hemlisis) -Aumento muy marcado de fibringeno (>800-1000mg/dl)* Valores acortados de TT: es muy controvertida su interpretacin; algunas disfibrinogenemias trombticas cursan con TT acortados. *Los valores aumentados de fibringeno no suelen afectar el TT, excepto en situaciones particulares, como por ejemplo pacientes con sndrome nefrtico. Dado que el fibringeno es una protena reactante de fase aguda, su concentracin plasmtica est aumentada en procesos infecciosos e inflamatorios, ciruga, sepsis, cncer o ateroesclerosis y constituye un marcador de riesgo para eventos vasculares oclusivos. Los niveles de fibringeno aumentan con la edad, masa corporal, embarazo, tabaquismo, estrs y con el uso de anticonceptivos orales. FACTOR XIII (FACTOR ESTABILIZADOR DE LA FIBRINA) PRUEBA DE SOLUBILIDAD DEL COAGULO Introduccin Las pruebas de laboratorio fundadas en la medida del tiempo de coagulacin no detectan los defectos o alteraciones del FXIII, dado que no participa en las reacciones que llevan a la formacin de fibrina soluble. El FXIIIa acta en una fase posterior, estableciendo uniones covalentes entre las molculas de fibrina, transformndola en insoluble. La deficiencia severa de FXIII puede ser detectada por la disolucin temprana del cogulo de fibrina en medio hidrofbico (urea, cido monocloroactico) (prueba de solubilidad del cogulo). Fundamento

La prueba consiste en evaluar la presencia de un cogulo de fibrina insoluble (estable); el plasma del paciente, en presencia de iones calcio coagula, dicho cogulo de coloca en un medio hidrofbico y se observa si se disuelve o no el cogulo. En pacientes con deficiencias severas del FXIII (1-5 U/dl) se produce un cogulo, que se disuelve tempranamente, comparado con los controles normales. Expresin de resultados Los resultados se expresan como normal (cogulo insoluble) o anormal (cogulo soluble). Interpretacin de resultados En ausencia de FXIII o en presencia de concentraciones menores a 1-5U/dl (depende del mtodo), el cogulo de fibrina se disuelve en el trmino de pocos minutos u horas. A pesar de su escasa sensibilidad, la tcnica es til para detectar defectos clnicamente importantes. Se requiere muy baja concentracin de FXIII para obtener una hemostasia adecuada (valor hemosttico: 1-5 U/dl). Las alteraciones del FXIII pueden deberse a defectos cualitativos o cuantitativos, ya sean congnitos o adquiridos. La prueba de solubilidad puede dar anormal por la presencia de inhibidores especficos del FXIII. COAGULMETRO AUTOMATIZADO Son equipos utilizados para determinar cualquiera de las pruebas de hemostasia que utilicen mtodo coagulomtrico (TP, APTT, TT, Fibringeno, factores, etc.). Desde el punto de vista prctico ahorran tiempo para procesar muchas muestras (ms de 30 en una maana por Ej.) pero fundamentalmente logran altos grados de reproducibilidad. Bsicamente su funcionamiento se basa en dos mtodos de deteccin: ptico (turbodensitometra) y/o magntico. Los que utilizan el mtodo magntico toman el tiempo que tarda en formarse el cogulo desde el momento de mezcla hasta que una varillita de metal deja de girar. Los basados en mtodos pticos utilizan medidas de transmitancia para dar el tiempo de formacin del cogulo. Dentro de las funciones que pueden brindar estos equipos est la incubacin de muestras por medio de fuentes secas, sta se realiza por el tiempo estipulado para cada prueba que debe ser determinado por el operador o bien ya viene estandarizado en el equipo. Cabe aclarar que en estos equipos se trabaja de modo muy similar al mtodo manual en lo que se refiere a preparacin de diluciones y curvas de actividad, la ventaja de estos equipos radica en agilizar el trabajo en caso de elevado nmero de muestras y la de permitir mayor reproducibilidad.

APTTest
Reactivos para la determinacin del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

SIGNIFICACION CLINICA El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma as como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulacin. Sirve para detectar anormalidades en la va intrnseca de la coagulacin, como son los factores necesarios para la formacin del activador intrnseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII. Tambin detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibringeno, no siendo as con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la teraputica anticoagulante por heparina. Tambin permite la identificacin rpida de hemoflicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirrgicos y evitar problemas hemorrgicos. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un bao a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado. Cloruro de Calcio: solucin de cloruro de calcio 0,025 mol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua bidestilada o desionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Cloruro de Calcio: listo para usar. Reactivo APTT, preparacin: - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. - Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37C - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10 C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 das en refrigerador o 30 das congelado (-20 C). El congelado y descongelado slo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo. MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extraccin con jeringas plsticas. b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados. - No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10C) hasta el momento de efectuar la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20C. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en bao a 37C) previo a la determinacin. La muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis en tubos plsticos para minimizar los efectos de activacin por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Pipetas y micropipetas capaces de medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37C.

- Cronmetro. - Fuente luminosa, para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en bao de agua a 37C. En un tubo de hemlisis colocar: Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37C, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37C) 100 ul Disparar simultneamente un cronmetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el bao unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronmetro en el momento de la formacin del cogulo. Tomar nota del tiempo de coagulacin. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distinta forma: 1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos. 2) Como relacin entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en individuos normales oscila entre 33-48 segundos. Se considera fuera de lo normal valores que difieran en ms de 6 segundos de un plasma control. Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe. CURVA DE CALIBRACION Este mtodo es til como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante. La tcnica empleada es la siguiente: 1) Preparar una Solucin de Trabajo de heparina en solucin fisiolgica cuya concentracin sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente. 2) Preparar diluciones de esta Solucin de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se debern obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml. 3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones as como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogartmico APTT vs. Concentracin de heparina. El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la grfica, para obtener la concentracin actual de heparina circulante. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA. El mecanismo de la coagulacin involucra una serie de reacciones enzimticas que pueden ser influenciadas por toda condicin que afecte a los sistemas enzimticos en general, razn por la cual se deben observar las mismas precauciones metodolgicas. Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes resultados: Nivel 45 seg 62 seg D.S. +1,1 seg +1,8 seg C.V. 2,5% 3,0%

PRESENTACION Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cd. 1705002). BIBLIOGRAFIA - Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954). - Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematologa Prctica Ediciones Toray, 2 Edicin (1970). - Wintrobe, M.M. - Hematologa Clnica 3 Edicin Intermdica (1969). - Bragos, I; Rodrguez Pcora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. Evaluacin de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada - 53 Triduo Bioqumico Cientfico Anual; Baha Blanca (1988). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Soluplastin
Tromboplastina clcica para la determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICA
El fenmeno de la coagulacin puede desencadenarse por una va extrnseca (lesin tisular) o por una va intrnseca contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal). La determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulacin extrnseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower. Por lo tanto la determinacin se aplica a: - estudios de rutina en los anlisis prequirrgicos; - deteccin de alteraciones en los niveles de uno o ms factores involucrados en la va extrnseca; - control de la teraputica con anticoagulantes orales. FUNDAMENTOS DEL METODO Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37C y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El mtodo no detecta deficiencias de factores de la va intrnseca (VIII, IX, XI y XII). REACTIVO PROVISTO Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentracin final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentracin final de 0,1 mol/l. REACTIVO NO PROVISTO Agua bidestilada o deionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37C. - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10C), es estable 5 das a partir del momento de su reconstitucin.

MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirn 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados; - la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados; - hemlisis visibles dificultan la medicin foto-ptica de los resultados. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10C) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtencin, la muestra se debe congelar (a -20C); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este ltimo procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37C) previo a la determinacin. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37C. - Cronmetro. - Fuente luminosa para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO 1- Colocar el plasma (desconocido o control) en bao de agua a 37C durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 2- En un tubo de hemlisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37 C durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rpidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultneamente el cronmetro. 4- Mantener el tubo dentro del bao y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulacin, sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronmetro en el momento de la aparicin del cogulo. 5- Calcular el tiempo promedio de coagulacin de la determinacin por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medicin, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distintas formas: 1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos. 2- Porcentaje de Actividad Protrombnica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombnica de un pool de plasmas frescos normales. Curva de calibracin En tubos de hemlisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, segn: Diluciones Porcentaje de actividad (%) Pool plasmas normales (ml) Solucin fisiolgica 1:1 100 0,5 1:2 50 0,3 0,3 1:3 33,3 0,3 0,6 1:4 25 0,2 0,6 1:8 12,5 0,2 1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilucin, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos

sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombnica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibracin, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos. 3- Razn Internacional Normatizada (R.I.N.) Para su clculo, deber emplearse la tabla de valores adjunta al equipo. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre: - Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 70 - 100% Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango teraputico que se puede expresar como: - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 25 - 35% - R.I.N.: 2,4 - 2,5 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Otras causas de resultados errneos son: - Extraccin defectuosa de sangre venosa. - Las variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. - La preincubacin en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como lmite mximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposicin por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvieron los siguientes datos: X (n=20 11,5 seg 21,2 seg D.S. +0,4 seg +0,6 seg C.V. 3,5% 2,8%

b) Comparacin con mtodo de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro mtodo tomado como referencia, se observa:

Reactivo Soluplastin Referencia

X (n=60) 13,2 seg 12,8 seg

D.S. +0,3 seg +0,3 seg

C.V. 2,3% 2,3%

PRESENTACION - Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cd. 1705001). - Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cd. 1705005). - Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cd. 1705003). BIBLIOGRAFIA - Quick, A.J. - Fisiologa y Patologa de la Hemostasis - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).

- Araldi, H.T., et al. - Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano Acta Bioqum. Cln. Latinoam. XVI/1:131 (1982). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 28: Normalizacin de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. N 610:49-56 (1977). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Tc. N 658:202-223 (1981). - Suer Casadevall, F. - Nuevas Normas Internacionales para la Expresin del Tiempo de Quick - Anlisis Clnicos X/40:240-245 (1985). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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