MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA. ENFERMERA. DOCENTE: MNICA LATORRE.

TRABAJO PRCTICO N 1. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS PROCARIONTES Y EUCARIONTES. 1.- FUNDAMENTO TEORICO Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolucin de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin y el punto de ebullicin del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes. Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las caractersticas del ambiente determinan cules especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de protozoos, algas, virus. microorganismos: mohos, levaduras, bacterias,

El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto de microorganismos compiten entre s para obtener nutrientes y energa. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composicin qumica del suelo donde habitan. Ms an, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presin del ambiente. Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscpicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelcula de microorganismos contenidos en una matriz de polisacridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrmetros y pocos milmetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelculas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente hmedos

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tales como paredes de la caera de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies Los mohos y levaduras forman parte de los hongos. Las levaduras son unicelulares en condiciones normales mientras que los mohos crecen como un sistema ramificado de filamentos (micelio). Se trata de organismos eucariticos cuyas clulas, al igual que las de vegetales y animales, tienen un ncleo cerrado por una doble membrana porosa y llevan como mnimo dos cromosomas, a ms de veinte en algunas especies. Los mohos son pluricelulares y aunque sus clulas aisladas miden a lo sumo 25 mm de largo, su conjunto se distingue a simple vista. Los hongos con reproduccin sexual pueden tener cuerpos fructferos de tamao notable como los championes y otras setas, formados por millones de clulas. Las eubacterias son procariticos. Sus clulas carecen de membrana nuclear y mitocondrias, adems poseen un solo cromosoma que se encuentra libre en el citoplasma y una pared celular rgida. Las clulas de los procariotas son, en general, mucho menores que las de los eucariotas; unas 10 veces menor en medidas lineales y por lo tanto unas 1000 veces menor en volumen. Las eubacterias presentan diversa morfologa: esfrica, cilndrica, espiralada e incluso filamentosa. Son organismos pequeos, que miden uno o varios micrmetros. Las levaduras, en cambio, miden entre 6 y 12 mm.

Dominio Archea Bacteria Eukarya

Reino Monera Protozoa Fungi Plantae

Tipo celular Ejemplos Procaritico Arqueobacterias Procaritico Eubacterias Cianobacterias Eucariota Protozoos Eucariota Levaduras, mohos, setas Eucariota Musgos, Hepticas, conferas, Plantas con flores, Algas unicel. Eucariota Esponjas, Corales, Moluscos, Insectos, Vertebrados
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Animalia Gusanos,

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Si bien existe una gama diversa de microorganismos que viven libremente en el medio ambiente, existe un nmero no menor de estos que estn asociados a nuestro cuerpo y que son patgenos del ser humano. Los patgenos, particularmente las bacterias y las levaduras, coexisten con microorganismos inofensivos sobre o en el interior del husped. Estos patgenos deben identificarse adecuadamente como la causa real de las enfermedades infecciosas. La microbiologa clnica identifica los agentes y organismos causantes de enfermedades basndose en procedimientos morfolgicos, bioqumicos, inmunolgicos y moleculares. El laboratorio de microbiologa clnica puede proporcionar una identificacin preliminar o definitiva de los microorganismos basndose en (1) el examen microscpico de las muestras, (2) el estudio del crecimiento y las caractersticas bioqumicas de los microorganismos aislados, (3) las pruebas inmunolgicas que detectan anticuerpos o antgenos microbianos, (4) el fagotipado, y (5) los mtodos moleculares. Habitualmente los laboratorios clnicos son capaces de aislar, identificar y determinar la sensibilidad a los antibiticos de las bacterias patgenas, resultados que rutinariamente se obtienen en las primeras 48 horas de procesar la muestra. Sin embargo, los recientes avances en los mtodos de diagnostico rpido han hecho posible identificar algunos patgenos en minutos y los patrones de sensibilidad antibitica en horas. MICROSCOPA. Las estructuras celulares, los tejidos, los aspectos morfolgicos de estos, se pueden observar a travs del microscopio ptico y electrnico. Este instrumento desde su invencin increment el estudio y el desarrollo de teoras de la identificacin y funcionamiento de los diferentes elementos biolgicos que componen las clulas. Para el examen microscpico de microorganismos se puede hacer uso bien del microscopio ptico o del electrnico. Para la mayora del trabajo de rutina se usa el microscopio ptico, mientras que para el examen de las estructuras intracelulares el microscopio electrnico es en muchos casos completamente imprescindible. Las muestras en un examen en fresco, fijadas por calor o qumicamente se pueden examinar con un microscopio de campo claro ordinario. El examen puede mejorar con un microscopio de contraste de fases o de campo oscuro. Este ltimo es el de eleccin para la deteccin de espiroquetas en las lesiones de la piel asociadas con la sfilis temprana o la enfermedad de Lyme. El microscopio de fluorescencia se puede utilizar para identificar algunos microorganismos acidorresistentes (Mycobacterium tuberculossi) despus de haberlos teido con fluorocromos. Se han descrito muchas tinciones que se pueden usar para examinar muestras en bsqueda de microorganismos especficos. Dos de las tinciones bacterianas ms ampliamente utilizadas son la tincin de Gram y la tincin acidorresistentes. Puesto que estas tinciones se basan en la composicin qumica de las paredes celulares, no son tiles para la identificacin de bacterias que no presentan pared celular. Para
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teir hongos de los cultivos, tpicamente se usa azul de lactofenol. Las infecciones fngicas a veces se diagnostican por el examen microscpico directo de muestras mediante fluorescencia. Los exmenes en fresco de muestras de sangre, heces u orina concentrados se pueden examinar microscpicamente para la presencia de huevos, quistes, larvas o clulas vegetativas de parsitos. En conclusin, para poder observar los microorganismos directamente, el microbilogo debe utilizar un instrumento de precisin, el microscpico. Si lo que interesa observar es la motilidad o reactividad frente a sustancias qumicas es conveniente examinar las bacterias sin teir, por otra parte si que quiere visualizar estructuras celulares especificas es necesario tratar las clulas con colorantes, proceso denominado Tincin. Examen de microorganismos sin tincin.
1.

Preparacin Hmeda: Es la forma ms simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos, y consiste en la suspensin de un inculo de cultivo en agua u otro liquido, colocando un gota de sta suspensin en un portaobjeto comn y cubrirlo con un cubreobjeto. Este procedimiento requiere utilizar microscopia de contraste de fase. Preparacin de gota pendiente: sta tcnica requiere de un portaobjeto con una concavidad o depresin circular en su centro (portaobjeto excavado o clula de Kacli). Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos, sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias qumicas.

2.

Examen de microorganismos teidos: Colorantes: Son compuestos qumicos orgnicos, generalmente sales, en las que uno de sus iones es portador del color. Segn su comportamiento qumico los colorantes pueden clasificarse en cidos, bsicos y neutros. a) Colorantes cidos o Aninicos: La carga del in que imparte el color es negativa: Ejemplo: Fuesina cido, eosina, rojo congo. b) Colorantes Bsicos o Catinicos: El in que imparte el color tiene carga positiva. Ejemplo: cristal violeta, azul e metileno, safranina. c) Colorantes Neutros: sal compuesta de un colorante cido y otro bsico. Ejemplo eosinato de azul de metileno, giemsa. El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones, entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Para teir una preparacin se pone una pequea cantidad del material a examinar en un portaobjeto limpio sin grasa. Si el inculo proviene de un medio slido se emulsiona en una gota de solucin fisiolgica estril. La muestra se extiende con el asa (esterilizada y enfriada) hasta que quede una fina pelcula. Esta pelcula se conoce como FROTIS. Una vez realizado el frotis, se procede a la FIJACIN. Este es un procedimiento que mata las bacterias del frotis y hace que se adhieran al
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portaobjeto. La fijacin se puede realizar sumergiendo el portaobjeto en alcohol metlico o ter o formalina; siendo el calor el ms indicado para el trabajo de rutina. La fijacin por calor se logra pasando el portaobjeto varias veces por sobre la llama del mechero. El mtodo de fijacin depender del tipo de microorganismos que se desea observar; por ejemplo las bacterias Halfilas se fijan sumergiendo el portaobjeto en cido actico, para poder extrae las sales. Una vez realizado el frotis y la fijacin se procede a aplicar el o los colorantes segn sea la tincin. En bacteriologa se utilizan tres clases de tinciones: T. simple, T. diferencial y T. especiales.
1.

Tincin Simple: Es aquella que hace uso de un solo tipo de colorante y sirve para observar tamao y forma celular. Las ms comunes son la de azul de metileno, carbolfuesina, cristal violeta y safranina. Tcnica: - Frotis y fijacin de la muestra. - Colorante durante un minuto. - Lavar con agua para retirar el exceso de colorante. - Dejar secar al aire. - Observar al microscopio de inmersin. Tincin Diferencial: Permite dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reaccin con los colorantes utilizados. Entre ellos la tincin Gram y la de alcohol-cido resistente son las ms usadas Tincin Gram: Es la tcnico de uso ms comn en microbiologa y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades fsicas de la pared celular. Tcnica: - Frotis y fijacin de la muestra. - Crital violeta durante un minuto. - Lavar con agua. - Mordiente: solucin de yodo (lugol) guante un minuto. - Lavar con agua. - Agente decolorante: alcohol durante 30 seg. - Lavar con agua. - Safranina por 30 seg. - Lavar con agua y secar al aire. - Examinar al microscopio con objetivo de inmersin. El mordiente, tienen la funcin de aumentar la afinidad de colorante con las estructuras celulares. El agente decolorante tienen la funcin de retirar el colorante de la clula. Las bacterias sometidas a la tincin Gram que retienen el colorante cristal violeta y aparecen de color violeta profundo se clasifican como Gram positivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tien rojas por el colorante de contraste, se clasifican como bacterias Gram negativas. Este resultado se fundamente en el hecho de que las bacterias Gram positivas, despus del tratamiento con alcohol, se produce una deshidratacin con la consiguiente disminucin en el dimetro de los poros del pptidoglicano de la pared celular. Esto permite que el colorante cristal violeta quede retenido en el
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2.

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interior de la clula. Las paredes de las bacterias Gram negativas tienen una cantidad mucho menor de pptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas, lo que le da una consistencia mucho ms laxa que permite la salida del complejo cristal violeta-yodo y la posterior tincin con safranina Reaccin de las clulas Gram positivas y Gram negativas frente a la tincin Gram. COLORANTE Crital violeta Lugol Alcohol Safranina GRAM POSITIVAS Azul Azul Azul Azul GRAM NEGATIVAS Azul Azul Decolora Rojo

Tincin Alcohol-acido resistente (Ziehl-neelsen): Existen bacterias que son de difcil tincin con colorantes habituales, siendo preciso teirlas con la adicin de mordientes y con la intervencin de calor. Estas bacterias, una vez teidas no se decoloran por la accin del alcohol o de soluciones cidas fuertes (ntrico, sulfrico, clorhdrico). La cido alcohol-resistente es un propiedad esencial ligada al gnero Mycobacterium. Estn tambin descritas como cido resistentes las esporas bacterianas y algunas especies de actinomicestales. Tcnica: - Frotis y fijacin de la muestra. - Cubrir el frotis con un pedazo de papel filtro. - Agregar Carbol fuesina por 3 a 5 min. - Pasar la llama del mechero durante uno segundos por debajo de la preparacin hasta que el colorante emita vapores. Repetir la operacin durante 10 a 15 min. No hierva el colorante ni permita que se seque el papel. - Deje que se enfre e portaobjetos y lavarlo con agua. - Decolorar con HCl-Etanol. En este momento todas las clulas tienen un color rojo. - Aplicar durante 1 min. Azul de metileno. - Lavar con agua y secar al aire. - Observar al microscopio con inmersin.
-

Los microorganismos cido alcohol-resistentes se observan de color ojo y aquellos que no lo son aparecen teidos de azul. Esta tincin se basa en el hecho de que las bacterias alcohol cido-resistentes poseen un alto contenido de sustancias grasas en el interior de la clula y una capa de serosa que no permite el paso de colorantes comunes, las que se ablandan con el calor dejando penetrar el colorante vaporizado que queda unido estrechamente a la clula. Al aplicar el agente decolorante, este es incapaz de penetrar en la clula. Reaccin de las clulas frente a la tincin de Ziehl-Neelsen.
COLORANTE ALCOHOL-CIDORESISTENTE NO ALCOHOL- CIDORESISTENTE
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Carbol fuesina HCl-etanol Azul de metileno 3.

Rojo Rojo Rojo

Rojo Decolora Azul

Tincin Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la clula bacteriana, inclusiones citoplasmticas como tambin algunos microorganismos que dadas sus caractersticas especiales no se tien adecuadamente con tcnicas rutinarias. Tincin de estructuras: Esporas: Son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar tcnicas especiales. Tcnica: Frotis y fijacin de la muestra. Cubrir frotis con papel filtro. Teir con Verde Malaquita a emisin de vapores por 10 a 15 min. Aplicar Safranina por 30 seg. por 1 min. Lavar con agua y secar al aire. Observar al microscopio con inmersin. Las esporas aparecen de color verde y la clula vegetativa roja. La vaporizacin del colorante sobre la muestra incrementa la penetracin de ste en los recubrimientos impermeables de la espora. Reaccin de las clulas frente a la tincin de Esporas. COLORANTE Verde malaquita Agua Safranina ESPORA Verde Verde Verde CLULA VEGETATIVA Verde Decolora Roja

Cpsula: Usada para los gneros Klebsiella y Sreptococcus. Muchas bacterias estn rodeadas por una envoltura mucosa o cpsula, pero slo en algunas se encuentra bien desarrollada. Esta se compone de polisacridos, polipptidos y polmeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran por el calor, nunca se podr utilizar calor en ninguno de los pasos de la tincin. La cpsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un halo transparente alrededor de la clula. La tcnica de la tincin negativa incorpora materiales como tinta china, que se compone de partculas demasiado grandes para penetrar la clula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la clula bacteriana. Al examinar la preparacin, la cpsula aparecer como una zona transparente que rodea la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cpsulas, debido a que el encogimiento de las clulas o la separacin de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado contiene muchas zonas transparente con siluetas uniformes, es probable que sean reales y no artificiales. Tcnica.

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Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con asa loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar. Extender la muestra y dejar secar al aire. Cubrir con Safranina por 30 a 45 seg. Dejar secar. Observar al microscopio con inmersin. La Cpsula se ver como un halo transparente rodeando a la clula de color rojo y el resto de la preparacin aparecer de color negro. Flagelos: Son estructuras de locomocin cuya longitud suele ser varias veces la de la bacteria, pero su dimetro oscila entre 10 a 20 nm. Debido a esto ltimo es imposible verlos en su estado natural en un microscopio de luz. Sin embargo existen mtodos de tincin, para poder observarlos a microscopa ptica de campo claro, que hacen uso de sustancias qumicas que dilatan su dimetro; uno de los mtodos que se utilizan es el Metodo de Gray. Tincin de Inclusiones: Muchas bacterias crecidas en ciertas condiciones de cultivo, producen como resultado de su metabolismo depsitos dentro del citoplasma, los cuales son denominados inclusiones. Entre stos depsitos se encuentran: Polihidroxibutirato, Polifosfatos, Sulfuros y varios cristales. Algunos de stos son productos de desechos y otros son reservas alimenticias. Varios procedimientos de tincin se usan para revelar estas inclusiones. Tincin de Poli-Beta-hidroxibutirato: Tcnica: Frotis y fijacin de muestra. Agregar Negro Sudn por 15 min. Lavar con agua y secar. Limpiar el portaobjeto con Xilol. Secar y agregar Safranina durante 1 a 3 min. Lavar y secar al aire. Observar al microscopio con inmersin. Las inclusiones de PHB aparecen como gotculas azul oscuras y las partes citoplasmticas de color rosado. Tincin de Polifosfatos Tcnica: Frotis y fijacin al calor. Teir con azul de metileno o Azul de Toluidina durante 20 min. Lavar el portaobjeto con agua, dejar secar. Observar al microscopio con inmersin. Los grnulos de Polifosfato aparecen como esferas de color azul intenso a violeta y el resto del citoplasma aparece celeste. 2.- OBJETIVOS.
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1. Recordar la utilizacin del microscopio. 2. Diferenciar organismos eucariontes de procariontes. 3. Diferenciar organismos auttrofos de hetertrofos. 4. Realizar diferentes tinciones: Tincin simple, Tincin Gram. 5. Identificar los microorganismos como Gram positivos negativos. 3.- Metodologa.

Gram

a) OBSERVACIN DE HONGOS Esporas y zygosporas del moho del pan: 1. Con la ayuda del microscopio ubicar los esporangios maduros y enteros. 2. Tomar, con una aguja de diseccin, una porcin muy pequea de muestra, y extender el material recogido en el portaobjetos. 3. Colocar una gota de agua y una de azul de metileno, aplicar el cubreobjetos. 4. Realizar preparados de diferentes regiones del hongo que ha crecido en el pan y buscar zygosporas y observar al microscopio ptico. 5. Averigua sobre las caractersticas de este hongo (moho). __________________________________________________________________________________ 6. Cul es el o los beneficios que aportan los hongos al medio ambiente? __________________________________________________________________________________

Aumento Total ____________ Sin/Con tincin ____________

Aumento Total ____________ Sin/Con tincin ____________

b) OBSERVACIN DE LEVADURAS. 1. Usando una pipeta Pasteur (gotero), transferir varias gotas del cultivo de levaduras a un portaobjetos. Agregar una gota de rojo neutro u otro colorante y colocar el cubreobjetos. Usar aumento (40X) para observar la levadura. 2. Para qu que se agreg el colorante al preparado? ________________________________________________________________________________ Bajo condiciones ptimas, las levaduras se multiplican por gemacin, que involucra un proceso en el citoplasma con un subsiguiente desprendimiento de una nueva clula. Busque en su preparado, clulas con yemas. 3. Las levaduras son procariotas o eucariotas? Cmo lo sabe? ________________________________________________________________________________
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4. En qu partes de la clula de levadura ocurre la gluclisis? ________________________________________________________________________________ C) OBSERVACIN DE ALGAS UNICELULARES. 1. Limpiar con alcohol el portaobjetos. 2. Agregar 1 gota de cultivo de microalgas. 3. Colocar encima de cada portaobjetos el correspondiente cubreobjetos, procurando que no haya una excesiva cantidad de agua. 4. Observar al microscopio, a pequeo aumento. Estos organismos son casi transparentes, por ello debe cerrarse un poco el diafragma, de forma que el campo visual aparezca poco iluminado (abrir y cerrar ligeramente el diafragma segn convenga con cada organismo distinto). 5. Dibujar las estructuras observadas. D) OBSERVACIN DE PROTOZOOS. 1. Limpiar con alcohol el portaobjetos. 2. Agregar 1 gota de agua de florero o agua estancada. 3. Colocar encima de cada portaobjetos el correspondiente cubreobjetos, procurando que no haya una excesiva cantidad de agua. 4. Puede teirse alguna preparacin colocando una gota de azul de metilo o rojo neutro antes de la gota de agua, o bien despus de colocar el cubre y junto al borde de ste (el agua penetrar en el espacio que queda entre porta y cubre por capilaridad). 5. Observar al microscopio, a pequeo aumento. Estos organismos son casi transparentes, por ello debe cerrarse un poco el diafragma, de forma que el campo visual aparezca poco iluminado (abrir y cerrar ligeramente el diafragma segn convenga con cada organismo distinto). 6. Algunos protozoos son muy rpidos, por lo que su observacin resulta difcil al principio; sin embargo, transcurridos 5 a 10 minutos van disminuyendo considerablemente su movilidad. Cuando se consiga tener inmovilizado un ejemplar, pasar a objetivos de mayor aumento, hasta llegar al objetivo de inmersin, si fuese necesario. 7. Dibujar las estructuras que observa y clasificarlos en Flagelados, Ciliados y Rizpodos E) OBSERVACIN DE BACTERIAS. i) Tincin Simple. 1. Tomar con cuentagotas una pequea cantidad de un cultivo bacteriano y depositarlo sobre el portaobjetos. 2. Fijar la preparacin pasndola 3-4 veces por encima de la llama de un mechero, cogiendo el portaobjetos por los bordes de uno de los extremos. Hay que procurar que la temperatura no sea excesiva; para ello se pasa la preparacin por la llama e inmediatamente, se posa el portaobjetos sobre el dorso de la mano (nunca debe quemar al ponerlo en contacto con la piel). 3. Apoyar el portaobjetos sobre el soporte de tinciones y aadir unas gotas de azul de metileno. 4. Dejar actuar el colorante durante 5 minutos y lavar con agua destilada. Dejar secar al aire. 5. Colocar el cubreobjetos. 6. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

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7.

Dibujar lo observado. Sealar cul es la forma celular de los microorganismos observados.

ii) Tincin Gram: 1. Realizar tincin gram de acuerdo a lo descrito anteriormente. 2. Dibujar lo observado. Sealar cul es el tipo de microorganismos observado y mencionar caracteristicas al respecto. PREGUNTAS DE DESARROLLO: 1.- Realice un cuadro comparativo en el cual establezca diferencias y semejanzas entre organismos procariotas y eucariotas. 2.- Realice comparaciones entre los microorganismos observados. BIBLIOGRAFA. 1. Campos P. Victoriano. Microbiologa. Manual de Laboratorio. 1980, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso. 2. Campos P. Victoriano. Microbiologa General. Manual de Laboratorio 2000, Pontifica Universidad Catlica de Valparaso. 3. Practicas de Microbiologa 2 curso de Biologa. 2006, Departamento de Microbiologa y Gentica. Universidad de Salamanca. 4. Practicas de Microbiologa Industrial y Alimentaria. Curso 2001-2002. 5. Madigan, Martinko and Parker. Brock, Biologa de los microorganismos. Octava edicin, 1998.

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