LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

ISOLASI DAN SKRINING MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK

PENYUSUN:

Nama NIM Kelompok Tanggal Praktikum PJ Laporan

: Andrea Nita Karisa : 118114034 : B2 : 22 Maret 2012 :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2012

ACARA III ISOLASI DAN SKRINING MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK

A. TUJUAN 1. Mengisolasi dan memurnikan bikan untuk mendapatkan mikroba yang berpotensi menghasilkan antibiotik.
2. Melakukan skrining mikroba yang berasal dari habitat alam (misalnya:

tanah rhizosfer di dekat system perakaran tumbuhan, sludge/lumpur).

B. LANDASAN TEORI Mengisolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk mengisolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono, 1980). Antibiotik adalah zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri. Antibiotika memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Sumber mikroba penghasil antibiotika anatara lain berasal dari tanah, air laut, lumpur, kompos, isi rumen, limbah domestik, bahan makanan busuk, dan lainnya. Kebanyakan mikroba penghasil antibiotik diperoleh dari tanah, terutama genus Streptomyces (90-95% dari Actinomyces) dan fungi. Tanah merupakan tempat interaks biologis yang paling dinamis dan memiliki 5 kategori utama, yaitu partikel mineral, bahan organik, air, gas, dan jasad hidup. Bila suatu contoh tanah diinokulasikan pada agar nutrient dan diinkubasikan pada suhu 35, maka beberapa bakteri yang tidak akan tumbuh ialah termofil obligat, disamping psikofil, anaerob, dan autotrof. Protozoa tidak akan tumbuh dan hanya beberapa algae dan cendawan akan tumbuh (Pelczar, 1986).

Berdasarkan cara kerjanya, antibiotik dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu antibiotika bakteriostatik (menghambat pertumbuhan dan perkembangan bakteri) dan antibiotika bakterisidik (mematikan bakteri). Mekanisme kerja antibiotika umumnya sebagai berikut: Menghambat biosintesis dinding sel (penisilin, sefalosporin, sikloserin, basitrasin) Meninggikan permeabilitas membran (sitoplasma, sefalosporin, sikloserin, basitrasin) Mengganggu sintesis protein normal bakteri (tetrasiklin,

kloramfenikol, citromisin, novobiosin, antibiotika aminoglikosida). Antibiotik dibagi berdasarkan: 1. Pendekatn kimia, yang terdiri dari daro golongan beta laktam, amino glikolisin, tetrasiklin, klorampenikol, polipeptida, dan maktohida. 2. Mekanisme kerja terdiri dari: Antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel Antibiotik yang menghambat sintesis protein Antibiotik yang mempengaruhi membran sel Antibiotik yang mempengaruhi biosintesis asam nukleat

3. Sasaran kerja. 4. Daya kerja (Volk & Wheeler, 1998).

Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri penghasil antibiotika: Sifat-sifat spesies mikroba yang akan diisolasi Tempat hidup atau asal mikroba tersebut Medium pertumbuhan yang sesuai Cara menanam mikroba tersebut

 Cara inkubasi mikroba tersebut Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap berupa biakan murni (Jutono, 1980). Bakteri di alam jarang terdapat dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies bakteri. Ada dua cara yang umum digunakan untuk mengisolasi bakteri, yaitu: 1. Cara goresan ( streak plate method) Cara ini adalah dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. 2. Cara taburan (pour plate method) Pada dasarnya adalah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50 C dengan suspensi yang mengandung bakteri dan menuangkannya kedalam petridish steril. Setelah inkubasi akan terlihat kolonikoloni yang tersebar dipermukaan agar yang mungkin berasal dari satu sel bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono, 1980).

C. SKEMA KERJA Alat dan Bahan : 1. Ekstrak sampel tanah berupa lumpur 2. Media Nutrien Agar (OXOID) dan Nutrien Broth (OXOID) 3. Buffered Pepton Water (BPW) sebagi larutan pengencer 4. Alkohol 70% 5. Kultur murni bakteri uji

6. Deret larutan standar Mac Farland 7. Cawan petri steril, tabung reaksi. Erlenmeyer, pipet volume, gelas ukur 8. Spreader, vortex mixer, jangka sorong/penggaris

Cara Kerja 1. Pembuatan media NA Media NA dibuat sebanyak 125 ml(3,5 g NA/125 ml) Media NA disiapkan sebanyak 7 tabung reaksi @ 15 ml (4perlakuan, 1 kontrol kontaminasi media, 1 kontrol pertumbuhan mikroba uji dan 1 kontrol negatif) Sisa media NA digunakan untuk membuat medium agar dalam cawan petri 1 buah @15-20 ml dan media NA miring dalam tabung reaksi

2. Pembuatan suspensi bakteri uji Tabung reaksi berisi larutan pengencer BPW sebanyak 9 ml disiapkan Ke dalam tabung reaksi dengan larutan pengencer tersebut, diteteskan dengan pipet volume steril suspensi kultur murni bakteri uji sampai kekeruhannya setara dengan kekeruhan larutan standard Mac Farland II (kepadatan populasi bakteri : 6.108 CFU/ml) Pembuatan suspensi bakteri uji juga bisa dilakukan dengan meneteskan larutan pengencer ke dalam kultur bakteri uji yang disediakan sampai kekeruhan setara dengan kekeruhan larutan standard Mac Farland II

3. Pembuatan kontrol kontaminasi media

Dibuat media NA 15 ml dan tuang dalam cawan petri. Biarkan memadat Pada dasar petri diberi label: nama percobaan/nama bakteri uji/kelpompok praktikum/tanggal Diinkubasikan dalam suhu kamar selama 24 jam bersama kelompok perlakuan Pertumbuhan yang terjadi diamati dan dibandingkan dengan perlakuan

4. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Diambil 1 ml suspensi kultur murni bakteri uji dengan kepadatan suspensi setara dengan larutan standard Mac Farland II, diinokulasikan ke dalam petri berisi 15 ml media NA secara pour plate dan dibiarkan memadat Pada dasar petri diberi label : nama percobaan/nama bakteri uji/kelompok praktikum/tanggal Diinkubasikan dalam suhu kamar selama 24 jam bersama kelompok perlakuan Pertumbuhan yang terjadi diamati dan dibandingkan dengan perlakuan

5. Pembuatan kontrol negatif atau kontrol pelarut Diambil 1 ml suspensi kultur murni bakteri uji dengan kepadatan suspensi setara dengan larutan standard Mac Farland II, diinokulasikan ke dalam petri berisi 15 ml media NA secara pour plate dan dibiarkan memadat

 0,1 ml pelarut (larutan pengencer BPW) diinokulasikan ke permukaan agar secara spread plate. Pada dasar petri diberi label: nama percobaan/nama bakteri uji/kelompok praktikum/tanggal/pelarut Diinkubasikan dalam suhu kamar selama 24 jam bersama kelompok perlakuan Pertumbuhan yang terjadi diamatidan dibandingkan dengan perlakuan

6. Penyiapan ekstrak tanah Membuat ekstrak sampel tanah (berupa sludge/lumpur) dengan mensuspensikan 1 gram sludge dalam 5 ml larutan pengencer BPW, divortex sampai homogen Dari ekstrak sludge tersebut, dibuat suspensi sludge dengan pengenceran 10-1 104

7. Isolasi bakteri tanah penghasil antibiotik Disiapkan cawan agar yang telah ditumbuhi bakteri uji secara pour plate: 1 ml suspense kultur murni bakteri uji dengan kepadatan suspense setara dengan larutan standar Mac Farland II Diinokulasikan ke dalam petri berisi 15 ml medi NA secara pour plate. Biarkan memadat 0,1 ml suspensi sludge pengenceran 10-1 104 diinokulasikan secara spread plate ke atas permukaan agar yang telah ditumbuhi bakteri uji (tahap 6a)

 Permukaan cawan agar diratakan secara spread plate dengan menggunakan spreader/batang Drigalsky Biarkan permukaan agar mengering Diinkubasikan pada suhu kamar selama 1-2 hari atau sampai terbentuknya zona jernih/zona hambatan pertumbuhan bakteri uji di sekitar koloni mikrobia penghasil antibiotik Diamati pertumbuhannya Aktivitas penghambatan diukur dengan mengukur diameter zone jernih/hambatnya menggunakan jangka sorong/penggaris Koloni terseleksi (koloni mikroba penghasil antibiotik yang ditunjukkan dengan adanya zona jernih/zona hambatan bakteri uji di sekitarnya) diisolasi dengan cara memindahkannya pada medium cawan agar secara streak plate sampai didapatkan koloni terpisah Supaya diperoleh biakan yang benar-benar murni dapat dilakukan reisolasi secara streak plate beberapa kali (2-3 kali) Koloni yang terpisah kemudian diisolasi lebih lanjut ke dalam media agar miring dan media nutrien cair sebagai stok isolat murni

Isolat murni bakteri penghasil antibiotik yang diperoleh dari tahap e, digunakan untuk acara berikutnya yaitu Acara IV (Identifikasi dan Determinasi Bakteri)

D. PERTANYAAN DISKUSI 1. Mengapa perlu dilakukan eksplorasi mikroba penghasil senyawa antibiotik? 2. 3. Apa yang dimaksud dengan antibiotik? Apakah yang dimaksud dengan isolasi dan skrining? Dalam tahap manakah dipraktikum ini Anda melakukan isolasi dan skrining? 4. Mengapa larutan suspensi bakteri yang diuji perlu di setarakan dengan larrutan Standar Mac Farland? Bagaimana cara penyetaraan dengan larutan standar Mac Farland? 5. Bagaimana cara penentuan isolat terseleksi atau isolat mikroba pneghasil antibiotik dalam praktikum ini? 6. Pertanyaan lain diberikan oleh assisten/dosen.

DAFTAR PUSTAKA Jutono, J., 1980, Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum, UGM Press, Yogyakarta, pp. 70-75. Pelczar, M., 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi, Jilid 2, UI Press, Jakarta, pp. 514-515. Volk and Wheeler, 1998, Mikrobiologi Dasar, Edisi V, Erlangga, Jakarta, pp. 247-269.