IMUNOVIR
heliojm@fcaqv.unesp.br
INTRODUO
Epidemiologia Molecular
Fundamenta-se ppalte. na anlise das sequncias gnicas (PCR; RTPCR; RFLP; Seq. NCLS)
Auxlio para definir os problemas de sanidade animal e trazer solues para determinada regio
Adaptado de:- Computational Aspects in Dengue Vaccine Research, Celia Aurora T. Torres
Adaptado de:- Computational Aspects in Dengue Vaccine Research, Celia Aurora T. Torres
Genotyping Mutations
RNA - Virus
DNA
RNA
PROTEIN
Transcription
Translation
Adaptado de:- Lecture III: Molecular and Genetic Measures, Jan 20, 2009, Joe Wiemels
Como as mutaes e os polimorfismos afetam a funo dos genes e no curso das doenas?
Mutations in GENES can result in altered protein structure and Biological Activities Example of a missense base pair change M P N S G N V ATGTTTAATAGCGGTAATGTT ATGTTTAATAGCAGTAATGTT M P N S S N V
- Protena Parental - Gene Parental - Gene Mutante - Protena Mutante
Gene sequence
In other words, theoretically, you can surmise the function of proteins from their genetic sequence!de:- Computational Aspects in Dengue Vaccine Research, Celia Aurora T. Torres Adaptado
3. Determinar as relaes entre Genotipos e Patotipos Virais. 4. Detectar a ocorrncia de processos de recombinao gnica 5. Determinar a origem de novos isolados virais. 6. Caracterizar a ocorrncia de processos de seleo purificadora, ou de seleo positiva, nos genes, ou regies gnicas importantes de um patgeno viral. 7. Predizer e/ou determinar a evoluo viral. 8. Conhecer a geo-epidemiologia e a eco-epidemiolgia de gentipos e de fentipos de isolados / estirpes virais.
ALTA CAPACIDADE DE VARIAO FENOTPICA - Sorotipos (+20) Lee &Jackwood, 2000 - Grande N de Estirpes Variantes Antignicas - Protectotipos Diferentes VARIAO DE PATOTIPOS
-Tropismos Diferentes p/ Tecidos / rgos - Virulncia / Atenuao Diferentes manifestaes clnicas patolgicas da infeco pelo VBI em galinhas, ou frangos de corte, ou at outras sps. de aves (galiformes ou no) por exemplo estirpes patognicas dos tratos respiratrio, genital, ou ainda, nefropatognicas.
VARIAO ANTIGNICA
Ave doente Rins Tonsila Cecal Ave persistentemente Perodo de infectada Eliminao (VBI)
do VBI???
Transmisso rpida
Ave sadia
CAVANAGH, 2005)
1
S1
2
S2
3 a
E
4 5
6
UTR
1a
Replicase 1b
Ma b b N
3 (A)n
Tropismo Celular
5
UTR
1
S1
2
S2
3 a
E
4 5
1a
Replicase 1b
Ma b b N
3 UTR (A)n
15 Protenas No estruturais so Codificadas pelo Conjunto de Genes da Replicase do VBI e esto relacionados a Patogenicidade Viral.
Ammayappan et al., 2009
(L)
5-
L L
mRNAs
-3
L L L
subgenmicos
VBI REC.
2
S2
3 a
E
4 M a
6 3 N
1a
1b 1
b 5 a b
Estirpe-Mutante -1
5 L
S1
2
S2
3 a
E
4 M
6 3 N
1a
1b
Estirpe- Mutante-2
Estirpes Americanas
Estirpes Australianas
Estirpes Europias
Estirpes Americanas
(Lee, 2002)
VBI REC.
5 L 5 L 5 L 5 L 1a 1a 1a
2 1b
S1
3
S2
6 3
S 2
S2
1b 1
S1
S 2
S2
a bE Ma b N Estirpe-P1 3 4 5 6 3 a E Ma b b N
Recomb-1x2
3 a
E
6 3
1b 1
S1
S 2
Ma b b NRecomb-2x1 3 4 5 6
Estirpe-P2
1b
S2
a bE Ma b N
Brasil x IBV
Primrdios - I A primeira notificao de isolamento de VBI no Brasil foi em 1957 (Hiplito, 1957). A introduo oficial da vacinao contra BI se deu em 1979 sendo a vacina constituda pelas estirpes H52 e/ou H120, mas os surtos de infeco pelo VBI continuam a ocorrer (Ito, 2006). A maior parte dos isolados de campo brasileiros at o final da dcada de 80 foram classificados como sorotipo Mass (Ito, 2006). A partir da aparecem isolados brasileiros com caractersticas antignicas diferentes do sorotipo Mass.
Brazil x IBV
Tempos + Recentes - II Meados Final dos anos 80 (VBI): Embrapa/CNPSA: isolados brasileiros (*regio Sul do pas) diferentes perfis de reao em prova de soroneutralizao cruzada com relao s estirpes de referncia do VBI. Branden et al (1986): demonstram a presena da amostra Arkansas no Brasil. Problemas crescentes de sintomatologia respiratria. Perodo de 1990 a 1995 (VBI / VBI-Like): 15 isolados de frangos de corte, poedeiras comerciais, reprodutoras e codornas de diferentes regies - diferentes perfis de reao na prova de soroneutralizao cruzada, porm com > similaridades em testes de proteo traqueal. Isolamento e caracterizao de VBI / VBI-Like de galinhas-dangola
(ITO et al, 1991, BYRON, 2002); DI FABIO et al, 2000
Brasil x IBV
Tempos + Recentes - II
Mais recentemente (2000/06), tm sido reportado a presena de um significante nmero de isolados de campo brasileiro do VBI, apresentando diferenas acentuadas nos genes codificadores das protenas estruturais S1, N ou ainda de protenas no estruturais das estirpes vacinais da Amrica, Europa, Australia ou eventualmente estirpes Asiticas, em lotes comerciais.
(Abreu et al., 2006a/b, , Brentano et al., 2006, Montassier et al., 2006, Villarreal et al., 2007a/b).
Anlises filogenticas do Gene S1 de Isolados do VBI de Surtos a Campo no Brasil entre 2002 e 2006 - I
Casos de Enterite
Casos de Orquite
Villarreal et al., 2007 a/b
Anlises filogenticas do Gene N de Isolados do VBI de Surtos a Campo no Brasil entre 1972 e 1989 - II
Presena de Isolados do VBI de Surtos a Campo na Argentina entre 2001 e 2008 filogeneticamente Relacionados com os Isolados variantes Autctones do VBI no Brasil
Argentina
2. Replicao
3. Evoluo
1- Presso Imune Induzida pela Vacina 2- Co-infeco (Recombinao) 3- Outras restries (gargalos de seleo)
4. Seleo
Comparao da Evoluo de Duas Estirpes do VBI Submetidas a Diferentes Situaes de Seleo Imune
MUTAO
RECOMBINAO
ESTIRPES VARIANTES
Figura 2. Alinhamento mltiplo das seqencias nucleotdicas da poro 5-proximal do gene S1, obtidas de isolados de campo no Brasil, adicionadas das seqencias das estirpes de referncia obtidas de banco de dados genticos. Os resduos de nucleotdeos idnticos so representados por pontos (.) e as posies das delees so representadas por traos (-).
ANLISE DA VARIABILIDADE NUCLEOTDICA NAS SEQENCIAS PARCIAIS DO GENE S1 Mutaes Sinnimas Mutaes No Sinnimas
A
H120 e M41 + 15
B
HVR-1 HVR-2
HVR-1
HVR-2
C
IBVPRB01 IBVPR01 IBVPR02 IBVPR05 IBVPR06 IBVSC02 IBVSP02
Figura 3e 4. Variao da diversidade nucleotdica (parmetro Pi) das mutaes no sinnimas e mutaes sinnimas em relao a posio de nucleotdeos da seqencia 5-terminal do gene S1 de trs grupos de estirpes e isolados brasileiros de campo do VBI. (A) seqencias nucleotdicas dos 15 isolados mais as estirpes do gentipo Massachusetts (H120, M41); (B) Oito isolados brasileiros de campo mais relacionados ao gentipo Massachusetts e (C) sete isolados brasileiros de campo com maior variabilidade e menos relacionados ao gentipo Massachusetts.
RELAES FILOGENTICAS BASEADAS NAS SEQENCIAS DE NUCLEOTDEOS DA PORO 5-PROXIMAL DO GENE DA GLICOPROTENA S1 DE 15 ISOLADOS BRASILEIROS DO VBI ESTIRPES DE REFERNCIA DO G. BANK
99 99 99 624
RFLP
G1 M41
I =97,96%
Gen. MASS
97
94 57
83 81 98 63 85
G2 H120
I =97,69%
Gen. MASS
G3
CONN I =99,44%
Gen. D
G4 ARK / CHINA
I =99,5%
99
Gen. A Gen. C
80
99
IBVPR02-S1-PARC IBVPRB01-S1-PARC
1988
99 98 91 99
IBVPR05-S1-PARC IBVPR06-S1-PARC
2001/2006
G5
Gen. B
99 99 99 624
IB VS C01-S 1-P A RC IB VS C03-S 1-P A RC IB VP R08-S 1-P A RC IB VP R07-S 1-P A RC IB VS P 01-S 1-P A RC
I =95,98%
35 91 74 99
G1
A Y561712-M 41-S 1-gene IB VS P 04-S 1-P A RC DQ487085-E gy pt-F -03-S 1-GE NE IB VS P 03-S 1-P A RC
99
I =98,15%
98 39 3 86
A Y561713-M a5-S 1-gene A F352315-H52-S 1-gene M 21970-H120-s 1-gene IB VP R03-S 1-P A RC L18990-CONN-S 1-G ENE
G2
G3
I =99,4%
61 34
99 42
IB VS C02-S 1-P A RC A F006624-A RK -DP I-S -1-gene IB VS P 02-S 1-P A RC A Y839144-Jilin-S 1-gene DQ458218-A L7149/00-S 1-gen DQ167143CK CHLHN00I-S 1-gene
I =98,87%
G4
99
69 89 99
I =90,11%
99 91 56 90
IB VP R05-S 1-P A RC IB VP R06-S 1-P A RC DQ448275-B R-US P -10-S1-gene DQ355995-B R-US P -01-S1-gene A Y587882-TGE V -HN2002-S -GENE
G5
A identidade mdia das sequncias de aminocidos dos isolados variantes autctones em relao a das estirpes classificadas nos grupos Mass de 67,4% Montassier et al, 2006; Montassier, 2008
ALINHAMENTO MLTIPLO DAS SEQENCIAS DEDUZIDAS DE AMINOCIDOS DA PORO AMINO-TERMINAL DA GLICOPROTENA S1 DE ISOLADOS DO VBI NO BRASIL
HVR-1 HVR-2
Mutaes em Ponto Grupo MASS Grupo CONN Grupo ARK Grupo Isolados Brasileiros Inseres / Delees Motifs Caracts. de AAs
H120
H120
IBVSC02
ALTERAES NOS STIOS DE ANTIGENICIDADE NA EXTREMIDADE AMINOTERMINAL DA GLICOPROTENA S1 DE ISOLADOS DO VBI NO BRASIL
> Hidrofilicidade
IBVPR06
H120
IBVPR06
IBVSC02
IBVSP02
H120
IBVPR01
ALINHAMENTO MLTIPLO DAS SEQENCIAS DEDUZIDAS DE AMINOCIDOS DA PORO CARBXI-TERMINAL DA NUCLEOPROTENA N DE ISOLADOS DO VBI NO BRASIL
Figura 12. Alinhamento mltiplo das sequncias de aminocidos da extremidade carbxi-terminal da nucleoprotena N (B), obtidas dos isolados de campo do VBI no Brasil, adicionadas das sequncias das estirpes de referncia provenientess do banco de dados genticos. Os resduos de aminocidos idnticos so representados por (.) e as posies das delees so representadas por traos (-).
ALTERAES NOS STIOS DE ANTIGENICIDADE NA EXTREMIDADE CARBXI-TERMINAL DA NUCLEOPROTENA N DE ISOLADOS DO VBI NO BRASIL
> Hidrofilicidade
IBVPR01 IBVPR05
H120
H120
IBVPR01 IBVPR05
< Hidrofilicidade
Eptopo Linf. B
Eptopo Linf. B
Avaliao da especificidade dos fragmentos de anticorpos scFv-N e scFv-S1 anti H120 frente a estirpes homlogas e variantes do VBI
Deteco das estirpes virais do VBI utilizando o framento de anticorpo scFv-N
3 DOs obtidas 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Soro policlonal (1:100) scFv-N (1:20) scFv-N (1:40)
02
05
01
12 0
01
M 41
an sa s
PR
PR
PR
IB V
IB V
IB V
IB V
SC
Estirpes avaliadas
Ar k
LC
02
05
01
12 0
01
M 41
an sa s
PR
PR
PR
IB V
IB V
IB V
IB V
SC
Estirpes avaliadas
Figura Reatividade dos fragmentos de anticorpos monoclonais contra a protena N e contra a protena S do VBI com estirpes homlogas e heterlogas nos testes de SELISA.
Caetano et al, 2009
Ar k
LC
OCORRNCIA DE SELEO NAS SEQENCIAS PARCIAIS DO GENE S1 E N DE ISOLADOS DO VBI NO BRASIL G1- Gentipo Massachusetts - H120, H52,M41 e Ma5
G2 - Isolados com maior similaridade -IBVPR03, IBVPR07, IBVPR08, IBVSC01, IBVSC03, IBVSP01, IBVSP03, e IBVSP04. G3 - Isolados com maior variabilidade- IBVPR01, IBVPRB01, IBVPR02, IBVPR05 IBVPR06, IBVSC02 e IBVSP02 Ocorrncia de seleo POSITIVA - dNS>dS PARA O GENE S1 Ocorrncia de seleo DEPURADORA - PARA O GENE N
Teste Z, com nvel de 0,5% de probabilidade, usando o mtodo de Nei-Gojobori integrado ao programa MEGA verso 4 (Tamura et al., 2007).
Vacinas Atuais Sorotipo Mass Seleo Imune e ??? pouca ou ausente proteo Variantes Br Antigas do cruzada!!!
???
?
Variantes Arg. Atuais do VBI
?
Variantes Br Atuais do VBI
Riscos e Custo - Benefcio da Introduo de Novas Vacinas contra a VBI na Argentina e Brasil
??? Novas Vacinas Estirpes Vacinais Heterlogas Atenuadas Imunidade ??? / Risco de Recombinao???
???
Variantes Arg. Recentes do VBI (2000)
?
Variantes Br Recentes do VBI (2000)
?
Variantes Arg. Atuais do VBI
?
Variantes Br Atuais do VBI
PERSPECTIVAS E IMPORTNCIA DE SE CONTINUAR INVESTIGANDO AS NOVAS VARIANTES DO VBI NO BRASIL E SE DEFINIR ESTRATGIAS MAIS EFICIENTES PARA O CONTROLE DESSES NOVOS VRUS
COMENTRIOS FINAIS
As ferramentas da Epidemiologia Molecular podem trazer contribuies de grande importncia para a caracterizao gentica e molecular de novos isolados do VBI, bem como para estimar / predizer quais so as consequncias que essas alteraes tero sobre as propriedades fenotpicas, particularmente sobre as propriedades dos antgenos mais relevantes desse vrus (Glicoprotena S1 e a Nucleoprotena N), possibilitando que sejam triadas e selecionadas estirpes virais de referncia com maior potencial de conferir imunidade cruzada em testes de desafio e proteo. No entanto, os testes biolgicos de proteo cruzada no devem ser descartados, pois a avaliao definitiva do estado de imunidade efetiva conferida, deve ser avaliada em testes de proteo em aves SPF vacinadas com a estirpe selecionada e depois desafiadas com o novo isolado do VBI. A introduo de novas estirpes vacinais atenuadas pode compor e direcionar o processo de evoluo viral. A maioria dos novos isolados do VBI no Brasil precisam ter caracterizada a sua patogenicidade em aves, para que se tenha disponvel um inculo viral de desafio para os futuros testes de proteo ao desafio de futuras estirpes candidatas para comporem uma nova vacina.