PRCTICO N 1

ESPECTROFOTOMETRA La espectrofotometra es un mtodo fsico que permite detectar un compuesto en solucin y/o determinar su concentracin aprovechando el comportamiento de ste frente a la luz ultravioleta (UV) y visible.

Figura 1: Onda Electromagntica. En la figura se muestran los dos componentes de una luz polarizada, un campo elctrico y un campo magntico, perpendicular el uno respecto al otro y perpendiculares a la direccin de la onda.

La luz es una radiacin electromagntica definida por un rango de longitudes de onda (). La luz UV presenta de 100 a 200 nm (UV lejano) y de 200 a 400 nm (UV cercano), mientras que la luz visible corresponde a ondas electromagnticas de 400 a 800 nm. La energa de una onda electromagntica est dada por la ecuacin: E = h donde h es la constante de Planck y es el nmero de onda (el recproco de la longitud de onda ).

Figura 2: Espectro Electromagntico. Rango de las radiaciones electromagnticas existentes

La energa de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energtico mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molcula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en molculas conjugadas (molculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugacin aumenta la longitud de onda de la absorcin al disminuir la diferencia energtica entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto nmero de enlaces conjugados, como el -caroteno (Figura 3) absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorcin de luz se denomina cromforo.

Figura 3: Molcula de -Caroteno.

Se han formulado reglas empricas para estimar la longitud de onda que absorbe un compuesto segn su estructura (reglas de Woodward-Fieser). Sin embargo, se desconoce el modo de predecir la estructura de un compuesto no descrito a partir de su espectro ultravioleta o visible. Para ese fin se pueden aprovechar el espectro infrarrojo, la resonancia magntica nuclear y la espectrometra de masas. El uso de la espectrofotometra est limitado a la deteccin y cuantificacin de compuestos, que absorben a una determinada longitud de onda cuando en la solucin no se detectan otros compuestos que interfieran (que absorban a la misma longitud de onda). Ley de Lambert-Beer La ley de Lambert-Beer, es una combinacin de dos leyes, las cuales permiten relacionar la concentracin de un compuesto dado, con la proporcin de luz absorbida por el compuesto, a una longitud de onda determinada. Una sustancia capaz de absorber luz que es parcialmente transparente transmitir una porcin de radiacin incidente. La relacin entre las intensidades de luz transmitida e incidente equivale a la TRANSMITANCIA (T). T = I/Io Donde Io es la intensidad de luz incidente; I es la intensidad de luz transmitida. La intensidad se define como el nmero de fotones que estn interactuando en una unidad de tiempo (segundos). Un valor de transmitancia de 100% representa una sustancia totalmente transparente, mientras que un valor de 0 representa una sustancia totalmente opaca. Para valores intermedios se puede definir la ABSORBANCIA (A), la cual esta dada por el logaritmo en base 10 del recproco de la transmitancia: A=log (1/T)= log (IO/I)

Es posible ahora definir la ley de Lambert-Beer, la cual establece que la absorbancia es proporcional a la concentracin de la sustancia que absorbe y el grosor de la capa que debe atravesar el haz de luz. Esto se expresa en la siguiente ecuacin:

A=cl
Donde es el coeficiente de extincin molar para una sustancia a una longitud de onda determinada, c es la concentracin MOLAR de la sustancia y l es el largo en CENTIMETROS del camino recorrido por el haz de luz a travs de la solucin.

Figura 4: Ley de Lambert-Beer. Representacin de una solucin de una sustancia con coeficiente de extincin molar y concentracin molar c, en una cubeta con una camino ptico b.

INSTRUMENTACIN El instrumento que mide absorbancia es el espectrofotmetro y su esquema bsico se muestra en la siguiente figura

Figura 5: Esquema de un Espectrofotmetro. El equipo cuenta con una lmpara que acta como fuente de luz (UV o visible), un prisma, un espacio donde instalar una cubeta con la solucin a analizar y un fotodetector conectado a un computador.

El haz de luz emitido por la lmpara es refractado en un selector de longitudes de onda para obtener luz aproximadamente monocromtica. Una rendija define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta cuyo dimetro interno define la variable l. La luz emitida despus de su paso por la celda es cuantificada por un detector. Los principios de cada componente de un espectrofotmetro son materia de un curso de anlisis instrumental que usted puede realizar posteriormente, de modo que

nos referiremos a los aspectos de inters prctico. La fuente de luz emite un rango continuo de longitudes de onda y es regulada por voltaje. Generalmente, la luz del rango visible es emitida por una lmpara de tungsteno (340-900 nm) y la luz UV es emitida por una lmpara de deuterio (200-360). Las cubetas empleadas son de vidrio para el rango visible y de cuarzo para el rango UV (el vidrio no es transparente a la luz UV). Usted dispone en este prctico de espectrofotmetros Jenway 6300 que slo emiten luz visible. El Jenway 6300 posee dos escalas de medida: de Absorbancia (0-2) y de % de Transmitancia (% T). El espectrofotmetro Spectronic Genesys-5 es ms sofisticado que el anterior y en l es posible medir absorbancia en el rango UV-VIS. Adems, posee un bao termorregulado para especificar la temperatura de la celda, lo que es de inters para realizar estudios de cintica enzimtica. Este equipo se usar para medir la concentracin de ADN en el prctico de preparacin de cidos nucleicos.

ACTIVIDADES
Este prctico consistir de dos partes: 1.- Uso de Micropipetas En la primera parte Ud. se familiarizar con el uso de micropipetas y determinar su precisin y exactitud. Para ello dispone de micropipetas Gilson o Labnet (existen otras marcas) de distintas capacidades, como por ejemplo: P1000 (mide hasta 1 ml), P200 (mide hasta 200 l) y P20 (mide hasta 20 l). Las micropipetas y su mantencin son costosas por lo tanto siga cuidadosamente las instrucciones que se le den. Determine el peso de los siguientes volmenes de agua en tres mediciones independientes: 5 y 10 l con una P20 10 y 50 l con una P200 50 y 500 l con una P1000 2.- Uso del espectrofotmetro Jenway 6300 En la segunda parte Ud. aprender a calibrar y usar un espectrofotmetro visible Jenway 6300. Siga las siguientes instrucciones generales del uso del espectrofotmetro: l. Encienda el equipo y espere a que termine la calibracin automtica. 2. Oprima las flechas izquierda/derecha hasta encontrar el modo absorbancia 3. Oprima las flechas arriba/abajo para seleccionar la longitud de onda (en este prctico Usted partir a 400 nm). 4. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimento de muestras 5. Oprima la tecla CAL para llevar la absorbancia a 0 (cero). 6. Saque el blanco e inserte la muestra problema en el portaceldas, cierre la puerta del compartimento. 7. Lea la medicin de absorbancia en la pantalla

2a.-Establecer el espectro de absorcin para distintos compuestos Se le entregarn 2 soluciones de la siguiente lista de colorantes: 1 mg/100 ml de Eosina Amarilla (Eosin Y) 2,5 mg/l00 ml de Anilina azul (Aniline Blue) 0,5 mg/100 ml de Violeta de Genciana (Gentian Violet) 1,5 mg/100 ml de Fuccina cida (Fuchsin acid) 0,5 mg/l00 ml de Verde Malaquita (Malachite Green) PARA CADA COLORANTE ENTREGADO: Determine el valor de absorbancia a 400 nm, registre el valor. Seleccione ahora la longitud de onda de 420 nm. Vuelva a calibrar el equipo (pasos 3 a 7 de las instrucciones generales) Lea la absorbancia a 420 nm, registre el valor. Repita el procedimiento, cambiando de 20 en 20 nm, hasta los 700 nm, para obtener el espectro visible completo de cada colorante. Cuando tenga el espectro determine la longitud de onda del mximo de absorcin. Proceda de la misma forma, pero ahora vaya cambiando la longitud de onda de 5 en 5 nm. Luego, haga lo mismo, de 1 nm. Grafique en papel milimetrado absorbancia v/s . SI A LAS CONCENTRACIONES ENTREGADAS, LA ABSORCION ES MAYOR A 2 REALICE EL PROCEDIMIENTO CON UNA SOLUCIN MS DILUDA DEL COLORANTE. 2b.-Realizar una curva de calibracin para obtener el coeficiente de extincin molar. Prepare 5 diluciones seriadas (por duplicado) de los colorantes que le fueron entregados (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32) y mida la absorbancia a la longitud de onda del mximo de absorcin que determin anteriormente. No necesita recalibrar el equipo al no cambiar la longitud de onda. Grafique absorbancia v/s concentracin y determine el coeficiente de extincin molar de cada colorante. 2c.-Determinar la concentracin de una muestra problema Prepare diluciones seriadas (por duplicado) del colorante problema (de concentracin desconocida) de manera que caiga dentro del rango lineal. Usando el grfico absorbancia v/s concentracin determine la concentracin de su muestra problema. INFORME En el plazo de una semana cada grupo deber entregar un informe conteniendo los resultados experimentales tabulados y graficados segn corresponda y adems deber contestar las siguientes preguntas en una hoja separada: 1. Qu conclusiones saca Ud. de las determinaciones de volmenes con micropipetas? 2. A bajas y altas concentraciones de un cromforo se observan desviaciones a la

Ley de Lambert-Beer. Explquelas. 3. Explique porqu una sustancia que absorbe luz en el rango visible presenta a la vista el color complementario de la longitud de onda que absorbe. Ocurre esto en el rango UV? Por qu? 4. Averige la estructura molecular de los colorantes que emple en este prctico e identifique el cromforo. 5. Indique cules son los cromforos de protenas y DNA en el rango UV. 6. Haga una lista de biomolculas que absorben a una longitud de onda similar al DNA. Indique claramente qu tienen en comn. 7. Realice los grficos en papel milimetrado del espectro de absorbancia y de la curva de calibracin obtenida por Ud. durante el paso prctico 8. Reporte la concentracin de la muestra problema determinada por usted LECTURA OBLIGATORIA Modern Experimental Biochemistry R. Boyer. (2000) 3 Edicin CAPITULO 5, pags. 141-157.