Mtodo de produo de anticorpos monoclonais

Grupo 5 Aline Sayuri Cawamura Isis Andreatta Karina Sayuri Takeuti Luciana Emi Nishimi Paolillo Marcela Emi Ueda Nataly Paredes da Rocha

PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS Para produzir o anticorpo monoclonal desejado, as clulas precisam ser cultivadas por duas formas: por injeo na cavidade abdominal de camundongos devidamente preparados ou por cultura de clulas de tecidos em frascos plsticos (Figura 1). Em ambos os mtodos pode ser necessrio um tratamento posterior para que se obtenha o anticorpo com a devida pureza e concentrao. O mtodo com rato geralmente familiar, bem entendido, e amplamente disponvel em muitos laboratrios, mas os ratos requerem observao cuidadosa para minimizar a dor ou desconforto que algumas linhagens de clulas induzem pelo acmulo excessivo de lquidos (ascite) no abdmen ou pela invaso de vsceras. O mtodo por cultura de tecidos seria amplamente adotado se fosse to familiar e bem compreendido quanto o anterior, e se produzisse a quantidade necessria de anticorpos com cada linhagem celular; mas os mtodos de cultura tm sido caros e demorados e muitas vezes no conseguiram produzir a quantidade necessria de anticorpos sem manipulao hbil considervel. No entanto, os mtodos de cultura esto se tornando menos dispendiosos, mais familiares, e mais amplamente disponveis.

Figura 1. Mtodos de produo de anticorpos monoclonais in vivo e in vitro. (Fonte: foto retirada do website http://faculty.matcmadison.edu/mljensen acessado em 02/05/11)

Fabricao de anticorpos com clulas mamrias (in vitro) Para se produzir um anticorpo monoclonal contra um determinado antgeno, inicialmente imuniza-se um animal, geralmente um camundongo, com esse antgeno. Em seguida, isolam-se clulas B do bao ou linfonados desse animal. Estas clulas

so misturadas com clulas de mieloma mltiplo, do tipo que no produz imunoglobulina, e que no sobrevivem em determinados meios de cultura, como por exemplo o meio HAT (meio de cultura que requer a existncia de enzimas capazes de metabolizar a hipoxantina ou a timidina, na presena de um antimetablito, a aminopterina, para que a clula no morra). Essas clulas so ento expostas ao polietilenoglicol, o que provoca sua fuso, formando-se ento clulas hbridas. Aps 1 a 2 semanas, as clulas B do bao ou linfonodos, que no se fundiram, sofrem a esperada apoptose. As clulas mielomatosas que no se fundiram tambm morrem, por no possurem as enzimas necessrias para a sobrevivncia no meio de cultura na presena de aminopterina. As clulas hbridas, por obterem as enzimas das clulas normais e a imortalidade das clulas neoplsicas, so as nicas a persistirem no meio de cultura. Ento estas clulas so replicadas em placas de cultura, tentando-se colocar 1 clula em cada orifcio. Elas iro se multiplicar, cada uma originando um clone de clulas hbridas (hibridoma), capazes de fabricar anticorpos com uma nica especificidade. Atravs de mtodos imunolgicos a especificidade das imunoglobulinas presentes nos sobrenadantes pode ser testada, identificando-se os orifcios onde esto os hibridomas capazes de fabricar anticorpos contra o antgeno utilizado para imunizar o camundongo. Atravs de diversas parties das culturas e inmeros testes, chegamos obteno de uma populao homognea de clulas hbridas, capazes de serem mantidas e de replicarem em meio de cultura, que fabricam o anticorpo por ns desejado. (Figura 2).

Figura 2. Explanao sobre a produo in vitro de anticorpos monoclonais, mostrando a fabircao de hibridomas. (Figura retirada do website

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/monoclonal.php acessado em 02/05/11)

Tipos celulares usados O tipo de clula mais utilizada para a produo de anticorpos monoclonais o hibridoma de camundongo. Uma variedade de clulas de mieloma tem sido utilizada para criar hibridomas, sendo a maioria descendente da linhagem de clulas MOPC 21. Hibridomas de ratos tambm tem sido fontes teis de anticorpos monoclonais. A escolha de uma linhagem celular e do sistema de expresso gnica consiste na produtividade atingida, estabilidade da linhagem celular, ausncia de agentes

acidentais indesejveis e da habilidade da clula em fornecer um processo pstranslacional adequado, principalmente a glicosilao. Na prtica, anticorpos tm sido expressados em clulas do ovrio de camundongos chineses e clulas do mieloma de ratos por variados meios de sistema de expresso gentica. Ambos os tipos celulares tem sido amplamente utilizados prestando-se a processos de fabricao em larga escala, pois eles crescem em cultura de suspenso. O uso de sistemas de expresso gnica de alta eficincia tem levado alta produtividade, muitas vezes excedendo o atingido com hibridomas.

Banco de clulas

Para a produo comercial de anticorpos monoclonais o processo de fabricao para cada ciclo produtivo inicia com clulas retiradas do banco de clulas altamente caracterizadas. No caso de clula mamria, o banco consiste em alquotas de clulas retiradas de um pool homogneo que preservado crioscopicamente em nitrognio lquido.

Sistema de cultura para cultura de clula animal

Muitos anticorpos monoclonais so produzidos a partir do crescimento de clulas hibridomas. Entretanto, para anticorpos teraputicos, a maioria dos produtores tem aplicado tcnicas de cultura celular in vitro. Esse tipo de tcnica reduz a chance de introduzir agentes acidentais a anticorpos irrelevantes do animal hospedeiro. Muitos tipos de sistema de cultura de clulas in vitro tem sido descritas . Para aplicao em pequena escala, que so necessrios mg ou g de produtos, uma variedade de mtodos so usados que atinge desde simples garrafas rotativas e frascos de agitao at fibras ocas de perfuso. Como a produo de clulas pode crescer em suspenso, possvel o uso de reatores convencionais em batelada com mistura por agitao ou por uma bomba de ar, usados para produo em larga escala (industrial).

Processo de otimizao e caracterizao

Para a produo em escala necessrio otimizar no s o meio de cultura como tambm os parmetros fsico-qumicos como pH, concentrao de oxignio dissolvida, e temperatura da cultura.

Mtodo In Vitro x In Vivo Mtodo In Vitro Vantagens: reduo da necessidade do uso de cobaias; facilidade de produo em larga escala (mais fcil e mais barato); no necessita do emprego de profissionais especficos para o manuseio dos animais e; dependendo da tcnica utilizada, produzem uma maior concentrao de anticorpos monoclonais do que as

concentraes geralmente encontradas no sistema in vivo, alm de serem tecnicamente livres de contaminantes. Desvantagens: alguns hibridomas no crescem bem em culturas in vitro; aumento na imunogenicidade devido a possvel perda da glicosilao adequada (em comparao com mtodos in vivo) podendo, tambm, haver perda da afinidade pelo receptor; algumas tcnicas utilizadas podem produzir menor concentrao de anticorpos monoclonais por mililitro necessitando, portanto, de outros processos no esquema de produo, adicionando tempo e custos aos processos e; o Food and Drug Administration (FDA) estima que, comparativamente, a diferena dos gastos de uma produo in vitro para uma in vivo pode se de dois a dez milhes de dlares. Mtodo In Vivo Vantagens: geralmente produz boas concentraes de anticorpos monoclonais, o que no exige posteriores etapas de concentrao, diminuindo o risco de desnaturar o anticorpo e diminuir sua efetividade. Desvantagens: envolve o uso contnuo de camundongos, bem como sua observao diria; anticorpos monoclonais produzidos pela tcnica in vivo podem conter protenas ou outros contaminantes da cobaia, necessitando de processos de

purificao posteriores extrao; pode-se, eventualmente, causar dor ou estresse aos camundongos.

Bibliografia:
Rossi-Ferreira R. Obteno de anticorpo monoclonal murino anti-fator VIII da coagulao sangnea. Doctoral thesis. Faculdade de Medicina, Unesp, Botucatu, Brazil. 2001

Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, Monoclonal Antibody Production, Washington, 1999