METANOTROFOS Y SU ROL MITIGANTE EN LAS EMISIONES DE METANO DESDE RELLENOS SANITARIOS

RESUMEN: Por algn tiempo, los ingenieros ambientales han estado utilizando la capacidad de los metantrofos (la bacteria abundante en la naturaleza que oxida metano a dixido de carbono) en los intentos de limitar las emisiones de metano desde los rellenos sanitarios, siendo stos la tercera fuente ms importante de las emisiones antropognicas de gas en el mundo. Este estudio revisa la literatura sobre las bases microbiolgicas para metantrofos. Se caracteriza a los organismos metanotrficos, y presenta el sistema actual de clasificacin para esta bacteria, junto con modernos mtodos de identificacin basados en muestreos del medioambiente. El estado actual de conocimiento sobre los requerimientos de hbitat es luego resumido, junto con las caractersticas cualitativas de la bacteria metanotrfica, encontrados en muestras colectadas desde las capas que recubren los vertederos, y en biofiltros comprometidos en la oxidacin del metano. Este documento tambin ofrece una caracterizacin de microorganismos que oxidan metano bajo condiciones anxicas (donde el oxgeno molecular est ausente). Palabras claves: la oxidacin del metano, rellenos sanitarios metantrofos, biofiltros, biocubiertas, oxidacin anxica, identificacin de microorganismos, rRNA 16S, genes funcionales. INTRODUCCION: Las necesidades de reducir las emisiones de metano desde rellenos sanitarios y vertederos de desecho es un reflejo de la capacidad del gas para aumentar el efecto invernadero. La propensin del metano para absorber la radiacin infrarroja lo hace 20-30 veces ms eficiente (por molcula) que el dixido de carbono como gas de efecto invernadero. El metano es adems inflamable, explosivamente en una mezcla de 5-15% en volumen con el aire, por lo que puede ser una verdadera amenaza para la salud o la vida de quienes trabajan en los vertederos, o que viven en proximidad a ellos. La Historia recuerda ejemplos de explosiones de gas en vertederos con graves consecuencias. Tres personas murieron en Winston-Salem (Carolina del Norte, EE.UU), en 1969, con otros cinco heridos de gravedad, cuando el gas acumulado en el stano de una fbrica de armas junto a un vertedero (ATSDR 2001, segn USACE 1984). Luego en 1983, en Cincinnati (Ohio, EE:UU), un edificio residencial fue destruido cuando el gas de un vertedero cercano se infiltr (ATSDR 2001, segn la EPA, 1991). Tambin hay numerosas referencias a incendios estallando en rellenos sanitarios en varias partes del mundo, uno con al menos cuatro meses de duracin en Maalaea, Maui (Hawaii, USA) en 1988, uno de una severa semana en Danbury (Connecticut, USA) en 1996, otro en 2007 en el rellenos sanitario regional Frederiction en Canad, y otro en 2006 en Tagardes (Grecia).

El metano es mayormente removido en la tropsfera, por va de su oxidacin por radicales libres de OH, que oxidan muchos gases contaminantes en la atmsfera. Dado que, como Lu y Khalil (1993) y Crutzen (1994) mostraron, con reacciones con metano ahora representan el 20% de estos radicales, es probable que el aumento de las concentraciones de metano es significante para la qumica de la atmsfera como conjunto, ya que hay menos restos de OH disponibles para lidiar con los muchos otros contaminantes atmosfricos. En la estratsfera, en cambio, el metano reacciona con cloro molecular derivado de los cloroflurocarbonados y por lo tanto genera molculas de cido clorhdrico y radicales de metil (CH3). Actualmente, la concentracin de metano en la atmsfera es mayor que 1.774 ppb, con persistente, si pequeas diferencias entre el del norte y el hemisferio austral (IPCC, 2007). Del metanos removido de la atmsfera el 90% es oxidado por reacciones fotoqumicas en la tropsfera, solo el 10% de su extraccin es atribuible a la actividad metanotrfica. El metano atmosfrico puede ser de origen biolgico (es decir de la digestin aerbica de la materia orgnica en los ecosistemas naturales como los pantanos o cinagas, y antropognico, como los campos de arroz y vertederos) o de origen no biolgico (es decir, del a combustin incompleta de materia orgnica). Un estimado 70-80% del metano atmosfrico es de origen biolgico. Las fuentes antropognicas son dominantes en las emisiones globales de metano, siendo responsable de las emisiones de un 60-70%del metano en la atmsfera. Los rellenos sanitarios son responsables de un 6%del total de las emisiones de metano. Sin embargo, el rol jugado en las emisiones individuales de los pases podra ser mucho mayor. La mezcla gaseosa liberada a partir de capas de residuos comprende metano metanos (0.64% del total), dixido de carbono (0.35% del total) y contabilidad de los compuestos voltiles olorosos de < 1%. La eliminacin de las emisiones de metano de rellenos sanitarios podra experimentar una sensible mejora de la calidad del aire, y esto parece alcanzable. Cuando el contenido de metano del biogs es < 30%, podran ser usados los mtodos biolgicos para la eliminacin de metano. Es decir, aprovechar de las capacidades de las bacterias para oxidar metano a dixido de carbono. El mtodo se basa en la transferencia del gas metano que contiene el depsito biolgico, lo ms a menudo a un material orgnico o mineral-orgnico (compost, suelo natural, turba o corteza) en el que las bacterias oxidantes de metano (metantrofos) se pueden desarrollar. Precisar el mtodo a usar depende de la concentracin y la velocidad de generacin del metano en el biogs, el perodo previsto sobre el cual las emisiones son probables, y las condiciones ambientales (la presencia de pozos de desgasificacin, y el aislamiento o falta de aislamiento-de la capa de cobertura del relleno sanitario). Los mtodos aplicados o que se estn introduciendo para limitar las emisiones de metano desde rellenos sanitarios

involucran la participacin de las llamadas bio-cubiertas, biowindows o biofiltros, o cubiertas ms temporales y diarias. La bacteria usada en la tecnologa anterior se encuentra ampliamente en la naturaleza, habitando una variedad de entornos diferentes a veces caracterizados por extremas temperaturas, pH o salinidad. Ellas usan metano como una fuente de carbono y energa y son aerobios obligados, por lo general prefieren una concentracin de oxgeno molecular menor que la de la atmsfera. Su capacidad para oxidar metano es asociada con la presencia de un complejo enzima multi-componente conocido como metano monooxigenasa (MMO). Los datos del IPCC (2007) muestran que aproximadamente 5.2% de metano removido de la atmsfera implica la oxidacin por bacterias metantrficas en los suelos. No slo la eliminacin de la atmsfera tiene lugar, de hecho, ante todo, las bacterias evitarn la emisin inicial de gas desde la superficie de terreno. Las evaluaciones sugieren que la oxidacin del gas por las bacterias en las capas superiores del relleno sanitario, o en las capas superiores de sellado, disminuye las emisiones anuales de metano desde los vertederos en un 10-25%. Las estimaciones de Reeburgh et al. (1993) en cambio sugiere que el papel de los suelos como biofiltros, previniendo las emisiones de metano procedentes de los suelos de los humedales, de los campos de arroz y rellenos sanitarios es enorme. La oxidacin del metano mediada por microorganismos es de aproximadamente 200 Tg (por ao) mayor que las tasas anuales de emisin. En comparacin, la emisin anual total desde todas las fuentes es de un estimado de 582 Tg de metano (IPCC 2007). 2 CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS OXIDANTES DE METANO Las bacterias oxidantes del metano (metantrofos o CH4-bacteria oxidante) son obligadamente, aerobias Gram negativas que usan CH4 como una fuente tanto de carbn como de energa. Ellos son parte del llamado subgrupo de los metiltrofos, en el cual ellos incluyen las bacterias que utilizan cualquier compuesto de carbn (que no sea CO2), o compuestos multicarbn que carecen de C-C directas. La bacteria que oxida metano fue identificada primero en 1906 (Hanson* Hanson 1996). Con el tiempo se hizo convencional asignar como metantrofos a dos grupos taxonmicos doblados tipos I y II (tabla 1). El tipo I pertence a la (gama) subdivisin de la Proteobacteria, mientras que los de tipo II estn en la subdivisin (alfa) de la Proteobacteria. Los gneros de tipo I son Methylobacter, Methylomicrobium, Methylomonas, Methylocaldum, Methylosphaera, Methylothermus, Methylosarcina, Methylohalobius, Methylosoma y Methylococcus, asignado a la familia Methylococcaceae. El tipo I hace uso de la va ribulosa en la conversin del formaldehdo que se convierte en componentes multicarbn que forman la parte de biomasa de clula. Los gneros de tipo II son Methylocystis, Methylosinus, Methylocella y Methylocapsa, incluyendo Methylocystaceae. Las bacterias del tipo II utilizan la va serina para convertir el

formaldehdo en compuestos multicarbn que otra vez forman la parte de la biomasa de clula. Dentro del tipo I y Methylococcus se ha demostrado posible distinguir un tipo X, parecido al tipo I en que el formaldehido es asimilado por la va ribulosa, pero difieren en que pequeas cantidades de enzima caracterstica para la va serina estn presentes. Dos oxidantes filamentosos de metano han sido descritos -Crenothrix polyspora y Clonothrix fusca. Ambos estn estrechamente relacionados con el tipo I de metantrofos. La temprana clasificacin de los metantrofos estaba basada en diferencias morfolgicas y estapas de descanso. Hoy en da, anlisis de ADN (diferencias en el nmero de G+C de pares de bases) ofrece una manera ms cientfica para la identificacin de bacterias, como lo hacen referencias a detalles estructurales internos (organizacin de la membrana intracitoplasmtica), as como la naturaleza de las vas por las que el carbono es asimilado a partir de formaldehido. El tipo I de metantrofos tiene como caractersticas intracitiplasmticas paquetes de membrana a lo largo de toda la clula, mientras que la bacteria tipo II tiene mebranas celulares concentradas en los mrgenes. Los descubrimientos ms recientes muestran que las bacterias metanotrficas son ms diversas taxonmicamente, ecolgica y genticamente de lo que se pensaba, y esto, obviamante, tendr consecuencias para su clasificacin. En esencia, hay bacterias de metano oxidantes que no pretenecen al phylum Proteobacteria. Tales organismos fueron encontrados en las aguas geotermales de Hells gate Reserve en Nueva Zelanda las cuales estn contaminadas con altas conectraciones de compuestos en extremo txicos. La bacteria en cuestin se ha aislado con xito y parece pertenecer a la familia Verrumicrobiaceae (filo Verrucomibrobia), en lugar de la phylum Proteobacteria, esta afinidad fue sugerida por el anlisis filogentico de los genes del 16S rRNA. Lo que primero se llam Methylokorus infernorum fue modificado despus a Methylacidiphilum infernorum, coherente con su preferencia por la temperatura de al menos de 60C, adems de condiciones extremadamente cidas (pH 2.0-2.5). Estos son organismos autotrficos. Anlisis de su genoma , el que ahora ha sido secuanciado por completo, muestra que los genes de codificacin de MMO son homlogos con los de los metantrofos Proteobacteria. Sin embargo, el mdulo gentico que codifica para la oxidacin de metanol y formaldehido estaba ausente o incompleto, lo que sugiere que estas bacterias utilizan una va metablica diferente a las hasta ahora identificadas para los metantrofos. Otras bacterias asignadas a las Verrucommicrobia se han encontrado en las aguas termales de Kamchatkay son conocidas como Methyloacida kamchatkensis, y otras en los suelos y lodos en torno a volcanes del sur de Italia.

2.1 Condiciones ambientales que apoyan el crecimiento de los metantrofos Los metantrofos han sido encontrados en diferentes ambientes que son terrestres (suelos resecos, campos de arroz y la cubierta de los rellenos sanitarios), anfibios (humedales, los principios de temporadas en campos de arroz) o acuticos (lagos y el mar). Algunos existen en ambientes extremos como las aguas termales o lagos salados. Los metantrofos ms conocidos son no-halfilos neutrfilos, desarrollndose en hbitats con bajas concentraciones de sal y pH neutro. Sin embargo se ha descubierto que las cepas pueden crecer en hbitas con salinidad 8-9% (w/v) de NaCl. Loa metantrofos se pueden cultivar en una amplia gama de pH. Las bacterias acidfilas crecen mejor a pH 5.0-5.5 (como Methylocella palustris) o en pH entre 4.2 hasta 7.2 (como Methylocapsa acidophila), mientras que las especies alcalfilas como methylomicrobium a un 7.5 a 10. Del mismo modo, las citadas bacterias metanotrficas asignadas a la Verrucomicrobia pueden oxidar metano a pH < 1. Los metantrofos se desarrollan en ambientes de diferentes temperaturas, las especies han sido aisladas de los dos manantiales de agua caliente y de los suelos en el extremo norte del mundo. Optimos 42.62C caracterizan a especies termfilas como Methylothermus (I) y Methyloccocus (X), Methylocaldum (I) y MMethylokorus infernorum, mientras que 25.35C es mejor para las especies mesfilas como Methylocystis, Methylomonas, methylosinus y Methylobacter. Las bacetrias oxidantes de metani asignadas a Verrucomicrobia (y por lo tanto ambas termfilas y acidfilas) se encontraron en las aguas termales cidas de Kamchatka. Estas bacetrias lo hacen mejor a temperatutas de app 55C y pH 3.5. En cambio para las bacterias de los gneros psicrfilos Methylomonas (I), Methylophaera (I) y Methylobacter (I), 5-15C es una temperatura ptima.

Figura1: La va oxidativa del metano en las bacterias metano-oxidadoras. Debido a la presencia de cobre en el centro activo de MMO (como la enzima clave en el proceso de oxidacin del metano), la concentracin correcta de este metal en el sustrato es de gran importancia para el xito de los experimentos en cultivo de metantrofos. Concentraciones ptimas del elemento difieren de una cepa de metantrofo a otra. Sin embargo la concentracin de cobre no debera exceder 4.3 mM.

2.2 Transformaciones bioqumicas en el proceso de oxidacin del metano en condiciones aerobias.

La frmula simplificada para la reaccin por la cual los metantrofos oxidan el metanoexpresando el balance entre sustratos y productos- es el siguiente: CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O Sin embargo, los metantrofos oxidan metano a dixido de carbono usando una serie de reacciones que generan productos intermedios como metanol, formaldehido y formiato (figura1). En general la oxidacin de metano es exergnica, el total de energa generada es la suma de las energas liberadas en etapas sucesivas. La mayor liberacin de hecho caracteriza a las etapas 3 y 4 de la reaccin global, en la que el formaldehido se transforma en formiato, y en este en productos orgnicos finales. Es posible identificar dos tipos de va en la oxidacin de metano: -La va de desasimilativa, mediante la cual el carbono del metano se reincorpora al dixido de carbono liberado a las atmsfera y no es utilizado en la biomasa celular. -La va de asimilacin, mediante la cual el carbn del metano se convierte en compuestos orgnicos de construccin de la biomasa celular. El curso de las dos vas es igual hasta el momento de la generacin de formaldehido, que puede ser oxidado a formiato (figura 1), o asimilado por las clulas a travs de las serina o ciclos de ribulosa monofosfato.

Como ya se ha sealado, la oxidacin de metano a metanol involucra metano monooxigenasa MMO, una enzima que puede estar en una forma asociada con la membrana celular (pMMO), o bien en una forma citoplasmtica disuelta (sMMO). El tipo monooxigensa depende de la concentracin de cobre en el sustrato. sMMO es nonhaeme Fe fierro-constituida tres-componentes que comprende un complejo enzimtico hodroxilasa, adems de las protenas B y C. pMMO es a su vez construido a partir de tres polipptidos de masas 46, 29 y 28 kDa. Hay CBCs de masas 1,218 y 0,1779 kDa en la estructura de pMMO, su funcin probablemente es la estabilizacin y el mantenimiento de un adecuado programa de instalacin de xido-reduccin. Tambin podran ser importantes para el secuestro de los iones de cobre. El cobre no es meramente un elemento de la enzima, sino tambin un regulador de la expresin de la enzima. pMMO tambin es sensible a la presencia de oxgeno y la disponibilidad de luz. El proceso por el cual el meatnol es transformado ende masa 60-70 kDa adems de una beta-unidad de masa 8.5 kDa. Las subunidades estn presentes juntas en la forma de un tetrmero alfa2beta2. El metanol presente en el sustrato tambin puede derivar de la pectina y la degradacin de la lignina. Una etapa adicional en el proceso de oxidacin del metano es la conversin de formaldehido en dixido de carbono, con formiato como intermediario. Este proceso implica: -Formaldehdo desidrogenasa asociado a NAD(P), el cual podrs o no requerir glutatin reducido u otro co-factor para su actividad.

-Colorante ligado a la desidrogenasa que es medido por la reduccin de colorantes como 2,6-diclorofenol. El formiato es oxidado a dixido de carbono con la ayuda de una enzima formiato desidrogenasa NAD-dependiente. El formiato derivado de la oxidacin del metano y metanol por bacterias metanotrficas es asimilado para formar intermediarios de los ciclos metablicos centrales que se utilizan para la biosntesis de material celular. Existen dos vas conocidas por las cuales el formaldehido es convertido en biomasa: -La va serina, en la cual dos moles de formaldehido y un mol de dixido de carbono son usados en la produccin de compuestos tres-carbono. -La va ribulosa monofosfato (RuMP), en la que tres moles de formaldehido se utilizan en la generacin de compuestos de carbono utilizados en tres reacciones metablicas bsicas. Despus de Hilger y Humer (2003), las ecuaciones estequiometrias que expresan la demanda de oxgeno y nitrgeno a lo largo de la va ribulosa y serina son las siguientes (donde C4H8O2N) denota biomasa bacteriana): -La va RuMP: CH4 +1.5O2 +0.118NH40.118 (C4H8O2N)+0.529 CO2+1.71H2O+0.118H+ -La va serina: CH4 +1.57O2 +0.102NH40.102 (C4H8O2N)+ 0.593 CO2 +1.75 H2O+0.102 H+ A lo largo de la va ribulosa, la reaccin de condensacin aldlica utiliza el formaldehido y la ribulosa monofosfato en la generacin de hexulosa-6-fosfato en una reaccin catalizada por la sintasa hexulosa fosfato (HPS). La fosfato hexulosa isomerasa (IHP) a su vez convierte la de hexulosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Las dos enzimas en cuestin son caractersticas para metantrofos de los tipos I y X. En la segunda parte de la va ribulosa, la fructosa-6-fosfato se convierte en 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. En otras reacciones, este ultimo se convierte en piruvato y 3-fosfogliceraldehdo-. En la tercera parte 3fosfogliceraldehdo y fructosa-6-fosfato se someten a una serie de reacciones que conducen a la regeneracin de ribulosa-5-fosfato y al final de la va. Las enzimas de la va serina (figura 3) son metantrofos caractersticos del tipo II. La primera etapa de la va implica una reaccin, catalizada por serina hidrxidometiltransferasa (STHM), entre formaldehdo y glicina, para la creacin de serina. La serina es transaminada con glioxilato como aceptor del grupo amino, generando as hridroxipiruvato y glicina. El hidroxipiruvato es reducido a glicerato por la hidroxipiruvato reductasa (HPR). El glicerato quinasa cataliza la adicin de un grupo fosfato desde ATP para producir 2-fosfoglicerato. La conversin de este ltimo en fosfoenolpiruvato, con la unin de dixido de carbo, es catalizada por carboxilasa fosfoenolpiruvato, formando oxaloacetato, y es reducida a malato. Por actividad del malato tiocinasa, el malato es convertido en malyl-CoA liasa para crear acetil coenzima A y glioxilato, poniendo as fin a la va.