Universidad Popular del Cesar Facultad de ciencias de la salud Departamento de microbiologa 2009

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE SUELOS.

ANTES DE INICIAR EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS El uso de bata de manga larga, gorro, tapabocas y guantes es obligatorio durante la permanencia en el laboratorio, igualmente no olvide usar zapatos cerrados de material resistente para evitar cualquier riesgo de accidente y/o infeccin. Organcese; coloque las maletas y dems tiles no relacionados con la practica de laboratorio en el lugar indicado por el docente, luego desinfecte su mesn de trabajo con hipoclorito de sodio; posteriormente ubique los reactivos, equipos y muestras necesarios para realizar su trabajo, de manera que facilite la consecucin de los procedimientos, llevndolos a cabo, de la manera ms sencilla. Verifique que el material necesario para el desarrollo de la prctica este completo y estril. Cada estudiante debe contar con asas curva y redonda, lminas y laminillas, marcadores de tinta indeleble, cinta amarilla para pared, vinipel, toallas de papel desechables e hipoclorito. Tenga muy en cuenta las seales de seguridad, nunca las cambie de lugar o dae alguna.

DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRCTICA Tenga cuidado con el uso del mechero, antes de prenderlo reconozca la posicin de cerrado o abierto (palanca en cruz o en paralelo al tubo de gas). Verifique igualmente que la manguera que conduce el gas hacia mechero este en buenas condiciones, de lo contrario evite usar ese mechero. Para evitar contaminaciones con otros microorganismos al hacer repiques, debe asegurarse de esterilizar el asa calentando el alambre de ferro nquel con el mechero en

toda su extensin hasta que sta se ponga roja, este proceso debe realizarse antes y despus del uso. Abra la caja de Petri, tubos u otros que contengan medios o cultivos el menor tiempo posible y cerca al mechero para evitar contaminaciones. Es conveniente mantener un poco de hipoclorito concentrado en un vaso en donde se descarten las asas utilizadas; cuando se manipulan hongos se prefiere la desinfeccin del asa sumergindola en hipoclorito por 5 minutos, ya que, el proceso de incineracin puede generar aerosoles que contienen esporas dispersantes. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano, cerca de a la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo ndice y el pulgar. Del correcto manejo de los tubos depende el xito de los cultivos y por consiguiente tambin los resultados microbiolgicos. Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlos a tapar para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del tubo con bacterias del medio ambiente. Destapar las cajas de Petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. Para tener esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta se debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano. Las lminas deben estar limpias y desengrasadas. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos. No olvide descartar los medios de cultivo en un tiempo no superior a 8 das, segn lo indicado por el docente, ya que los hongos y actinomicetes tienen un perodo de crecimiento mayor. Es recomendable no incubar tubos con medios de cultivo slidos o lquidos en gradillas de madera, ya que, adems de ocupar gran espacio en la incubadora, la madera es un material no recomendado para el trabajo con microorganismos. Recuerde mantener su sitio de trabajo aseado y organizado, an durante el desarrollo de las prcticas, evite caminar o recorrer el laboratorio continuamente con muestras biolgicas, microorganismos, o reactivos peligrosos como cidos o bases fuertes. Si va a preparar y servir medios de cultivo, tenga en cuenta que este procedimiento debe hacerse en un sitio destinado para este fin, cuyo mesn debe haber sido desinfectado previamente con hipoclorito de sodio. La temperatura adecuada para servir el medio de cultivo es aquella un poco superior a la corporal, si el medio esta demasiado caliente puede generar vapores de agua que posteriormente, al disminuir la temperatura generaran agua lquida que a su vez facilita la contaminacin del medio; si por el contrario, el medio se deja enfriar demasiado antes de servir, se tienden a generar grumos de agar solidificado y la probabilidad de contaminacin por microorganismos presentes en el ambiente aumenta. El microscopio debe manejarse de manera tcnica. Encenderlo una sla vez. Una vez logrado el enfoque de la muestra para retirar la lmina, pase al objetivo de menor aumento (10X), no gire el tornillo macromtrico, pues desenfocara la distancia frontal.

Est prohibido hacer manipulacin boca-mano. Comer, fumar, cortar cinta pegante con la boca, morder lpices dentro del laboratorio. En caso de derrame o ruptura de un recipiente con cultivo, cubrir con papel toalla y aplicar un germicida. Informar al profesor, en caso eventual de accidente, cortadura, quemadura para tomar accin pronta y apropiada

DESECHOS Comunes Infecciosos (Aguas o suelo contaminadas) Punzocortantes

ESTADO FISICO Slidos Slidos Lquidos

ENVASE Bolsas plsticas Bolsas plsticas Recipientes hermticos bolsas plsticas

COLOR Negro/Gris

Rojo en Rojo

Solido Solido Liquido

Quimicos

Recipientes rigidos Doble bolsa plsticas cuando las caractersticas lo permitan Envases originales

Rojo

Biologico (plantas, suelo, troncos) Especiales

Solido Solido

Bolsas gruesas Bolsas plasticas en recipientes hermeticos

Verde Amarillo

AL FINALIZAR LA PRCTICA.

Elimine los residuos de muestras en las bolsas destinadas para su desecho, recuerde que los medios de cultivo con microorganismos deben someterse a esterilizacin en autoclave, antes de ser desechados. Lave el material de vidrio que no requiera ser esterilizado y dispngalo de manera organizada sobre el mesn indicado. Limpie los lentes del microscopio con papel de arroz y guarde estos equipos en el lugar correspondiente. Verifique que su puesto de trabajo haya quedado limpio y desinfectado con hipoclorito de sodio. Recuerde guardar su bata de laboratorio dentro de una bolsa y lavarla por separado, previa desinfeccin con un lquido blanqueador.

Todo el equipo reusable (por ej. puntas de micro pipetas, jeringas, cnulas, agujas, tubos para recoleccin de especmenes, etc.) deber ser ubicado en un recipiente metlico o de plstico resistente a punciones o cortaduras. Se recomienda el uso de bidones y botellas de plstico o cualquier recipiente similar acondicionado para tal fin. El recipiente contendr lquido decontaminante y deber estar ubicado en el mismo lugar de trabajo.

ACTIVIDAD GRUPAL. 1. Observa el comportamiento del personal de laboratorio (estudiantes, auxiliares, docentes) toma fotos o realiza un video si es posible y analiza: Se practican las normas de bioseguridad? Qu riesgos potenciales corre el personal de laboratorio? Qu prcticas inadecuadas (no acordes con las normas de bioseguridad) observaste? Como microbilogo, qu recomendaciones generales haras para mejorar la bioseguridad en tu universidad?

Todos los grupos de trabajo presentan los videos realizados o exponen las fotos y con base en lo observado deben elaborar un plegable o folleto, que contenga las normas necesarias para prevenir contaminaciones y accidentes, durante el desarrollo de las prcticas de microbiologa de suelos. El mejor folleto o plegable ser expuesto en el laboratorio.

PRACTICA 1 TCNICAS PARA EL ENRIQUECIMIENTO Y OBSERVACIN IN SITU DE MICROORGANISMOS DEL SUELO

OBJETIVOS Aplicar tcnicas sencillas para el enriquecimiento y la observacin de microorganismos del suelo in situ. Observar la diversidad y los patrones de colonizacin de microorganismos del suelo sobre superficies slidas. Practicar la observacin de microorganismos del suelo in vivo

MATERIALES Laminas portaobjetos limpias Capilares Cinta adhesiva Pala Asas Agujas rectas y curvas. Coloraciones (Gram, Azul de lactofenol, safranina) Microscopio Parafina (una vela) Una Papa Sacabocados Frascos de vidrio Muestras de suelo Alcohol Mecheros PROCEDIMIENTO I. Observacin De Microorganismos Del Suelo Por La Tcnica De Portaobjeto Enterrado Tome un par de portaobjetos limpios y desengrasados, nalos por sus superficies. Posteriormente envulvalos con cinta adhesiva transparente en sus extremos. Seleccione un suelo protegido de la actividad humana, animales etc. Con la ayuda de una pala entierre varios pares de laminas unidas a profundidades de 5, 15 y 30 cm. Puede tambin enterrar laminas en diferentes tipos de suelo segn si inters (ejm: diferente grado de humedad, diferente grado de fertilidad, diferente vegetacin). Marque el sitio y deje enteradas las laminas por 2 , 4 y 6 semanas. Retire del suelo las lminas enterradas en cada sitio, a las 2, 4 y 6 semanas.

Separe el par de laminas, lave cuidadosamente la superficie expuesta y retire las partculas gruesas de suelo, debe quedar una pelcula fina sobre la lamina, la cual no debe ser daada. Lave bien la parte opuesta de la lamina y y squela con cuidado para colocarla sobre la platina del microscopio Observe primero en montaje hmedo, (con agua y laminilla), y luego con colorantes a 10, 40 y 100X. Trate de identificar estructuras microbianas, patrones de crecimiento, diversidad de formas etc.

 Dibuje y describa las observaciones, tabule los resultados de acuerdo a las diferentes profundidades y suelos que quiere comparar. II. Observacin De Microorganismos Del Suelo Por La Tcnica De Capilares Tome una lamina portaobjetos y y coloque sobre ella entre 5 y 10 tubos capilares, Pguelos con cinta adhesiva en sus extremos sin obstruir los orificios. Entierre las laminas en el suelo a diferentes profundidades (igual que en el procedimiento anterior, sin embargo es recomendable esta tcnica para observar microorganismos en suelos bastante hmedos), si se quiere se puede introducir algunos sustratos en el interior de los capilares. Despus de transcurridas 2,4 y 8 semanas, desentierre las lminas, realice observaciones macro y microscpicas tomando las muestras del interior los capilares con ayuda de una aguja ( en caso de ser necesario parta los capilares y prepare montajes hmedos y coloreados). Compare lo observado entre diferentes muestras y con la tcnica anterior.

III. Enriquecimiento Y Observacin De Clostridium Sp Amiloliticos Este ensayo es un mtodo clsico de enriquecimiento para la obtencin de bacterias anaerbicas, aisladas a partir de agregados de suelo en un medio natural rico en almidn como es la papa. Se toma una papa y con un sacabocados de aproximadamente 1 centmetro de dimetro (previamente impregnado con alcohol y flameado) se orada hasta la mitad. Se retira el cilindro de papa y se corta unos 3mm en la base, e deja sobre papel absorbente, caja de Petri o una lamina limpia junto al mechero para que no se contamine. Se introduce en el orificio una pequea cantidad de agregados de suelo (cerca de 0,5 g) y se coloca nuevamente el cilindro de papa. Se sella con parafina liquida (vela derretida), y se coloca dentro de un frasco de boca ancha, al que se le agrega agua hasta cubrir la papa inoculada y se tapa con papel de aluminio o una tapa metlica. Se deja incubar al medio ambiente por 2 -3 das.

Se retira la papa del frasco, se retira el cilindro de papa y del interior del orificio se toman muestras con ayuda del asa para hacer extendidos, se dejan secar al aire. Se fijan al calor y se colorea con Gram. Realice otro montaje para ser coloreado con la coloracin para endosporas de Shaeffer Fulton (Consultar procedimiento). CUESTIONARIO 1. Consulte que es una tcnica microbiologa del suelo. de cultivo por enriquecimiento y para que se usa en

2. Consulte las diferentes morfologas de bacterias endosporadas y los tipos de sustratos utilizados, tanto anaerobias como aerobias. Que son los microorganismos oligotrficos y un mtodo de enriquecimiento para la seleccin de este tipo de microorganismos presentes en el suelo o el agua, consulte dos

gneros de este tipo de microorganismos y describa sus caractersticas morfolgicas y de crecimiento.