964557477.biotecnologia y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II
Editores: Gabriela Levitus, Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski
Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa
Ediciones
Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria
Editores:
Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski.
ndice
Prefacio ............................................................................................................................... Agradecimientos ................................................................................................................ Lista de Autores .................................................................................................................. Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ............................................. Prlogo a la Segunda Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ........................................... Parte I: Herramientas Bsicas ...........................................................................................
Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland . Captulo 2: Morfognesis. Silvia Radice ... Captulo 3: La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo, Aveliano Fernndez y Viviana G. Sols Neffa. .................................................................................................................................................. Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique. ................................................................................................................................ Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. Captulo 6: Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pablo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf. .............................................................................................................................................. Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... Captulo 9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich ............................................................. Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... Captulo 12: Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari. ...................................................................................
6 7 7 11 11 15
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86 100 121 136 146 157 170 183
Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad

Captulo 1: Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez Camargo y Aurora Picca. .................................................................................................................................................. Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich. ....................................................
185 197
Captulo 3: Epigentica y evolucin 5LFDUGR : 0DVXHOOL \ &DUORV ) 0DUO Captulo 4. Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique. ............... Captulo 6: Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz, Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros ............................................................... Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos. Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi .. Captulo 8: Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibez, Nlida Winzer .............................................................................................................................. Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica. Nlida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez. .........................................................................................
211 217 229 243 259 271 283
3DUWH ,,, 0pWRGRV SDUD DFHOHUDU SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR H LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO

Captulo 1: Obtencin de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranda y Nicols Gear. .................................................................................................................................... Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, Antonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos. Carlos Sala, Mariano Bulos, Anala Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... &DStWXOR ,GHQWLFDFLyQ \ UHJLVWUR GH YDULHGDGHV Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y Mara Alicia Loray .........................................................................................................................................
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Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma

Captulo 1: Micropropagacin. Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... Captulo 2: Semilla sinttica. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. Captulo 3: Conservacin de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. .......................
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Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetal

Captulo 1: Aportes de la citogentica al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Graciela Gonzlez, Mara Rosa Ferrari, Ana Mara Garca, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, Pablo Tomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. Captulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genmica. Germn Spangenberg, Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... Captulo 3: Caracterizacin molecular de la apomixis y su aplicacin en la agricultura. Silvina C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... Captulo 4: Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandn, Pablo A. Marinangeli y Mariana Prez de la Torre. ..................................................................................
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Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales. Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas. Mariana del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... Captulo 7: Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mercedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngico en la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Salazar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontivero y Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y conservacin de plantas libres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... Captulo 11: Aplicaciones biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. Delucchi. .................................................................................................................................................. Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos. Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, Nstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Mara Binaghi ........................................................................................................................................... Captulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. Captulo 15: Fitorremediacin. Mara Eugenia Segretn, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, Mara Eugenia Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matas Lentz. .........................................................................
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467 481 495 507 519 529 539 545 559
Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa
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&DStWXOR &ULWHULRV FLHQWtFRV SDUD OD HYDOXDFLyQ GH OD ELRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV Clara Rubinstein ........................................................................................... &DStWXOR %LRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV 0DUFRV 5HJXODWRULRV Moiss Burachik .................................................................................................................................. Captulo 3: Flujo gnico y su posible impacto ambiental. Mnica Poverene, Soledad Ureta y Agustina Gutirrez. ............................................................................................................................. Captulo 4: Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... Captulo 5: Manejo integrado de plagas Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y Cecilia Roca. ................................................................................................................................................... Captulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolucin y estrategias de manejo. Daniel Tuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. .....................................................
571 583 595 603 613 621
Parte VII: Biotecnologa y sociedad

Captulo 1: La transformacin tecnolgica y los nuevos desafos. Carmen Vicin. ..........................
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&DStWXOR $GRSFLyQ GH ORV FXOWLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV HQ $UJHQWLQD \ HQ HO PXQdo. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin. Valeria Durand ...............
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PREFACIO En oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, nos habamos propuesto responder a la necesidad de un texto en idioma espaol, dirigido a docentes y estudiantes de los cursos de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas aplicadas al mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de informacin general y consulta para no especialistas. Esta Segunda Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas, atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad gentica y seleccionar caractersticas deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismo modo, se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las aplicaciones. Esta edicin intenta UHHMDU HVWH SURFHVR GLQiPLFR \ DSRUWDU LQIRUPDFLyQ DFWXDOL]DGD FRQ HMHPSORV GH DSOLFDFLRQHV DO mejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentes campos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas bsicas, se ha hecho foco en las tcnicas de cultivo de tejidos y micropropagacin que se utilizan en s mismas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades o como paso obligado en la construccin de plantas transgnicas. En la seccin que se ocupa de las DSOLFDFLRQHV GH HVWDV WpFQLFDV D FDVRV HVSHFtFRV VH EULQGDQ HMHPSORV GH PHMRUDPLHQWR ORJUDGR en diferentes especies. La tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica) constituyen una de las herramientas ms importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo GH OD LQYHVWLJDFLyQ EiVLFD HQ HO PDSHR GH JHQHV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV FRPR HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH IXQFLRQHV \ UHGHV UHJXODWRULDV TXH LQX\HQ HQ ODV FDUDFWHUtVWLFDV TXH VH desean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestas a diferentes tipos de estrs ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologas de mejoramiento, la transgnesis o transformacin gentica es una de las herramientas ms verstiles y poderosas, ya que permite resolver problemas que por va del mejoramiento convencional no sera posible enfrentar. En esta edicin se presentan numerosos ejemplos de transgnesis para la obtencin de cultivos tolerantes a estrs bitico y abitico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. 'HVGH FXDQGR VH FXOWLYDURQ SRU SULPHUD YH] OD VXSHUFLH PXQGLDO GH FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV aument 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectreas en 2009. Segn el ltimo informe del ISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnolgicas) estas hectreas fueron cultivadas por 14 millones de agricultores de 25 pases, siendo Argentina uno de los lderes en adopcin, con el 16% del rea global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacional para regular el desarrollo y la aplicacin de la ingeniera gentica al mejoramiento de organismos YLYRV FRQRFLGRV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV X 2*0V 6L ELHQ pVWRV QR VH OLPLWDQ a plantas, en este trabajo se presentan slo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relacionados con los cultivos transgnicos. Esperamos que esta nueva edicin constituya una herramienta til y accesible para docentes, estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarn a la noble tarea de mejorar la agricultura.
Los Editores
AGRADECIMIENTOS A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y profesionales de instituciones argentinas, que han contribuido con sus aportes. Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido investigador y catedrtico espaol, por regalarnos tambin el prlogo de esta segunda edicin. Al Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por auspiciar la publicacin del libro. A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este proyecto. Los Editores
(O XVR GH IXHQWHV \ QRPEUHV FRPHUFLDOHV HQ HVWH GRFXPHQWR HV VyOR SDUD QHV GH LGHQWLFDFLyQ y no implica ningn aval ni recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas en esta publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores.
LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)

Abriata Aguilar Almasia Altieri Asurmendi Bazzini Bey Binaghi Bravo Almonacid Bulos Burachik Cardone Carrari Carrera Carrillo Casati Castagnaro Cervigni Chalfoun Chan Chantre Conci Confalonieri Conti del Vas del Viso Delucchi Luciano A. O. Mario Natalia Emiliano Sebastin Ariel Paula Mara Fernando Mariano Moiss Susana Fernando Alicia Nstor Paula Atilio Pedro Gerardo D. Nadia Raquel L. Guillermo Vilma Viviana Vernica Mariana Florencia Julio E. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Nidera Semillas Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA INGEBI, CONICET Nidera Semillas Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y Pesca Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario EEAOC, Tucumn CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Litoral CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INTA IFFIVE Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) INTA-EEA Bordenave Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina
Daz Daz Ricci DiRienzo Distfano Drincovich Durand Echenique Escandn Feingold Felitti Fernndez Fernndez Ferrari Ferrari Filippone Flaschland Franzone Fresco Friedrich Fusari Galdeano Gallo Garayalde Garbus Garca Garca Olmedo Gear Gmez Gonzlez Grasso Greizerstein Grellet Gutirrez Heinz Helguera Hopp Ibez Labarta Landau Lavia Lentz Levitus Lewi Lia Longo Loray Luciani Mamani Marcucci Poltri 0DUO Marinangeli Martnez
Marina L. Juan Carlos Miguel Ana Julia Mara F. Valeria Viviana Alejandro S. Sergio E. Silvina Aveliano Paula Germn Mara Rosa Paula Eduardo Pascual M. Anala Pablo Corina Ernestina Leonardo Antonio Ingrid Ana Mara Francisco Nicols Marisa Graciela Daniel H. Eduardo Carlos Agustina Ruth Marcelo Esteban Mercedes Marcelo Alejandra Graciela I. Ezequiel M. Gabriela Dalia Vernica Florencia Mara Alicia Gabriela Alicia Susana Carlos F. Pablo A. Ma. Carolina
CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Crdoba Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario Ketchum Argentina - ArgenBio Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Instituto de Floricultura, INTA Castelar INTA - EEA Balcarce Universidad Nacional de Rosario Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina Universidad Nacional de Buenos Aires EEAOC, Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE IGEAF INTA Castelar Nidera Semillas Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE INTA - EEA Bariloche CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, UBA Universidad Politcnica de Madrid Syngenta CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Instituto de Suelos, INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA EEA Marcos Jurez Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Universidad Nacional de Ro Cuarto Instituto Nacional de Semillas INASE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE INGEBI, CONICET ArgenBio IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Direccin de Calidad - INASE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar
Martnez-Zamora Masuelli Meier Mentaberry Miranda Morgenfeld Mroginski Nisensohn Olmos Ontivero Ortiz Pacheco Paniego Prez Camargo Prez de la Torre Pessino Picca Poggio Polci Poverene Prina Puebla Radice Rey Ros Rivero Robledo Roca Rodrguez Roncallo Rubinstein Sabbatini Sala Salazar Sansberro Scarpeci Schrauf Scocchi Segretin Seijo Selva Sharry Sols Neffa Spangenberg Tomas Tonello Torales Tranquilli Tuesca Ureta Valle Vzquez Rovere
Gustavo Ricardo W. Mauro Alejandro Rubn Mauro Luis Luisa Sofa Marta Juan Pablo Ma. Gabriela Norma Gladys Mariana Silvina C. Aurora Lidia Pablo Mnica Alberto Andrea F. Silvia Hebe Ral D. Mercedes Germn Cecilia Cecilia Pablo Clara Mario R. Carlos Sergio Pedro Telma E. Gustavo Adriana Ma. Eugenia Guillermo Juan P. Sandra Viviana G. Germn Pablo Ursula Susana Gabriela Daniel Soledad Estela M. Cecilia
INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Asociacin Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Universidad Nacional de Rosario Laboratorio de Biotecnologa, INTA Pergamino INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias, UNR IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Floricultura, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IGEAF INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE Dow Agrosciences Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CERZOS, CONICET Monsanto Argentina ILSI CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Nidera Semillas INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR Facultad de Agronoma, UBA Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE INGEBI, CONICET Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Victorian Department of Primary Industries (DPI) FCA, Universidad Nacional del Litoral INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn IRB, INTA Castelar IRB, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar
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Vellicce Vicario Vicin Vila Vojnov Winzer Wirth Wulff Zappacosta Zelada Zelener
Gabriel Ana Laura Carmen Alejandro J. Adrin Nlida Sonia Arturo Diego C. Alicia Noga
EEAOC, Tucumn Direccin de Calidad INASE Facultad de Agronoma, UBA IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Fundacin Pablo Cassar Universidad Nacional del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA IRB, INTA Castelar
PRLOGOS Prlogo a la primera edicin Recientemente, un periodista, que comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yo slo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el bilogo le explic que al comer sta no haba ms opcin que engullir unos 25.000 genes del genoma de Lactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los miFURRUJDQLVPRV TXH KDELWXDO \ FyPRGDPHQWH KDELWDQ HQ OD VXSHUFLH GH ODV WXUJHQWHV KRMDV HO periodista qued atnito. Segn un eurobarmetro de hace unos meses, ms de dos tercios de los europeos estaban en contra de los alimentos transgnicos. Sin embargo, en la misma encuesta se inclua una aseveracin - los tomates normales no tienen genes, los transgnicos s - frente a la que tambin ms de dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es una lstima que dicho eurobarmetro no registrara la proporcin correspondiente al encabezamiento no saben, pero s contestan, aunque es fcil colegir que dicha fraccin era alta y en extremo vergonzante. Los avances del conocimiento biolgico y de la biotecnologa destacan en el panorama cienWtFRWpFQLFR GH HVWH Q GH VLJOR \ KDQ LPSUHJQDGR ODV PiV GLYHUVDV YHUWLHQWHV GH QXHVWUD YLGD cotidiana sin que se haya aceptado que un mnimo de estos conocimientos debera formar parte integral de la cultura general. La ignorancia de los hechos bsicos relativos a nuestra herencia JHQpWLFD R D QXHVWUD DOLPHQWDFLyQ VH FRQVLGHUD LQFOXVR GH EXHQ WRQR (VWR VH UHHMD GH HQWUDGD en el caos semntico que se ha creado en torno a la biotecnologa, del que hay que culpar no VyOR D OD LJQRUDQFLD GHO FLXGDGDQR VLQR WDPELpQ D OD WRUSH]D GH ORV FLHQWtFRV \ D OD GLFWDGXUD GH los medios de comunicacin. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir de la ciencia, y no a sus espaldas. 7pUPLQRV WDOHV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0V DOLPHQWRV WUDQVJpQLcos, ingeniera gentica, ADN recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos naturales, mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden ni concierto. A estas alturas empieza a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de contribuir a ello. /D GHQLFLyQ GH ELRWHFQRORJtD DEDUFD D WRGDV ODV WHFQRORJtDV PHGLDGDV SRU XQ VHU YLYR R SRU SDUWHV GH pO VHDQ pVWDV FpOXODV R HQ]LPDV DLVODGDV %DMR HVWD GHQLFLyQ VH LQFOX\HQ GHVGH OD propia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricacin de las veinticuatro clases de cerveza mesopotmica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la ltima forma de producir
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insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida para referirse exclusivamente a los ltimos avances basados en la biologa molecular. Para esto ltimo resulta ms adecuado el uso de la expresin biotecnologa molecular. 3UiFWLFDPHQWH OD WRWDOLGDG GH OR TXH SRQHPRV HQ QXHVWUD PHVD KD VLGR JHQpWLFDPHQWH PRGLcado. La domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica de sus genoPDV \ OD PHMRUD JHQpWLFD VXEVLJXLHQWH KD LGR DxDGLHQGR PRGLFDFLRQHV H[WHQVDV \ VXVWDQFLDOHV Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados para ello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos - una modalidad ms de meMRUD JHQpWLFD \ VyOR VLUYH SDUD PRGLFDU XQR R SRFRV JHQHV GH IRUPD PX\ VHOHFWLYD 1R VHUYLUtD para obtener razas de perro tan distintas - en su tamao, morfologa y temperamento - como el Chihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a los mtodos genticos ms tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs slo a los productos de la ingeniera gentica para contraponerlos a los supuestamente naturales. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayora de los organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivir por s mismos en la naturaleza. Es ms, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteraciones JHQpWLFDV TXH OHV SULYHQ GH LQQLGDG GH VXVWDQFLDV QDWXUDOHV TXH VRQ Wy[LFDV R LQKLELWRULDV SDUD HO VHU KXPDQR 8QD YDULHGDG PRGHUQD PRGLFDGD SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HVWi WDQ OHMRV GH VHU natural como las que la precedieron. Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinnimo de inocuo. Se consideran organismos transgnicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingeniera JHQpWLFD R VL VH SUHHUH SRU VDVWUHUtD JHQpWLFD \D TXH ODV RSHUDFLRQHV IXQGDPHQWDOHV GH HVWD va experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN (una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una protena (una secuencia de aminocidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave gentica. Mediante la nueva tecnologa se puede alterar un genoma por la adicin de uno o varios (pocos) genes que previamente no formaban parte de l o por la inutilizacin de uno o varios genes entre los ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminar FDUDFWHUHV LQGHVHDEOHV GHO RUJDQLVPR UHVSHFWLYDPHQWH REMHWLYRV TXH QR GLHUHQ GH ORV GH OD mejora gentica tradicional. (Q OR TXH GLHUHQ OD YLHMD \ OD QXHYD WHFQRORJtD HV HQ HO UHSHUWRULR JpQLFR TXH VH SXHGH PDQHjar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nueYD \ HQ HO PRGR GH LQWURGXFLU \ WUDQVIHULU OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD SRU YtD VH[XDO R SRU DGLFLyQ H[yJHQD WUDQVIRUPDFLyQ UHVSHFWLYDPHQWH /RV RUJDQLVPRV PRGLFDGRV SRU WUDQVIRUPDFLyQ VH suelen denominar transgnicos. Llamar transgnicos a los alimentos derivados de dichos organismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrn, degradado es todo gen que entra por boca de cristiano. Es absurdo llamar transgnico al azcar procedente de una remolacha transgnica, ya que es un producto qumico puro, esencialmente indistinguible del aislado de la remolacha normal o de la caa de azcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todos ORV PpWRGRV REMHWLYRV \ ORJURV GH OD DOWHUDFLyQ JHQpWLFD GH ODV SODQWDV FRQ QHV SUiFWLFRV )DOWDQ en nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra cultura general. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo por un nico autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnologa. De aqu que la aproximacin adoptada en esta obra, segn la cual cada captulo est a cargo de verdaderos especialistas, sea la ms apropiada en la actualidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2004
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Prlogo a la segunda edicin La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto que, hace seis aos, supuso una esSOpQGLGD \ DIRUWXQDGD DSRUWDFLyQ D OD UHFHQVLyQ GH XQ iUHD WHFQRFLHQWtFD HQ YLJRURVD HEXOOLFLyQ \ de gran relevancia prctica. La necesidad de esta edicin surge de mltiples circunstancias, entre ODV TXH FDEH UHVDOWDU HO HQRUPH DYDQFH GHO FRQRFLPLHQWR TXH KD WHQLGR OXJDU OD UHGHQLFLyQ GH ORV UHWRV HQWRQFHV SODQWHDGRV \ OD DSDULFLyQ GH RWURV QXHYRV TXH KDQ GLYHUVLFDGR ORV REMHWLYRV prcticos de la disciplina. Adems, entre la aparicin de la primera edicin y la de esta segunda, ha RFXUULGR XQD FULVLV DOLPHQWDULD VLJQLFDWLYD TXH QR HV VHSDUDEOH GH RWUDV WDOHV FRPR OD HFRQyPLFD la climtica o la energtica. Segn todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores mltiples: la subida del precio del petrleo, el bajo nivel de reservas, la especulacin, el incremento de la poblacin y del consumo per capita, el desvo de una parte sustancial de la produccin agraria hacia la fabricacin de biocombustibles, la disminucin de los rendimientos por el estrs debido al cambio climtico y la falta de inversin en innovacin agropecuaria. Parece como si el xito relativo de las ltimas dcadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la produccin de alimentos ha ido por detrs de la del crecimiento de la poblacin durante la ltima dcada, justo el tipo de comportamiento relativo que propuso Malthus hace ms de dos siglos. En el ltimo medio siglo, ha sido la mejora gentica la TXH KD WHQLGR HO SURWDJRQLVPR WpFQLFR HQ OD GHUURWD GH OD DPHQD]D PDOWXVLDQD \D TXH OD VXSHUcie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia de que no se sabe bien cmo se va a conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un 70-100 % para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar una poblacin proyectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, adems, tendrn una demanda per cpita VLJQLFDWLYDPHQWH VXSHULRU D OD DFWXDO 6L VH TXLHUH ORJUDU GLFKR REMHWLYR KDEUHPRV GH VHU D~Q PiV HFDFHV HQ ODV SUy[LPDV GpFDGDV GH OR TXH OR KHPRV VLGR HQ ODV SUHFHGHQWHV Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni sern exclusivamente tcnicas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrn un importante componente tcnico y es sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climtico est alterando los estreses biticos y abiticos a que deben hacer frente las cosechas, lo que hace prioritaria la investigacin bsica y aplicada tanto en el esclarecimiento de los mecanismos involucrados como en la adaptacin de las cosechas tradicionales a las nuevas condiciones, as como el desarrollo de nuevas cosechas que sean ms apropiadas para condiciones extremas. La crisis energtica ha impulsado un nuevo inters por los biocombustibles, en los que se han centrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulacin de objetivos polticos que pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentacin mundial. As por ejemplo, los objetivos declarados para fechas prximas, tanto por lo EEUU como por la UE, estn determinando una competencia por el suelo agrcola de la generacin de biocombustibles con la produccin de DOLPHQWRV TXH QR SXHGH VLQR HQFDUHFHU VLJQLFDWLYDPHQWH ORV DOLPHQWRV \ DXPHQWDU HO Q~PHUR GH hambrientos en el mundo, as como contribuir a la destruccin de bosque tropical. Por otra parte, La bsqueda de especies y variedades aptas para la produccin de biocombustibles plantea retos formidables a la investigacin de su agronoma y a su mejora convencional y biotecnolgica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edicin de %LRWHFQRORJtD \ 0HMRUDPLHQWR 9HJHWDO ,, PDQLHVWD VX SOHQR SRWHQFLDO \ GHEH DOFDQ]DU VX Pi[Lma funcionalidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2010
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PARTE I Herramientas bsicas
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I - CAPTULO 1 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales

Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland 1 Introduccin El cultivo de tejidos en su acepcin amplia SXHGH VHU GHQLGR FRPR XQ FRQMXQWR PX\ KHWHrogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en XQ PHGLR DUWLFLDO GH FRPSRVLFLyQ TXtPLFD GHQLGD \ VH LQFXED HQ FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV FRQWURODGDV /D LPSUHFLVLyQ GH HVWD GHQLFLyQ puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisOLGRV \ E FXOWLYRV HQ PHGLRV OtTXLGRV ORV TXH a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este FDStWXOR $GLFLRQDOPHQWH VH LQFOX\H HO WHPD GH la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, TXH HV GH JUDQ LPSRUWDQFLD HQ OD PD\RUtD de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:
1. Objetivo del cultivo: VL ELHQ HV GLItFLO WUDWDU GH FODVLFDU ODV DSOLFDFLRQHV TXH VH SHUVLJXHQ FRQ HO FXOWLYR GH WHMLGRV VH SRGUtD HVTXHPDWLzarlas en aplicaciones para: Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos SDUD HVWXGLDU DOJ~Q SURFHVR VLROyJLFR VH puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de FRQWDPLQDFLyQ FRQ PLFURRUJDQLVPRV $ YHFHV se hace uso del cultivo de tejidos porque repreVHQWD XQ VLVWHPD H[SHULPHQWDO TXH VLPSOLFD la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento GH ORV IUXWRV $VLPLVPR HO FXOWLYR GH yYXORV KD sido muy til para estudiar aspectos relacionaGRV FRQ OD IRUPDFLyQ GH ODV EUDV HQ DOJRGyQ El cultivo de discos de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in vitro. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la ELRORJtD GH OD UHSURGXFFLyQ GH OD SODQWD SDUD aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de VHPLOODV VLQWpWLFDV YHU 3DUWH ,9 FDStWXOR HO explante original deber posibilitar la induccin
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de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. 2EWHQFLyQ GH KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo FRPR D\XGD SDUD OD REWHQFLyQ GH KtEULGRV GHULYDGRV GH FUX]DPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV GRQGH se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su GHVDUUROOR &RQ OD PLVPD QDOLGDG WDPELpQ VH utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios 3DUD HVWD QDOLGDG ORV H[SODQWHV SXHGHQ VHU VHPLOODV SRU HM RUTXtGHDV R ELHQ VH DtVODQ ORV HPEULRQHV HQ XQ HVtado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtencin de plantas haploides (consiGHUDQGR FRPR KDSORLGH D XQ HVSRURWR TXH contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero VL OD QDOLGDG GH VX XWLOL]DFLyQ HV OD DSOLFDFLyQ en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad GH H[SODQWHV /RV GH UDtFHV VXHOHQ VHU PX\ utilizados. Obtencin de hbridos somticos. Para esta QDOLGDG VH UHFXUUH D OD IXVLyQ GH SURWRSODVWRV (Q OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VH DtVODQ ORV SURWRSODVWRV GH PHVyORV GH KRMDV \ GH VXVSHQViones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin D PHGLDQR \ ODUJR SOD]R FUtR FRQVHUYDFLyQ FRQ QLWUyJHQR OtTXLGR \ SDUD HO intercambio de material gentico.
Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los culWLYRV D SDUWLU GH H[SODQWHV H[WUDtGRV GH VHPLOODV en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledoQHV UDtFHV. 2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar HO XVR GH H[SODQWHV VXFLRV UDtFHV UL]RPDV que provienen de plantas crecidas en macetas R HQ HO FDPSR GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. 3. (GDG VLROyJLFD. Este es un aspecto de JUDQ LQXHQFLD HQ OD PRUIRJpQHVLV &RPR UHJOD general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor FUtWLFR 6L ORV WHMLGRV VRQ MyYHQHV OD PLFURSURpagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un taPDxR PtQLPR GHO H[SODQWH TXH GHSHQGH GH OD especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropa gacin y que generalmente est asociado al
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grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos KRQJRV OHYDGXUDV EDFWHULDV WRSODVPDV YLrus). El ambiente generado por explante-medio GH FXOWLYRFRQGLFLRQHV ItVLFDV GH LQFXEDFLyQ es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es GLItFLO FXDQWLFDU HO LPSDFWR GH HVWDV SpUGLGDV pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrienWHV GHO PHGLR GH FXOWLYR R ELHQ OR PRGLFDQ (V PX\ GLItFLO FRQVHJXLU FXOWLYRV HVWULFWDPHQWH DVpSWLFRV GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos es altamente probable que los mismos FRQWHQJDQ YLUXV \ WRSODVPDV SRU OR TXH HQ OD SUiFWLFD FXDQGR VH UHHUH D FXOWLYRV DVpSWLFRV HQ JHQHUDO VH TXLHUH VLJQLFDU TXH VRQ cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en OD VXSHUFLH GH ORV H[SODQWHV \ E IDOODV HQ ORV procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin \ SRU RWUR ODGR D\XGD D OD SODQLFDFLyQ GH ORV procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de honJRV ODPHQWRVRV Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmen-
te con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo difeUHQFLDOHV \ WHVW ELRTXtPLFRV HVSHFtFRV Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se traEDMD \ ORV SRVLEOHV FRQWDPLQDQWHV HVSHFtFRV 2) Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con SURGXFWRV TXtPLFRV TXH HOLPLQHQ SDWyJHQRV \ HYHQWXDOHV PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 3URFHGHU D OD GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO GH los explantes mediante el uso de compuestos TXtPLFRV FRQ HO REMHWR GH HOLPLQDU ORV PLFURorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. $OJXQRV SURFHGLPLHQWRV VH EDVDQ HQ HO HPpleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operacioQHV GH GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO HQ XQD FiPDUD de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.
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En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. (QWUH ORV PiV XVDGRV JXUDQ 7ZHHQ 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. ltimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones GH PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 8QR GH HVWRV compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la FDxD GH D]~FDU (VWH FRPSXHVWR TXtPLFDPHQte: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio FRQWHQLHQGR VDFDURVD \ QDOPHQWH VRQ GHVLQfectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o espoUDV 3DUD OD HVWHULOL]DFLyQ HQ OD PD\RUtD GH ORV casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a mi-
croondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, OD HVWHULOL]DFLyQ VH SXHGH KDFHU PHGLDQWH OWUDFLyQ D WUDYpV GH OWURV EDFWHULROyJLFRV No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: /D HVWHULOL]DFLyQ HQ HVWXIDV PHGLDQWH FDORU seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. /D HVWHULOL]DFLyQ FRQ FDORU K~PHGR FRQ YDpor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin). Es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de WUDQVIHUHQFLD FRQ DLUH HVWpULO JDELQHWH GH Xjo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se des-
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infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras GH OD ERFD \ GH OD QDUL] DVt FRPR ORV JRUURV protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben DPHDU FXLGDGRVDPHQWH HQ OD OODPD GH XQ PHFKHUR 7DPELpQ HV QHFHVDULR DPHDU OD ERFD de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo 8Q PHGLR GH FXOWLYR SXHGH VHU GHQLGR como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de UHYLVDU PiV GH WUDEDMRV FLHQWtFRV GHVcriben en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: 8QD IXHQWH GH FDUERQR 1XWULHQWHV PLQHUDOHV 6XVWDQFLDV YLWDPtQLFDV 6XVWDQFLDV UHJXODGRUDV GHO FUHFLPLHQWR $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV semislidos)
Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.

Compuestos Medio bsico MS N6 1.650 1.900 170 440 ----370 ----0,83 ----6,20 22,30 8,60 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 2,00 0,10 0,50 Nicotnico 100,00 30.000,00 5,7
-1- 1. 1
B5 ----2.500 ----150 134 250 150 0,75 10,00 3,00 ----2,00 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 ----10,00 1,00 0,50 100,00 20.000,00 5,5
NH 4NO3 KNO 3 KH 2PO4 CaCl 2.2H 2O (NH4) 2SO 4 MgSO4.7H 2O NaH 2PO 4.4H 2O KI MnSO 4.H2O H 3BO 3 MnSO 4.4H 2O ZnSO 4.7H 2O Na2MoO 4.2H 2O CuSO 4.5H 2O FeSO 4.7H 2O Na2EDTA CoCl 2.6H 2O Glicina Tiamina -HCl Piridoxina -HCl cido 1,00 Mioinositol Sacarosa PH
1)
----2.830 400 166 463 185 ----0,80 ----1,60 4,40 1,50 --------27,85 37,25 ----2,00 1,00 0,50 0,50 ----50.000,00 5,8
Composicin en mgL
MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962) N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C., y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell Res. 50: 151 - 158. 1968)
2WURV FRPSXHVWRV Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente
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altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y FDVHtQD KLGUROL]DGD (V IXQGDPHQWDO TXH HO KLHrro sea incorporado juntamente con un agente TXHODQWH 1D('7$ OR TXH OR KDFH GLVSRQLEOH es un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En OD PD\RUtD GH ORV FDVRV ORV PHGLRV XWLOL]DGRV para el establecimiento de los cultivos conWLHQHQ DX[LQDV $1$ ' $,$ $,% 12$ 'LFDPED 3LFORUDP \R FLWRFLQLQDV %$ .,1 =($ L3 7KLGLD]XUyQ /DV JLEHUHOLQDV HVSHFLDOPHQWH *$ VRQ UHTXHULGDV HQ DOJXQDV ocasiones para el cultivo de meristemas o para OD HORQJDFLyQ GH EURWHV (O $%$ HV XVDGR HQ algunos casos. $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV VHmislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emSOHDUVH $JDUJHO 7UDQVIHUJHO (2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de YDULDGD FRPSRVLFLyQ TXtPLFD VXHOHQ VHU DGLFLRQDGDV D ORV PHGLRV EiVLFRV $GHPiV GH OD glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparaJLQD \ FLVWHtQD DXQTXH KD\ TXH WHQHU SUHVHQWH que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos RUJiQLFRV FRPR HO PiOLFR HO FtWULFR HO SLU~YLFR \ HO VXFFtQLFR \ HV IUHFXHQWH HO HPSOHR GH /JOXWDPLQD \ GH FDVHtQD KLGUROL]DGD $~Q KR\ se siguen utilizando ciertos componentes de FRPSRVLFLyQ TXtPLFD QR ELHQ GHQLGD FRPR HO
agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes /FLVWHtQD iFLGR DVFyUELFR SROLYLQLOSLUUROLGRna) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describen detalladamente este punto. 5. Condiciones incubacin. ambientales para la
La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo meQRV HQ OR TXH VH UHHUH D WHPSHUDWXUD FDOLGDG H LQWHQVLGDG GH OX] IRWRSHUtRGR KXPHGDG DWmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire DFRQGLFLRQDGR IUtRFDORU \ XQD EXHQD \ XQLforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz HV JHQHUDOPHQWH SURYLVWD SRU OiPSDUDV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD FRQ XQD LUUDGLDQFLD GH HQWUH \ PRO PV /D KXPHGDG DWmosfrica debe ser elevada (80- 90%). 6 Aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro. 'XUDQWH HO SHUtRGR GH LQFXEDFLyQ ORV FXOWLYRV VRQ H[SXHVWRV D FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV GLVtmiles al ambiente externo. La atmsfera interna se caracteriza por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura consWDQWH H LQWHQVLGDG OXPtQLFD EDMD $ VX YH] HO medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas hetertrofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento,
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sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatPLFDV \ VLROyJLFDV TXH ODV SODQWDV GHEHUiQ corregir cuando son transferidas al ambiente H[WHUQR (VWH SHUtRGR GH DGDSWDFLyQ DO QXHYR hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo WLHPSR HVWLPXODU OD IRWRVtQWHVLV FRQ HO REMHWR GH generar un rpido crecimiento de los plantines. (O UHWUDVR HQ HO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXOD \ OD escasa funcionalidad del aparato estomtico TXH SUHVHQWDQ ODV KRMDV GH OD PD\RUtD GH ODV especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El control de este SURFHVR VLROyJLFR HV GH YLWDO LPSRUWDQFLD GXrante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los estomas, DVt FRPR WDPELpQ GHO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXla. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de $%$ KRUPRQD LQYROXFUDGD HQ HO FRQWURO GHO FLHrre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa VHPLSHUPHDEOH HQ OD VXSHUFLH GH OD KRMD (Q este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reDFFLRQHV GH WRWR[LFLGDG Resulta imprescindible evitar la exposicin a temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel
del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de OX] QDWXUDO HV EDMR \ ORV GtDV VRQ FRUWRV GXrante una parte considerable del ao, la luz arWLFLDO SXHGH VHU DSOLFDGD FRPR FRPSOHPHQWR GH OD OX] QDWXUDO /DV OiPSDUDV WXEXODUHV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD VRQ HPSOHDGDV HQ KRUWLFXOWXUD SDUD SURORQJDU HO IRWRSHUtRGR $VLPLVPR ODV OiPSDUDV WXEXODUHV GH VRGLR DOWD presin presentan una distribucin espectral GH OD HQHUJtD DGHFXDGD SDUD HVWLPXODU IRWRVtQWHVLV \ VH HPSOHDQ SDUD WDO Q HQ XQD DPSOLD variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal creciPLHQWR \ GHVDUUROOR GH ODV UDtFHV 6H SXHGH HPplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a travs del substrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporcioQHV ULFDV HQ IyVIRUR 13. \ SRWDVLR 13. TXH IDYRUHFHUiQ HO GHVDUUROOR UDGLFXODU \ OD UXVWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV En todo momento deber realizarse un riguURVR FRQWURO WRVDQLWDULR HPSOHiQGRVH DQWLELyWLcos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste. Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que FRQWLHQH JUiQXORV GH DUFLOOD H[SDQGLGD D Q GH facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de PXOWLSOLFDFLyQ DVt FRPR WDPELpQ SDUD HO HQUDL]DPLHQWR FRQYHQFLRQDO D UDt] GHVQXGD de estacas de tallos u hojas.
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La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima GH OD WXEHUtD GH ULHJR (O VLVWHPD KXPLGLcador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remaQHQWH HQ ODV FDxHUtDV HO VLVWHPD FRQVWD GH una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que, conjuntamente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal.
'HELGR D OD ODWLWXG JHRJUiFD HQ TXH VH HQcuentra, la cmara est equipada con un aconGLFLRQDGRU GH DLUH IULJRUtDV SDUD HYLWDU situaciones de estrs trmico en poca estival. $ VX YH] \ GDGR TXH OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase area.
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7. Agradecimientos. /RV DXWRUHV DJUDGHFHQ DO ,QJ 3DEOR $ /XQD SRU OD SODQLFDFLyQ GLJLWDO GH OD FiPDUD GH DFOLPDWDFLyQ $ OD 6HFUHWDUtD *HQHUDO GH &LHQFLD y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La CaFKXHUD SRU HO DSRUWH QDQFLHUR UHFLELGR SDUD construir la misma. 8. Lecturas Recomendadas
*(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg. *(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25*( 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. +857$'2 '9 \ 0(5,12 0( &XOWLYR GH Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora *HQpWLFD GH 3ODQWDV SRU %LRWHFQRORJtD ,QVWLWXWR GH %LRORJtD GH 3ODQWDV6DQWD &ODUD &XED pg. 326326,/29$ - , 7,&+$ 3 .$'/(&(. ' +$,6(/ 6 3/=$.29$ $FFOLPDWL]DWLRQ of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497. 52&$ :0 \ /$ 052*,16., VHJXQGD HGLFLyQ &XOWLYR GH WHMLGRV HQ OD $JULFXOWXUD )XQGDPHQWRV \ DSOLFDFLRQHV &,$7 &DOL &RORPbia, 970 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg.
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I - CAPTULO 2 Morfognesis
Silvia Radice 1.- Introduccin La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas, mientras que por organogQHVLV SXHGHQ REWHQHUVH WDOORV UDtFHV R RUHV Estos rganos son inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que, segn las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoUtD GH TXH WRGDV ODV FpOXODV YHJHWDOHV WLHQHQ la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular. Los medios de cultivo que empleaba no LQFOXtDQ UHJXODGRUHV GHO FUHFLPLHQWR GHELGR D que esos compuestos eran an desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales IXHURQ PX\ OHQWRV HQ VXV LQLFLRV (Q :KLte pudo mantener, en forma ilimitada, el creciPLHQWR GH UDtFHV HQ PHGLRV OtTXLGRV D SDUWLU GH iSLFHV GH WRPDWH $O PLVPR WLHPSR VH LGHQWLFy HO iFLGR LQGRO DFpWLFR $,$ TXH SRVLELOLWy HO PDQWHQLPLHQWR LQGHQLGR GH FDOORV GH ]Dnahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia GH XQD UHJXODFLyQ TXtPLFD HQ OD SDUWH DpUHD \ HQ OD UDt] 7UDEDMRV SRVWHULRUHV HQ FDOORV GH OD misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron GHPRVWUDU TXH OD GLIHUHQFLDFLyQ GH EURWHV UDtces o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.
7LSRV GH PRUIRJpQHVLV 'HQLFLRQHV En condiciones de cultivo in vitro, las clulas somticas pueden regenerar embriones (Fig R EURWHV UDtFHV \R RUHV )LJ FRPR UHVSXHVWD D XQ GHWHUPLQDGR HVWtPXOR /D UHJHQHracin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis citadas. De .OHUN \ FRODERUDGRUHV HQ GHQRPLQDURQ a estas diferentes fases como adquisicin de la competencia; fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase, las clulas no responGHQ DO HVWtPXOR RUJDQRJpQLFR SHUR DGTXLHUHQ esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de inGXFFLyQ ODV FpOXODV VRQ UHFHSWLYDV DO HVWtPXOR morfognico y hay una relacin directa con el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. $ SDUWLU GH OD VLHPEUD in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa, sin la formacin de callo. Si la formacin es GH EURWHV UDtFHV R RUHV VH GHQRPLQD organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa (Figs. 1 y 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares (Figs. $ \ /D GLIHUHQFLDFLyQ GH yUJDQRV D SDUWLU de callos, denominada morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. Morfognesis directa o indirecta fueron trminos propuestos por Hicks en1980. 3.- Histologa de la morfognesis Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado,
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Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de %$3 B-D-F, embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$ PJ O-1 GH .LQ FRQ XQD SUHYLD LQGXFFLyQ HQ 06 + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.
D SDUWLU GH XQD FpOXOD HSLGpUPLFD R GHO PHVyOR IROLDU FRPR RFXUUH HQ ODV FRQtIHUDV VH VXFHGHQ XQD VHULH GH GLYLVLRQHV PLWyWLFDV $Vt VH pueden observar, a travs del estudio histolgico, pequeas masas de clulas que contienen citoplasma denso y grandes nucleolos. Este conjunto de clulas, agrupadas a modo de esferas, fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son responsables de la dife-
renciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa, a partir de clulas diferenciadas pertenecientes a un explante cultivado in vitro, o indirectamente, a partir de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celuODU )LJ $ 6X HYROXFLyQ GHWHUPLQDUi HO FUHcimiento de un rgano, por ejemplo una yema adventicia (Fig 4 B).
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Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp $QGUp 5HKGHU FXOWLYDGD HQ 06 PJ O-1 de picloran. B ,QLFLR GH EURWHV HFKDV HQ KRMDV crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$ PJ O-1 de .LQ C, Brotes de Gerbera jamesonii %ROXV REWHQLGRV D SDUWLU GHO FXOWLYR GH FDStWXORV RUDOHV HQ 06 mg l-1 GH ,%$ PJ O-1 GH %$3 PJ O-1 GH *$3. D EURWHV RUHFLGRV in vitro de Abelia sp $QGUp Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 GH %$3 E UDtFHV HFKDV FUHFLGDV GH FDOOR GH Abelia sp $QGUp 5Hhder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las reglillas representan 5 mm
Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeos granos de almidn. Estas clulas, que en general se agrupan, pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un gru-
po de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincronizado. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio GH FXOWLYR $TXHOODV FpOXODV TXH QR GHVDUUROODQ proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir se vacuolizan, disminuye
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noso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin globular. Previo a esta polarizacin se deposita almidn, luego se forma la epidermis \ DGTXLHUH VLPHWUtD ELODWHUDO 6XFHVLYDPHQWH VH observa el crecimiento de uno o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de tallo y XQD SURJUHVLYD DFXPXODFLyQ GH DOPLGyQ OtSLGRV \ SURWHtQDV En el caso de un origen multicelular de los embriones somticos pueden observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comnmente budding o embriognesis adventicia. Estas clulas pequeas tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo voluminoso que se tie fuertemente. Se diferencian de las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente divisin celular. Estas estructuras se denominan proembriones JOREXODUHV )LJ $ % (Q una etapa posterior desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somticos que presentan pices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de un embrin cigtico. En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazn que Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfognicos obtenidos se corresponde con la adquia partir de la siembra in vitro GH GLIHUHQWHV H[SODQWHV /DV OtQHDV FRQtinuas expresan organognesis o embriognesis directa mientras que VLFLyQ GH OD VLPHWUtD ELODWHUDO ODV OtQHDV TXHEUDGDV LQGLFDQ TXH OD PRUIRJpQHVLV VH REWLHQH SRU YtD desarrollo de la epidermis, el volumen de ncleo y nucleolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se PRGLFDQ ODV FRQGLFLRQHV GH FXOWLYR (Q JHQHral, cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o se elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que estas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos condiciones ontognicas diferentes, es decir que el origen de los embriones sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una clula, la PLVPD VH DtVOD GH ODV GHPiV SRU XQD LPSRUWDQWH PRGLFDFLyQ HQ VX SDUHG FHOXODU HQ SDUWLFXODU SRU OD JHOLFDFLyQ GH OD ODPLQLOOD PHGLD (VWD clula, rodeada por un polisacrido mucilagiindirecta.
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Figura 4: A-E Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A PHULVWHPRLGHV HFKDV observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 GH $,$ PJ O-1 GH %$3 [ B, yemas DGYHQWLFLDV HFKDV HQ iSLFHV GH Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 GH ,%$ mg l-1 GH %$3 PJ O-1 GH *$3 4 x. C JUXSR GH FpOXODV HPEULRJpQLFDV HFKDV HQ Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D, embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E, embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.
de los estratos procambiales y de manera sucesiva el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde, durante la etapa cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de
OD UDt] \ DO SURFDPELXP HQ UHVSXHVWD D OD HORQgacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que ORV FLJyWLFRV FRPR DVt WDPELpQ OD SURGXFFLyQ de sustancias de reserva.
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Sin el seguimiento histolgico detallado, la formacin del embrin somtico slo puede ser FRQUPDGD SRU OD JHUPLQDFLyQ )LJ ) 6LQ embargo, debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Comparados con los embriones cigticos de la misma especie, los embriones somticos frecuentemente desarrollan de manera anormal R VRQ LQPDGXURV /D DQRPDOtD PiV IUHFXHQWHmente encontrada es la formacin doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del meristema apical o una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas en los embriones somticos de algunas especies no GHEH VHU WRPDGD FRPR XQD DQRUPDOtD (VWR SXHGH VHU XQ VtQWRPD GH LQPDGXUH] GHELGR a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar. 4.- Factores que afectan los procesos morfognicos Los cuatro principales factores que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos in vitro son: 4.1.- el genotipo 4.2.- las FRQGLFLRQHV TXtPLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.3.- las FRQGLFLRQHV ItVLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.4.- el explante. 4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos, desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rga-
nos. Por esta causa, no es posible generalizar PHWRGRORJtDV R SURWRFRORV GH WUDEDMR GHELGR D TXH ORV PHGLRV GH FXOWLYR DVt FRPR ODV FRQGLciones de cultivo seleccionados, deben ser esSHFtFRV SDUD FDGD VLWXDFLyQ HQ SDUWLFXODU 8Q ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp and Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones cigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar "Pinot Noir". 9DULRV VRQ ORV FRPSXHVWRV TXtPLFRV TXH LQX\HQ HQ ORV SDWURQHV PRUIRJpQLFRV in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 4.2.1.- la composicin salina del medio de cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis GLUHFWD R LQGLUHFWD HQ OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones morfognicos. Existe adems una estrecha relacin entre la composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis an cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones ptimas de cultivo SXHGHQ DXPHQWDU VLJQLFDWLYDPHQWH OD GLIHrenciacin de rganos. Para la induccin de embriones somticos en muchas especies vegetales es necesario el agregado de auxinas, como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para otras, como es el caso del crotn (Codiaeum variegatum HV VXFLHQWH FRQ HO DJUHJDGR GH thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 4.2.3.- antibiticos. En procesos de transformacin con Agrobacterium tumefaciens es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de la bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se encontr que 250 mg L1 de cefotaxime DXPHQWDQ VLJQLFDWLYDPHQWH OD UHJHQHUDFLyQ de brotes mientras que 500 mg L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la
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kanamicina inhibe los procesos morfognicos. 4.2.4.- carbn activado. En general se usa para adsorber compuestos txicos de la micro atmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo pero (. 3HWWHUVVRQ \ VX HTXLSR GH FRODERUDGRUHV GH OD 6ZHGLVK 8QLYHUVLW\ RI $JULFXOWXUH GHPRVWUDURQ que puede promover la embriognesis somtica debido a la incorporacin de ciertos compuestos al medio de cultivo por difusin. 4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. 3XHGH HPSOHDUVH FRPR VHPLVyOLGR R OtTXLGR (O DJHQWH JHOLFDQWH PiV XWLOL]DGR HQ HO FXOWLYR in vitro HV HO DJDU H[WUDtGR GH GLYHUVDV DOJDV PDrinas. Las diferentes calidades existentes en el PHUFDGR PRGLFDQ OD H[SUHVLyQ PRUIRJpQLFD debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de $,$ PJ/ GH %$3 FX\D UHVSXHVWD PRUIRJpQLca vari segn el tipo de agar utilizado. Cuando HO JHOLFDQWH HPSOHDGR IXH &KXEXWDJDU GH SURduccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con HO DJUHJDGR GH DJDU 6,*0$ R slo se indujo la proliferacin de callo. (Q FDVR GH VHOHFFLRQDU PHGLRV GH FXOWLYR OtTXLGRV OD UHVSXHVWD PRUIRJpQLFD REVHUYDGD YDUtD GH PDQHUD FRQVLGHUDEOH (O FXOWLYR OtTXLGR HV LPprescindible cuando se busca promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos HQ PHGLR OtTXLGR FRQ DJLWDFLyQ SDUD SHUPLWLU TXH las clulas se disgreguen y puedan diferenciar UDtFHV EURWHV R HPEULRQHV VRPiWLFRV HQ IRUPD aislada. /D HOHFFLyQ GH XQ PHGLR GH FXOWLYR OtTXLGR R slido depende, adems, de la especie con la que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se KD REVHUYDGR TXH HO HPSOHR GH PHGLR OtTXLGR promueve una mayor diferenciacin de protoFRUPRV UHVSHFWR GHO PLVPR JHOLFDGR $ VX YH] este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos, mientras que en medio de cultivo geOLFDGR VH REVHUYy TXH ORV SURWRFRUPRV WLHQGHQ a formar tallos. 4.2.6.- atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y esta con-
dicionada por el tipo y tamao del envase selecFLRQDGR SDUD HO FXOWLYR DVt FRPR WDPELpQ SRU HO sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro YDUtDQ GHVGH HO WDSyQ GH DOJRGyQ SDSHO GH DOXPLQLR SHOtFXOD GH UHVLQLWH WUDQVSDUHQWH R WDSDV UtJLGDV GH SROLSURSLOHQR (O intercambio gaseoso es diferente para cada tipo de tapa, en consecuencia la atmsfera interna tambin sufrir variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 GH QLWUyJHQR GH R[tJHQR \ GH dixido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado adems, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. (O QLYHO GH R[tJHQR GLVSRQLEOH SDUD HO H[SODQWH condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita una buena aireacin para obtener cualquier tipo de proceso morfognico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriognicas cuando la solucin se VDWXUD FRQ GH R[tJHQR 3RU HO FRQWUDULR XQD WHQVLyQ GH R[tJHQR GHO HVWLPXOD OD SURGXFcin de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentracin de dixido de carbono (CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro YDUtD VHJ~Q OD UHVpiracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa empleados. Concentraciones superiores al 1 %, que son generalmente txicas en condiciones in vivo, probablemente no fueron limitantes para la actividad fotosinttica. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulacin tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de clulas, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro YDUtD FRQ OD HVSHFLH HO WLSR GH explante, la concentracin de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a travs de la esterilizacin del material de diseccin realizada con el material embebido HQ DOFRKRO \ DPHDGR FRQ PHFKHUR %XQVHQ (Q muchos casos el etileno acta como promotor de la morfognesis pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados
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(QWUH ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV SRGHPRV PHQcionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 4.3.1.- La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones naturales las plantas exSHULPHQWDQ GLIHUHQFLDV WpUPLFDV GXUDQWH HO GtD \ la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observ que la regeQHUDFLyQ PD\RU GH EURWHV VH SURGXFtD D & mientras que por encima de los 30 C, prcticamente no se observ diferenciacin. 4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros ItVLFRV D WHQHU HQ FXHQWD /D +5 GHSHQGHUi GHO sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un intercambio gaseoso la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso de la HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comunicacin personal). 4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad \ SHUtRGR GH VXPLQLVWUR /D UHVSXHVWD PRUIRJpnica de un explante puede variar segn si se le proporciona luz o no. Para estimular la formacin GH FDOOR HV FRP~Q TXH VH SUHHUD OD RVFXULGDG El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos. 4.4.- Tal como ya se seal anteriormente, los proceso morfognicos dependen del genotipo, pero a esto debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV \ VLROyJLFDV HQ ODV TXH sta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarn a su vez la respuesta morfognica en condiciones in vitro. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada en hojas de Camellia japonica
cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la lmina utilizada (Pedroso y Pais, 1993). Estos investigadores cultivaron estas hojas in vitro durante seis semanas previa inmersin GHO H[SODQWH HQ XQD VROXFLyQ GH ,%$ PJ O1) durante 20 minutos (Fig 5).
Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn la porcin de la lmina. 1, callo organognico. 2 embriognesis somtica directa. 3, regeneraFLyQ GLUHFWD GH UDtFHV FDOOR RUJDQRJpQLFR
Lecturas recomendadas
%XGGHQGRUI-RRVWHQ -0& DQG :ROWHULQJ (- 1994. Components of the gaseous environment DQG WKHLU HIIHFWV RQ SODQW JURZWK DQG GHYHORSPHQW LQ YLWUR 3ODQW *URZWK 5HJXODWLRQ 'H .OHUN *- $UQKROGW6FKPLWW % /LHEHUHL 5 DQG 1HXPDQQ .+ 5HJHQHUDWLRQ RI URRWV shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaa. 1361pp. Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23. :LOOLDPV (* DQG 0DKHVZDUDQ * 6RPDWLF HPEU\RJHQLF IDFWRUV LQXHQFLQJ FRRUGLQDWHG EHKDYLRU RI FHOOV DV DQ HPEU\RJHQLF JURXS $QQ Bot. 57: 443-597.
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I - CAPTULO 3 La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales

Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; *HUPiQ 5REOHGR $YHOLDQR )HUQiQGH] 9LYLDQD * 6ROtV 1HIID 1 Introduccin La comprensin de la organizacin de los genomas lograda a travs del anlisis citogentico ha tenido un gran impacto en la evaluaFLyQ \ XWLOL]DFLyQ GH OD ELRGLYHUVLGDG DVt FRPR HQ HO PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR \ OD LQJHQLHUtD JHntica, en particular, desde el desarrollo de las tcnicas de citogentica molecular. El empleo VRQGDV GH $'1 \ GH DQWLFXHUSRV FRQMXJDGRV FRQ XRURFURPRV HQ XQ Q~PHUR FUHFLHQWH GH especies vegetales ha permitido, entre otros loJURV OD ORFDOL]DFLyQ GH VHFXHQFLDV HVSHFtFDV OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV SDUWLFXODUHV HO estudio del origen y la estructura de los genoPDV GH KtEULGRV \ SROLSORLGHV OD FRPSDUDFLyQ de regiones genmicas homlogas, el estudio del comportamiento cromosmico y el anlisis de la expresin gnica. Por ello, las tcnicas de hibridacin in situ (ISH) e inmunocitogentica constituyen actualmente herramientas indispensables para la comprensin de la organizacin y la expresin del genoma de las plantas. (Q HVWH FDStWXOR VH GHVFULEHQ HQ SULPHUD instancia, algunos de los criterios empleados tradicionalmente para la caracterizacin carioWtSLFD \ SRVWHULRUPHQWH VH SUHVHQWDQ ORV SULQcipios y las aplicaciones de diferentes tcnicas de hibridacin in situ de cidos nucleicos y de LQPXQRGHWHFFLyQ GH PRGLFDFLRQHV HSLJHQpWLcas de nucletidos e histonas. 2 Citogentica clsica La caracterizacin cromosmica de especies o variedades de plantas se inicia con la descripcin del cariotipo a travs del anlisis del nmero, el tamao y la forma de los cromosomas que presentan (complemento cro-
mosmico). Esta caracterizacin se realiza en metafase mittica debido a que, en esta fase, los cromosomas han alcanzado su mxiPR JUDGR GH FRQGHQVDFLyQ \ VXV OtPLWHV HVWiQ SHUIHFWDPHQWH GHQLGRV 3DUD HVWH DQiOLVLV JHneralmente se emplean tejidos meristemticos porque presentan un alto ndice mittico (i.e. la razn entre el nmero de clulas en divisin y el nmero total de clulas observadas). Los rganos (pices radicales o caulinares, vulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias que inhiben la formacin del huso mittico (colFKLFLQD KLGUR[LTXLQROHtQD SDFORVRO HWF D los efectos de acumular metafases, dispersar los cromosomas en el citoplasma y producir una mayor condensacin de los mismos. Los PDWHULDOHV VH MDQ \ OXHJR VH WLxHQ FRQ FRORUDQWHV QXFOHDUHV IXFVLQD EiVLFD RUFHtQD FDUPtQ JLHPVD HWF )LQDOPHQWH VH FRQIHFFLRnan los preparados por macerado y aplastado (squash) del material sobre un portaobjetos. Con estos mtodos de tincin, los cromosomas metafsicos observados con un microscopio ptico aparecen uniformemente teidos, excepto en el centrmero (constriccin primaria) y en algunas constricciones menores (secundarias). Mediante la observacin microscpica se determina el nmero cromosmico somtico (2n) y, a travs del anlisis de microfotograItDV R GLEXMRV GH PHWDIDVHV FRQ FURPRVRPDV ELHQ GHQLGRV \ VHSDUDGRV )LJ $ VH HVWDblecen los cariotipos. Para ello, se analiza la morfologa de los cromosomas determinando la posicin del centrmero y la longitud de los brazos corto (bc) y largo (bl DVt FRPR la longitud total (lt GH FDGD FURPRVRPD $ partir de estas medidas, se calcula el ndice centromrico [IC = (bc / lt) 100], segn el FXDO ORV FURPRVRPDV VH FODVLFDQ HQ FXDWUR WLpos morfolgicos: metacntricos (m, IC = 50 37,5), submetacntricos (sm, IC = 37,5 - 25), subtelocntricos (st, IC = 25-12,5), acrocntricos (t, IC = 12,5 - 0) y telocntricos (T, IC = 0). Otro aspecto a considerar para caracterizar morfolgicamente a los cromosomas es la presencia y la posicin de las constricciones VHFXQGDULDV DVt FRPR OD SUHVHQFLD \ HO WLSR de satlites. En general, las primeras corresponden a regiones organizadoras de los nu-
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cleolos (NORs) y los ltimos a las porciones cromosmicas distales delimitadas por la constriccin secundaria y el telmero de los brazos que los portan. Los cromosomas que presentan satlites se denominan cromosomas SAT )LJ $ ( \ ) Para la confeccin del cariotipo los cromosomas del complemento se ordenan segn su PRUIRORJtD GH PHWDFpQWULFRV D VXEPHWDFpQWULcos, subtelocntricos, acrocntricos y telocn-
tricos) y, dentro de cada tipo, segn su tamao (de mayor a menor) ubicando los centrmeros alineados a una misma altura y los brazos cortos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig. 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se compone de pares de cromosomas homlogos; mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D y F) se compone de grupos de tres o ms croPRVRPDV GH DFXHUGR FRQ HO QLYHO GH SORLGtD El orden que ocupa en el cariotipo cada par o
FIGURA 1. A-D: Metafases mitticas teidas con coloracin de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x = ODV HFKDV VHxDODQ ORV VDWpOLWHV GH ORV FURPRVRPDV 6$7 B: Oziroe argentinensis [citada en Fernndez y Davia (1991) como )RUWXQDWLD ELRUD], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimtrico. C y D: Turnera sidoides subsp. SLQQDWLGD, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramas de los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. SLQQDWLD ilustrados en C y D, respectivaPHQWH (Q JULV VH UHSUHVHQWDQ ORV VDWpOLWHV GH ORV FURPRVRPDV 6$7 /D EDUUD UHSUHVHQWD PLFUDV HQ $ \ B, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F.
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grupo de cromosomas se indica mediante un nmero y, mediante una letra, el tipo cromosmico al que pertenece de acuerdo a su morfoORJtD /D UHSUHVHQWDFLyQ JUiFD GHO FDULRWLSR VH denomina idiograma (Fig. 1E y F). La composicin de un complemento cromosmico tambin se puede expresar mediante una frmula cariotpica, en la que se indica el nmero de cada tipo morfolgico de cromosomas que presenta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm + 2 st + 2 t). Entre los parmetros cuantitativos ms utilizados para caracterizar los cariotipos se encuentra el grado de asimetra que presentan los mismos. Para ello, se emplean categoras o ndices de asimetra cromosmica que consideran las diferencias de tamao entre los cromosomas del cariotipo (asimetra intercromosmica), y las diferencias morfolgicas de los cromosomas derivadas de la proporcin entre sus brazos (asimetra intracromosmica). Un cariotipo simtrico es aquel cuyos cromosomas son aproximadamente del PLVPR WDPDxR \ HQ VX PD\RUtD PHWDFpQWULFRV mientras que uno asimtrico es aquel que presenta cromosomas de diferentes tamaos y predominantemente submetacntricos, acrocntricos o telocntricos (Fig. 1B). La informacin obtenida a partir del anlisis de los carioWLSRV SHUPLWH LGHQWLFDU FURPRVRPDV FODVLFDU los cariotipos, realizar anlisis comparativos entre grupos de especies ms o menos relacionadas e inferir sus tendencias evolutivas. $VLPLVPR SHUPLWH GHWHFWDU ODV DQRPDOtDV QXmricas y estructurales en los complementos cromosmicos de clulas o individuos. En numerosos grupos de plantas, la identiFDFLyQ GH ORV GLIHUHQWHV SDUHV GH KRPyORJRV del cariotipo puede resultar engorrosa debido D TXH SUHVHQWDQ FURPRVRPDV FRQ PRUIRORJtD muy similar. En estos casos, la aplicacin de determinados tratamientos en combinacin con diferentes tipos de tincin, puede revelar regiones cromosmicas con condensacin o FRPSRVLFLyQ FURPDWtQLFD GLIHUHQFLDO bandas), generando marcadores cromosmicos adicioQDOHV $Vt HO WUDWDPLHQWR GH ORV FURPRVRPDV con un lcali y la posterior tincin con Giemsa revela regiones de heterocromatina constitutiva, mientras que la impregnacin argntiFD EDQGHR $J125 UHYHOD ODV NORs activas
)LJ $ $GHPiV SXHGHQ XWLOL]DUVH GLYHUVRV XRURFURPRV TXH WLHQHQ OD FDSDFLGDG GH LQWHUFDODUVH SUHIHUHQWHPHQWH HQ UHJLRQHV GHO $'1 con una composicin de bases particular. Por ejemplo, las regiones ricas en adenina y timina VRQ UHYHODGDV FRQ '$3, (4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato) o quinacrina, mientras que ODV ULFDV HQ JXDQLQD \ FLWRVLQD OR VRQ FRQ &0$3 FURPRPLFLQD $3). Las bandas pueden ser de tamao e intensidad diferentes y presentar una distribucin particular sobre los cromosomas de un complemento generando un patrn de bandeo FDUDFWHUtVWLFR )LJ % (VWDV WpFQLFDV de bandeo cromosmico han permitido, en PXFKRV FDVRV OD LGHQWLFDFLyQ LQHTXtYRFD GH cromosomas homlogos, la caracterizacin de JHQRPDV DVt FRPR HO VHJXLPLHQWR GH FURPRVRPDV R EORTXHV FURPRVyPLFRV HQ KtEULGRV \ OtQHDV GH LQWURJUHVLyQ La diferenciacin lineal de los cromosomas por tcnicas de bandeo no siempre es evidente en todos los grupos de plantas y, an en aquellas especies que presentan buenos patrones de bandas, a menudo no se cuenta con XQ Q~PHUR VLJQLFDWLYR GH PDUFDGRUHV FRPR para integrar los mapas de ligamiento con los PDSDV ItVLFRV /D SRVLELOLGDG GH SRVLFLRQDU VHcuencias particulares sobre los cromosomas y, de esta forma, generar un gran nmero de marcadores cromosmicos ha sido posible gracias al desarrollo de las tcnicas de hibridacin in situ, cuyo uso se ha generalizado a partir del desarrollo de sistemas de marcado y de deteccin de sondas no radiactivas. +LEULGDFLyQ LQ VLWX XRUHVFHQWH ),6+ Esta tcnica se basa en reacciones de reconocimiento y asociacin de bases entre un VHJPHQWR GHO $'1 FURPRVyPLFR secuencia blanco) y una secuencia complementaria marcada (sonda). La misma se aplica a preparaciones de clulas somticas o germinales, previamente incubadas con enzimas (celulasa, pectinasa y citohelicasa) que remueven las paredes celulares. Las preparaciones son traWDGDV FRQ $51DVD $ SDUD HYLWDU KLEULGDFLRQHV LQHVSHFtFDV GH OD VRQGD FRQ $51V \ SRVWHriormente, son permeabilizadas mediante la incubacin con proteasas. Las sondas pueden
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ser marcadas con nucletidos unidos a hapteQRV GLJR[LJHQLQD ELRWLQD HWF R D XRURFURmos (Cy3, Cy5, etc.) por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por una transferasa terminal o por medio de la actividad exonuFOHRWtGLFD \ GH OD VXEVLJXLHQWH SROLPHUL]DFLyQ UHDOL]DGDV SRU OD $'1 SRO , D SDUWLU GH HVFLVLRQHV VLPSOHV FDXVDGDV SRU XQD $'1DVD nick translation). La sonda marcada, componiendo una mezcla de hibridacin que contiene formaPLGD \ $'1 EORTXHDQWH HQWUH RWURV FRPSRnentes) es colocada sobre las preparaciones cromosmicas, para luego realizar una desnaturalizacin FRQMXQWD GHO $'1 GH ORV FURPRVRPDV \ GH OD VRQGD D WHPSHUDWXUDV TXH YDUtDQ entre 70 C y 90 C durante unos 10 minutos. Posteriormente, los preparados son incubados a 37 C durante al menos 1 hora (normalmente WRGD OD QRFKH D Q GH LQGXFLU OD hibridacin. En este paso, la sonda y la secuencia cromosmica complementaria al blanco compiten enWUH Vt SHUR GHELGR D OD DOWD FRQFHQWUDFLyQ GH la primera y a su menor tamao, bajo condiciones ptimas, la sonda hibrida en todos los sitios complementarios a lo largo de los cromosomas. En el caso de las sondas marcadas con haptenos, la deteccin de los sitios de hibridacin se realiza mediante una o dos rondas GH DQWLFXHUSRV FRQMXJDGRV FRQ XRURFURPRV Los preparados se analizan con microscopios GH HSLXRUHFHQFLD XWLOL]DQGR OWURV HVSHFtFRV SDUD FDGD XRURFURPR UHJLVWUDQGR OD presencia, el tamao y el Q~PHUR GH VHxDOHV XRrescentes por complemento. Normalmente, VH REWLHQH XQD PLFURIRWRJUDItD PRQRFURPiWLFD por cada sonda utilizada y una del complemenWR FURPRVyPLFR WHxLGR FRQ '$3, R LRGXUR GH SURSLGLR (VWDV PLFURIRWRJUDItDV VRQ VXSHUpuestas e integradas en una sola imagen. El posicionamiento relativo de las seales con respecto al centrmero, los telmeros u otros marcadores cromosmicos permite mapear con precisin cada sonda sobre el complemento cromosmico y representarlas en un idiograPD $ GLIHUHQFLD GH OD FLWRJHQpWLFD FOiVLFD OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV R GH VHJPHQWRV cromosmicos particulares usando sondas de ),6+ HV LQGHSHQGLHQWH GH OD PRUIRORJtD FURPRsmica y, por lo tanto, es posible reconocerlos en diferentes estados del ciclo celular.
Desde el desarrollo inicial de la tcnica de FISH, se han mejorado sustancialmente tanto la sensibilidad LH HO WDPDxR PtQLPR GH XQD secuencia que puede ser detectada bajo el microscopio) como el poder de resolucin espacial LH OD GLVWDQFLD ItVLFD PtQLPD D OD TXH GRV VHFXHQFLDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV FRPR independientes). Bajo condiciones ptimas de hibridacin y de deteccin, la sensibilidad de esta tcnica depende de la accesibilidad de la sonda a la regin complementaria sobre el $'1 /D PLVPD D VX YH] HVWi GHWHUPLQDGD por el grado de condensacin de la cromatina. El xito de FISH se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a las tcnicas clsiFDV SDUD LGHQWLFDU KRPRORJtDV \ VREUH WRGR D OD SRVLELOLGDG GH FRQWDU FRQ XQD DPSOLD EDWHUtD de sondas disponibles de acuerdo con la naturaleza de la secuencia blanco que se quiera detectar. En general, se pueden utilizar sondas de $'1 GH copia nica, moderadamente repetitivo o altamente repetitivo. Las secuencias repetitivas pueden ser conservadas o variables y estar dispuestas en tndem (i.e. una copia est seguida de otra en arreglos de decenas D PLOHV GH FRSLDV IRUPDQGR XQ ORFXV GHQLGR o dispersas (i.e. las repeticiones pueden estar dispuestas a lo largo de una regin cromosmica, de algunos cromosomas o de todo el complemento). Entre las secuencias repetitivas, las sondas de los genes ribosomales $'1U 45S y 5S son las empleadas con mayor frecuencia para la generacin de marcadores cromosmicos por FISH. Esto es debido a que son secuencias altamente conservadas y a que presentan una disposicin en tndem que facilita la deteccin de los loci. Los mismos pueden estar presentes en ms de un sitio por complemento cromosmico, proporcionando marcadores ~WLOHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV \ SDUD UHDOL]DU FRPSDUDFLRQHV FDULRWtSLFDV )LJ 2C). Otra de las sondas de secuencias conservadas y repetidas en tndem que se emplean habitualmente en experimentos de FISH son las telomricas (Fig. 2D). Las mismas son utilizadas tanto para establecer con precisin ORV OtPLWHV FURPRVyPLFRV FRPR SDUD UHYHODU LQversiones que comprenden los segmentos cromosmicos distales y la ocurrencia de fusiones
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cromosmicas. Las sondas de secuencias no conservadas repetidas en tndem son muy ~WLOHV SDUD HO GHVDUUROOR GH PDUFDGRUHV HVSHFtFRV GH FURPRVRPDV \ GH FRPSOHPHQWRV FUR-
mosmicos; mientras que las de secuencias repetidas dispersas OR VRQ SDUD GHQLU UHJLRnes cromosmicas o genomios, en particular, SDUD LGHQWLFDU ORV JHQRPDV SDUHQWDOHV HQ ORV
FIGURA 2. A %DQGHR $J125 HQ XQD PHWDIDVH GH Arachis hypogaea GRQGH VH LGHQWLFDQ ODV UHJLRQHV RUJDQL]DGRUDV GHO QXFOHROR HQ PDUUyQ RVFXUR HFKDV B: bandeo con quinacrina que distingue las regioQHV KHWHURFURPiWLFDV ULFDV HQ $7 HQ DPDULOOR LQWHQVR GH ODV UHJLRQHV HXFURPDWLFDV DPDULOOR SiOLGR HQ los cromosomas prometafsicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratincin realizada con '$3, GLIHUHQFLD EDQGDV KHWHURFURPiWLFDV FHQWURPpULFDV ULFDV HQ $7 HQ EODQFR GH ODV SRUFLRQHV FURPRsmicas eucromticas (en azul). D: FISH que revela las regiones telomricas (verde) de A. hypogaea. E: ),6+ TXH UHYHOD OD GLVWULEXFLyQ SUHIHUHQFLDO GH XQ UHWURHOHPHQWR HQ HO JHQRPD $ GH A. hypogaea. F: GISH doble sobre una metafase de A. hypogaea XWLOL]DQGR FRPR VRQGDV $'1 JHQyPLFR GH A. ipaensis (rojo) y de A. duranensis YHUGH TXH GHPXHVWUD OD FRQVWLWXFLyQ DORSROLSORLGH GHO FXOWtJHQR \ ODV HVSHFLHV GLSORLGHV progenitoras ms probables. G y H $51),6+ HQ DQWHUD \ RYDULR GH Paspalum notatum utilizando como VRQGD XQ $51 PDUFDGR GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO \ WHMLGRHVSHFtFD HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV SHUR QR VH[XDOHV /D LQWHQVLGDG GHO FRORU YLROHWD LQGLFD FDQWLGDGHV UHODWLYDV GHO $51 DQDOL]DGR SUHVHQWH HQ ORV GLIHUHQWHV WHMLGRV GH SODQWDV DSRPtFWLFDV /D EDUUD UHSUHVHQWD PLFUDV HQ $ &) PLFUDV HQ % PLFUDV HQ * y 100 micras en H.
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KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV \ HQ ORV DORSROLSORLGHV )LJ ( $PERV WLSRV GH VHFXHQFLDV UHpetidas pueden mostrar diferencias notorias en ORV PRWLYRV TXH ODV FRPSRQHQ DVt FRPR HQ VX abundancia y distribucin, an entre especies estrechamente emparentadas. El anlisis del conjunto de las secuencias repetitivas constiWX\H XQD KHUUDPLHQWD H[FHOHQWH HQ Vt PLVPD R como complemento de otras tcnicas, para la LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV \ JHQRPLRV HO estudio de la arquitectura nuclear y los anlisis ORJHQpWLFRV 7DPELpQ QRV SHUPLWHQ UHDOL]DU estudios detallados de aberraciones cromosmicas estructurales y numricas, hacer inferencias sobre los mecanismos involucrados en la evolucin cromosmica y realizar el seguimiento de cromosomas o regiones particulares en las sucesivas generaciones de los programas de mejoramiento. Las sondas de secuencias nicas KLEULGDQ FRQ HO $'1 FURPRVyPLFR FRUUHVSRQGLHQWH D XQ ORFXV HVSHFtFR $ GLIHrencia de las secuencias repetidas que pueden ser localizadas fcilmente por FISH, la deteccin de las secuencias nicas es ms laboriosa debido a que, por lo general, las regiones codiFDQWHV GH ORV JHQHV SUHVHQWDQ ORQJLWXGHV PHnores que las detectables por FISH convencional (10 kb). El empleo de grandes bloques de $'1 JHQyPLFR FORQDGR HQ YHFWRUHV FRPR ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV BACs), en combinacin con FISH (BAC-FISH), consWLWX\H XQ PpWRGR HIHFWLYR SDUD HO PDSHR ItVLFR GH VHFXHQFLDV ~QLFDV GH $'1 6LQ HPEDUJR HO $'1 UHSHWLWLYR SUHVHQWH HQ ODV UHJLRQHV QR FRGLFDQWHV GH ORV LQVHUWRV PXFKDV YHFHV JHQHUD SDWURQHV GH VHxDOHV GLVSHUVDV R LQHVSHFtFDV EDFNJURXQG $ SHVDU GH HVWD GLFXOWDG KDVWD HO PRPHQWR %$&),6+ FRQVWLWX\H XQD GH ODV mejores tcnicas para correlacionar los mapas JHQpWLFRV FRQ ORV ItVLFRV \D TXH VH SXHGHQ GHVDUUROODU VRQGDV HVSHFtFDV SDUD FDGD FURPRsoma o locus en particular. 4 Hibridacin in situ genmica (GISH) (VWD WpFQLFD VH XWLOL]D SDUD LGHQWLFDU ORV GLferentes genomios presentes en un organismo KtEULGR R DORSROLSORLGH $XQTXH DSOLFD WRGRV ORV SULQFLSLRV GH ),6+ GLHUH GH pVWD SRUTXH ODV sondas que utiliza estn constituidas por ADN
genmico total \ QR SRU XQ IUDJPHQWR GH $'1 GH VHFXHQFLD FRQRFLGD (O $'1 XWLOL]DGR SDUD FRQVWUXLU HVWDV VRQGDV HV H[WUDtGR PHGLDQWH protocolos estndares y luego es marcado por QLFN WUDQVODWLRQ R SRU DPSOLFDFLRQHV DO D]DU usando cebadores cortos (random priming). El xito de GISH depende del grado de diferenciacin que presenten los genomios que se pretende analizar. Por lo general, las secuenFLDV FRGLFDQWHV GH ORV JHQRPDV GH GRV HVSHFLHV PiV R PHQRV UHODFLRQDGDV QR YDUtDQ VXEVWDQFLDOPHQWH HQWUH Vt SRU OR WDQWR OD KLbridacin diferencial de las sondas en GISH est determinada principalmente por el grado de divergencia del componente repetitivo de los genomas en cuestin. En la medida en que los dos genomas presenten ms secuencias HQ FRP~Q PD\RU VHUi OD GLFXOWDG SDUD GLVWLQguirlos. Una estrategia para mejorar la capacidad discriminante de esta tcnica consiste en realizar un GISH simple XWLOL]DQGR $'1 GH XQ genoma marcado (sonda) junto con una deterPLQDGD SURSRUFLyQ GH $'1 VLQ PDUFDU GHO JHnoma que no se va a detectar (sonda fra). En cambio, cuando la diferencia entre las secuencias de los genomas considerados es alta se puede utilizar GISH doble o triple, colocando sobre el preparado mezclas equimolares de las sondas marcadas diferencialmente para cada uno de los genomas que se quiere distinguir en una metafase. Las regiones cromosmicas que hibridan con una sola sonda se visualizan con HO FRORU RULJLQDO GHO XRURFURPR PLHQWUDV TXH las que presentan complementariedad con dos o ms sondas presentan colores intermedios. Entre las diferentes aplicaciones de GISH, se destaca el estudio de la composicin genmica de los alopoliploides y de los hbriGRV QDWXUDOHV R DUWLFLDOHV En estos casos, la tcnica VH EDVD HQ OD KLEULGDFLyQ GHO $'1 genmico marcado de los probables ancestros o progenitores sobre las preparaciones cromosmicas del material en estudio. La hibridacin diferencial de las sondas con slo un subgrupo de cromosomas en una metafase constituye una clara evidencia de que el material estudiado est compuesto por diferentes genomios. Mediante el empleo de GISH se han determinado los progenitores probables de algunas especies alopoliploides cultivadas como el ta-
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EDFR OD DYHQD HO WULJR \ HO PDQt )LJ ) 2WUD GH ODV YHQWDMDV GH DQDOL]DU ORV KtEULGRV \ ORV alopoliploides con GISH doble o mltiple, consiste en la capacidad que ofrece esta tcnica para detectar translocaciones intergenmicas, las que pueden pasar inadvertidas con los mtodos convencionales de anlisis genmico. Aplicado a clulas meiticas, GISH proporciona un mtodo preciso para el anlisis de los apareamientos cromosmicos que ocurren en los genomas hbridos. El estudio de la capacidad de los cromosomas de aparearse en meiosis es el procedimiento utilizado tradicionalmente para establecer las relaciones genmicas entre diferentes especies. Sin embargo, HQ PXFKDV FRQJXUDFLRQHV PHWDIiVLFDV resulta difcil distinguir los apareamientos ocurridos entre cromosomas homlogos de aquellos ocurridos entre cromosomas homelogos (i.e. parcialmente homlogos). Mediante GISH es posible pintar los cromosomas y, de este modo, determinar el origen genmico de los cromosomas apareados y no apareados, tanto en profase como en metafase de la meiosis I. La tcnica de GISH tambin constituye una herramienta irreemplazable para el desarrollo de programas de mejoramiento vegetal que involucran KLEULGDFLRQHV LQWHUHVSHFtFDV R LQWHUJHQpULFDV \D TXH SHUPLWH FRQUPDU HO RULJHQ KtEULGR de la progenie, 2) determinar el origen de los cromosomas en las distintas generaciones, HQ SDUWLFXODU FXDQGR ORV KtEULGRV )1 muestran inestabilidad cromosmica tal como la elimiQDFLyQ FURPRVyPLFD XQLSDUHQWDO LGHQWLFDU bivalentes interparentales en la meiosis de los KtEULGRV )1 sexuales y 4) comprobar si los cromosomas recombinantes son transmitidos a las siguientes generaciones. Esta tcnica tambin ha sido utilizada para detectar regiones cromaWtQLFDV LQWURJUHVDQWHV HVSHFLDOPHQWH DTXHOODV que portan caracteres agronmicos de inters. 8Q HMHPSOR GH HOOR HV HO DQiOLVLV GH XQD OtQHD lite de cebada introgresada con Hordeum bulbosum resistente a roya. Mediante una combinacin de GISH y FISH se pudo determinar la localizacin de los fragmentos cromosmicos de H. bulbosum introgresados en el complemento cromosmico de cebada que le confeUtDQ GLFKD UHVLVWHQFLD
0DSHR SRU DPSOLFDFLyQ GLUHFWD GH VHcuencias de inters por PCR in situ (PRINS) La tcnica de PRINS (primed in situ) es considerada como una alternativa a ISH para la deteccin de ciertos tipos de secuencias de cidos nucleicos. Esta tcnica involucra la extensin de cebadores diseados para las secuencias blanco por medio de la Taq polimerasa. Durante la extensin, se incorporan QXFOHyWLGRV PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV R KDSWHQRV D Q GH SHUPLWLU OD ORFDOL]DFLyQ ItVLFD de las secuencias en forma directa o indirecta mediante protocolos adicionales de deteccin. Comparada con FISH convencional, PRINS ofrece algunas ventajas tales como: 1) el emSOHR GH FHEDGRUHV GLVHxDGRV D SDUWLU GH XQ Ptnimo de informacin de la secuencia blanco, 2) dichos cebadores pueden hibridar con secuenFLDV GH $'1 PiV IiFLO \ UiSLGDPHQWH TXH ODV sondas (de mayor tamao) usadas en FISH, an en cromatina compacta, 3) no requiere el marcado de sondas y 4) los cebadores pueden ser extendidos an dentro de las secuencias adyacentes (a diferencia de FISH que depende GH XQD VHFXHQFLD HVSHFtFD UHIRU]DQGR OD LQtensidad de la seal para una secuencia corta. Mediante PRINS se han localizado secuencias repetitivas en tndem (secuencias telomricas, elementos mviles \ $'1U HQ FURPRVRPDV GH leguminosas (Vicia faba y Pisum sativum) y de JUDPtQHDV Hordeum vulgare, Avena sativa y /ROLXP PXOWLRUXP). Todos los loci encontrados fueron coincidentes con los hallados por FISH. Los resultados demuestran que la tcnica de PRINS es apropiada para la localizacin rpida de repeticiones en tndem sobre cromosomas vegetales cuando la distancia entre los cebadores es pequea (1 kb) y los blancos son largos (100 500 kb). Sin embargo, no se obtienen buenas seales cuando las secuencias UHSHWLGDV HVWiQ PX\ VHSDUDGDV HQWUH Vt FRPR ocurre con el gen de la vicilina. Este gen est repetido muchas veces en el genoma de Vicia faba, pero cada copia est separada por una distancia mayor de 12 kb. En estos casos, el empleo de FISH resulta ms adecuado dado que se obtienen mejores seales. Por otra parte, PRINS no ha presentado ventajas con respecto a FISH convencional para la deteccin
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GH VHFXHQFLDV VLPSOHV HQ OD PD\RUtD GH ORV FDVRV D~Q XWLOL]DQGR 35,16 FtFOLFR TXH LQYROXFUD GH D FLFORV GH DPSOLFDFLyQ 8QD GH las mayores desventajas de PRINS es el alto JUDGR GH DSDULFLyQ GH VHxDOHV LQHVSHFtFDV probablemente debido a la incorporacin de nucletidos marcados en los extremos 3OH libres que resultan de roturas espontneas de los cromosomas durante el procesamiento del material. Estas incorporaciones indeseables pueden disminuirse mediante el tratamiento con ligasa o incorporando 2, 3 - didesoxinucletidos (ddNTP) antes de PRINS. (Q VtQWHVLV HVWD WpFQLFD HV ~WLO SDUD OD GHteccin rpida de repeticiones en tndem grandes, pero no constituye una alternativa a FISH para la deteccin de genes de copia simple o para el pintado de los cromosomas en plantas mediante el uso de un cctel de cebadores FURPRVRPDHVSHFtFRV 6 FISH de alta resolucin Bajo este concepto se agrupan una serie de tcnicas que, utilizando los mismos principios de FISH convencional, permiten hacer hibridaciones sobre cromosomas profsicos o an sobre ncleos interfsicos. Estas estrategias permiten aumentar tanto la resolucin como la sensibilidad de la deteccin. - FISH sobre cromosomas poco condensados: consiste en el anlisis de cromosomas meiticos en paquitene o de cromosomas mitticos extendidos. La tcnica de cromosomas paquitnicos VH DSOLFD D FpOXODV PDGUHV GHO SROHQ MDGDV HQ etanol : cido actico (3:1) y tratadas con una mezcla de enzimas (celulasa, pectiolasa y citohelicasa) que digieren la calosa de las paredes celulares. En general, los cromosomas paquitnicos vegetales son de 7 a 40 veces ms largos que aquellos de metafases mitticas, HVWiQ FRPSXHVWRV SRU FXDWUR KHEUDV GH $'1 (iguales en los homocigotos), son ms accesibles a las sondas (debido a que tienen una HVWUXFWXUD FURPDWtQLFD PHQRV FRQGHQVDGD \ presentan marcadores cromosmicos particulares (bloques heterocromticos y knobs) que permiten individualizarlos con facilidad. Estas
FDUDFWHUtVWLFDV KDFHQ TXH ORV FURPRVRPDV SDquitnicos constituyan el material de eleccin para los estudios de FISH de alta resolucin, HQ SDUWLFXODU SDUD LGHQWLFDU VHFXHQFLDV EODQco de alrededor de 10 kb y resolver dos loci separados por menos de 100 kb. Por otra parte, la tcnica de FISH sobre cromosomas mitticos extendidos utiliza cromosomas metafsicos seleccionados por FLWRPHWUtD GH XMR a partir de meristemas radicales sincronizados. El estiramiento de los cromosomas se realiza mediante una digestin PRGHUDGD FRQ SURWHLQDVD . DQWHV GH OD MDcin con etanol-cido actico (3:1). Mediante este procedimiento, se pueden obtener cromosomas con una longitud de 10 a 100 veces mayor que la original. Esto permite aumentar la resolucin de los arreglos de secuencias gnicas y repetidas sobre los cromosomas, sin perder la informacin sobre la orientacin relativa con respecto al centrmero y los telmeros. Esta tcnica posee una resolucin similar a la que utiliza cromosomas paquitnicos y es muy til en aquellas especies en las que la obtencin GH EXHQRV SUHSDUDGRV PHLyWLFRV HV GLFXOWRVD o en aquellas que poseen cromosomas paquiWpQLFRV GLItFLOHV GH UHVROYHU - FISH en ncleos interfsicos: esta tcniFD VH DSOLFD D Q~FOHRV HQ FRUWHV GH WHMLGRV DVt como a ncleos aislados, y permite incrementar tanto la sensibilidad como la resolucin de FISH. Para el anlisis de los ncleos en tejidos, ORV yUJDQRV GH OD SODQWD VH MDQ FRQ IRUPDOGHKtGR R JOXWDUDOGHKtGR HVWH ~OWLPR HQ EDMD SURSRUFLyQ \D TXH SXHGH LQGXFLU DXWRXRUHVFHQcia), luego se cortan con micrtomo y los cortes se montan directamente sobre un portaobjetos. Debido a que la sonda necesita penetrar en el tejido para alcanzar el interior del ncleo, se realizan diversos pre-tratamientos tendientes a incrementar la permeabilidad de los tejidos y, adems, se emplean como sondas fragmentos marcados cuyo tamao no supera los 100-500 pb. El anlisis de las hibridaciones se realiza con un microscopio confocal, debido a que este tipo de microscopio permite visualizar las estructuras mediante la reconstruccin tridimensional de las secciones pticas de la muestra.
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Para el anlisis de ncleos aislados, los tejidos se disgregan en un buffer de estabilizacin apropiado y la fraccin de inters se obtiene por centrifugacin y tamizado en mallas con diferentes dimetros de poro. Los ncleos aislados se colocan directamente sobre un portaobjetos y se secan al aire y deshidratan en serie alcohlica. Este procedimiento, que tambin puede ser aplicado a suspensiones celulares, no presenta mayores problemas de permeabilidad para las sondas. Las regiones de hibridacin de las sondas sobre las secuencias de copia simple se observan como seales individuales dentro del ncleo (dos seales en los ncleos diploides), cada una de ellas correspondiente a cada uno de los cromosomas homlogos. Mediante estas tcnicas tambin se ha estudiado la organizacin y la disposicin de los centrmeros, de los telmeros y de los cromosomas en ncleos interfsicos de diferentes rganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco y Arabidopsis thaliana. En particular, las mismas resultan muy tiles para el anlisis de los cambios que se producen durante el ciclo celular en las diferentes estructuras cromosmicas dependientes de secuencias. Tambin se emplean para el mapeo de secuencias separadas por distancias menores a 500-1000 kb, ya que en los cromosomas metafsicos las seales de las sondas separadas por estas distancias se superponen. - ),6+ HQ EUDV GH $'1 H[WHQGLGDV EHU FISH): se basa en la hibridacin de las sondas VREUH EUDV H[WHQGLGDV GH $'1 (VWD WpFQLFD LQYROXFUD ORV VLJXLHQWHV SDVRV VH DtVODQ ORV ncleos por medio de mallas de nylon de diferentes dimetros de poro, 2) se deposita un pequeo volumen de la suspensin de ncleos en uno de los extremos de un portaobjetos tratado con poli-L-lisina (este compuesto reduce DO PtQLPR OD DSDULFLyQ GH VHxDOHV LQHVSHFtFDV \ IDYRUHFH OD H[WHQVLyQ GH ODV EUDV GH $'1 3) se agrega un buffer de lisis y se realiza la extensin usando un cubreobjetos de manera similar a como se hace un frotis de sangre, y 4) sobre estos extendidos se realizan las hibridaciones siguiendo el protocolo convencional de FISH. Normalmente, se realizan dos o tres
URQGDV GH DPSOLFDFLyQ FRQ DQWLFXHUSRV SDUD obtener una buena intensidad de las seales. /D SULQFLSDO YHQWDMD GH EHU),6+ IUHQWH D ),6+ en ncleos interfsicos es que se logra una mayor sensibilidad (200 pb) y una resolucin a nivel genmico de 1 kb. Esta tcnica es de gran utilidad para analizar clones solapantes, detectar rearreglos cromosmicos pequeos, GHWHUPLQDU GLVWDQFLDV ItVLFDV HQWUH JHQHV \ VX orientacin, medir tamaos de loci y acelerar el clonado posicional. Sin embargo, su utilidad para el mapeo de secuencias es limitada debido a que slo permite establecer posiciones relativas, perdiendo la orientacin real de las sondas con respecto al centrmero y a los telmeros. Una variante de esta tcnica es el empleo de cromatina estirada, un procedimiento TXH LQYROXFUD OD H[WHQVLyQ GH ODV EUDV FURPDWtQLFDV VLQ UHPRYHU ODV SURWHtQDV OD TXH UHVXOWD PX\ ~WLO SDUD H[DPLQDU ODV LQWHUDFFLRQHV $'1 SURWHtQDV 7 Mapas cromosmicos Estos mapas constituyen una herramienta IXQGDPHQWDO SDUD LQWHJUDU ORV PDSDV ItVLFRV (basados en el ordenamiento de secuencias y el armado de contiguos) y los mapas genticos (derivados de los anlisis de ligamiento). Los mapas cromosmicos permiten posicionar genes y/o marcadores ligados a stos, con respecto a marcadores estructurales propios de los cromosomas (por ejemplo, centrmeros, telmeros, bandas heterocromticas y constricciones secundarias) o a otros marcadores cromosmicos desarrollados por FISH. Esta integracin facilita el mapeo y el aislamiento de genes particulares por mtodos convencionales y son indispensables para el aislamiento de secuencias por microdiseccin y microclonado. Para el clonado posicional de secuencias es importante tener una estimacin precisa de la razn kb/cM existente en la regin del locus de inters. Esto posibilita la conversin de las distancias genticas establecidas entre los marcadores y el gen en estudio en distancias ItVLFDV (Q JHQHUDO VH KD REVHUYDGR TXH OD GLVtancia entre loci en los mapas genticos (y no el orden) puede diferir mucho de la distancia HVWDEOHFLGD HQ ORV PDSDV ItVLFRV /RV HVWXGLRV
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de los ndulos de recombinacin en complejos sinaptonmicos han revelado que la discrepanFLD HQWUH ORV PDSDV ItVLFRV \ JHQpWLFRV HV HO resultado de la distribucin no al azar de los eventos de crossing-over a lo largo de los cromosomas. En este marco, el desarrollo de los mapas cromosmicos ha cobrado importancia debido a que, dependiendo de las regiones cromosmicas que se analicen y a la frecuencia de recombinacin propia de cada una, los mapas genticos pueden ser mejores o peores HVWLPDGRUHV GH ODV GLVWDQFLDV ItVLFDV UHDOHV Por tal motivo, en varias especies modelo se ha puesto especial nfasis en el desarrollo de marcadores cromosmicos por las tcnicas de ,6+ SULQFLSDOPHQWH %$&),6+ \ )LEHU ),6+ para poder integrar los grupos de ligamiento gentico con cromosomas, y para relacionar las estimaciones de distancia por recombinaFLyQ FRQ OD GLVWDQFLD ItVLFD UHDO 9HU FDStWXOR GH Genmica). 8 Anlisis de la expresin gnica en tejidos por ARN-ISH /RV SURWRFRORV GH ,6+ GH $51 UHVXOWDQ DSURpiados para describir los patrones temporales y espaciales de expresin de un determinado gen a nivel celular o subcelular. En los organismos multicelulares, ISH constituye un complemento de los anlisis de northern blotting, RT-PCR y PLFURDUUD\V HQ ORV TXH OD H[WUDFFLyQ GH $51 de los tejidos resulta invariablemente en la prGLGD GH LQIRUPDFLyQ HVSDFLDO $VLPLVPR VL ELHQ los microarrays constituyen una de las tcnicas ms poderosas para analizar la expresin de muchos genes simultneamente, con frecuencia los resultados que se obtienen deben ser YHULFDGRV SRU PpWRGRV LQGHSHQGLHQWHV WDOHV como ISH. El anlisis de la expresin gnica por ISH generalmente se efecta sobre cortes de tejido, aunque tambin puede realizarse soEUH yUJDQRV HQWHURV ZKROHPRXQW ,6+ ,6+ :,6+ /D WpFQLFD VH EDVD HQ OD XWLOL]DFLyQ GH XQD VRQGD JHQHUDOPHQWH F'1$ PDUFDGD FRQ haptenos que se hibridar directamente sobre los cortes de tejido. Las detecciones se realizan con anticuerpos conjugados con fosfataVDV DOFDOLQDV R FRQ XRURFURPRV 3DUD DTXHOORV FDVRV HQ ORV TXH HO $51P D
detectar est poco representado en las muesWUDV VH SXHGHQ XWLOL]DU SURWRFRORV TXH DPSOLcan la seal mediante el precipitado enzimtiFR GH WLUDPLGD VREUH ORV VLWLRV EODQFRV 76$ 7\UDPLGH 6LJQDO $PSOLFDWLRQ /D DSOLFDFLyQ GH 76$ HQ ORV SURWRFRORV HVWiQGDUHV GH ,6+ consiste en una deteccin inicial de la sonda marcada con anticuerpos o estreptavidina conjugados con una peroxidasa (por ejemplo la de rbano picante, horseradish peroxidase o HRP). Posteriormente, se agrega al preparado WLUDPLGD FRQMXJDGD FRQ DOJ~Q KDSWHQR R XRURcromo, la cual es precipitada masivamente por la HRP y unida en forma covalente al sitio de deteccin inicial. El sistema resultante es detectado mediante anticuerpos conjugados con fosfatasas alcalinas (para detecciones cromognicas estndares) o directamente con miFURVFRStD GH HSLXRUHVFHQFLD 'HELGR D TXH OD tiramida adicionada slo se deposita en las regiones prximas a la enzima, se logra aumenWDU VLJQLFDWLYDPHQWH OD VHQVLELOLGDG VLQ SHUGHU UHVROXFLyQ /D SULQFLSDO OLPLWDQWH GH $51,6+ radica en que, generalmente, se puede analizar una sola sonda por cada hibridacin. No obstante, esta tcnica se ha utilizado para comparar los niveles y sitios de expresin de secuencias en numerosas especies de plantas. Uno ejemplo de ello, es el anlisis espacial de transcritos expresados diferencialmente en SODQWDV FRQ UHSURGXFFLyQ VH[XDO \ DSRPtFWLFDV de Paspalum notatum (Fig 2 G y H). 9 FISH cuantitativo para estimar la expresin gnica (QUISH) $ GLIHUHQFLD GH OD WpFQLFD GH $51),6+ TXH utiliza anticuerpos sobre cortes de tejidos para la deteccin de la expresin gnica, QUISH se basa en la hibridacin de oligonucletidos JHQHVSHFtFRV PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV directamente sobre porciones de tejidos u rganos enteros, combinada con el anlisis de secciones pticas realizadas con un microscopio lser confocal de barrido. De este modo, se logra mejorar notablemente la calidad de los resultados debido a que se eliminan los pasos que generan artefactos e impiden realizar una FXDQWLFDFLyQ SUHFLVD /D FDUDFWHUtVWLFD FODYH GH 48,6+ HV OD FXDQWLFDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ
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gnica utilizando como estndar a los genes de mantenimiento celular (genes housekeeping, *$3'+ \ 6 $51U (O HPSOHR GH HVWH HVtndar permite corregir la variacin de la razn citoplasma/vacuola en los diferentes tipos celulares, los efectos pticos de los tejidos y las VHxDOHV QR HVSHFtFDV /D QDWXUDOH]D FXDQWLWDtiva de esta tcnica hace posible el anlisis de la expresin gnica en rganos, a nivel tisular o celular, independientemente de las diferencias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. Este mtodo es mas rpido que los mtodos tradicionales y puede utilizarse para estudiar la localizacin celular de la expresin de uno o YDULRV JHQHV HQ XQ SHUtRGR UHODWLYDPHQWH FRUWR GH WLHPSR $VLPLVPR FRQ 48,6+ HV SRVLEOH LQvestigar los cambios en los niveles de los transcriptos durante la ontogenia o, en respuesta a cambios de las condiciones ambientales en diIHUHQWHV OtQHDV GH SODQWDV PRGHOR ,GHQWLFDFLyQ GH PRGLFDFLRQHV cromatnicas por inmunocitogentica La identidad celular est determinada por un programa nuclear establecido por un paWUyQ FRPSOHMR GH LQWHUDFFLRQHV HQWUH HO $'1 \ ODV SURWHtQDV /D RUJDQL]DFLyQ GHO $'1 HQ la cromatina regula la expresin y el mantenimiento de la informacin gentica (replicacin, reparacin, recombinacin y segregacin) en forma dinmica. Las colas N-terminales de las histonas que conforman el ncleo de los nucleosomas estn sujetas a diferentes modiFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV DFHWLODFLyQ PHtilacin, fosforilacin, ubiquitinacin, etc.) las TXH FRQMXQWDPHQWH FRQ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 controlan el empaquetamiento de los nucleosomas en arreglos de orden superior y proveen seales para diversos procesos celulares. $XQTXH ODV KLVWRQDV \ VXV PRGLFDFLRQHV VRQ altamente conservadas, la distribucin de las mismas en los cromosomas puede variar a lo largo de los procesos de diferenciacin y del FLFOR FHOXODU DVt FRPR GHQWUR \ HQWUH JUXSRV de eucariotas. Recientemente, se han producido grandes avances en el esclarecimiento del llamado cdigo de las histonas y del intrincado mecanismo de regulacin epigentica. La citogentica se encuentra en una posicin privile-
giada para realizar estudios de este tipo ya que permite unir estructuras nucleares con caracWHUtVWLFDV ELRTXtPLFDV WDOHV FRPR OD DFWLYLGDG WUDQVFULSFLRQDO OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1 ODV PRGLFDFLRQHV GH ODV KLVWRQDV \ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 PHGLDQWH OD LQPXQRGHWHFFLyQ GH GLVWLQWRV blancos celulares con anticuerpos conjugados FRQ IRVIDWDVD DOFDOLQD R FRQ XRURFURPRV /D SUHSDUDFLyQ GHO PDWHULDO OD MDFLyQ OD GLJHVtin de las paredes celulsicas, la permeabilizacin y la incubacin con anticuerpos se realizan de igual modo que en FISH, aunque se omiten los pasos de desnaturalizacin e hibridacin. Las tcnicas de inmunocitogentica se emplean para analizar la estructura cromaWtQLFD \ OD GLVSRVLFLyQ GH ODV GLIHUHQWHV PROpFXlas que intervienen en las divisiones celulares. En particular, estas tcnicas son tiles para HVWXGLDU OD GLVWULEXFLyQ GH ODV PRGLFDFLRQHV KLVWyQLFDV \ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 HQ UHODFLyQ FRQ OD HVWUXFWXUD FURPDWtQLFD HQ FURPRVRPDV y ncleos durante el ciclo celular. Merecen especial mencin aquellos anlisis relacionados FRQ ODV PRGLFDFLRQHV TXH LQGLFDQ HVWUXFWXUDV FURPDWtQLFDV DELHUWDV FRQ SRWHQFLDOLGDG GH transcripcin, y las que delimitan estructuras FURPDWtQLFDV FHUUDGDV FRQ DFWLYLGDG WUDQVFULScional reprimida. El advenimiento de las tcnicas de citogentica molecular y de inmunocitogentica ha permitido disectar progresivamenWH HO Q~FOHR D QLYHO GH PLFURVFRStD ySWLFD /D deteccin individual de complejos proteicos y GH VHFXHQFLDV GH $51V \ $'1 KD UHYHODGR OD existencia de muchos compartimientos nucleares. Las variaciones en la arquitectura nuclear UHHMDQ OD UHODFLyQ H[LVWHQWH HQWUH OD RUJDQL]Dcin nuclear y la regulacin gnica. El anlisis de dicha arquitectura incluye varios parmetros cuantitativos y cualitativos, tales como el tamao y forma nuclear, el contenido relativo y la distribucin de heterocromatina, los patroQHV JHQHUDOHV GH PRGLFDFLyQ FURPDWtQLFD OD presencia de compartimientos nucleares (nucleolos, cromocentros, territorios cromosmicos y cuerpos nucleares) y la organizacin de los cromosomas en el ncleo (ie. la posicin y la orientacin de los cromosomas en el ncleo) \ ODV GLIHUHQFLDV HQ OD FRQGHQVDFLyQ FURPDWtQLca a nivel local.
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11 Anlisis de la posicin de la insercin de los transgenes Diferentes ensayos han demostrado que la expresin de los transgenes puede variar VLJQLFDWLYDPHQWH HQWUH HVSHFLHV GLSORLGHV UHODFLRQDGDV HQWUH OtQHDV WUDQVIRUPDGDV LQGHpendientes, y an entre generaciones de las OtQHDV WUDVIRUPDGDV /RV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ de estas secuencias pueden ser afectados por diversos factores, entre ellos, la presencia de numerosas copias de la construccin en uno o varios loci y el contexto genmico en que se encuentran las copias. La tcnica de FISH permite mapear los trangenes en cromosomas PHWDIiVLFRV HQ Q~FOHRV LQWHUIiVLFRV R HQ EUDV H[WHQGLGDV GH $'1 \ D VX YH] GHWHUPLnar el nmero de loci en que se encuentran los mismos. Para el mapeo se utiliza una sonda marcada correspondiente al transgen y otras VRQGDV TXH SHUPLWDQ LGHQWLFDU ORV SDUHV FURmosmicos, un genoma o un subgenoma parWLFXODU HQ HO FDVR GH KtEULGRV R DORSROLSORLGHV Uno de los ejemplos clsicos, en el cual se combinaron diferentes tcnicas moleculares y citogenticas para analizar los efectos del contexto genmico en la expresin de los transgenes fue realizado en tabaco. En el mismo se emple FISH para mapear los trangenes sobre ORV FURPRVRPDV \ *,6+ SDUD LGHQWLFDU ORV JHQRPDV GHO DORSROLSORLGH $ SDUWLU GH HVWRV HVtudios, se ha demostrado que, en general, los transgenes con expresin estable estn localizados en las proximidades de las regiones telomricas y ricas en genes, mientras que los de expresin inestable se localizan en las regiones intercalares o paracentromricas que son ms pobres en genes. Por otra parte, la combinacin de FISH con tcnicas de inmunocitogentica permite analizar el contexto epigentico de la cromatina circundante a los transgenes y su relacin con la expresin de los mismos. Lecturas / sitios recomendados
Bennett M.D. 1995. The development and use of genomic in situ K\EULGL]DWLRQ *,6+ DV D QHZ WRRO in plant biosystematics. In: Brandham P.E. and %HQQHWW 0' HGV .HZ &KURPRVRPH &RQIHUHQFH ,9 5R\DO %RWDQLF *DUGHQV .HZ SS 167-183.
)HUQiQGH] $ DQG 'DYLxD -5 +HWHURFKURPDtin and genome size in Fortunatia and Camassia +\DFLQWKDFHDH .HZ %XOOHWLQ 46, 307-316. )UDQV] 3) $ORQVR%ODQFR & /LKDUVND 7% 3HHWHUV $-0 =DEHO 3 DQG -RQJ -+ +LJK resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana DQG WRPDWR E\ XRUHVFHQFH in situ hyEULGL]DWLRQ WR H[WHQGHG '1$ EHUV 7KH 3ODQW -Rurnal, 9, 421-430. .SHU + 2UW 6HLE / 6LYDJXUX 0 +RHNHQJD 2$ DQG .RFKLDQ /9 $ PHWKRG IRU FHOOXODU ORcalization of gene expression via quantitative in situ hybridization in plants. The Plant Journal, 50, 159-175. /DVSLQD 19 9HJD 7 6HLMR -* *RQ]iOH] $0 0DUWHORWWR /* 6WHLQ - 3RGLR 0 2UWL] -3$ (FKHQLTXH 9& 4XDUtQ &/ DQG 3HVVLQR 6& 2008. Gene expression analysis at the onset of aposporous apomixis in Paspalum notatum. Plant Molecular Biology, 67, 615-628. /DYLD *, )HUQiQGH] $ DQG 6HLMR -* &\WRgenetic and molecular evidences on the evolutionary relationships among Arachis species. In: 6KDUPD $. DQG 6KDUPD $ HGV 3ODQW *Hnome: Biodiversity and Evolution. Volume 1E: 3KDQHURJDP$QJLRVSHUP 6FLHQFH 3XEOLVKHUV (QHOG 1+ 86$ SS 0RVFRQH ($ 0DW]NH 0$ DQG 0DW]NH $-0 1996. The use of combined FISH/GISH in conMXQFWLRQ ZLWK '$3, FRXQWHUVWDLQLQJ WR LGHQWLI\ chromosomes containing transgene inserts in amphidiploid tobacco. Chromosoma, 105, 231236. Robledo G., Lavia G.I. and Seijo G. 2009. Species UHODWLRQV DPRQJ ZLOG Arachis VSHFLHV ZLWK WKH $ JHQRPH DV UHYHDOHG E\ ),6+ PDSSLQJ RI U'1$ loci and heterochromatin detection. Theoretical DQG $SSOLHG *HQHWLFV 118, 1295-1307. 6FKZDU]DFKHU 7 DQG +HVORS+DUULVRQ 3 3UDFWLFDO LQ VLWX K\EULGL]DWLRQ %,26 6FLHQWLF Publishers, Oxford, 2000. pp. 203. 6HLMR -* /DYLD *, )HUQiQGH] $ .UDSRYLFNDV $ 'XFDVVH ' DQG 0RVFRQH ($ 3K\VLFDO PDSSLQJ RI 6 DQG 66 U51$ JHQHV HYLGHQFHV WKDW $UDFKLV GXUDQHQVLV DQG $ LSDHQVLV DUH WKH ZLOG GLSORLG VSHFLHV LQYROYHG LQ WKH RULJLQ RI $ K\SRJDHD /HJXPLQRVDH $PHULFDQ -RXUnal of Botany, 91, 1294-1303. 6HLMR -* /DYLD *, )HUQiQGH] $ .UDSRYLFNDV $ 'XFDVVH ' %HUWLROL '- DQG 0RVFRQH ($ *HQRPLF UHODWLRQVKLSV EHWZHHQ WKH FXOWLYDWHG SHDQXW $UDFKLV K\SRJDHD /HJXPLQRVDH and its close relatives revealed by double GISH. $PHULFDQ -RXUQDO RI %RWDQ\ 6ROtV 1HIID 9* DQG )HUQiQGH] $ .DU\RW\SLF VWX-
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dies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, /HLRFDUSDH $PHULFDQ -RXUQDO RI %RWDQ\ 89, 551-558. Stein N., Ponelies N., Musket T., McMullen M. and :HEHU * &KURPRVRPH PLFURGLVVHFWLRQ DQG UHJLRQVSHFLF OLEUDULHV IURP SDFK\WHQH chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant Journal, 13, 281289. 7HUNHOVHQ & .RFK - .OYUDD 6 +LQGNMU - 3Hdersena S. and Bolund L. 1993. Repeated primed in situ labeling: formation and labeling of VSHFLF '1$ VHTXHQFHV LQ FKURPRVRPHV DQG nuclei. Cytogenetics and Genome Research, 63, 235-237.
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I.-CAPTULO 4 Herramientas Bsicas de Ingeniera Gentica

Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique Introduccin +DVWD SULQFLSLRV GH ORV DxRV HO $'1 era la molcula de la clula que planteaba PiV GLFXOWDGHV SDUD VX DQiOLVLV ELRTXtPLFR ([FHVLYDPHQWH ODUJD \ TXtPLFDPHQWH PRQyWRQD OD VHFXHQFLD GH QXFOHyWLGRV GHO '1$ WDQ VROR SRGtD VHU HVWXGLDGD SRU FDPLQRV LQGLUHFWRV tales como la determinacin de la secuencia de SURWHtQDV R GHO 51$ $FWXDOPHQWH HV SRVLEOH VHSDUDU UHJLRQHV GHWHUPLQDGDV GHO $'1 REtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucletidos. Estos adelantos tcnicos forman SDUWH GH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH de cuyo desarrollo han sido pilares fundamentales el conocimiento de las enzimas de restriccin, el esclarecimiento de los procesos de
UHSOLFDFLyQ \ UHSDUDFLyQ GH $'1 DVt FRPR GH OD UHSOLFDFLyQ GH YLUXV \ SOiVPLGRV \ OD VtQWHVLV TXtPLFD GH VHFXHQFLDV GH QXFOHyWLGRV 'H HVWD PDQHUD SXHGH GHFLUVH TXH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH HVWD LQWHJUDGD SRU GLYHUVDV estrategias metodolgicas, muchas de las cuales son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. LA CLONACIN MOLECULAR CLONACIN DE GENES O
/D QDOLGDG GH OD FORQDFLyQ PROHFXODU HV OD obtencin de un determinado fragmento de $'1 TXH SXHGH FRUUHVSRQGHU D XQ JHQ LQVHUto en un vector capaz de replicarse, pudindoVH SRVWHULRUPHQWH DPSOLFDU D YDULRV PLOORQHV de copias, por ejemplo para anlisis de secuencia o para obtener grandes cantidades de un producto gnico. (O GHVDUUROOR GH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHcombinante y la clonacin molecular han aporWDGR VRVWLFDGRV SURFHGLPLHQWRV TXH SHUPLWHQ HO DLVODPLHQWR SXULFDFLyQ \ UHSOLFDFLyQ GH IUDJPHQWRV HVSHFtFRV GH $'1 /D FORQDFLyQ GH VHJPHQWRV GH $'1 WDPELpQ OODPDGD FUHDFLyQ GHO $'1 UHFRPELQDQWH requiere esencialmente de las etapas que se enumeran a continuacin (Fig. 1) 1. Obtencin del ADN a clonar Segn la estrategia experimental involucrada, el $'1 D FORQDU SXHGH WHQHU diferentes procedencias. 3XHGH WUDWDUVH GH $'1 de origen genmico, de XQ SURGXFWR GH DPSOLFDcin por PCR, provenir de OD VtQWHVLV in vitro, a partir de una retrotranscripcin $'1F WRPDQGR FRPR PROGH HO $51P R GH OD VtQWHVLV in vitro de secuenFLDV SUHYLDPHQWH GHQLdas. Cuando el material de
Figura 1. (WDSDV EiVLFDV HQ OD FORQDFLyQ GH XQ IUDJPHQWR GH $'1 (Q SULPHU OXJDU HO $'1 D FORQDU \ HO YHFWRU SOiVPLGR VH FRUWDQ FRQ OD PLVma enzima de restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de OD HQ]LPD OLJDVD SDUD REWHQHU XQD PROpFXOD GH $'1 UHFRPELQDQWH TXH se introduce en bacterias que multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de inters.
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SDUWLGD HV HO $'1 JHQyPLFR ORV IUDJPHQWRV D ser clonados deben ser escindidos mediante el empleo de enzimas de restriccin. En algunas situaciones, particularmente cuando se trata de la clonacin de productos de PCR, los fragmentos deben ser aislados en funcin de su tamao. Este aislamiento se lleva a cabo a travs de electroforesis en geles de poliacrilamida o agarosa. 2. Eleccin del vector de clonacin Un vector de clonacin es una molcula de $'1 TXH YHKLFXOL]DUi DO IUDJPHQWR GH LQWHUpV \ SHUPLWLUi VX DPSOLFDFLyQ UHVXOWDQGR GH HVWD manera indispensable para la creacin del $'1 UHFRPELQDQWH 8QR GH ORV SULQFLSDOHV UHTXLVLWRV SDUD TXH XQD PROpFXOD GH $'1 SXHGD actuar como vector, es la capacidad de autorreplicacin que ir acompaada de la replicacin del fragmento inserto. Tambin es necesario que los vectores tengan un tamao que permita su manipulacin fuera de la clula. Los ms pequeos se manipulan con mayor faciliGDG TXH ODV PROpFXODV GH $'1 PiV JUDQGHV que tienden a ser ms frgiles. Los vectores de clonacin ms utilizados derivan del genoma viral o de plsmidos bacterianos. Los componentes esenciales de un vector de clonacin son el origen de replicacin, un gen marcador UHVSRQVDEOH GH DOJXQD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLca para la seleccin y al menos un sitio nico de restriccin. 3. Generacin del ADN recombinante (O WpUPLQR $'1 UHFRPELQDQWH VH HPSOHD para hacer referencia al material gentico a clonar unido al vector de clonacin. Para su obtencin es requisito contar con los dos fragPHQWRV GH $'1 HQ IRUPD SXUD \ OLJDUORV HQ]LPiWLFDPHQWH SRU DFFLyQ GH OD HQ]LPD $'1 OLJDVD HQ SUHVHQFLD GH $73 4. Introduccin del ADN recombinante en el organismo hospedador Este proceso es realmente el verdadero HYHQWR GH FORQDFLyQ HQ HO FXDO HO $'1 UHcombinante es clonado para producir varias
copias idnticas. Los organismos hospedaGRUHV XWLOL]DGRV HQ ELRORJtD PROHFXODU GHEHQ contener toda la maquinaria gentica para la DPSOLFDFLyQ GHO $'1 UHFRPELQDQWH 3XHGH tratarse de organismos procariotas (bacterias) R HXFDULRWDV OHYDGXUDV FpOXODV GH PDPtIHURV cultivadas). En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin se realiza valindose de los procesos naturales de la geQpWLFD PLFURELDQD R PRGLFDFLRQHV HVSHFtFDV GH ORV PLVPRV 'H HVWRV PpWRGRV PRGLFDGRV el ms ampliamente utilizado es el de transformacin en clula competente (ver vectores de FORQDFLyQ 2WUD IRUPD GH LQWURGXFLU HO $'1 HQ la clula hospedadora, de eleccin para molFXODV GH $'1 GH JUDQ WDPDxR HV HO SURFHVR de electroporacin, que consiste en la creacin de poros en la membrana celular inducida por descargas elctricas que permiten la introducFLyQ GHO $'1 /RV SOiVPLGRV KtEULGRV LQWURGXcidos a travs de alguno de estos procesos, continuarn replicndose en la clula hospedadora mientras sta crezca y se divida, siempre que sea mantenida la presin de seleccin. ,GHQWLFDFLyQ \ VHOHFFLyQ GH ODV FpOXODV que contienen al ADN recombinante (Q HO HVTXHPD GH WUDQVIHUHQFLD GHO $'1 UHcombinante al hospedador descripto anteriormente, se asume que durante la transformacin, no todas las bacterias reciben una copia GHO YHFWRU KtEULGR (V QHFHVDULR VHOHFFLRQDU aquellas clulas que han incorporado el vector, a travs de la utilizacin de marcadores gnicos presentes en los vectores de clonacin. Los ms comnmente empleados son los genes de resistencia a antibiticos y el fragmento funcional de lac Z, el gen de E. coli TXH FRGLFD SDUD la enzima E-galactosidasa (E-gal). Estos genes marcadores tienen insertado un sitio mltiple de restriccin (polylinker), de manera que cuando ORV IUDJPHQWRV GH $'1 VRQ FORQDGRV HQ HO SRlylinker del gen lacZ, anulan la actividad de la E-galactosidasa. Esta enzima hidroliza un comSXHVWR TXtPLFR GHQRPLQDGR ;JDO \ VH OLEHUD un colorante azul relativamente insoluble. El ;JDO VH LQFRUSRUD DO PHGLR GH FXOWLYR HQ SODFD de Petri donde desarrollarn las clulas hospeGDGRUDV GHO $'1 UHFRPELQDQWH 6L HO $'1 FOR-
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nado se insert en el polylinker y desactiv la E-galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de Petri. Caso contrario las colonias de las clulas hospedadoras se vern de color azul. Cuando el marcador es un gen de resistencia a los antibiticos, las clulas se LQRFXODQ HQ PHGLR DJDULFDGR TXH FRQWLHQH HO DQWLELyWLFR FX\D UHVLVWHQFLD FRQHUH HO YHFWRU de manera que slo sobrevivirn aquellas clulas que lo contienen. Luego deber buscarse HVSHFtFDPHQWH DTXHOODV FpOXODV TXH SRVHHQ el fragmento de inters. Estos dos marcadores suelen ser utilizados en forma conjunta de manera que solo las colonias portadoras del vector crecern en medio con antibitico, y, paralelamente, las colonias que poseen el plsmido recombinante sern de color blanco. Una vez obtenidas las colonias recombinanWHV ORV SDVRV D VHJXLU LQFOX\HQ OD DPSOLFDFLyQ GH OD FRORQLD HQ PHGLR OtTXLGR FRQ DQWLELyWLFR SXULFDFLyQ GHO SOiVPLGR D SDUWLU GH OD VXVSHQsin de bacterias y comprobacin de la presencia del inserto esperado. Para la deteccin del inserto, pueden utilizarse diversas estrategias. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se puede utilizar cuando la secuencia del fragPHQWR FORQDGR HV FRQRFLGD R SDUD LGHQWLFDU la secuencia de los fragmentos clonados por DPSOLFDFLyQ FRQ VRQGDV FRPSOHPHQWDULDV D la secuencia terminal del vector. La hibridacin PROHFXODU FRQ XQD VRQGD HVSHFtFD PDUFDGD puede ser utilizada cuando se conoce la secuencia de inters y se dispone de dicha sonda. En otros casos, se realiza la seleccin en funcin del tamao del inserto, para lo que el plsmido recombinante es digerido mediante enzimas de restriccin y posteriormente se realiza una corrida electrofortica en gel de agarosa. HERRAMIENTAS Y PROCEDIMIENTOS IMPLICADOS. $ SHVDU GH TXH OD REWHQFLyQ GH $'1 UHFRPbinante pudo ser explicada a travs de cinco pasos sencillos, es muy amplio el conjunto de KHUUDPLHQWDV \ PHWRGRORJtDV H[SHULPHQWDOHV que estn involucradas en su desarrollo. El objetivo de esta parte del capitulo es introducir
al lector en las herramientas metodolgicas de ELRORJtD PROHFXODU PiV DPSOLDPHQWH XWLOL]DGDV 1. VECTORES DE CLONACIN Como hemos mencionado, un vector es una PROpFXOD GH $'1 D OD TXH VH XQLUi HO IUDJPHQWR GH LQWHUpV UHVXOWDQGR HQ HO $'1 UHFRPELnante y, debido a su capacidad de autorrepliFDFLyQ SHUPLWLUi OD DPSOLFDFLyQ GHO IUDJPHQWR insertado. Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de restriccin mltiple (polylinker) que HV XQ VHJPHQWR FRUWR GH $'1 FRQ VLWLRV GH UHVtriccin para varias enzimas diferentes, cada uno de ellos nico para el vector (Fig. 2). Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura (ORF) de un gen responsable de alguQD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLFD SRU OR TXH UHVXOWD VHQFLOOR FRQUPDU VL WUDV OD UHVWULFFLyQ VH KD REWHQLGR HO SOiVPLGR KtEULGR \D TXH OD LQFOXVLyQ del inserto produce la prdida de funcionalidad del gen mediante inactivacin por insercin. Existen diferentes tipos de vectores de clonacin, entre los que se incluyen: A) Plsmidos: 6RQ PROpFXODV GH $'1 FLUFXODU GH GREOH cadena, extracromosmicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin, a saber: 1. Pequeo tamao que hace sean fciles de aislar y manipular. 6RQ FLUFXODUHV OR TXH KDFH TXH HO $'1 VHD PiV HVWDEOH GXUDQWH VX DLVODPLHQWR TXtPLFR 3. Su replicacin transcurre independientePHQWH GHO $'1 QXFOHDU HQ OD FpOXOD EDFWHULDQD 4. Existen mltiples copias en la clula, dependiendo del plsmido y de la especie hospedadora puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1000 a 3000 copias de pBR322 por clula). 5. La presencia de genes de resistencia a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables facilita la deteccin y seleccin de los clones que los contienen. El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable, sin embargo si son
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Figura 2. Elementos genticos que constituyen un vector de clonacin. a) Sitio de restriccin mltiple que FRQVLVWH HQ XQ FRUWR VHJPHQWR GH $'1 FRQ YDULRV VLWLRV GH UHVWULFFLyQ FDGD XQR GH HOORV ~QLFR SDUD HO vector. b) representacin esquemtica del plsmido pBR322 con el origen de replicacin (Ori) y los genes marcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina ($03R) que contienen los sitios de restriccin de BamHI y PstI, respectivamente;
mayores de 10 kb, el plsmido se hace generalmente inestable. $XQTXH HQ HO DPELHQWH QDWXUDO ORV SOiVPLGRV FRQMXJDWLYRV JHQHUDOPHQWH VH WUDQVHUHQ SRU contacto clula a clula, los plsmidos vectores de clonacin generalmente han sido modiFDGRV D Q GH HYLWDU VX WUDQVIHUHQFLD SRU FRQMXJDFLyQ \ DVt ORJUDU VX FRQWHQFLyQ ELROyJLFD Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin, utilizando choque trmico en presencia de cloruro de calcio o mediante electroporacin. $XQTXH ORV SULPHURV SOiVPLGRV XWLOL]DGRV H[LVWtDQ HQ IRUPD QDWXUDO ORV YHFWRUHV GH FORnacin actuales constituyen una generacin posterior de vectores construidos in vitro, como el plsmido pBR322 (Fig. 2). En este plsmido, el sitio de restriccin de BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina. Si se inserta un fragmento de un $'1 HQ XQR GH HVWRV VLWLRV OD UHVLVWHQFLD DO DQtibitico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivacin por insercin). Por
tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI \ VH OLJD D XQ $'1 \ OXHJR VH DtVODQ ORV FORQHV transformados, aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina QR SRUWDQ QLQJ~Q $'1 FORQDGR $TXHOODV FpOXlas que continan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen HO SOiVPLGR FRQ HO IUDJPHQWR GHO $'1 FORQDGR Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina puede determinarse independientemente en placas con agar, resulta fcil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las clulas que no los contengan. B) Bacterifagos o fagos: )DJR : se caracteriza por ser un fago especializado en la transduccin (transduccin especializada) por lo tanto este fago puede utilizarse tambin como vector de clonacin para la recombinacin in vitro. Es un vector de clonacin particularmente til porque: 1. Se conoce bien su estructura, gentica molecular y funcionamiento
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3XHGH LQVHUWDU PD\RU FDQWLGDG GH $'1 TXH OD PD\RUtD GH ORV SOiVPLGRV HQWUH \ NE (O $'1 SXHGH VHU HFLHQWHPHQWH HPSDTXHtado in vitro GHQWUR GH ODV SDUWtFXODV GHO IDJR /DV SDUWtFXODV GHO IDJR VRQ PXFKR PiV Hcientes en la infeccin de las clulas hospedadoras (transfeccin) que la transformacin. (O IDJR WLHQH XQ PDSD JHQpWLFR FRPSOHjo. El tercio central del cromosoma, que contiene genes requeridos para la lisogenia pero QR SDUD HO FLFOR OtWLFR SXHGH VHU HVFLQGLGR SRU UHVWULFFLyQ \ VXEVWLWXLGR SRU $'1 IRUiQHR )LJ D (O $'1 UHFRPELQDQWH UHVXOWDQWH SXHGH VHU empaquetado en las cabezas del fago in vitro, pudindolas el fago inyectar en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. 'DGR TXH HO IDJR VLOYHVWUH WLHQH H[FHVLYD cantidad de sitios de restriccin, no es indicado como vector de clonacin por lo que se han FRQVWUXLGR IDJRV PRGLFDGRV &KDURQ HQ los cuales los sitios de restriccin no deseados KDQ VLGR PRGLFDGRV Fago M13 HV XQ IDJR ODPHQWRVR TXH FRQWLHQH $'1 PRQRFDWHQDULR \ VH UHSOLFD VLQ PDtar a su hospedador. Sin embargo, para poder usar M13 para la clonacin es necesario disponer de una forma bicatenaria ya que las enzimas de restriccin slo trabajan sobre $'1 ELFDWHQDULR (O $'1 ELFDWHQDULR GH 0 puede obtenerse de clulas infectadas, donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene informacin gentica esencial para la replicacin. Sin embargo existe una pequea regin, llamada secuencia intergnica, que puede ser utilizada como sitio de clonacin. (V SRVLEOH FORQDU $'1 GH ORQJLWXGHV YDULDEOHV hasta 5kb sin afectar la viabilidad del fago. El $'1 PRQRFDWHQDULR GH 0 \ GH VXV YHFWRUHV derivados, ha sido extremadamente til para VHFXHQFLDU $'1 Tanto en el fago O como el M13 se ha insertado como marcador el gen lacZ. C) Csmidos: 6RQ KtEULGRV HQWUH SOiVPLGRV \ HO IDJR \ combinan las ventajas de ambos como vectores. Poseen la habilidad del plsmido para replicarse autnomamente en las clulas de E.
coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro GHO FURPRVRPD GH \ FRQWLHQHQ HO RULJHQ GH replicacin y los genes de resistencia a los antibiticos de su plsmido parental. Cos proviene de sitio cohesivo (cohesive site) en referencia a la terminal de simple cadena de 12 bases FRPSOHPHQWDULD HQ HO FURPRVRPD GH PDGXro. El sitio cos es reconocido por el sistema GH HPSDTXHWDPLHQWR GH $'1 GH KDFLHQGR cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. La principal ventaja de los csmidos como vectores es su habilidad para LQVHUWDU IUDJPHQWRV GH $'1 GH D NE D) Fsmidos (fagmidos): 6RQ YHFWRUHV KtEULGRV HQWUH HO IDJR 0 \ HO SOiVPLGR S%5 TXH FRQWLHQHQ ORV RUtJHnes de replicacin de ambos. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con un fago de tipo salvaje, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan FRSLDV PRQRFDWHQDULDV (VWH $'1 PRQRFDWHnario es empaquetado en viriones y puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente los fsmidos pueden transportar GH IRUPD HVWDEOH XQ IUDJPHQWR GH $'1 FORQDGR PD\RU TXH XQ YHFWRU WtSLFR GHULYDGR GH M13. ( &URPRVRPDV DUWLFLDOHV $ SDUWLU GH OD FUHDFLyQ GH SUR\HFWRV GH VHcuenciacin de genomas completos se gesta la necesidad de obtener vectores que alberJXHQ SRUFLRQHV GH $'1 GH PD\RU WDPDxR SDUD efectuar el anlisis genmico y obtener mapas ItVLFRV GH FURPRVRPDV (O primer sistema de FORQDGR GH JUDQGHV IUDJPHQWRV GH $'1 IXH informado en 1987 por Burke y colaboradoUHV ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH OHYDGXUDV (YACs), minicromosomas con la capacidad de FRQWHQHU LQVHUWRV GH $'1 GH NES )LJ E /RV <$&V VRQ YHFWRUHV GH '1$ OLQHDUHV que contienen los elementos esenciales de los cromosomas de la levadura, como por ejemplo HO RULJHQ GH UHSOLFDFLyQ $56 $XWRQRPRXVO\ Replicating Sequence). Introducidos en la cOXOD GH OHYDGXUD ORV <$&V VH UHSOLFDQ \ VHJUHgan junto con el complemento cromosmico
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Figura 3. Vectores de clonacin. Se muestran los elementos genticos que constituyen los vectores de FORQDFLyQ D )DJR ODPEGD (O FURPRVRPD VH RUJDQL]D GH DFXHUGR FRQ ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU ORV JHQHV & & FDEH]D \ FROD JHQHV GH SURWHtQDV GH OD FiSVLGH GH XQLyQ FDEH]DFROD \ GH HVWDELOL]DFLyQ \ HPSDTXHWDPLHQWR GH $'1 UHF JHQHV GH UHFRPELQDFLyQ SURWHtQDV SDUD OD LQWHJUDFLyQ \ HVFLVLyQ GHO $'1 del fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora, reg: genes regulatorios, para el cambio entre los distintos ciclos del fago, rep: regin de replicacin, con el origen de replicacin y los genes O y P, lisis: JHQHV TXH SRVLELOLWDQ OD OLVLV FHOXODU E &URPRVRPD DUWLFLDO GH OHYDGXUD <$& $56 RULJHQ GH UHSOLFDFLyQ &(1 FHQWUyPHUR 7(/ WHOyPHURV 85$ JHQ PDUFDGRU VHOHFFLRQDEOH SDUD HO GHVDUUROOR HQ PHGLR FRQ XUDFLOR $PS JHQ PDUFDGRU VHOHFFLRQDEOH HQ PHGLR FRQ DPSLFLOLQD (O $'1 HV FORQDGR HQ HO VLWLR BamHI. C) &URPRVRPD DUWLFLDO GH EDFWHULDV %$& 'HULYD GHO IDFWRU EDFWHULDQR ) 6X HVTXHOHWR FRQWLHQH UHJLRQHV esenciales que le otorgan estabilidad y bajo nmero de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS: origen de replicacin unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE: JHQ GH SURWHtQD DXWRUHJXODWRULD HVHQFLDO SDUD OD UHSOLFDFLyQ GHVGH oriS S%HOR%$& HO YHFWRU %$& PDV utilizado, tiene tres sitios nicos de clonado, HindIII, BamHI y SphI dentro del gen marcador lacZ.
habitual. El marcador seleccionable suele ser XQ JHQ GH WLSR VLOYHVWUH TXH OH FRQHUH OD FDSDFLGDG SURWRWUyFD D OD FpOXOD KRVSHGDGRUD (O PDV FRP~QPHQWH XWLOL]DGR HV 85$ TXH FRQHUH D ODV DX[yWURIRV 85$ OD FDSDFLGDG de desarrollarse en un medio de cultivo sin uraFLOR 'XUDQWH OD PHLRVLV ORV <$&V VH DSDUHDQ FRQ FXDOTXLHU <$& KRPyORJR SUHVHQWH UHVXOtando en una alta frecuencia de recombinacin entre los fragmentos clonados. Esta alta frecuencia de quimerismo lleva a predicciones LQH[DFWDV HQ ORV PDSDV ItVLFRV PROHFXODUHV \
junto con la falta de familiaridad en el manejo de levaduras entre bilogos moleculares, limiWDURQ HO XVR GH ORV <$&V 3DUD VXSHUDU HVWDV GLFXOWDGHV IXHURQ GHVDUUROODGRV ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV %$&V FRQVWLtuyen un sistema de clonacin que mantiene un bajo nmero de copias en cada bacteria, JDUDQWL]DQGR XQD UHFRPELQDFLyQ PtQLPD HQWUH GLIHUHQWHV IUDJPHQWRV GH $'1 \ VRQ GH VHQFLOOD manipulacin. Los BACs se basan en el plsmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb aunque el promedio es de 100
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kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esenciales una copia del origen de replicacin de E. coli, un marcador de seleccin que suele ser un gen de resistencia a antibiticos y un sistePD GH UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFLFR FUHOR[ cuyo rol consiste en forzar la circularizacin de JUDQGHV LQVHUWRV /RV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV derivados del fago P1 (PACs) permiten la cloQDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH .SE \ DO LJXDO TXH ORV %$&V SUHVHQWDQ EDMR JUDGR GH TXLmerismo. El fago P1 se replica primero como plsmido de bajo nmero de copias y luego FRPR XQ ODUJR VHJPHQWR GH $'1 FRPSXHVWR por mltiples copias de la secuencia repetida (concatemero), que es empaquetado en la cabeza del fago por un mecanismo similar al del fago lambda. Las propiedades de los clones 3$& SHUPLWHQ OD LQLFLDFLyQ GH HPSDTXHWDPLHQto en las etapas de clonacin, escisin de las secuencias de alto nmero de copias despus de la infeccin bacteriana y la induccin de la UHSOLFDFLyQ LQPHGLDWDPHQWH DQWHV OD DPSOLFDFLyQ GHO $'1 8WLOL]DQ DO LJXDO TXH ORV %$&V HO sistema cre-lox. Introduccin del vector en la clula hospedadora En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin del vector en la clula hospedadora se realiza valindose de los mecanismos naturales de la gentica microbiana dado que en los procariotas existen mecanismos de intercambio gentico, que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinacin del inserto, a travs de uno de los siguientes procesos genticos: Transformacin: es un proceso por cual HO $'1 OLEUH GHO PHGLR DPELHQWH VH LQFRUSRUD en una clula receptora, trayendo aparejado XQ FDPELR JHQpWLFR 8QD FDGHQD GH HVWH $'1 libre, llamado donador, es captada y puede transformar genticamente la clula receptora por recombinacin con una regin homloga del cromosoma. El movimiento de las molcuODV GH $'1 D WUDYpV GH OD PHPEUDQD \ GHQtro del citoplasma de la clula receptora es un SURFHVR DFWLYR TXH UHTXLHUH HQHUJtD /DV Fplulas que son capaces de tomar una molcu-
OD GH $'1 \ VHU WUDQVIRUPDGDV VH GHQRPLQDQ competentes. Estas clulas secretan el factor GH FRPSHWHQFLD TXH HV XQD SHTXHxD SURWHtQD TXH LQGXFH OD VtQWHVLV GH RWUDV D QXHYDV SURWHtQDV UHTXHULGDV SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ La transformacin es un proceso que ocurre slo en algunas especies bacterianas. Transduccin VH UHHUH D OD WUDQVIHUHQFLD GHO $'1 GH XQD FpOXOD D RWUD SRU PHGLR GH un fago, denominacin utilizada para los virus cuando se trata de hospedadores bacterianos. Esta transferencia de genes puede ocurrir de dos maneras: a) transduccin generalizada: una fracFLyQ GHO $'1 FHOXODU TXH SXHGH SURFHGHU GHO cromosoma o del plsmido del hospedador, durante el ensamblaje del virus pasa a formar SDUWH GHO $'1 GH OD SDUWtFXOD YtULFD PDGXUD UHemplazado el genoma del fago. Una vez que son liberados, estos fagos anormales pueden SHJDUVH D RWUDV FpOXODV \ GRQDU $'1 SHUR QR dan lugar a lisogenia ni a lisis dado que no pueden replicarse independientemente por carecer GH JUDQ SDUWH GHO $'1 IiJLFR 6L ORV JHQHV GHO donador no sufren recombinacin homloga con el cromosoma de la bacteria de la clula receptora se perdern. b) transduccin especializada (restringida): ocurre slo en algunos virus atemperados, es decir, aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biolgico. En HVWH PHFDQLVPR HO $'1 GH XQD UHJLyQ HVSHFtFD GHO FURPRVRPD GHO KRVSHGDGRU VH LQWHJUD directamente en el genoma del fago, reemplazando algunos de sus genes. El genoma fgico recombinante puede empaquetarse seguidamente en una cabeza de fago y el resto del fago puede ensamblarse normalmente. Este fago puede carecer de la capacidad de repliFDU QR REVWDQWH SXHGH LQ\HFWDU VX $'1 TXH contiene adems algunos genes de la clula receptora a una nueva clula receptora. Puede tambin ocurrir recombinacin homloga, VLQ HPEDUJR FRPR HO $'1 GRQDGRU EDFWHULDno est formando parte del genoma de un fago atemperado se presentan dos posibilidades: TXH HO $'1 VH LQWHJUH HQ HO FURPRVRPD GHO hospedador durante la lisogenizacin, o que el $'1 VH UHSOLTXH HQ HO UHFHSWRU FRPR SDUWH GH
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XQD LQIHFFLyQ OtWLFD (Q DPERV FDVRV OD SDUWtFXOD YtULFD WUDQVGXFWRUD HV QRUPDOPHQWH GHIHFWLYD FRPR YLUXV \D TXH ORV JHQHV YtULFRV KDQ sido reemplazados. Si bien no todos los fagos tienen la capacidad de transducir, ni todas las bacterias son transducibles, el fenmeno est OR VXFLHQWHPHQWH H[WHQGLGR FRPR SDUD DVXmir que desempea un importante papel en las transferencias genticas que se producen en la naturaleza. Conjugacin: mecanismo de transferencia gentica mediada por un plsmido que requiere contacto de clula a clula. Ciertos plsmidos y WUDQVSRVRQHV FRQMXJDWLYRV FRQHUHQ D VXV Fplulas hospedadoras la capacidad de transferir $'1 D RWUDV FpOXODV SRU FRQMXJDFLyQ /D FRQMXgacin requiere una clula donadora, que contiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece de l. El proFHVR GH FRQMXJDFLyQ SUHVHQWD FDUDFWHUtVWLFDV diferenciales segn se trate de bacterias Gram positivas o Gram negativas. En el primer caso, las clulas receptoras secretan un pptido de pequeo tamao que provoca que la clula donadora sintetice un componente adhesivo en la VXSHUFLH FHOXODU (O $'1 SODVPtGLFR HV SRVteriormente transferido desde el donador a la clula receptora adherida. Estos cruzamientos SXHGHQ WHQHU OXJDU HQ PHGLRV OtTXLGRV (Q HO VHJXQGR FDVR HO SOiVPLGR FRGLFD HQWUH RWUDV SURWHtQDV ODV VXEXQLGDGHV GH OD SURWHtQD GHO pelo sexual, mediante el cual se realiza el contacto. El pelo constituye un puente de conjugaFLyQ D WUDYpV GHO FXDO SDVD HO $'1 SHUPLWLHQGR HO DSDUHDPLHQWR HVSHFtFR 'XUDQWH OD FRQMXgacin, pueden resultar movilizados otros elementos genticos, como grandes bloques del cromosoma del hospedador u otros plsmidos. Transposicin conjugativa: es una conjugacin independiente del plsmido, un tipo de conjugacin facilitada por un transposn conjugativo, que pueden encontrarse tanto en el cromosoma como en los plsmidos. El contacto entre las bacterias donadora y receptora induce la escisin del transposn en el donador: en cada extremo del transposn (integrado), se producen un par de cortes alternos de modo que al escindirse una de las cadenas en
cada extremo del transposn porta con ella (generalmente) seis nucletidos de la molcula hospedadora. (Estas secuencias terminales de simple cadena se denominan secuencias acoplantes). El transposn escindido se circulariza entonces como resultado del apareamiento de entre las secuencias acoplantes. Parece proEDEOH TXH VyOR VH WUDQVHUD XQD VLPSOH FDGHQD al receptor, y que la cadena complementaria se sintetice, en el receptor, antes de la insercin. Las estrategias de introduccin de vectores en clulas hospedadoras utilizadas en las tcnicas in vitro del ADN recombinante, han sido GHVDUUROODGDV HQ EDVH D PRGLFDFLRQHV GH HVtos procesos naturales de transferencia de material gentico en procariotas. 2. ENZIMAS UTILIZADAS EN LA GENERACIN DE ADN RECOMBINANTE El requisito primordial para la clonacin GH XQ JHQ R VHJPHQWR GH $'1 GH LQWHUpV HV poder contar con dicho fragmento en forma individual, aislado desde su entorno gnico. 3DUD HOOR OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQte cuenta con una herramienta indispensable, las endonucleasas de restriccin. Estas HQ]LPDV UHFRQRFHQ VHFXHQFLDV HVSHFtFDV GH $'1 GH D EDVHV GH H[WHQVLyQ \ HVcinden los enlaces fosfodister del material gentico en dichos sitios, denominados sitios de restriccin. Para actuar como sustrato de HVWDV HQ]LPDV HO $'1 GHEH KDOODUVH FRPR doble hebra. 6RQ H[WUDtGDV GH RUJDQLVPRV SURFDULyWLcos, donde actan como un mecanismo de defensa para degradar material gentico extrao que entra en la clula, proveniente principalmente de fagos. Para diferenciar el $'1 SURSLR GHO H[WUDxR ODV EDFWHULDV WLHQHQ OD FDSDFLGDG GH PHWLODU VX SURSLR $'1 LQPHdiatamente despus de la replicacin, hacindolo de este modo irreconocible por las endonucleasas. Las endonucleasas se nombran en relacin a las bacterias de las que fueron aisladas por primera vez, considerando que la primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta OHWUD LQGLFD OD FHSD \ XQ Q~PHUR DO QDO LQGLFD HO RUGHQ HQ TXH IXH LGHQWLFDGD OD HQ]LPD en esa cepa. Segn este criterio, la enzima EcoRI, representa a la primer endonucleasa
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Figura 4. &RUWH GHO $'1 SRU HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ 5HFRQRFLPLHQWR \ HVFLVLyQ GH secuencias palindrmicas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzima transferasa terminal para la incorporacin de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuencias QR SDOLQGUyPLFDV /DV HFKDV LQGLFDQ ORV VLWLRV GH FRUWH PLHQWUDV TXH ODV VHFXHQFLDV UHFRQRFLGDV VH VHalan en negrita.
aislada en el gnero Escherichia, especie coli, cepa RV 13. Se utiliza el trmino isoquizmeros para las enzimas que reconocen la PLVPD VHFXHQFLD GH $'1 SHUR KDQ VLGR REtenidas de diferentes especies de bacterias. Pueden diferenciarse tres tipos de enzimas de restriccin. Las de tipo I y III escinden en sitios alejados de la secuencia de reFRQRFLPLHQWR UHTXLULHQGR GH $73 SDUD UHDOLzar el traslado del sitio de reconocimiento al de accin y tienen actividad de restriccin y metilacin simultneamente. En cambio, las de tipo II cortan en el sitio de reconocimiento, tienen actividad de restriccin exclusivamente y reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Estas ltimas son las utilizaGDV SDUD HO FORQDGR GH $'1 DXQTXH WLHQHQ otras aplicaciones como las construccin de mapas de restriccin de un plsmido o bacWHULyIDJR IUDJPHQWDFLyQ GHO $'1 JHQyPLFR para su separacin por electroforesis con aplicacin en tcnicas como Southern Blot R QJHUSULQWLQJ R OD JHQHUDFLyQ GH IUDJPHQtos para ser usados como sondas.
Las escisiones realizadas por las endonucleasas de tipo II, pueden resultar en extremos romos o cohesivos. En el primer caso, se producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a asociarse con una cadena complementaria por apareamiento de bases (Fig. 4a), a secuencias complementarias de otro fragmento con colas generadas por la misma enzima. Cuando se generan extremos romos, el $'1 HV FOLYDGR HQ HO FHQWUR GH OD VHFXHQcia de reconocimiento, en el mismo punto en ambas cadenas, no quedando bases desapareadas en los extremos por lo que no presentan tendencia a unirse con otros fragmentos por complementariedad (Fig. 4b). $XQTXH SRU VX HVSHFLFDG \ YHUVDWLOLGDG las endonucleasas de restriccin son las enzimas las mas renombradas, la tecnoORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH QR VHUtD IDFtible sin la participacin en el proceso de otras enzimas de roles diversos (Tabla 1).
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Enzima Endonucleasas de tipo II Ligasa de ADN
Accin
Aplicacin
Clivaje sitio -especifico del ADN Generacin de fragmentos de ADN Unin de dos fragmentos de ADN con extremos romos, en presencia de ATP. Forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una cadena polinucleotdica y el extremo 3 de otra cadena Construccin de bibliotecas de cDNA. Amplificacin por PCR Permite ligado con otro polinucletido o incorporacin de fosfato marcado. Genera extremos cohesivos oligo dT u oligo dA
Transcriptasa reversa Polinucleotido kinasa
Sntesis de una hebra de ADNc utilizando como molde ARN. Incorporacin de un grupo fosfato al e xtremo 5de un polinucletido. Adicin de colas homopolimricas al extremo 3OH de ADN doble hebra lineal Remocin de nucletidos del extremo 3 de un ADN doble hebra. Remocin de nucletidos del extremo 5 de ADN doble hebra. Remocin de fosfatos terminales de extremos 5 Fragmento de una enzima ADN polimerasa, con actividad DNA polimerasa y exonucleasa en direccin 3'?5'.
Transferasa Terminal
Exonucleasa III
Expone los extremos 5.
Exonucleasa del fago l
Expone los extremos 3.
Fosfatasa alcalina
Fragmento klenow
Impide autoligado de vectores. Permite la incorporacin de fosfato 5 marcado. Genera extremos romos desde el ext remo 3, por sntesis complementaria o clivaje de nucletidos desapareados.
Tabla 1. $OJXQDV HQ]LPDV XWLOL]DGDV HQ OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH
3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ADN: ELECTROFORESIS EN GEL La electroforesis es una tcnica que permite la separacin de molculas en funcin de su diferente movilidad en un campo elctrico, siendo el parmetro esencial su diferencia en carga elctrica. Sin embargo, determinados soportes como los geles de agarosa o poliacrilamida, ofrecen una resistencia notable al avance de ODV PROpFXODV $XQTXH HO SDUiPHWUR TXH ULJH el avance es la relacin carga/masa, como en los cidos nucleicos la carga elctrica es proporcional a la longitud en nucletidos, la relacin carga/masa es la misma para todas las molculas. Como resultado, el efecto de retardo del gel depende del tamao molecular por lo que la electroforesis separa los fragmentos de cido nucleico segn su tamao o longitud. La agarosa es un polisacrido, cuyas disolu-
ciones (0,5 - 2%) forman un gel semislido al enfriarse, constituido por una matriz o trama triGLPHQVLRQDO GH EUDV SROLPpULFDV TXH UHWDUGD el paso de las molculas de cido nucleico a su travs, en funcin de su tamao. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de acrilamida y bis-acrilamida, catalizada por el agente oxidante persulfato de amonio y la amina terciaria TEMED como agente reductor. La variacin de la concentracin de acrilamida SRVLELOLWD OD PRGLFDFLyQ FRQWURODGD HO WDPDxR del poro. Estos geles presentan menor rango de separacin que los geles de agarosa, pero mayor poder de resolucin, pudiendo discrimiQDU IUDJPHQWRV GH $'1 FRQ GLIHUHQFLD GH WDmao de slo una base. Se usan adems para OD VHSDUDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV Para establecer el tamao de fragmentos separados se utilizan marcadores moleculares, que consisten en una mezcla de fragmentos de
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$'1 GH WDPDxR FRQRFLGR D SDUWLU GH ORV TXH se puede inferir el tamao de la muestra analizada. Se establece una curva de calibrado en OD TXH VH FRQVLJXH OD OLQHDOLGDG JUDFDQGR HO tamao en funcin de la inversa de la movilidad o el logaritmo del tamao respecto de la movilidad. Dentro de las aplicaciones ms comunes de OD HOHFWURIRUHVLV HQ JHO HQ ELRORJtD PROHFXODU SRGHPRV PHQFLRQDU FKHTXHR GH OD DPSOLFDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH 3&5 LGHQWLFDFLyQ GH SROLPRUVPRV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV PHdiante el establecimiento de sus patrones de restriccin. 4. HIBRIDACIN. ANLISIS MOLECULAR DE ADN, ARN Y PROTENAS /D KLEULGDFLyQ HV OD FRQVWUXFFLyQ DUWLFLDO GH un cido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos cidos nucleicos monocatenarios. 3DUD TXH H[LVWD OD IRUPDFLyQ GH KtEULGRV HVWDbles debe haber un alto grado de complemenWDULGDG 6H GHQH IRUPDOPHQWH FRPR VRQGD SUREH D XQ IUDJPHQWR GHWHUPLQDGR GH $51 R $'1 PDUFDGR TXtPLFD R UDGLRDFWLYDPHQWH utilizado para localizar determinadas secuencias de cidos nucleicos mediante hibridacin. A) Anlisis de ADN por hibridaciones Southern Blot Los procedimientos utilizados, para separar iFLGRV QXFOHLFRV \ SURWHtQDV VH ULJHQ SRU HO mismo principio, pero involucran algunas difeUHQFLDV GH WpFQLFDV GHELGDV D ODV FDUDFWHUtVWLcas particulares de cada clase de molculas. En 1975, E. M. Southern, public un nuevo procedimiento que permiti a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de $'1 VREUH IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ VHSDUDdos por electroforesis en gel. La principal caUDFWHUtVWLFD GH HVWD WpFQLFD HV OD WUDQVIHUHQFLD GH ODV PROpFXODV GH $'1 TXH KDQ VLGR GLJHULdas por endonucleasas de restriccin y separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se GHQRPLQD 6RXWKHUQ %ORW HQ KRQRU DO FLHQWtco que desarroll la tcnica (Fig. 5). Para reaOL]DUOD HO $'1 HV GHVQDWXUDOL]DGR DELHUWR HQ
Figura 5. Mtodo de hibridacin de Southern. a) EsFLVLyQ HQ]LPiWLFD R PHFiQLFD GHO $'1 E LQFOXVLyQ GHO $'1 HQ HO JHO GH DJDURVD \ FRUULGD HOHFWURIRUpWLFD F WUDQVIHUHQFLD GH ODV PROpFXODV GH $'1 GHVGH HO JHO GH DJDURVD KDFLD XQ OWUR GH QLWURFHOXORVD SRU FDSLODULGDG SUHYLD GHVQDWXUDOL]DFLyQ GHO $'1 d) hibridacin con la sonda monohebra, seguida de ODYDGRV \ GHWHFFLyQ SRU DXWRUUDGLRJUDItD
sus dos cadenas), ya sea antes o durante la transferencia, mediante tratamiento alcalino. 8QD YH] FRPSOHWDGD OD WUDQVIHUHQFLD HO $'1 es inmovilizado sobre la membrana por exposicin a elevada temperatura o a radiacin UV. 8QD VRQGD GH $'1 FRQWHQLHQGR OD VHFXHQFLD GH LQWHUpV HV HQWRQFHV LQFXEDGD FRQ HO $'1 inmovilizado. La sonda slo va a hibridar con PROpFXODV GH $'1 TXH FRQWLHQHQ OD VHFXHQFLD
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de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes mtodos: con elementos radioactivos, o compuestos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el que haya sido marcada. B) Anlisis de ARN por transferencia e hibridacin: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado FRQ ODV PROpFXODV GH $'1 ODV PROpFXODV GH $51 WDPELpQ SXHGHQ VHU VHSDUDGDV SRU HOHFtroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de $51 VH GHQRPLQD 1RUWKHUQ EORW HQ UHFRQRFLmiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la tcnica Southern blot. $PERV SURFHGLPLHQWRV VRQ HVHQFLDOPHQte idnticos. Sin embargo, las molculas de $51 VRQ PX\ VHQVLEOHV D OD GHJUDGDFLyQ SRU HQ]LPDV $51DVDV 3RU OR WDQWR VH GHEH WHQHU mucha precaucin para evitar la contaminacin GH ORV PDWHULDOHV FRQ HVWDV HQ]LPDV $GHPiV OD PD\RUtD GH ODV PROpFXODV GH $51 FRQWLHQHQ estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas en base a su tamao. La desnaturalizacin VH SURYRFD LQFRUSRUDQGR IRUPDOGHKtGR X RWUR TXtPLFR GHVQDWXUDOL]DQWH D OD VROXFLyQ WDPSyQ (buffer) utilizada en la electroforesis. Despus de la transferencia a la membrana apropiada, ODV PROpFXODV GH $51 SXHGHQ KLEULGDU FRQ VRQGDV GH $'1 R $51 C) Anlisis de protenas por transferencia e inmunodeteccin o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la sepaUDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV 'HELGR D TXH PXFKDV GH ODV SURWHtQDV HVWiQ FRPSXHVtas por dos o ms subunidades, las cadenas SROLSHSWtGLFDV LQGLYLGXDOHV VRQ VHSDUDGDV SRU electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que acta como
DJHQWH GHVQDWXUDOL]DQWH GH ODV SURWHtQDV /RV polipptidos separados por electroforesis tambin pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados XWLOL]DQGR DQWLFXHUSRV HVSHFtFRV (VWD WUDQVIHUHQFLD GH SURWHtQDV VH GHQRPLQD :HVWHUQ blotting y se realiza utilizando una corriente HOpFWULFD SDUD WUDVODGDU ODV SURWHtQDV GHVGH HO JHO D OD VXSHUFLH GH OD PHPEUDQD 'HVSXpV GH OD WUDQVIHUHQFLD OD SURWHtQD GH LQWHUpV HV LGHQWLFDGD PHGLDQWH OD XQLyQ D XQ DQWLFXHUSR HVSHFtFR TXH HVWi FRQMXJDGR PDUFDGR \D sea con istopos radioactivos, que permiten la GHWHFFLyQ SRU DXWRUDGLRJUDItD R FRQ HQ]LPDV que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. 5. AMPLIFICACION DEL ADN: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) /D 3&5 FRQVWLWX\H XQD WHFQRORJtD SRGHURVD TXH LQYROXFUD OD VtQWHVLV HQ]LPiWLFD in vitro de PLOORQHV GH FRSLDV GH XQ VHJPHQWR HVSHFtFR GH $'1 /D UHDFFLyQ VH EDVD HQ OD KLEULGDFLyQ de un par de oligonucletidos, diseados en base a la secuencia de inters y sintetizados DUWLFLDOPHQWH D OD VHFXHQFLD GH $'1 )LJ Estos oligonucletidos funcionan como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan la VHFXHQFLD D VHU DPSOLFDGD /D SULPHUD HWDSD de la reaccin involucra la desnaturalizacin GHO $'1 GH GREOH FDGHQD SRU HOHYDFLyQ GH la temperatura a 92-95C. Posteriormente comienzan los ciclos de PCR, que comprenden: desnaturalizacin de la doble cadena, unin SRU FRPSOHPHQWDULHGDG GHO FHEDGRU DO $'1 GH VLPSOH KHEUD \ UHSOLFDFLyQ GHO $'1 D SDUtir del cebador, catalizada por la enzima Taq polimerasa. La temperatura de unin de los FHEDGRUHV DO $'1 GH FDGHQD VLPSOH GHSHQGH de la secuencia y tamao del oligonucletido, DVt FRPR GH OD HVWUDWHJLD HVSHFLFD GH WUDEDMR comprendindose en trminos generales entre ORV & /D IDVH GH VtQWHVLV GH $'1 FRPplementario se lleva a cabo a la temperatura ptima para que la Taq polimerasa realice la replicacin a partir de cada extremo 3 de los FHEDGRUHV 6H WUDWD GH XQD $'1 SROLPHUDVD termo-resistente aislada de Thermus aquaticus, bacteria que vive en fuentes termales.
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Figura 6. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). a) Representacin de una reaccin de PCR de tres FLFORV (Q FDGD FLFOR VH VXFHGHQ WUHV HWDSDV L GHVQDWXUDOL]DFLyQ SRU FDORU GHO $'1 & SDUD VHSDUDU las hebras, ii- unin por complementariedad de los cebadores a las monohebras (en este ejemplo 55C), LLL UHDFFLyQ GH SROLPHUL]DFLyQ GH SRU OD HQ]LPD 7$4 SROLPHUDVD GDQGR OD KHEUD FRPSOHPHQWDULD DO PROGH GH $'1 & E &RPSRUWDPLHQWR GH XQD IUDJPHQWR GH $'1 EODQFR GH ORV FHEDGRUHV D WUDYpV GH ORV PHQFLRQDGRV FLFORV GH 3&5 (Q FDGD FLFOR VH LQFUHPHQWD OD FDQWLGDG GH $'1 EODQFR VLJXLHQGR OD UHODFLRQ 2n, donde n es el nmero de ciclos. En el ejemplo, con tres ciclos de PCR, se obtienen 23 FRSLDV F 9HULcacin de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En la calle de la izquierda se muestra el marcador de peso molecular. En la primera calle, se observan dos fragmentos de 700 y 650 pares de bases (bp), respectivamente, sugiriendo que el cebador ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma. Las calles 2 y 3 presentan banda nica de 700 y 550 bp aaproximadamente en cada caso.
Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerizacin sirve como molde para el siguiente, en cada ciclo se duplica la cantidad de producto sintetizado. Es necesario tener en cuenta que, DGHPiV GH OD HQ]LPD ORV FHEDGRUHV \ HO $'1 GH LQWHUpV SDUD TXH VH SURGX]FD OD DPSOLFDcin es necesaria la presencia de un medio tamponado y desoxinucletidos (dNTPs) y cloruro de magnesio que acta como cofactor de la enzima. El resultado de la reaccin es un IUDJPHQWR GH $'1 GH GREOH FDGHQD FX\RV H[tremos corresponden a los extremos 5 de los cebadores y su tamao a la distancia entre los PLVPRV $ SHVDU GH TXH VH IRUPDQ PROpFXODV ms largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no FRQWULEX\HQ VLJQLFDWLYDPHQWH D OD PDVD QDO de secuencia blanco.
Despus de apenas 20 ciclos se logra ms de un milln de veces la cantidad inicial de la VHFXHQFLD GH LQWHUpV (VWD HVFDOD GH DPSOLcacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso FRQ FDQWLGDGHV PtQLPDV GH $'1 GHO RUGHQ GH pico o nanogramos) y terminar la reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inters. La versatilidad de esta reaccin es enorme y la combinacin de la PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes. Como hemos mencionado, la tcnica de 3&5 HV GH VXPD XWLOLGDG SDUD DPSOLFDU $'1 a partir de fragmentos clonados en distintos vectores, donde los cebadores son complePHQWDULRV D ORV VLWLRV GHO YHFWRU TXH DQTXHDQ el fragmento inserto. La versatilidad de la PCR LQFOX\H OD DPSOLFDFLyQ D SDUWLU GH $'1 GH PDWHULDO HPEHELGR HQ SDUDQD SRU YDULRV DxRV
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de material PRPLFDGR GH UHVWRV IyVLOHV HWF Dentro de los usos mas frecuentes, podemos mencionar la deteccin de enfermedades genticas, determinacin del sexo en embriones humanos, clonacin de genes, mutagnesis in vitro y mapeo y secuenciacin de genomas. A) RT-PCR Se trata de una reaccin de PCR, secundaria D OD WUDQVFULSFLyQ UHYHUVD GHO $51P FDWDOL]DGD por la enzima transcriptasa reversa (RT). Esta HQ]LPD HV FDSD] GH VLQWHWL]DU $'1 XWLOL]DQGR $51 FRPR PROGH \ IRUPD SDUWH GH OD EDWHUtD HQ]LPiWLFD GH ORV UHWURYLUXV YLUXV GH $51 TXH UHTXLHUHQ OD VtQWHVLV GH $'1 SDUD VHU LQWHJUDGRV en el genoma del hospedador. El esquema general de la RT-PCR consiste en un primer paso GH VtQWHVLV GH $'1 FRPSOHPHQWDULR $'1F GH FDGHQD VLPSOH WRPDQGR FRPR PROGH HO $51 (Q HVWD HWDSD OODPDGD VtQWHVLV GH OD SULPHUD KHEUD UVW VWUDQG V\QWKHVLV VH XWLOL]DQ FHEDGRUHV TXH SXHGHQ VHU HVSHFtFRV SDUD HO JHQ GH LQWHUpV hexmeros de secuencia al azar u oligodT, seJ~Q VH EXVTXH VLQWHWL]DU VyOR HO $'1F HVSHFtFR R ORV $'1F FRUUHVSRQGLHQWHV D WRGRV ORV $51V del tejido en cuestin. Por lo tanto, mientras que HO XVR GH SULPHUV HVSHFtFRV DXPHQWD OD HVSHFLFLGDG ORV RWURV GRV WLSRV GH FHEDGRUHV PD[LPL]DQ HO Q~PHUR GH PROpFXODV GH $51P TXH pueden ser analizadas en una muestra pequexD GH $51 (O XVR GH KH[iPHURV DO D]DU SXHGH ocasionar distorsiones por exceso en el nmero GH FRSLDV GH XQ GHWHUPLQDGR $51P FRPSDUDGR FRQ ORV FHEDGRUHV HVSHFtFRV /D VHJXQGD etapa consiste en subsecuentes ciclos de PCR FRQ ORV FHEDGRUHV HVSHFtFRV SDUD OD VHFXHQcia de inters, lo que permite obtener cantidaGHV DSURSLDGDV GHO $'1 SDUD GLYHUVDV PDQLpulaciones genticas. Esta estrategia conjunta de retrotranscripcin y PCR puede ser utilizada SDUD HO HVWXGLR GH $51P D QLYHO GH XQD FpOXOD individual. Los principales alcances de esta tcnica incluyen la determinacin de la presencia o ausencia de un transcripto, estimacin del nivel GH H[SUHVLyQ \ SDUD HO FORQDGR GH $'1F VLQ OD construccin de una genoteca. La tcnica de PCR por transcriptasa reversa es denominada como RT-PCR, la cual desafortunadamente, puede ser confundida con la PCR de Tiempo Real, ya que ambas tienen la misma
VLJOD 57 3&5 'H OR H[SXHVWR HV REYLR OD QHFHVLGDG GH VHU HVSHFtFRV HQ ODV GHQRPLQDFLRnes, sobre todo cuando se combinan ambas tcnicas: Real Time de RT PCR B) PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiempo real (RT-PCR). Una variante de la PCR convencional que se EDVD HQ OD GHWHFFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ VLPXOWiQHD GH OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD SRU ORV SURGXFWRV GH PCR que se acumulan durante el proceso de DPSOLFDFLyQ /D 3&5 FXDQWLWDWLYD RIUHFH OD SRsibilidad de detectar, en tiempo real, el nivel de DPSOLFDFLyQ GH XQD VHFXHQFLD GH LQWHUpV FRQ el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia presente en la muestra original. En la PCR a WLHPSR UHDO ORV SURFHVRV GH DPSOLFDFLyQ \ GHteccin se producen en el mismo vial cerrado, sin QHFHVLGDG GH QLQJXQD DFFLyQ SRVWHULRU $GHPiV PHGLDQWH GHWHFFLyQ SRU XRUHVFHQFLD VH SXHGH PHGLU GXUDQWH OD DPSOLFDFLyQ OD FDQWLGDG GH $'1 VLQWHWL]DGR HQ FDGD PRPHQWR \D TXH OD HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD SURGXFLGD HQ OD UHDFFLyQ HV SURSRUFLRQDO D OD FDQWLGDG GH $'1 IRUPDdo. Esto permite conocer y registrar en todo moPHQWR OD FLQpWLFD GH OD UHDFFLyQ GH DPSOLFDFLyQ Los termocicladores para llevar a cabo la PCR D WLHPSR UHDO LQFRUSRUDQ XQ OHFWRU GH XRUHVFHQcia y estn diseados para poder medir, en cualTXLHU PRPHQWR OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD HQ FDGD XQR GH ORV YLDOHV GRQGH VH UHDOLFH OD DPSOLFDFLyQ /RV VLVWHPDV GH GHWHFFLyQ SRU XRUHVFHQcia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas HVSHFtFDV PDUFDGDV /RV DJHQWHV LQWHUFDODQWHV VRQ XRURFURPRV FX\D HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD DXPHQWD QRWDEOHPHQWH FXDQGR VH XQHQ D $'1 de doble hlice. El ms empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I. El incremento GH $'1 HQ FDGD FLFOR VH UHHMD HQ XQ DXPHQWR SURSRUFLRQDO GH OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD (VWH sistema de deteccin es de fcil implementacin \ PDV HFRQyPLFR TXH HO XVR GH VRQGDV HVSHFtFDV 6LQ HPEDUJR SUHVHQWD EDMD HVSHFLFLGDG (O ULHVJR GH DPSOLFDFLRQHV LQHVSHFtFDV SXHde disminuirse iniciando la reaccin de PCR a temperaturas elevadas (hot-start PCR). Pueden utilizarse polimerasas recombinantes que funcionan despus de ser activadas por temperatura o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-
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nen bloqueado el centro activo de la enzima hasWD TXH VRQ GHVQDWXUDOL]DGRV SRU FDORU $GHPiV OD PD\RUtD GH ORV HTXLSRV GH 573&5 WLHQHQ OD posibilidad de determinar el Tm de los fragmenWRV DPSOLFDGRV TXH GHSHQGH GH VX ORQJLWXG \ de la composicin de sus bases, resultando caUDFWHUtVWLFR GH FDGD IUDJPHQWR /DV VRQGDV GH VHFXHQFLD HVSHFtFD HVWiQ PDUFDGDV FRQ GRV WLSRV GH XRURFURPRV XQ GRQDGRU \ XQ DFHSWRU Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, denominadas tambin sondas TaqMan que conWLHQHQ XQ XRURFURPR GH H[WLQFLyQ GH XRUHVcencia (Q, quencher) unido en el extremo 3 y otro reportero (R) en el extremo 5. Cuando se produce la extensin de la cadena de la sonda por accin de la Taq polimerasa, como resultado del clivaje del extintor por su actividad de exoQXFOHDVD HV HPLWLGD OD XRUHVFHQFLD /D XRUHVcencia detectada durante cada ciclo de la PCR VHUi SURSRUFLRQDO D OD FDQWLGDG GH $'1 TXH VH HVWi DPSOLFDQGR /D FRQDELOLGDG GH ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV mediante esta tcnica requiere de la realizacin en paralelo una curva patrn en las mismas conGLFLRQHV SDUD FRQRFHU OD FDQWLGDG WRWDO GH $'1 TXH VH HVWi DPSOLFDQGR Ente las principales aplicaciones de PCR en tiempo real, podemos mencionar: $PSOLFDFLyQ \ GHWHFFLyQ GH $'1 R $51 HVSHFtFR HQ XQD PXHVWUD Los blancos de deteccin pueden estar asociados a la presencia de agentes patgenos, resultando una herraPLHQWD GH H[WUHPD XWLOLGDG SDUD QHV GH GLDJQyVWLFR FOtQLFR (Q HO FDVR GHO $51P GHEH VHU SUHYLDPHQWH UHWURWUDQVFULSWR D F'1$ PHGLDQWH una transcriptasa reversa que posee actividad HQGR + HV GHFLU UHPXHYH HO $51P SHUPLWLHQGR TXH VH IRUPH OD VHJXQGD KHEUD GH $'1 7DPbin puede aplicarse al estudio de las variantes de splicing (corte y empalme de intrones) del $51P &XDQWLFDFLyQ GHO $'1 R $51 GLDQD HQ OD muestra. 6H SXHGH FXDQWLFDU OD FRQFHQWUDFLyQ LQLFLDO GH $'1 R $51 GLDQD HQ OD PXHVWUD GH manera muy sencilla, a travs de la construccin de una curva de calibrado. El control de la amSOLFDFLyQ FRPR PHGLGD GH OD FRQFHQWUDFLyQ HQ la muestra se obtiene en las fases iniciales de la reaccin, en las que la concentracin de los reactivos no es limitante y el efecto de la variabi-
OLGDG HQ OD HFLHQFLD GH DPSOLFDFLyQ HV PHQRV importante. C) Variantes de la qPCR PCR mltiple: es una variante de la PCR FXDQWLWDWLYD HQ OD TXH VH DPSOLFDQ VLPXOWiQHDmente dos o ms secuencias blanco en una nica reaccin. Este anlisis en simultneo de varias secuencias optimiza el aprovechamiento de la muestra cuando se trata de materiales de disponibilidad limitada y ofrece la posibilidad de realizar controles internos, por ejemplo, la expresin de un gen constitutivo en ensayos de expresin. La PCR mltiple suele ser ms complicada que la simple adicin de varios cebadores a la PCR cuantitativa simple. Se requiere extremar ORV FXLGDGRV HQ FXDQWR DO GLVHxR HVSHFtFR GH cebadores, sugirindose que tengan igual temperatura de fusin (meeting point, Tm), un contenido de GC del 45-60% y que carezcan de homoORJtD HQWUH Vt /D DOWD HFLHQFLD GH ORV FHEDGRUHV en la PCR individual, no asegura el xito en la PCR mltiple, pero aumenta considerablemente las posibilidades de obtenerlo. La combinacin GH RXUyIRURV D XWLOL]DU HQ ORV GLIHUHQWHV FHEDGRres tambin debe elegirse de manera cuidadosa, para que no exista superposicin entre los espectros absorcin y emisin entre ellos. Anlisis de curvas de disociacin. Se basa en la aplicacin de un gradiente de temperaturas creciente despus de la PCR para monitorizar la cintica de disociacin de los fragmentos DPSOLFDGRV SXGLpQGRVH HVWDEOHFHU VX 7P SDUD FRPSUREDU VX HVSHFLFLGDG 7DPELpQ SHUPLWH HO anlisis de mutaciones puntuales, usando una VRQGD FRPSOHPHQWDULD FRQ HO $'1 GH WLSR VDOYDMH TXH DEDUTXH OD SRVLFLyQ GHO SROLPRUVPR (O KtEULGR IRUPDGR HQWUH VRQGD \ $'1 GH WLSR VDOYDje tendr una estabilidad mayor que el formado HQWUH OD VRQGD \ HO $'1 PXWDGR SXHVWR TXH HQ este caso la complementariedad no es absoluta, UHHMiQGRVH HQ XQD 7P VXSHULRU $GLFLRQDOPHQte, permite establecer adems, de forma relatiYD OD FDQWLGDG GH $'1 GH WLSR VDOYDMH \ OD GH tipo mutado cuando ambos estn presentes en la misma muestra. En la Seccin IX, Captulo 4, se detalla ms este punto y se aplica esta tcnica para la deWHFFLyQ GH RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0V.
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6. GENOTECAS Una genoteca (gene library) es una colecFLyQ GH IUDJPHQWRV GH $'1 FORQDGRV TXH UHSUHVHQWDQ HQ VX FRQMXQWR HO $'1 WRWDO GH XQ RUJDQLVPR GH LQWHUpV R ELHQ HO $'1F TXH UHpresenta el conjunto de genes que se estn expresando en un rgano o tejido determinado o bajo una situacin particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una genoteca genmica, donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo mientras que en el segundo se trata de una genoteca de $'1F GRQGH VH HQFXHQWUDQ VROR ODV VHFXHQcias expresadas. Estas genotecas consisten en una coleccin bacterias, conteniendo cada una un vector con HO $'1 LQVHUWR GLVSXHVWDV HQ SRFLOORV /DV JHnotecas carecen de un catlogo a travs del cual se pueda saber cul es el clon que contiene una secuencia de inters, por lo que es necesario realizar un relevamiento de las colonias bacterianas. Para ello se utiliza una sonda GH $'1 FRPSOHPHQWDULD D OD VHFXHQFLD R JHQ buscados, que puede ser conocida o deducirse a partir de la secuencia de aminocidos de la SURWHtQD SXULFDGD 8QD GH ODV SULQFLSDOHV GLFXOWDGHV HQ HO FORQDGR GH $'1 JHQyPLFR HV TXH DOJXQDV VHcuencias estn representadas una sola vez en HO JHQRPD \ HV GLItFLO KDOODUODV 3DUD VXSHUDU HVWD OLPLWDFLyQ GH OD PHWRGRORJtD SXHGH FORQDUVH GLUHFWDPHQWH HO $'1F \D TXH HO Q~PHUR GH FRSLDV GHO $51P HQ HO WHMLGR FRUUHVSRQGLHQte a un gen que se esta expresando es ms elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qu circunstancias o en qu tejido se H[SUHVD XQ JHQ HQ SDUWLFXODU $FWXDOPHQWH HV SRVLEOH FORQDU XQ $'1F D SDUWLU GH PHQVDMHURV poco abundantes en la clula, con concentraciones de 1 a 2 molculas por clula. A) Genotecas de ADNc El primer paso en la construccin de una geQRWHFD GH $'1F FRQVLVWH HQ HO DLVODPLHQWR GHO $51 D SDUWLU GHO WHMLGR R FRQGLFLyQ H[SHULPHQWDO planteada. Los cambios en la expresin gnica DVRFLDGRV D OD H[SRVLFLyQ D HVWtPXORV GLYHUVRV hacen necesaria la preservacin del material
nitrgeno liquido para impedir cambios cuali o cuantitativos de la expresin. La susceptibiliGDG GHO $51 DO FOLYDMH SRU $51DVDV UHTXLHUH de cuidados especiales en el material del laboUDWRULR D VHU HPSOHDGR HQ HO DLVODPLHQWR $ SDUWLU GHO $51 WRWDO HV SRVLEOH VHSDUDU HO $51P WRPDQGR YHQWDMD GH OD FDUDFWHUtVWLFD FROD GH poliadeninas que posee en el extremo 3, meGLDQWH FURPDWRJUDItD GH DQLGDG XWLOL]DQGR columnas de celulosa que tienen ligados oligonucletidos compuestos solo por desoxitimina ROLJRG7 $O SDVDU HO $51 SRU OD FROXPQD HO $51P queda unido por complementariedad DO ROLJRG7 D WUDYpV GH OD FROD GH SROL$ 8QD YH] VHSDUDGR GHO $51 WRWDO HO $51P HV HOXtGR de la columna utilizando una solucin tampn adecuada. (VWDV FRODV GH SROL$ WDPELpQ VRQ XWLOL]DGDV en el prximo paso de clonado, donde funcionan como sitio de unin de los cebadores oligo(dT), para la reaccin catalizada por la enzima transcriptasa reversa. El producto de OD UHDFFLyQ HV XQ KtEULGR $51$'1 /D SULQFLpal limitacin de esta tcnica radica en que en ORV FDVRV HQ ORV TXH HO $'1F HV PX\ ODUJR DO comenzar en el extremo 3, muchas veces no llega la retrotranscripcin al extremo 5. Para VXEVDQDU HVWD GLFXOWDG VH XWLOL]DQ SULPHUV DO azar de 6 a 10 nucletidos de longitud y estn confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes, por lo que la reaccin comienza a partir de muchos sitios diferentes, no solo del extremo 3. Cualquiera de estas estrategias conduce a la obtencin de XQ KtEULGR $51$'1 D SDUWLU GHO FXDO PHGLDQWH 3&5 VH REWLHQH $'1 GH GREOH FDGHQD TXH puede clonarse en el vector apropiado. Para obtener la segunda cadena, se desarroll inicialmente un mtodo que tomaba ventaja de una vuelta o giro que da la hebra recin sintetizada, como un efecto de cambio de rumER GH OD WUDQVFULSWDVD UHYHUVD DO OOHJDU DO QDO GH OD FDGHQD GH $51 (VWH DUWHIDFWR SURYHH XQ FHEDGRU DGHFXDGR SDUD OD VtQWHVLV GH OD VHJXQGD FDGHQD GH $'1 \ SXHGH HOLPLQDUVH XQD YH] obtenida la segunda cadena, con una nucleasa S1, perdindose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5 del mensajero. Existe una segunda tcnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que ge-
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QHUD PROpFXODV GH $'1F PiV ODUJDV \ OD VHgunda es que contiene prcticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH, TXH UHFRQRFH PROpFXODV KtEULGDV $51$'1 \ GLJLHUH OD FDGHQD GH $51 GHMDQGR WUR]RV SHqueos que permanecen unidos a la primera FDGHQD GHO $'1F \ VLUYHQ FRPR primers para OD $'1 SROLPHUDVD , TXH XVD HO $'1F RULJLQDO como molde para sintetizar la hebra complePHQWDULD GH $'1 6ROR TXHGD XQ SHTXHxR VHJPHQWR GH $51 HQ HO H[WUHPR /D VHJXQGD FDGHQD GH $'1 WLHQH DOJXQRV VHFWRUHV QR XQLGRV TXH VRQ VHOODGRV SRU XQD OLJDVD GH $'1 (VWDV PROpFXODV GH $'1F GH GREOH FDGHQD estn listas ahora para ser insertadas en un vector, que puede ser un plsmido o un deriva-
do del fago . Para ello se utiliza la transferasa WHUPLQDO TXH DGLFLRQD FRODV GH SROL$ R SROL7 o se agregan adaptadores, que son sitios arWLFLDOHV GH UHFRQRFLPLHQWR GH DOJXQD HQ]LPD de restriccin que se unen a los extremos de la secuencia. Se trata de oligonucletidos arWLFLDOHV ES TXH VH XQHQ DO IUDJPHQWR XWLOL]DQGR XQD OLJDVD GH $'1 \ VRQ FRUWDGRV con la enzima de restriccin apropiada (Fig. $PERV SURFHGLPLHQWRV VLUYHQ SDUD JHQHUDU H[WUHPRV FRKHVLYRV D Q GH XQLU HO IUDJPHQWR al vector, que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Si se utilizan como vectores los plsmidos, se introducen en las clulas husped (bacterias) por transformacin, Si se eligen los fagos, son empaquetados in vitro para formar
Figura 7. &ORQDGR GH $'1F GH GREOH FDGHQD HQ XQ IDJR (O $'1 GHO IDJR FRQWLHQH GRV VLWLRV GH UHVWULFFLyQ Eco5, (O $'1 GH OD UHJLyQ FHQWUDO QR HVHQFLDO GHO IDJR VH UHHPSOD]D SRU $'1 IRUiQHR XQLHQGR ORV IUDJPHQWRV GHO IDJR FRQ HO $'1 D FORQDU D WUDYpV GH OD HQ]LPD $'1 OLJDVD (V QHFHVDULR SUHYLDPHQWH DGLFLRQDU DO $'1F DGDSWDGRUHV TXH OOHYDQ VLWLRV Eco5, SDUD JHQHUDU H[WUHPRV FRKHVLYRV SDUD DFRSODUVH FRQ HO $'1 GHO IDJR 6H JHQHUD DVt XQD VHULH GH PROpFXODV UHFRPELQDQWHV GLVSXHVWDV HQ WDQGHP DQTXHGDV SRU VLWLRV cos (VWH $'1 UHFRPELQDQWH VH HPSDTXHWD IRUPDQGR SDUWtFXODV LQIHFFLRVDV GHO IDJR TXH VH XWLOL]DUiQ para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de una molcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localizacin del gen de inters en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego ser hibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcacin es radiactiva, por ejemplo, VHUi UHYHODGD SRU DXWRUDGLRJUDItD \ HO FORQ VH LGHQWLFD SRU FRPSDUDFLyQ HQWUH OD PDUFD GH OD PHPEUDQD de nylon y la placa de bacterias.
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SDUWtFXODV YtULFDV TXH LQWURGXFLUiQ VX $'1 HQ el hospedador apropiado por infeccin de un FpVSHG GH EDFWHULDV FUHFLGR VREUH OD VXSHUFLH de una placa de agar (Fig. 7). Si bien los vectoUHV SODVPtGLFRV VRQ PiV IiFLOHV GH PDQLSXODU ODV JHQRWHFDV FRQVWUXtGDV HQ ORV IDJRV SRVHHQ fragmentos de mayor tamao. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un milln colonias bacterianas o de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la SURGXFFLyQ GH SDUWLFXODV YtULFDV GHSHQGLHQGR del vector utilizado, cada una conteniendo un fragmento clonado, distribuidas sobre la placa GH DJDU $ Q GH UHDOL]DU OD E~VTXHGD GH XQ JHQ particular (screening), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrn de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la PHPEUDQD GH Q\ORQ R OWUR )LJ /D E~VTXHda se lleva a cabo por hibridacin con una sonda de cido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de inters. Eleccin de la sonda: En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se XVD XQ VRQGD GRQGH OD KRPRORJtD HV FRPSOHWD el screening puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados ms fuertes, que tienden a despegar lo que se ha XQLGR LQHVSHFtFDPHQWH 6L OD VRQGD QR HV completamente homloga el screening deber realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas ms elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminocidos GH OD SURWHtQD Cuando se utiliza esta estrateJLD HO WDPDxR PtQLPR GH OD VRQGD GHEH VHU de 15 a 16 nucletidos (que permite encontrar VHFXHQFLDV ~QLFDV HQ JHQRWHFDV GH $'1F HXcariticos. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucletidos (correspondientes a 6 aminocidos contiguos). Otra consideracin a tener en cuenta cuando se construye la sonda es TXH H[LVWH PiV GH XQ FRGyQ R WULSOHWH SDUD GHQLU OD PD\RUtD GH ORV DPLQRiFLGRV HV OR TXH VH conoce como la degeneracin del cdigo gentico) por lo que un aminocido puede estar HVSHFLFDGR SRU KDVWD FRGRQHV GLIHUHQWHV
3RU HOOR HVWDV VRQGDV ROLJRQXFOHRWtGLFDV HVWiQ FRQVWLWXtGDV SRU XQD PH]FOD de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponder a la secuencia correcta del gen buscado. El problema de esta estrategia es el elevado nmero de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor nmero de oligonucletidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nuFOHyWLGRV HOLJLHQGR XQD UHJLyQ GH OD SURWHtQD que contenga el menor nmero posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones ms probables para la especie en estudio. Existen otras tcnicas para localizar genes HQ ODV JHQRWHFDV GH $'1F FRPR KLEULGDFLyQ diferencial, si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilizacin de sondas de UHJLRQHV FRQVHUYDGDV HQ IDPLOLDV GH SURWHtQDV para encontrar genes relacionados o bien la utilizacin de vectores de expresin. B) Genotecas Genmicas Un genoteca genmica puede obtenerse de cualquier tejido ya que todas las clulas de un organismo tienen la misma constitucin gentica. Se encuentran en ella, no solo las secuencias expresadas sino tambin las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy JUDQGHV HO GH PDPtIHURV SRU HMHPSOR FRQWLHne 3x109 SE GH $'1 6L HO SURPHGLR WtSLFR GH inserto es de 15.000 pb, se necesitarn unos 200.000 fagos para contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estn representadas al menos una vez, los FiOFXORV HVWDGtVWLFRV GLFHQ TXH GHEHUiQ DQDlizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Por este motivo, especialmente cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del genoma humano o de varias especies vegetales y animales, se utilizan las genotecas GH <$&V R %$&V Genotecas genmicas en cromosomas DUWLFLDOHV La capacidad de clonar fragmentos de ms de 100 kb es crucial para la genmica estruc-
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tural, funcional y comparativa de organismos complejos. Las primeras genotecas genmicas fueron construidas utilizando como vectores los <$&V DXQTXH SRU VXV OLPLWDFLRQHV VH SUHHUH DFWXDOPHQWH HO XVR %$&V \ 3$&V FRPR YHFWRres. Cuando se trata de genomas de plantas, pueden utilizarse como vectores los cromosoPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV ELQDULRV %,%$&V que presentan la ventaja adicional de pueden usarse directamente para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens. Para preparar una genoteca genmica el $'1 HV HVFLQGLGR FRQ HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ o mecnicamente al azar, si se desea evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o FRUWRV 8Q SDVR FUtWLFR HQ HO SURFHVR HV HO DLVODPLHQWR GH PROpFXODV LQWDFWDV GH $'1 GH HOHYDGR SHVR PROHFXODU HVHQFLDOPHQWH $'1 FURmosmico. Para ello las clulas se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura GH JHOLFDFLyQ y se tratan con enzimas y otros UHDFWLYRV SDUD VHSDUDU HO $'1 GH ODV SURWHtQDV FHOXODUHV \ GHO 51$V /D IXQFLyQ GHO EORTXH GH agarosa es proteger a las grandes molculas, que, embebidas en esta matriz, se someten a la digestin con enzimas de restriccin que realicen cortes poco frecuentes (rare cutters). /D SUHSDUDFLyQ GH $'1 GH DOWD FDOLGDG HQ SODQtas es ms complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia GH OD SDUHG FHOXODU TXH GLFXOWD HO HPEHELGR HQ EORTXHV GH D]DURVD 3DUD VXSHUDU HVWD GLcultad se trabaja directamente con los ncleos aislados. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis, los bloques de agarosa FRQWHQLHQGR HO '1$ GLJHULGR SXHGHQ VHU GLUHFtamente embebidos en la matriz del gel que se correr. /D FDQWLGDG GH FORQHV %$&V TXH FRQVWLWXyen una genoteca, se relaciona con el tamao del genoma, el tamao promedio de los insertos y la cobertura genmica esperada. Considerando el tamao de inserto promedio GH ORV FORQHV %$&V SDUD FXEULU FLQFR YHFHV HO JHQRPD XQD JHQRWHFD GH %$&V GH OD HVSHFLH modelo Arabidopsis thaliana, cuyo genoma es pequeo, requerir la obtencin de 7.000 cloQHV %$&V PLHQWUDV TXH XQD GH WULJR FDQGHDO cuyo genoma es dos ordenes de magnitud mayor, tendr que estar compuesta por 500.000 clones.
Separacin de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulsti. Las tcniFDV HVWiQGDU GH VHSDUDFLyQ GH $'1 HQ JHOHV de agarosa no son adecuadas para molculas mayores de 10 kb. Esta limitacin ha sido subsanada con la electroforesis de campo pulstil, en la que el campo elctrico en el gel de agarosa cambia peridicamente de orientacin. De esta manera pueden separarse molculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin de las molculas de este tamao depende de su UHODWLYD IDFLOLGDG R GLFXOWDG SDUD UHRULHQWDUVH en respuesta a direcciones cambiantes de un campo elctrico. Esta tcnica puede utilizarse SDUD KDFHU PDSDV ItVLFRV D JUDQ HVFDOD Preparacin de una genoteca de BACs. Como todo proceso de clonacin, consiste en la preparacin del vector, aislamiento y digesWLyQ GHO $'1 VHOHFFLyQ GH ORV IUDJPHQWRV SRU tamao, transformacin de las bacterias y ensamblado de la genoteca. (O YHFWRU GHEH HVWDU SXULFDGR GLJHULGR \ defosforilado (cuando se corta con una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularizacin). La digestin GHO $'1 HV FUtWLFD SDUD REWHQHU IUDJPHQWRV adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulstil y se separan de la matriz de agarosa por digestin de la misma con agarasa o gelasa, o SRU HOXVLyQ GHO $'1 GHVGH HO JHO (VWR SHUPLWH construir genotecas con fragmentos de tamaos similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciacin y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada FRPR IXHQWH GH $'1 HO WLSR GH LQVHUWR HWF dado que la misma puede utilizarse para variados propsitos. En la Fig. 8 se esquematiza la bsqueda de XQ JHQ HQ XQD JHQRWHFD GH %$&V 0iV GHtalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados puede encontrarse en el FDStWXOR FRUUHVSRQGLHQWH D JHQyPLFD
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Figura 8. %~VTXHGD GH XQ JHQ HVSHFtFR HQ XQD JHQRWHFD GH %$&V PHGLDQWH 3&5 /DV SODFDV GH cultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agruSDGDV GH D HQ OWURV R PHPEUDQDV 6H UHDOL]D OXHJR XQD UHDFFLyQ GH 3&5 FRQ HO FHEDGRU HVSHFtFR DO $'1 REWHQLGR GH XQ WXER TXH FRQWLHQH ORV FORQHV FRUUHVSRQGLHQWHV D WUHV OWURV UHSUHVHQWDQGR SODFDV TXH IXHURQ SUHYLDPHQWH DJUXSDGRV &RPR FRQWURO SRVLWLYR VH XWLOL]D HO $'1 YHJHWDO WRWDO WDPELpQ DPSOLcado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia GHO JHQ HQ HO $'1 JHQyPLFR GHO YHJHWDO \ WDPELpQ HQ XQR GH ORV WXERV FRQWHQLHQGR HO $'1 GH SODFDV GH SRFLOORV HQ OD JXUD FRUUHVSRQGH DO WXER TXH FRQWLHQH ORV FORQHV GH ODV SODFDV \ 6H UHDliza en mismo procedimiento con tubos que contienen los clones de cada placa. Cuando se chequean los FRQMXQWRV LQGLYLGXDOHV VH HQFXHQWUD TXH HO FORQ SRVLWLYR SHUWHQHFH DO OWUR (O SURGXFWR GH 3&5 VH KLEULGD OXHJR FRQ HVWH OWUR \ HVWR QRV GDUi OD SRVLFLyQ H[DFWD HQ OD SODFD GH SRFLOORV GRQGH VH HQFXHQWUD HO gen de inters.
& *HQRWHFDV GH FURPRVRPDV HVSHFtcos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe est XELFDGR HQ XQ FURPRVRPD HVSHFtFR VLPSOLFD mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una tcnica que permite separar cromosomas metafsicos WHxLGRV FRQ HO FRORUDQWH XRUHVFHQWH +RHFKVW SDUD UHJLRQHV ULFDV HQ $7 \ FURPRPLFLQD $ SDUD UHJLRQHV ULFDV HQ *& /RV FURPRVRPDV WHxLGRV XRUHVFHUiQ FXDQGR VH H[SRQJDQ D OX] UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm +RHFKVW R QP FURPRPLFLQD $ Las cantidades y proporciones de colorantes YDUtDQ SDUD FDGD FURPRVRPD \ XQD FRPSXWD-
GRUD UHFRQRFH HO SDWUyQ XRUHVFHQWH WtSLFR GH FDGD FURPRVRPD $OJXQRV FURPRVRPDV VRQ muy similares por lo que no pueden ser separados. Se necesita un milln de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. Tambin puede microdisectarse un cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se utiliz esta tcnica para cromosomas grandes, IiFLOPHQWH GLVWLQJXLEOHV SRU PLFURVFRStD GH FRQWUDVWH GH IDVH $FWXDOPHQWH OD FRPELQDFLyQ con PCR posibilita la aplicacin de la tcnica a cualquier cromosoma. Estos son teidos con
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Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son FRUWDGDV FRQ DJXMDV GH YLGULR XOWUDQDV \ FORnadas. Cebadores posicionados en el vector SHUPLWHQ DPSOLFDU VHFXHQFLDV GHVFRQRFLGDV (O $'1 DPSOLFDGR VH FORQD HQ XQ YHFWRU DSURpiado y la localizacin cromosmica de cada clon se determina utilizando hibridacin in situ (ver III.5) 7. SECUENCIACIN DEL ADN CLONADO Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de inters, el paso siguiente es secuenciarlo. La determinacin de la secuencia puede UHDOL]DUVH SRU HO PpWRGR TXtPLFR GH 0D[DP \ Gilbert o por el mtodo enzimtico de Sanger. El primero consiste en la utilizacin de compuestos que destruyen selectivamente una o dos de las EDVHV TXH FRQVWLWX\HQ HO $'1 SDUWLHQGR GH PROpFXODV GH $'1 PDUFDGDV UDGLDFWLYDPHQWH HQ XQ extremo. La destruccin no debe ser total, sino TXH HQ SURPHGLR FDGD PROpFXOD GH $'1 LQGLYLdual, debe ser clivada una vez. En funcin del FRPSXHVWR TXtPLFR XWLOL]DGR \ GH ODV FRQGLFLRQHV GH UHDFFLyQ VH REWLHQHQ IUDJPHQWRV GH $'1 KLGUROLVDGRV D OD DOWXUD GH ODV EDVHV * $* 7& R C. Se generan fragmentos de distinto tamao en funcin de la distancia de la base destruida al extremo marcado del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren en un gel de poliacrilamida que es revelado por autoUUDGLRJUDItD \ OD VHFXHQFLD GHO IUDJPHQWR TXHGD determinada por el patrn de bandas. El mtodo de Sanger, se basa en la interrupcin controlada de la replicacin enzimtica del $'1 DxDGLHQGR D OD UHDFFLyQ GH VtQWHVLV MXQWR con los cuatro desoxinucletidos, un 2,3- didesoxinucletido (ddNTP) marcado. Los ddN73V SXHGHQ VHU LQFRUSRUDGRV DO $'1 SRU OD $'1 SROLPHUDVD SHUR LQWHUUXPSH OD VtQWHVLV GH OD FDdena por carecer del OH en posicin 3, necesario para la formacin del enlace con la base siguiente. Se preparan cuatro reacciones con HO $'1 PROGH HO FHEDGRU ORV FXDWUR G173V \ en cada una de ellas diferencialmente un ddNTPS. Con la proporcin ddNTP:dNTP adecuada, se generan fragmentos de distinta longitud, dependiendo de la distancia de la ltima base incorporada al extremo marcado GHO $'1 (VWRV fragmentos son separados en un gel de polia-
FULODPLGD GRQGH PHGLDQWH DXWRUUDGLRJUDItD VH GHWHUPLQD HO SDWUyQ GH EDQGDV TXH UHHMD OD VHFXHQFLD GHO $'1 )LJ $FWXDOPHQWH VH XWLOL]DQ digitalizadores de imgenes para la lectura de la DXWRUUDGLRJUDItD Messing desarroll una serie de vectores de FORQDGR EDVDGRV HQ HO IDJR ODPHQWRVR 0 muy tiles para el secuenciado enzimtico, con los que se utiliza un cebador universal que se posiciona en un lugar adyacente al sitio de policlonado del vector. La ventaja es que solo una de las cadenas del vector es empaquetada en ODV FDEH]DV GHO IDJR (VWH $'1 GH VLPSOH FDGHna es ideal para utilizar con el mtodo de Sanger. $FWXDOPHQWH VH XWLOL]DQ IiVPLGRV /D DGLFLyQ GH un fago ayudante (helper phage) a las clulas TXH OR FRQWLHQHQ KDFH TXH HO $'1 GHO PLVPR de simple cadena, sea replicado, empaquetado \ H[WUXtGR GH OD FpOXOD $O VHU GH PHQRU WDPDxR (aprox. 3000 bp) que M13 permite la insercin GH IUDJPHQWRV GH $'1 PiV ODUJRV Los proyectos de secuenciacin genmica han requerido mtodos de secuenciado ms veloces y econmicos. Para ello se ha desarrollado una tcnica llamada Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. 6H XWLOL]DQ YHFWRUHV SODVPtGLFRV TXH SHUPLten construir 20 genotecas diferentes a partir del PLVPR $'1 &DGD YHFWRU OOHYD GRV VHFXHQFLDV ~QLFDV TXH DQTXHDQ DO VLWLR GH FORQDGR TXH pueden ser usadas como etiquetas (tags) para HO $'1 FORQDGR \ HVWDUiQ SUHVHQWHV VREUH FDGD fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. Se hace crecer el cultiYR VH DtVOD HO $'1 \ VH VHFXHQFLDQ ORV SOiVPLdos utilizando el mtodo Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de seFXHQFLDFLyQ VH FRUUHQ HQ XQ JHO \ VH WUDQVHUHQ D XQD PHPEUDQD GH Q\ORQ (O OWUR VH KLEULGD VHcuencialmente (es decir, se despega una sonda SDUD OXHJR KLEULGDU FRQ ODV VLJXLHQWH \ DVt VXcesivamente), utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. De esta manera, una sola reaccin produce datos de 20 clones a la vez. $FWXDOPHQWH H[LVWHQ HTXLSRV URERWL]DGRV que pueden llevar a cabo dos de las reacciones ms limitantes en el proceso de secuen-
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Figura 9. (VTXHPD GH OD VHFXHQFLDFLyQ GH $'1 SRU HO PpWRGR GH GLGHVR[LQXFOHyWLGRV GH PDQHUD D PDnual, usando marcacin radiactiva b) automtica, utilizando ddNTPs que emiten color. Se representa a OD KHEUD GH $'1 D VHFXHQFLDU FRQ HO FHEDGRU XQLGR SRU FRPSOHPHQWDULHGDG /D UHDFFLyQ GH VtQWHVLV GHO $'1 FRPSOHPHQWDULR SRU OD HQ]LPD $'1 SROLPHUDVD 3&5 VH GHVDUUROOD D HQ FXDWUR WXERV LQGLYLGXDOHV cada uno con los cuatro desoxinucletidos (dNTPs) y un didesoxinuletido particular (ddNTP). En general, HO G173 PDUFDGR UDGLDFWLYDPHQWH HV G$73 y E HQ XQ ~QLFR WXER FRQ FDGD GG173 XQLGR D XQ PDUFDGRU XRUHVFHQWH GLIHUHQWH /XHJR UHDOL]D OD FRUULGD HOHFWURIRUpWLFD HQ JHO GH SROLDFULODPLGD \ OD VHFXHQFLD HV OHtGD GHVGH OD EDQGD PiV FRUWD H[WUHPR KDFLD HO GH PD\RU ORQJLWXG H[WUHPR GH PDQHUD D PDQXDO y E GLJLWDO OXHJR GH OD H[FLWDFLyQ FRQ OiVHU \ HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD REWHQLpQGRVH XQ FURPDWRJUDPD
ciaGR OD GHWHFFLyQ GH ODV EDQGDV GH $'1 \ OD traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV 6H XWLOL]DQ FRlorantes diferentes, que al ser exitados por lser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciacin de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reaccin con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es
completada los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un JHO HQ XQ VHFXHQFLDGRU DXWRPiWLFR $ PHGLGD que los fragmentos pasan a travs del lser, VXV PDUFDV XRUHVFHQWHV VH H[FLWDQ \ HPLWHQ luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. Despus de ser procesada por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucletido diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro: guanina y azul: citosina) (Fig. 9).
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Lecturas Recomendadas
Madigan M. T., Martinko J. M. and Parker J. 1999 %URFN %LRORJtD GH ORV 0LFURRUJDQLVPRV 2FWDva edicin revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid, Espaa. 6LQJOHWRQ 3 %DFWHULDV HQ %LRORJtD %LRWHFQRORJtD \ 0HGLFLQD WD (GLFLyQ $FULELD Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor. 6RXWKHUQ ( 0 'HWHFWLRQ RI VSHFLF VHTXHQFHV DPRQJ '1$ IUDJPHQWV VHSDUDWHG E\ JHO electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517 )WWHUHU - *LVHO $ ,JOHVLDV 9 .ORWL $ .RVW % Mittelsten Scheid O., Neuhaus G., Neuhaus-Url G., Schrott M., Shillito R., Spangenberg G. and :DQJ = < 6WDQGDUG 0ROHFXODU 7HFKQLTXHV IRU WKH $QDO\VLV RI 7UDQVJHQLF 3ODQWV (Q Gene Transfer to Plants. Potrykus Y, Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual. :DWVRQ - ' %DNHU 7 $ %HOO 6 3 *DQQ $ /HYLQH 0 DQG /RVLFN < 5 %LRORJtD 0ROHFXODU del Gen. 5 Edicin, Ed. Mdica Panamericana. Madrid.
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I. CAPTULO 5. Marcadores Moleculares

0DUtD &DUROLQD 0DUWtQH] 0DUFHOR +HOJXHUD $OLFLD &DUUHUD 5.1. Introduccin Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotiSRV VXSHULRUHV D SDUWLU GH OD LGHQWLFDFLyQ GH fenotipos superiores. El grado de xito en este proceso depende de: i) el nmero de genes involucrados en el control gentico del carcter (herencia monognica o polignica) y las relaciones interallicas (dominancia o aditividad), ii) OD LQXHQFLD GHO DPELHQWH TXH VH PLGH QRUPDOmente a travs del parmetro heredabilidad. El proceso de caracterizacin y/o seleccin se YXHOYH PiV HFLHQWH D WUDYpV GHO XVR GH PDUFDGRUHV JHQpWLFRV GHQLGRV FRPR FDUDFWHUHV TXH SUHVHQWDQ SROLPRUVPR R YDULDELOLGDG H[perimentalmente detectable en individuos de una poblacin segregante y un tipo de herencia predecible segn las leyes de Mendel. Esta variacin puede considerarse a diferentes niveles ELROyJLFRV GHVGH FDPELRV IHQRWtSLFRV KHUHGDEOHV VLJQLFDWLYRV PDUFDGRU PRUIROyJLFR KDVWD OD YDULDFLyQ GH XQ VROR QXFOHyWLGR GH $'1 PDUFDGRU PROHFXODU (O PDUFDGRU LGHDO GHEHUtD VHU DOWDPHQWH SROLPyUFR GHQWUR \ HQWUH HVSHFLHV de herencia mendeliana no episttica, insensible a los efectos ambientales, codominante (capaz de diferenciar individuos heterocigotas de KRPRFLJRWDV GH UiSLGD LGHQWLFDFLyQ \ VLPSOH anlisis, y de deteccin en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En la actualidad existe una gran variedad de marcadores genticos y a lo largo de este FDStWXOR GHVDUUROODUHPRV DTXHOORV PiV IUHFXHQtemente utilizados en plantas. Para una mejor FRPSUHQVLyQ VH SURSRQH FODVLFDU ORV PDUFDGRUHV HQ ODV VLJXLHQWHV FDWHJRUtDV L PDUFDGRUHV PRUIROyJLFRV LL PDUFDGRUHV ELRTXtPLFRV iii) marcadores moleculares, iv) marcadores funcionales o de expresin, vi) marcadores basados en SNPs. 5.2 Marcadores Morfolgicos 6RQ FDUDFWHUtVWLFDV IHQRWtSLFDV GH VHQFLOOD
LGHQWLFDFLyQ YLVXDO WDOHV FRPR IRUPD GH KRMD pubescencia, color de fruto, etc. En todos los casos debe tratarse de caracteres de herencia monognica y predecible segn las leyes de Mendel. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para LQVFULELU H LGHQWLFDU YDULHGDGHV GH WULJR HQ OD 6HFUHWDUtD GH $JULFXOWXUD *DQDGHUtD 3HVFD \ $OLPHQWDFLyQ GH OD $UJHQWLQD (VWH WLSR GH PDUFDGRUHV FRQWULEX\y VLJQLFDWLYDPHQWH DO desarrollo terico del concepto de ligamiento gentico y a la construccin de los primeros mapas genticos de plantas (como por ejemSOR HQ WRPDWH \ PDt] (Q HO PHMRUDPLHQWR GH JLUDVRO ORV SULPHURV KtEULGRV VH REWXYLHURQ utilizando color de hipoctile como marcador ligado al gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran androestULOHV VH XWLOL]DEDQ FRPR OtQHDV PDWHUQDV \ ODV plantas con antocianas que eran frtiles se eliminaban del lote de produccin al comienzo de su desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfolgicos son: i) se encuentran disponibles en un nmero restringido de especies vegetales, utilizadas como sistemas modelo para HVWXGLRV JHQpWLFRV WDOHV FRPR HO PDt] HO WRPDWH \ OD DUYHMD LL EDMR QLYHO GH SROLPRUVPR LLL SXHGHQ SURGXFLU DOWHUDFLRQHV IHQRWtSLFDV TXH GLFXOWDQ HO GHVDUUROOR GH OD SODQWD DOELQLVmo), iv) generalmente de herencia dominante y en algunos casos polignica y, v) muchos de ellos se expresan en estadio de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluacin en los programas de mejoramiento. Un enorme espectro de especies vegetales carece de informacin a este nivel. No obstante, los marcadores morfolgicos permanecen FRPR FDUDFWHUHV ~WLOHV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo. 5.3 Marcadores Bioqumicos 6RQ SROLPRUVPRV SUHVHQWHV HQ FLHUWDV SURWHtQDV GHWHFWDGRV D WUDYpV GH WpFQLFDV ELRTXtPLFDV (O GHVDUUROOR GH ORV PDUFDGRUHV ELRTXt-
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micos produjo una revolucin en los estudios genticos en plantas, que hasta el momento KDEtDQ FRQWDGR FRQ XQ OLPLWDGR Q~PHUR GH PDUFDGRUHV PRUIROyJLFRV /D WpFQLFD SHUPLWtD incluir potencialmente a todas las especies de SODQWDV (Q HVWD SDUWH GHO FDStWXOR QRV UHIHULUHPRV D ODV ,VRHQ]LPDV \ D ODV 3URWHtQDV GH reserva. 5.3.1 Isoenzimas /DV LVRHQ]LPDV VH GHQHQ FRPR GLIHUHQWHV formas moleculares de una enzima, que poVHHQ XQD DFWLYLGDG FDWDOtWLFD FRP~Q HV GHFLU actan sobre el mismo sustrato. Ciertos camELRV HQ HO $'1 TXH FRGLFD HVWDV HQ]LPDV (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos, originando proWHtQDV FRQ OD PLVPD DFWLYLGDG ELROyJLFD SHUR con diferente carga neta y por lo tanto con diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patroQHV FDUDFWHUtVWLFRV GH PLJUDFLyQ HOHFWURIRUpWLFD de las formas iso-enzimticas. Varios factores GHQHQ HO SDWUyQ GH EDQGDV R ]LPRJUDPD L 1~PHUR GH JHQHV TXH ODV FRGLFDQ OD SUHVHQFLD GH YDULRV JHQHV FRGLFDQGR SDUD XQD misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergencia a travs de mutaciones diferentes en cada caso; ii) Estados allicos: el proceso ms simple de generacin de nuevas formas enzimticas es la mutacin de un gen estructural, las variantes allicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia (en un individuo diploide ambos alelos de un ORFXV VRQ H[SUHVDGRV \ YLVXDOL]DGRV $ PRGR de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa $'+ SXHGH FRPSUHQGHU YDULRV ORFL \ DOHORV con denominacin Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c, etc.; iii) Estructura cuaternaria de los productos proteicos: la enzima funcional puede estar compuesta por un nmero variable de sub-unidades. En las formas ms simples o monomricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve ms compleja, encontramos enzimas activas compuestas por GtPHURV WHWUiPHURV HWF (Q HVWH FDVR HO LQGLYLduo heterocigota presenta bandas adicionales
no presentes en los homocigotas, que se generan por la combinacin de sub-unidades coGLFDGDV SRU ORV GLVWLQWRV DOHORV R ORFL )LJXUD 1). Finalmente, iv) Compartimentalizacin subcelular: se encuentran formas enzimticas localizadas en citoplasma, cloroplasto o mitoFRQGULD FRGLFDGDV WRGDV SRU JHQHV QXFOHDUHV pero con diferentes velocidades de migracin.
Figura 1.
Las isoenzimas se extraen por homogenei]DFLyQ GHO WHMLGR VHPLOOD UDt] KRMD HQ FRQGLciones no desnaturalizantes (que preservan la DFWLYLGDG FDWDOtWLFD GH OD HQ]LPD \ VH DQDOL]DQ mediante electroforesis en un soporte slido, generalmente almidn. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destiQD D XQD VROXFLyQ GH UHYHODGR HVSHFtFD TXH consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado. La reaccin que ocurre entre las enzimas presentes en el gel y el correspondiente sustrato generan productos coloreados que conforman el patrn GH EDQGDV /DV PHWRGRORJtDV HPSOHDGDV HQ la extraccin y electroforesis son relativamente sencillas y rpidas y el equipamiento es de bajo costo. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura gentica, sisWHPiWLFD \ ELRORJtD HYROXWLYD DVt FRPR HQ GHVFULSFLyQ GH JHUPRSODVPD H LGHQWLFDFLyQ GH variedades. Su aplicacin en la construccin de mapas se ha visto limitada por el nmero de marcadores isoenzimticos disponibles (en general menor a 50), y por su reducido poliPRUVPR DOHORV 3RU RWUR ODGR ODV IRUPDV HQ]LPiWLFDV H[WUDtGDV GH KRMD R UDt] QR DVt ODV de semilla) presentan variaciones en relacin a
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las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir GH GLVWLQWRV PDUFDGRUHV GH $'1 5.3.2 3URWHtQDV GH UHVHUYD /DV SURWHtQDV GH UHVHUYD VRQ XQ JUXSR KHWHURJpQHR GH SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ OD VHPLlla de planta que tienen por funcin proveer HQHUJtD DO HPEULyQ HQ ORV SULPHURV HVWDGLRV GH FUHFLPLHQWR (VWDV SURWHtQDV KDQ VLGR H[WHQVDmente estudiadas en cereales y oleaginosas y se relacionan directamente con la calidad del grano. /DV SURWHtQDV GH UHVHUYD VH H[WUDHQ PHdiante procedimientos sencillos a partir de las semillas y se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes). No se requiere detectar actividad enzimtica, las proWHtQDV VH YLVXDOL]DQ GLUHFWDPHQWH SRU WLQFLyQ FRQ $]XO GH &RRPDVVLH HYLGHQFLiQGRVH ORV SROLPRUVPRV FRPR GLIHUHQFLDV HQ OD PRYLOLGDG electrofortica. (Q OD PD\RUtD GH ORV FHUHDOHV HVWDV SURWHtQDV HVWiQ FRGLFDGDV SRU YDULRV JHQHV UHODFLR-
nados conformando familias. Varios estudios demuestran que durante la evolucin de estos genes se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos mviles, entre otros rearreglos cromosmicos, que seUtDQ ORV UHVSRQVDEOHV GH JHQHUDU XQ DOWR QLYHO GH SROLPRUVPR SURWpLFR HQWUH \ GHQWUR GH especies. Por ejemplo, en el caso del trigo, las principaOHV SURWHtQDV GH UHVHUYD GHO JUDQR VH GHQRPLQDQ JOXWHQLQDV \ JOLDGLQDV HVWDV SURWHtQDV VRQ capaces de polimerizar durante el amasado de la harina formando una red denominada gluten de importancia fundamental en la elaboracin de pan. Desde un punto de vista gentico, las JOXWHQLQDV VH KD\DQ FRGLFDGDV HQ ORV ORFL Glu1 y Glu-3 y las gliadinas en Gli-1 y Gli-2 pudiendo tener cada uno de estos loci 1, 2 o ms genes; mutaciones en estos genes generan nuevas variantes allicas. Numerosos estudios electroforticos han revelado alto grado de poOLPRUVPR HQ HO Q~PHUR \ OD PRYLOLGDG HOHFWURIRUpWLFD GH HVWDV SURWHtQDV \ PXFKRV GH HVWRV SROLPRUVPRV VRQ XWLOL]DGRV FRPR PDUFDGRUHV genticos para mejorar la calidad panadera del trigo, principalmente en el caso de las gluteninas (Figura 2). Las gliadinas muestran patrones electroforticos ms complejos que las
Figura 2.
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gluteninas y han sido utilizadas en la descripFLyQ GH JHUPRSODVPD H LGHQWLFDFLyQ GH YDULHdades. Como en el caso de las isoenzimas, la DSOLFDFLyQ GH SURWHtQDV GH UHVHUYD HQ OD FRQVtruccin de mapas genticos es limitada por el nmero de marcadores genticos disponibles, sin embargo estos loci representan importantes marcas de referencia, por ejemplo, para los cromosomas 1 y 6 de trigo, donde estn presentes los principales genes de gluteninas y gliadinas. Para ms informacin sobre estructura, proSLHGDGHV \ URO GH ODV SURWHtQDV GH UHVHUYD HQ grano se recomienda la lectura de la revisin de Branlard et al. (2001). La principal ventaja de los marcadores bioTXtPLFRV HV VX IiFLO LPSOHPHQWDFLyQ HQ HO ODERUDWRULR \D TXH LQYROXFUDQ PHWRGRORJtDV VHQFLllas, rpidas y de bajo costo. Como desventajas se pueden citar: baja cobertura del genoma, diFXOWDGHV HQ OD LQWHUSUHWDFLyQ GH ORV UHVXOWDGRV (principalmente para las Isoenzimas) y, en el FDVR GH ODV SURWHtQDV GH UHVHUYD GDGR TXH PXFKRV GH ORV JHQHV FRGLFDQWHV VXHOHQ HVWDU HVtrechamente ligados (familias multignicas), no se puede asumir independencia entre los loci. 5.4 Marcadores moleculares Un marcador molecular es simplemente un VHJPHQWR GH $'1 FRQ XQD XELFDFLyQ HVSHFtFD HQ XQ FURPRVRPD SXQWR GH UHIHUHQFLD cuya herencia puede seguirse en individuos de una poblacin. La secuencia puede pertenecer D UHJLRQHV FRGLFDQWHV JHQHV R VLQ IXQFLyQ conocida. Con el advenimiento de las tcnicas moderQDV GH ELRORJtD PROHFXODU SDUD PiV GHWDOOH YHU I.- 4), surgieron diversos mtodos de deteccin GH SROLPRUVPR JHQpWLFR GLUHFWDPHQWH D QLYHO GH $'1 (Q OD DFWXDOLGDG VH SXHGH REWHQHU XQ nmero prcticamente ilimitado de marcadores en cualquier organismo vivo que permiten analizar la totalidad de la informacin gentica (genoma) de un organismo. Para describir los distintos tipos de marcaGRUHV PROHFXODUHV VH VHJXLUi XQD FODVLFDFLyQ DUELWUDULD HQ EDVH D ODV PHWRGRORJtDV TXH HPplean para su deteccin. Todas estas tcnicas SDUWHQ FRPR SULPHU SDVR GH H[WUDHU $'1 JHnmico de la planta bajo estudio.
5.4.1 Marcadores basados en la hibridacin GHO $'1 5.4.1.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism R SROLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG de fragmentos de restriccin (Botstein et al., 1980) Son los marcadores moleculares ms antiguos y an son usados para algunas aplicaciones importantes como mapeo comparativo y estudios de sintenia entre especies (ver Parte ,,, &DStWXOR $SOLFDFLRQHV GH ORV 0DUFDGRUHV Moleculares"). Este marcador se basa en la comparacin de SHUOHV GH EDQGDV JHQHUDGRV D SDUWLU GHO $'1 de distintos individuos por digestin con enzimas de restriccin. Los fragmentos obtenidos se separan por su tamao mediante electroforeVLV \ VH WUDQVHUHQ D XQD PHPEUDQD GRQGH VRQ desnaturalizados y luego hibridados con una VRQGD (VWD VRQGD HV XQ IUDJPHQWR GH $'1 GH cadena simple (de secuencia conocida o no) que est marcado radioactivamente. La sonda se unir a aquellos fragmentos de restriccin con secuencia complementaria a la misma (ver enzimas de restriccin y mtodo de Southern Blot HQ 3DUWH , &DStWXOR +HUUDPLHQWDV EiVLcas de Ingenieria Genetica). Para la visualizacin, la membrana se exSRQH D XQD SODFD UDGLRJUiFD (Q FXDQWR D la sonda empleada esta puede ser genmica FRQ DOWD SURSRUFLyQ GH $'1 QR FRGLFDQWH QR SHUWHQHFLHQWH D QLQJ~Q JHQ R GH $'1F FXDQdo proviene de un transcripto). Tambin puede REWHQHUVH D SDUWLU GH $'1 GH RUJDQHODV PLtocondrias o cloroplastos). Pueden emplearse sondas aisladas de especies relacionadas (por ejemplo, sondas aisladas de tomate pueden emplearse en papa y viceversa). La variabilidad gentica presente en el marcador molecular proviene de diferencias en la VHFXHQFLD GHO $'1 JHQyPLFR GHELGDV D PXtaciones puntuales en los sitios de restriccin, a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc., TXH PRGLFDQ OD GLVWDQFLD HQWUH SDUHV GH VLtios de restriccin generando fragmentos poOLPyUFRV GH GLIHUHQWHV WDPDxRV )LJXUD 8Q ORFXV 5)/3 HVWi GHQLGR SRU OD FRPELQDcin de una enzima de restriccin y una sonda. Individuos homocigotas poseen el mismo pa-
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Figura 3.
trn de restriccin en ambos cromosomas homlogos y por lo tanto producen una sola banda. Ejemplos de nomenclatura utilizada para loci RFLP son XNpb136 de arroz o Xpsr912-2A de trigo, que hacen referencia al laboratorio de origen y a las sondas utilizadas. Las ventajas de los RFLPs radican en que son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos. Por otro lado, cuentan con las GHVYHQWDMDV GH VHU PX\ ODERULRVRV GLItFLOHV GH automatizar, se necesita disponer de las sondas para la especie en estudio y requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas y trabajar con radiactivo, lo que los hace relativamente costosos. 5.4.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o repeticiones en tandem de nmero variable Los VNTR, tambin conocidos como mini-
satlites, son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases. El nmero de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR: por hibridacin o por tcnicas de PCR. En el priPHU FDVR HO $'1 JHQyPLFR HV GLJHULGR FRQ enzimas de restriccin que reconocen sitios adyacentes a la regin repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana y se detectan mediante sondas. La longitud de los fragmentos de restriccin producidos en diferentes individuos vaUtD GH DFXHUGR DO Q~PHUR GH UHSHWLFLRQHV GHO minisatlite. La diferencia bsica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la tcnica de VNTR las sondas estn constituidas por secuencias homlogas a las secuencias repetidas de los minisatlites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homlogas a secuencias ~QLFDV GHO JHQRPD GHWHFWDQGR DVt XQR R SRcos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma, al contrario del patrn simple de bandas obtenido por RFLP, para minisatlites VH REWLHQH XQ SHUO FRPSOHMR GH EDQGDV P~OWLples. Los VNTR tienen la ventaja que adems GH H[SORUDU HO SROLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG GH los fragmentos de restriccin en cada locus hiSHUYDULDEOH XWLOL]DQ WDPELpQ HO SROLPRUVPR HQ el nmero y distribucin de estos loci a lo largo GHO JHQRPD SRVLELOLWDQGR DVt OD YLVXDOL]DFLyQ simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatlites tambin pueden ser detecWDGRV PHGLDQWH OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH ORV segmentos conteniendo diferente nmero de repeticiones, utilizando iniciadores o "primers" TXH DQTXHHQ ORV 9175 \ OXHJR VX YLVXDOL]Dcin mediante electroforesis y tincin con bromuro de etidio. Esta opcin se ha vuelto ms frecuente con el aumento de informacin de secuencias en bases de datos que permiten el GLVHxR GH LQLFLDGRUHV DQTXHDQWHV D GHWHUPLnados minisatlites. Sin embargo estos marcadores han sido poco utilizados en plantas. 5.4.2 0DUFDGRUHV EDVDGRV HQ OD DPSOLFDFLyQ DUELWUDULD R VHPL DUELWUDULD GHO $'1
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5.4.2.1 5$3'V 5DQGRP $PSOLHG Polymorphic DNAs R $'1 SROLPyUFR DPSOLFDGR DOHDWRULDPHQWH :LOOLDPV HW DO :HOVK \ 0F&OHOODQG /D PHWRGRORJtD GH 5$3' IXH GHVDUUROODGD de forma independiente por dos grupos de (VWDGRV 8QLGRV 8Q JUXSR OD GHQRPLQy 5$3' \ HO RWUR $33&5 Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction o reaccin en cadena de la polimerasa con iniciadores arbitrarios). /D WpFQLFD GH 5$3' HV XQD YDULDQWH GH 3&5 que utiliza un solo oligonucletido de 10 bp TXH KLEULGD DO D]DU FRQ HO $'1 HQ HVWXGLR 3DUD TXH VH JHQHUH XQ IUDJPHQWR 5$3' HV QHFHsario que el oligonucletido iniciador hibride HQ ODV GRV FDGHQDV GHO $'1 HQ RULHQWDFLRQHV RSXHVWDV VXFLHQWHPHQWH FHUFDQDV PHQRV GH ES FRPR SDUD SHUPLWLU OD DPSOLFDFLyQ La secuencia del oligonucletido es aleatoria DO LJXDO TXH ORV VLWLRV GH KLEULGDFLyQ HQ HO $'1 SRU OR WDQWR OD VHFXHQFLD DPSOLFDGD HV GHVFRnocida. El iniciador puede hibridar en distintos VLWLRV GHO $'1 VLQ QHFHVLGDG GH FRPSOHPHQWDriedad exacta de bases, dado que la PCR se hace con temperaturas de unin del iniciador bajas, generando varios fragmentos que son resueltos mediante electroforesis y posterior tincin (Figura 4). Cada banda del patrn de DPSOLFDFLyQ HV FRQVLGHUDGD XQ ORFXV 5$3' GHQLGR SRU OD VHFXHQFLD GHO LQLFLDGRU \ HO SHVR PROHFXODU (O SROLPRUVPR TXH VH REVHUYD HQ-
tre distintos individuos consiste en la presencia R DXVHQFLD GH IUDJPHQWRV GH $'1 DPSOLFDGR debido a mutaciones en el sitio de reconocimiento del iniciador, deleciones, inserciones. Este marcador no permite diferenciar individuos heterozigotas, por lo que es un marcaGRU GRPLQDQWH /RV PDUFDGRUHV 5$3' HVWiQ basados en una tcnica sencilla, de bajo costo de implementacin, automatizable y no radioDFWLYD $ GLIHUHQFLD GH ORV PDUFDGRUHV EDVDGRV en PCR convencional no se requiere informaFLyQ QXFOHRWtGLFD SUHYLD SDUD VX GHVDUUROOR VH dispone de un nmero ilimitado de marcadores \ HO QLYHO GH ORFL SROLPyUFRV HV DOWR /D SULQFLpal desventaja de esta tcnica es su baja reproducibilidad entre laboratorios, en el sentido GH TXH SHTXHxDV PRGLFDFLRQHV HQ OD WpFQLFD FRPR SRU HMHPSOR FRQFHQWUDFLyQ GH $'1 LQLFLDO PRGHOR GH WHUPRFLFODGRU RULJHQ GH $'1 Polimerasa termoestable, etc., pueden alterar HO SDWUyQ GH IUDJPHQWRV GH $'1 JHQHUDGRV SRU 5$3' GH XQD PXHVWUD 5HODFLRQDGRV FRQ ORV 5$3'V HQFRQWUDPRV D ORV PDUFDGRUHV '$) '1$ $PSOLFDWLRQ Fingerprinting &DHWDQR $QROOpV HW DO \ $33&5 $rbitrary Primed 3&5 :HOVK \ 0F&OHOODQG '$) \ $33&5 VRQ WpFQLFDV VLPLODUHV D 5$3' '$) LQYROXFUD HO XVR de iniciadores arbitrarios de 5 pares de bases de longitud. Esto incrementa la probabilidad de DSDUHDPLHQWR FRQ HO $'1 PROGH UHVSHFWR DO
Figura 4.
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5$3' \ SRU OR WDQWR UHVXOWD HQ XQ SHUO PiV complejo de bandas. La visualizacin se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida WHxLGRV FRQ SODWD $33&5 XWLOL]D LQLFLDGRUHV ligeramente ms largos que la tcnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de DPSOLFDFLyQ VRQ PDUFDGRV UDGLDFWLYDPHQWH \ tambin pueden ser resueltos por electroforesis en geles de poliacrilamida. Las ventajas y limitaciones de estas tcnicas son similares a ODV GHVFULSWDV SDUD ORV 5$3' $)/3V $PSOLHG )UDJPHQW /HQJWK Polymorphism R SROLPRUVPRV HQ OD ORQJLWXG GH IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV 9RV HW DO /RV PDUFDGRUHV $)/3 FRQVWLWX\HQ XQD KHrramienta poderosa de anlisis del genoma dado que poseen un alto poder de deteccin GH OD YDULDELOLGDG JHQpWLFD (O HQVD\R GH $)/3 FRPELQD OD HVSHFLFLGDG UHVROXFLyQ \ SRGHU de muestreo de la digestin con enzimas de restriccin con la velocidad y practicidad de la GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV PHGLDQWH 3&5 VLQ necesidad de disponer de informacin previa del genoma a estudiar. Desde su desarrollo y divulgacin esta tcnica se utiliza ampliamente en el anlisis de plantas. Consiste esencialmente en cuatro etapas: i) HO $'1 JHQyPLFR HV FRUWDGR FRQ GRV HQ]LPDV de restriccin. Generalmente una es de corte raro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 pares de bases y otra es de corte frecuente (ej. MseI) que reconoce 4 pares de bases; ii) fragmenWRV GH $'1 GREOH FDGHQD GH D SDUHV GH bases llamados adaptadores se ligan en forma HVSHFtFD D ORV H[WUHPRV GH ORV IUDJPHQWRV REWHQLGRV HQ HO SDVR DQWHULRU JHQHUDQGR DVt HO PROGH SDUD OD DPSOLFDFLyQ SRVWHULRU GHO $'1 LLL VH DPSOLFDQ VHOHFWLYDPHQWH IUDJPHQWRV por PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadores de aproximadamente 20 nucletidos que conWLHQHQ XQD VHFXHQFLD HVSHFtFD FRPSOHPHQWDria a la secuencia de los adaptadores y adems, 1 a 3 nucletidos selectivos adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3. Dado que slo una subpoblacin de los fragmentos RULJLQDOHV HV DPSOLFDGD VH REWLHQH XQ SDWUyQ de bandas que permite un registro adecuado. /D DPSOLFDFLyQ GHVFULSWD HQ LLL VH UHDOL]D HQ GRV HWDSDV XQD SULPHUD DPSOLFDFLyQ VHOHFWL-
YD HPSOHDQGR XQ QXFOHyWLGR DUELWUDULR DPSOLFDFLyQ R SUHDPSOLFDFLyQ \ OXHJR HVWH SURGXFWR GH DPSOLFDFLyQ REWHQLGR HV HPSOHDGR FRPR PROGH HQ XQD QXHYD DPSOLFDFLyQ HPpleando iniciadores que poseen 2 nucletidos VHOHFWLYRV DGLFLRQDOHV DO DQWHULRU DPSOLFDFLyQ R DPSOLFDFLyQ QDO LY (O DQiOLVLV GH ORV IUDJPHQWRV DVt DPSOLFDGRV VH UHDOL]D PHdiante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Si uno de los iniciadores empleados est marcado radiactivamente, se YLVXDOL]DUi PHGLDQWH DXWRUUDGLRJUDItD VL XQR GH los iniciadores est marcado con un compuesWR XRUHVFHQWH SXHGH VHU UHVXHOWR HPSOHDQGR XQ VHFXHQFLDGRU DXWRPiWLFR $OWHUQDWLYDPHQWH se puede visualizar mediante tincin con nitrato de plata (Figura. 5).
Figura 5.
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/D EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GH $)/3 es la ausencia o presencia de fragmentos amSOLFDGRV GH XQ WDPDxR GHWHUPLQDGR GDGR SRU mutaciones puntuales, inversiones, inserciones y deleciones que llevan a la prdida o ganancia de un sitio de restriccin o la alteracin GH OD VHFXHQFLD UHFRQRFLGD R DPSOLFDGD SRU ORV LQLFLDGRUHV $O LJXDO TXH HQ ORV 5$3'V QR es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. 8QD EDQGD $)/3 VH LQWHUSUHWD FRPR XQ ORFXV GHQLGR SRU ODV GRV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ una combinacin de primers que incluyen las bases selectivas (Ej. Eco5,$7&Mse,$$* \ un peso molecular. Su implementacin en laboratorio requiere de una infraestructura considerable, son relativamente laboriosos para su obtencin y el costo es medio a alto. Estos marcadores presentan un alto poder de deteccin de la variabilidad gentica, ya que se explora simulWiQHDPHQWH HO SROLPRUVPR GH DXVHQFLDSUHsencia de sitios de restriccin (como los RFLP) \ OD RFXUUHQFLD R QR GH DPSOLFDFLyQ D SDUWLU GH VHFXHQFLDV DUELWUDULDV FRPR ORV 5$3'V Es un marcador mucho ms robusto que los 5$3'V \D TXH HQ OD DPSOLFDFLyQ VH XWLOL]DQ oligonucletidos ms largos, que aumentan VLJQLFDWLYDPHQWH OD HVSHFLFLGDG GH OD UHDFFLyQ VLQ SHUGHU ODV YHQWDMDV GH OD DPSOLFDFLyQ de secuencias al azar (no requiere informacin SUHYLD GH VHFXHQFLD GH $'1 $VLPLVPR VH pueden emplear distintas enzimas de restriccin e iniciadores selectivos, resultando en una LOLPLWDGD SRVLELOLGDG GH JHQHUDU SROLPRUVPRV 2WUD YHQWDMD GH ORV $)/3V HV HO Q~PHUR GH fragmentos (marcadores) obtenidos por reaccin y resueltos por electroforesis (oscila entre FRQWUD ORV GH 5$3'V Una variante de esta tcnica es la llamaGD F'1$$)/3 TXH HQ YH] GH $'1 JHQyPLFR SDUWH GH $51 PHQVDMHUR TXH HV FRSLDGR D $'1F (VWD PHWRGRORJtD HV HPSOHDGD HQ anlisis de expresin diferencial de genes, estudios del transcriptoma y genmica funcional. 5.4.3. Marcadores moleculares basados en OD DPSOLFDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GHO $'1 En contraste con los marcadores basados en OD DPSOLFDFLyQ GH VHFXHQFLDV DUELWUDULDV ORV
PDUFDGRUHV LQFOXLGRV HQ OD SUHVHQWH FDWHJRUtD UHTXLHUHQ GHO GLVHxR GH LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV SDUD OD DPSOLFDFLyQ GH XQ ORFXV HQ SDUWLFXODU 5.4.3.1 Microsatlites (Litt y Luty 1989) Los microsatlites son regiones hipervariables del genoma que contienen arreglos de secuencias simples en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos que se repiten entre 10 y 100 veces. Los marcadores microsatlites, tambin denominados Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP), Simple Sequence Repeat Polymorphism (SSRP), Simple Sequence Repeats (SSR) o SequenceTagged Microsatellite Sites (STMS) se encuentran distribuidos por todo el genoma de la ma\RUtD GH ODV HVSHFLHV HXFDULRWDV Los microsatlites se detectan mediante su DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 XVDQGR LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV GH D SE GH ORQJLWXG TXH KLEULGDQ HQ OD UHJLyQ TXH DQTXHD DO WDQGHP GH repeticiones (microsatlite). Estos marcadores se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, mediante tincin con plata o por autoradiograItD HQ HO FDVR GH XVDU XQ LQLFLDGRU PDUFDGR radioactivamente). Si se dispone de un secuenciador automtico, se pueden resolver por tamao en este equipo mediante el empleo de XQ LQLFLDGRU PDUFDGR FRQ XQ XRUyIRUR SRVLELlitando un anlisis automatizado. /D EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GHWHFWDdo en microsatlites se basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tandem y, consecuentemente, en el tamao del microsatliWH DPSOLFDGR HQ LQGLYLGXRV GH XQD HVSHFLH Estas diferencias son originadas durante la reSOLFDFLyQ GHO $'1 GHELGR D IDOODV HQ OD DFFLyQ GH OD $'1 SROLPHUDVD GXUDQWH HO FRSLDGR GH una regin repetida donde incorpora o elimina repeticiones. Otro mecanismo responsable de la variacin es el entrecruzamiento desigual entre cromosomas homlogos. En este caso se generan alelos con diferencias mayores en el nmero de repeticiones. El desarrollo de marcadores microsatlites requiere del conocimiento de las secuencias DQTXHDQWHV DGHFXDGDV SDUD HO GLVHxR GH ORV LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV /RV SULPHURV 665 se desarrollaron a travs de un proceso ex-
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perimental complejo que implic la obtencin de genotecas enriquecidas en microsatlites, secuenciacin, diseo de iniciadores aptos SDUD DPSOLFDU PLFURVDWpOLWHV SRU 3&5 \ VHleccin de loci con patrones de herencia simSOH $FWXDOPHQWH ODV VHFXHQFLDV DQTXHDQWHV pueden obtenerse a partir de las secuencias depositadas en las bases de datos (bsqueda in silico). El uso de programas informticos especializados en la bsqueda de microsatlites ha revelado que existen secuencias con estas FDUDFWHUtVWLFDV IRUPDQGR SDUWH GH VHFXHQFLDV que se expresan (genes), denominndose SSR JpQLFRV R (67665V $XQTXH WHQGUtDQ XQ QLYHO GH SROLPRUVPR PHQRU VHUtDQ PiV IiFLOPHQWH transferibles entre especies relacionadas. 8Q ORFXV 665 HVWi GHQLGR SRU ODV VHFXHQFLDV GH ORV LQLFLDGRUHV DQTXHDQWHV DO PLFURVDWpOLWH 3RU HO DOWR SROLPRUVPR TXH VXHOHQ presentar por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autgamas como el trigo. Estos marcadores son codominantes (ambos alelos de un individuo heterocigota pueden ser YLVXDOL]DGRV JHQRPDHVSHFtFRV \ DOWDPHQWH SROLPyUFRV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ ORV 5)/3V \ 5$3'V 6X LPSOHPHQWDFLyQ HQ XQ ODERUDWRULR requiere de mayor infraestructura y presupuesWR TXH ORV 5$3'V VLHQGR VHPHMDQWHV HQ HVWH DVSHFWR D ORV $)/3V 5.4.3.2 Otros marcadores basados en los microsatlites Una de las limitaciones para la utilizacin de los marcadores microsatlites es la necesidad GH FRQRFHU ODV UHJLRQHV TXH DQTXHDQ D ODV repeticiones para poder desarrollar los iniciaGRUHV HVSHFtFRV $Vt VH GHVDUUROODURQ PDUcadores moleculares buscando explorar las repeticiones microsatlites sin necesidad de VHFXHQFLDU HO $'1 (QWUH HVWD FODVH GH PDUFDdores podemos encontrar: MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR): en el desarrollo de este marcador molecular, se utiliza un iniciador que contiene las repeticiones GH XQ PLFURVDWpOLWH HVSHFtFR SDUD DPSOLFDU HO $'1 (Q ODV UHJLRQHV GHO $'1 TXH SRVHHQ las dos secuencias inversamente orientadas GH HVWH PLFURVDWpOLWH HVSHFtFR KLEULGDUi HO LQLFLDGRU \ DPSOLFDUi HO IUDJPHQWR GH $'1 OR-
FDOL]DGR HQWUH HOODV &RQFHSWXDOPHQWH VHUtD VLPLODU D 5$3' HPSOHDQGR XQ LQLFLDGRU FRQ OD secuencia repetida del microsatlite. ISSR (,QWHU665 DPSOLFDWLRQ): se basan en OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 HPSOHDQGR LQLFLDGRres que contienen en su secuencia repeticiones de di o trinucletidos junto con 4 bases nucleoWtGLFDV GHWHUPLQDGDV HQ XQR GH VXV H[WUHPRV (VWR SHUPLWH OD DPSOLFDFLyQ SDUFLDO GH WRGDV ODV UHJLRQHV SRWHQFLDOPHQWH DPSOLFDGDV SRU el marcador MP-PCR, descripto anteriormente, aumentando la reproducibilidad, que es una de ODV OLPLWDFLRQHV GHO XVR GH ORV 033&5 $O WHner en el iniciador esas 4 bases extras, a este tipo de marcador se lo conoce tambin como PLFURVDWpOLWH DQFODGR $033&5 Anchored Microsatellite-Primed PCR). 6$03/( 6HOHFWLYH $PSOLFDWLRQ RI Microsatellite Polymorphic Loci R DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD GH ORFL PLFURVDWpOLWHV SROLPyUFRV (Q HVWD PHWRGRORJtD VH DPSOLFDQ ORFL PLFURVDWpOLtes a partir de un iniciador arbitrario empleando GRV WpFQLFDV PLFURVDWpOLWHV \ $)/3 6H UHDOL]DQ WRGDV ODV HWDSDV GH $)/3 HV GHFLU GLJHVtin con dos enzimas de restriccin, ligacin de DGDSWDGRUHV SUHDPSOLFDFLyQ \ DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD GHO $'1 6yOR TXH HQ OD DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD QDO VH HPSOHD HO LQLFLDGRU GH $)/3 con sus tres nucletidos selectivos en combiQDFLyQ FRQ XQ LQLFLDGRU 6$03/( (VWH LQLFLDdor, posee en su secuencia bases complemenWDULDV D XQ PLFURVDWpOLWH /D EDQGD SROLPyUFD UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GHO $'1 FRQ HO PDUFDGRU 6$03/( SXHGH VHU FRQYHUWLGD HQ XQ marcador microsatlite convencional, a parir del clonado y secuenciacin de la misma. 5.4.3.3. STS (Sequence-Tagged Sites) o sitios marcados por secuencias (Olson et al. 1989) STS es un trmino general dado a un locus HQ SDUWLFXODU GHQLGR SRU ODV VHFXHQFLDV GH VXV LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV 8Q 676 SXHGH VHU JHnerado para cualquier sitio del genoma siempre y cuando ese sitio (locus) pueda ser clonado y secuenciado. Un STS debe satisfacer dos condiciones: se debe conocer su secuencia, TXH SHUPLWH GLVHxDU LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV TXH SHUPLWLUiQ VX DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 \ WHner una localizacin nica en el cromosoma o
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genoma estudiado. Estos marcadores son suPDPHQWH XVDGRV HQ PDSHR ItVLFR GHWDOODGR GH genomas grandes para ensamblar, por ejemSOR FORQHV GH %$& HQWUH Vt $OWHUQDWLYDPHQWH SDUD XQD XWLOL]DFLyQ PiV HFLHQWH GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HQ SURgramas de mejoramiento existe la posibilidad de convertir marcadores complejos y costosos R LQHVWDEOHV FRPR 5)/3V $)/3V \ 5$3'V HQ PDUFDGRUHV 3&5 DOHORHVSHFtFRV TXH VRQ econmicos, robustos y de sencilla implemenWDFLyQ HQ FXDOTXLHU ODERUDWRULR GH ELRORJtD PROHFXODU ORV PDUFDGRUHV 3&5 DOHORHVSHFtFRV WDPELpQ VHUtDQ 676 HQ HO VHQWLGR GH TXH VH WUDWD GH XQD VHFXHQFLD GH $'1 FRUWD TXH LGHQWLFD XQ ORFXV HVSHFtFR GHO JHQRPD \ SXHGH VHU DPSOLFDGD SRU 3&5 /D HVWUDWHJLD FRQVLVWH HQ DLVODU HO IUDJPHQWR GH $'1 SROLPyUFR GHO JHO se clona, se secuencia y se disean iniciadores HVSHFtFRV GH DOUHGHGRU GH SE SDUD DPSOLcar por PCR dicho fragmento. Cuando se parte GH XQ IUDJPHQWR 5$3' HO PDUFDGRU GHULYDGR mediante este proceso ha sido descripto como 6&$5 6HTXHQFH &KDUDFWHUL]HG $PSOLHG Region, Paran y Michelmore 1993). El problema que enfrentan estas estrategias VXHOH VHU HO EDMR QLYHO GH SROLPRUVPR HQWUH variedades de una misma especie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las posibilidades de encontrar mutaciones tiles para desarrollar estos marcadores. De todos modos, existen antecedentes exitosos de desarrollo de marcadores GH 3&5 DOHORHVSHFtFRV HQ WULJR SDUD FDUDFteres de inters agronmico como pueden ser alelos de gluteninas, genes de resistencia a patgenos, genes vinculados a adaptacin, etc.
Una segunda variante de los STS son ORV PDUFDGRUHV &$36 &OHDYDJH $PSOLHG Polymorphic Sequence) o "secuencia poliPyUFD DPSOLFDGD \ FOLYDGD .RQLHF]Q\ \ $XVXEHO (Q HVWD WpFQLFD WDPELpQ FRQRFLGD FRPR 5)/33&5 XQ IUDJPHQWR GH $'1 HV DPSOLFDGR SRU 3&5 OXHJR GLJHULGR FRQ enzimas de restriccin y resuelto por electroforesis en agarosa o poliacrilamida. Este mtodo aprovecha la capacidad que posee la tcnica GH 3&5 GH DPSOLFDU VHJPHQWRV HVSHFtFRV GH $'1 FRQ OD FDSDFLGDG TXH SRVHHQ ODV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ GH FRUWDU HO $'1 HQ VHcuencias blanco de la enzima de restriccin. La EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GHWHFWDGR SRU HO PDUFDGRU &$36 HV OD SUHVHQFLDDXVHQFLD GH VLWLRV GH UHVWULFFLyQ HQ OD VHFXHQFLD DPSOLFDGD SRU 3&5 (VWH PDUFDGRU SHUPLWH LGHQWLFDU individuos heterocigotas, por lo que se comporta como marcador codominante (Figura 6). /RV PDUFDGRUHV 676 \ VXV YDULDQWHV 6&$5 \ &$36 WLHQHQ OD YHQWDMD GH UHTXHULU XQ HQVDyo metodolgico sencillo y altamente reproducible por los que son fcilmente transferibles a otros laboratorios, permitiendo que sean muy usados en seleccin asistida por marcadores. $VLPLVPR VHJ~Q ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH VX GLVHo, pueden ser codominantes y ser analizados en simultneo varios loci STS en un mismo gel. $FWXDOPHQWH GDGD OD GLVSRQLELOLGDG GH VHcuencias en base de datos es posible tambin disear marcadores STS directamente a partir de secuencias de inters (secuencias genmicas, secuencias ESTs, etc) evitndose de este modo el trabajo previo de secuenciacin del STS.
Figura 6.
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5.5 Marcadores Expresin
Funcionales
de
(Q OD DFWXDOLGDG ODV WHFQRORJtDV GH PDUFDdores moleculares en plantas superiores han VXIULGR XQ FDPELR $Vt OD PD\RUtD GH ORV PDUcadores descriptos anteriormente derivan del $'1 JHQyPLFR \ SRU OR WDQWR SXHGHQ SHUWHnecer a regiones transcriptas y no transcriptas del genoma. Estos marcadores basados en $'1 GHULYDGR GH FXDOTXLHU UHJLyQ GHO JHQRma, han sido descriptos como marcadores de $'1 DO D]DU 5'0V Random DNA Markers). Sin embargo, durante los ltimos aos se ha observado una fuerte tendencia hacia el desarrollo de marcadores moleculares derivados de la regin transcripta del genoma (genes). Esto ha sido posible gracias a la disponibilidad de un gran nmero de secuencias de clones de $'1F $51P WUDQVFULSWR D $'1 HPSOHDQGR transcriptasa reversa, tambin conocidos como Expressed Sequence Tags o ESTs), en bases de datos pblicas (TIGR, NCBI; EBI, etc., ver 3DUWH , &DStWXOR $QiOLVLV LQIRUPiWLFR GH VHcuencias moleculares). Los tipos de marcadores desarrollados a partir de la regin expresada del genoma son numerosos, complejos y variados. Slo se describirn en detalle aquellos marcadores ms relevantes y que no fueron enunciados anteriormente, recomendndose la lectura de la revisin de Gupta y Rustgi (2004) para informacin adicional. 5.5.1 Marcadores COS (Conserved Orthologue Set) Los marcadores COS representan genes funcionales conservados en un amplio rango de plantas dicotiledneas. Inicialmente, estos marcadores fueron desarrollados a partir de la comparacin de la secuencia genmica de Arabidopsis con la base de datos de ESTs de tomate. Se postula que estos marcadores podrn ser aplicados en el mapeo comparativo entre genomas emparentados y, por lo tanto, sern tiles para estudios taxonmicos y en la GHGXFFLyQ GH ODV UHODFLRQHV ORJHQpWLFDV 5.5.2 Marcadores GTMs (Gene Targeted Markers)
/RV *70V VH EDVDQ HQ SROLPRUVPRV GHQWUR de genes, independientemente de si se conocen o no sus funciones. Estos marcadores se pueden desarrollar a partir de secuencias disSRQLEOHV HQ ODV EDVHV GH GDWRV F'1$(67VHcuencias genmicas que representan genes) o D SDUWLU GH JHQRWHFDV GH $'1 JHQyPLFR HQULquecidas para secuencias de genes. Un ejemSOR GH *70V VRQ ORV $QiORJRV D *HQHV GH Resistencia (Resistance Gene Analogs 5*$V que son marcadores basados en secuencias derivadas de genes de resistencia a patgeQRV /DV VHFXHQFLDV 5*$V VRQ ~WLOHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH QXHYRV JHQHV GH UHVLVWHQFLD D patgenos en plantas. 5.5.3 Marcadores Funcionales propiamente dichos (FM: Functional Markers) El desarrollo reciente de varios proyectos de genmica estructural y funcional en especies cultivadas, ha generado un enorme caudal de informacin a nivel de secuencias y esto ha posibilitado el desarrollo de un nuevo tipo de marcadores denominados marcadores funcionales (FM). Estos marcadores derivan de motivos SROLPyUFRV PXWDFLRQHV GHQWUR GH ORV JHQHV \ HVWRV SROLPRUVPRV DIHFWDQ GLUHFWDPHQWH OD H[SUHVLyQ IHQRWtSLFD GHO FDUiFWHU DVRFLDGR DO JHQ $QGHUVHQ \ /EEHUVWHGW /RV )0 reciben tambin el nombre de marcadores diagnsticos, marcadores de genes blanco o marcadores perfectos (perfect markers). El desarrollo de FM requiere de secuencias allicas de genes caracterizados funcionalPHQWH D SDUWLU GH ORV FXDOHV SXHGDQ LGHQWLFDUVH PRWLYRV SROLPyUFRV IXQFLRQDOPHQWH UHVponsables de afectar el fenotipo de la planta. El primer paso en el desarrollo de FM es disponer de la secuencia de un gen con una funcin asignada. En Arabidopsis, menos del 10% de sus aproximadamente 25.000 genes han sido caracterizados funcionalmente. En otras especies, el nmero de secuencias caracterizadas funcionalmente es sustancialmente menor. Sin embargo, considerando la identidad de secuencias es posible asignar funciones putativas (probables) a un 30-50% de las secuencias expresadas (ESTs) en otras especies. Esta estrategia de considerar genes candidatos y las relaciones sintnicas (similitud) entre genomas
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de plantas ha sido explotada exitosamente para LGHQWLFDU JHQHV DJURQyPLFDPHQWH LPSRUWDQWHV El segundo paso en el desarrollo de FM es la E~VTXHGD GH VHFXHQFLDV SROLPyUFDV R DOHORV del gen en cuestin. Para ello se deben analizar las secuencias del gen en ms de un genotipo por especie. Las estrategias de desarrollo GH PDUFDGRUHV IXQFLRQDOHV YDUtDQ GHVGH OD GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV GH XQ VROR QXFOHyWLGR (SNPs), el descubrimiento en regiones gnicas de secuencias tipo microsatelites (SSRs), la LGHQWLFDFLyQ GH VLWLRV GH UHVWULFFLyQ TXH GLIHUHQFLHQ DOHORV &$3V OD GHWHFFLyQ GH LQVHUciones y/o deleciones (InDels), las variaciones a nivel de secuencias que se pueden revelar HPSOHDQGR OD PHWRGRORJtD GH FRQIRUPDFLyQ GH $'1 VLPSOH FDGHQD HQ HOHFWURIRUHVLV SDUFLDOmente desnaturalizantes (SSCP), etc. Posteriormente, se debe probar la existenFLD GH YDULDFLyQ IHQRWtSLFD DVRFLDGD DO DOHOR HQ cuestin. Esto puede realizarse indirectamente, por estudios de asociacin en poblaciones segregantes, o directamente, mediante la comparacin de genotipos isognicos generados por PXWDJpQHVLV HVSHFtFD HQ OD VHFXHQFLD GHO JHQ mediante TILLING, Targeting-Induced Local Lesions In Genomes (McCallum et al., 2003), etc. En varias aplicaciones, la gran ventaja que presentan los FM es su ligamiento completo con motivos (mutaciones) funcionales. En contraste con los marcadores tradicionales (distribuidos al azar en el genoma), los FM permiten: L OD DSOLFDFLyQ FRQDEOH GH PDUFDGRUHV HQ SRblaciones sin necesidad de mapeo previo; ii) el uso de marcadores en poblaciones segregantes sin el riesgo de perder informacin debido a la recombinacin; iii) una mejor representacin de la variacin gentica en poblaciones naturales o de mejoramiento. (Q JHQHUDO ORV )0 VRQ ~WLOHV SDUD L OD MDFLyQ PiV HFLHQWH GH DOHORV HQ FXDOTXLHU SREODcin segregante; ii) el anlisis de alelos tanto en poblaciones naturales como de mejoramiento; iii) la combinacin de alelos de FM que afectan idnticos o diferentes caracteres en mejoramiento de plantas; iv) la construccin de haplotipos de FM ligados. En la actualidad se encuentran disponibles varios genes con potencial para el desarrollo
de FM sobre caracteres de importancia agronmica, por ejemplo, altura de planta en cereaOHV WLHPSR GH RUDFLyQ HQ PDt] UHTXHULPLHQtos de vernalizacin en Brassica y trigo, tamao de fruto en tomate, calidad de alimento en arroz; resistencia a enfermedades y respuesta a stress en varias especies, etc. Sin embargo, an en especies modelo, slo el 10% de los genes han sido caracterizados funcionalmente mientras que para especies no modelo, este nmero es probablemente menor al 5%. Los FM derivan de estudios de asociacin realizados en grandes colecciones de genotiSRV R GH OD FRPSDUDFLyQ GH OtQHDV LVRJpQLFDV las cuales tienen un costo alto para su desarrollo, limitando el estudio inicial a uno o unos pocos fondos genticos. Luego estos FM deben ser evaluados en otros fondos genticos, con lo cual, para todo esto es necesario desarroOODU XQ PDUFR H[SHULPHQWDO HVWDGtVWLFR \ ELRinformtico para la acumulacin de datos y las evaluaciones a lo largo de diferentes estudios. Teniendo en cuenta estos factores y el laborioso desarrollo de los FM, la generacin de )0 GHEHUtD FRQFHQWUDUVH HQ JHQHV TXH FRQHUDQ XQD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD VXVWDQFLDO $Vt OD seleccin de genes claves para caracteres de inters agronmico ser crucial y el paso limitante para el desarrollo de FM tiles. $UUHJORV GH $'1 SDUD HVWXGLRV GH H[presin de genes /RV DUUHJORV GH $'1 arrays) permiten, entre otras cosas, analizar sistemticamente el patrn de expresin gnica de un organismo en escala genmica. De este modo, es posible examinar la expresin simultnea de cientos a miles de genes en varios estadios del desarrollo, en respuesta a diferentes condiciones amELHQWDOHV \ HQ WHMLGRV HVSHFtFRV /RV DUUHJORV GH $'1 VRQ VRSRUWHV VyOLGRV comnmente vidrio o nylon, en los cuales esWiQ MDGDV GH IRUPD RUGHQDGD JUDQ FDQWLGDG GH VHFXHQFLDV GH $'1 GH LQWHUpV PDUFDGRUHV Estas secuencias pueden ser genes completos o parciales. El empleo de estos arreglos como herramienta para el estudio de expresin GH JHQHV D HVFDOD JHQyPLFD VLJXH WtSLFDPHQte los siguientes pasos: i) la construccin del DUUHJOR GH $'1 LL OD SUHSDUDFLyQ GH VRQGDV
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D SDUWLU GH $51P GH ODV GLVWLQWDV VLWXDFLRQHV a comparar); iii) la hibridizacin del arreglo; iv) la deteccin de la seal y anlisis de los datos por herramientas computacionales apropiadas. Existen diferentes sistemas de arreglos se $'1 GHSHQGLHQGR GH OD IXHQWH GH $'1 GH inters, naturaleza del soporte slido y el sistema de deteccin de la hibridizacin. El sistema ms simple es el que requiere menos inversin, comnmente se lo llama macroarreglo (macroarray) y emplea una membrana de nylon como soporte en combinacin con VRQGDV UDGLDFWLYDV (O VLVWHPD PiV VRVWLFDGR XWLOL]D OiPLQDV GH YLGULR \ VRQGDV XRUHVcentes y se lo llama microarreglo (microarray). $VLPLVPR HQ ORV PDFURDUUHJORV VH GHSRVLWDQ FHQWHQDV GH VHFXHQFLDV GH $'1 PLHQWUDV TXH en los microarreglos la densidad de secuencias es al menos un orden de magnitud mayor. Es importante destacar la existencia de distintos trminos empleados para describir estos arreglos, de modo que glass array, chips GH $'1 \ biochips son denominaciones usadas para los microarreglos sobre placas de vidrio, en cuanto que nylon array y high density membranes son para los macroarreglos sobre nylon. En el rea vegetal, la utilizacin de arreglos GH $'1 SDUD HO DQiOLVLV GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD DXPHQWy VLJQLFDWLYDPHQWH GH OD PDQR GH ORV proyectos de secuenciacin completa del genoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa (arroz) (para mas detalles ver Rensink y Buell, 2005). $GHPiV GH OD FRQWULEXFLyQ SDUD HO HQWHQGLmiento de la expresin gnica a gran escala, se vislumbra la posibilidad de emplear la tcniFD GH DUUHJORV GH $'1 HQ PHMRUDPLHQWR DVLVtido por marcadores, QJHUSULQWLQJ, seleccin
de accesiones de germoplasma, desarrollo de plantas tolerantes a diferentes tipos de estrs, HWF $VLPLVPR OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV H[presados diferencialmente, en especial aquellos cuya expresin no es abundante o estn involucrados en cascadas de transduccin de seales, ampliar enormemente los horizontes una vez que esos genes puedan ser empleados como marcadores para seleccin asistida (Galbraith, 2006). 5.6 Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Si bien, son una clase particular de marcaGRUHV PROHFXODUHV TXH SRGUtDQ VHU LQFOXLGRV dentro del punto 5.4, se los decidi tratar aparte dado que los SNPs pueden derivar tanto de VHFXHQFLDV JHQyPLFDV FRGLFDQWHV TXH VH H[SUHVDQ FRPR QR FRGLFDQWHV Recientemente, de la mano de los proyectos de secuenciacin de genomas enteros de plantas, una nueva clase de marcadores molecuODUHV GHQRPLQDGRV 613V SROLPRUVPR GH XQ nucletido), est siendo utilizada en distintos estudios genticos. Estos marcadores se baVDQ HQ OD GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV UHVXOWDQtes de la alteracin de una nica base en una VHFXHQFLD GH $'1 (Q OD JXUD VH PXHVWUDQ VHFXHQFLDV GH $'1 HMHPSOLFDQGR DOJXQDV YDULDFLRQHV GH SXQWR ODV FXDOHV VH GHQHQ FRPR 613V $OJXQRV DXWRUHV FRQVLGHUDQ 613V VyOR cuando ocurre una sustitucin de base, otros consideran tambin la insercin/delecin de una base (InDel). Los SNPs pasaron a tener mayor importancia a partir de la secuenciacin del genoma humano, al descubrirse que el 90% de polimorVPR HQFRQWUDGR HQ HO JHQRPD HUDQ 613V
Figura 7.
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Recientemente en el rea vegetal, la secuenciacin a gran escala de genomas completos y de secuencias expresadas (ESTs), ha permitido evidenciar la presencia de SNPs en especies como Arabidopsis thaliana, meln, soja, girasol, DUUR] PDt] FHEDGD WULJR \ FDxD GH D]~FDU HQtre otras. Los marcadores genticos SNP poseen naturaleza biallica y son muy abundantes en el genoma, siendo la frecuencia de SNPs de 1 cada 100-300 pb para los genomas de plantas. Los SNPs pueden localizarse en regiones codiFDQWHV UHJXODWRULDV \ QR FRGLFDQWHV &XDQGR HVWiQ SUHVHQWHV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV muestran 100% de asociacin con el carcter GH LQWHUpV SRU OR TXH VRQ PX\ ~WLOHV HQ 0$6 (marker assisted selection o seleccin asistida por marcadores) y en el aislamiento de genes. Debido a su frecuencia de distribucin, los SNPs surgen como importantes marcadores para la obtencin de mapas genticos de alta resolucin. Estudios llevados a cabo utilizando Arabidopsis como organismo modelo, han demostrado que estos marcadores posibilitan la obtencin de mapas de una resolucin cerca de 100 veces superior a la obtenida con los marcadores convencionales. Los SNPs son estables desde el punto de vista evolutivo, lo que facilita su empleo en esWXGLRV GH SREODFLRQHV 2WUD FDUDFWHUtVWLFD LPSRUWDQWH HV TXH OD JHQRWLSLFDFLyQ GH ORV 613V no est basada en la medida del tamao de los alelos como ocurre con los otros marcadores moleculares, y la distincin de los alelos puede ser automatizada. Por lo tanto, los SNPs, por tener una tasa de mutacin relativamente baja, ser mucho ms frecuentes en el genoma y ser detectables en forma automatizada, surgen FRPR LPSRUWDQWHV PDUFDGRUHV JHQRWtSLFRV En tiempos recientes se han desarrollado YDULDV PHWRGRORJtDV SDUD GHWHFWDU 613V TXH utilizan diferentes estrategias para comparar UHJLRQHV HVSHFtFDV GHO $'1 REWHQLGDV GH YDrios individuos. La eleccin de uno de los mtodos depender de muchos factores: costos, potencial para el procesamiento de los datos generados, los equipamientos necesarios y la GLFXOWDG GH ORV HQVD\RV Inicialmente, los abordajes para la deteccin GH 613V FRQVLVWtDQ HQ DPSOLFDU \ VHFXHQFLDU
fragmentos genmicos equivalentes de regioQHV JpQLFDV HVSHFtFDV GHO $'1 GH YDULRV LQdividuos y comparar sus secuencias buscando SNPs. La adopcin de esa estrategia involucra HO GLVHxR GH LQLFLDGRUHV SDUD DPSOLFDU VHJPHQWRV GH $'1 GH HQWUH D SE GHULvados frecuentemente de genes de inters o SURYHQLHQWHV GH (67V 3DUD OD DPSOLFDFLyQ VH HPSOHDQ $'1V GH YDULRV LQGLYLGXRV SUHIHrencialmente representativos de la diversidad de la poblacin de inters. Estos productos GH DPSOLFDFLyQ UHVXOWDQWHV VH VHFXHQFLDQ directamente y las secuencias resultantes se alinean, empleando programas bioinformticos DSURSLDGRV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH SROLPRUVmos (SNPs). $FWXDOPHQWH OD VHFXHQFLDFLyQ D JUDQ HVFDla del genoma de varios organismos permite la LGHQWLFDFLyQ GH 613V PHGLDQWH OD FRPSDUDcin de millares de secuencias depositadas en las bases de datos, incluyendo clones genmiFRV \ SULQFLSDOPHQWH VHFXHQFLDV GH $'1F \R ESTs. Independientemente del mtodo utilizado SDUD LGHQWLFDU ORV 613V HV LQGLVFXWLEOH OD FRQtribucin de la bioinformtica en dicho proceso. Por otra parte, la necesidad de la validacin experimental de los datos es indispensable. $FWXDOPHQWH HVWiQ GLVSRQLEOHV GLVWLQWRV Pptodos de validacin y genotipado (deteccin), XQR GH HOORV VRQ ORV FKLSV GH $'1 R PLFURDUUHJORV GH $'1 &RPR VH GLMR DQWHULRUPHQWH HVtos chips consisten en arreglos de oligonucletidos de secuencia conocida depositados sobre un soporte slido. Para el caso de la deteccin GH 613V ORV ROLJRQXFOHyWLGRV GLHUHQ HQWUH Vt HQ VLWLRV HVSHFtFRV HQ QXFOHyWLGRV LQGLYLGXDles (en el sitio del SNP). La tcnica es apropiada para analizar varios SNPs en paralelo a partir de cada muestra (en forma multiplex). En una columna del arreglo cuatro oligonucletidos diferirn solamente en el sitio del SNP (tendr cada uno, una de las cuatro bases en la posicin del SNP). Cuando este arreglo es hibridado con productos de PCR o fragmentos GH $'1 JHQyPLFR REWHQLGRV SRU QHEXOL]DFLyQ URPSHU HO $'1 HQ IUDJPHQWRV GH XQ WDPDxR determinado y al azar), estos se unirn solo a los oligonucletidos perfectamente complementarios y los productos no perfectamente
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complementarios (con mismatch) sern lavados. La unin perfecta de cada caso podr ser WRPDGD SRU XQ VLVWHPD GH GHWHFFLyQ $Vt HQ un nico microarreglo (chip) es posible analizar miles de SNPs, correspondientes a distintos loci en simultneo. Otros mtodos de anlisis de SNPs incluyen: FURPDWRJUDItD OLTXLGD GH DOWD UHVROXFLyQ GHVQDWXUDOL]DQWH '+3/& HVSHFWURPHWUtD GH PDVD ensayos con extensin de iniciadores, PCR en tiempo real, minisecuenciacin, secuenciacin de una nica base, digestin por enziPDV GH UHVWULFFLyQ 5)/3 &$36 HQWUH RWURV Puede encontrarse una revisin detallada de HVWRV PpWRGRV HQ .ZRN 7VXFKLKDVKL \ Dracopoli (2002). En cuanto a las aplicaciones y perspectivas de los marcadores SNPs cabe destacar que han sido fundamentales para el anlisis de genes y el descubrimiento de la base gentiFD PROHFXODU GH LPSRUWDQWHV FDUDFWHUtVWLFDV agronmico-industriales. Como por ejemplo en arroz, el descubrimiento de SNPs involucrados en la calidad de coccin, procesamiento y aroma del grano (Larkin y Park, 2003). La comparacin directa de SNPs tambin ha sido empleada en estudios de gentica de SREODFLRQHV \ ORJHQLD LGHQWLFDFLyQ GH YDriedades, construccin de mapas genticos y ItVLFRV DQiOLVLV IXQFLRQDOHV DQiOLVLV GH DVRFLDcin en mejoramiento gentico vegetal etc. El uso de mtodos masivos de anlisis, como los arreglos de alta densidad de oligonucletidos, se estn empleando en la actualidad SDUD LGHQWLFDU Single Feature Polymorphisms 6)3V 3ROLPRUVPRV GH &DUDFWHUtVWLFD QLFD como una alternativa atractiva para detectar SNPs y otro tipo de mutaciones entre genotipos. Los SFPs son detectados sobre arreglos de alta densidad de oligonucletidos (chips) \ UHSUHVHQWDQ SROLPRUVPRV GH VHFXHQFLD GH $'1 HQWUH GRV JHQRWLSRV GHQWUR GH XQ ROLJRQXcletido individual, el cual se detecta por difeUHQFLD HQ OD DQLGDG GH KLEULGDFLyQ (O WpUPLQR FDUDFWHUtVWLFD feature UHHUH D OD VHxDO GH hibridacin dada por una sonda (oligonucletido) en el arreglo (Zhu y Salmeron, 2007). El descubrimiento de los SNPs, asociado a la posibilidad de utilizarlos como marcadores, permite a los investigadores explorar nuevas
hiptesis. Se considera que muchos de estos SNPs estn localizados en el interior de seFXHQFLDV JpQLFDV HVWR SXHGH VLJQLFDU XQD importante reduccin en el tiempo y costos para el descubrimiento de genes de inters, comparado con los marcadores actualmente GLVSRQLEOHV $VLPLVPR HO GHVDUUROOR FRQVWDQWH GH WHFQRORJtDV SDUD VX DSOLFDFLyQ SHUPLWLUi DXtomatizar el mapeo de alta densidad y, consecuentemente, reducir los costos de su empleo en estudios moleculares a gran escala. 5.7 Lecturas recomendadas
$QGHUVHQ -3 /EEHUVWHGW 7 )XQFWLRQDO markers in plants. Trends Pl. Sc. 8: 554-560. %RWVWHLQ ' :KLWH 5/ 6NROQLFN 0 'DYLV 5 : Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. $P - +XP *HQHW Branlard G., Dardevet M., Saccomano R., Lagoutte F. & Gourdon J. 2001. Genetic diversity of ZKHDW VWRUDJH SURWHLQV DQG EUHDG ZKHDW TXDOLW\ Euphytica 119: 59-67. &DHWDQR$QROOpV * %DVVDP %- *UHVVKRII 30 '1$ DPSOLFDWLRQ QJHUSULQWLQJ XVLQJ very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/ Technology 9: 553-557. Se puede borrar *DOEUDLWK ': '1$ 0LFURDUUD\ $QDO\VLV LQ +LJKHU 3ODQWV 20,&6 $ -RXUQDO RI ,QWHJUDWLYH Biology. 10(4): 455-473. *XSWD 3. 5XVWJL 6 0ROHFXODU PDUNHUV from the transcribed/expressed region of the genome in higher plants. Funct Integr Genomics 4:139-162. .RQLHF]Q\ $ ) $XVXEHO $ SURFHGXUH IRU PDSSLQJ $UDELGRSVLV PXWDWLRQV XVLQJ FRGRPLQDQW HFRW\SHVSHFLF 3&5 EDVHG PDUNHUV 3ODQW J. 4:403410. .ZRN 3< 0HWKRGV IRU JHQRW\SLQJ 6LQJOH 1XFOHRWLGH 3RO\PRUSKLVPV $QQX 5HY *HQRPLFV Hum. Genet. 2: 235-258. /DUNLQ 3' 3DUN :' $VVRFLDWLRQ RI ZD[\ JHQH VLQJOH QXFOHRWLGH SRO\PRUSKVLP ZLWK VWDUFK characteristics in rice (Oryza sativa L.). Mol Breed 12:335-339. /LWW 0 /XW\ -$ $ K\SHUYDULDEOH PLFURVDWHOOLWH UHYHDOHG E\ LQ YLWUR DPSOLFDWLRQ RI D GLQXFOHRWLGH UHSHDW ZLWKLQ WKH FDUGLDF PXVFOH DFWLQ JHQH $P - +XP *HQHW 0F&DOOXP &0 &RPDL / *UHHQH ($ +HQLNRIIHW S. 2003. Targeting induced local lesions in genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123:439-442.
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I CAPITULO 6 Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas
Gerardo D L Cervigni, -XDQ 3DEOR $ 2UWL] 6HUJLR ( )HLQJROG 1. Introduccin La posibilidad de construir mapas de ligamiento gentico en especies vegetales o animales es una de las contribuciones de mayor impacto de las tcnicas de marcadores moleculares en las ciencias biolgicas. Los marcadores moleculares utilizados pueden corresSRQGHU D UHJLRQHV LQWHUJpQLFDV QR FRGLFDQWHV o a segmentos gnicos, en cuyo caso son denominados funcionales y constituyen marcadores ideales a los efectos de seleccin de genotipos. Un mapa gentico establece de maQHUD SUREDELOtVWLFD HO DUUHJOR OLQHDO GH XQ JUXSR marcadores (o genes) sobre el genoma de una especie. Si bien el concepto data de principios GH VLJOR ;; D SDUWLU GH ORV WUDEDMRV GH 0RUJDQ y Bridges con mutantes de Drosophila, recin a partir del advenimiento de los marcadores moleculares fue tcnicamente posible construir PDSDV JHQpWLFRV VDWXUDGRV HQ OD PD\RUtD GH las especies vegetales de inters agronmico. Usando este tipo de mapas es posible idenWLFDU OD SRVLFLyQ \ HO HIHFWR GH JHQHV VREUH caracteres de importancia mediante asociaFLRQHV HVWDGtVWLFDV HQWUH ORV YDORUHV IHQRWtSLcos y las variantes allicas de los marcadores. La disponibilidad de mapas genticos permite tambin la seleccin indirecta de genotipos deseables, comnmente denominada MAS (del ingls Marker Assisted Selection), mediante el seguimiento de marcadores localizados en regiones genmicas determinadas. La utilizacin de marcadores comunes permite comparar la estructura del genoma de diferentes especies (comparative mapping H LGHQWLFDU UHDUUHJORV cromosmicos a pequea y gran escala (micro y macro sintenia) SDUD HVWXGLRV GH ORJHQLD \ evolucin molecular. Por otro lado, el desarro-
llo de mapas genticos altamente saturados permite el clonado posicional de genes. 2. Introduccin a la construccin de mapas genticos en vegetales Para comprender mejor las bases tericas y metodolgicas empleadas en el mapeo gentico es necesario recordar algunos conceptos bsicos de gentica Mendeliana. Gregor Mendel realiz sus experimentos en Pisum sativum (arveja cultivada) efectuando cruzamientos controlados entre individuos que se GLIHUHQFLDEDQ HQ GHWHUPLQDGDV FDUDFWHUtVWLFDV FRPR SRU HMHPSOR HO FRORU GH OD RU WLSR GH tegumento de las semillas y largo de los tallos), y estudi la forma en que estos caracteres se WUDQVPLWtDQ D OD GHVFHQGHQFLD $ SDUWLU GH GDWRV experimentales formul una hiptesis simple para explicarlos y posteriormente dise experimentos para contrastarla. Sus trabajos permitieron inferir la existencia de factores hereditarios y sus mecanismos de transmisin antes GH FRQRFHU OD H[LVWHQFLD GHO $'1 FRPR PDWHrial de transmisin gentico. En base a sus datos experimentales Mendel formul su primera ley, o ley de la segregacin. Ella establece que los miembros de un par gnico (alelos) se segregan (se separan) uno de otro durante la formacin de las gametas. Como consecuencia, la mitad de las mismas portan un alelo y la otra mitad el otro. La progenie es luego formada por la combinacin al azar de las gametas de ambos progenitores. La segunda ley de Mendel, o ley de la segregacin independiente, indica que la segregacin de los alelos de un gen es independiente de la segregacin de los alelos de otro gen. Estas dos leyes fueron los puntos de partida sobre los cuales se elabor WRGD OD WHRUtD GH KHUHQFLD TXH KR\ FRQRFHPRV Incluso an en el presente, los anlisis de las frecuencias en que aparecen los caracteres en las progenies de cruzamientos controlados son una parte fundamental de los anlisis genticos. Los caracteres genticos pueden estar controlados por uno o pocos genes, o poseer un control complejo que involucra muchos genes, denominados loci de caracteres cuantitativos o QTLs (del ingls Quantitative Traits Loci), a menudo afectados por el ambiente. La disponibilidad de un gran nmero de marcadores
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(loci SROLPyUFRV QR DIHFWDGRV SRU HO PHGLR ambiente, neutros, sin efectos deletreos y cuya herencia pude determinarse con relativa IDFLOLGDG VLPSOLFy HQRUPHPHQWH ORV DQiOLVLV genticos en especies vegetales y animales. La construccin de un mapa de ligamiento gentico es esencialmente una representacin JUiFD OLQHDO GHO RUGHQ PiV SUREDEOH GH PDUcadores moleculares o genes a partir de los valores de recombinacin observados entre ellos. Cada arreglo lineal es denominado grupo de OLJDPLHQWR (Q WHRUtD XQ PDSD VDWXUDGR GHEH contener el mismo nmero de grupos de ligamiento que nmero bsico de cromosomas. (Q HVWH &DStWXOR VH GHVDUUROODUiQ ORV FRQceptos bsicos del mapeo gentico en vegetales y algunas de sus aplicaciones. De ninguna manera se pretende abordar el tema en toda su extensin debido a que la misma supera ODUJDPHQWH ORV REMHWLYRV GH HVWH OLEUR $TXHOORV lectores que deseen ampliar y profundizar los WHPDV TXH DTXt VH GHVDUUROODQ SXHGHQ FRQVXOtar los textos que se citan en la lista de referenFLDV ELEOLRJUiFDV DO QDO GHO &DStWXOR Los pasos fundamentales a seguir en la construccin de un mapa gentico de una deWHUPLQDGD HVSHFLH R HO PDSHR HVSHFtFR GH XQ gen (locus) de inters pueden resumirse en: 1) seleccin de progenitores y desarrollo de una poblacin segregante (poblacin de mapeo), 2) JHQHUDFLyQ GH XQ Q~PHUR VXFLHQWH GH PDUFDdores y registro de los mismos en cada uno de los individuos de la poblacin (genotipado), 3) determinacin de las frecuencias de recombinacin entre marcadores y determinacin de grupos de ligamiento y 4) determinacin del orden de los marcadores y conversin de la frecuencia de recombinacin (r) en unidades de mapeo o centiMorgan (cM). 2.1. Poblaciones de mapeo El primer paso en todo proyecto de mapeo es el desarrollo de una poblacin segreganWH SDUD XQD R PiV FDUDFWHUtVWLFDV GH LQWHUpV La seleccin de los progenitores es un punto importante debido a que no slo deben ser FRQWUDVWDQWH SDUD OD FDUDFWHUtVWLFD HQ HVWXGLR sino que adems deben presentar diferencias D QLYHO GH VHFXHQFLDV GHO $'1 \ DVt REWHQHU VXFLHQWHV PDUFDGRUHV SROLPyUFRV TXH SHU-
mitan la construccin del mapa gentico. En DXVHQFLD GH SROLPRUVPRV JHQpWLFRV ORV DQilisis de segregacin y ligamiento son impracticables. En general los cruzamientos entre especies algamas presentan mayor grado de SROLPRUVPR TXH HQWUH DXWyJDPDV /D IDOWD GH SROLPRUVPRV HV FRP~Q HQ SREODFLRQHV GHULvadas de cruzamientos entre progenitores de base gentica estrecha, como los realizados entre distintos cultivares de la misma especie o entre individuos de especies silvestres deriYDGRV GH OD PLVPD SREODFLyQ QDWXUDO (Q WHRUtD es posible desarrollar varios tipos de poblaciones segregantes y la decisin de cual utilizar depende de la resolucin que se desee alcanzar con el mapa y la posibilidad y/o facilidad de desarrollarla. En la Figura 1 se muestra un esquema del desarrollo de 5 poblaciones bsicas de mapeo. Las poblaciones de tipo retrocruza (backcross o BC1) y F2 son generalmente DGHFXDGDV \ IiFLOHV GH JHQHUDU HQ OD PD\RUtD GH ODV HVSHFLHV FXOWLYDGDV FRPR WULJR PDt] y soja. Las poblaciones F2 proveen mayor informacin gentica que las retrocruzas para el mismo nmero de individuos debido a que pueden evaluarse dos cromosomas recombinantes por planta. En especies autoincompatibles y altamente heterocigotas las poblaciones F1 tambin son segregantes y pueden emplearse para mapeo. Estos 3 tipos de familias son HItPHUDV HV GHFLU TXH FDGD LQGLYLGXR VHJUH-
Figura 1.
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gar las combinaciones gnicas que porta en la siguiente generacin. Si no es posible mantenerlas clonalmente como por ejemplo a partir de rganos vegetativos o por cultivo in vitro, la informacin obtenida en ellas debe ser transferida a una nueva poblacin utilizando algunos de los marcadores que fueron previamente localizados (mapeados) de manera de conservar puntos de referencia entre ambas. En el caso de requerirse mltiples ensayos, (repeticiones intra experimento, ensayos en distintas localidades o en varios aos), es necesario desarrollar poblaciones de maSHR LQPRUWDOHV FRPR ODV /tQHDV (QGRFULDGDV Recombinantes (RILs por Recombinant Inbred Lines) o poblaciones de Haploides Duplicados '+V $PEDV SREODFLRQHV VH FRPSRQHQ GH XQ FRQMXQWR GH OtQHDV KRPRFLJRWDV TXH SXHGHQ ser replicadas por semillas varias veces y por YDULRV FLFORV GH FXOWLYR (VWDV FDUDFWHUtVWLFDV las hacen especialmente adecuadas para mapear QTLs. Las RILs son generadas a partir de una poblacin F2 por descendencia de semilla nica de un nmero determinado de individuos durante cinco o ms generaciones. Finalmente, FDGD OtQHD UHSUHVHQWDUi ORV GLIHUHQWHV EORTXHV de ligamiento presentes en un individuo F2 de la poblacin original, pero en estado homocigota. Una vez estabilizadas, las RILs pueden ser mantenidas y multiplicadas por semillas ao tras ao. Una de las desventajas de este mtodo es que algunas regiones del genoma pueden seguir en el estado heterocigota a pesar de las mltiples autofecundaciones. Por otro lado, no es posible desarrollarlas en especies autoincompatibles. Las poblaciones DH se generan a partir del cultivo de tejidos de anteras de individuos F1. En algunas especies es posible regenerar plantas enteras a partir GH PLFURJDPHWRWRV KDSORLGHV JUDQR GH SROHQ en el estado uninucleado). Si la planta dadora es una F1, sus granos de polen portarn las gametas derivadas de la meiosis con diferentes combinaciones allicas. Posteriormente, por tratamientos de duplicacin cromosmica con colchicina, las plantas haploides obtenidas pueden diploidizarse llevando todos los loci al estado homocigota. Como resultado se obtiene XQD VHULH GH OtQHDV TXH UHSUHVHQWDQ ODV FRPbinaciones gnicas presentes en las gametas
de la F1. La desventaja de este mtodo es que HV QHFHVDULR GLVSRQHU GH XQ SURWRFROR HFLHQWH para la regeneracin de plantas in vitro a partir del cultivo de anteras y la posterior duplicacin cromosmica. Una vez establecido el tipo de poblacin a utilizar, el nmero de individuos es tambin un punto importante debido a que la resolucin del mapa y el ordenamiento de los marcadores en los grupos de ligamiento dependen de ste. En general, poblaciones de 60 a 100 individuos son adecuadas para trabajos de tipo acadmico, como la localizacin de un determinado locus en el genoma o el mapeo de un carcter cualitativo. Sin embargo, para proyectos de mapeo de QTLs o la construccin de mapas de alta resolucin son necesarias poblaciones de 500 a 1000 individuos. 2.2. Registro de marcadores moleculares \ FODVLFDFLyQ GH OD SREODFLyQ Los marcadores moleculares tiles para mapeo deben existir en 2 o ms formas allicas distinguibles, de manera que los genotipos de FDGD LQGLYLGXR SXHGDQ VHU FODUDPHQWH LGHQWLcados. Los mismo pueden ser de tipo dominante (presencia o ausencia de una banda como HQ 5$3' \ $)/3 SRU OR FXDO QR HV SRVLEOH GLVWLQJXLU HQWUH HO JHQRWLSR KRPRFLJRWD $$ GHO KHWHURFLJRWD $D R FRGRPLQDQWHV WRGRV ORV DOHORV SXHGHQ LGHQWLFDUVH SRU HM XVDQdo SSR y RFLP), donde los 3 genotipos de un mismo locus diallico pueden ser discriminados $$ $D \ DD &RPR FULWHULR JHQHUDO XQD YH] que se dispone de entre 100-200 marcadores en una determinada poblacin es posible identiFDU JUXSRV GH OLJDPLHQWR UHJLRQHV JHQyPLFDV HVSHFtFDV \ PDSHDU JHQHV R 47/V $VLPLVPR prcticamente cualquier nuevo marcador que se agregue pude integrarse a los preexistentes. El genotipo de cada individuo de la poblacin, para cada uno de los marcadores debe ser determinado (genotipado). En general se toman como marcadores informativos aquellos que muestran relaciones de segregacin, por presencia/ausencia, que se ajusten a las frecuencias esperadas considerando el tipo de poblacin y marcador molecular utilizado (por ej.: 1 $D DD HQ XQD UHWURFUX]D R $B DD HQ XQD F2), por medio de la prueba del ji-cuadrado 2).
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2.3. Estimacin de las frecuencias de recombinacin y deteccin de grupos de ligamiento 2.3.1. Concepto de ligamiento Dos loci que se encuentran muy cercanos en el mismo cromosoma no segregan independientemente durante la meiosis. Esta relacin se denomina ligamiento gentico y explica la aparicin de una proporcin mayor de individuos portando combinaciones allicas parentales que lo esperado segn la Segunda Ley de Mendel. Los genes ligados pueden ser seSDUDGRV SRU XQ LQWHUFDPELR ItVLFR GH SDUWHV GH cromosomas (cromtidas hermanas) durante la meiosis por el proceso de entrecruzamiento o crossing-over (CO), el cual genera gametas recombinantes, distintas de las parentales (Figura 2).
para que el nmero de plantas recombinantes sea igual al de no recombinantes, se dice que los mismos segregan independientemente. Por otro lado, si el nmero de plantas recombinantes es menor al esperado (50%) se considera que ambos loci estn ligados genticamente. De esta manera, determinando la frecuencia de aparicin de individuos con combinaciones allicas recombinantes es posible realizar una medida relativa de la distancia entre ellos. 2.3.2 Deteccin del ligamiento El primer paso en el estudio del ligamiento entre 2 loci SRU HM $ \ % FRQVLVWH HQ GHWHUminar si los mismos segregan individualmente de acuerdo al modelo esperado (1:1, 3:1, 1:2:1, etc.), y posteriormente, si lo hacen en forma independientemente o no. En ambos FDVRV OD SUXHED HVWDGtVWLFD DGHFXDGD HV HO 2
Figura 2.
([LVWH XQD UHODFLyQ HQWUH OD GLVWDQFLD ItVLFD a la que se encuentran 2 loci y la probabilidad de que se produzca un CO entre ellos. Cuanto ms alejados estn uno del otro mayor ser la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento y se generen gametas recombinantes. Consecuentemente, si dos loci HVWiQ OR VXcientemente separados en el cromosoma como
FRQVLGHUDQGR XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD SUHGHWHUPLQDGR S R DXQTXH WDPELpQ es posible utilizar el LOD score (ver punto 2.4). 6L OD SUREDELOLGDG DVRFLDGD DO 2 obtenido para cada locus en forma individual es superior a la predeterminada, se considera que ambos marcadores segregan de acuerdo a lo esperado. En el segundo paso, el nmero de progenies
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REVHUYDGDV HQ FDGD FODVH JHQRWtSLFD VH FRQtrasta con los valores esperados para una segregacin independiente (Tabla 1).
Tabla 1: Segregaciones esperadas para 2 loci independientes en distintas poblaciones de mapeo.
1 producto de cada 100 meiosis es del tipo recombinante. Un ejemplo de los pasos a seguir en la estimacin del ligamiento entre dos genes se muestra en la Figura 3.
(i)
Tipo de Marcador poblacin dominante BC 1 F2 RILs DH 1:1:1:1 9:3:3:1 1:1:1:1 1:1:1:1
Marcador co-dominante 1:1:1:1 1:2:1:2:4:2:1:2:1
F1 A a B b
x
P2 a a b b
(ii) Datos derivados del cruzamiento prueba
Gametas Parentales AB ab Ab aB
Fenotipos AB ab Ab aB
Genotipos AaBb aabb Aabb aaBb
No. 60 59 4 3 126
1:1:1:1 1:1:1:1
Gametas F1
Recombinantes
Total
BC1: poblacin de retrocruzamiento; F2: poblacin tipo F2 derivada del cruzamiento entre 2 progenitores heterocigotas; RIL: poblacin de lneas endocriadas recombinanWHV 5,/V SRU 5HFRPELQDQW ,QEUHG /LQHV \ '+ SREODFLyQ de haploides duplicados.
(iii) Prueba de segregaci n de factores simples A/a y B/b
Nmero de individuos con fenotipo A Nmero de individuos con fenotipo a X2 1 g.l Nmero de individuos con fenotipo B Nmero de individuos con fenotipo b
= 60 + 4 = 64 = 59 + 3 = 62
.=
0.03 n.s
= 60 + 3 = 63 = 59 + 4 = 63 X2 1 g.l = 0.00
La hiptesis nula (Ho) es que ambos loci segregan independientemente y la hiptesis alternativa (H$) es que ambos loci estn ligados. 6L ORV GHVYtRV REWHQLGRV HQWUH ORV YDORUHV REservados y esperados tienen una probabilidad de ocurrencia menores que 1/20 o 1/100 (p < 0,05-0,01), se considera que los loci $ \ % QR segregan independientemente y por lo tanto se acepta H$ que indica la existencia de ligamiento entre ellos (ver ejemplo Figura 3). 2.3.3. Estimacin de la frecuencia de recombinacin 8QD YH] YHULFDGD OD H[LVWHQFLD GH OLJDPLHQto entre 2 loci es posible estimar la frecuencia de recombinacin (r) entre ellos. En el caso ms simple de una retrocruza, todas las clases IHQRWtSLFDV R JHQRWtSLFDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV )LJXUD (O YDORU GH r expresado en porcentaje se calcula:
(iv) Prueba de segregaci n independiente de locus A y B
Fenotipos (genotipos) AB (AaBb) Ab (Aabb) aB (aaBb) ab (aabb)
Frecuencia esperada xn xn xn xn
No. esperado 31,5 31, 5 31, 5 31, 5 Total

X2 =
No. observado 60 4 3 59 126
( E - O )2 = 99, 56* E
*(P < 0.001)
(v) Clculo del porcentaje derecobminacin (% r)
%r=
nmero de gametas recombinantes (4 + 3) = = 0,0555 o 5,55 % nmero total de gametas 126
Figura 3.
r(%)=
nmero de gametas recombinantes x100 nmero total de gametas
Una estimacin de r HV GHQLGD como una unidad de mapeo (u.m), y corresponde a la distancia entre dos loci en la cual
En este caso la frecuencia de recombinacin HQWUH $ \ % HV GH &RPR OD IUHFXHQcia de recombinacin es una proporcin, su variancia (derivada de la distribucin binomial) est dada por la expresin: R (1-R)/N, donde R es la frecuencia de recombinacin y N es el nmero total de los individuos de la poblacin. Por lo tanto, un valor de r = 5,55 % (como el de nuestro ejemplo), posee el siguiente error estndar:
90
[0,055x(1-0,055)/126]=0,020 .
De esta manera es posible establecer el grado de ligamiento entre 2 loci. Sin embargo, en algunos tipos de poblaciones como las F2, no WRGDV ODV FODVHV JHQRWtSLFDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV IiFLOPHQWH HVSHFLDOPHQWH FXDQGR VH trabaja con marcadores co-dominantes. Esto es debido a que no es posible diferenciar si los dobles heterocigotas derivan de 1 o 2 gametas recombinantes. Para estos casos se han desarrollado procedimientos alternativos para estimar las distancias genticas. El mtodo de mxima probabilidad (maximum likelihood method) es el ms utilizado. Debido a que se WUDWD GH XQ PpWRGR HVWDGtVWLFR GH HVWLPDFLyQ de probabilidades las frmulas empleadas en los clculos son generalmente complejas. $OODUG GHVDUUROOy HO PpWRGR GH ORV scores para derivar las frmulas, estimar las distancias genticas y calcular las desviaciones estndares para varios tipos de poblaciones. $IRUWXQDGDPHQWH HQ HO SUHVHQWH VH GLVSRQH GH programas de computacin que utilizan estas frmulas y permiten trabajar con grandes archivos de datos derivados de poblaciones de un gran nmero de individuos. Entre los ms populares se encuentran el Mapmaker (Lander 1987) y el JoinMap (Stam et al. 1993).
2.3.4. Ordenamiento de los marcadores y conversin de frecuencias a unidades de mapeo

Cuando se estudia el ligamiento simultneo HQWUH R PiV PDUFDGRUHV SRU HM $ % \ & se puede establecer un orden en base a las distancias relativas entre ellos (mapeo de 3 SXQWRV 6XSRQLHQGR TXH HO RUGHQ VHD $%& OD distancia estimada en la prueba de 2 puntos HQWUH $ \ & VHUi DSUR[LPDGDPHQWH LJXDO D OD VXPD GH OD GLVWDQFLD HQWUH $% %& 6LQ HPEDUJR IUHFXHQWHPHQWH OD GLVWDQFLD HQWUH $ \ & (medida como prueba de dos puntos) suele ser PHQRU D OD GH $% %& (VWR VH GHEH D OD presencia de entrecruzamientos dobles entre $ \ & FX\R UHVXOWDGR QDO HV OD IRUPDFLyQ GH JDPHWRV SDUHQWDOHV $& \ DF TXH VH FRPSXWDQ como "no recombinantes", cuando en realidad Vt OR VRQ 6L QR KXELpUDPRV PDSHDGR HO JHQ
B nunca hubiramos detectado estos dobles entrecruzamientos. Extendiendo este razonamiento, en realidad tampoco sabemos si entre $% KXER HQWUHFUX]DPLHQWRV GREOHV \ SRU OR tanto, haber subestimado la proporcin de recombinantes entre ellos. Cuanto ms grande es la distancia entre 2 marcadores, ms inexacta VHUi OD PHGLGD GH OD GLVWDQFLD $VLPLVPR RWUR hecho que debe considerarse es el fenmeno de interferencia (I). La interferencia se relacioQD FRQ OD LPSRVLELOLGDG ItVLFD GH TXH DG\DFHQWH a un punto de entrecruzamiento se produzca otro en la misma meiosis debido a un impediPHQWR ItVLFR HQWUH HOORV VH LQWHUHUHQ (VWDV FDUDFWHUtVWLFDV KDFHQ TXH ODV IUHFXHQFLDV GH recombinacin no sean magnitudes aditivas para grandes segmentos cromosmicos. Para solucionar esto, los valores de r se convierten en unidades de mapeo (centMorgan cM) mediante la aplicacin de las funciones de mapeo. Las ecuaciones para convertir r en cM derivan de funciones de distribucin y son fundamentalmente dos, la funcin de Haldane (1919) y la GH .RVDPEL /D GLIHUHQFLD EiVLFD HQWUH ellas es el supuesto que asumen con respecto a la interferencia en la ocurrencia de dobles CO. La funcin de Haldane considera interferencia nula (I=0) mientras que la funcin de .RVDPEL HVWLPD HO YDORU GH , (VWRV YDORUHV JHneralmente se encuentran entre 0 y 1 (interferencia completa). El valor real de interferencia se ubicar entonces en algn lugar en medio de ambos valores. Los valores de cM estimados con ambas funciones son equivalentes cuando se consideran valores de r de hasta 10 %, para valores mayores la transformacin de .RVDPEL HV PiV H[DFWD
2.4. Programas de mapeo

La utilizacin de programas de mapeo como el Mapmaker 3.0 (Lander et al. 1987; KWWSZZZQVOLMJHQHWLFVRUJVRIWPDSPDNHU R -RLQ0DS 6WDPS KWWSZZZ kyazma.nl), permiten el anlisis simultneo de muchos marcadores en poblaciones de gran nmero de individuos, mediante la utilizacin de mtodos de estimacin de parmetros FRPR HO GH Pi[LPD SUREDELOLGDG R PtQLPRV cuadrados. Estos programas poseen diferentes procedimientos, o rutinas, que permiten la
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estimacin de r entre pares de marcadores, OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV JUXSRV GH OLJDPLHQWR \ la determinacin del orden de los marcadores dentro de cada grupo. El programa Mapmaker XWLOL]D HO WHVW HVWDGtVWLFR /2' score para evaluar el valor de r estimado y la posicin ms probable de un marcador en el grupo de ligamiento. El LOD score (logaritmo de los odds) es el logaritmo en base 10 del cociente entre la probabilidad de obtener los datos observados en caso de que los loci considerados estuvieran ligados, sobre la probabilidad de obtener los datos en ausencia de ligamiento. Un LOD = 3 para un par de marcadores indica que es mil veces ms probable que los loci estn ligados respecto a que no lo estn. El programa Mapmaker tambin utiliza LOD score para comparar difeUHQWHV yUGHQHV SRVLEOHV HQWUH YDULRV JHQHV $O orden ms probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos. Por su parte, el programa JoinMap (Stam, 1993) permite trabajar con distintos tipos de poblaciones e inclusive con distintos tipos de segregacin dentro de la misma poblacin. Este programa fue especialmente diseado para estimar datos de ligamiento gentico en poblaciones derivadas de especies altamente heterocigotas y/o donde QR HV SRVLEOH REWHQHU OtQHDV SXUDV 2WUD GH VXV principales ventajes es que permite combinar mapas derivados de distintas poblaciones (o GDWRV ELEOLRJUiFRV VL GLVSRQHQ PDUFDGRUHV HQ comn (Stam 1993). Debido a que las unidades de mapeo gentico estn basadas en frecuenFLD GH UHFRPELQDFLyQ VX VLJQLFDGR HQ FXDQWR D GLVWDQFLD ItVLFD Q~PHUR GH QXFOHyWLGRV HQWUH dos loci YDUtD VHJ~Q OD HVSHFLH FRQVLGHUDGD HO cromosoma y la localizacin dentro del mismo. Es conocido que existen regiones de alta frecuencia de recombinacin localizadas sobre los brazos cromosomales (comnmente llamados hotspots) y regiones donde la recombinacin est fuertemente restringida como por ejemplo FHUFD GH ORV FHQWUyPHURV R WHOyPHURV $XQTXH se corre el riesgo de cometer un error grosero puede considerarse que en promedio 1 cM equivale aproximadamente a 1 Mpb (un milln de pares de bases) en humanos y entre 500 y 750 kpb (mil pares de bases) en plantas superiores (como el arroz y tomate, respectivamente).
3. Mapeo de QTL 0XFKDV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH LPSRUWDQcia agronmica presentan una distribucin continua de valores, esto es, dentro de una poblacin determinada no existe una clara disWLQFLyQ HQ FODVHV IHQRWtSLFDV /D EDVH JHQpWLFD GH HVWDV FDUDFWHUtVWLFDV IXH HVFODUHFLGD SRFR despus del redescubrimiento de las leyes de Mendel, cuando Yule en 1902 propuso que esa variacin era la consecuencia de la accin aditiva de muchos genes. Entre stos se sueOH LGHQWLFDU D JHQHV GH HIHFWRV SURQXQFLDGRV denominados genes mayores y genes con pequeos efectos que fueron inicialmente denominados poligenes. Sin embargo, la distincin entre poligenes y genes mayores (tambin llamados oligogenes) no result satisfactoria ya que el efecto de un gene depende del entorno gentico, el ambiente y del alelo presente en el locus del gen. Geldermann (1975) propuso denominar a estos loci controladores de caracWHUtVWLFDV FXDQWLWDWLYDV FRPR 47/V GHO LQJOpV Quanitative Traits Loci). Esta nomenclatura result ms adecuada ya que no asocia al gen con la magnitud de su efecto. Si bien la gentica cuantitativa ha propuesto y utilizados modelos biomtricos con gran xito a lo largo de la historia del mejoramiento de plantas y animales, estos modelos se basan en la estimacin de los efectos gnicos y no tanto en el nmero de genes involucrados. Utilizando marcadores moleculares ligados a los QTLs, es posible estimar el genotipo, los efectos genticos y tener una aproximacin menos sesgada del nmero de o genes/QTLs determinantes del carcter. Es indispensable TXH HO OHFWRU QR FRQVLGHUH OD PHWRGRORJtD GH marcadores moleculares sustituta de de los PRGHORV JHQpWLFRVHVWDGtVWLFRV XWLOL]DGRV SRU la gentica cuantitativa, por el contrario, ellos son la base de los estudios de mapeo de genes/QTL utilizando marcadores moleculares. 8QD GH ODV WpFQLFDV GH LGHQWLFDFLyQ GH QTLs es la denominada asociacin con marcas simples o marcadores individuales. En este caso, la utilizacin de un mapa gentico no es necesaria, aunque un mapa gentico ayuda a la interpretacin de los resultados. Las posibiOLGDG GH LGHQWLFDU XQ 47/ XVDQGR PDUFDGRUHV
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moleculares depende de la distancia gentica existente entre el marcador y el QTL, y de la magnitud de los efectos genticos, aditivo (a) y de dominancia (d) (ver ms abajo), del propio QTL. La estimacin de estos efectos es indirecta pues se realiza con base en el marcador OLJDGR DO 47/ $GHPiV OD HVWLPDFLyQ GH HVWRV efectos ser ms o menos exacta dependiendo de la tcnica de mapeo utilizada, siendo la ms adecuada aquellas tcnicas derivadas del mapeo por intervalo. Consideremos M/m el locus del marcador molecular y Q/q el locus del QTL. Para saber si M y Q estn ligados, son necesarias las siguientes etapas: obtener una poblacin segregante para ambos loci M y Q(poblacin de mapeo), PHGLU OD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLFD < FRQtrolada por el QTL (Q), obtener el fenotipo del marcador (M) en cada planta de esta poblacin, y registrarlo en una matriz de datos. Considerando el caso de un nico locus (Q/q), en que el alelo Q aumenta el valor de OD FDUDFWHUtVWLFD \ KDFLHQGR PQQ, PQq y Pqq las medias de los individuos con genotipos QQ, Qq y qq, respectivamente, y P = (PQQ + Pqq)/2 la media entre los genotipos homocigotos, los siguientes efectos genticos pueden ser obtenidos una poblacin F2:
Efecto aditivo :
a=
m MM - m mm 2(1 - 2r )
Efecto de dominancia:
m Mm d=
m MM + m mm 2 (1 - 2r ) 2
Razn d/a (grado medio de dominancia):
2m Mm - m MM + m mm d d = a (1 - 2r )( m MM - m mm)
Si el QTL no estuviera ligado al marcador, (r = 0,5) las diferencias entre las tres medias QR VHUiQ HVWDGtVWLFDPHQWH VLJQLFDWLYDV 'H OD misma forma, si a y d fuesen iguales a cero (auVHQFLD GH HIHFWR QR VH GHWHFWDUtDQ GLIHUHQFLDV HVWDGtVWLFDV HQWUH ODV PHGLDV 'H HVWD PDQHUD slo si r < 0,5 es posible detectar asociaciones entre M y Q, dependiendo esta deteccin del grado de ligamiento o magnitud de r (pequeos valores de r facilitan la deteccin) y del efecto del alelo Q sobre el carcter. Formalmente tenemos: Ho: MM=Mm=Pmm; H$: MM z Mm; H$a2: MM z mm; H$:Mm z mm.
Pqq
P d -a
PQq
PQQ
Medias de los genotipos
9DORUHV JHQRWtSLFRV
a
/D DVRFLDFLyQ 0DUFDGRU47/ VH FRQUPD VL ODV GLIHUHQFLDV HQWUH ODV PHGLDV IHQRWtSLFDV GH JUXSRV GH PDUFDGRUHV VRQ HVWDGtVWLFDPHQte diferentes de cero (se rechaza de Ho). Las diferencias pueden ser evaluadas por medio GHO DQiOLVLV GH OD YDULDQ]D $129$ R SUXHED t, HOLJLHQGR XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD GH 3 FRPR VH HMHPSOLFD HQ OD 7DEOD En una poblacin F2, la asociacin entre el marcador y el QTL puede ser valorada a travs de la regresin entre los genotipos y su corres-
a) efecto aditivo (a) y (d) efecto de la dominancia donde:
a=
mQQ - mqq mQQ + mqq d = mQq 2 2
n una generacin F2 cuyos genotipos marcadores MM, Mm y mm estarn presente en la frecuencia de 1/4, 1/2 y 1/4, respectivamente. En este caso los efectos a, d y d/a son estimados con base en el marcador ligado al QTL, como sigue:
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Tabla 2: $129$ HQWUH ORV WUDWDPLHQWRV 00 0P \ PP obtenidos de una poblacin F2

FV Tratamiento Residuo Total GL 2 142 144 SC 202791,97 262030,95 464822,93 CM 101395,98 1845,28 F 54,94 P 0,0000
Observe que: a = g1 - g2 d = g2 + g1
por lo que para estimar los efectos a y d en una poblacin de retroFV: fuente de variacin, GL: grados de libertad, SC: suma de cuadracruzamiento debe retrocruzarse la GRV &0 FXDGUDGRV PHGLRV ) YDORU GHO HVWDGtVWLFR ) &0 7UDWDPLHQWR F1 con cada uno de los progenitoCM Residuo) y P: probabilidad de rechazar una Ho verdadera. Cuando res. Un problema adicional es que P < 0,05 indica asociacin entre el marcador (M) y el QTL (Q).v a y d pueden anularse. Si existiera dominancia completa de Q sobre q pondiente fenotipo. En este caso, es necesario (d = a), g1 = 0 y si existiera dominancia compleFRGLFDU ORV WUHV JHQRWLSRV 00 0P \ PP ta de q sobre Q (d = -a), g2 = 0. como 1, 0 y -1 para el modelo aditivo, y 0, 1 y 0 (O DQiOLVLV GH $129$ \ OD UHJUHVLyQ VRQ WpFpara el modelo dominante. QLFDV TXH SHUPLWHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH PDUcadores ligados a QTLs, pero poseen ciertas El modelo de regresin adoptado es: limitaciones: 1) no indican si hay uno o ms QTLs asociaYi = E0 + E1;1j +E2;2j + Hj. dos al marcador, 2) no estiman la posicin del QTL y donde: 3) el efecto del QTL puede ser subestimado Yi YDORU GH OD FDUDFWHUtVWLFD ;1j= cdigo del debido a que es confundido con la frecuencia marcador para efecto aditivo (MM = 1, Mm = 0, PP ;2j= cdigo del marcador para efec- de recombinacin. to dominante (MM = 1, Mm = 0, mm = -1); E0 3.2. Mapeo por intervalos = intercepto de la regresin (media de la caEl mapeo por intervalo (interval mapping) fue UDFWHUtVWLFD E1 = inclinacin de la recta para el modelo aditivo; E2 = inclinacin de la recta para propuesto originalmente por Lander y Botstein el modelo dominante y Hj = error aleatorio para (1989) y es la base de todos los mtodos de mapeo de QTL utilizados actualmente. Para j-simo individuo. FRQFHSWXDOL]DU HVWD PHWRGRORJtD SRGHPRV 8QD YH] HYDOXDGR \ FRQUPDGR HO PRGHOR considerar el cruzamiento entre dos progenitocompleto (modelo aditivo + dominante), debe res homocigotos cuya F1 posee la constitucin analizarse la importancia relativa de cada uno JHQpWLFD TXH VH HMHPSOLFD HQ OD )LJXUD $ GLIHUHQFLD GHO PDSHR SRU PDUFDV VLPSOHV de los modelos, por ejemplo mediante la meen el mapeo por intervalo es indispensable WRGRORJtD GH UHJUHVLyQ P~OWLSOH GH HOLPLQDFLyQ poseer un mapa gentico ya que la unidad de SRU SDVR VWHSZLVH En poblaciones de retrocruzamiento, slo el anlisis es el intervalo gentico y no un marcagenotipo heterocigoto (Qq) y uno de los homo- dor individual. De manera resumida el mapeo cigotos (QQ o qq) estn presentes por lo que por intervalo utiliza la siguiente estrategia: 1) el efecto aditivo y dominante quedan confun- como la distancia entre cada par de marcadodidos, en este apartado denominados g1 y g2, res es conocida, el mtodo estima los parmetros del modelo a incrementos de distancias respectivamente, y estimados como sigue: JHQpWLFDV SUHGHQLGRV 2) los parmetros del modelo pueden ser estimados mediante la funcin de verosimilitud o regresin, 3) la hiptesis g1=mMM-mMm = (a-d)(1-2r) H0: ausencia de QTL/ H$: QTL en un intervalo Yg2=mMm-mmm = (a+d)(1-2r) entre marcadores, son contrastadas a travs
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Figura 4.
de la razn de dos verosimilitudes, LR (LR por Likelihood Ratio) o LOD score y 4) la presencia de un QTL es inferida cuando el mximo valor de LR o de LOD obtenido es mayor a un umbral previamente establecido (punto 3.4). +DOH\ \ .QRWW SUHVHQWDURQ XQ PRGHOR de mapeo por intervalos basados en regresin. El modelo adoptado para poblaciones F2 es: Yj = + ax* + dz* j. donde: Yj YDORU GH OD FDUDFWHUtVWLFD < HQ HO LQGLYLGXR M PHGLD GH OD FDUDFWHUtVWLFD HQ OD poblacin; a = efecto aditivo del locus que est VLHQGR HVWXGLDGR VREUH OD FDUDFWHUtVWLFD < G efecto de dominancia del locus que est siendo HVWXGLDGR VREUH D FDUDFWHUtVWLFD < [* y z* son las variables indicadoras (utilizadas para estimar los efectos a y d del QTL) y dependen de ORV JHQRWLSRV GH ORV PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV del QTL, en el individuo j y Hj = error aleatorio para j-simo individuo. Expliquemos como se obtienen los valores de las variables indicadoras x* y z* presentados en la Tabla 3. Para adjudicar estos valores debemos respondernos la pregunta: Dado un intervalo gentico de marcadores moleculares, cuyo fenotipos son conocidos, cul es la probabilidad que dentro del intervalo el genotipo del QTL sea QQ, Qq o qq?. Consideremos el intervalo gentico M1M1M2M2. El genotipo de los marcadores indica que fue generado por el encuentro al azar de las gametas parentales M1M2. Dado que no existi recombinacin
entre los marcadores, el genotipo de QTL ms SUREDEOH GHQWUR GHO LQWHUYDOR VHUtD 44 $Vt la nica variable indicadora que asume valor es x* y ese valor es 1 (p = 1), pues no exisWHQ GHVYtRV GHELGR D OD GRPLQDQFLD \ HO DOHOR Q incrementa el valor del carcter. El intervalo M1M1M2m2 fue generado por una gameta paUHQWDO \ RWUD UHFRPELQDQWH $KRUD HV SUREDEOH que dentro del intervalo gentico el genotipo del QTL sea QQ o Qq con probabilidades 1-p y p, respectivamente. El valor 1-p ser mximo cuando estemos cerca del genotipo marcador M1M1 \ PtQLPR FXDQGR HVWHPRV SUy[LPRV GH M2m2. Lo contrario suceder con el valor de p. Las variables x* y z* asumirn valores 1-p y p, respectivamente, cuyos valores variaran conforme nos desplacemos en el intervalo a distancias ra. Con el mismo razonamiento se pueden encontrar las probabilidades condicionales de los genotipos QQ, Qq y qq para los intervalos M1M1m2m2 y M1m1M2m2. 6HJ~Q HO PRGHOR GH 6HJ~Q +DOH\ \ .QRWW (1992) una regresin es realizada para cada valor de ra entre los marcadores M1 y M2. El valor de ra que produzca el mayor valor de R2 FRHFLHQWH GH GHWHUPLQDFLyQ /5 R GH /2' indica la localizacin del QTL. El test de sigQLFDQFLD GH KLSyWHVLV /5 VHJ~Q SXHGH VHU expresado como:
LR = 2 ln
SCR SCR
(reducido) (completo)
= Suma de cuadrados del residuo del educido) modelo reducido: Yj = + ej; SCR(completo) = Suma de cuadrados del residuo del modelo completo: Yj D[ G\ j ( para F2), Yj = + g1x* j (para Retrocruzamientos) y Yj = + ax* + (para RIL y DH). Los valores de LOD se enj cuentran dividiendo el valor LR por 4,61 (LOD = LR / 4,61). 3.3. Mapeo por intervalo compuesto En el mapeo por intervalo, los tests de hiptesis no son independientes de otros QTLs ligados al intervalo siendo analizado. Para QTLs no ligados al intervalo el efecto no es tan dramtico, pero deben hacerse las siguientes consideraciones: 1) la segregacin del QTL no
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Tabla 3: (VSHUDQ]D GH ORV HIHFWRV JHQRWtSLFRV PHGLRV SDUD XQ 47/ SDUD WRGRV ORV SRVLEOHV JHQRWLSRV GH ORV PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV HQ XQD SREODFLyQ )2, cuando no se considera la ocurrencia de recombinaciones dobles en el intervalo.
Genotipo Marcador
Probabilidad c ondicional QQ Qq qq 0 p 2p(1-p) 1-p 1-2cp(1-p) 1-p 2p(1-p) p 0 0 0 p2 0 Cp(1-p) p (1-p)2 1-p 1
Variables indicadoras (d)z* (a)x* 1 1-p 1-2p p 0 -p -(1-2p) -(1-p) -1 0 p 2p(1-p) 1-p 1-2cp(1-p) 1-p 2p(1-p) p 0
M1 M1 M2 M2 1 1-p M1 M1 M2m 2 M1 M1 m2m2 (1-p)2 M1m1 M2 M2 p M1m1 M2m 2 cp(1-p) M1m1 m2m2 0 p2 M1m1 M2 M2 m1 m1M2m 2 0 m1 m1m2m2 0
p=ra/r ; (1-p)= rb/r; c=r2/[r2+(1-r)2] (Tomado de Schuster & Cruz, 2004).
OLJDGR FRQWULEX\H D OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD 2) LQWHUHUH HQ OD HVWLPDFLyQ GHO HIHFWR GHO 47/ y 3) removiendo el efecto de la segregacin del otro QTL se reduce la varianza residual del intervalo en consideracin, aumentando el poder de deteccin y precisin. El mapeo por intervalo compuesto (Jansen 1993, 1994; Zeng 1993, 1994), combina el mapeo por intervalo con la regresin mltiple. Esta ltima, permite incluir en el mapeo marcadores ubicados por fuera del intervalo como cofactores, incrementando el poder de deteccin y precisin en la estimativa de la posicin del QTL. La pregunta de cuntos cofactores deben utilizarse no es de fcil respuesta. En principio los dos marcaGRUHV TXH DQTXHHQ HO LQWHUYDOR GHEHQ VHU LQcluidos, al igual que aquellos que resulten sigQLFDWLYRV HQ XQD UHJUHVLyQ P~OWLSOH 'HQLGRV los marcadores que se utilizarn como cofacWRUHV OD PHWRGRORJtD GH PDSHR SRU LQWHUYDOR compuesto se aplica exactamente igual a la de mapeo por intervalo simple. 3.4. Test de hiptesis y nivel de VLJQLFDQFLD La formulacin de hiptesis adecuadas y XWLOL]DFLyQ GH HVWDGtVWLFRV DSURSLDGRV SDUD OD evaluacin de las mismas, es esencial para declarar la presencia de un QTL. En una po-
blacin F2 pueden ser estimados los efectos aditivo y de dominancia, en un RC el efecto g1 o g2 y slo el efecto aditivo en poblaciones de RILs y DH. Para determinar si el valor de cada efecto estimado es diferente de cero se usan ODV HVWDGtVWLFDV /5 R /2' (Q PXFKRV WUDEDMRV de mapeo un valor de LOD superior a 2 3 es utilizado como criterio para declarar la presencia de un QTL. Esta forma de determinar el YDORU XPEUDO R FUtWLFR HV DUELWUDULR \ OD PD\RUtD de los autores no lo consideran el ms adecuado, pues la probabilidad e detectar al menos un falso positivo (declarar la real la presencia de un QTL inexistente) en alguna regin del genoma es prcticamente 1 (100 %). Se propuso disminuir este sesgo determinando un nivel de VLJQLFDQFLD SDUD FDGD FURPRVRPD (Q HVWH caso, el nivel de corte para cada cromosoma FRUUHVSRQGHUtD DO GHO JHQRPD FRPSOHWR GLYLGLdo el nmero de cromosoma o grupos de ligaPLHQWRV REWHQLGRV 7DPELpQ HV SRVLEOH GHQLU XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD SDUD FDGD LQWHUYDOR GLYLGLHQGR OD VLJQLFDQFLD GHO FURPRVRPD SRU HO nmero de intervalos en el grupo de ligamiento (nmero de marcadores menos uno). )LQDOPHQWH HO YDORU FUtWLFR GH FRUWH SXHGH HVWDEOHFHUVH HPStULFDPHQWH PHGLDQWH HO WHVW de permutaciones que es actualmente el ms usado. Para realizar este test deben numerar-
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se los individuos de 1 a n /RV YDORUHV IHQRWtSLFRV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV VRQ WRPDGRV DO D]DU y atribuidos a los individuos conforme vayan VLHQGR UHWLUDGRV (O SULPHU YDORU IHQRWtSLFR UHWLrado es asignado al individuo 1, el segundo vaORU IHQRWtSLFR DO LQGLYLGXR DVt VXFHVLYDPHQWH VH DVLJQDQ WRGRV ORV YDORUHV IHQRWtSLFRV D FDGD uno de los individuos. Los datos permutados son analizados para detectar la presencia de QTL, almacenando el mayor valor de LOD obtenido. El proceso se repite de forma completa 1 YHFHV QDOPHQWH ORV YDORUHV GH /2' UHWHnidos, son ordenados por orden de magnitud permitiendo estimar el valor critico de cada WHVW (O YDORU FUtWLFR GH FDGD LQWHUYDOR WHQGUi OD magnitud N R VHD VL VH UHDOL]DURQ SHUPXWDFLRQHV OD VLJQLFDQFLD GH VHUi HO 950 valor ordenado. Se procede de la misma forma para obtener el valor de corte para un determinado grupo de ligamiento o para el genoma completo (conjunto de grupos de ligamientos) considerando uno u otro en el test de permutacin. Cuanto mayor el nmero de permutaciones, mayor la precisin en el valor FUtWLFR 4. Mapas y marcadores funcionales En la historia del desarrollo de los marcadores moleculares se ha priorizado la deteccin GH SROLPRUVPRV HQ UHJLRQHV QR FRGLFDQWHV del genoma. Esto ha sido en funcin de aseguUDU OD QHXWUDOLGDG IHQRWtSLFD GH ORV PDUFDGRUHV y posibilidad de maximizar la variacin entre GLIHUHQWHV JHQRWLSRV (VWD ~OWLPD FDUDFWHUtVtica est sustentada en que las regiones no gnicas del genoma no han sufrido presin de seleccin sobre las mutaciones que pudieran haber ocurrido en el transcurso de la evolucin y por consiguiente ser ms variables. La asociacin de los marcadores con caracteres de inters, como se ha visto anteriormente, est determinada por la distancia de recombinacin R ItVLFD GHO PDUFDGRU FRQ HO JHQ UHVSRQVDble del fenotipo. De esta manera, los mapas genticos basados en marcadores moleculares han posibilitado la localizacin de regiones FURPRVyPLFDV HVWDGtVWLFDPHQWH DVRFLDGDV D caracteres de tipo cualitativos (monognicos) o cuantitativos (polignicos o QTLs). Como ya se ha visto, la determinacin de QTLs permite
establecer el nmero, posicin y efecto individual de cada uno de los loci involucrados. Sin HPEDUJR OD LGHQWLFDFLyQ GH 47/V HQ GLYHUVRV FXOWLYRV QR KD FRQFOXLGR FRQ OD LGHQWLFDFLyQ GH los genes responsables del fenotipo, cuya existencia se presume en el intervalo comprendido HQWUH PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV GH ORV PLVPRV Como consecuencia, la funcin biolgica (o el modo de accin) de los genes responsables de los efectos de los QTLs es an desconocida en OD PD\RUtD GH ORV FDVRV UHSRUWDGRV $VLPLVPR la posibilidad de realizar un caminado cromosmico (cromosome walking) desde el marcaGRU DQTXHDQWH DO 47/ KDFLD OD UHJLyQ ItVLFD GRQGH UHVLGH HO JHQ UHVSRQVDEOH FRQ HO Q GH aislarlo, depende de la distancia de recombinacin entre el marcador y el gen, y de la UHODFLyQ GH HVD GLVWDQFLD FRQ OD GLVWDQFLD ItVLca real, que puede estar afectada por varios otros factores, como fuera mencionado antes HQ HVWH FDStWXOR La creciente disponibilidad pblica de inforPDFLyQ GH VHFXHQFLDV GH WUDQVFULSWRV GH $'1 mensajero (Expressed Sequence Tags, ESTs), MXQWR FRQ HO JUDGR GH KRPRORJtD HYLGHQFLDGR entre especies, ha permitido la generacin de los llamados marcadores gnicos o funcionaOHV FX\D FDUDFWHUtVWLFD UHOHYDQWH HV OD GH HVWDU ORFDOL]DGRV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV GHO genoma. ticipan en las llamadas mutaciones silencioVDV (VWR HV FXDQGR HO FDPELR QXFOHRWtGLFR VH produce en la tercera base del codn sin alteUDU HO DPLQRiFLGR SDUD HO FXDO FRGLFD /D LGHQWLFDFLyQ GH 613V SXHGH LQIHULUVH GLUHFWDPHQte a partir de datos de secuencias pblicas, si estas corresponden a distintos genotipos, o por VHFXHQFLDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH JHQHV DPSOLcados por PCR de individuos diversos. $XQTXH KLVWyULFDPHQWH VH KD DVXPLGR TXH las secuencias tipo microsatlites son propias GHO $'1 QR FRGLFDQWH KR\ VDEHPRV TXH ODV mismas pueden encontrarse tambin en regiones gnicas. Si bien la frecuencia relativa de estos motivos es baja (< 5 %) la gran abundancia de secuencias de ESTs en diversos cultivos, ha ocasionado que varios estudios hayan usado esta estrategia para el desarrollo de marcadores moleculares. La seleccin de motivos de trinucletidos, aumenta la posibilidad
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GH HQFRQWUDU 665V SROLPyUFRV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV PLQLPL]DQGR ORV SRVLEOHV FDPbios en el marco de lectura ocasionados por una variacin en el nmero de repeticiones de motivos de di, tetra o pentanucletidos. Estos marcadores, denominados SSRs gnicos o EST-SSRs, presentan las mismas ventajas que los SSRs neutros que han sido enunciadas HQ HO &DStWXOR /RV PDUFDGRUHV &$3V UHTXLHUHQ OD H[LVWHQFLD GH XQ VLWLR GH UHVWULFFLyQ SROLPyUFR HQ OD secuencia gnica, y si bien se han reportado casos, los mismos son de baja ocurrencia. La aproximacin ms sencilla para el desarrollo de un marcador funcional es a travs de XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH XQ IUDJPHQWR GH un gen y estableciendo la existencia de polimorVPR HQWUH JHQRWLSRV D WUDYpV GH OD UHVROXFLyQ GHO SURGXFWR HQ JHOHV GH 66&3 /RV SROLPRUVmos detectados mediante esta tcnica se basa HQ TXH KHEUDV VLPSOHV GH $'1 FRQ VHFXHQFLDV distintas, migrarn diferencialmente en un campo elctrico, en funcin de un diferente plegamiento intra-cadena dado por la complementariedad de bases. Patrones de bandas distintos HQWUH JHQRWLSRV HVWDUtDQ LQGLFDQGR XQD YDULDFLyQ GH VHFXHQFLD HQ HO IUDJPHQWR DPSOLFDGR Sin embargo, no puede asegurarse identidad GH VHFXHQFLD GH GRV IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV por no observarse diferencias en los patrones de electroforesis, ya que la deteccin de las mismas es un balance entre el nmero de SNPs presentes y el tamao del fragmento amSOLFDGR /RV SROLPRUVPRV SUHVHQWDGRV SRU los marcadores funcionales pueden entenderse como variantes allicas, que pueden o no estar asociados a una variacin a nivel proteico, ya sea en estructura o expresin. De todos modos, estos marcadores, anlogamente a lo HQXQFLDGR DQWHV HQ HVWH FDStWXOR SXHGHQ XWLlizarse para generar mapas genticos, que al estar formados por marcadores funcionales se denominan mapas funcionales. Los mapas funcionales en general estn basados en mapas pre-existentes de marcadores neutros con el agregado de marcadores funcionales. Estos marcadores funcionales pueGHQ FRUUHVSRQGHU D JHQHV VLQ UHODFLyQ HQWUH Vt como por ejemplo en mapas de ESTs-SSRs, o incluir anlogos de genes de resistencia
(5*$V R JHQHV SHUWHQHFLHQWHV D UXWDV PHWDEyOLFDV SDUWLFXODUHV SRU HMHPSOR VtQWHVLV GH carbohidratos), o a integrantes de una familia gnica (por ejemplo: genes de la familia P450). Los mapas genticos funcionales posibilitan establecer una estrategia de genes candidatos HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH IDFWRUHV UHVSRQVDEOHV GH QTLs a nivel molecular, a travs de la coincidencia en la localizacin de QTLs y marcadores gnicos. Un marcador funcional se convierte en gen candidato cuando est asociado al carcWHU IHQRWtSLFR D WUDYpV GH XQ DQiOLVLV GH PDUFDV simple, o cuando en un mapa su localizacin coincide con un QTL. En el primer caso, tanto el PDUFDGRU FRPR HO FDUiFWHU IHQRWtSLFR GHEHQ HVtar evaluados en la misma poblacin, mientras que en el segundo caso esto no es necesario, y es factible comparar la posicin de un marcador funcional con QTLs de mapas de otras poblaciones de la misma u otra especie. Por ejemplo, se ha encontrado que el locus del gen Lin5 del croPRVRPD ,; GHO WRPDWH FRUUHVSRQGLHQWH D XQD invertasa vacuolar (responsable de la degradacin de sacarosa en glucosa y fructosa) colocalizada con el QTL Brix9-2-5 de rendimiento de azcar de fruto, mientras que en papa el gen ortlogo invGE est asociado a variaciones en el nivel de azcares reductores en tubrculos de una poblacin segregante, y su posicin coincide con el QTL Sug9a, responsable del endulzaPLHQWR SRU IUtR HQ WXEpUFXORV GH RWUD SREODFLyQ GH SDSD $QiORJDPHQWH VH KD HQFRQWUDGR TXH marcadores funcionales, basados en anlogos D JHQHV GH UHVLVWHQFLD 5*$V VH DVRFLDQ HQ diferentes especies a resistencias a distintas enfermedades fngicas y virales. $VLPLVPR HQ FDUDFWHUHV FRPSOHMRV GRQGH VH hayan establecido mltiples QTLs, los marcadores funcionales permiten establecer la interaccin entre stos a la luz de las rutas metablicas LQYROXFUDGDV SXGLpQGRVH LGHQWLFDU HQ]LPDV claves para la manifestacin del carcter. Esta informacin genera un marco adecuado para HVWXGLRV GH LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD El mejoramiento gentico asistido por marcaGRUHV PROHFXODUHV 0$6 HQFXHQWUD HQ ORV PDUcadores funcionales una situacin ideal en la que la recombinacin entre el gen responsable y el marcador es nula, ya que ambos guardan identidad.
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$O HVWDU GLVHxDGRV VREUH JHQHV OD WUDQVIHrencia de estos marcadores a travs de espeFLHV HVWi EHQHFLDGD GDGD OD PD\RU FRQVHUYDFLyQ GH ODV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV $VLPLVPR la comparacin de mapas funcionales aporta LQIRUPDFLyQ HQ HVWXGLRV GH VLQWHQtD FRQVHUYDcin del tipo y orden de marcadores entre especies relacionadas), evolucin y especiacin entre diferentes organismos. Del mismo modo, la utilizacin de marcadores funcionales en la conservacin de los recursos genticos permite ponderar la diversidad gentica existente en base a las variantes allicas LQWUD H LQWHUHVSHFtFDV &RQFRUGDQWHPHQWH los estudios de gentica de asociacin (o mapeo de asociacin), basados en el desequilibrio de ligamiento entre un marcador y un carcter IHQRWtSLFR HQ XQD SREODFLyQ GH LQGLYLGXRV QR relacionados (como es el caso de los bancos de germoplasma) se presenta robustecido por el uso de marcadores gnicos. Finalmente, la correlacin de los marcadores IXQFLRQDOHV FRQ GDWRV IHQRWtSLFRV R FRQ 47/V slo sugiere la funcin putativa de un gen y sus variantes allicas. Es por esto que la conUPDFLyQ GHQLWLYD GH OD IXQFLyQ JpQLFD GHEH realizarse mediante estrategias ms directas como ensayos de complementacin y/o silenciamiento gnico.
5. Bibliografa y lecturas recomendadas:

ALLARD, R. W. 1956. Formulas and tables to facilitate the calculation of recombination values in heredity. Hilgardia 24: 235278. FEINGOLD, S. E.; LLOYD, J.; NORERO, N.; BONIERBALE, M. y LORENZEN, J. 2005. Map loFDWLRQ DQG GLYHUVLW\ YDOXHV IRU QHZ SRWDWR 665V GHYHORSHG IURP (67 GDWDEDVHV 7KHRU $SSO Genet. 111: 456-466. GELDERMANN, H. 1975. Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by JHQH PDUNHUV , 0HWKRGV 7KHRU $SSO *HQHW 46: 319-330. HALEY, C. S. y KNOTT, S.A. $ VLPSOH UHJUHVsion method for mapping quantitative trait loci in OLQH FURVVHV XVLQJ DQNLQJ PDUNHUV +HUHGLW\ 315-324. JANSEN, R. C. 1993. Interval mapping of multiple quantitative trait loci. Genetics 135: 205-211. KEARSEY, M. J. y POONI, H.S. 1996. Estimation of
recombination frequency. En: The genetic analysis of quantitative traits. (First edition). Chapman & Hall. London. pp. 120-132 LANDER, E. S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BARLOW, A.; DALY, M. J.; LINCOLN, S. E. y NEWBURG, L. 0$30$.(5 DQ LQWHUDFtive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1:174181. LANDER, E.S. y BOTSTEIN, D. 1989. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185199. ORTIZ, J. P. A.; PESSINO, S. C.; BATH, V.; HAYWARD, M. D. y QUARN, C. L. $ JHQHWLF linkage map of diploid Paspalum notautm. Crop. Science 41: 823-830. RUSSELL, P.J. 1996. Mendelian Genetics. En: Genetics, Chapter 2 (4th Edition). Harper Collins &ROOHJH 3XEOLVKHUV 1HZ <RUN SS 6$; . 7KH DVVRFLDWLRQ RI VL]H GLIIHUHQFHV ZLWK VHHG FRDW SDWWHUQ DQG SLJPHQWDWLRQ LQ Phaseolus vulgaris. Genetics 8:552-560 SCHUSTER, I. y CRUZ, C. D. (VWDWtVWLFD JHnmica aplicada a populaes derivadas de cruzamentos controlados. Primera Edicin. Viosa, Brasil. Ed. UFV. pp 568. STAM, P. 1993. Construction of integrated genetic OLQNDJH PDSV E\ PHDQV RI D QHZ FRPSXWHU SDFNage: JoinMap. Plant J. 3:739744. WEISING, K.; NYBON, H.; WOLFF, K. y KAHL, G. 2005. Linkage analysis and genetic maps. En: '1$ )LQJHUSULQWLQJ LQ SODQWV 3ULQFLSOHV 0HWKRGV DQG $SSOLFDWLRQV nd Edition). CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida. pp. 277-289 YOUNG, N.D. 1994 Constructing a plant genetic OLQNDJH PDS ZLWK '1$ PDUNHUV (Q '1$EDVHG PDUNHUV LQ SODQWV $GYDQFHV LQ FHOOXODU DQG PRlecular biology of plants. Vol. 1. (PHILLIPS, R. L. \ 9$6,/ , . (GLWRUV st HGLWLRQ .OXZHU $FDdemic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. pp. 39-57 YULE, G.U. 0HQGHOV ODZV DQG WKHLU SUREDEOH UHODWLRQ WR LQWUDUDFLDO KHUHGLW\ 1HZ 3K\WRO 193-207.
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I CAPTULO 7. Genmica
Viviana Echenique; Juan P. Selva; Mauro Meier; Pablo Roncallo; Gustavo Schrauf
1 Introduccin La genmica se desarroll en las ultimas dos dcadas como consecuencia de los DYDQFHV UHDOL]DGRV HQ ELRORJtD PROHFXODU H Informtica, dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnolgico enorme, generando una revolucin en el conocimiento y en la comprensin de los procesos biolgicos. El trmino fue acuado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la gentica que se ocupa del mapeo, secuenciacin y anlisis de las funciones de genomas completos y sirvi de nombre para una revista especializada en la publicacin de los mencionados temas, Genomics. Consiste en la caracterizacin molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo \ EDMR GLIHUHQWHV FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV DVt como de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el anlisis individual de genes o pequeas regiones cromosmicas, se aplican al anlisis global de genomas completos, estudianGR HQ FRQMXQWR ORV PLOHV GH JHQHV SURWHtQDV y metabolitos que constituyen un organismo, DVt FRPR ODV FRPSOLFDGDV UHGHV GH LQWHUDFciones que operan entre ellos. La informacin generada es enorme y es clave para la identiFDFLyQ \ HO DLVODPLHQWR GH JHQHV GH LQWHUpV \ permitir interpretar, en trminos moleculares, los procesos biolgicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformticas que permiten almacenar e interpretar esta informacin. Las aplicaciones de la genmica alcanzan a todos los mbitos de la actividad humana reODFLRQDGRV FRQ OD ELRORJtD FRPR OD VDOXG OD DOLPHQWDFLyQ \ HO PHGLR DPELHQWH $FWXDOPHQWH
se encuentran disponibles las secuencias de nucletidos y aminocidos de miles de genes \ SURGXFWRV JpQLFRV FRGLFDGRV SRU ORV JHnomas de varios organismos complejos. Esta informacin se utiliza para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comSUHQGHU IHQyPHQRV WDOHV FRPR OD VLRORJtD celular, el desarrollo, la conducta, la evolucin, etc. Tambin aportan informacin acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciacin y respuesta a estreses biticos y abiticos. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biolgica y econmicamente importantes con los genes responsables de los PLVPRV DFWXDOPHQWH HV SRVLEOH LGHQWLFDU JHnes de inters para ser transferidos a otros orJDQLVPRV SRU PHGLR GH WHFQRORJtD JpQLFD 3RU otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilita el desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual facilita la seleccin y la transferencia de los mismos a variedades de inters. La FRQMXQFLyQ HQWUH WHFQRORJtD JpQLFD PDUFDGRres moleculares, genmica y bioinformtica ha revolucionado el mejoramiento gentico vegetal, dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y se estn desarrollando nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1). La genmica puede dividirse en: - Genmica estructural, que se ocupa de OD FDUDFWHUL]DFLyQ ItVLFD GH ORV JHQRPDV - Genmica funcional, que caracteriza el transcriptoma, que est constituido por el conjunto completo de transcriptos producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU XQ JHQRPD \ HO metaboloma o conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la funcin de los $51 \ SURWHtQDV El objetivo de la genmica es la dilucidacin FRPSOHWD \ H[DFWD GH OD VHFXHQFLD GH $'1 GH un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por anlisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de gentica es posible:
100 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II
Figura 1: /D FRQMXQFLyQ HQWUH WHFQRORJtD JpQLFD PDUFDGRUHV PROHFXODUHV JHQyPLFD \ ELRLQIRUPiWLFD UHvolucionaron el mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos cultivares. Los nuevos genes KDOODGRV VRQ LQWURGXFLGRV HQ SODQWDV SRU WHFQRORJtD JpQLFD (VWR D VX YH] SHUPLWH HVWDEOHFHU OD IXQFLRQDlidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permite la obtencin de mapas, marcadores perfecWRV \ UHDOL]DU VHOHFFLyQ DVLVWLGD SRU PDUFDGRUHV PROHFXODUHV 0$6 DVt FRPR HO IHQRWLSHDGR PROHFXODU Gentileza de G. Spangenberg.
Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y comprender la funcin de las mismas. Realizar predicciones acerca de toGDV ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU XQD especie. Establecer las variaciones genticas entre distintas poblaciones de una misma especie. Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos. Esto ha dado origen a la genmica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia, es decir, una localizacin conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig. 2). Tambin ha sido una H[FHOHQWH KHUUDPLHQWD SDUD LGHQWLFDU PRWLYRV de secuencia altamente conservados y, por lo tanto, funcionalmente importantes en regio-
QHV FRGLFDQWHV \ QR FRGLFDQWHV GHO JHQRPD Catalogar las variaciones genticas entre individuos ayudar a LGHQWLFDU DTXHOORV FDPELRV TXH conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. Para la comparacin de secuencias se utiliza el algoritmo BLAST (basic local alignement search tool: herramienta de bsqueda de alineacin local bsica), para lo cual existen distintos programas que permiten hallar regiones similares entre diferentes genes (Parte I, Cap. 12). En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la publicacin del modelo HVWUXFWXUDO GHO '1$ SRU :DWVRQ \ &ULFN OD UHYLVta Nature public el primer borrador del genoma humano, que ha sido secuenciado completamente. Tambin se han secuenciado otros geQRPDV FRPR PDt] FRO]D VRMD WUpERO raigrs, etc. (Tabla 1).
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 101
Tabla 1. Ejemplos de genomas secuenciados en los ltimos aos.

Especie Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium Methanococcus jannaschii Helicobacter pylori Escherichia coli Bacillus subtilis Treponema pallidum Levadura (Saccharomyces cerevisiae )
Trichomonas vaginalis Nematodo (Caenorhabditis elegans) Mosca del vinagre ( Drosophila melanogaster ) Mosquito de la malaria ( Anopheles gambiae ) Mosquito del dengue y fiebre amarilla (Aedes aegypti ) Abeja (Apis mellifera) Protozoo malaria ( Plasmodium falciparum ) Sorgo (Sorghum bicolor ) Arroz (Oryza sativa ssp. japonica e indica) Pez globo (Tetraodon nigroviridis ) Gallo rojo de la jungla ( Gallus gallus) Zarigeya (Marsupial, Monodelphis domestica) Ratn (Mus musculus ) Rata (Rattus norvegicus ) Perro (Canis familiaris ) Chimpanc (Pan troglodytes ) Macaco rhesus (Macaca mulatta) Humano (Homo sapiens )
Tamao del genoma 1.830.137 pb 580.070 pb 1.660.000 pb 1.667.867 pb 4.639.221 pb 4.214.810 pb 1.138.006 pb 12.052.000 pb
160 Mpb 97 Mpb 120 Mpb 278 Mpb 1.380 Mpb 236 Mpb 22 Mpb 700 Mbp 420 - 466 Mpb 300 Mpb 1.000 Mpb 3.475 Mpb 2.500 Mpb 2.750 Mpb 2.411 Mpb 2.843 Mpb 2.870 Mpb 3.000 Mpb
Bacterias
Organismos Eucariotas
Plantas
Vertebrados
Figura 2: 6LQWHQLD HQWUH ORV JHQRPDV GH YDULDV JUDPtQHDV (O JHQRPD GH DUUR] FRQWLHQH JUXSRV GH PDUcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden VLQWHWL]DUVH EiVLFDPHQWH FRPR FRPSXHVWRV SRU EORTXHV GH OLJDPLHQWR GH DUUR] (Q OD JXUD VH PXHVWUD HO DOLQHDPLHQWR GH ORV FURPRVRPDV \ VHJPHQWRV GH FURPRVRPDV LGHQWLFDGRV FRQ OHWUDV PD\~VFXODV GH YDULDV JUDPtQHDV FRQ ORV GHO DUUR] FHQWUR (O JHQRPD GHO PDt] WLHQH GRV FRSLDV VHPHMDQWHV GH FDGD EORTXH GH JHQHV SRU OR TXH HVWi UHSUHVHQWDGR SRU GRV DQLOORV GHO FtUFXOR /DV OtQHDV H[WHUQDV SXQWHDGDV FRQHFWDQ VHFWRUHV DG\DFHQWHV GH ORV FURPRVRPDV GH WULJR 0RGLFDGR GH *DOH \ 'HYRV
Tambin es posible estudiar todos los genomas bacterianos asociados a genomas ms complejos, sin necesidad de aislar y de cultivar especies microbianas particulares. Esto se denomina metagenmica (Parte I, Cap. 11). Para este estudio se extrae WRGR HO $'1 GH XQD FRPXQLGDG PLFURELDQD GH XQ ambiente particular (suelo, agua de mar, intestino humano, etc.), se determina que genes se encuentran presentes, cuales son sus funciones y las diferencias que existen entre distintas comunidades a este nivel. Ms recientemente ha surgido la denominada Genmica Sinttica, que pretende crear formas VLQWpWLFDV GH YLGD UHFUHDQGR JHQRPDV DUWLFLDOHV FpOXODV FRQ YtDV PHWDEyOLFDV SUHGHWHUPLQDGDV \ SURSLHGDGHV FDWDOtWLFDV HVSHFLFDV ,QYROXFUD HO UHGLVHo y la fabricacin de sistemas biolgicos. Como ejemplo podemos citar el transplante de un genoma de una clula bacteriana a otra. $ FRQWLQXDFLyQ VH EULQGD XQ SDQRUDPD JOREDO acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genmica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigacin en Sudamrica.
2 Genmica estructural Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de XWLOLGDG SDUD PDQLSXODU JHQHV \ VHJPHQWRV GH $'1 en una especie particular. El anlisis comparativo de diferentes genomas posibilitar deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. La genmica estructural procede a travs de niYHOHV LQFUHPHQWDOHV GH UHVROXFLyQ DQDOtWLFD FRPHQzando con la asignacin de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos genes y PDUFDGRUHV GHQWUR GH ORV FURPRVRPDV QDOL]DQGR FRQ OD SUHSDUDFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR D WUDYpV GH la secuenciacin. Es decir, que se procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, hacia uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares, OOHJDQGR D OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDdo en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. 3). Los pasos a seguir son:
1) -Asignacin de genes a los cromosomas
2) -Mapeo Cromosmico
marcador 2 marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restriccin gen marcador 2
3) -Mapeo Fsico gen fragmentos clonados
Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resoOXFLyQ EDVDGR HQ PDUFDGRUHV PROHFXODUHV KDVWD OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDGR HQ OD VHFXHQFLD GH IUDJPHQWRV FORQDGRV VRODSDQWHV 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2004).
- Mapeo cromosmico de baja resolucin (ubicacin de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos (crossing overs) y son medidas como porcentaje de recombinacin en centimorgans (cM). - Mapeo gentico de alta resolucin de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados PX\ SUy[LPRV HQWUH Vt - Mapeo fsico, basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamao de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo que lleva ambos marcadores una estimacin de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin puede construirse un mapa
ItVLFR GHWHUPLQDQGR TXp IUDJPHQWRV SRVHHQ PDUFDGRUHV HQ FRP~Q /DV GLVWDQFLDV ItVLFDV VH PLGHQ HQ kilobases (kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa gentico en el mapa fsico. - Secuenciacin de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa gentico y del mapa fsico en el de secuencia. /DV GLVWDQFLDV ItVLFDV JHneralmente no se correlacionan directamente con las distancias genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera ms difusa). En humanos, un cM es equivalente, en promeGLR D DSUR[LPDGDPHQWH 0E GH $'1
1) -Asignacin de genes a los cromosomas
2) -Mapeo Cromosmico
marcador 2 marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restriccin gen marcador 2
3) -Mapeo Fsico gen fragmentos clonados
Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resoOXFLyQ EDVDGR HQ PDUFDGRUHV PROHFXODUHV KDVWD OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDGR HQ OD VHFXHQFLD GH IUDJPHQWRV FORQDGRV VRODSDQWHV 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2004).
2.1 Asignacin de loci a crosomas HVSHFtFRV Se utilizan los siguientes mtodos: - Ligamiento a loci conocidos: anlisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulstil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeos, separables por esta tcnica, como sucede con los de levaduras. Las banGDV HQ HO JHO FRUUHVSRQGHUtDQ D FURPRVRPDV individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicacin desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posicin en un cromosoma determinado. +tEULGRV FHOXODUHV LQWHUHVSHFtFRV, por ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de OtQHDV FHOXODUHV TXH FRQWHQJDQ WRGRV ORV FURmosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo SDUD XQD IXQFLyQ ELRTXtPLFD GHWHUPLQDGD HQ HO genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo GHFLHQWH SDUD HO IDFWRU TXH QR VLQWHWL]DQ HV porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la funcin faltante. 2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del cromosoma El prximo nivel de resolucin consiste en determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genticos pueGHQ DOLQHDUVH FRQ ORV PDSDV ItVLFRV \ XWLOL]DUVH para validar los mismos. - Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo (organismos experimentales como levaduras, mosca de la IUXWD UDWyQ $UDELGRSVLV HWF KD SRVLELOLWDGR OD construccin de mapas que a lo largo de los aos aparecen repletos de genes con efectos IHQRWtSLFRV GHWHUPLQDGRV 6LQ HPEDUJR ORV
intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de $'1 (VWRV LQWHUYDORV R JDSV QR SXHGHQ VHU completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatlites)(Parte I, Cap. 5). Estos marcadores permiten la construccin de mapas genticos con una densidad de un PDUFDGRUFHQWLPRUJDQ F0 $XQTXH WDO UHVRlucin es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un milln de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcaGRUHV EDVDGRV HQ HO SROLPRUVPR GH XQ VROR nucletido. - Hibridacin in situ: cuando se dispone de un gen clonado ste puede ser utilizado como para hibridar con los cromosomas in situ, para OR FXDO VH OR PDUFD UDGLDFWLYDPHQWH R SRU XRUHVFHQFLD 3XHGH GH HVH PRGR LGHQWLFDUVH a los cromosomas portadores de la secuencia, GHWHUPLQDU VL VRQ VHFXHQFLDV HVSHFtFDV GH XQ cromosoma y determinar la posicin del gen en HO PLVPR (Q HO FDVR GH XRUHVFHQFLD OD WpFnica se denomina FISH XRUHVFHQFH in situ hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (Parte I, Cap. 3). - Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de LGHQWLFDU XQ FRQMXQWR GH IUDJPHQWRV GH $'1 clonados superpuestos que, juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los PDSDV DVt REWHQLGRV VH OODPDQ mapas fsicos, SRUTXH HO $'1 HV HO PDWHULDO ItVLFR GHO JHQRPD 2.3 Secuenciacin a gran escala del genoma - Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir, aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la
ADN Genmico
Genoteca de BACS Clones organizados en Contigs BAC a ser secuenciado
Subclones (shotgun clones) Secuenciado Ensamblado
Figura 4: Estrategia de secuenciado jerrquico (hierarchical shotgun sequencing strategy). El primer SDVR FRQVLVWH HQ FRQVWUXLU XQD JHQRWHFD SRU IUDJPHQWDFLyQ GHO $'1 H LQWURGXFFLyQ GHO PLVPR HQ YHFWRUHV TXH DFHSWDQ JUDQGHV LQVHUWRV HQ HVWH FDVR GH %$&V /RV IUDJPHQWRV GH $'1 UHSUHVHQWDGRV HQ OD PLVPD VRQ RUJDQL]DGRV HQ XQ PDSD ItVLFR \ ORV FORQHV LQGLYLGXDOHV VRQ VHOHFFLRQDGRV \ VHFXHQFLDGRV SDUD OR FXDO se hace una nueva genoteca de trozos ms pequeos (shotgun library). La secuencia de los clones se HQVDPEOD QDOPHQWH SDUD UHFRQVWUXLU OD VHFXHQFLD GHO JHQRPD 0RGLFDGD GH OD SXEOLFDFLyQ GHO ,QWHUQDtional Human Genome Sequencing Consortium, 2001
vida del organismo. Para ello se obtienen poEODFLRQHV GH $'1F TXH UHHMDQ VyOR VHFXHQcias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen VHU VXFLHQWHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV JHnes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de anlisis informtico (Parte I, Cap.12). Si la informacin contenida en la secuencia SDUFLDO QR HV VXFLHQWH KDEUtD TXH GHWHUPLQDU OD HVWUXFWXUD GHO $'1F FRPSOHWR SDUD HVWXGLDU su funcin por otros mtodos. - Secuenciacin genmica La aproximacin anterior no permite idenWLFDU JHQHV TXH VH H[SUHVDQ D EDMR QLYHO R HQ VLWXDFLRQHV VLROyJLFDV QR FRQVLGHUDGDV R UHJLRQHV QR UHSUHVHQWDGDV HQ HO $51P 3DUD obtener esta informacin debe secuenciarse el
JHQRPD FRPSOHWR 3DUD HOOR HO $'1 JHQyPLco total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas o se fragmenta mecnicamente en fragmentos de gran tamao (100-300 kb.), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (Parte I, Cap. 4 $ Q GH GLVWLQJXLU ODV UHJLRQHV FRGLFDQWHV GH ODV QR FRGLFDQWHV ODV VHFXHQFLDV VH FRPSDUDQ FRQ ODV GH (67V \ $'1F SUHYLDmente estudiados. Para reconstruir la secuencia del genoma original a partir de los fragmentos clonados se utilizan las siguientes estrategias: a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de
PDSDV ItVLFRV GH JHQRPDV VH XWLOL]DQ YHFWRUHV FRPR ORV FyVPLGRV <$&V %$&V \ 3$&V TXH aceptan insertos de gran tamao (Parte I, Cap 4). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo. Para establecer el solapamiento de clones se secuencian regiones cortas del inserto proximas al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los intervalos sin secuencias (gaps) se FRPSOHWDQ XWLOL]DQGR HO QDO GH XQ IUDJPHQWR clonado para llegar al siguiente (primer walking $ PHGLGD TXH VH YDQ FDUDFWHUL]DQGR ORV clones, los contiguos se alargan y van convergiendo unos con otros. El proyecto termina cuando se tiene un conjunto de contiguos que equivale al nmero de cromosomas de la especie en estudio. En la Figura 4 se resume una estrategia de secuenciacin jerrquica (hierarchical shotgun sequencing). Esta se usa para genomas grandes. Para genomas ms pequeos se utiliza otra, llamada secuenciacin de
genomas completos (whole genome shotgun sequencing) (Fig. 5). Todos los estadios del anlisis genmico como la preparacin de cloQHV HO DLVODPLHQWR GH $'1 OD HOHFWURIRUHVLV \ la secuenciacin han sido bien adaptados a diferentes mquinas o robots, automatizando el trabajo. b) Ordenamiento de los clones Se utilizan varias tcnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. )HQRWLSLFDFLyQ QJHUSULQWLQJ se corta el clon con enzimas de restriccin que generan un grupo de bandas que representan XQ QJHUSULQW R KXHOOD GLJLWDO GHO FORQ /DV bandas generadas por varios clones pueden alinearse visualmente o por un programa de computacin para determinar si se superponen o solapan. - STS (sequence tag sites o sitios de secuencia marcada): son secuencias cortas
Figura 5: Montaje de un genoma complejo mediante la secuenciacin completa del genoma por tiros de escopeta (ZKROH JHQRPH VKRWJXQ VHTXHQFLQJ). En primer lugar, se construyen los contiguos con las secuencias que se superponen. Finalmente se utilizan los extremos apareados para cubrir los intervalos VLQ VHFXHQFLD \ DVt RULHQWDU \ RUGHQDU ORV FRQWLJXRV HQ XQLGDGHV OODPDGDV DQGDPLRV scaffolds 0RGLFDGR de Griffths et al. (2004).
de insertos grandes clonados. Se rene un conjunto de clones al azar y se cortan en fragmentos PiV SHTXHxRV TXH VH FORQDQ HQ \ se secuencian pequeas regiones de cada uno. Para ello se disean primers TXH DPSOLFDQ XQD VHFXHQFLD FRUWD GH $'1 676 $FWXDOPHQWH H[LVWH XQD WHFQRORJtD PiV moderna para el secuenciado de genomas, la pirosecuenciacin. Esta tcnica utiliza esferas atrapadas en una placa que contiene 1.600.000 microceldas. Cada esfera (una por microcelda) permite realizar una reaccin de VHFXHQFLDFLyQ LQGLYLGXDO EDVDGD HQ OD VtQWHVLV FRPSOHPHQWDULD GH XQ $'1 GH FDGHQD VHQFLOOD previamente multiplicado por PCR y alineado a cada esfera. La incorporacin de cada nucleWLGR GXUDQWH OD VtQWHVLV GH $'1 OLEHUD XQD PRlcula de pirofosfato (PPi), que al interactuar con enzimas presentes en el medio (luciferasa, entre otras) produce una seal quimioluminiscente captada por una cmara de deteccin de fotones, la traducida en una computadora como la adicin de un nucletido determinado, generando una secuencia individual por cada FHOGD (VWD WHFQRORJtD GHVDUUROODGD SRU OD HPpresa 454 Life Sciences, dio lugar a la creacin del primer equipo de secuenciacin masiva (Secuenciador GS 20) diseado para secuenciar genomas bacterianos, con una capacidad para descifrar 20 millones de bases por corrida (4hrs) en secuencias individuales de 100 bases. En el proyecto del gnero Bacillus, que tiene un genoma de aproximadamente 4 Mb, con seis corridas se descifraron 129.6 Mb, con una cobertura mayor a 20x de su genoma. En comparacin, por el mtodo de Sanger, se logr una cobertura de 3x (12,5Mb). 3 Utilizacin de mapas genmicos para el anlisis gentico /RV PDSDV JHQpWLFRV \ ORV ItVLFRV VRQ XQ LPportante punto de partida para varios tipos de anlisis gentico, incluyendo el aislamiento de genes y genmica funcional. Por ejemplo: - Aislamiento de genes por clonado posicional: para ubicar un gen cuya secuencia se desconoce se puede partir de un marcador conocido que est estrechamente ligado al
mismo. El mismo acta como punto de partida para el caminado cromosmico (chromosome walking GRQGH ORV IUDJPHQWRV QDOHV GHO PDUcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restriccin y los fragmentos obtenidos son utilizados para realizar una nueva ronda de seleccin de clones VXSHUSXHVWRV $Vt HO SURFHVR GH FDPLQDGR se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de inters. Existe otra tcnica relacionada llamada salto cromosmico, que permite saltar a travs de reas distantes y potencialmente no clonaEOHV GHO $'1 \ JHQHUD PDUFDV DPSOLDPHQte espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para mltiples caminatas cromosmicas bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restriccin GHO $'1 HQ OD UHJLyQ TXH VH FUHH FRQWLHQH DO JHQ GH LQWHUpV &DGD IUDJPHQWR GH $'1 HV luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unin un sitio que no sea cortado en una posterior restriccin, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma DKRUD HVWpQ XQLGDV HQ XQ IUDJPHQWR (O FtUFXOR se corta con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una genoteca de saltos. Una sonda del sector de comienzo de la regin que contiene al gen de inters puede utilizarse como punta de partida para comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de LQWHUpV 8QD YH] DOOt HO RWUR extremo de la unin del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a travs de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para una caminata cromosmica. Estas regiones VH YDQ VHFXHQFLDQGR $OOt FRPLHQ]D la bsqueda de genes utilizando programas
de prediccin y se seleccionan las secuencias candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz SDUD FORQDU HO JHQ GH OD EURVLV TXtVWLFD que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en un gen de gran tamao localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado en esa regin, estas secuencias pasan a ser candidatas. Para cada una de ellas, o para la ms probable, de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qu condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El H[SHULPHQWR LGHDO SDUD FRQUPDU HVWR VHUtD OD transformacin de un individuo mutante para esta funcin con el gen normal. Si se produce la reversin del fenotipo mutante (complementacin), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci) (Parte I, Cap. 5 y 6). Para abordar este problema, se buscan GRV WLSRV GH OtQHDV TXH PXHVWUHQ IHQRWLSRV contrastantes para un carcter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequexR Q~PHUR GH VHJPHQWRV GH XQD GH ODV OtQHDV Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribucin de ORV VHJPHQWRV HVSHFtFRV D OD YDULDFLyQ REVHUYDGD /RV 613 SROLPRUVPRV GH XQ QXFOHytido simple) aceleran el mapeo de caracteres complejos.
4 Anlisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo SXHGHQ LGHQWLFDUVH OD PD\RUtD GH ORV JHQHV GH XQD HVSHFLH 5HVWDUtD HQWRQFHV GHWHUPLQDU cul es la funcin de cada uno de ellos y cmo LQWHUDFFLRQDQ SDUD GHQLU XQ IHQRWLSR GHWHUPLnado. La genmica funcional intenta resolver esta cuestin a travs del estudio de: - El transcriptoma: VH UHHUH DO HVWXGLR GH los SHUOHV GH H[SUHVLyQ GH WRGRV ORV genes presentes en el genoma. Para ello se extraen todos los $51P FRQWHQLGRV HQ XQD FpOXOD WHjido u rgano en un determinado momento de GHVDUUROOR R VLWXDFLyQ VLROyJLFD (O PpWRGR PiV XWLOL]DGR HV HO GH PLFURPDWULFHV GH $'1 que permite analizar simultneamente la expresin de miles de genes, pudindose disponer entre 5000-50.000 genes (67V $'1F oligonucletidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este chip GH $'1 VH UHDOL]DQ H[SHULPHQWRV GH KLEULGDcin con muestras marcadas radiactivamente R FRQ XRUyIRURV DSURSLDGRV \ ORV UHVXOWDGRV VH FXDQWLFDQ PHGLDQWH DQiOLVLV FRQ phosphorimager R PLFURVFRStD FRQIRFDO 'H HVWD PDQHUD VH SXHGHQ LGHQWLFDU GH IRUPD VLPXOWiQHD los patrones de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta D GLIHUHQWHV HVWtPXORV DPELHQWDOHV (O DQiOLVLV bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin importante sobre la funcin de los mismos (Parte I, Cap. 8). - El proteoma: comprende el conjunto total de protenas expresadas por un genoma completo LQFOX\HQGR ODV PRGLFDGDV despus de la traduccin. El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el anlisis GH ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV por los transcriptos, puesto que estas macromolculas estn al QDO GH OD UXWD de expresin gnica. El mtodo ms utilizado para estudiar la abundancia relativa de FLHQWRV GH SURWHtQDV HV OD HOHFWURIRresis bidimensional en geles de poliacrilamida '3$*( que permite separar con gran resolucin OD PD\RUtD GH ORV SROLSpSWLGRV FHOXODUHV combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de anlisis de imagen
VH VHOHFFLRQDQ ODV SURWHtQDV FX\D DEXQGDQcia relativa cambia durante el desarrollo o en UHVSXHVWD D GLIHUHQWHV HVWtPXORV DPELHQWDOHV (Parte I, Cap.9). - El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una clula. En plantas, el metabolismo secundario (reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la produccin de compuestos que a veces ayudan a su supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes. 6H KDQ LGHQWLFDGR PiV GH \ VH HVWLma que an quedan por descubrir alrededor de 100.000. Los investigadores que trabajan en HVWH QXHYR FDPSR GH OD TXtPLFD DSOLFDGD D OD ELRORJtD PHWDEROyPLFD FRQVLGHUDQ TXH VyOR GH HVWD IRUPD VH SRGUtD GHQLU HQ WpUPLQRV moleculares, un fenotipo concreto. En metaEROyPLFD VH HPSOHDQ KHUUDPLHQWDV DQDOtWLFDV PX\ VHQVLEOHV WDOHV FRPR HVSHFWURPHWUtD GH PDVD FURPDWRJUDItD OtTXLGD R JDVHRVD \ UHsonancia magntica nuclear) para analizar los cambios metablicos provocados por mutaciones gnicas o por la expresin de transgenes. La metabolmica puede ser aplicada al monitoUHR GH HVWUHVHV LQGXFLGRV SDUD LGHQWLFDU SDsos metablicos limitantes, para el anlisis de mutantes y hasta para realizar la evaluacin de manejos agronmicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc. (Parte I, Cap. 10). - La bioinformtica intenta dar sentido a la informacin derivada de las tcnicas anteriormente descriptas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (Parte I, cap. 12). 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organizacin de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a travs de la evolucin, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genoPDV GH FDVL WRGDV ODV JUDPtQHDV FXOWLYDGDV entre las solanceas, entre las brasicaceas FXOWLYDGDV \ $UDELGRSVLV HQWUH ORV SLQRV URViceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo
en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado, los emprendimientos genmicos tomaron especies modelo, representativas de un genoma vegetal. El primer modelo vegetal fue una dicotilednea, Arabidopsis thaliana. Le sigui una monocotilednea, el arroz, cuyo JHQRPD HV VHLV YHFHV PHQRU TXH HO GHO PDt] y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitir arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotilednea que posee uno de los genomas vegetales ms pequeos. Carece de importancia econmica pero resulta ser un excelente organismo para la investigacin puesto que es fcil de transformar y su ciclo de vida tarda slo VHPDQDV GH VHPLOOD D VHPLOOD $OUHGHGRU GH FLHQWtFRV WUDEDMDQ FRRUGLQDGDPHQWH en esta pequea planta, conformando el ms DYDQ]DGR VLVWHPD GH H[SHULPHQWRV HQ ELRORJtD vegetal del mundo. Su secuencia gentica es GH OLEUH DFFHVR HQ HO VLWLR KWWSZZZDUDELGRSVLVRUJ (Q XQ DUWtFXOR SXEOLFDGR HQ 1DWXUH VH DQDOL]D HO JHQRPD GH $UDELGRSVLV D partir de las 115.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Su evolucin involucr una duplicacin completa del genoma, seguida por una subsecuente prdida y duplicacin de genes, lo cual dio origen a un genoma dinmico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. Contiene 25.498 JHQHV TXH FRGLFDQ SDUD IDPLOLDV GH SURWHtQDV FRQ XQD GLYHUVLGDG IXQFLRQDO VLPLODU a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans $UDELGRSVLV posee varias familias GH SURWHtQDV QXHYDV SHUR FDUHFH GH RWUDV FRmunes, indicando que los grupos proteicos en comn han experimentado una expansin y contraccin en estos tres grupos eucariotas. El genoma de arroz est compuesto por 19 bloques gnicos que, reordenados como bloques de Lego, permiten reconstruir el genoma de las Tritceas PDt] Setaria, caa de azcar y sorgo (Fig. 6). Considerados como una uniGDG JHQpWLFD UHSUHVHQWDUtDQ HO JHQRPD DQFHVWUDO GH ODV JUDPtQHDV HO FXDO WHQGUtD XQ ~QLFR par de cromosomas. /D IDPLOLD GH ODV JUDPtQHDV HV SUREDEOHmente la mejor caracterizada en este aspecto, contando con una buena cantidad de mapas
Figura 6: El genoma de arroz est compuesto por 19 bloques gnicos que, reordenados como bloques de Lego, permiten reconstruir el genoma de las Tritceas PDt] Setaria, caa de azcar y sorgo. Estos EORTXHV FRQVLGHUDGRV FRPR XQD XQLGDG JHQpWLFD UHSUHVHQWDUtDQ HO JHQRPD DQFHVWUDO GH ODV JUDPtQHDV HO FXDO WHQGUtD XQ ~QLFR SDU GH FURPRVRPDV
genticos comparativos que demuestran las UHODFLRQHV LQWHUHVSHFtFDV (Fig. 7). En trmiQRV JHQpWLFRV ODV JUDPtQHDV UHSUHVHQWDQ XQD familia muy diversa. Se estima que el genoma de las mismas divergi hace alrededor de 65 millones de aos desde un antecesor comn. (O QLYHO GH SORLGtD \ HO Q~PHUR EiVLFR GH FURPRVRPDV VRQ PX\ YDULDEOHV DVt FRPR HO WDmao del genoma. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una de ellas es que el nmero de genes no es la base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos 13.000 genes, Caenorhabitis elegans $UDELGRSVLV 26.000 y los humanos 30.000. Si el nmero de genes no es
muy diferente entre estas especies, cul es la base de la mayor complejidad en los humanos? /D H[SOLFDFLyQ HVWDUtD HQ HO SURWHRPD PiV TXH HQ HO JHQRPD /DV SURWHtQDV FRGLFDGDV por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el nmero de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo. Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. /DV QXHYDV SURWHtQDV VXUJHQ D WUDYpV GH FRUWHV \ HPSDOPHV DOWHUQDWLYRV GH XQ PLVPR $51 mensajero (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las
Figura 7: $OLQHDPLHQWR GH FURPRVRPDV GH DUUR] \ PDt]
predicciones indican que el 60% de los genes humanos tiene dos o ms alternativas de empalme. En Caenorhabitis el 22%. Un elevado nmero de factores de transFULSFLyQ \ PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV tambin conducen a una mayor complejidad. (Q HO FDVR GH $UDELGRSVLV FHUFD GHO GH los genes son factores de transcripcin (FT). Si se compara la proporcin con los genomas GH RWUDV HVSHFLHV VH REVHUYD TXH $UDELGRSVLV no slo tiene ms genes que algunos animales pequeos, sino que la proporcin de FT es ms alta que en cualquier clase de organismo HVWXGLDGR (VWR SDUHFH UHHMDU HO KHFKR GH que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los animales, que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. En humanos, los genes ocupan una cuarta SDUWH GHO JHQRPD \ VyOR HO FRGLFD SDUD SURWHtQDV /DV VHFXHQFLDV FRUUHVSRQGLHQWHV D
los exones (secuencias del mensajero que se HQFXHQWUDQ UHSUHVHQWDGDV HQ OD SURWHtQD ODV secuencias correspondientes a los intrones no lo estn) comprenden un porcentaje bajo del genoma, mientras que los intrones comprenden el 24%. Los genes no estn distribuidos en IRUPD SDUHMD $OJXQRV VH HQFXHQWUDQ DJUXSDdos en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, HO QHPDWRGR \ $UDELGRSVLV la disposicin de los genes es mucho ms regular. $SUR[LPDGDPHQWH la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, VLHQGR OD PD\RUtD elementos transponibles que se propagan replicndose e insertando una copia GH Vt PLVPRV HQ RWUDV UHJLRQHV GHO genoma. En la actualidad solo dos tipos de elePHQWRV VRQ DFWLYRV $OX \ /,1( /D PD\RUtD de los mismos se encuentran en regiones ricas HQ $ \ 7 PLHQWUDV TXH ORV JHQHV VH encuentran en reas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos tambin
se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresin de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, SRGUtDQ DIHFWDU SRVLWLYDPHQWH su expresin y evolucin. Los genomas vegetales tambin estn plagados de secuencias repetitivas (transposones y retrotransposones), que constituyen un SRUFHQWDMH PX\ LPSRUWDQWH GHO $'1 QXFOHDU \ han contribuido, a lo largo de la evolucin, a OD H[SDQVLyQ GH ORV JHQRPDV (Q PDt] UHSUHsentan del 50 al 80% del genoma y en trigo el 80% (Fig. 8). De esta manera los genomas de los cereales pueden considerarse como islas de genes que se hallan dispersas en un mar de secuencias repetitivas.
7 Genmica y Agricultura Especialistas en varias disciplinas han llegado a la conclusin de que el alcance de la JHQyPLFD VHUi PD\RU HQ OR TXH VH UHHUH D OD HFRQRPtD \ OD FDOLGDG GH YLGD TXH HQ HO iPbito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigacin de todo el mundo se dispone de bases de datos pblicas con informacin genmica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cmo actan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su funcin en otra. Las VHFXHQFLDV GH ORV JHQRPDV GH $UDELGRSVLV y de arroz proporcionan informacin relevante DFHUFD GH RWURV FXOWLYRV FRPR HO PDt] \ HO WULgo. Dado que estos tres cereales representan
Figura 8: D (OHPHQWRV UHSHWLWLYRV HQ XQ IUDJPHQWR FURPRVyPLFR GH PDt] E 'LDJUDPD TXH PXHVWUD FRPR ORV HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV HQ JUDPtQHDV VRQ UHVSRQVDEOHV GHO LQFUHPHQWR HQ HO WDPDxR GHO JHQRPD (O DUUR] VRUJR FHEDGD \ PDt] GHULYDURQ GH XQ DQFHVWUR FRP~Q KDFH DSUR[LPDGDPHQWH PLOORQHV GH aos. Desde entonces, los transposones y retrotransposones se han ido acumulando a diferentes niveles HQ ODV HVSHFLHV /RV FURPRVRPDV VRQ PiV ODUJRV HQ PDt] \ FHEDGD FX\RV JHQRPDV FRQWLHQHQ JUDQGHV cantidades de retros con LTR (long terminal repeats). En verde se sealan los elementos transponibles y en naranja los genes. 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2000).
ms de la mitad de la produccin alimentaria mundial y que el arroz es el alimento bsico de ms de la mitad de la poblacin del planeta, la trascendencia de la genmica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las especies de cereales tambin implica que cuando se trasladan genes de una especie a otra, tendern a funcioQDU ELHQ \ HQ OD PLVPD IRUPD FRQ XQD PtQLPD manipulacin gentica. $ WUDYpV GH HVIXHU]RV S~EOLFRV \ SULYDGRV VH WUDEDMD HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV DVRFLDGRV con caracteres como rendimiento, resistencia a OD VHTXtD FDOLGDG GH ORV DOLPHQWRV UHVLVWHQFLD a insectos y tolerancia a herbicidas. 'H HVWD PDQHUD VH KD DFHOHUDGR VLJQLFDtivamente el aporte de nuevas variedades al PHUFDGR \D VHD SRU PRGLFDFLyQ JHQpWLFD R por seleccin con marcadores moleculares o utilizando criterios de seleccin a partir de la informacin molecular.
La genmica comparativa, basada en el anlisis de ESTs de diferentes plantas tolerantes a estreses abiticos, ha permitido la LGHQWLFDFLyQ GH UHGHV GH JHQHV FRPXQHV DVRciados con estreses ambientales, tales como VDOLQLGDG VHTXtD EDMDV \ DOWDV WHPSHUDWXUDV El anlisis de especies tolerantes a situaciones H[WUHPDV KD LGHQWLFDGR JHQHV LQYROXFUDGRV en los mecanismos que las hacen tolerantes. Dichos genes podrn entonces ser transferidos a especies de cultivo. Como ejemplos pueden citarse Agrostis adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a aluminio y Deschampsia antarctica, tolerante a bajas WHPSHUDWXUDV OD ~QLFD JUDPtQHD que crece en OD $QWiUWLGD (Fig. 9). Tambin se ha mencionado que los factores GH WUDQVFULSFLyQ VHUtDQ ODV OODYHV SDUD GHVbloquear funciones gnicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejo-
Figura 9: Categorizacin funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto es HQFRQWUDU JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD UHVLVWHQFLD D EDMDV WHPSHUDWXUDV SDUD VHU WUDQVIHULGRV SRU WHFQRORJtD gnica, a especies de cultivo. Gentileza de G. Spangenberg.
res cultivos. Estos son genes que virtualmente controlan todo carcter importante, desde el SXQWR GH YLVWD DJUtFROD HQ ODV SODQWDV LQFOXyendo rendimiento, resistencia a las enfermeGDGHV SURWHFFLyQ FRQWUD ODV KHODGDV \ VHTXtD SURGXFFLyQ GH TXtPLFRV SURWHtQDV XVDGDV HQ IDUPDFpXWLFD HWF /D PD\RUtD GH ORV FDUDFWHres vegetales a los que interesa aplicar la ingeQLHUtD JHQpWLFD VRQ PXOWLJpQLFRV HM WROHUDQFLD DO HVWUpV KtGULFR \ ORV JHQHV LQYROXFUDGRV VH expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. Los factores GH WUDQVFULSFLyQ VHUtDQ ORV UHVSRQVDEOHV GH KDcer funcionar a los genes primarios, obtenindose largas cascadas de expresin de genes por la manipulacin de un solo gen. Durante los ltimos aos se ha obtenido una gran coleccin de FT de plantas, funcionalPHQWH FDUDFWHUL]DGRV QR VyOR HQ $UDELGRSVLV, VLQR WDPELpQ HQ HVSHFLHV FRPR WRPDWH PDt] y soja. En total hay cerca de 1900 FT en $UDELGRSVLV pero en el contexto de la genmica funcional el inters recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la funcin de los FT consiste en sobreexpresarlos y/o detener la expresin de algunos de ellos. Se puede, por ejemplo, medir el efecto GH FDGD )7 HQ OD FRPSRVLFLyQ GH ORV OtSLGRV HQ ODV VHPLOODV DFHLWHUDV \ OD FRPSRVLFLyQ GH OtSLdos en las hojas, la composicin de azcares, de esteroides, etc., estudiar procesos bsicos, a travs de la dilucidacin de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enferPHGDGHV R WUDWDU GH LGHQWLFDU HO )7 TXH UHJXla el consumo de nitrgeno (N). El N es uno de los insumos ms costosos para la agricultura, SRU OR TXH LGHQWLFDU ORV JHQHV TXH FRQWURODQ \ PRGLFDQ OD UHVSXHVWD DO 1 VHUtD GH JUDQ YDORU Tambin existen proyectos genmicos relacionados con leguminosas y con sus simbiontes MDGRUHV GH QLWUyJHQR 5HFLHQWHPHQWH VH KDQ secuenciado los genomas de las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el caso de M. truncatula no slo se han disectado los pasos que controlan las seales entre la
EDFWHULD MDGRUD \ OD SODQWD VLQR WDPELpQ HQWUH la planta y otro simbionte, las micorrizas (asoFLDFLyQ GH XQ KRQJR FRQ OD UDt] GH XQD SODQWD VXSHULRU (VWD DVRFLDFLyQ QR HV HVSHFtFD GH especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios gneros y aporta fsforo a la planta). Recientemente VH ORJUy OD LGHQWLFDFLyQ HQ DOIDOID GH XQ UHceptor requerido para el reconocimiento de seales bacterianas de nodulacin, los llamados factores NOD. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacutica. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450, TXH SDUWLFLSDQ HQ OD ELRVtQWHVLV GH PXFKRV FRPSXHVWRV DQWLFDQFHUtJHQRV DOFDORLGHV WRHVWHURLGHV DQWLR[LGDQWHV \ DQWLPLFURELDnos. Tambin tienen un rol muy importante en OD GHWR[LFDFLyQ GH [HQRELyWLFRV KHUELFLGDV \ SHVWLFLGDV 6H KDQ LGHQWLFDGR FLWRFURmos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolmica, determinar su IXQFLyQ ELRTXtPLFD SUHFLVD Otro de los objetivos de la metabolmica es HO HVWXGLR GH OD VtQWHVLV GH ODV HVHQFLDV TXH FRQHUHQ SHUIXPH D ODV RUHV \ HO PHMRUDPLHQto del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentacin humana, como por ejemplo manGLRFD GRQGH HO REMHWLYR VHUtD OD HOLPLQDFLyQ GH ORV JOXFyVLGRV FLDQRJpQLFRV TXH OH FRQHUHQ sabor amargo. La devastacin de los bosques es motivo suFLHQWH SDUD LQYHUWLU HQ SUR\HFWRV GH JHQyPLFD WHQGLHQWHV D OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV LQYROXcrados en perennidad, desarrollo, interaccin FRQ KHUEtYRURV UHVSXHVWD D HVWUpV \ VtQWHVLV de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. Se han generado ESTs de lamo, abedul, abeto, pino y eucaliptos. El lamo se utiliza como sistema modelo para el anlisis de los genes involucrados en la formacin de madera. Otro objetivo en este campo es la E~VTXHGD GH HVWUDWHJLDV SDUD LQGXFLU RUDFLyQ WHPSUDQD TXH HV XQ IDFWRU FUtWLFR HQ HO PHMRUDmiento de forestales. La secuenciacin de los genes y la diluciGDFLyQ GH ODV YtDV TXH FRQWURODQ OD RUDFLyQ HQ ORV FHUHDOHV TXH GLHUH HQ YDULRV DVSHFWRV FRQ ORV FRUUHVSRQGLHQWHV HQ $UDELGRSVLV KD VLGR
otro de los logros de la genmica. Tambin se localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes FHQWUDOHV HQ OD YtD GH YHUQDOL]DFLyQ HQ WULJR cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que perPLWLUtD SRWHQFLDOPHQWH FRQWURODU OD RUDFLyQ en cultivos de gran importancia econmica, como los cereales y los forrajes. 8 Aportes de la genmica al mejoramiento de cereales El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; $$%%'' HV XQR GH ORV SULQFLSDOHV FXOWLYRV alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. La gentica de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres genoPDV KRPHyORJRV GHQRPLQDGRV $ % \ ' TXH aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los genes redundantes son una norma, con sets KRPRDOpOLFRV WULSOLFDGRV HQ OD PD\RUtD GH HOORV El genoma del trigo hexaploide es el de mayRU WDPDxR 0ES WULJR 0ES PDt] 800 Mbp sorgo, 450 Mbp arroz). Ms del 80% del mismo est constituido por secuencias de $'1 DOWDPHQWH UHSHWLWLYR (O UHVWDQWH HVWi compuesto por secuencias de bajo nmero de copias o copia nica, donde se encuentran la PD\RUtD GH ORV JHQHV 6L ELHQ ODV VHFXHQFLDV DOWDPHQWH UHSHWLWLYDV YDUtDQ GH HVSHFLH HQ HVpecie, las secuencias gnicas, en general, son FRQVHUYDGDV (VWD FDUDFWHUtVWLFD SHUPLWH HO XVR de sondas heterlogas (de otros genomas) en experimentos de hibridacin de tipo RFLP 3DUWH , &DS SDUD LGHQWLFDU VHFXHQFLDV conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonmica (Devos y Gale, 2000). En 1989 se public el primer mapa gentico molecular de trigo, correspondiente a los cromosomas homelogos del grupo 7, observndose que el orden de los genes y marcadores se conserva en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide. Esta fue la primera SUXHED GH FROLQHDULGDG HQ JUDPtQHDV \ SRVLELOit el desarrollo de la gentica comparativa en cereales. En trabajos posteriores se comprob que largos segmentos de los cromosomas de
PDt] VRUJR DUUR] WULJR \ FHEDGD FRQVHUYDQ OD presencia y el orden de marcadores y genes, aunque en algunos casos la correspondencia FURPRVyPLFD IXH PRGLFDGD SRU GXSOLFDFLRnes, inversiones o translocaciones. De esta PDQHUD VH ORJUy FRQVHQVXDU XQ PDSD XQLFDGR GH JUDPtQHDV HQ HO TXH VH GHWDOODQ VHFXHQcias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. 2). Utilizando estas herramientas fue posible transferir informacin proveniente de plantas de genomas pequeos (arroz, sorgo) a plantas de genomas ms complejos como el trigo. Esto ha facilitado la localizacin ms precisa de genes para tolerancia a estrs bitico y abitico (prebrotado, dormicin, vernalizacin, IUtR \ RWURV \ HO GHVDUUROOR GH PDUFDGRUHV ~WLOHV para el mejoramiento. Tambin ha conducido a OD REWHQFLyQ GH PDSDV FRQVHQVR HVSHFtFRV SDUD WULJR SDQ FDQGHDO PDt] \ FHEDGD Las nuevas tcnicas de genmica funcional, epigentica, mapeo por asociacin, TILLING \ ORV $51 LQWHUIHUHQWHV $51L HQWUH RWUDV contribuirn a un mayor conocimiento del funcionamiento del genoma de este cereal. ([LVWHQ JHQRWHFDV GH %$&V%,%$&V SDUD WRdos los genomas de trigo. Estas representan un importante complemento para saturar los mapas. En los ltimos aos fueron confeccionado numerosos mapas genticos de trigo pan, candeal y cebada a partir de poblaciones de RILs OtQHDV UHFRPELQDQWHV HQGRFULDGDV R KDSORLdes duplicados, que resultan tiles en estudios GH LGHQWLFDFLyQ GH 47/ DVRFLDGRV D FDOLGDG y estreses biticos (enfermedades) y abiticos VHTXtD VDOLQLGDG 3DUD HOOR VH XWLOL]DURQ \ desarrollaron miles de marcadores moleculaUHV LQFOX\HQGR 5)/3V 665V $)/3V 613V \ PDUFDGRUHV '$U7 Diversity array technology), (estos ltimos basados en matrices de diversidad). La informacin generada posibilit el desarrollo de marcadores perfectos, a partir de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar de marcadores genticamente ligados. Como ejemplo pueden citarse los genes de las enziPDV SROLIHQRO R[LGDVDV OLSR[LJHQDVDV \ WRHQR sintasa, entre otros. Tambin posibilit la confeccin de mapas consenso para trigo pan, candeal y cebada.
El acceso a los principales genes que afectan OD FDOLGDG KD DELHUWR QXHYDV YtDV SDUD HO GHVDrrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidn, diferente textura de grano, diferente composicin de gluteninas, gliadinas y secalinas en funcin del uso industrial. El descubrimiento de genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo por transgnesis permitirn resolver problemas del cultivo, como pueden ser limitantes debido a estreses biticos y abiticos o desarrollar nuevas generaciones de transgnicos en funcin de las necesidades del consumidor, con mayor contenido de aminocidos esenciales como la lisina, vitaminas, etc. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genmicos a travs del transcriptoma. Para ello se han establecido consorcios internacionales como HO ,QWHUQDWLRQDO :KHDW *HQRPH 6HTXHQFLQJ &RQVRUWLXP ,:*6& R HO ,QWHUQDWLRQDO 7ULWLFHDH Mapping Initiative (ITMI), el cual coordina gruSRV GH LQYHVWLJDFLyQ GH GLVWLQWRV SDtVHV HQ OD construccin de mapas moleculares del genoma de trigo. Existe colaboracin internacional para otros cultivos como el arroz, donde el Internacional Rice Genome Sequencing Project ,5*63 FRRUGLQD HVIXHU]RV GH SDtVHV \ FRPR resultado de esto, en 2002, fueron colocadas en bases de datos pblicas secuencias de alta calidad que representaban 366 Mbp del genoma de arroz. En el 2005 se lleg a 371 Mbp, que representan el 95% del mismo. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la ltima dcada, de manera que en Septiembre de KDEtD PLOORQHV GH (67V GHSRVLWDGDV HQ el National Center for Biotechnology Information GE(67 GDWDEDVH KWWSZZZQFELQOPQLKJRY dbEST). Esto incluye cerca de 1.607.934 de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes ms cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L.; especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides Tausch. Estas ESTs se utilizan para el desarrollo de marcadores funcionales, la preparacin de mapas de transcriptos y la construccin de PDWULFHV GH $'1F $FWXDOPHQWH HO HVWXGLR GH $51 LQWHUIHUHQWHV 7,//,1* \ OD JHQpWLFD GH H[presin lideran el mapeo de eQTL (Quantitative
Traits Loci de expresin) y han sido utilizados SDUD LGHQWLFDU IXQFLRQHV GH JHQHV LQGLYLGXDOHV Toda esta informacin permite inferir que la ELRWHFQRORJtD SXHGH FDPELDU HO HVFHQDULR GH ORV cereales en dos reas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses biticos y abiticos y PRGLFDQGR HO FRQFHSWR GH SURGXFFLyQ GH commodities por el de produccin de specialities, por ejemplo para derivados de trigo con mayor valor agregado, como noodles (clase GH GHR PX\ XWLOL]DGR HQ $VLD JDOOHWLWDV GXOFHV crackers (un tipo de galletita que se rompe fcilmente), masa congelada, pan de molde, pasta, almidones, plsticos biodegradables, etc. 6H KDQ LGHQWLFDGR FLQFR iUHDV GH LQYHVWLJDcin a desarrollar en los prximos aos para el mejoramiento de trigo, que pueden aplicarse a los cereales en general: (i) mapeo gentico, (ii) anlisis de QTL, (iii) mejoramiento molecular, (iv) mapeo por asociacin, y (v) desarrollo de VRIWZDUH 9 Genomas trabajadores La genmica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo funciones complejas. Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante fuente de HQHUJtD &RQWLHQH HQ]LPDV TXH VRSRUWDQ WHPperaturas y presiones elevadas por lo que son SRWHQFLDOPHQWH ~WLOHV SDUD QHV LQGXVWULDOHV Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiacin extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biolgico de carbono hacia las profundidades de los ocanos, por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climticos del planeta. 10 Proyectos de Genmica en Sudamrica En Sudamrica se han desarrollado y se encuentran en ejecucin algunos proyectos genmicos. Frente al estado del desarrollo de
estas reas en el mundo, existen en la regin serias carencias, tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableci una red de cooperacin que secuenci completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataFD D ORV FtWULFRV FDXVDQGR LPSRUWDQWHV SpUGLGDV econmicas. Tambin incursion en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas y de secuenciacin del genoma de caa de azcar, 6DFFKDUXP RFLQDOLV (Q $UJHQWLQD VH ha trabajado en la secuenciacin de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina. Investigadores argentinos participan tambin en proyectos de genmica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciacin del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llev a la clonacin y caracterizacin de los genes de vernalizacin en trigo o el proyecto de bsqueda GH JHQHV GH WROHUDQFLD D IUtR HQ 'HVFKDPSVLD antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciacin de Piscirickettsia salmonis, patgeno intracelular de salmones que causa importantes prdidas en esta industria. Tambin se trabaja activamente en especies KRUWtFRODV SULQFLSDOPHQWH IUXWDOHV Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores microsatlites (Parte I, Cap. 5) de diversas especies, como girasol (colaboracin de ,17$$UJHQWLQD FRQ HPSUHVDV VHPLOOHUDV locales), YLGHV ,1,$&KLOH FRPR SDUWH GH XQ consorcio internacional), alpacas y otros camOLGRV VXGDPHULFDQRV ,1,$&KLOH SDVWR OORUyQ &(5=26 815 ,17$ &DVWHODU HQWUH otros. El girasol es una especie de importancia econmiFD HQ OD $UJHQWLQD \ HV HO HMH GH YDULRV SUR\HFWRV JHQyPLFRV $OJXQRV GH ORV REMHWLYRV VRQ OD caracterizacin de la diversidad funcional del JLUDVRO \ OD LGHQWLFDFLyQ GH 613V DVRFLDGRV D caracteres agronmicos de importancia como la resistencia a estreses biticos y abiticos. Por otro lado, el desarrollo de marcadores microsatlites, ESTs y el mapeo gentico de las mismas es utilizado para asistir al mejoramienWR \ UHDOL]DU LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO En Chile se ha desarrollado un programa de genmica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de
LQWHUpV DJUtFROD 2WUR SUR\HFWR GH JHQyPLFD HQ HVWH PLVPR SDtV DSXQWD D GHVDUUROODU SODWDformas tecnolgicas en genmica forestal con el objeto de mejorar la posicin competitiva del sector forestal chileno. En el marco del Programa Cooperativo para HO 'HVDUUROOR 7HFQROyJLFR $JURDOLPHQWDULR \ $JURLQGXVWULDO GHO &RQR 6XU 352&,685 los Institutos Nacionales de Investigacin $JURSHFXDULD GH $UJHQWLQD %ROLYLD %UDVLO Chile, Paraguay y Uruguay han conformado una plataforma regional para enfrentar los deVDItRV TXH LPSRQH OD VHFXHQFLDFLyQ GHO JHQRma de la papa. Esta iniciativa es desarrollada a nivel mundial por el Consorcio Internacional de Secuenciacin del Genoma de la Papa, que liGHUD OD 8QLYHUVLGDG GH :DJHQLQJHQ GH +RODQGD y en la que estn comprometidos China, Estados Unidos, Holanda, India, Inglaterra, Irlanda, Nueva Zelanda, Polonia, Rusia y los VXGDPHULFDQRV &KLOH 3HU~ $UJHQWLQD \ %UDVLO Estos ltimos, en conjunto, secuenciarn el cromosoma 3 del genoma de la papa y en total se debern secuenciar los 12 cromosomas de la especie. (Q YDULRV SDtVHV VH KDQ VHFXHQFLDGR fragmentos de genomas de virus y viroides $UJHQWLQD &KLOH 8UXJXD\ (Q $UJHQWLQD VH esta realizando la caracterizacin biolgica \ PROHFXODU GHO YLUXV GHO PDO GH 5tR &XDUWR 05&9 FRQ HO Q GH HVWLPDU OD GLYHUVLGDG JHntica de las poblaciones del virus, detectar la existencia de razas y limitar la propagacin de HVWD HQIHUPHGDG GH LPSRUWDQFLD SDUD HO PDt] (Q HO DxR OD $JHQFLD 1DFLRQDO GH 3URPRFLyQ &LHQWtFD \ 7HFQROyJLFD GH $UJHQWLQD $13&\7 ODQ]y XQD FRQYRFDWRULD SDUD 3UR\HFWRV GH UHD GH 9DFDQFLD 3$9 donde la genmica era una de las prioridades. En respuesta a esta convocatoria se form una Red de laboratorios dedicados al anlisis genmico funcional y comparativo en especies de inters agropecuario, forestal o ambiental 3$9 /RV REMHWLYRV IXHURQ JHQHUDU XQD LQfraestructura operativa y comunicacional adecuada y formar recursos humanos necesarios para apoyar el desarrollo de iniciativas e investigaciones en reas de genmica funcional y ELRLQIRUPiWLFD FUtWLFDV SDUD OD ELRORJtD DJURSHcuaria, forestal y ambiental. La red pudo capa-
citar recursos humanos orientados a la bsqueda, prospeccin y/o anlisis funcional de genes con inters bsico o aplicado. Se abordaron cinco reas de desarrollo e integracin: a) transcriptmica, b) protemica, interactmica y metabolmica, c) genmica comparativa, d) genmica evolutiva para la caracterizacin de la diversidad gentica y e) ecogenmica (aplicada a la evaluacin de impacto ambienWDO \ HSLGHPLRORJtD PROHFXODU (Q ORV GRV SULmeros subproyectos se encararon trabajos de prospeccin y caracterizacin funcional de regiones genmicas de inters en plantas superiores y bacterias zoonticas mediante el anOLVLV GH SHUOHV GH WUDQVFULSFLyQ LQWHUDFFLyQ GH SURWHtQDV \ SHUOHV PHWDEyOLFRV JLUDVRO FLWUXV soja, solanceas, Mycobacterium y otros). En el c) se caracterizaron molecularmente regioQHV JHQyPLFDV LQYROXFUDGDV HQ FDUDFWHUtVWLFDV reproductivas (apomixis) de especies forrajeras, de resistencia a estreses en especies FXOWLYDGDV DVt FRPR GH FDUDFWHUtVWLFDV SURductivas en girasol y caprinos. El rea d) sirvi para evaluar la diversidad gentica de recursos biolgicos naturales o cultivados, en particular en especies leguminosas y en forestales. La e) permiti estudiar la dinmica poblacional de variantes allicas en ecosistemas (impacto del FXOWLYR GH PDtFHV WUDQVJpQLFRV HQ SRWHQFLDOHV genes de resistencia en insectos plaga, cuantiFDFLyQ GH GLYHUVLGDG JHQpWLFD GH HVSHFLHV HQ peligro de extincin en ecosistemas naturales explotados por el hombre) y encarar la epidePLRORJtD PROHFXODU GH OD HEUH DIWRVD \ GH OD peste porcina clsica. (VWH SUR\HFWR DFDED GH QDOL]DU VHSWLHPEUH de 2008) y, si bien an no se ha realizado la HYDOXDFLyQ QDO GHO PLVPR YDULRV GH ORV REjetivos fueron cumplidos exitosamente, ya que se formaron varios doctores en el rea en disWLQWDV 8QLYHUVLGDGHV GHO SDtV HQWUHQDGRV SDUD trabajar en equipos multidisciplinarios, adems de lograr avances en el conocimiento en las mencionadas reas. (O ,1,$ 8UXJXD\ FXHQWD FRQ SUR\HFWRV GH desarrollo y validacin de herramientas bioinformticas para integrar informacin genmica HQ SURJUDPDV GH WRPHMRUDPLHQWR \ VHOHFFLyQ de germoplasma. Dentro de los proyectos de JHQyPLFD GH DUUR] HO (0%5$3$ %UDVLO UHD-
liza el estudio de genes y sus productos, involucrados en los mecanismos moleculares de susceptibilidad y resistencia a estreses biticos, a travs de estudios de genmica funcional, utilizando ESTs y unigenes y micromatriFHV GH $'1F Los objetivos para programas de genmica VXGDPHULFDQRV GHEHUtDQ HQIRFDUVH KDFLD HO aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos, desarrollando capaciGDGHV SDUD LGHQWLFDU JHQHV GHO JHUPRSODVPD regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aisODGRV SRU SDtVHV GHO SULPHU PXQGR \ EXVFDU VRluciones para problemas propios de la regin, TXH GLItFLOPHQWH SXHGHQ VHU HQIUHQWDGRV SRU programas de mejoramiento gentico ajenos a la misma. 11 Lecturas / sitios recomendados
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I CAPTULO 8 Transcriptmica
Silvina Felitti y Silvina Pessino El anlisis de los niveles de representacin GH $51 PHQVDMHURV SURSRUFLRQD LQIRUPDFLyQ importante sobre la actividad de un gen, evidenciando si est siendo copiado para posteULRUPHQWH GLULJLU OD VtQWHVLV GH OD SURWHtQD D OD FXDO FRGLFD (Q ORV ~OWLPRV DxRV ORV SURFHdimientos para la deteccin de los niveles de $51 PHQVDMHURV KDQ SURJUHVDGR YHOR]PHQWH GHVGH HO DQiOLVLV GH JHQHV ~QLFRV HVSHFtFRV (como el Northern, slot, y dot blotting, la RTPCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de proteccin de nucleasas) hacia otros HQIRFDGRV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH P~OWLSOHV WUDQVFULSWRV TXH GLHUHQ HQ VX UHSUHVHQWDFLyQ entre las diversas muestras experimentales (como la hibridizacin substractiva, el display GLIHUHQFLDO HO $'1F$)/3V, la secuenciacin de etiquetas expresadas o ESTs, el anlisis seULDO GH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV R 6$*( \ OD KLbridizacin de microarreglos). La organizacin posterior de las secuencias dentro de grupos IXQFLRQDOHV EDVDGD HQ ORV GDWRV GH KRPRORJtD proporciona un marco bsico para conducir QXHYRV HVWXGLRV GLULJLGRV D GHQLU HO URO ELROygico de cada producto gnico. Por otra parte, la aplicacin de tcnicas de PCR en tiempo real y de hibridizacin in situ de tejidos permiten una validacin ms precisa de los datos de expresin diferencial obtenidos por mtodos anteriormente citados. La capacidad tecnolgica creciente permite ahora capturar sectores de tejidos o incluso clulas aisladas y analizar su contenido de $51P OR TXH SURYHH LQIRUPDFLyQ HVSHFtFD sobre la representacin del transcriptoma para tipos celulares nicos. La asociacin de los datos provenientes de la secuenciacin genmica con aquellos originados en la transcriptmica y la protemica facilita la prediccin de la exisWHQFLD GH IUDJPHQWRV FRGLFDQWHV HQ VHFWRUHV acotados del genoma, y da informacin sobre la posible funcin de los candidatos en tejidos SDUWLFXODUHV $GHPiV OD DVRFLDFLyQ GH ORV GD-
tos de posicin (originados en el mapeo gentico) con los datos de expresin (originados en el anlisis del transcriptoma) posibilita la seleccin de candidatos responsables de disparar un determinado carcter de inters. (VWH FDStWXOR WLHQH FRPR REMHWLYR SUHVHQWDU HQ IRUPD DEUHYLDGD XQD VHULH GH PHWRGRORJtDV que son utilizadas habitualmente para el anlisis del transcriptoma de plantas. Debido al muy rpido cambio y perfeccionamiento en las tcnicas empleadas para abordar el estudio de la representacin de mensajeros tanto a nivel de mesada como bioinformtico, algunas de las PHWRGRORJtDV PHQFLRQDGDV DTXt \D KDQ VLGR reemplazadas y se usan actualmente en forma poco frecuente. Sin embargo hemos decidido incluirlas, dada su gran importancia histrica en relacin al cambio de abordaje conceptual que va desde el anlisis de la actividad de genes nicos al estudio integral de la expresin gnica. Comenzaremos describiendo las tcnicas en orden cronolgico de desarrollo. Hibridizacin substractiva Los mtodos de hibridizacin substractiva fueron creados a principios de los aos 80 con HO SURSyVLWR GH FRQVWUXLU ELEOLRWHFDV GH $'1F para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito GH LGHQWLFDU JHQHV UHJXODGRV SRVLWLYD R QHJDtivamente en una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de tcQLFDV FRPXQHV GH ELRORJtD PROHFXODU TXH QR requieren equipos especializados de deteccin y anlisis. El procedimiento general consiste HQ OD KLEULGL]DFLyQ GH XQ $'1F SURYHQLHQWH de una muestra prueba (tester) con un exceso GH $51P SURYHQLHQWH GH XQD PXHVWUD FRQWURO (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de $51P$'1F KtEULGDV PLHQWUDV TXH ODV VHFXHQFLD GH $'1F TXH HVWiQ SUHVHQWHV ~QLFDmente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatograItD HQ KLGUR[LODSDWLWD /RV $'1FV H[SUHVDGRV diferencialmente pueden entonces ser recu-
perados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades GH $51P \ LL XQD WHQGHQFLD D XQD PHQRU HFLHQFLD HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH WUDQVFULSWRV SRFR abundantes. La hibridizacin substractiva es aplicable slo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de exSUHVLyQ $GHPiV QR JHQHUD XQD PHGLGD FXDQWLWDWLYD \ DXQTXH HV HFLHQWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en ambas muestras en distinta SURSRUFLyQ 6H UHDOL]DURQ PRGLFDFLRQHV SDUD mejorar el protocolo original que incluyen la SURGXFFLyQ GH $'1F FRQ PDUFDV GH ELRWLQD R ROLJRG7OiWH[ GH PDQHUD GH UHQDU OD VHparacin de las molculas de cadena simple \ GREOH 7DPELpQ VH LQFRUSRUy OD DPSOLFDFLyQ GH $'1FV VHOHFWRV SRU 3&5 SDUD GLVPLQXLU OD FDQWLGDG LQLFLDO GH $51P UHTXHULGR \ DXPHQWDU OD HFLHQFLD GH FORQDGR GH ORV WUDQVFULSWRV seleccionados. Tambin se ha utilizado un protocolo ingenioso conocido como hibridizacin substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la representacin de los transcriptos diferenciales basada en la LQKLELFLyQ GH OD DPSOLFDFLyQ GH DTXHOORV TXH son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (ver Figura 1). Display diferencial y RAP-PCR Las tcnicas conocidas en general como KXHOODV GLJLWDOHV GH $51 $51 QJHUSULQWLQJ incluyen al display diferencial (DD) y la PCR GH $51 FHEDGD DUELWUDULDPHQWH 5$33&5 $PERV PpWRGRV HVWiQ EDVDGRV HQ XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH VXEJUXSRV DO D]DU GH transcriptos a partir de dos o ms muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es FRP~Q \ FRQVLVWH HQ JHQHUDU $'1FV KDFLHQGR una transcripcin reversa de una fraccin de ODV PROpFXODV GH $51P GH XQD PXHVWUD (Q
el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripcin reversa a un poliT anclado con una o ms bases adicionales DO H[WUHPR GHO $51 PHQVDMHUR SRU HMHPSOR (T)12$& (VWRV ROLJRQXFOHyWLGRV VH MDQ DO $51 mensajero a travs de la unin de las bases adicionales, impidiendo que el poliT resbale VREUH GLVWLQWDV ]RQDV GHO SROL $ (O ~QLFR JUXSR GH $51PV TXH HV WUDQVFULSWR HQ IRUPD UHYHUVD es el integrado por las molculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyaFHQWH DO SROL$ (Q FRQWUDVWH OD 5$33&5 XWLOL]D oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias complementarias permitiendo IRUPDU XQD KHEUD GH $'1F GHVGH HVWH VLWLR (Q HVWH FDVR HO VXEJUXSR GH $51PV TXH VXfre transcripcin reversa estar integrado por aquellas molculas que presenten la secuencia complementaria a la del cebador orientada en el sentido adecuado. /XHJR GH KDEHUVH UHDOL]DGR OD VtQWHVLV GH OD SULPHU KHEUD GHO $'1F VH DPSOLFDQ VHJPHQtos de los transcriptos usando pares mltiples de cebadores de PCR. Tanto para el display GLIHUHQFLDO FRPR SDUD HO 5$33&5 HO FHEDGRU superior es un oligonucletido arbitrario de 10 pares de bases. El cebador inferior es el mismo oligonucletido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario SDUD HO FDVR GH 5$33&5 TXH VH XVDURQ DOWHUnativamente para hacer la transcripcin reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclaGRV UHSUHVHQWDQ HVWDGtVWLFDPHQWH D WRGRV ORV $51P RULJLQDOPHQWH SUHVHQWHV HQ OD PXHVWUD Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporacin de un nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un ceEDGRU XQLGR D XQ XRUyIRUR X RSWDUVH SRU QR PDUFDU ORV IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV \ XVDU OXHgo una tincin con nitrato de plata para revelar
cDNA driver (en exceso) cDNA tester con el adaptador 1 cDNA tester con el adaptador 2
Primera hibridizacin
a b c
Segunda hibridizacin: mezcado de muestras, agregado de driver desnaturalizado y anillado a, b, c, d + e Rellenado de los extremos a b
e Agregado de los cebadores Amplificacin por PCR a , d no hay amplificacin b b b no hay amplificacin c amplificacin lineal e amplificacin exponencial +
Figura 1.
los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra luego de la electroforesis en geles de poliacrilamida seguida de la apropiada generacin y deteccin de imgenes, que son evaluadas comparando la intensidad relativa de las bandas producidas a partir de diferentes muestras experimentales. Los fragmentos que estn presentes en una muestra y ausentes en
la otra, o aquellos que estn presentes con diferentes intensidades relativas en los distintos tratamientos experimentales, representan poWHQFLDOHV WUDQVFULSWRV GH $51P GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO 7tSLFDPHQWH ODV EDQGDV VRQ HYDOXDGDV VyOR VL DPSOLFDQ HQ IRUPD FRQVLVWHQWH en reacciones de PCR duplicadas para cada muestra (ver la Figura 2).
Muestra de RNA 1
A)A A) (n A A(n A AA AA
A)A( nAA A
Muestra de RNA 2
A) A(
A)A (n A AA
AA A
AAA(A)nA
A)A(n AA A
A)A( AA
n
AA ( nAA A)AAA A( A n)
AAA
(A) A
n
A A)A( nAA
AA
AAA(A)nA
)A (A
An )
A(A
Transcripcin reversa usando cebador ancla del tipo 5T(T)nTXY3 Muestra de cDNA 1
Muestra de cDNA 2
PCR usando el cebador ancla 5T(T)nTXY3 y un decmero al azar
Muestra 1
Muestra 2
Figura 2. /D IDVH QDO GHO GLVSOD\ GLIHUHQFLDO FRQVLVWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH OD VHFXHQFLD GHO WUDQVcripto representado por el producto de PCR y OD FRQUPDFLyQ GH TXH pVWH UHDOPHQWH VH H[presa en forma contrastante. Estas etapas se ORJUDQ ORFDOL]DQGR ItVLFDPHQWH \ HVFLQGLHQGR OD seccin del gel de poliacrilamida que contiene DO SURGXFWR GH LQWHUpV (Q OD PD\RUtD GH ORV casos debe realizarse un alineamiento de las LPiJHQHV GH ORV IUDJPHQWRV GH DPSOLFDFLyQ con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la UHFXSHUDFLyQ GH OD EDQGD HV PXFKR PiV HFLHQWH /RV SURGXFWRV GH 3&5 VRQ SXULFDGRV GHO JHO \ UHDPSOLFDGRV 3DUD HOOR HO IUDJPHQWR
)n A
AA
)A (A
AA
AAA(A )n A
A(A
A)A
AA
AA
( nA
AA
A A ( AA n A )A n (A)A
AAA (A) A
n
AA
(A )A
de poliacrilamida se procesa en fragmentos peTXHxRV FRQ XQ EtVWXUt TXH VH WUDQVHUHQ D XQD solucin tampn adecuada para la elucin de los fragmentos. Luego de una centrifugacin, HO VREUHQDGDQWH VH SXULFD FRQ IHQROFORURIRUPR \ HO $'1 VH SUHFLSLWD FRQ HWDQRO VH GLOX\H HQ DJXD \ VH UHDPSOLFD SRU 3&5 Se han utilizado varias estrategias para FRQUPDU OD H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH ORV WUDQVcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a anlisis de Northern inverso y el clonado y secuenciacin de los productos para disear ceEDGRUHV HVSHFtFRV TXH SHUPLWDQ UHDOL]DU 3&5 VHPLFXDQWLWDWLYDV DVt FRPR WDPELpQ OD KLEULGLzacin in situ de tejidos. Dos ventajas importantes de los mtodos GH QJHUSULQWLQJ GH $51 FRQ UHVSHFWR D ORV GH hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales mltiples HQ IRUPD VLPXOWiQHD \ OD GH LGHQWLFDU JHQHV que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las RWUDV 6LQ HPEDUJR ORV PpWRGRV GH QJHUSULQWLQJ GH $51 FRPSDUWHQ FRQ HO 66+ OD OLPLWDFLyQ de que no son cuantitativos. Uno de los problemas que suelen atribuirse D GLVSOD\ GLIHUHQFLDO HV OD DPSOLFDFLyQ GH IDOsos positivos o sea fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son luego cosiderados artefactos de PCR porque no pueden validarse por Northern blot o PCR en tiempo real. Es necesario dar una mirada ms detallada a este punto. Es cierto TXH HV LPSUHVFLQGLEOH UHDOL]DU ODV DPSOLFDFLRnes de DD PCR por duplicado o triplicado para DVHJXUDUVH TXH OD DPSOLFDFLyQ HV UHSURGXFLble y no se trata de una banda espuria. Pero una vez superado este punto de la reproduciELOLGDG GH OD DPSOLFDFLyQ KD\ TXH FRQVLGHUDU que no siempre las diferencias detectadas con esta tcnica pueden ser validadas por Northern o por PCR en tiempo real. Por ejemplo, cuando existe expresin allica diferencial entre muestras, o cuando diferentes miembros de una misma familia gnica son expresados diferencialmente, es posible que se detecten polimorVPRV HQ ORV JHOHV GH '' FRPR FRQVHFXHQFLD de que los primers se unan a sitios variables
de la secuencia. Sin embargo, es probable que distintos alelos o incluso diferentes miembros de una familia gnica hibridicen en conjunto en el experimento de Northern, o que los diseos de cebadores para real time PCR no permitan diferenciarlos. Tambin puede ocurrir que en los experimentos de DD se detecte una hebra antisentido sobreexpresada en una de las muestras. Si la hebra sentido est expresada en la otra, los experimentos de real time no permitirn la deteccin de la expresin diferencial. Estos son slo algunos de los muchos casos posibles en los cuales el northern y la PCR en tiempo real no reproducirn los datos de DD, pero no precisamente porque el DD haya generado un falso positivo, sino simplemente porque estas tcnicas estn basadas en principios de deteccin diferentes. Muchos de los supuestos falsos positivos detectados por DD HQ HO SDVDGR FXDQGR QR VH WHQtD FRQFLHQFLD sobre la frecuencia de la expresin antisentido) pueden englobarse seguramente en estas FDWHJRUtDV Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamenWH LGpQWLFRV SRU HMHPSOR LVROtQHDV &XDQGR VH FRPSDUDQ ORV SHUOHV GH $51P GH LQGLYLduos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una DPSOLFDFLyQ GLIHUHQFLDO GHELGD D XQD YDULDcin en la secuencia de los transcriptos ms que a diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de anlisis de segregantes en grupo %6$ DSOLFDGDV DO HVWXGLR GH SHUOHV GH $51 Finalmente, la investigacin de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de ltima generacin y una inversin extensiva de WLHPSR \ WUDEDMR SDUD GHWHFWDU \ FRQUPDU OD expresin diferencial de cada uno de los genes individuales. 3ROLPRUVPRV HQ HO ODUJR GH ORV IUDJPHQWRV GH $'1F DPSOLFDGRV $'1F$)/3) /D WHFQRORJtD GH $)/3, generalmente utili]DGD SDUD SURGXFLU KXHOODV JHQpWLFDV GH '1$ genmico, puede ser aplicada tambin a pre-
SDUDFLRQHV GH $'1F GH GREOH KHEUD SDUD REWHQHU XQ SHUO GHO WUDQVFULSWRPD /RV SDWURQHV obtenidos por esta tcnica son una herramienWD FRQDEOH \ HFLHQWH SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH $51PV H[SUHVDGRV GLIHUHQFLDOPHQWH /D WpFQLFD GH $'1F$)/3 detecta fragmentos de UHVWULFFLyQ GH '1$ SRU PHGLR GH DPSOLFDFLyQ por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) JHQHUDFLyQ GH $'1F LL UHVWULFFLyQ GHO $'1F FRQ GRV HQGRQXFOHDVDV HVSHFtFDV SUHIHULEOHmente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligacin
mRNA
de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restriccin, iv) ampliFDFLyQ GH XQ VXEJUXSR GH ORV IUDJPHQWRV GH restriccin usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis GH ORV IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ DPSOLFDGRV en geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las huellas digitales genticas mediante el uso GH DXWRUDGLRJUDItDV IRVIRLPiJHQHV \ RWURV Pptodos (ver Figura 3).
AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT
Cebador Oligo dT
AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT
Sntesis de cDNA
cDNA Digestin con las endonucleasas de restriccin
Ligacin de los adaptadores
Preamplificacin con los cebadores
Amplificacin selectiva de fragmentos
XY
YX XY YX
Huella digital (Fingerprint)
Figura 3.
Las mayores ventaja del uso de la tecnoORJtD GH $'1F$)/3 son: i) no se requiere informacin previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fraccin muy grande de todos los genes expresados, iii) es una tcnica muy sensible que permite la deteccin de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son exWUDtGRV IiFLOPHQWH GH ORV JHOHV \ ODV VHFXHQcias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. Etiquetas de secuencia expresadas (Expressed sequence tags, ESTs) La secuenciacin exhaustiva de ESTs (Expressed Sequence Tags) es considerado principalmente un mtodo para la caracterizacin de la expresin gnica, a pesar de que la generacin de ESTs resulta tambin importante para deducir la presencia de genes no predichos en ausencia de datos genmicos. Las ESTs son obtenidas a gran escala por secuenFLDFLyQ GH XQD VROD KHEUD GH FORQHV GH $'1F (aproximadamente 500 pb) provenientes de bibliotecas que representan distintos tejidos o condiciones experimentales. Las ESTs representan descripciones parciales de las regiones que se transcriben de un genoma. Una cantidad creciente de centros de investigacin han FRQVWUXtGR \ VHFXHQFLDGR ELEOLRWHFDV GH $'1F HQ ORV ~OWLPRV DxRV (VWD WHQGHQFLD VH YH UHHjada en el nmero de ESTs depositadas en la base de datos del NCBI (ESTdb), el que al 6 de Junio de 2008 es de 2994249 provenientes de 261 especies de plantas. (Q WHRUtD OD DEXQGDQFLD GH XQD (67 HV GLrectamente proporcional a la representacin en nmero de copias de un transcripto en un tejido determinado. El proceso de generacin de ESTs es relativamente lento y costoso, lo que KDFH GLItFLO TXH VH ORJUH OD VDWXUDFLyQ GH XQD biblioteca. Tericamente, si se secuencia el nPHUR VXFLHQWH GH (67V HVWH PpWRGR SHUPLWH analizar incluso aquellos genes que presentan niveles de expresin bajos, pero si el nmero de secuencias obtenidas es limitado conviene UHFXUULU D WpFQLFDV GH DPSOLFDFLyQ FRPSOHPHQWDULDV $'1F$)/3 R '' SDUD GHWHFWDU transcriptos poco abundantes. Las secuencias ESTs a menudo se generan D SDUWLU GH ELEOLRWHFDV GH $'1F TXH KDQ VLGR
normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas ltimas pueden ser comparados para LGHQWLFDU WUDQVFULSWRV TXH VH H[SUHVDQ HQ XQD biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a biEOLRWHFDV GH $'1FV QR QRUPDOL]DGDV 7DPELpQ existen productos comerciales que permiten la construccion de bibliotecas donde los transcripWRV KDQ VLGR DPSOLFDGRV SHUR PDQWHQLHQGR OD proporcin relativa de unos respecto a otros, lo que facilita la comparacin cuantitativa entre muestras. Las ESTs requieren de varias etapas de procesamiento, ensamblado en grupos (contigs) y anotacin para que se pueda extraer informacin biolgica a partir de las mismas. Para esto, resulta muy importante el almacenamiento, la organizacin y la anotacin de estas secuencias utilizando distintas herramientas informticas (revisadas por Nagaraj et al., 2007). Anlisis serial de la expresin de genes (SAGE) El anlisis serial de la expresin de genes 6$*( FRQVLVWH HVHQFLDOPHQWH HQ XQD YHUVLyQ acelerada de la secuenciacin de ESTs. Est basada en el concepto de que una etiqueta FRUWD GH XQDV SRFDV EDVHV HV VXFLHQWH SDUD LGHQWLFDU LQHTXtYRFDPHQWH D XQ WUDQVFULSWR siempre y cuando est ubicada en una posicin GHQLGD GHQWUR GH OD VHFXHQFLD GHO PHQVDMHUR 8QD HWLTXHWD 6$*( FRQVLVWH WtSLFDPHQWH HQ 9-14 bases de secuencia ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una enGRQXFOHDVD HVSHFtFD HQ HO WUDQVFULSWR EODQFR 0~OWLSOHV HWLTXHWDV 6$*( VH OLJDQ MXQWDV HQ XQ vector de clonado de manera que una reaccin de secuenciacin de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiemSR YHU )LJXUD &RPR FDGD HWLTXHWD 6$*( UHSUHVHQWD XQ ~QLFR WUDQVFULSWR GH $51P HV posible obtener una visin general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresin de genes entre muestras experimentales pueden entonces VHU LGHQWLFDGDV FRPSDUDQGR OD DEXQGDQFLD
AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T
Corte con la enzima ancla (EA) Unin a esferas de estreptavidina

Divisin a la mitad y aadido de los adaptadores A y B
CATG GTAC
A A
CATG GTAC
CATG GTAC
B B
CATG GTAC
CATG GTAC
CATG GTAC
Corte con la enzima de etiquetado (ET)
Cebador A
GGATGCATGXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXX
TE AE Etiqueta (tag)
GGATGCATGOOOOOOOOO Cebador B CCTACGTACOOOOOOOOO

TE AE Etiqueta (tag)
Ligacin y amplificacin con los cebadores A y B
Cebador A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC Cebador B CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG

Etiqueta doble (ditag)
Corte con la enzima ancla (ET), purificacin de las ditags, concatenado y clonado
CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC
AE Tag 1 Ditag Tag 2 AE Tag 3 Ditag Tag 4 AE
Figura 4.
UHODWLYD GH HWLTXHWDV 6$*( HVSHFtFDV HQ GLIHrentes bibliotecas. Los genes o las secuencias (67V UHSUHVHQWDGRV SRU ODV HWLTXHWDV 6$*( son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiTXHWD 6$*( HQ OD SRVLFLyQ DGHFXDGD (VWD WpFQLFD VH XWLOL]D SDUD LGHQWLFDU \ FXDQWLFDU WUDQVFULSWRV )XH GHVFULSWD SRU SULPHUD vez por Velculescu y colaboradores en 1995 YHU ELEOLRJUDItD UHFRPHQGDGD %UHYHPHQWH se utiliza una enzima de restriccin tipo II (enzima de etiquetado) que libera fragmentos de HQWUH \ SE D SDUWLU GH ORV $'1F SUHYLDmente digeridos con otra enzima de restriccin (la ms comnmente utilizada es NlaIII). Estos fragmentos son luego ligados entre si para formar un concatmero que es clonado y secuenciado. Los fragmentos detectados en una muestra representan a los transcriptos que los originaron y su frecuencia de deteccin indi-
FD VX DEXQGDQFLD HQ OD PXHVWUD HQ HVWXGLR $ diferencia de los microarreglos, la tcnica de 6$*( SHUPLWH GHWHFWDU WUDQVFULSWRV GH ORV FXDles no se conoce su secuencia previamente a la realizacin del experimento, es decir es una tcnica conocida como abierta (pueden reconocerse genes nuevos). $ SDUWLU GH XQ H[SHULPHQWR GH 6$*( VH SXHden obtener unos 50.000 a 100.000 fragmentos, los que representan de 20.000 a 40.000 genes nicos. Estos fragmentos brindan informacin cualitativa de los transcriptos detectados, mientras que el nmero de copias de cada uno de ellos brinda informacin cuantitativa y UHHMD OD DEXQGDQFLD GH ORV WUDQVFULSWRV HQ OD muestra. Generalmente se observa que alguQRV GH ORV IUDJPHQWRV GHWHFWDGRV SRU 6$*( presentan ms de 100 copias, otros entre 2 y FRSLDV \ OD PD\RUtD GH HOORV VH HQFXHQWUDQ HQ FRSLD ~QLFD (Q OD PD\RUtD GH
los casos se observa que entre el 50-70% de los fragmentos presentan similitud con genes o transcriptos de funcin conocida, mientras que entre 30-50% no son similares a ninguna secuencia conocida. Es esperable que estos porcentajes que son usuales actualmente se PRGLTXHQ HQ HO IXWXUR D PHGLGD TXH DXPHQWH el nmero de genes caracterizados y la cantidad de etiquetas promedio secuenciadas por proyecto. 6H KD REVHUYDGR XQD HVSHFLFLGDG UHODWLYDmente alta de un fragmento de entre 9 y 14 pb para su asociacin con transcriptos conocidos en el caso de genomas relativamente simples. 6LQ HPEDUJR OD HVSHFLFLGDG GLVPLQX\H FXDQdo se estudian genomas ms complejos. Se KDQ KHFKR LQWHQWRV SDUD PHMRUDU OD HVSHFLcidad aumentando el largo de los fragmentos. /RQJ6$*( DXPHQWD HO ODUJR GH ORV IUDJPHQWRV D SE \ 6XSHU6$*( D SE XWLOL]DQGR GLIHrentes enzimas de etiquetado. Esta estrategia PHMRUy OD HVSHFLFLGDG GH XQ GDGR IUDJPHQWR para representar a un transcripto nico (aunque no completamente) y tambin la probabilidad de que dicho fragmento se localice una nica vez en el genoma. Sin embargo, el hecho de trabajar con fragmentos ms largos aumenta los costos de secuenciacin de la tcnica. Por estos motivos, el usuario debe considerar cuidadosamente cul es la longitud de los fragmentos a utilizar para cada caso particular. /RV IUDJPHQWRV REWHQLGRV PHGLDQWH 6$*( no se pueden utilizar directamente en bsTXHGDV GH KRPRORJtD FRQ VHFXHQFLDV FRQWHQLdas en bases de datos debido a que son muy cortos. Para poder asignar un gen a un dado fragmento es necesario contar con una base de datos de referencia construida previamente. Esta base de datos contiene informacin de fragmentos obtenidas in silico a partir de secuencias conocidas de transcriptos o de genes de la especie en estudio. Si un fragmento aislaGR H[SHULPHQWDOPHQWH SUHVHQWD KRPRORJtD FRQ una secuencia presente en la base de datos 6$*( GH UHIHUHQFLD HQWRQFHV VH FRQVLGHUD que el transcripto que lo origin proviene del JHQ TXH KDEtD VLGR DVLJQDGR D HVD VHFXHQFLD /D FRQDELOLGDG GH OD DVLJQDFLyQ GH JHQHV XWLOL]DQGR HVWDV EDVHV GH GDWRV HVWi LQXHQFLDGD por factores biolgicos (por ejemplo, isoformas
del transcripto tales como las resultantes de splicing alternativo o SNPs presentes en la etiqueta pueden resultar en distintos fragmentos que en realidad se correspondan con un mismo gen), experimentales (artefactos introducidos en las secuencias como consecuencia de la tcnica utilizada) y por redundancia de transcriptos. Las bases de datos de referencia se construyen con secuencias que son altamente redundantes. Las mismas son agrupadas en IXQFLyQ GH OD KRPRORJtD GH VHFXHQFLDV OR TXH puede originar que se encuentren transcriptos que corresponden a un mismo gen en grupos distintos (como en el caso de que hubiera splicing alternativo) o que se agrupen transcriptos correspondientes a genes distintos porque preVHQWDQ XQ DOWR JUDGR GH KRPRORJtD GH VHFXHQcia. Es importante mencionar que las bases de datos de referencia pueden ser incompletas, debido a que comnmente se incluyen en las mismas secuencias de alta calidad y anotadas SDUD DXPHQWDU OD HVSHFLFLGDG 6LQ HPEDUJR esta estrategia disminuye en gran medida el nmero de transcriptos representados en la base de datos. Esto origina que muchos de ORV IUDJPHQWRV REWHQLGRV SRU 6$*( VHDQ FODVLFDGRV FRPR GHVFRQRFLGRV LQFOXVR FXDQGR sus transcriptos correspondientes hayan sido SUHYLDPHQWH LGHQWLFDGRV $GHPiV XQ PLVPR IUDJPHQWR SXHGH SUHVHQWDU KRPRORJtD FRQ PiV GH XQ JHQ OR TXH SUHVHQWD XQ GHVDItR DGLFLRQDO SDUD OD FODVLFDFLyQ GH ORV PLVPRV 3RU WRGRV HVWRV PRWLYRV HV QHFHVDULR YHULFDU OD DVLJQDcin de un fragmento mediante otras tcnicas. Entre las ms utilizadas se pueden mencionar HO 5$&( Rapid $PSOLFDWLRQ RI $'1F Ends) y GLGI (Generation of LRQJ $'1F IURP 6$*( tags for Gene IGHQWLFDWLRQ /RV IUDJPHQWRV REWHQLGRV SRU 6$*( SXHGHQ organizarse en tres grupos: de alta, intermedia y baja abundancia. Sin embargo, no se ha analizado exhaustivamente an si el nmero de FRSLDV GH XQ IUDJPHQWR REWHQLGR SRU 6$*( UHHMD H[DFWDPHQWH HQ WRGRV ORV FDVRV OD FDQWLGDG GH $51PHQVDMHUR UHDO FRQWHQLGD HQ OD PXHVWUD 'DGR TXH HO 6$*( LQYROXFUD QXPHURVDV DPSOLFDFLRQHV SRU 3&5 SXHGHQ RULJLQDUVH HUURUHV HVSHFtFRV SDUD XQ GDGR IUDJPHQWR $GHPiV VH KD REVHUYDGR TXH ODV VHFXHQFLDV obtenidas por esta tcnica presentan un ma-
yor contenido de G+C, lo que sugiere una preIHUHQFLD GH DPSOLFDFLyQ TXH FRPSURPHWH OD H[DFWLWXG GH OD FXDQWLFDFLyQ 'RV YHQWDMDV LPSRUWDQWHV GHO 6$*( VREUH la hibridizacin substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuanWLWDWLYRV \ DFXPXODWLYRV 6L VH JHQHUD OD VXciente cantidad de informacin de secuencia VH REWLHQHQ SHUOHV H[DFWRV GH OD H[SUHVLyQ GH los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base de datos pblica de expresin gnica que ha sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de 6$*( FX\R SRGHU FRQWLQXDUi FUHFLHQGR D PHdida que se contribuya con ms informacin. 2WUD FDUDFWHUtVWLFD GH ORV GDWRV GH 6$*( HV que pueden complementar otros de ESTs geQHUDGRV D SDUWLU GH ELEOLRWHFDV GH $'1F QRUPDOL]DGDV R VXEVWUDtGDV /RV (67V EULQGDQ LQIRUPDFLyQ GH VHFXHQFLD PLHQWUDV TXH HO 6$*( provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a SHVDU GH TXH HO 6$*( UHTXLHUH FDSDFLGDG GH secuenciacin de ltima generacin, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST. Hibridizacin de microarreglos Los microarreglos han revolucionado la bioORJtD PROHFXODU (VWD WpFQLFD XWLOL]D FLHQWRV D miles de sondas altamente organizadas sobre XQD VXSHUFLH VyOLGD SDUD LQWHUURJDU GH PDQHUD VLPXOWiQHD D WRGDV ODV PROpFXODV GH $51 GHQLGDV FRPR EODQFRV FRQWHQLGDV HQ XQD muestra biolgica. Las muestras a ser analizaGDV VH PDUFDQ XRUHVFHQWHPHQWH R UDGLDFWLYDmente y se aplican al microarreglo. Los cidos nucleicos marcados hibridan con las molculas GH $'1 FRPSOHPHQWDULDV TXH VH HQFXHQWUDQ inmovilizadas en el microarreglo. La fuerza de OD VHxDO XRUHVFHQWH R UDGLDFWLYD FDSWXUDGD SRU ODV VRQGDV GH $'1 HQ HO DUUHJOR HV GHWHFWDGD \ GLJLWDOL]DGD SDUD VX FXDQWLFDFLyQ Los microarreglos fueron originalmente disexDGRV SDUD LGHQWLFDU GLIHUHQFLDV GH H[SUHVLyQ gnica en dos muestras distintas basadas en las cantidades relativas de blancos unidos a una sonda determinada en el arreglo. La utili-
GDG GH OD WpFQLFD VH YH UHHMDGD HQ VX DPSOLD variedad de aplicaciones que abarca desde el anlisis de expresin gnica hasta estuGLRV GH $'1 JHQyPLFR FRPR Comparative Genomic Hybridization - CGH- y Chromatin ImmunopXULFDWLRQ PLFURDUUD\V FRQRFLGRV como ChIP-chips). Sin embargo, en este caStWXOR VyOR GHVFULELUHPRV ORV PLFURDUUHJORV GH $'1F \ GH ROLJRQXFOHyWLGRV \D TXH VRQ ORV PiV utilizados para el anlisis del transcriptoma. /RV PLFURDUUHJORV GH $'1 SXHGHQ VHU FUHDGRV GH GRV PDQHUDV MDQGR ODV PROpFXODV GH iFLGRV QXFOHLFRV VREUH XQD VXSHUFLH VyOLGD R SRU VtQWHVLV in situ de oligonucletidos. En el SULPHU FDVR ODV PROpFXODV GH $'1 SXHGHQ VHU $'1FV DPSOLFDGRV SRU 3&5 ROLJRQXFOHyWLGRV R IUDJPHQWRV GH $'1 JHQyPLFRV FORQDGRV HQ %$&V %DFWHULDO $UWLFLDO &KURPRVRPHV /D XWLOL]DFLyQ GH FORQHV GH $'1F DPSOLFDdos por PCR como sondas es el mtodo de eleccin cuando se interrogan muestras de organismos cuyo genoma no est secuenciado. Estos microarreglos son generalmente fabricados utilizando robots. Los mismos contienen un cabezal de puntas que es sumergido en VROXFLRQHV GH VRQGDV GH $'1 GLVXHOWDV HQ HO buffer correspondiente y que luego son depoVLWDGDV VREUH XQ VXVWUDWR GH YLGULR PRGLFDGR TXtPLFDPHQWH /DV SXQWDV VH FDUJDQ GH VRQGD SRU FDSLODULGDG \ OD WHQVLyQ VXSHUFLDO HQWUH HO buffer y el vidrio acta para descargar las sondas. Las perturbaciones en la estructura de las descargas son frecuentes y son una fuente sigQLFDWLYD GH YDULDFLyQ GH OD VHxDO 6L ELHQ H[LVten otras alternativas, la utilizacin de robots es la ms popular debido a su disponibilidad, DOWD H[LELOLGDG \ EDMRV FRVWRV /RV VXVWUDWRV inertes sobre los cuales se depositan las sondas son variados. Los portaobjetos de vidrio cubiertos con poli-L-lisina fueron gradualmente reemplazados por sustratos con aminosilano comerciales debido a su mayor consistencia HQ FXDQWR D OD PRUIRORJtD GH ODV GHVFDUJDV 3DUD HVWH WLSR GH TXtPLFDV ODV VRQGDV VRQ inicialmente unidas por atraccin electrosttiFD \ OXHJR MDGDV SRU OLJDFLyQ FUX]DGD FURVV linking) al sustrato mediante radiacin UV o calor. Posteriormente se introdujeron sustratos UHDFWLYRV \ VRQGDV PRGLFDGDV TXH SHUPLWHQ una mayor discriminacin de secuencia debido
Muestra prueba
Muestra de referencia
Transcripcin reversa y marcaje con fluorforos
Clones de DNA
Impresin robtica
Hibridizacin al microarreglo
Excitacin
Laser 1
Laser 2
Emisin
Anlisis computacional
Figura 5. a que hay un nico punto de unin y una mayor retencin de la sonda al sustrato. Tambin se han desarrollado otros sustratos para producir seales ms intensas y que demanden menores cantidades de sondas. Para lograrlo se aument la cantidad de grupos reactivos sobre OD VXSHUFLH (VWR VH SXHGH ORJUDU FXEULHQGR ORV SRUWDREMHWRV FRQ GHQGUtPHURV PH]FODV GH HSR[LVLODQR \ DPLQRVLODQR R FRQ SROtPHURV TXH se auto-absorben. 2ULJLQDOPHQWH ODV VRQGDV GH $'1 HUDQ GLsueltas en soluciones con alto contenido de sales. Luego se introdujo la utilizacin de deWHUJHQWHV SDUD PHMRUDU OD PRUIRORJtD GH ODV descargas. Sin embargo, algunos investigadores informaron que la presencia de detergentes resulta en un mayor arrastre de la sonda y una mayor variabilidad entre una deposicin y la siguiente. La utilizacin de soluciones de descarga conteniendo agentes higroscpicos
permiti mejorar la estructura de los puntos y aumentar las intensidades de seal obtenidas. La desventaja de la utilizacin de aditivos higroscpicos es que producen aumentos en el rea ocupada por la sonda, sin embargo, este efecto se puede reducir disminuyendo la velocidad del robot o aplicando micro-vibraciones de las puntas. Disminuir la temperatura de la cmara del robot donde se generan los microarreglos y utilizar soluciones hidrofbicas contribuye tambin a reducir el tamao promedio de las descargas. La variedad de soluciones de descarga que existe sugiere que no hay un tipo de solucin que resulte ideal para todas las aplicaciones y que la eleccin de la misma depende en gran medida del tipo de microarreglo que se quiere construir. Las puntas de los cabezales que se utilizan son normalmente de acero inoxidable o de titanio y contienen un capilar generado mediante descargas elctricas o la utilizacin de un lser. Se observa una variacin sistemtica en la extensin de la descarga, porque sta es una funcin del formato de la punta, y existe variabilidad durante la fabricacin de las mismas. Se han deVDUUROODGR QXHYDV WHFQRORJtDV SDUD VROXFLRQDU este problema como por ejemplo la generacin de puntas de cermica ms uniformes. La evaporacin durante el proceso de impresin de los microarreglos es la principal causa de variabilidad. La evaporacin reduce el volumen de solvente en las microplacas de 384 pocillos y dentro del reservorio capilar de las puntas, lo que produce un aumento de concenWUDFLyQ GH ODV VRQGDV \ DOWHUD ODV FDUDFWHUtVticas de la solucin de descarga. Como consecuencia de esto, las propiedades del punto VHPEUDGR \ OD GLVWULEXFLyQ GH OD VRQGD GH $'1 GHQWUR GHO iUHD GHO PLVPR VH PRGLFDQ (VWH problema se puede solucionar en parte regulando las condiciones de humedad y temperatura dentro de la cmara del robot donde se realiza la impresin de los microarreglos. Dado que existen numerosas interacciones entre los distintos componentes del proceso, no es sencillo predecir en forma exacta cmo va a resultar la combinacin entre una solucin de siembra y un sustrato determinados. Sin embargo, se estn realizando constantemente estudios para examinar este proceso que, suma-
GRV DO GHVDUUROOR GH QXHYDV WHFQRORJtDV YDQ D permitir reducir los niveles de variabilidad sistemticos resultantes de la fabricacin de los microarreglos. /D PD\RUtD GH ORV ODERUDWRULRV HQVD\DQ OD calidad de sus microarreglos antes de realizar los experimentos de hibridacin con las muestras biolgicas de inters. Generalmente se controla la bondad de la impresin y se detectan errores tales como puntos que no estn bien formados, aquellos de tamaos mayores a los deseados o faltantes. Los puntos pueden VHU YLVXDOL]DGRV XWLOL]DQGR WLQWXUDV XRUHVFHQWHV GH XQLyQ D $'1 7DPELpQ VH SXHGHQ HPplear mtodos ms precisos como son la hibridacin con mezclas de oligonucletidos al D]DU GH PHU PDUFDGRV XRUHVFHQWHPHQWH R con oligonucletidos marcados que hibridizan con secuencias marcadoras cortas que estn SUHVHQWHV HQ WRGDV ODV VRQGDV GH $'1 GHO microarreglo. Para controlar la calidad de la produccin de microarreglos es recomendable desarrollar, documentar y emplear protocolos estndar (Standard Operating ProceduresSOPs). Se pueden encontrar ejemplos de los mismos en la pgina KWWSZZZ\FKLSRUJXN. Esta prctica no solamente aumenta la consistencia entre experimentos dentro de un laboratorio, sino que facilita la transferencia de informacin entre laboratorios. El segundo mtodo posible para la construcFLyQ GH PLFURDUUHJORV HV OD VtQWHVLV GH ROLJRnucletidos in situ, inicialmente desarrollada SRU $II\PHWUL[ $II\PHWUL[ 6DQWD &ODUD ((88 Este mtodo usa una conjuncin de fotolitograItD \ GH TXtPLFD FRPELQDWRULD TXH UHVXOWD HQ OD VtQWHVLV GH FKLSV GH $'1 GH DOWD GHQVLGDG Tambin NimbleGen (NimbleGen, Madison, ((88 ;HRWURQ ;HRWURQ +RXVWRQ ((88 \ )HELW )HELW 0DQQKHLP $OHPDQLD KDQ GHVDUUROODGR RWURV SURFHVRV SDUD ORJUDU OD VtQWHVLV de oligonucletidos in situ. Todos estos procesos se basan en la utilizacin de radiacin UV. En cambio Combimatrix (Combimatrix, 0XNLOWHR ((88 XVD HOHFWURTXtPLFD ORFDOL]DGD (Q HO FDVR GH $II\PHWUL[ VH ORJUD OD VtQWHVLV in situ mediante fotoactivacin y desproteccin de cidos nucleicos. Se utilizan fotomscaras para dirigir la radiacin UV a sectores espeFtFRV GHO PLFURDUUHJOR GH PRGR GH ORJUDU
OD VtQWHVLV HQ IRUPD VHOHFWLYD (Q HO FDVR GH 1LPEOH*HQ ;HRWURQ \ )HELW WRGRV HOORV XVDQ mtodos que no requieren la utilizacin de fotomscaras. En este caso, la radiacin UV es dirigida mediante miles de espejos regulables \ HO $'1 HV VLQWHWL]DGR XWLOL]DQGR QXFOHyWLGRV PRGLFDGRV FRQ IRVIRDPLGLWD (Q HO FDVR GH CombiMatrix, numerosos microelectrodos son utilizados para sintetizar distintas molculas de $'1 HQ SDUDOHOR /D UHDFFLyQ TXtPLFD SDUD OD VtQWHVLV GH ROLJRQXFOHyWLGRV RFXUUH HQ HO iUHD que rodea a cada microelectrodo a la que se VXHOH GHQRPLQDU YDVR YLUWXDO YLUWXDO DVN Una estrategia para estudiar la expresin gnica de todo un genoma es la deteccin de la actividad transcripcional completa de los cromosomas usando arreglos solapados o en tejado (tiling arrays). En este caso, en lugar de XWLOL]DU VRQGDV HVSHFtFDV SDUD FDGD JHQ HO genoma completo incluyendo regiones intergQLFDV HVWi UHSUHVHQWDGR HQ HO DUUHJOR $GHPiV de detectar transcriptos estos chips permiten realizar hibridaciones comparativas de genoPDV SDUD GHWHFWDU GHOHFLRQHV \ SROLPRUVPRV HVWXGLDU ORV SHUOHV GH PHWLODFLyQ \ DQDOL]DU muestras de inmunoprecipitacin de cromatiQD $II\PHWUL[ GHVDUUROOy ORV SULPHURV DUUHJORV de este tipo para Arabidopsis. Los estudios realizados utilizando arreglos de tipo tejado SHUPLWHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH QXPHURVRV VLWLRV WUDQVFULSFLRQDOPHQWH DFWLYRV TXH QR KDEtDQ sido detectados mediante algoritmos predictiYRV \R HQ FROHFFLRQHV GH $'1F 0XFKRV GH estos nuevos transcriptos son expresados a partir de la hebra complementaria y en antisentido con respecto a transcriptos anotados previamente. O sea, mientras que en determinados tejidos y/o condiciones se expresa la hebra sentido, en otros se transcribe la antisentido. Sumado a esto, tambin se demostr que las regiones centromricas presentan actividad transcripcional en ambos sentidos resultando esta observacin sorprendente, ya que hasta KDFH PX\ SRFR WLHPSR DWUiV VH VXSRQtD TXH HQ HVWDV UHJLRQHV QR KDEtD WUDQVFULSFLyQ DFWLYD (VWD PHWRGRORJtD SHUPLWH DVLPLVPR HO HVWXGLR GHO PHWLORPD GH ODV UHJLRQHV GH $'1 regulatorias, del procesamiento alternativo de $51 \ GHO GHVFXEULPLHQWR GH SROLPRUVPRV GH
secuencia. Por lo tanto, los estudios de expresin usando arreglos de tipo tejado permiten obtener una visin mucho ms completa del transcriptoma y de su relacin con el genoma. La necesidad de descripciones precisas de experimentos de microarreglos para permitir el almacenamiento de los datos experimentales y su anlisis posterior ha originado la creacin del Minimum Information $bout a Microarray E[SHULPHQW 0,$0( 6WDQGDUG 0,$0( 6WDQGDUG $O LJXDO TXH FRQ ODV VHFXHQFLDV GH $'1 R FRQ ODV HVWUXFWXUDV GH SURWHtQDV HV cada vez ms comn el requerimiento de enviar los resultados a bases de datos de este tipo antes de su publicacin. Estos estndares son necesarios para permitir que la informacin est pblicamente disponible en un formato nico, y tambin para uniformar la nomenclatura empleada lo que hace posible la integracin y comparacin de resultados obtenidos de disWLQWDV IXHQWHV 0,$0( DGPLQLVWUD GHVFULSFLRnes tcnicas detalladas (plataforma utilizada, mtodos de marcacin e hibridacin, medicin de datos y diseo del arreglo), pero no provee LQIRUPDFLyQ UHOHYDQWH HVSHFtFD GHO RUJDQLVPR en estudio que es necesaria para comprender el experimento planteado. Por este motivo, se GLVHxy OD EDVH 0,$0(3ODQW OD TXH LQFOX\H GHtalles biolgicos para describir experimentos de microarreglos realizados en plantas. El anlisis de los datos originados en un microarreglo resulta mucho ms laborioso que su generacin. En el mismo se consideran la hiptesis de trabajo y los objetivos experimentales SDUD ORJUDU LGHQWLFDU D ORV JHQHV FDQGLGDWRV en las condiciones de estudio. El anlisis puede dividirse en dos fases: 1) el procesamiento de GDWRV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV GH LQWHUpV y la interpretacin biolgica de los resultados. El procesamiento de los datos incluye la deWHUPLQDFLyQ GHO QLYHO GH UXLGR OD FXDQWLFDFLyQ GH ODV VHxDOHV XRUHVFHQWHV HO H[DPHQ GH OD calidad de los datos, la eliminacin de los errores tcnicos y la normalizacin de los datos. La LGHQWLFDFLyQ GH ORV JHQHV FDQGLGDWRV LQFOX\H la reduccin del volumen de la informacin a un nivel manejable y ms fcil de visualizar, el reconocimiento de patrones de expresin esSHFtFRV \ OD LQWHUSUHWDFLyQ GHO VLJQLFDGR ELRlgico de los mismos.
Conclusiones /RV PpWRGRV GHVFULSWRV HQ HVWH FDStWXOR VRQ WHFQRORJtDV HFDFHV TXH H[SDQGHQ ORV HVWXdios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel del transcriptoma completo. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia SDUD VLWXDFLRQHV HVSHFtFDV SXHGH VHU FUHDU combinaciones de varios de ellos. El continuo UHQDPLHQWR GH ODV WpFQLFDV GH WUDQVFULSWyPLFD y de la bioinformtica relacionada proporcionar a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresin de la informacin hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre HO FRQWURO JHQpWLFR GH ORV SURFHVRV VLROyJLFRV Cada plataforma empleada actualmente para estudiar el transcriptoma tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, los microarreglos son una tcnica de alto rendimiento pero slo se pueden aplicar a transcriptos de secuencia FRQRFLGD /RV PpWRGRV GH $'1F $)/3 \ '' son abiertos, es decir permiten detectar genes noveles y son especialmente tiles cuando se trabaja fuera de los modelos, pero son cualitativos o semicuantitativos y requieren de un complemento de PCR en tiempo real para YDOLGDU \ FXDQWLFDU ODV GLIHUHQFLDV GH H[SUH-
sin. Las colecciones de ESTs presentan alta HVSHFLFLGDG SDUD ORV WUDQVFULSWRV HQ HVWXGLR pero baja sensibilidad para aquellos de escaVD DEXQGDQFLD /D WpFQLFD GH 6$*( GLVPLQX\H el largo secuenciado por transcripto lo que aumenta la velocidad de relevamiento, pero esta simplicidad resulta en una alta sensibilidad SHUR D FRVWD GH XQD PHQRU HVSHFLFLGDG 8QD FRPSDUDFLyQ GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH FDGD tcnica se presenta en la Tabla 1. La combinacin de la informacin generada por la transcriptmica (nivel y localizacin espacio/temporal de la expresin gnica) y la de los proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de H[SUHVLyQ \ KRPRORJtD HVWUXFWXUDO TXH HQ PXchos casos facilitan la inferencia de la posible IXQFLyQ GH ORV JHQHV LGHQWLFDGRV 3RU VXSXHVto esto constituye una instancia inicial en la GHQLFLyQ GH OD IXQFLyQ GH FDGD JHQ 3DUD GHterminar su rol preciso deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o DXPHQWDU VX H[SUHVLyQ SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD \ D PRGLFDU HVWUXFWXUDOPHQWH OD PROpFXOD GH manera de alterar la actividad de los diferentes GRPLQLRV GH OD SURWHtQD TXH FRGLFD
Tabla 1: Comparacin de los principales mtodos de relevamiento del transcriptoma.

Caractersticas
Detecta transcriptos conocidos Detecta transcriptos desconocidos Detecta transcriptos con splicing alternativo Detecta transcriptos antisentido Cuantificacin Sensibilidad Especificidad Reproducibilidad
SAGE/ESTs
S S S S Absoluta Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes Buena para transcriptos abundantes Ms alto que el de microarreglos
Microarreglos
S No S o no S o no Relativa Moderada Alta Buena para datos obtenidos con la misma plataforma Buena para transcriptos abundantes 5-10 veces menor que el de SAGE
DD/cDNAAFLP
S S S S Relativa Alta Moderada Requiere realizacin de duplicados o triplicados Buena para transcriptos abundantes Muy bajo
Hibridizacin sustractiva
S S No S Relativa Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes Buena para transcriptos abundantes Muy bajo
Comparable entre si
Costo
Adaptado de Wang 2006 understanding SAGE data, Trends in Genetics.
Para maximizar el potencial de la transcriptmica es necesario un cambio de paradigma respecto a la interpretacin de los resultados obtenidos en este tipo de experimentos. Este cambio de paradigma implica comprender que los datos de expresin no estn libres de errores y aceptar que la variabilidad biolgica espacio-temporal es una parte inherente y cuanWLFDEOH GH HVWH WLSR GH H[SHULPHQWRV $ SHVDU de que los continuos cambios en la expresin de genes en tiempo y espacio colocan al investigador en un escenario de arenas movedizas, es mucha y muy relevante la informacin que puede obtenerse de este tipo de estudios. Esta transicin en la interpretacin de los resultados ser ms fcil si se delinea claramente la diferencia entre proponer una funcin biolgica a partir de simples datos de expresin y postular una hiptesis que debe luego validarse en base a datos experimentales concretos. Biblografa Recomendada
$GDPV 0 ' - 0 .HOOH\ - ' *RFD\QH 0 'XEQLFN 0 + 3RO\PHURSRXORV + ;LDR & 5 0HUULO $ :X % 2OGH 5 ) 0RUHQR &RPSOHPHQWDU\ '1$ VHTXHQFLQJ H[SUHVVHG VHTXHQFH WDJV DQG KXPDQ JHQRPH SURMHFW 6FLHQFH :DVK DC) 252:16511666. $II\PHWUL[ KWWSZZZDII\PHWUL[FRP Combimatrix: KWWSZZZFRPELPDWUL[FRP 'DYLV 0 0 ' , &RKHQ ( $ 1LHOVHQ 0 6WHLQPHW] : ( 3DXO / +RRG &HOOW\SHVSHFLF $'1F SUREHV DQG WKH PXULQH UHJLRQ WKH ORFDOL]DWLRQ DQG RULHQWDWLRQ RI $G 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$ 'LDWFKHQNR / <) & /DX $ 3 &DPSEHOO $ Chenchik, F. Moqa-dam, B. Huang, S. Lukyanov, . 3XN\DQRY 1 *XUVND\D ( ' 6YHUGORY 3 ' Siebert. 1996. Suppression subtractive hybridi]DWLRQ $ PHWKRG IRU JHQHUDWLQJ GLIIHUHQWLDOO\ UHJXODWHG RU WLVVXHVSHFLF $'1F SUREHV DQG OLEUDULHV 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$ Febit: KWWSZZZIHELWFRP Gregory B.D., Yazaki J. and Ecker J.R. 2008. UtilizLQJ WLOLQJ PLFURDUUD\V IRU ZKROHJHQRPH DQDO\VLV in plants. The Plant Journal, 53, 636-644. *XUVND\D 1 * / 'LDWFKHQNR $ &KHQFKLN 3 ' 6LHEHUW * / .KDVSHNRY . $ /XN\DQRY / / 9DJQHU 2 ' (UPRODHYD 6 $ /XN\DQRY ( ' 6YHUGORY (TXDOL]LQJ $'1F subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell
transcripts induced by phytohem-aglutinin and SKRUERO P\ULVWDWH DFHWDWH $QDO %LRFKHP 240:9097. /LDQJ 3 $ % 3DUGHH 'LIIHUHQWLDO GLVSOD\ RI HXNDU\RWLF PHVVHQJHU $51 E\ PHDQV RI WKH SRO\PHUDVH FKDLQ UHDFWLRQ 6FLHQFH :DVK '& 257:967971. 0H\HUV %& *DOEUDLWK ': 1HOVRQ 7 DQG $JUDZDO 9 0HWKRGV IRU WUDQVFULSWLRQDO SUROLQJ in plants. Be fruitful and replicate. Plant Physiol., 135, 637-652. 0,$0( 6WDQGDUG KWWSZZZPJHGRUJ:RUkJURXSV0,$0(PLDPHKWPO Moody D. E. 2001. Genomics techniques: an overYLHZ RI PHWKRGV IRU WKH VWXG\ RI JHQH H[SUHVVLRQ - $QLP 6FL ( 6XSSO (( Nagaraj S.H., Gasser R.B. and Ranganathan S. $ KLWFKKLNHUV JXLGH WR H[SUHVVHG VHquence tag (EST) analysis. Brief Bioinform., 8, 6-21. NimbleGen: KWWSZZZQLPEOHJHQFRP 2NXER . 1 +RUL 5 0DWRED 7 1L\DPD $ )XNXVKLPD < .RMLPD . 0DWVXEDUD /DUJH VFDOH $'1F VHTXHQFLQJ IRU DQDO\VLV RI TXDQWLWDtive and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173179. 5HQVLQN :$ DQG %XHOO &5 0LFURDUUD\ H[SUHVVLRQ SUROLQJ UHVRXUFHV IRU SODQW JHQRPLFV Trends in Plant Science, 10, 603-609. 6DUJHQW 7 ' , % 'DZLG 'LIIHUHQWLDO *HQH expression in the gastrula of Xenopus laevis. 6FLHQFH :DVK '& 6FKHQD 0 ' 6KDORQ 5 : 'DYLV 3 2 %URZQ 1995. Quantitative monitoring of gene expresVLRQ SDWWHUQV ZLWK D FRPSOHPHQWDU\ '1$ PLFURDUUD\ 6FLHQFH :DVK '& 9HOFXOHVFX 9 ( / =KDQJ % 9RJHOVWHLQ . : .LQ]OHU 6HULDO DQDO\VLV RI JHQH H[SUHVVLRQ 6FLHQFH :DVK '& Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays status and prospects. Trends in Biotechnology, 22, 630-637. :HOVK - . &KDGD 6 6 'DODO 5 &KHQJ ' 5DOSK 0 0F&OHOODQG $UELWUDULO\ SULPHG 3&5 QJHUSULQWLQJ RI $51 1XFO $FLGV 5HV 20:49654970. ;HRWURQ KWWSZZZ[HRWURQFRP Zimmermann P., Schildknecht B., Craigon D., *DUFLD+HUQDQGH] 0 *UXLVVHP : 0D\ 6 0XNKHUMHH * 3DUNLQVRQ + 5KHH 6 :DJQHU 8 DQG +HQQLJ / 0,$0(3ODQW DGGLQJ value to plant microarray experiments. Plant methods, 2:1.
I CAPTULO 9 Protemica
3DXOD &DVDWL \ 0DUtD ) 'ULQFRYLFK 1. Introduccin La protemica, entendida como el estudio del patrn proteico de una clula u rgano, se encuentra ya en su segunda dcada como campo de estudio. Durante la primera dcada, la mayor parte de los estudios se realizaron principalmente mediante el uso de geles en dos dimensiones seguidos de tcnicas de tincin convencionales. Si bien estos mtodos continan siendo utilizados de manera importante, durante esta segunda dcada otros mtodos ms sensibles y que adems presentan mayor reproducibilidad han comenzado a ser utilizaGRV (VWDV WpFQLFDV KDQ VLGR FODVLFDGDV FRPR protemica cualitativa. Muchos de estos mtodos estn siendo aplicados en experimentos GH ELRORJtD YHJHWDO 3RU HMHPSOR la electroforesis bidimensional DIGE (del ingls, differential gel electrophoresis) y el marcado isotpico de SURWHtQDV \ SpSWLGRV VRQ WpFQLFDV XWLOL]DGDV HQ la actualidad para el estudio de diversos proWHRPDV (Q HO SUHVHQWH FDStWXOR VH GHVFULEHQ primero los mtodos utilizados en protemica en la actualidad, seguido de una descripcin de las aplicaciones de estas tcnicas en la bioORJtD GH SODQWDV 2. Electroforesis en dos dimensiones El procedimiento ms utilizado para los estudios de protemica es la separacin electrofortica por isoelectroenfoque (IEF) de las SURWHtQDV VHJXLGR GH XQD VHJXQGD VHSDUDFLyQ en gel de poliacrilamida en presencia de SDS 6'63$*( (VWD WpFQLFD VH GHQRPLQD FRmnmente electroforesis bidimensional (2D), GRQGH ODV SURWHtQDV VH VHSDUDQ HQ EDVH D VX carga y masa molecular. Los avances recientes en la resolucin del IEF gracias al uso de geles comerciales en tiras han aumentado la reproducibilidad y la resolucin de los geles 2D en protemica. En particular, la disponibilidad de tiras comerciales de diferentes tamaos y rangos de pH permiten un anlisis detallado del proteoma.
Luego de la separacin electrofortica, se lleva a cabo la tincin de los geles y el anlisis de las imgenes para visualizar y cuanWLFDU FDGD SURWHtQD /RV PpWRGRV GH WLQFLyQ utilizados van desde los ms convencionales, como la tincin con azul de Coomassie o nitrato de plata, hasta mtodos ms sensibles FRPR OD WLQFLyQ XRUHVFHQWH. Por otro lado han sido desarrollados recientemente varios comSXHVWRV XRUHVFHQWHV TXH SHUPLWHQ P~OWLSOHV tinciones de un mismo gel, tcnica que permite la tincin y visualizacin de diferentes grupos GH SURWHtQDV R GLIHUHQWHV VXESURWHRPDV SRU ejemplo, el fosfoproteoma o el glicoproteoma) de manera secuencial en un mismo gel. La separacin en geles bidimensionales puede dar lugar a un mapa proteico complejo, y algunas veces la reproducibilidad de estos geles puede ser problemtica debido a la naturaleza diversa GH ODV GLVWLQWDV SURWHtQDV VXPDGR D OD WDUHD GH LGHQWLFDU HO PLVPR SXQWR SURWHLFR HQ GLVWLQWRV geles. Esto se debe a que cuando se realizan estudios comparativos es necesario analizar mltiples geles que pueden contener 1000 SXQWRV SURWHLFRV FDGD XQR $Vt D SHVDU GHO XVR de programas avanzados para el anlisis de JHOHV ' VH UHTXLHUH XQD YDOLGDFLyQ PDQXDO nal. Existen distintos paquetes de computacin para el anlisis de las imgenes que permiten asistir con la substraccin del ruido de base, la deteccin de los puntos proteicos, el ajuste GH ODV LPiJHQHV OD GHWHFFLyQ H LGHQWLFDFLyQ GH SXQWRV HQWUH JHOHV \ OD FXDQWLFDFLyQ PHGLDQWH XQ DQiOLVLV HVWDGtVWLFR /RV JHOHV ELGLmensionales son una herramienta para la resolucin y visualizacin de isoformas proteicas, SURGXFWRV GH GHJUDGDFLyQ \ PRGLFDFLRQHV postraduccionales; adems de permitir el clFXOR HPStULFR GH OD PDVD PROHFXODU SXQWR LVRelctrico y niveles de expresin. Las limitaciones de la tcnica son la no automatizacin, la GLFXOWDG SDUD UHVROYHU SURWHtQDV GH PHPEUDQD \ SURWHtQDV PX\ EiVLFDV R iFLGDV Una tcnica que aumenta la sensibilidad y disminuye la variabilidad que existe entre distintos geles es la llamada electroforesis diferencial en gel o DIGE. En esta tcnica, las muestras proteicas se preincuban con compuestos XRUHVFHQWHV DFWLYRV TXH VH XQHQ D UHVLGXRV de Lys o Cys que pueden ser utilizados para
FXDQWLFDU OD DEXQGDQFLD GH FDGD SURWHtQD HQ una poblacin. La mayor ventaja de esta tcnica es la posibilidad de correr dos muestras distintas en un mismo gel, siempre y cuando las muestras se hayan marcado con marcadoUHV XRUHVFHQWHV FRQ GLVWLQWRV HVSHFWURV GH emisin. Esto disminuye los problemas que se JHQHUDQ GXUDQWH OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV SXQWRV \ OD FXDQWLFDFLyQ (Q WHRUtD OD FDQWLGDG Pi[Lma de muestras que se pueden separar en un mismo gel se limita al nmero de compuestos XRUHVFHQWHV TXH VH HQFXHQWUHQ GLVSRQLEOHV y que no muestren espectros de emisin que se superpongan, aunque en general se utilizan slo tres: dos para el marcado de las muestras a comparar, y el tercero se utiliza para marcar un control interno. La imagen de los geles es JHQHUDGD XWLOL]DQGR XQ HVFiQHU GH XRUHVFHQcia capaz de adquirir las imgenes provenienWHV GH FDGD XQR GH ORV XRUHVFHQWHV XWLOL]DGRV Esta tcnica es muy sensible, ya que permite resolver alrededor de 1000 puntos proteicos FRQ VROR J GH SURWHtQDV VHPEUDGDV SRU OR TXH HO OtPLWH GH GHWHFFLyQ HV GHO RUGHQ GH SLFR D IHPWRPRODU GH SURWHtQD HQ FDGD SXQWR Una ventaja de realizar estudios de protemica mediante separacin en geles bidimensionales es que estos experimentos pueden ser realizados utilizando muestras de cualquier especie vegetal, sin necesidad de que el genoma de la especie en estudio se encuentre VHFXHQFLDGD $GHPiV HVWD WpFQLFD HV LGHDO para experimentos en donde se observen pocos cambios en los patrones proteicos. Una alternativa a las separaciones 2D por ,()6'63$*( HV OD WpFQLFD GH VHSDUDFLyQ HQ electroforesis nativa en presencia de azul de &RRPDVVLH %13$*( GHO LQJOpV EOXHQDWLve). Esta tcnica es utilizada para la separaFLyQ GH SURWHtQDV KLGURIyELFDV \ SURWHtQDV HQ su estado nativo, ya que stas no se separan FRUUHFWDPHQWH HQ ORV JHOHV ,()6'63$*( Esta tcnica se basa en la integracin de una FDUJD QHWD QHJDWLYD HQ ODV SURWHtQDV \ FRPSOHjos proteicos por adicin del colorante azul de Coomassie, y permite la separacin en condiciones nativas en la primera dimensin. En la VHJXQGD GLPHQVLyQ VH UHDOL]D XQ 6'63$*( donde los complejos proteicos que migraron juntos en la primera dimensin se separan en
VXV VXEXQLGDGHV TXH VH REVHUYDQ HQ ODV YHUticales de puntos proteicos en los geles 2D. Esta tcnica complementa a los geles 2D IEF/ 6'63$*( &XDQWLFDFLyQ SRU HVSHFWURPHWUtD GH masa (MS) /XHJR GH OD VHOHFFLyQ GH ODV SURWHtQDV de inters en un gel 2D, stas pueden ser LGHQWLFDGDV SRU HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV Bsicamente, luego de la digestin de las proWHtQDV FRUWDGDV GHO JHO FRQ XQD SURWHDVD WtSLcamente tripsina), la mezcla compleja de pptidos es analizada. Existen distintos tipos de HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV TXH XWLOL]DQ GLVWLQWRV mtodos para la ionizacin de las muestras. 3RU XQ ODGR OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVD SRU desorcin por ionizacin mediante lser asistida por una matriz (del ingls matrix-assisted ODVHU GHVRUSWLRQ LRQLVDWLRQ 0$/',WLHPSR GH YXHOR WLPHRILJKW 72) VH XWLOL]D SULQcipalmente para realizar huellas dactilares de SpSWLGRV \ SURWHtQDV 3RU RWUR ODGR OD HVSHFWURPHWUtD HQ WDQGHP SRU HOHFWURSXOYHUL]DGR (ESI), usualmente se acopla a una separacin SUHYLD HQ XQ VLVWHPD GH FURPDWRJUDItD GH DOWD presin (HPLC) y se utiliza para la elucidacin GH OD VHFXHQFLD H LGHQWLFDFLyQ GH OD SURWHtQD correspondiente (Figura 1). En estos momentos, existe una actualizacin constante en los distintos tipos de espectrmetros de masa que se encuentran disponibles en el mercado, y la sensibilidad, selectividad y precisin de los equipos son cada vez mayores. Los principios de esta tcnica pueden ser resumidos en cuatro funciones del equipo: 1-Ionizacin: la molcula de inters sufre un cambio en la carga neta, formndose un anin o un protn. Dependiendo del mtodo de ionizacin utilizado, es posible que se generen iones fragmentados. En el caso de usos en protemica, los mtodos de ionizacin utili]DGRV VRQ 0$/', \ HOHFWURVSUD\PLFURVSUD\ nanospray. 2-Separacin: las especies inicas son separadas de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z), 3-Medida de la masa: las masas son asignadas segn las medidas de algn parmetro ItVLFR
)LJXUD 7pFQLFDV GH 06 SDUD LGHQWLFDFLyQ GH SURWHtQDV D SDUWLU GH JHOHV ELGLPHQVLRQDOHV Los SXQWRV GH LQWHUpV GHO JHO ' VRQ FRUWDGRV \ FRORFDGRV HQ WXERV /D SURWHtQD GHO EORTXH GH DFULODPLGD HV digerida con una proteasa, y los productos obtenidos son analizados por distintas tcnicas para su identiFDFLyQ $GDSWDGR GH 1HVDW\\ DQG 6XWHU
4-Medida de la abundancia: la medida de la abundancia de cada ion se realiza en base a la altura o rea del pico en el espectro, permiWLHQGR XQD VHPLFXDQWLFDFLyQ R FXDQWLFDFLyQ de cada ion. 3.1. MALDI-TOF y huella dactilar de pptidos: En esta tcnica, los pptidos generados luego de la digestin con tripsina son mezclados a una matriz en solucin, que est formada por una solucin concentrada o saturada de un compuesto de bajo peso molecular cido y que absorbe el UV. En el caso de pptidos, el compuesto ms utilizado es el cido D-cianoKLGUR[LFLQiPLFR $SUR[LPDGDPHQWH PL de la mezcla muestra/matriz es colocada en una SODFD SDUD 0$/', \ VH SHUPLWH FRFULVWDOL]DU HQ un nico punto. Como la matriz se coloca en exceso con respecto a la muestra y absorbe UV, cuando se irradia con un lser de UV esta HQHUJtD HV DEVRUELGD SRU OD PDWUL] \ SDVDGD D la muestra de manera que se ioniza pero no se fragmenta. Estos iones son luego acelerados por el espectrmetro de masa: los iones mas livianos viajan ms rpido que los pesados, por lo que el tiempo en el que llegan al detector puede ser utilizado para determinar la relacin masa/carga de cada ion, obtenindose un espectro que contiene todos los iones acelerados, y se obtiene una lista de las masas de los picos que presentan mayor intensidad. La lista de picos es enviado a una base de datos que compara las masas de los picos de los especWURV FRQ ORV WHyULFRV GH ODV SURWHtQDV GLJHULGDV y produce una lista de las posibles identidades utilizando un sistema de puntaje. 3.2. Espectrometra de masas en tandem por electropulverizado. Este proceso analiza los pptidos generados luego de la digestin con tripsina. En este caso, el espectrmetro de masas esta acoplado a un equipo de HPLC. Durante la ionizacin por electropulverizado, los pptidos se separan previamente por HPLC (usualmente son utilizadas columnas de C18) y luego entran a una fuente de ionizacin. Un voltaje alto es aplicado a una aguja por donde pasan las muestras que llegan como gotas, produciendo una carga en OD VXSHUFLH (Q OD JRWD VH JHQHUD XQD UHSXO-
sin electrosttica que hace que se liberen iones gaseosos que son acelerados en el espectrmetro de masas. Cuando los pptidos entran al espectrmetro de masa, algunos iones pepWtGLFRV VRQ VHOHFFLRQDGRV \ IUDJPHQWDGRV SRU colisin con un gas para producir un nmero de fragmentos inicos. Las relaciones m/z de estos fragmentos son registrados para dar el espectro de fragmentacin de ese pptido. Un pptido se puede considerar como una cadeQD DPLQRDFtGLFD TXH VH SXHGH IUDJPHQWDU HQ cualquier punto; sin embargo la fragmentacin ocurre preferencialmente entre la unin de N y C entre aminocidos, por lo que la secuencia de un pptido puede determinarse por el patrn de picos que se obtienen del espectro de fragmentacin. El espectrmetro de masa realiza el registro de todos los picos de fragmentacin, y luego de completada la separacin y especWURPHWUtD GH PDVD GH WRGRV ORV SpSWLGRV ORV espectros son enviados a una base de datos SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH OD SURWHtQD HQ HVWXGLR por comparacin al patrn de ionizacin terico GH ORV SpSWLGRV GH OD SURWHtQD %DVHV GH GDWRV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH protenas: Existen numerosas bases de datos para la LGHQWLFDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV OXHJR GH OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV E~VTXHda de semejanzas, patrones de fragmentacin \ SHUOHV SUHGLFFLyQ GH VLWLRV GH PRGLFDFLyQ postraduccional, etc. Entre ellos se encuenWUDQ 0$6&27 3URWHLQ3URVSHFWRU ([3$6\ Proteomics. Muchos de estos sitios son accesibles luego de una suscripcin, mientras que RWURV HVWiQ GLVSRQLEOHV HQ OD ZHE D WRGRV ORV usuarios interesados. La tabla 1 muestra las pginas correspondientes de algunos de los sitios. 4. Alternativas a los geles bidimensionales $OJXQDV DOWHUQDWLYDV DO XVR GH JHOHV HQ GRV dimensiones son los mtodos basados en esSHFWURPHWUtD GH PDVD SDUD FRPSDUDU OD DEXQdancia de pptidos. Luego de la digestin de ODV SURWHtQDV VLQ TXH VH UHDOLFH QLQJXQD VHparacin previa), la mezcla compleja de ppWLGRV VH VHSDUD SRU FURPDWRJUDItD SUHYLR DO DQiOLVLV SRU 06 /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV
Tabla 1.
Pginas disponibles correspondientes a bases de datos para identificacin de protenas para el anlisis posterior a la espectrometra de masas ExPASy Proteomics MASCOT Prosight PTM Protein Prospector GPM PROWL
http://us.expasy.org/tools http://www.matrixscience.com http://prosightptm.scs.uiuc.edu http://prospector.ucsf.edu http://thegpm.org http://prowl.rockefeller.edu
HO TXH OD PDUFD HV LQWURGXFLGD D OD SURWHtQD R D ORV SpSWLGRV \ FyPR VRQ H[WUDtGRV ORV GDWRV GH FXDQWLFDFLyQ $ FRQWLQXDFLyQ VH GHVFULEHQ brevemente los distintos tipos de marcado. 4.1. Marcado isotpico in vivo. Este es un mtodo comnmente utilizado en protemica comparativa. Para estos experimentos, una de las muestras se crece en una atmsfera de nitrgeno natural, mientras que la muestra a comparar se crece en presencia del istopo pesado. Esto puede hacerse por la introduccin de algn aminocido marcado en cultivos celulares o utilizando 15N como nica IXHQWH GH QLWUyJHQR WtSLFDPHQWH HQ OD IRUPD GH .15NO3. Como resultado, las masas de los pptidos de las poblaciones a comparar sern diferentes, permitiendo una comparacin directa de las intensidades de los iones de las dos mezclas. En principio, las dos muestras a comparar pueden ser mezcladas al comienzo del experimento, por lo que se eliminan virtualmente todas las potenciales variaciones tcnicas. Debido a que la diferencia isotpica de cada pptido es la misma entre los espectros de las dos muestras, el estudio del proteoma completo puede ser problemtico debido a la complejidad de los espectros, por lo que esta tcnica es recomendable para sub-proteomas, como por ejemplo el fosfoproteoma. 4.2. Marcado isotpico in vitro. Una alternativa es introducir la marca en los SpSWLGRV GH PDQHUD TXtPLFD GXUDQWH R OXHJR GH OD GLJHVWLyQ GH ODV SURWHtQDV 8QD YHQWDMD GH esta tcnica es que cualquier muestra proteica puede ser marcada, eliminando la limitacin que existe al querer introducir la marca en una clula viva. La mayor desventaja es el cuidado que hay que tener para no introducir variaciones tcnicas durante la obtencin de la muestra proteica (en especial si existe algn paso de fraccin subcelular). 4.2.1. Marcado con 18O durante la digestin con tripsina 'XUDQWH OD KLGUyOLVLV GH ODV SURWHtQDV FRQ WULSVLQD HO R[tJHQR GHO DJXD VH LQFRUSRUD DO & WHUPLQDO GHO SpSWLGR WUtSWLFR 3RU OR WDQWR VL la digestin de una muestra se realiza en presencia de H218O mientras que la de la muestra
puede ser corrida de manera independiente o bien acoplada a la separacin por HPLC. Los pptidos producidos por la digestin de las proWHtQDV WRWDOHV VRQ LRQL]DGRV SDUD DGTXLULU HO HVpectro de MS de todos los iones presentes en OD PH]FOD $OJXQRV SpSWLGRV VRQ VHOHFFLRQDGRV y son fragmentados individualmente para obtener un segundo espectro MS (MS/MS) que permite obtener la secuencia de aminocidos del pptido. La seal o integracin de los picos de los iones puede ser utilizada como tcnica GH FXDQWLFDFLyQ \D TXH HQ WHRUtD OD LQWHQVLdad de los picos es proporcional a la cantidad GH SURWHtQD GH OD FXDO SURYLHQH HO LRQ SHSWtGLco. Sin embargo, la variabilidad tcnica, tanto D QLYHO GH OD FURPDWRJUDItD OtTXLGD FRPR D QLYHO de los pasos de ionizacin, hacen que la comSDUDFLyQ GH ODV LQWHQVLGDGHV QR VHD FRQDEOH Por ello, se han desarrollado diferentes tcniFDV GH PDUFDGR GH ODV SURWHtQDV TXH SHUPLten una directa comparacin de los picos en un mismo espectro MS o MS/MS. La base de todas estas tcnicas es la misma: se introducen marcas inertes, estables e isotpicas a los pptidos de manera que los patrones de ioni]DFLyQ \ ODV SURSLHGDGHV FURPDWRJUiFDV GH los pptidos marcados sean similares a los de las muestras de origen, pero pueden ser diferenciados luego del anlisis por un leve corrimiento en el espectro de MS. De esta manera, las dos muestras a comparar pueden ser corridas de manera simultnea y analizadas a partir de un mismo experimento. Por ello, la separacin de los pptidos seguida de la cuanWLFDFLRQ GH ORV LRQHV UHHMD OD DEXQGDQFLD UHODWLYD GH FDGD SURWHtQD LQWDFWD GH OD FXDO GHULYD HO SpSWLGR FXDQWLFDGR /RV GLVWLQWRV PpWRGRV de marcado se diferencian en el momento en
a comparar se realiza en un medio con H216O, HQ WHRUtD VH JHQHUDQ SpSWLGRV TXH GLHUHQ en cuatro unidades de masa en el espectro. Experimentalmente, sin embargo, la incorporacin es siempre incompleta, generndose espectros que se solapan. Por esta razn este mtodo no es tan elegido como otros, aunque presenta bajo costo comparado a los que se describen a continuacin. 0DUFDGR LVRWySLFR FRQ VRQGDV SRU DQLGDG ,&$7 Otro mtodo de marcado se basa en la moGLFDFLyQ FRYDOHQWH GH &\V FRQ FRPSXHVWRV TXtPLFRV ELRWLQLODGRV TXH VyOR GLHUHQ HQ OD inclusin de istopos pesados y livianos luego de la digestin. El uso de biotina permite el rpido enriquecimiento de los pptidos marcaGRV \ GHELGR D TXH OD PD\RUtD GH ODV SURWHtQDV contienen pocas Cys, slo algunos pptidos de FDGD SURWHtQD VRQ DQDOL]DGRV 3RU HOOR HVWH mtodo permite el anlisis de muestras complejas. Sin embargo, dado que una de cada VLHWH SURWHtQDV QR FRQWLHQH UHVLGXRV GH &\V existen limitaciones en el anlisis. 0DUFDV LVREiULFDV SDUD FXDQWLFDFLyQ UHODWLYD \ DEVROXWD L75$4 8Q PpWRGR DOWHUQDWLYR LQYROXFUD OD PRGLFDcin de aminas primarias con marcas isobriFDV (VWD WpFQLFD HV VLPLODU D ,&$7 HQ FXDQWR D que cada muestra es marcada con una marca GLIHUHQWH SHUR FRQ ORV UHDFWLYRV L75$4 WRGRV ORV SpSWLGRV WUtSWLFRV VRQ PDUFDGRV $GHPiV esta tcnica permite el anlisis de hasta 8 muestras de manera simultnea si se utilizan GLVWLQWRV UHDFWLYRV L75$4 SDUD PDUFDU ODV GLVtintas muestras. &XDQWLFDFLyQ OLEUH GH PDUFD $ SHVDU GH ORV SUREOHPDV GH YDULDELOLGDG GHVFULSWRV DQWHULRUPHQWH HQ OD FXDQWLFDFLyQ GLUHFta de la intensidad de los picos de MS luego de OD FURPDWRJUDItD OtTXLGD GHELGR D OD DSDULFLyQ de espectrmetros de masa de ltima generacin y al aumento de la reproducibilidad de las VHSDUDFLRQHV HQ ODV FURPDWRJUDItDV JDVHRVDV esta tcnica ha comenzado a ser utilizada nuevamente. Para ello, varios programas de computacin han sido desarrollados para comparar
los pptidos de mltiples espectros de LC-MS/ 06 8QD YH] LGHQWLFDGR HO PLVPR SpSWLGR HQ distintos espectros, stos se comparan y se genera una relacin de expresin luego de un DQiOLVLV HVWDGtVWLFR &XDQWLFDFLyQ DEVROXWD XWLOL]DQGR SpSWLdos AQUA Los mtodos descriptos anteriormente son capaces de determinar cantidades relativas GH SURWHtQDV R SpSWLGRV 3DUD FRQYHUWLU GDWRV relativos a absolutos se requiere la inclusin de estndares internos de concentraciones conocidas, que deben estar marcados para GLVWLQJXLUVH GH OD SURWHtQD QDWLYD 3DUD HOOR VH utiliza la tcnica de marcado isotpico estable, en la que pptidos sintticos son marcados con un aminocido pesado en una o ms posiFLRQHV OODPDGR SpSWLGR $48$ 'HELGR D TXH ODV SURSLHGDGHV FURPDWRJUiFDV H LRQL]DQWHV GH ORV SpSWLGRV $48$ VRQ LGpQWLFDV D ODV GH los pptidos nativos, al analizar e integrar los cromatogramas de los iones del par isotpico, se obtiene una relacin entre el pptido nativo y el sinttico de concentracin conocida. Estos pptidos pueden ser sintetizados para P~OWLSOHV SURWHtQDV GH LQWHUpV \ XVDGRV SDUD determinar concentraciones absolutas en una PXHVWUD $GHPiV SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV SDUD FXDQWLFDU PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV 5. Aplicaciones de la protemic El anlisis del proteoma de rganos o tejidos de plantas se ha llevado a cabo para analizar, por ejemplo, la respuesta a hormonas o PROpFXODV VHxDO OD UHVSXHVWD D HVWtPXORV GHO ambiente, cambios durante el desarrollo o tamELpQ SDUD DQDOL]DU ORV SDWURQHV SURWHLFRV GH Otneas con diferente base gentica. Proteomas subcelulares tambin han sido analizados en diversas especies y, ms recientemente, se ha utilizado este tipo de estudio para analizar LQWHUDFFLyQ GH SURWHtQDV R PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV $GHPiV VH KDQ DQDOL]DGR SRU esta tcnica la equivalencia y seguridad de aliPHQWRV GHULYDGRV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV DVt como el estudio de la presencia de alergenos, HQWUH RWURV $Vt ORV FDPSRV GH DSOLFDFLyQ GH OD protemica en plantas ha ido en aumento en los ltimos aos (ver revisiones: Cnovas et al.
5RVVLJQRO HW DO -DUUtQ HW DO y a continuacin se detallarn algunos de los aspectos ms estudiados. La Tabla 2 resume las reas ms relevantes en las que se ha aplicado la protemica en plantas. 5.1. Anlisis de proteomas subcelulares de plantas El mayor avance en proteomas subcelulares se ha llevado a cabo en plastidios, mitocondrias y membranas. Estos estudios no slo han FRQWULEXLGR D OD ORFDOL]DFLyQ GH SURWHtQDV HVSHFtFDV VLQR WDPELpQ TXH KD EULQGDGR LQIRUPDcin relevante sobre transporte, metabolismo, YtDV GH VHFUHFLyQ GLIHUHQFLDFLyQ \ UHVSXHVWD D HVWUpV $ SHVDU GH TXH OD SXULFDFLyQ GH SODVtidios es una tcnica fcil y que brinda fracciones de alta pureza, el aislamiento de otras organelas o fracciones subcelulares es tcniFDPHQWH PiV GLFXOWRVD (Q WRGRV ORV FDVRV siempre se debe estimar el nivel de contaminaFLyQ GH OD IUDFFLyQ SXULFDGD XWLOL]DQGR PDUFD-
GRUHV HVSHFtFRV &DEH GHVWDFDU TXH PXFKDV GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV HQ ORV GLYHUVRV compartimentos provienen de anotaciones de genes con funcin desconocida, por lo cual el FRQRFLPLHQWR GH OD ORFDOL]DFLyQ GH OD SURWHtQD TXH FRGLFDQ SHUPLWH FRPHQ]DU D LGHQWLFDU OD funcin de dichos genes. El anlisis de proteomas de plastidios, especialmente de cloroplastos, ha brindado inIRUPDFLyQ VREUH QXHYDV SURWHtQDV ORFDOL]DGDV en membrana externa y en tilacoides. Estos estudios, llevados a cabo fundamentalmente en arabidopsis y espinaca, han evidenciado diversos procesos de procesamiento y transORFDFLyQ \ PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV GH SURWHtQDV *UDFLDV DO XVR GH H[WUDFFLRQHV FRQ GLYHUVRV VROYHQWHV VH KDQ LGHQWLFDGRV QXHYDV SURWHtQDV FDQGLGDWDV D VHU WUDQVSRUWDdores de membrana. La tcnica de electroforesis nativa en presencia de azul de Coomassie %13$*( VHJXLGD SRU VHJXQGD GLPHQVLyQ H
Tabla 2 Aplicaciones de la protemica en plantas: Especies analizadas, tipos de proteomas estudiados, procesos biolgicos y aspectos prcticos donde se ha analizado el proteoma.
Especies analizadas Proteomas Sistemas modelos Arabidopsis thaliana Medicago truncatula Cereales Maz Arroz Trigo Leguminosas Alfalfa Arveja Soja Lenteja Otros Papa Tabaco Tomate Vid Espinaca Individuales Genotipos Mutantes Trangnicas Procesos Biolgicos Aspectos prcticos Identidad de marcadores moleculares Caracterizacin del genotipo Equivalencia de OGM Identificacin alergenos
Desarrollo Germinacin Maduracin polen Embriognesis Respuesta a hormonas Fracciones subcelulares Muerte celular programada Cloroplasto Estrs abitico Mitocondria Sequa Plastidio Osmtico Citosol Temperatura Pared celular Anoxia Membrana Deficiencia nutricional Vacuola Metales pesados rganos y Tejidos UV-B Races Estrs bitico Semillas Patgenos Coleoptiles Herbvoros Haces vasculares Estrs oxidativo Hojas Tricomas Polen Estados de desarrollo Germinacin Plantas maduras Plantas jvenes
LGHQWLFDFLyQ GH ODV SURWHtQDV SRU 06 WpFQLFD ampliamente utilizada para el estudio de complejos mitocondriales, tambin ha sido utilizada para el estudio de la composicin de los complejos proteicos de la membrana tilacoidal. El estudio del proteoma mitocondrial se ha GLYLGLGR HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH SURWHtQDV VROXEOHV SURWHtQDV SHULIpULFDV \ SURWHtQDV LQWHgrales de membrana. En este caso, el uso de %13$*( VHJXLGR SRU '( H LGHQWLFDFLyQ GH ODV SURWHtQDV VH KD XWLOL]DGR SDUD DQDOL]DU OD composicin de los diversos complejos respiUDWRULRV LGHQWLFiQGRVH QXHYRV FRPSRQHQWHV y diferencias con complejos respiratorios de otros organismos. (O DQiOLVLV GH SURWHtQDV GH PHPEUDQD HV XQR GH ORV GHVDItRV PiV GLItFLOHV GHELGR D SUREOHPDV GH PHWRGRORJtD SRU OD EDMD DEXQGDQFLD GH ODV SURWHtQDV \ VXV FDUDFWHUtVWLFDV KLGURIyELFDV VLHQGR PXFKDV GH HOODV SURWHtQDV WUDQVmembrana. Para el anlisis de este tipo de proWHtQDV VH KDQ HPSOHDGR SDUWLFLyQ GH SURWHtQDV en distintas fases de solventes seguido de fraccionamiento teniendo en cuenta las propiedaGHV VLFRTXtPLFDV GH ODV SURWHtQDV 3RU HMHPplo, el proteoma de la membrana plasmtica de arabidopsis fue analizado, siendo uno de los primeros que, adems, se someti a anOLVLV GH SURWHtQDV IRVIRULODGDV LGHQWLFiQGRVH ms de 300 sitios de fosforilacin. El proteoma vacuolar de arabidopsis, tanto de la membraQD FRPR GH ODV SURWHtQDV VROXEOHV WDPELpQ KD VLGR DQDOL]DGR FRQUPiQGRVH GLFKD ORFDOL]DFLyQ VXEFHOXODU SDUD DOJXQDV GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV SRU RWUDV WpFQLFDV $GHPiV VH KDQ OOHYDGR D FDER HVWXGLRV SDUD LGHQWLFDU SURWHtQDV GH SDUHG FHOXODU \ H[WUDFHOXODUHV LGHQWLFiQGRVH OD SUHVHQFLD GH YDULDV SURWHDVDV SURWHtQDV QXFOHDUHV PX\ GLItFLO GHELGR D VX EDMD FDQWLGDG \ D VXV DVRFLDFLyQ FRQ HO 5HWtFXOR (QGRSODVPiWLFR \ SURWHRPDV PL[WRV GHO DSDUDWR GH *ROJL \ GHO 5HWtFXOR endoplasmtico. 5.2. Proteomas durante el desarrollo de rganos Uno de los primeros objetivos de la protemica en plantas fue generar mapas de reIHUHQFLD GH SURWHtQDV VROXEOHV GH XQ yUJDQR en un determinado estado de desarrollo. En
los ltimos aos un gran nmero de trabajos VH KDQ UHDOL]DGR FRQ HO REMHWLYR GH LGHQWLFDU los cambios proteicos que ocurren asociados DO FUHFLPLHQWR \ GHVDUUROOR FRQ OD QDOLGDG GH LGHQWLFDU ODV SURWHtQDV FODYHV LPSOLFDGDV HQ GLFKRV SURFHVRV $Vt VH KDQ GHVFULWR ORV FDPbios en el proteoma asociados al crecimiento o GHVDUUROOR GHO JUDQR GH SROHQ VHPLOODV UDtFHV haces vasculares, entre otros. Muchos son los estudios que demuestran que los anlisis de protemica pueden generar informacin relevante para dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en procesos de desarrollo. Por ejemplo, estudios llevados D FDER HQ UDtFHV GH PDt] KDQ LQGLFDGR TXH GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV OXHJR GH GtDV de germinacin, slo el 28% permanece en las ~OWLPDV HWDSDV GHO GHVDUUROOR LGHQWLFiQGRVH DGHPiV SURWHtQDV DVRFLDGDV D OD IRUPDFLyQ GH UDtFHV ODWHUDOHV 3URFHVRV FRPR OD HPEULRJpnesis somtica tambin han sido analizados en GLYHUVDV HVSHFLHV SRU SURWHyPLFD LGHQWLFiQGRVH SURWHtQDV GH PHPEUDQD QXFOHDUHV DVt FRPR SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ PHWDEROLVPR \ SURGXFFLyQ GH HQHUJtD HQ GLYHUVDV HWDSDV GH este proceso. En muchos casos, se han idenWLFDGR SURWHtQDV FX\RV $51P QR IXHURQ LGHQWLFDGRV SRU HVWXGLRV GH WUDQVFULSWRPD FRPR es el caso del anlisis del grano de polen en arabidopsis, entre otros. 5.3. Proteomas en respuesta a estrs abitico El estudio de la interaccin de las plantas con el ambiente ha sido clsicamente abordaGR PHGLDQWH HVWXGLRV ELRTXtPLFRV JHQpWLFRV \ ms recientemente, a nivel de transcriptoma, mediante PCR en tiempo real (qRT-PCR), microarreglos, entre otros. Sin embargo, la protemica, desde su aplicacin en este tipo de situaciones, ha comenzado a brindar contribuciones relevantes en cuanto a los elementos involucrados tanto en la percepcin de la situacin ambiental como en la traduccin de dicha seal en la planta. Los tipos de estrs analizaGRV PHGLDQWH SURWHyPLFD KDQ VLGR VHTXtD HVtrs salino, alta temperatura, alta luz, radiacin 89% GHFLHQFLD QXWULFLRQDO QLYHOHV HOHYDGRV de CO2, anoxia, metales pesados y herbicidas.
Este tipo de aplicacin de la protemica inFOX\H WtSLFDPHQWH DQiOLVLV GH '(06 SDUD estudiar variaciones proteicas entre especies sensibles y resistentes frente a una determinada situacin de estrs. Se analizan las difeUHQFLDV FXDQWLWDWLYDV \ FXDOLWDWLYDV GH SURWHtQDV FRQ OD QDOLGDG GH FRUUHODFLRQDU HVWRV FDPELRV FRQ ODV GLIHUHQFLDV IHQRWtSLFDV 6H HVWXGLDQ tambin plantas mutantes o transgnicas, donGH XQD OtQHD HV UHVLVWHQWH \ RWUD VHQVLEOH $Vt ODV SURWHtQDV GLIHUHQFLDOHV VH VHOHFFLRQDQ FRQWUDVWDQGR ORV SURWHRPDV HQWUH OtQHDV UHVLVWHQtes versus VXVFHSWLEOHV R HQWUH OtQHDV FUHFLGDV en condiciones ptimas versus estresadas. 5.4. Proteomas en respuesta a estrs bitico En los ltimos aos, muchos estudios se han llevado a cabo para analizar la respuesta de los proteomas de diversos rganos frente al ataque por hongos, virus o bacterias. 7tSLFDPHQWH H[WUDFWRV FUXGRV GH KRMDV VHPLOODV UDtFHV R FXOWLYRV FHOXODUHV VH DQDOL]DQ D distintos tiempos luego del tratamiento y se separan organelas o subfracciones para el anOLVLV GH ORV FDPELRV HQ HO SURWHRPD $GHPiV se analiza el efecto de elicitores o molculas claves de la sealizacin (como cido saliFtOLFR SHUy[LGR GH KLGUyJHQR X y[LGR QtWULFR sobre el proteoma. Por otro lado, se estudian los proteomas de especies tolerantes o resistentes versus el de sensibles. Estos estudios, junto con el estudio del proteoma de diversos compartimentos celulares (apoplasto, tricoma, VDS GH RHPD R [LOHPD HQWUH RWURV KDQ HYLGHQFLDGR TXH YDULDV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV D la defensa frente al ataque de patgenos estn presentes incluso en ausencia del mismo y que ODV PLVPDV SURWHtQDV UHVSRQGHQ D WLSRV YDULDGRV GH HVWUpV $GHPiV PXFKDV SURWHtQDV GHrivadas de genes de funcin desconocida, han sido encontradas en estos estudios. (Q JHQHUDO OD PD\RUtD GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV HQ ORV HVWXGLRV GH SURWHRPDV de genotipos resistentes comparadas con los de sensibles, han mostrado dos tipos geneUDOHV GH SURWHtQDV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV D la defensa y enzimas asociadas al metabolismo del carbono o nitrgeno y al metabolismo secundario. Dentro del primer grupo, se han HQFRQWUDGR SURWHtQDV 35 FRPR JOXFDQDVDV
quitinasas, proteasa, inhibidores de proteasas), antioxidantes (catalasas, SODs, peroxiGDVDV FKDSHURQDV +63V SURWHtQDV /($ (Q el segundo grupo, varias enzimas asociadas D PHWDEROLVPR FRPR OD JOXFyOLVLV IRWRVtQWHVLV FLFOR GH .UHEV DVLPLODFLyQ GHO QLWUyJHQR R implicadas en metabolismos secundarios han sido encontradas. Es notable que los estudios basados en anlisis del transcriptoma han analizado en mucha mayor medida el primer grupo que el segundo. Sin embargo, la presencia de PD\RU FRQFHQWUDFLyQ GH SURWHtQDV LPSOLFDGDV en metabolismo primario en genotipos resistentes versus VHQVLEOHV SRGUtD LQGLFDU XQD YHQtaja gentica para defenderse frente al ataque. 5.5. Protemica para el estudio de simbiosis en plantas La protemica se ha aplicado tambin para HO HVWXGLR GH ODV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ OD formacin de ndulos en especies leguminoVDV 0DSDV GH SURWHtQDV GH UDtFHV GH HVSHFLHV hospedadoras, ndulos, cultivos de bacteroides fueron generados y comparados, con el REMHWLYR GH LGHQWLFDU SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ OD VLPELRVLV $GHPiV VH DQDOL]DURQ ODV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ GLVWLQWDV HWDSDV GH OD nodulacin. 0RGLFDFLyQ SRVWUDGXFFLRQDO H LQWHUDFcin de protenas 8QD GH ODV PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV GH SURWHtQDV HVWXGLDGDV PHGLDQWH SURWHymica es la fosforilacin. En estos estudios, VH KDQ LGHQWLFDGR ORV FDPELRV FXDQWLWDWLYRV \ FXDOLWDWLYRV GH ODV SURWHtQDV IRVIRULODGDV HQ UHVSXHVWD D GLYHUVDV VHxDOHV $GHPiV VH KDQ DQDOL]DGR ODV SURWHtQDV PRGLFDGDV HQ VX HVWDGR UHGR[ HQ GLIHUHQWHV VLVWHPDV LGHQWLFiQGRse muchos candidatos putativos de ser blanco de reduccin por tioredoxinas. Recientemente, se ha comenzado a analizar el patrn de proWHtQDV VXMHWDV D XELTXLWLQDFLyQ HQ SODQWDV PHdiante estudios de protemica. En cuanto al estudio de interaccin de proWHtQDV PHGLDQWH SURWHyPLFD ORV HVWXGLRV OOHYDGRV D FDER HQ SODQWDV VRQ WRGDYtD PX\ SRcos comparados con los llevados a cabo en RWURV VLVWHPDV FRPR PDPtIHURV \ OHYDGXUDV $OJXQRV HMHPSORV LQFOX\HQ HVWXGLRV GH FRP-
SOHMRV IRUPDGRV SRU YLUXV GH SODQWDV \ SURWHtnas del husped, anlisis de inmunoprecipitaGRV GH SURWHtQDV TXH LQWHUDFFLRQDQ FRQ WRFURPRV DVt FRPR SURWHtQDV TXH LQWHUDFFLRQDQ FRQ cobre. 6. Perspectivas Los resultados obtenidos mediante estudios de protemica en sus distintas aplicaciones han indicado que los estudios de genmica \ WUDQVFULSWRPD QR VRQ VXFLHQWHV GDGR TXH la protemica generalmente evidencia procesos no detectados por los otros estudios mencionados. Esto se debe fundamentalmente a que las SURWHtQDV VRQ ItVLFD \ TXtPLFDPHQWH PiV GLYHUVDV TXH ORV iFLGRV QXFOHLFRV $GHPiV GHELGR DO SURFHVDPLHQWR GHO $51 \ D ODV PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV ODV SURWHtQDV GH XQ dado organismo exceden en nmero la cantidad de genes. Otro nivel de complejidad se presenta si se tienen en cuenta la interaccin GH SURWHtQDSURWHtQD OR FXDO PRGLFD ODV SURSLHGDGHV GH ODV SURWHtQDV LQGLYLGXDOHV De esta manera, el estudio del proteoma, en paralelo con el del transcriptoma, llevado a cabo sobre el mismo sistema, podr dilucidar los mecanismos de control de expresin de SURWHtQDV \ HYLGHQFLDUi ORV SURFHVRV ELROyJLFRV llevados a cabo en una determinada situacin. 7. Bibliografa
Cnovas F. M., Dumas-Gaudot E., Recorbet G., Jorrin J., Mock H-P and Rossignol M. 2005. Plant 3URWHRPH $QDO\VLV 3URWHRPLFV 4, 285-298 &KHQ 6 DQG +DUPRQ $ & $GYDQFHV LQ SODQW proteomics. Proteomics, 6, 55045516. -RUUtQ - 9 0DOGRQDGR $ 0 DQG &DVWLOOHMR 0 $ 3ODQW SURWHRPH DQDO\VLV $ XSGDWH Proteomics, 7, 2947-2962 Nesatyy V. J. and Suter M. J-F. 2007. Environmental Science & Technology, 41, 6891-6900. 1HZWRQ 5 3 %UHQWRQ $ * 6PLWK & - DQG 'XGley E. 2004. Plant proteome analysis by mass spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent developments. Phytochemistry, 65, 14491485. Thelen J.J. and Peck S.C. 2007. Quantitative ProWHRPLFV LQ 3ODQWV &KRLFHV LQ $EXQGDQFH 3ODQW Cell, 19, 33393346.
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I CAPTULO 10 Metabolmica
Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, /XFLDQR $ $EULDWD $OHMDQGUR - 9LOD \ Estela M. Valle. 'HQLFLyQ GH PHWDERORPD Se conoce como metabolismo al conjunto GH UHDFFLRQHV TXtPLFDV TXH RFXUUHQ HQ ODV Fplulas vivas, tejidos u organismos, mediante el cual estos participan del intercambio de mateULD \ HQHUJtD FRQ VX HQWRUQR (O RULJHQ GH OD palabra metabolismo procede del griego metabol TXH VLJQLFD FDPELR WUDQVIRUPDFLyQ En los sistemas biolgicos los metabolismos se encuentran interconectados formando reGHV ELRTXtPLFDV (Q ORV ~OWLPRV DxRV \ HQ HVWD era post-genmica, se ha acuado el trmino metaboloma, para indicar la totalidad de los metabolitos que actan en las redes metablicas de un sistema biolgico. Es decir, el metaERORPD LPSOLFD OD LGHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ simultneas de todos los metabolitos del material investigado. El metaboloma est conformado por dos tipos de compuestos: los metabolitos primarios y los secundarios. Los metabolitos primarios son compuestos que estn involucrados en funciones bsicas de la clula, como la respiracin o la ELRVtQWHVLV GH DPLQRiFLGRV 7RGRV ORV RUJDQLVmos comparten bsicamente los mismos tipos de metabolitos primarios y en trminos generales se puede decir que se trata de molculas simples y de bajo peso molecular. En cambio, ORV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV VRQ HVSHFtFRV GH la especie y muchos de ellos estn implicados en la defensa de la planta contra estrs bitico (siendo los terpenos los ms abundantes), en SURFHVRV GH GHVDUUROOR HVSHFtFRV GH OD HVSHcie (hormonas) y en estrategias de atraccin GH SROLQL]DGRUHV SLJPHQWRV GH ODV RUHV (Q las plantas, se estima que el nmero total de metabolitos supera los 200.000. El anlisis del metaboloma de un sistema biolgico dado es conocido como metabolmica. Este trmino no VLHPSUH WLHQH HO PLVPR VLJQLFDGR \D TXH OD metabolmica es multifuncional y depende del diseo experimental y del objeto de estudio. En
general, la metabolmica indica la totalidad de los patrones metablicos de los sistemas bioOyJLFRV WDPELpQ FRQRFLGRV FRPR SHUOHV PHtablicos. Como los metabolitos son el producto de reacciones enzimticas, ellos brindarn informacin importante sobre las propiedades UHJXODWRULDV R FDWDOtWLFDV GH XQ SURGXFWR JpQLFR dado. Los metabolitos presentes en un sistema ELROyJLFR EDMR FRQGLFLRQHV HVSHFtFDV HVWDGtRV GH GHVDUUROOR FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV PRGLFDFLRQHV JHQpWLFDV VH SXHGHQ DQDOL]DU PHGLDQWH HO XVR GH WpFQLFDV FURPDWRJUiFDV GH VHSDUDFLyQ HQ GLVWLQWDV IDVHV JDVHRVD OtTXLGD GH DOWD SUHVLyQ HWF \ GH LGHQWLFDFLyQ PHGLDQWH HVSHFWURPHWUtD GH DOWD UHVROXFLyQ que han comenzado a establecerse recientePHQWH HQ $UJHQWLQD FRPR OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVD 06 JDVHRVD R OtTXLGD \ WpFQLFDV HVpectroscpicas como la resonancia magntica QXFOHDU 501 $ VX YH] HO DFRSODPLHQWR GH los sistemas de separacin con los de identiFDFLyQ PHQFLRQDGRV PiV DUULED SHUPLWH OD REWHQFLyQ GH SHUOHV PHWDEyOLFRV GH PXHVWUDV complejas como por ejemplo, extractos crudos obtenidos de rganos fotosintticos de plantas. Diseo experimental, tcnicas, entrenaPLHQWR 0pWRGRV FURPDWRJUiFRV IDVH JDseosa y lquida). El anlisis de los metabolitos presentes en muestras complejas (como las que pueden obtenerse a partir de extractos crudos de plantas) puede realizarse en primer lugar a partir de la separacin de las molculas que las componen. Existen diversos mtodos de separacin con distintos grados de resolucin y sensibiliGDG /D FURPDWRJUDItD HQ IDVH JDVHRVD *& ha sido extensamente usada justamente por su alta resolucin y sensibilidad. Consiste en la separacin de las molculas por su capacidad mvil en una fase gaseosa impulsada por un gas usualmente inerte (por ejemplo Helio -He-) de modo de evitar reacciones con la matriz a analizar. Luego de su obtencin y acondicionamiento, los extractos son inyectados en una cmara de vaporizacin a alta presin y temperatura, donde la muestra es volatilizada para luego ser transportada a una columna bajo un XMR FRQVWDQWH GH JDV ([LVWHQ GLIHUHQWHV SURtocolos en cuanto a las condiciones y tiempos
de corrida y se utilizan columnas diferentes en funcin del tipo de muestras y molculas a analizar. Las molculas se separan de acuerdo D VXV SURSLHGDGHV ItVLFDV \ TXtPLFDV \ DO QDO de la columna, un detector emite una seal que es registrada como una serie de picos los que FRQVWLWX\HQ HO FURPDWRJUDPD (Q OD JXUD VH observa un cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de una muestra de extractos de frutos de tomate. El pice de un pico dado representa el momento de mayor intensidad registrado y se lo conoce como el tiempo de retencin (RT) de ese grupo de molculas. El RT es una propiedad de ODV PROpFXODV TXH SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ GH las mismas en el cromatograma. Sin embargo, dada la necesidad de volatilizar los extractos, es necesario un tratamiento SUHYLR GH ORV PLVPRV D Q GH WUDQVIRUPDU ODV molculas en compuestos menos polares y ms voltiles. Este paso, denominado derivaWL]DFLyQ FRQVLVWH HQ OD DGLFLyQ GH JUXSRV TXtmicos (tales como sililo -Si(CH3)3- y metoxi) a las molculas que componen la muestra com-
pleja. Si bien se han desarrollado diferentes mtodos de derivatizacin, esta etapa constituye la principal desventaja de la cromatograItD JDVHRVD GDGD OD GLYHUVLGDG GH SURSLHGDGHV VLFRTXtPLFDV GH ODV PLOHV GH PROpFXODV TXH componen un extracto crudo. La principal diFXOWDG UDGLFD HQ OD H[DFWD LGHQWLFDFLyQ GH los fragmentos obtenidos luego de la ionizacin de las distintas molculas (ver siguiente VHFFLyQ (VSHFWURPHWUtD GH PDVDV 3ULQFLSLRV bsicos). En este sentido, la aplicacin de la cromatoJUDItD HQ IDVH OtTXLGD /& FRQVWLWX\H XQ FRPplemento importante a la gaseosa y contribuye a expandir el rango de aplicaciones de las WpFQLFDV FURPDWRJUiFDV HQ PHWDEROyPLFD 6L bien la resolucin de sta es menor que la gaseosa, permite la separacin de compuestos de mayor peso molecular y polaridad sin la necesidad del paso de derivatizacin previamente mencionado. No obstante los avances en el conocimiento HQ FXDQWR D OD VHSDUDFLyQ H LGHQWLFDFLyQ GH FRPSXHVWRV RUJiQLFRV OD FURPDWRJUDItD QR KD
Figura 1. Cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de un extracto crudo de fruto de tomate. Sobre las abscisas se observan los tiempos de retencin para grupo de molculas en XQD FROXPQD HQ IDVH JDVHRVD 6REUH ODV RUGHQDGDV VH JUDFDQ ODV LQWHQVLGDGHV UHODWLYDV GH FDGD JUXSR GH PROpFXODV VHSDUDGR %DMR FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV GHQLGDV HVWDV LQWHQVLGDGHV VRQ SURSRUFLRQDOHV a la cantidad de la molcula en anlisis presente en una muestra dada.
UHVXHOWR D~Q OD H[DFWD LGHQWLFDFLyQ GH PROpculas individuales presentes en una muestra compleja. El empleo de sistemas de cromatoJUDItD DFRSODGRV D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV UHVXOWD GH JUDQ XWLOLGDG HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH molculas que se encuentran en trazas en una muestra compleja con un grado de exactitud de hasta 3-4 decimales. Espectrometra de masas. Principios bsicos. /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV HV XQ PpWRGR TXH SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ GH PROpFXODV D partir del patrn de fragmentos que se generan OXHJR GH OD LRQL]DFLyQ GH ODV PLVPDV $ HVWH SDtrn se lo denomina espectro de masas y constituye la huella digital de una molcula dada. Esta es una de las funciones primarias de los espectrmetros de masas. Existen varias mtodos para la ionizacin de molculas: ionizaFLyQ TXtPLFD &, SRU LPSDFWR GH HOHFWURQHV (, ERPEDUGHR UiSLGR GH iWRPRV )$% SRU campo elctrico (FI), por lser (LIMS), desorFLyQ DVLVWLGD SRU OiVHU 0$/', H LRQL]DFLyQ SRU electrospray (ESI). Este ltimo mtodo es uno de los ms utilizados para la generacin de los espectros de masas de molculas orgnicas el cual consiste en un impacto con electrones de DOWD HQHUJtD DSOLFDGR VREUH XQD FRUULHQWH GH PROpFXODV HQ IDVH OtTXLGD (VWR SURGXFH OD QHbulizacin y fragmentacin de las molculas y mediante cambios rpidos de temperatura se
produce luego una corriente gaseosa que conduce a los iones obtenidos hacia los detectores del espectrmetro. Durante esta corriente los iones generados son separados de acuerdo a su masa y carga que al impactar sobre los detectores generan una seal elctrica que es registrada de acuerdo a su intensidad. La maQHUD JUiFD GH UHSUHVHQWDU HVWDV VHxDOHV HV lo que se conoce como espectro de masas de XQD PROpFXOD (Q OD JXUD VH REVHUYD XQ HVpectro de masas del aminocido fenilalanina. Preparacin de muestras. Extraccin y derivatizacin. La obtencin de muestras biolgicas para el DQiOLVLV GH VXV SHUOHV PHWDEyOLFRV FRPR FXDOTXLHU RWUD WpFQLFD TXH LQYROXFUH OD LGHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ GH PHWDEROLWRV UHTXLHUH OD LQmediata inactivacin del metabolismo de modo de evitar efectos de su manipulacin sobre el mismo. La inhibicin rpida del metabolismo se logra mediante la disminucin brusca de temperatura (d -60C) por inmersin de las muestras en N2 OtTXLGR $ VX YH] ORV SURFHGLPLHQWRV posteriores de extraccin requieren el uso de materiales (tales como tubos plsticos o de vidrio) de alta calidad y pureza de modo de prevenir fuentes de eventuales contaminaciones. $ VX YH] GDGR TXH XQD GH ODV DSOLFDFLRQHV comunes de estas tcnicas es la comparacin del estado metablico de organismos frente a perturbaciones ambientales (por ejemplo de
Figura 2. Espectro de masas del aminocido fenilalanina. Sobre las abscisas se observan las relaciones masa/carga (m/z) de los diferentes fragmentos obtenidos luego de la ionizacin de la molcula. Sobre las RUGHQDGDV VH JUDFDQ ODV LQWHQVLGDGHV UHODWLYDV GH FDGD IUDJPHQWR REWHQLGR %DMR FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV GHQLGDV HVWDV LQWHQVLGDGHV VRQ SURSRUFLRQDOHV D OD FDQWLGDG GH OD PROpFXOD HQ DQiOLVLV SUHVHQWH en una muestra dada. Fuente: adaptado de The Golm Metabolome databases.
plantas de cultivo en ambientes extremos) y/o a cambios en la constitucin gentica de los mismos (por ejemplo de plantas transgnicas TXH H[SUHVHQ GLIHUHQFLDOPHQWH XQD SURWHtQD involucrada en sealizacin por azcares) una necesidad bsica es las consideraciones de controles tanto de los materiales per se como de las condiciones en las que las muestras son H[WUDtGDV \ SURFHVDGDV $ VX YH] OD DSOLFDFLyQ GH DOJRULWPRV HVWDGtVWLFRV D ORV GDWRV REWHQLdos requiere la determinacin del grado de variacin dentro de la poblacin de muestras a ser analizadas. $ HIHFWRV H[SOLFDWLYRV HQ HVWH FDStWXOR QRV concentraremos en un ejemplo de muestreo, acondicionamiento y extraccin de muestras de hojas de plantas (de tomate, papa, tabaco o Arabidopsis) en condiciones ambientales controladas (22-24C, 250 mol fotones.m-2.s-1 y 16 h de luz/8 h de oscuridad). El momento del GtD SDUD HO PXHVWUHR GHEH VHU FXLGDGRVDPHQte controlado. Como regla general, la mitad del periodo de luz es el ms indicado debido a que numerosos reportes en la literatura dan cuenta de los ritmos diurnos en los cambios en la composicin metablica de plantas. El otro punto importante a tener en cuenta es el estado fenolgico de las plantas y los rganos a muestrear. La posicin de las hojas en la planta y el rea de las mismas tambin debe ser teQLGR HQ FXHQWD $GHPiV XQD YH] TXH ODV SRUciones de hojas fueron cortadas de la planta, se debe registrar la masa exacta de la muestra y congelarlas inmediatamente. Las muestras deben mantenerse a la temperatura indicada durante todo el proceso de extraccin. Para ello es conveniente enfriar todos los instrumentos necesarios para la toma de muestras, tales como tijeras, pinzas, sacabocados, tubos, etc. Para el ejemplo mencionado, la cantidad de tejido necesario puede variar entre 100-150 mg (peso fresco). La muestra debe ser homogenizada en N2 OtTXLGR ODV HQ]LPDV LQDFWLYDGDV mediante el agregado de metanol y al mismo tiempo deben agregarse estndares internos (en concentraciones conocidas) no presentes en la muestra a analizar. La extraccin se realiza luego calentando la muestra a 70C con agitacin constante. Si bien este protocolo puede aplicarse a la obtencin tanto de la fase polar
como apolar, a los efectos de este ejemplo, los pasos siguientes se concentran en la obtencin de la fase polar. Mediante un paso de H[WUDFFLyQ FRQ FORURIRUPRDJXD ODV DOtFXRWDV GH OD IDVH SRODU VRQ FRQFHQWUDGDV \ OLROL]DGDV para su posterior derivatizacin. Tal como se mencion previamente, la deULYDWL]DFLyQ FRQVLVWH HQ OD PRGLFDFLyQ GH ODV PROpFXODV D Q GH GLVPLQXLU VX SRODULGDG \ SHUmitir la volatilizacin de las mismas. Existen varios mtodos y reactivos derivatizantes. Entre ORV PiV XVDGRV SDUD HVWD DSOLFDFLyQ HO 067)$ 1PHWLO1WULPHWLOVLOLOWULXRURDFHWDPLGD KD GHmostrado ser uno de los ms reactivos en reemplazar los hidrgenos lbiles de un amplio rango de compuestos polares por grupos sililos y el hidroxicloruro de metoxiamina es usado en XQ VHJXQGR SDVR GH GHULYDWL]DFLyQ D Q GH SURWHJHU JUXSRV DOGHKtGRV \ FHWRQDV GH ODV PROpculas presentes en la matriz. /RV H[WUDFWRV DVt SUHSDUDGRV VRQ LQPHGLDtamente inyectados en el cromatgrafo acoplado al espectrmetro de masas. Tanto las condiciones de corrida (tiempo, rampa de temperaturas, frecuencia de captura de datos, HWF FRPR ODV HVSHFLFDFLRQHV GH XMR GH JDV \ FROXPQDV FURPDWRJUiFDV GHEHQ VHU SXHVtas a punto para cada aplicacin particular. En este sentido, en los ltimos aos se dispone de programas de computacin especialmente diseados por los fabricantes de espectrmetros que controlan toda la operacin y posterior SURFHVDPLHQWR GH GDWRV $ VX YH] OD GLVSRQLbilidad de colecciones de espectros de masas en bases de datos de acceso pblico (ver sitios recomendados) permite la rpida evaluacin de los datos adquiridos. Resonancia magntica nuclear. Principios bsicos La resonancia magntica nuclear es un mtodo de anlisis espectroscpico no destrucWLYR TXH VH EDVD HQ OD DEVRUFLyQ GH HQHUJtD en la zona de radiofrecuencia por parte de los ncleos de algunos tomos, en presencia de un campo magntico. La MS es la tcnica ms utilizada en metabolmica. Sin embargo, la tcnica de RMN est ganando terreno en este sector, como una tcnica que brinda informaFLyQ FRPSOHPHQWDULD \D TXH DPSOtD HO UDQJR
de metabolitos detectados y provee informacin estructural detallada de las molculas SUHVHQWHV 0iV D~Q OD 501 SHUPLWH LGHQWLFDU sustancias previamente no halladas en muestras similares. La RMN explota una propiedad de los ncleos atmicos, el spin nuclear. El spin nuclear posee un momento magntico, es decir que se comporta como un pequeo imn. Normalmente, estos momentos magnticos estn orientados al azar y WLHQHQ OD PLVPD HQHUJtD JXUD 6L VH DSOLFD XQ FDPSR PDJQpWLFR MR %0) con una dada direccin, estos momentos magnticos quedarn alineados a favor o en contra del campo magntico externo JXUD 6HJ~Q VX RULHQWDFLyQ FRQ UHVSHFWR DO campo Bo, los ncleos tendrn ahora distinta enerJtD /D GLIHUHQFLD GH HQHUJtD ( HQWUH HVWRV GRV niveles est en el orden de las ondas de radio, es decir con frecuencias de MHz. Si ahora aplicamos al sistema orientado la frecuencia correspondienWH D HVD ( 0), se inducir una transicin entre
estos niveles, que es el fenmeno de Resonancia JXUD /D IUHFXHQFLD GH DEVRUFLyQ 0 depende del campo aplicado (B0 HO FXDO HVWi MR SDUD FDGD HTXLSR \ OD FRQVWDQWH JLURPDJQpWLFD QXFOHDU TXH HV FDUDFWHUtVWLFD GH FDGD Q~FOHR JXUD (V GHFLU TXH cada ncleo tendr una frecuencia de absorcin FDUDFWHUtVWLFD (V LPSRUWDQWH WHQHU HQ FXHQWD TXH como se trata de una propiedad del ncleo atmiFR GDGR XQ HOHPHQWR TXtPLFR ORV GLVWLQWRV LVyWRpos del mismo presentarn distintas propiedades PDJQpWLFDV $OJXQRV LVyWRSRV GHSHQGLHQGR GH VX composicin) pueden carecer de spin, y por lo tanto no sern activos en RMN y este es el caso de 12 C, 16O y 326 3RU VLPSOLFLGDG HQ HVWH FDStWXOR VH considerarn slo los ncleos con spin , que son los de inters biolgico. Dentro de los ncleos de spin se encuentran los ncleos de 1H, 13C, 15N y 31 P, que pueden ser estudiados por RMN. Cada ncleo posee una sensibilidad determinada, que est determinada por su constante giromagntica. El or-
Figura 3. (VTXHPD HQ GRQGH VH PXHVWUD ORV QLYHOHV GH HQHUJtD GH ORV Q~FOHRV HQ SUHVHQFLD R DXVHQFLD GH un campo magntico externo (B0 \ ODV WUDQVLFLRQHV GH ORV Q~FOHRV HQWUH XQ QLYHO GH HQHUJtD \ RWUR VXSHULRU al absorber una frecuencia (X0) FRUUHVSRQGLHQWH D OD GLIHUHQFLD GH HQHUJtD (
den de sensibilidad de estos ncleos es: 1H > 31P > 13 C > 15N. La deteccin de 1H o 31P, adems de su alta sensibilidad, est favorecida por la alta abundancia natural de estos istopos (99,9% y 100%, respectivamente). En cambio, los istopos de 13C y 15N poseen una abundancia de 1,1% y 0,4%, lo FXDO GLFXOWD PiV D~Q VX GHWHFFLyQ (VWH LQFRQYHniente se puede sortear enriqueciendo la muestra con el istopo activo de inters. Cabe destacar que ninguno de estos istopos es radioactivo, lo que facilita la manipulacin de las muestras. Todos los elementos con istopos magnticos detectables por la tcnica RMN pueden ser usados SDUD LGHQWLFDU PHWDEROLWRV HQ WHMLGRV GH SODQWDV \ sus extractos. El 1H es el istopo magntico ms XWLOL]DGR GHELGR D VX DOWD VHQVLELOLGDG LQWUtQVHFD \ VX DEXQGDQFLD QDWXUDO /D FRQFHQWUDFLyQ OtPLWH para poder detectar un metabolito por RMN de 1H en un extracto es alrededor de 10 M. Para una muestra dada, la sensibilidad aumenta con el campo magntico del instrumento utilizado. Los metabolitos fosforilados pueden ser idenWLFDGRV \ FXDQWLFDGRV SRU 501 XWLOL]DQGR HO istopo magntico 31P. De esta manera se pueden estudiar un nmero pequeo de molculas abundantes y de gran importancia metablica
como es el fosfato inorgnico, nuclesidos trifosfatos, fosfomonosteres, etc. Desplazamiento qumico La frecuencia de absorcin de cada ncleo GHSHQGH GH VX FRQVWDQWH JLURPDJQpWLFD D XQ campo dado. Por ejemplo, a un campo de 9,4 T, los 1H absorben a 400 MHz, los 13C a 100,6 MHz y los 15N a 40 MHz. Sin embargo, no todos los 1 H ni todos los 13C absorben a la misma frecuencia. La frecuencia de absorcin de cada protn depende de la ubicacin del ncleo en las molFXODV HV GHFLU GH VX DPELHQWH TXtPLFR /DV GLVtintas posiciones de los ncleos en un espectro VH FXDQWLFDQ FRQ XQ SDUiPHWUR OODPDGR desplazamiento qumico FX\R YDORU QR VyOR LQIRUPD la frecuencia precisa de absorcin, sino que nos permite distinguir el tipo de protn (por ejemplo DOLIiWLFR DURPiWLFR DPtGLFR HWF /D LQWHQVLGDG de una seal de resonancia, o sea el rea bajo cada pico, es proporcional al nmero de ncleos GH HVH WLSR JXUD Espectrmetro de RMN Cada equipo de RMN trabaja a un camSR PDJQpWLFR MR (Q JHQHUDO HV FRQYHQLHQWH
Figura 4. Dependencia ubicacin del ncleo en las molculas y su frecuencia de absorcin.
trabajar con un campo magntico alto porque esto trae aparejado una mayor sensibilidad y resolucin. Cada equipo se suele denominar no por la magnitud del campo (por ejemplo, 16 Tesla), sino por la frecuencia de absorcin del 1 H a ese campo (para el caso mencionado, 600 0+] /D PD\RUtD GH ORV DQiOLVLV PHWDEyOLFRV se realizan con instrumentos que operan en el rango de 300 a 900 MHz para 1H. El campo magntico est generado por +HOLR OtTXLGR D EDMDV WHPSHUDWXUDV . TXH es superconductor, y se encuentra en un termo que rodea la muestra, que constituye el imn o magneto. Los pulsos de excitacin de radiofrecuencia se generan mediante bobinas que estn alrededor del tubo donde se encuentra la muestra, complementadas con un conjunto de bobinas que permiten la deteccin de la seal resultante. Preparacin de las muestras Se pueden obtener espectros de RMN a partir de una amplia variedad de materiales: extractos vegetales (por ejemplo: jugo de tomate), suspensiones celulares e inclusive plntulas intactas. En el caso de realizar RMN de 1H, es conYHQLHQWH OLROL]DU ODV PXHVWUDV SDUD HOLPLQDU HO DJXD (VWR VH UHDOL]D FRQ HO Q GH UHGXFLU OD seal correspondiente al solvente, que (por su DOWD LQWHQVLGDG GLFXOWD OD GHWHFFLyQ GH VHxDles de los metabolitos. Luego se resuspende OD PXHVWUD OLROL]DGD HQ DJXD GHXWHUDGD '2O). La adicin de D2O a la muestra har que no se puedan detectar las seales de protones intercambiables con el solvente, como los de grupos amida o alcohol. En caso de que sea necesario SRGHU LGHQWLFDU ORV PLVPRV GHEHQ UHDOL]DUse experimentos que permitan la eliminacin selectiva de la seal del solvente. En caso de que se deseen extraer algunos componentes HVSHFtFRV WDPELpQ SXHGHQ XWLOL]DUVH VROYHQtes orgnicos, de preferencia deuterados (que se venden comercialmente). Conviene utilizar VROYHQWHV TXtPLFDPHQWH LQHUWHV \ YROiWLOHV OR que permite eliminar el solvente en caso de que la muestra deba ser analizada por otra tcnica. Esto es posible debido a que la tcnica de RMN es no destructiva. Las muestras se colocan en tubos de vidrio borosilicato puro y el
volumen de extracto utilizado es dependiente GHO HQVD\R SHUR YDUtD HQWUH \ O Utilizacin de la tcnica RMN en metabolmica ,GHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ GH PHtabolitos en tejidos vegetales: ventajas y desventajas Existen diversas ventajas de la tcnica de 501 SDUD HO DQiOLVLV GH SHUOHV PHWDEyOLFRV Las mayores ventajas con respecto a otras tcnicas son: (1) no se requiere tratamiento previo de la muestras (pudindose utilizar extractos crudos); (2) es un mtodo no destructivo, lo cual permite el anlisis subsiguiente de la muestra con otros mtodos; (3) se puede obtener informacin sobre una amplia variedad de metabolitos en un nico experimento; (4) no existen restricciones en cuanto a la volatilidad, polaridad de los compuestos, o la presencia GH GHWHUPLQDGRV FURPyIRURV TXH LQWHUHUDQ \ (5) la tcnica puede ser aplicada con escaso conocimiento previo de la composicin de la muestra. Otra gran ventaja de sta tcnica para el anlisis cualitativo de metabolitos es que no requiere del conocimiento de ningn parmeWUR HTXLYDOHQWH D ORV FRHFLHQWHV GH H[WLQFLyQ QHFHVDULRV SDUD FXDQWLFDU PXHVWUDV PHGLDQWH tcnicas espectrofotomtricas. Esto se debe a que la magnitud de la seal de resonancia de un istopo es directamente proporcional al nmero de ncleos que contribuyen a dicha seal. Lo anterior implica que, por una parte, no se requieren curvas de calibracin para efectuar el anlisis cuantitativo, y por otro lado no es necesario conocer el espectro de un compuesto puro ya que por lo general basta con LGHQWLFDU VHxDOHV GHELGDV D XQD SRUFLyQ GDGD de la molcula para obtener la informacin deseada. La informacin cuantitativa se obtiene a partir del rea integrada bajo la curva. Ejemplo 1: caracterizacin de extractos de frutos de tomate /D )LJXUD $ PXHVWUD XQ HVSHFWUR GH 501 de 1H en una muestra de jugo de tomate. En la regin de campo alto (3,1-0,3 ppm) del espectro de protones contiene la resonancia de los grupos alifticos de los aminocidos y ci-
dos orgnicos pertenecientes al metabolismo GH ORV iFLGRV WULFDUER[tOLFRV (Q SDUWLFXODU ODV seales provenientes de treonina, alanina, gluWDPDWR JOXWDPLQD *$%$ DVSDUWDWR FLWUDWR \ PDODWR IXHURQ LGHQWLFDGDV FODUDPHQWH /DV UHsonancias encontradas en la regin del espectro de campo intermedio (desde 3,2 a 5,3 ppm) FRUUHVSRQGHQ HQ VX PD\RUtD D VDFiULGRV GH los cuales D-glucosa y D-fructosa son los componentes principales. En la regin de campo bajo (5,5-9,4 ppm) del espectro se encuentran las seales correspondientes a aminocidos aromticos y compuestos fenlicos. Debido a la baja intensidad de la seal, las asignaciones se realizaron parcialmente. Estos resultados muestran que la tcnica RMN puede ser una herramienta til para ser usada en la caracterizacin de tomates. La principal desventaja de la tcnica de RMN es su baja sensibilidad. El advenimiento de instrumentos de RMN de alto campo, de tcnicas especiales de deteccin y el diseo de criosondas (de mucha mayor sensibilidad) ha mejorado este aspecto. De todas formas, rara vez se usa RMN para el anlisis de un componente que se encuentra en trazas. Generalmente, el problema de la baja relacin seal-a-ruido en los espectros de RMN (que sucede principalmente con istopos poco abundantes) puede ser superado haciendo varios espectros de manera automtica, y sumndolos. Esto redunda en mayor tiempo de adquisicin del experimento. Sin embargo, si se tiene en cuenta que cada experimento permite seguir muchos metabolitos a la vez, este aspecto negativo se ve compensado. La tcnica de RMN aplicada a heteroncleos (tales como 13C, 15N o 31P) es til debido al hecho de que estos ncleos presentan una gran dispersin en sus seales, dado que el rango GH GHVSOD]DPLHQWRV TXtPLFRV GH ORV PLVPRV es mayor que el de 1H. En el caso particular de 13 C o 15N, como ya se mencion, los ncleos son menos sensibles y abundantes, por lo cual es conveniente realizar una marca isotpica. Generalmente, se utiliza la estrategia de marcado isotpico selectivo (no uniforme) para el DQiOLVLV GH XMRV PHWDEyOLFRV PiV TXH SDUD UHDOL]DU SHUOHV PHWDEyOLFRV Otra de las desventajas de la tcnica es el solapamiento de las seales obtenidas en 1H
501 $ Q GH PLQLPL]DU HVWR VH SXHGH FRPELnar esta tcnica con una de separacin cromaWRJUiFD GH PDQHUD TXH HO H[WUDFWR VH IUDFFLRne, disminuyendo la complejidad de la muestra y por ende del espectro de RMN. Esto es anlogo a lo que se realiza cuando se acopla OD FURPDWRJUDItD JDVHRVD D XQ HVSHFWUyPHWUR de masa. La segunda opcin para incrementar la resolucin espectral es adquirir espectros bidimensionales, distribuyendo las seales a lo largo de dos ejes de frecuencia. Estos mtodos bidimensionales pueden adems utilizarse para incrementar la sensibilidad de istopos menos abundantes como 13C, y establecen conexiones entre las seales de 1H y 13C lo cual HV ~WLO SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV PHWDEROLWRV
Figura 5. 3HUO PHWDEyOLFR FRUUHVSRQGLHQWH D XQD PXHVWUD GH MXJR GH WRPDWH $ HVSHFWUR GH 1H RMN en una dimensin y (B) en dos dimensiones (COSY) de la zona de azcares y alifticos
La gran cantidad de informacin que se puede extraer de estos espectros bidimensionales compensa el hecho del mayor tiempo que lleva realizarlos. Estos experimentos explotan las interacciones entre los distintos istopos detectables por RMN en una molcula y resultan en lo que se denomina correlacin homonuclear, donde los dos ejes de frecuencia corresponden al mismo ncleo, por lo general 1 H, o correlacin heteronuclear en donde uno de los ejes de frecuencia corresponde al 1H y el otro a 13C, 15N y menos frecuentemente 31P. Los experimentos de correlacin homonuclear VRQ SDUWLFXODUPHQWH ~WLOHV SDUD UHDOL]DU SHUOHV metablicos, permitiendo que subgrupos de picos que se encuentran juntos en el espectro GH XQD GLPHQVLyQ SXHGDQ VHU LGHQWLFDGRV \ asignados a compuestos particulares. La correlacin heteronuclear tambin es til cuando los extractos derivan de tejidos que han sido marcados con 13C o 15N. Con el objeto de realizar una asignacin completa de las seales resonantes a comSXHVWRV HVSHFtFRV SUHVHQWHV HQ HO MXJR GH tomate, se realizaron diversos experimentos de RMN bidimensionales. La Figura 5B corresponde a un COSY de la zona de azcares y alifticos. Usando la informacin de conectividad y aprovechando la mayor separacin de las seales en la dimensin adicional, muchas de las seales fueron asignadas sin ambigedad. En los casos en donde la asignacin fue dudosa, se adicionaron los compuestos puros DO H[WUDFWR SDUD FRUURERUDU DVt OD LGHQWLGDG GHO metabolito analizado. Se utilizaron las tablas GH GHVSOD]DPLHQWRV TXtPLFRV H[LVWHQWHV HQ OD OLWHUDWXUD FRPR JXtD SDUD DVLJQDU FRUUHFWDPHQte las seales. Ejemplo 2: caracterizacin de plantas transgnicas El desarrollo de tcnicas para la generacin de plantas transgnicas ha revolucionado el iUHD GH OD ELRORJtD GH SODQWDV (VWDV SODQWDV transgnicas pueden tener perturbaciones en las rutas metablicas debido a la introduccin del transgen en el genoma de la planta. La tcnica de RMN permite tener un pantallazo general del estado metablico de las plantas lo FXDO HV GH VXPD XWLOLGDG SDUD JHQHUDU OtQHDV
GH SODQWDV TXH SRVHDQ HVSHFtFDPHQWH DOJXna ruta metablica alterada. Un ejemplo de esto es el anlisis de plantas de tabaco que SURGXFHQ FRQVWLWXWLYDPHQWH HO iFLGR VDOLFtOLFR las cuales son ms resistentes a infecciones. /RV SHUOHV PHWDEyOLFRV TXH VH REWXYLHURQ SRU RMN mostraron que las plantas transgnicas WHQtDQ DOWHUDGRV ORV QLYHOHV GH GLVWLQWRV FRPSXHVWRV FRPR DYRQRLGHV D]~FDUHV DPLQRicidos, etc. Este ejemplo muestra claramente la potencialidad de utilizar la tcnica de RMN para estudiar cambios metablicos. 2-Mapas de distribucin espacial de metabolitos en tejidos vegetales La tcnica 1H RMN puede ser utilizada in vivo para obtener informacin acerca de la distribucin espacial de un nmero limitado de metabolitos. Este mtodo se utiliza generalmente para el H2O ya que es la seal ms fuerte detectada in vivo. Las imgenes brindan informaFLyQ DFHUFD GH OD DQDWRPtD GHO WHMLGR \ HO PRYLmiento del H2O dentro del mismo. Tambin se puede obtener informacin acerca de la distribucin espacial de ciertos metabolitos menos abundantes que el H2O como ser aminocidos y carbohidratos. Debido a que es una tcnica no destructiva y no invasiva, se pueden monitorear cambios temporales en ciertos metabolitos. Es posible a partir de la misma muestra grabar una serie de espectros in vivo y luego analizar en el tiempo cmo es la respuesta meWDEyOLFD IUHQWH D FDPELRV HQ HO HVWDGR VLROyJLco del tejido vegetal. RMN versus MS /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVD DFRSODGD D FURPDWRJUDItD JDVHRVD *&06 HV OD WpFQLFD ms utilizada en metabolmica. Sin embargo, la tcnica de RMN est siendo utilizada como una tcnica que brinda informacin complementaria a la que se obtiene con GC-MS. La sensibilidad es tal vez el requisito ms imSRUWDQWH TXH GHEH FXPSOLU XQD WpFQLFD DQDOtWLFD para ser utilizada en metabolmica, ya que una alta sensibilidad favorece el anlisis rpido de una fraccin mayor del metaboloma. La tcnica 1 + 501 TXH WLHQH XQ OtPLWH GH GHWHFFLyQ GH 5 nmoles, es varios rdenes de magnitud meQRV VHQVLEOH TXH OD WpFQLFD *&06 FX\R OtPLWH
de deteccin es de 10-12 mol. Esta diferencia se incrementa an ms si se tiene en cuenta la tcnica de RMN con otros istopos menos abundantes. Se estima que con la tcnica de GC-MS se SXHGH LGHQWLFDU PHQRV GHO GH ORV PHWDERlitos de una clula vegetal si bien todo el metaboloma es potencialmente detectable. Este argumento ignora cualquier diferencia que pudieVH H[LVWLU HQ OD HFLHQFLD GH H[WUDFFLyQ \ GHULYDWL]DFLyQ GH PHWDEROLWRV FX\DV FDUDFWHUtVWLFDV son muy diversas. Otro obstculo que impide un anlisis completo tanto en RMN como en *&06 HV OD GLFXOWDG GH GHWHFWDU FRPSRQHQtes minoritarios en presencia de seales ms intensas. ([LVWHQ RWURV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ OD eleccin de una tcnica o la otra. Uno de ellos es el procesamiento de las muestras. Como se HMHPSOLFR PDV DUULED HQ HO FDVR GH *&06 es necesario realizar una extraccin con solventes y adems derivatizar los compuestos por lo que la preparacin de las muestras es ms laboriosa y adems es ms probable que en la muestra no estn representados todos los metabolitos que existen en el tejido de parWLGD (VWH QR VHUtD HO FDVR GH ODV PXHVWUDV TXH son analizadas por RMN, en donde se pueden obtener espectros a partir de una amplia variedad de materiales sin necesidad de realizar extracciones con solventes. La tcnica de RMN tiene una ventaja para el anlisis cuantitativo y es el hecho de que los espectrmetros modernos son muy estables en comparacin con los GC-MS en donde es necesario realizar calibraciones frecuentes y la variabilidad en los tiempos de retencin pueGHQ FRPSOLFDU VLJQLFDWLYDPHQWH HO DQiOLVLV FXDQWLWDWLYR $PEDV WpFQLFDV JHQHUDQ XVXDOmente mltiples seales lo cual es una ventaja SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH PHWDEROLWRV SHUR D OD vez representa una desventaja en trminos de complejidad espectral. Sin embargo, en MS, algunas de estas multiplicidades se deben al fraccionamiento de la molcula ionizada, complicando el anlisis cuantitativo. En cambio, para el caso de RMN, las seales mltiples provienen de la misma molcula, lo cual perPLWH XQD YHULFDFLyQ FUX]DGD GH ORV GDWRV GH FXDQWLFDFLyQ GH ORV PHWDEROLWRV
Resumiendo, una comparacin entre RMN y GC-MS muestra que esta ltima tcnica es ms sensible aunque el procesamiento de las PXHVWUDV HV PiV ODERULRVR \ OD HFLHQFLD GH H[WUDFFLyQ \ GHULYDWL]DFLyQ QR VHUtD KRPRJHnea para todos los metabolitos. Por otro lado, la facilidad con la que se generan los especWURV \ VH FXDQWLFDQ ORV PHWDEROLWRV \ OD LQIRUmacin complementaria (como ser estructural) que suministra hacen de la tcnica RMN una herramienta de gran utilidad para los estudios metabolmicos. Lectura y sitios recomendados
)LHKQ 2 0HWDERORPLFV WKH OLQN EHWZHHQ JHQRtypes and phenotypes. Plant Molecular Biology 48:155-171 .|FNHQEHUJHU : 1XFOHDU PDJQHWLF UHVRQDQFH PLcro-imaging in the investigation of plant cell metabolism. Journal of Experimental Botany. 2001, 52(356): 641-656. .ULVKQDQ 3 .UXJHU 1- \ 5DWFOLIIH 5* 0HWDEROLWH QJHUSULQWLQJ DQG SUROLQJ LQ SODQWV XVLQJ 105 Journal of Experimental Botany. 2005, 56(410): 255-265. /LVHF - 6FKDXHU 1 .RSND - :LOOPLW]HU / \ )HUQLH $5 *DV FKURPDWRJUDSK\ PDVV VSHFWURPHWU\ EDVHG PHWDEROLWH SUROLQJ LQ SODQWV 1DWXUH SURtocol. 2006, 1(1): 387-396. Ratcliffe RG y Hill YS. Probing plant metabolism ZLWK 105 $QQX 5HY 3ODQW 3K\VLRO 3ODQW 0RO Biol. 2001, 52: 499-526. 6LOYHUVWHLQ 50 \ :HEVWHU ); 3URWRQ PDJQHWLF UHVRQDQFH VSHFWURPHWU\ (Q 6SHFWURPHWULF LGHQWLcation of organics compounds, 1998, 6 edicin, :LOH\ 6RQV 6REROHY $3 6HJUH $ /DPDQQD 5 3URWRQ KLJKHOG NMR study of tomato juice. Magnetic Resonance in Chemistry, 2003, 41: 237-245. 9HUSRRUWH 5 &KRL <+ .LP +. 105EDVHG PHWDERORPLFV DW ZRUN LQ SK\WRFKHPLVWU\ 3K\WRFKHP Rev. 2007, 6:314. :HFNZHUWK : 0HWDERORPLFV 0HWKRGV DQG 3URWRcols. Methods in Molecular Biology Series 358. Humana Press 2007. ZZZPHWDERORPLFVVRFLHW\RUJ 6RFLHGDG GH 0HWDbolmica). Z Z Z V S U L Q J H U R Q O L Q H F R P V J Z F G D I U R Q W S D ge/0,11855,5-40109-70-34409863-0,00.html (SiWLR ZHE GH OD UHYLVWD FLHQWtFD 0HWDERORPLFV UHYLVWD RFLDO GH OD OD 6RFLHGDG GH 0HWDEROyPLFD ZZZPHWDERORPLFVQUSRUJXN 1RUZLFK 5HVHDUFK Park Metabolomics and plants).
ZZZPHWDERORPLFVEEVUFDFXN 5RWKDPVWHG 7KH National Centre for Plant and Microbial Metabolomics). http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd. html (Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology / The Golm Metabolome databases consortium). ZZZQREOHRUJ 1REOH )RXQGDWLRQ 3ODQW %LRORJ\ The Sumner group). ZZZLQIRPHWUL[FRP 'LYHUVRV SDTXHWHV LQIRUPiWLFRV SDUD DOLQHDPLHQWR GH GDWRV FURPDWRJUicos y espectroscpicos y anlisis multivariados: 3&$ 6,0&$ HWF
ZZZPHWDOLJQQO 6RIWZDUH SDUD SUHWUDWDPLHQWR suavizado, estimacin del ruido, correccin de la OtQHD EDVH DOLQHDPLHQWR HWF GH GDWRV GH *& \ LC) http://metacyc.org (La base de datos MetaCyc incluye informacin sobre las rutas metablicas, sustratos, reacciones, enzimas, etc de ms de 150 organismos diferentes).
I CAPTULO 11 Metagenmica
2 0DULR $JXLODU1 y Daniel H. Grasso2 Introduccin (QFDUDPRV HVWH FDStWXOR UHFRQRFLHQGR HO protagonismo de los microorganismos en la vida de nuestro planeta, desde su origen ms remoto. Tenemos el caso de nuestra atmsIHUD ULFD HQ R[tJHQR UHVXOWDQWH GH OD DFWLYLdad fotosinttica de los primeros organismos microbianos, y an hoy los microorganismos aportan la mayor capacidad fotosinttica del planeta. Cada proceso en la bisfera hace uso de la casi ilimitada potencialidad de los microorganismos para transformar el medio que los rodea. El resto de los organismos vivos dependemos en gran parte de ellos gracias a su capacidad de transformar compuestos en nutrientes asimilables, accesibles y requeridos para nuestra forma de vida. En este sentido mencionemos los siguientes ejemplos: La capacidad de transformar el nitrgeno molecular atmosfrico en una forma asimilable por las diferentes formas de vida se encuentra restringida a los microorganismos. Miles de millones de microbios benignos que habitan el intestino nos ayudan a digerir los alimentos, degradar potenciales toxinas y combatir otros microorgaQLVPRV SDWyJHQRV 7DPELpQ QRV EHQHFLDPRV de aquellos microorganismos que son capaces de mantener el medio ambiente libre de contaminantes y xenobiticos. La capacidad de adaptacin de los procariotas, que les permite prosperar y poblar cada ambiente, an aquellos de condiciones extremas tales como los respiraderos hidrotermales del fondo del ocano y los drenajes cidos GH ODV PLQDV \ HXHQWHV LQGXVWULDOHV HV FRQsecuencia de su gran diversidad metablica \ VLROyJLFD $GHPiV GH VX LPSRUWDQFLD GHELdo a su rol esencial en la bisfera, los microorganismos han sido objeto del desarrollo de QXPHURVDV WHFQRORJtDV TXH KDQ FRQWULEXLGR D mejorar la calidad de vida. Son empleados inGXVWULDOPHQWH SDUD SURGXFLU OD PD\RUtD GH ORV DQWLELyWLFRV \ PXFKDV RWUDV GURJDV GH XVR FOtQLco, tambin como agentes de remediacin de
suelos y agua, mejoramiento de la produccin DJUtFROD SURGXFFLyQ GH ELRFRPEXVWLEOHV IHUmentar alimentos para el hombre, etc. $OUHGHGRU GH OD GpFDGD GH ORV PLFURbilogos disfrutaban la percepcin de haber logrado un conocimiento satisfactorio de los miFURRUJDQLVPRV GHO VXHOR $Vt HQ HO DxR HO PLFURELyORJR :DNVPDQ TXLHQ FRQWULEX\y VLJQLFDWLYDPHQWH DO FRQRFLPLHQWR GH PLFURRUJDQLVmos del suelo productores de antibiticos, conFOXtD GLVSRQHPRV GH XQD EXHQD LQIRUPDcin que nos da un panorama claro del mundo PLFURVFySLFR GHO VXHOR 6LQ HPEDUJR RWURV investigadores con iniciativas aisladas y disSHUVDV SHUVLVWtDQ HQ VX DIiQ SRU GHPRVWUDU OD existencia de otras poblaciones microbianas ignoradas, recogiendo evidencias experimentales que cuestionaban esa aparente tranquiOLGDG FLHQWtFD (Q 6WDOH\ \ .RQRSND D partir de la revisin de los datos relacionados a la capacidad de cultivo de microorganismos de muestras ambientales, concluyen en la llamaGD JUDQ DQRPDOtD GHO FRQWHR HQ SODFD (VWD DQRPDOtD HV OD GLVFUHSDQFLD HQWUH ORV YDORUHV de recuento de clulas obtenidos mediante miFURVFRStD \ ORV YDORUHV GH UHFXHQWRV HQ SODFD La conclusin latente, de un conocimiento limitado de los microorganismos del suelo, restringida esencialmente a aquellos que los microELyORJRV KDEtDQ VLGR FDSDFHV GH FXOWLYDU in vitro en sus laboratorios, ha sido tanto abundante como slidamente documentada durante la ltima dcada. El concepto de organismo viable pero no cultivable se hizo evidente con Vibrio cholerae, el cual es viable y virulento cuando se DtVOD GH XQ PHGLR DFXiWLFR SHUR FUHFH HQ FXOWLvo hasta despus de su pasaje por el intestino humano o de ratn. Este tipo de evidencias comenzaron a redirigir la atencin hacia el mundo de los organismos no cultivables, entre las cuales destacamos dos descubrimientos que han tenido una gran relevancia en esta rea. En el primero de ellos se describi mediante curvas GH UHDVRFLDFLyQ '1$'1$ OD GLYHUVLGDG GH ODV bacterias del suelo, encontrndose que era al menos 100 veces mayor que la que puede ser estimada mediante tcnicas dependientes de cultivo. El segundo descubrimiento fue la demostracin de Helicobacter pylori como agente etiolgico de lceras y cncer gstrico. Pese a
que hace ms de un siglo que esta bacteria ha sido observada en la mucosa gstrica, hasta que no fue cultivada no se acept su rol en la enfermedad. /D HFRORJtD PLFURELDQD KD H[SHULPHQWDdo una gran transformacin en los ltimos 25 DxRV GHELGR D OD LQWURGXFFLyQ GH OD ORJHQptica, revolucionando la forma de ver a los microorganismos. El primer hito fue el trabajo de &DUO :RHVH TXLHQ SURSXVR D ORV JHQHV U$51 FRPR FURQyPHWURV HYROXWLYRV :RHVH Posteriormente, Pace y colaboradores utilizaron el anlisis de las secuencias de 5S y 16S U$51 SDUD GHVFULELU OD GLYHUVLGDG GH ORV PLFURorganismos (cultivables y no cultivables) presentes en muestras ambientales (Pace, 1997). Estos primeros trabajos se realizaron secuenFLDQGR GLUHFWDPHQWH HO $51 R VXV UHVSHFWLYDV FRSLDV GH F$'1 (O GHVDUUROOR GH OD WHFQRORJtD GH 3&5 \ HO GLVHxR GH ORV FHEDGRUHV TXH SHUPLWHQ DPSOLFDU HO JHQ FRPSOHWR SHUPLWLy un acceso mayor a este procedimiento por una FRPXQLGDG FLHQWtFD PiV DPSOLD \ D XQD PD\RU diversidad de nichos ecolgicos. La aplicacin GH OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH ORV JHQHV 6 U$51 D SDUWLU GHO $'1 WRWDO GH XQD FRPXQLGDG seguido del clonado y secuenciacin, ha geneUDGR XQD JUDQ FDQWLGDG GH GDWRV \ KD UHGHQLGR la diversidad procariota. Si la muestra ambiental contiene varios tipos diferentes de organismos, se espera entonces encontrar diferentes VHFXHQFLDV GH U$51 FX\D GLYHUVLGDG VHUi XQD medida de la complejidad de la comunidad y HQ HO FRQWH[WR GH XQ iUERO ORJHQpWLFR QRV GLUi quienes son sus miembros. Se ha empleado SDUD FDUDFWHUL]DU HO SHUO SREODFLRQDO GH GLYHUVRV DPELHQWHV QDWXUDOHV $Vt PHGLDQWH HVWH tipo de anlisis se ha demostrado que el suelo es el hbitat de la Tierra ms rico en diversidad procariota, an cuando los mtodos basados en el cultivo in vitro QR SRQHQ GH PDQLHVWR HVD alta diversidad. (O DGYHQLPLHQWR GH QXHYDV WHFQRORJtDV \ procedimientos de anlisis de muestras amELHQWDOHV PHWRGRORJtDV LQGHSHQGLHQWHV GHO cultivo de los microorganismos, con potencialidades distintas para revelar componentes de la comunidad microbiana, impuls un nuevo enfoque de estudio ampliando los horizontes del conocimiento. Se ha denominado con el
trmino metagenmica al anlisis del genoma de comunidades independientemente de las tareas de aislamiento y cultivacin. El conjunto de mtodos desarrollados para acceder al coQRFLPLHQWR VLROyJLFR \ JHQpWLFR GH FRPXQLGDGHV FRPSUHQGH OD H[WUDFFLyQ GLUHFWD GH $'1 de muestras ambientales, clonado de fragmenWRV GH $'1 HQ JHQHUDO R UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GH VHFXHQFLDV GHO JHQ 6 U51$ R genes asociados a funciones tales como metabolismo nitrogenado, antibiosis, etc. (Figura 1). El avance y los logros ya alcanzadas por la metagenmica estn asociados al desarrollo de capacidades tcnicas de secuenciacin de
Figura 1. Bibliotecas metagenmicas. Esquema del proceso de obtencin y anlisis de bibliotecas consWUXLGDV FRQ $'1 H[WUDtGR GLUHFWDPHQWH GH PXHVWUDV ambientales.
$'1 FRQ DOWD HFLHQFLD GH JHQHUDFLyQ GH GDWRV primarios y a la bioinformtica que ha desarrollado herramientas tiles para el procesamiento y anlisis de datos. Los microbilogos encontraron la oportunidad para dirigir sus esfuerzos a una descripFLyQ DPSOLD GH OD GLYHUVLGDG ORJHQpWLFD GH DPbientes comunes y exticos tales como aguas RFHiQLFDV GH VXSHUFLH \ SURIXQGLGDG UXPHQ GH DQLPDOHV VXSHUFLH GH UHGHV \ FDxHUtDV GH agua, aguas termales surgentes y suelo. Ms all de permitirles realizar una descripcin de la comunidad microbiana, con un nivel de resolucin taxonmico preciso, promovi la aceptacin y difusin del concepto ecolgico de consorcio microbiano para lo cual el estudio de microorganismos aislados y cultivados in vitro UHVXOWD LQVXFLHQWH SDUD H[SOLFDU OD IXQFLRQDOLdad y dinmica poblacional. Mirar ms all de los microorganismos que se pueden aislar, alcanzando al metagonoma permitir responder no slo la pegunta cules son los componentes de una determinada comunidad sino an ms importante qu hacen R VHUtDQ FDSDFHV GH KDFHU (Q HO GHVDUUROOR GH HVWH FDStWXOR VH GHVFULELrn las potencialidades de la metagenmica en general, haciendo nfasis en el suelo. El suelo: Un hbitat complejo El suelo constituye un soporte para la vida IRUPDGR SRU SDUWtFXODV PLQHUDOHV GH GLIHUHQWHV IRUPDV WDPDxRV \ FRPSRVLFLyQ TXtPLFD compuestos orgnicos en distintas etapas de degradacin, e inmersos en este medio enconWUDPRV D OD ELRWD $ QLYHO PDFURVFySLFR VH GHtectan complejos de arcilla, materia orgnica, SDUWtFXODV GH DUHQD WRGR HQ VX FRQMXQWR IRUmando agregados que constituyen una matriz. Los procariotes son los componentes predominantes de la biomasa del suelo, los cuales se HQFXHQWUDQ DGKHULGRV R DGVRUELGRV D ODV SDUWtculas del suelo. Dada la heterogeneidad de la matriz del suelo, los microorganismos pueden FRQVWLWXLU PLFURDPELHQWHV VREUH OD VXSHUFLH y en los poros que se forman. La persistencia y el metabolismo de los microorganismos del suelo dependen de la disponibilidad de agua y nutrientes. El suelo es un ambiente que experimenta cambios drsticos en sus niveles
de humedad, pasando desde una saturacin por persistentes lluvias o defectos de drenaje KDVWD SHUtRGRV GH DULGH] (VWR VXJLHUH TXH OD composicin de la comunidad microbiana experimenta ajustes peridicos en respuesta a esos cambios ambientales, aunque se ignora la manera cuali y cuantitativa del impacto de esos efectores. El suelo es un reservorio muy importante de carbono, y son los microorganismos quienes desempean roles protagnicos en el reciclado GHO FDUERQR $VLPLVPR IXQFLRQHV LPSRUWDQWHV tales como la captacin del nitrgeno molecular, la movilizacin de fsforo inorgnico, y la formacin de nitratos residen en actividades microbianas, los cuales impactan en la fertilidad de los suelos (Daniel, 2005). 7HQLHQGR HQ FXHQWD OD FRPSOHMLGDG VLFRTXtPLFD GHO VXHOR \ OD GLYHUVLGDG GH IXQFLRQHV que transcurren en el mismo, es posible imaginar al suelo como un cuerpo orgnico con capacidades metablicas asociadas a poblaciones microbianas diversas, que su vez se FRPSOHPHQWDQ HQWUH Vt HQ IRUPD VHPHMDQWH D lo encontrado entre los rganos de un cuerpo. Coincidentemente con este paralelismo, se ha renovado el enfoque del estudio de los genomas dirigido a la consideracin global de las interacciones mutuas y la coordinacin de la complejidad del sistema, que se lo conoce FRPR ELRORJtD GH VLVWHPDV V\VWHP ELRORJ\ $FWXDOPHQWH HO HVWXGLR GHO WDPDxR \ OD GLYHUsidad de las comunidades del suelo, es un deVDItR SDUD ORV PLFURELyORJRV GH VXHOR TXH VH proyecta en aspectos aplicados tales como la fertilidad de los suelos y su sustentabilidad. Se ha estimado que un gramo de suelo contiene aproximadamente 4 x 107 clulas procariotas. El estudio de esta diversidad puede encararse aplicando mtodos de cultivo directo o mtodos moleculares de metagenmica. Los mtodos tradicionales de aislamiento y cultivos en medios nutritivos y condiciones de laboraWRULR VRQ DSURSLDGRV SHUR LQVXFLHQWHV 6H KD estimado que solamente entre 0.1% y 1.0% de las bacterias de suelo son cultivables, lo cual remarca la magnitud de la comunidad an no examinada. Estos nmeros dan una idea de la magnitud de la complejidad, y del tamao de la caja negra que representa descubrir los
elementos de esa biodiversidad presentes en una pizca de suelo. Es importante tener en cuenta que la metagenmica es aplicable no slo a examinar la diversidad microbiana de un ambiente natural con el objetivo ltimo de lograr el ensamble de genomas a partir de datos fragmentados (meta anlisis), sino tambin revelar un espectro amplio de productos gnicos con potencialidades biotecnolgicas. Mtodos de anlisis El anlisis metagenmico implica el aislaPLHQWR GHO $'1 GH OD PXHVWUD FORQDGR GH IUDJPHQWRV GH $'1 XVDQGR YHFWRUHV SODVPtGLFRV y transformacin en alguna cepa apropiada de la bacteria E. coli )LJXUD $SDUHQWHPHQWH el procedimiento es experimentalmente muy directo sin embargo el metagenoma comprende a numerosos genomas individuales que contribuyen, con distintos grados de representatividad, al tamao y la complejidad del mismo. Esto impacta en el tamao de la muestra a examinar. La etapa siguiente al clonado molecular constituye la oportunidad de aplicar estrategias alternativas y en general exigen la creatividad del investigador a los efectos de maximizar las posibilidades de alcanzar resultados deseables e interesantes. En trminos generales, los procedimientos de anlisis de clones interesantes se pueden agrupar en aquellos basados en seFXHQFLDFLyQ PDVLYD GH $'1 \ HQ DTXHOORV RWURV basados en la expresin heterloga de funcioQHV EXVFDGDV $GRSWDUHPRV HQ HVWH WH[WR HO anglicismo screening para referirnos a la etapa H[SHULPHQWDO GH DQiOLVLV GH FORQHV H LGHQWLFDcin de genes y secuencias de inters. Para lograr una idea de la envergadura de la tarea de screening hagamos la siguiente referencia a algunas estimaciones numricas soEUH HO WDPDxR GHO $'1 PHWDJHQyPLFR - Es muy probable que el nmero de genoPDV GLVWLQWRV SUHVHQWHV HQ HO VXHOR UHHMH HO WLSR \ FDUDFWHUtVWLFDV GHO PLVPR DTXHOORV GHdicados a la agricultura con un buen nivel de materia orgnica y humedad presentarn una diversidad ms amplia que un suelo oligotrpiFR \ FDUDFWHUtVWLFDV H[WUHPDV GH S+ KXPHGDG \R VDOLQLGDG $ SDUWLU GH JUDPR GH VXHOR VH SXHGH REWHQHU HQWUH XJ GH $'1 VHJ~Q
el protocolo de extraccin aplicado y la naturaleza del suelo. Por otro lado y aplicando un procedimiento basado en cintica de reasociacin GH $'1 VH KD HVWLPDGR TXH JUDPR GH VXHOR FRPSUHQGHUtD HQWUH \ JHQRPDV - Segn el vector usado para el clonado del $'1 PHWDJHQyPLFR GH VXHOR VH HVWLPD UHFRmendable examinar ms de 10 7 clones plasPtGLFRV R 6 FORQHV %$&V FRQ LQVHUWRV GH un tamao de 5 kb y 100 kb, respectivamente. 3DUD ORJUDU UHSUHVHQWDFLyQ VLJQLFDWLYD GH ORV genomas de miembros raros de la comunidad (menos del 1%) se ha calculado necesario seFXHQFLDU *E GHO $'1 H[WUDtGR GH VXHOR Por otro lado, se ha estimado en 1013 genes en un gramo de suelo provinentes de al menos 103 HVSHFLHV OR TXH LQGLFDUtD TXH KD\ DO PHQRV 6 genes nuevos en 1 gramo de suelo (Schloss y Handelsman, 2006). El objetivo de establecer el metagenoma teniendo en cuenta estos nmeros adquiere un valor relativo cuando se los pone en el contexto de los recursos tecnolgiFRV \ QDQFLHURV QHFHVDULRV SDUD VX DERUGDMH $FWXDOPHQWH FRQ HO GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV de secuenciacin de alta generacin de datos, basadas en el denominado procedimiento de pirosecuenciacin que no requiere de la construccin de bibliotecas metagenmicas, el tiempo requerido para la resolucin de un metagenoma adquiere una dimensin real. Sin embargo, la limitacin de estos procedimientos consistente en generar lecturas relativamente cortas aproximadamente entre 100 y 200 nucletidos- complica la tarea posterior de ensamble de secuencias parciales en un genoma completo. No obstante, y an haciendo uso de la tecnoORJtD SUHFHGHQWH EDVDGD HQ HO SURFHGLPLHQWR de Sanger, el costo de secuenciacin masiva es caro en general, y ms an para nuesWUR SDtV 6LQ HPEDUJR \ FRPR VH WUDWD HQ ODV VHFFLRQHV VLJXLHQWHV GH HVWH FDStWXOR H[LVWHQ estrategias alternativas a la secuenciacin de bibliotecas metagenmicas, que asisten la bsqueda y resultan tiles para revelar diversidad y descubrir nuevos genes. Screening basado en el anlisis del gen 16S rARN Este mtodo est basado en el anlisis de la
VHFXHQFLD GHO JHQ TXH FRGLFD SDUD HO JHQ TXH FRGLFD OD VXEXQLGDG 6 U $51 GH ORV ULERsomas procariticos. Todos los microorganisPRV SRVHHQ HVWH $51 TXH SUHVHQWD XQD DOWD VLPLOLWXG HQWUH HOORV SHUR FRQ GLIHUHQFLDV VXcientes para su uso como medida de distancias evolutivas. Existe una amplia base de datos de VHFXHQFLDV GHO 6 U$51 GH RUJDQLVPRV GLYHUVRV TXH KD SHUPLWLGR HODERUDU XQ iUERO ORJHntico llamado rbol de la vida. Esto permite XVDU ORV GDWRV PHWDJHQyPLFRV GH 6 U$'1 generado a partir de una determinada muestra DPELHQWDO SDUD SRVLFLRQDU ORJHQpWLFDPHQWH D las distintas secuencias, y eventualmente inIHULU OD ELRORJtD \ HFRORJtD GH ORV PLVPRV (O DQiOLVLV GHO ORV JHQ HV 6 U$51 HV HFRQymicamente accesible a los laboratorios y es til para evaluar diversidad microbiana. En particular, ha sido efectivo para revelar la abundancia de especies, y la estructura poblacional de PXHVWUDV GH VXHOR $JXLODU HW DO /D DPSOLFDFLyQ PHGLDQWH OD 3&5 XVDQGR oligonucletidos cebadores que hibridan las UHJLRQHV FRQVHUYDGDV GH ORV JHQHV 6 U$51 de bacterias y arqueas, genera fragmentos que pueden ser clonados y secuenciados. El WDPDxR GHO $'1 UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GH DSUR[LPDGDPHQWH .E VH LQVHUWD HQ XQ SOiVPLGR YHFWRU WLSR 7$ VHJXLGR GH WUDQVIRUmacin de E. coli (O $'1 XVDGR FRPR PROGH SXHGH VHU HO $'1 PHWDJHQyPLFR R WDPELpQ el proveniente de una biblioteca metagenmica (Furlong et al., 2002). Los datos primarios pueden ser examinados con programas computacionales apropiados que permiten evaluar la predominancia de especies (DOTOUR), y el grado de similitud entre los miembros de dos FRPXQLGDGHV 6216 /,%6+8)) KWWSZZZ libshuff.mib.uga.edu). El mtodo tiene sus limitaciones. Por ejemSOR D SURYHH XQ PDUFR ORJHQpWLFR GH OD FRmunidad pero da informacin escasa sobre la funcionalidad de la misma; b- como todo procedimiento basado en PCR, no todos los geQHV U$51 DPSOLFDQ LJXDOPHQWH UHVXOWDQGR HQ la sub-estimacin de especies, y c los genes 6 U$51 SXHGHQ H[LVWLU HQ P~OWLSOHV FRSLDV no idnticas. Es claro entonces que el anlisis gentico HPSOHDQGR 6 U$51 SURYHH YDOLRVD LQIRUPD-
cin acerca de la diversidad y de la evolucin de poblaciones microbiana, sin embargo el gen 16S representa aproximadamente el 0.05% de un genoma procariota. Se ha demostrado que microorganismos que poseen secuencias GH 6 U$'1 LGpQWLFDV SXHGHQ SRVHHU JHQRPDV PX\ GLVWLQWRV \ SUHVHQWDU GLIHUHQWHV VLRORJtDV \ WHPSHUDWXUDV ySWLPDV GH FUHFLPLHQWR Los miembros de una comunidad microbiana pueden diferir enormemente en sus actividaGHV ELRTXtPLFDV H LQWHUDFFLRQHV QR VyOR HQWUH especies sino dentro de una misma especie. 3RU HQGH OD ORJHQpWLFD QRV GLFH HQ HO PHMRU de los casos quines son los miembros de la comunidad pero muy poco acerca de qu es lo que hace cada miembro. Uno de los prinFLSDOHV REMHWLYRV GH OD HFRORJtD PLFURELDQD HV el poder asociar la identidad de los diferentes microorganismos dentro de un hbitat con los procesos que ellos llevan a cabo en ese ambiente. Los mtodos metagenmicos, que sern discutidos ms adelante, comienzan a dar respuestas a esta segunda cuestin. Construccin de bibliotecas genmicas ambientales Muchos de los mtodos corrientemente utilizados en la construccin de bibliotecas ambientales, son adaptaciones de las tcnicas empleadas para la construccin de bibliotecas de insertos grandes de organismos eucariotas, WDOHV FRPR FORQDGR HQ FURPRVRPDV DUWLFLDOHV %$&V \ OtVLV FHOXODU HQ WDFRV GH DJDURVD 6LQ embargo, en la construccin de genotecas ambientales se encuentran obstculos que no se presentan en la construccin de bibliotecas de organismos aislados. La diversidad de nichos HFROyJLFRV SODQWHD GHVDItRV LQWHUHVDQWHV D OD hora de disear una estrategia adecuada para OD REWHQFLyQ GH XQ $'1 GH FDOLGDG DSURSLDda y que el mismo represente la poblacin de microorganismos presentes en ese ambiente. En la actualidad se han preparado diversas bibliotecas metagenmicas de variados ambientes, en esta seccin discutiremos algunos de ORV DVSHFWRV FUtWLFRV D WHQHU HQ FXHQWD HQ VX preparacin. La primera biblioteca ambiental se constru\y D SDUWLU GH $'1 GH PLFURRUJDQLVPRV RFHinicos, los que fueron concentrados a partir de
DJXD GH PDU DQWHV GH OD H[WUDFFLyQ GH $'1 Sin embargo en el caso de otros habitat tales como el suelo, existen procedimientos alternativos, cada uno con sus ventajas y desventajas. La construccin de una biblioteca metagenmica de suelo se inicia con la toma de muestra. Como las muestras de suelo son heterogneas, ORV GDWRV VLFRTXtPLFRV WDOHV FRPR WDPDxR GH SDUWtFXOD WLSR GH VXHOR FRQWHQLGR GH DJXD S+ temperatura y las plantas que lo cubren son tiles para la evaluacin y comparacin de los resultados obtenidos en estos estudios. Dado que las poblaciones microbianas son grandes, los volmenes de muestras pueden ser pequeos. Durante la toma de muestra necesariamente se generan perturbaciones que pueden PRGLFDU OD FRPSRVLFLyQ GH ODV FRPXQLGDGHV microbianas del suelo, por lo que es importante GLVPLQXLU DO PtQLPR HO WLHPSR GH WUDQVSRUWH \ almacenamiento de la misma. /RV PpWRGRV GH H[WUDFFLyQ GH $'1 VH SXHGHQ GLYLGLU HQ GRV FDWHJRUtDV D OLVLV GLUHFWD GH las clulas contenidas en la matriz de la muesWUD VHJXLGR GH OD VHSDUDFLyQ GHO $'1 GH OD PDtriz y los desechos celulares, o b) la separacin de las clulas de la matriz del suelo seguido por OLVLV FHOXODU (O $'1 FUXGR UHFXSHUDGR SRU DPERV PpWRGRV VH SXULFD SRU ORV SURFHGLPLHQWRV KDELWXDOHV /D UHFXSHUDFLyQ GH $'1 DLVODGR GH diferentes tipos de suelo utilizando ambos tipos de protocolos van desde menos de aproximaGDPHQWH J D J GH $'1 SRU JUDPR GH suelo, sin embargo el rendimiento es entre 10 y 100 veces mayor por lisis directa cuando se compara para una misma muestra. Para lograr la lisis celular directa, se utilizan una combinacin de tratamientos enzimticos, detergente y DOWDV WHPSHUDWXUDV $GHPiV GHO $'1 GH ODV Fplulas procariotas lisadas, tambin se recupera $'1 H[WUDFHOXODU \ HXFDULRWD /RV PpWRGRV GH H[WUDFFLyQ GH $'1 EDVDdos en la separacin de clulas como una etapa previa a la lisis de las mismas, aunque PHQRV HFLHQWHV HQ WpUPLQRV GH FDQWLGDG GH $'1 UHFXSHUDGR VRQ PHQRV GDxLQRV SDUD OD integridad del mismo. La separacin de los microorganismos de la matriz del suelo se logra mediante suaves fuerzas mecnicas como los procedimientos de mezcla, la rotacin del piln HQ PRUWHUR R TXtPLFRV WDOHV FRPR OD DGLFLyQ
de resinas de intercambio catinico, seguido de gradiente de densidad o centrifugacin difeUHQFLDO (Q HVWH FDVR HO $'1 REWHQLGR HV FDVL H[FOXVLYDPHQWH SURFDULyWLFR $GHPiV HO $'1 recuperado por este mtodo parece ser menos contaminado con compuestos de la matriz compuestos, entre ellos sustancias hmicas. $GHPiV HO WDPDxR PHGLR GH ORV $'1 DLVODGRV es mayor que el que suele obtenerse mediante lisis directa y, por lo tanto, es ms adecuado para la generacin de bibliotecas de insertos grandes. Como los diferentes microorganismos del suelo tienen diferentes susceptibilidades a los mtodos de lisis celular, las secuencias preVHQWHV HQ HO $'1 DLVODGR \ HQ ODV ELEOLRWHFDV dependen del mtodo de extraccin. No se ha estudiado cul es el sesgo que se introduce en las bibliotecas debido al mtodo de extraccin, VLQ HPEDUJR HV GH SUHVXPLU TXH HO $'1 DLVODdo por lisis directa represente mejor la diversidad microbiana de una muestra de suelo, ya que este no incluye el paso de separacin de las clulas, por lo tanto sern lisados an los microorganismos que se adhieren fuertemente D ODV SDUWtFXODV El anlisis metagenmico puede requerir de bibliotecas con insertos de tamao grande o pequeo. Las bibliotecas de insertos pequeos VRQ VXFLHQWHV HQ HO FDVR HQ TXH HO DQiOLVLV LQvolucre el estudio de un nico gen o un pequeo grupo de genes. Por el contrario, se requieren insertos mayores para el estudio de rutas metablicas completas, procesos complejos u organizacin genmica. Independientemente del tamao de inserto requerido, la preparaFLyQ GH $'1 HV FUtWLFD SDUD HO p[LWR GHO DQiOLVLV En el caso de emplear digestiones parciales de $'1 SDUD OD FRQVWUXFFLyQ GH OD ELEOLRWHFD VH UHTXLHUH SDUWLU GH XQ $'1 GH XQ WDPDxR SURPHdio 3 veces mayor al de los insertos deseados. Por ende si se desea un inserto de 100 kb se GHEHUi SDUWLU GH XQ $'1 GH WDPDxR SURPHGLR ! NE 8Q $'1 GH HVWH WDPDxR HV PX\ YXOQHrable a las fuerzas de cizalla que se producen en el manipuleo de las soluciones, centrifugaciones, congelado-descongelado, etc. Por ello en estos casos la lisis de las clulas para la OLEHUDFLyQ GHO $'1 \ VX SRVWHULRU GLJHVWLyQ SDUcial con enzimas de restriccin, se realiza en tapones de agarosa.
Dependiendo del tamao promedio de los insertos, las bibliotecas se construyen empleanGR GLIHUHQWHV WLSRV GH YHFWRUHV $Vt ODV GH LQsertos pequeos (menores a 15 kb) emplean YHFWRUHV SODVPtGLFRV HQ WDQWR TXH ODV GH LQsertos de hasta 40 kb hacen uso de csmidos o IyVPLGRV \ %$&V SDUD PiV GH NE /RV YHFWRUHV WLSR %$&V FRQ Q~PHUR GH FRSLD LQGXFLEOH son particularmente tiles, dado que permiten un mantenimiento en la clula husped a bajo nmero de copia, pero permiten el incremento del nmero de copias para facilitar el estudio de expresin. Si bien el husped de eleccin para la construccin y mantenimiento de todas las bibliotecas publicadas es E.coli, es fcil de notar que la bsqueda de fenotipos interesantes se ver restringida a aquellos que nos permita expresar este husped. Se han construido vectores FRVPtGLFRV \ %$&V TXH SHUPLWHQ OD WUDQVIHUHQcia de bibliotecas producidas en E. coli a otros especies huspedes tales como Streptomyces o Pseudomonas 0DUWtQH] HW DO :H[OHU et al., 2005). Screening basado en la expresin funcional Otra forma de acceder al metagenoma, particularmente cuando se trata de ambientes complejos en cuanto a su diversidad poblacional y a su alta densidad de microorganismos diferentes, es la bsqueda de genes que geQHUHQ SURGXFWRV GHQLGRV H LGHQWLFDEOHV R asociados a determinadas actividades que se pueden evaluar in vitro aplicando bio-ensayos. La ventaja ms importante de este abordaje es el desarrollo de un proyecto acotado de menor envergadura que el anlisis alternativo dirigido a la secuenciacin masiva del metagenoma. Este criterio de screening comprende varias estrategias agrupadas dentro de la llaPDGR PHWDJHQyPLFD IXQFLRQDO $ FRQWLQXDFLyQ se describirn algunas estrategias que ilustran formas ingeniosas de abordar el conocimiento del metagenoma con un propsito directo de GHVFXEULPLHQWR \ XVR GH SURSLHGDGHV HVSHFtFDV FRGLFDGDV SRU HO PHWDJHQRPD El usufructo exitoso de actividades microELDQDV R YtDV PHWDEyOLFDV UHTXLHUH GHO ORJUR GH YDULDV HWDSDV FUtWLFDV (Q SULPHU OXJDU HO
$'1 DPELHQWDO GHEH FRQWHQHU HOORV JHQHV TXH FRGLFDQ ODV IXQFLRQHV EXVFDGDV \ HV deseable que las secuencias correspondientes se encuentren representadas en una freFXHQFLD DOWD HQ HO $'1 DPELHQWDO VHJXQGR ORV SURFHGLPLHQWRV GH SUHSDUDFLyQ GHO $'1 metagenmico y de clonado molecular deben permitir la recuperacin e integridad de genes \ RSHURQHV \ QDOPHQWH ORV JHQHV GHEHQ VHU GHWHFWDEOHV JHQpWLFDPHQWH R IHQRWtSLFDPHQWH Resulta obvio al encarar un proyecto de este tipo, que la correcta seleccin del ambiente apropiado, constituya una de las etapas funGDPHQWDOHV SDUD GDUOH XQD EDVH SUREDELOtVWLFD razonable de xito a nuestro diseo experimental. Por ejemplo, en un trabajo publicado por Rhee et al., (2005), cuyo objetivo fue el DLVODPLHQWR GH JHQHV QXHYRV FRGLFDQWHV GH enzimas termoestables con actividad esterasa, se realiz la bsqueda sobre el metagenoma de muestras de suelo de sitios con aguas termales cuyas temperaturas fueron entre 65 y 90 o C (Rhee et al., 2005). Esta consideracin da cierta certeza sobre la presencia de las funciones buscadas en la muestra pero, no asegura que la representacin de los genes buscados HQ HO PHWDJHQRPD VHD VXFLHQWHPHQWH DOWD para lograr su recuperacin. Por ejemplo, la E~VTXHGD GH FORQHV FRQ DFWLYLGDG OLSROtWLFD HQ XQD ELEOLRWHFD SURYHQLHQWH GH $'1 GH VXHOR UHVXOWy HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH XQ FORQ HQWUH 730.000 clones examinados. Con el propsito de aumentar la probabilidad de deteccin de genes de inters se ha recurrido a la inclusin en el diseo experimental de etapas de enriquecimiento previas a la construccin de las ELEOLRWHFDV JpQLFDV (Q OD PD\RUtD GH HVWRV estudios, las fuentes de carbono y/o nitrgeno han sido los criterios selectivos de especies microbianas con genes deseados que son requeridos para su desarrollo en esas condiciones de incubacin. El anlisis metagenmico de cultivos enriquecidos ha demostrado su potencialidad para el aislamiento de genes determiQDQWHV GH IXQFLRQHV FDWDOtWLFDV GHJUDGDWLYDV y nuevos antibiticos a partir de suelo y otros ambientes (Entcheva et al., 2001; Gupta et al., .QLHWVFK HW DO 'DQLHO HW DO Mori et al., 2008). Sin embargo, se deben considerar sus limitaciones: Las poblaciones mi-
crobianas que contienen los genes deseados QR UHVSRQGHQ HFLHQWHPHQWH D ODV FRQGLFLRQHV de enriquecimiento, su crecimiento lento determina baja representacin en la muestra previa D OD H[WUDFFLyQ GH $'1 Los mtodos de screening funcional son potencialmente tiles para descubrir nuevas vaULDQWHV GH IXQFLRQHV LQWHUHVDQWHV 6X HFLHQFLD usando bibliotecas metagenmicas, depende a VX YH] GH OD HFLHQFLD \ VHQVLELOLGDG GHO HQVDyo in vitro y tambin de la compatibilidad del sistema de trascripcin y traduccin de la clula hospedadora para transcribir y traducir el/ los gen(es) contenidos en el clon transgnico. $XQTXH OD ELEOLRJUDItD GHPXHVWUD TXH HO KRVSHdador ms usado es Escherichia coli, el rango de hospedadores se ha ampliado en los ltimos aos a otras microorganismos tales como Streptomyces lividans, Pseudomona putida, y Rhizobium leguminosarum 0DUWtQH] HW DO /L HW DO H LQFOXVR HXFDULRWHV $O Hasani et al., 2003). Esto permitir un mayor acceso hacia la expresin de un amplio rango de actividades gnicas del medio ambiente. El anlisis metagenmico basado en identiFDFLyQ GH FORQHV TXH H[SUHVDQ XQD GHWHUPLnada funcin ha sido exitoso cuando se lo ha combinado al uso de mutantes de E. coli. Por ejemplo, Daniel y su grupo usaron mutantes de E. coli GHFLHQWHV HQ VXV VLVWHPDV DQWLSRUWHU Na+ (Li+)/H+ para descubrir dos antiporters nuevos a partir del screening de una biblioteca de aproximadamente 1,5 x 106 clones. El procedimiento experimental consisti en transferir los clones a E. coli, y evaluar el crecimiento de los transformantes en cajas de petri conteniendo un medio de cultivo con 7,5 mM LiCl (Majernik HW DO $SOLFDQGR XQ SURFHGLPLHQWR VLPLODU VH LGHQWLFDURQ JHQHV SDUWLFLSDQWHV HQ OD ELRVtQWHVLV GH ELRWLQD D SDUWLU GH $'1 GH VXHOR (Entcheva et al., 2001). Por otro lado, la seleccin por resistencia a antibiticos ha conducido al aislamiento de nuevas formas de resistencia a tetraciclina y a aminoglicsidos a partir de muestras de la biota de la boca humana, y de suelo, respectivamente. El descubrimiento de resistencia a aminoglicsidos es un buen ejemplo del uso del VFUHHQLQJ IXQFLRQDO 6H LGHQWLFDURQ FORQHV GH ORV FXDOHV FRGLFDQ SDUD DFHWLOWUDQVIH-
rasas que forman un grupo nuevo. Estos genes resultaron del anlisis de una biblioteca FRQVLVWHQWH HQ *E GH $'1 HTXLYDOHQWH D 6 genes, sugiriendo la obvia y baja representacin de dichos genes en la biblioteca. El uso del procedimiento experimental de seleccin positiva hizo posible su deteccin que de otra manera por ejemplo mediante secuenciacinhubiera resultado una tarea casi imposible. No obstante, el nmero de clones/muestras individuales de una biblioteca que son necesarios examinar, sigue siendo experimentalmente un nmero grande. Con el objetivo de encontrar resultados en tiempo real y examinar un universo grande, se han diseado estrategias de alta productividad (en Ingls son referidas como high-throughput screen), las cuales incorporan sistemas automatizados y robotizados con DOWD WHFQRORJtD LQVWUXPHQWDO Otro enfoque es el estudio de antibiticos nuevos en metagenoma de suelo el cual ha expandido nuestra visin de las comunicaciones entre comunidades microbianas. Se ha encontrado que concentraciones sub-inhibidoras de crecimiento inducen respuesta del tipo qurum sensing, an cuando los compuestos no muestran similitud con las conocidas homoserina lactonas que han sido descritas como inductores naturales en bacterias. Esto sugiere la existencia de un dilogo comunicativo entre microorganismos que activan funciones en el HQWRUQR $GHPiV HVWH KDOOD]JR KD VLGR DGRStado para el screening de molculas que funcionan como inductoras de qurum sensing y eventualmente tambin como antibiticos. Esta oportunidad condujo al diseo de un procediPLHQWR GH VFUHHQLQJ FRQ DOWD HFLHQFLD FXDQWLWDWLYD GH DQiOLVLV GH FORQHV H LGHQWLFDFLyQ GH compuestos que funcionan como inductores de genes que se encuentran bajo el control de un promotor sensible a qurum sensing. Este sensor consiste en el promotor del gen luxR fusionado al gen reportero gfp, residente en un plsmido replicativo en una variante de E. coli que no induce qurum sensing. En el caso que HO $'1 PHWDJHQyPLFR H[SUHVH XQ LQGXFWRU GHO promotor luxR, se sintetizar la proteina GFP UHYHOiQGRVH XRUHVFHQFLD (VWH SURFHGLPLHQWR acoplado a cell sorting DFWLYDGD SRU XRUHVFHQcia, permite capturar aquellos clones potencial-
mente productores de compuestos de quorum sensing (Figura 2) (Lynn et al., 2005; Uchiyama et al., 2005). Otro mtodo de enriquecimiento se basa en el uso de istopos estables, en el cual se administra -como nica fuente de carbono- un sustrato marcado con 13C a una comunidad de miFURRUJDQLVPRV SURYHQLHQWHV GH VXHOR $TXHOOD comunidad bacteriana capaz de utilizar ese sustrato incorporar 13C en sus macromolFXODV SDUWLFXODUPHQWH HQ $'1 GHWHUPLQDQGR TXH HO $'1 VHUi PiV GHQVR TXH HO $'1 QRUPDO de la bacteria. El procedimiento contina con OD XOWUDFHQWULIXJDFLyQ GHO $'1 HQ JUDGLHQWHV GH GHQVLGDG GH &V&O SDUD VHSDUDU HO $'1 PDUFDGR GHO $'1 QRUPDO R QR PDUFDGR (VWH $'1 puede separarse de la columna de gradiente, someterse a dilisis y posteriormente concenWUDUVH SRU SUHFLSLWDFLyQ HWDQyOLFD (O $'1 VH IUDJPHQWD \ FORQD HQ YHFWRUHV SODVPtGLFRV /D biblioteca resultante puede analizarse mediante un screening funcional, o haciendo uso de sondas dirigidas a revelar un determinado gen. El mtodo tiene potencialidad para fraccionar
las poblaciones provenientes del suelo concentrando aquellas asociadas a una funcin (por ejemplo degradacin de un compuesto hidrocarburo que es asimilado). Sin embargo, el mtodo tiene sus limitaciones principalmente generadas por el llamado cross feeding, en el cual bacterias carentes de esa propiedad pueden desarrollar en el medio a expensas de metabolitos provistos por otras bacterias 5DGDMHZDVNL HW DO Lo no cultivable se vuelve cultivable (O HVWXGLR PHWDJHQyPLFR GHO ELROP TXH se forma sobre las aguas que drenan de una mina de hierro abandonada, ubicada en la Iron Mountain en Richmond, California ha permitido establecer la estructura de la comunidad y las IXQFLRQHV PHWDEyOLFDV \ ELRJHRTXtPLFDV (VD agua de drenaje constituye un medio extremadamente adverso, su acidez es de pH 1.0 y posee un alto contenido en metales. Tambin es rica en pirita (FeS2). No hay fuentes asimilables de carbono o nitrgeno ms all de las que pueden derivar del aire. Tyson et al. (2004)
Figura 2 $LVODPLHQWR GH FORQHV SURYHQLHQWHV GH XQ ELEOLRWHFD PHWDJHQyPLFD TXH H[SUHVDQ SURGXFWRV gnicos inductores/activadores de qurum sensing. LuxR es un producto gnico que interacciona con molculas efectoras producidas por microorganismos, activador de un promotor sensible fusionado al gen UHSRUWHUR SDUD *)3 JUHHQ XRUHVFHQW SURWHLQ IDFLOLWDQGR VX GHWHFFLyQ
secuenciaron una biblioteca construida con $'1 H[WUDtGR GHO ELROP \ ORJUDURQ HQVDPblar a partir de datos metagenmicos los genomas de miembros del grupo Leptospirillum y Ferroplasma tipo II, tambin una sustanciosa informacin de otros miembros de la comunidad. El anlisis de estos resultados fue muy VXJHVWLYR /RV DXWRUHV QRWDURQ TXH QR KDEtDQ detectado la presencia de Leptospirillum ferrooxidants, OD HVSHFLH MDGRUD GH 12. Por el contrario, el genoma de la comunidad revel la presencia de miembros pertenecientes a los grupos II y III de Leptospirillum. El gnero Leptospirillum ha sido sub-dividido en 3 gruSRV GH ORV FXDOHV D~Q QR VH KDEtD ORJUDGR FXOtivar a representativos del grupo III. El estudio tambin revel la presencia de genes nif (geQHV GH MDFLyQ ELROyJLFD GH QLWUyJHQR TXH ORV autores asociaron al genoma de Leptospirillum grupo III. Estos datos permitieron concluir que la contribucin de esta poblacin al consorcio GHO ELROP GH OD PLQD iFLGD HV HO DSRUWH GH nitrgeno asimilable, y adems, el conocimiento de las capacidades metablicas inferidas de los datos metagenmicos gui los pasos siguientes dirigidos a lograr la cultivacin en el laboratorio de Leptospirillum grupo III y a la GHQLFLyQ GH OD HVSHFLH L. ferrodiazotrophum (Tyson et al., 2005). De la misma manera, estudiando los datos resultantes, se ha especulado que Ferroplasma y Leptospirillum VS GHULYDUtDQ OD HQHUJtD D SDUWLU GH OD R[LGDFLyQ GHO KLHUUR $GHPiV VH HQFRQWUy TXH WRGRV ORV JHQRPDV muestran genes asociados con la remocin de elementos potencialmente txicos, tales como VLVWHPDV GH XMR GH SURWRQHV \ ERPEDV GH H[clusin de metales (Tyson et al., 2004). El estudio de las comunidades en el drenaje de aguas de la mina cida de Richmond, es un modelo de complementariedad de funciones asignables a miembros del consorcio microbiano. Es posible imaginar que la proyeccin de este modelo de estudio a otros sistemas ambientales no resulte fcil. La extrema adversidad de la mina cida limita la diversidad de genomas en la comunidad y facilit el anlisis El mensaje intrnseco de este descubrimiento de componentes importantes de las comunidades del suelo, aplicando un anlisis metagenmico, es su uso como gua en
la formulacin del medio de cultivo y logro de su cultivacin in vitro. Potencialidades de la metagenmica Las posibilidades que este nuevo campo ofrece son alucinantes. Descifrar la enorme gama de procesos e interacciones que caracterizan las comunidades microbianas en la Tierra puede conducir a avances en la salud humana, la mejora de la comprensin a gran escala de los cambios climticos y atmosfricos, los mtodos para obtener cultivos ms fuertes y nutritivos, nuevos enfoques para la limpieza de la contaminacin ambiental, y el GHVDUUROOR GH QXHYDV IXHQWHV GH HQHUJtD UHQRvable. Estos son slo algunos ejemplos de las muchas posibles aplicaciones prcticas de la metagenmica. El ser humano siempre vivi en un mundo dominado por los microbios, y la estrecha relacin entre los microbios y los seres humanos es un tema antiguo. Las clulas microbianas que viven en el cuerpo humano adulto son diez veces ms numerosos que las clulas humanas. Los genomas microbianos de las comunidades que viven dentro y en el cuerpo humano (el microbioma humano) contiene muchos ms genes que el genoma humano. Estudiar el microbioma humano puede dar lugar a valiosas nuevas herramientas en nutricin humana y animal, el descubrimiento de medicamentos, y en medicina preventiva. Este estudio tambin puede ampliar mucho la profundidad de nuestra comprensin de enfermedades complejas tales como obesidad, el cncer y ciertas enfermedades inmunolgicas, como el asma (Turnbaugh et al., 2006). /D LQPHQVD PD\RUtD GH QXHVWURV PLFURRUJDnismos asociados viven en el intestino. Estos 10 a 100 billones microorganismos desempean funciones tales como la extraccin de nuWULHQWHV \ FDORUtDV GH FRPSRQHQWHV GH QXHVWUDV GLHWDV \ OD VtQWHVLV GH YLWDPLQDV HVHQFLDOHV \ aminocidos. Las bacterias intestinales tamELpQ D\XGDQ D GHWR[LFDU SURGXFWRV TXtPLFRV potencialmente nocivos que pueden estar preVHQWHV HQ OR TXH FRPHPRV $OJXQRV GH ORV PLcrobios que viven en y sobre el cuerpo humano desempean un papel fundamental en la defensa contra agentes patgenos. Esta relacin PXWXDPHQWH EHQHFLRVD QRV D\XGD D SURWH-
gernos de enfermedades al tiempo que se da a los microbios un lugar para vivir. El uso de metagenmica para obtener un conocimiento ms profundo de las comunidades microbianas HQ HO FXHUSR KXPDQR SRGUtD VHU LQPHQVDPHQWH valioso en la comprensin tanto de microbios GDxLQRV FRPR GH EHQHFLRVRV \ SXHGH FRQducir a formas ms efectivas de diagnosticar, tratar y prevenir enfermedades. El enfoque metagenmico ofrece la posibiOLGDG QR VyOR GH DQDOL]DU OD GLYHUVLGDG ORJHQpWLFD GH GLYHUVRV DPELHQWHV \ ELROPV VLQR tambin de localizar los genes y operones que FRGLFDQ SURSLHGDGHV GH LQWHUpV ELRWHFQROygico. La metagenmica ha dado lugar al descubrimiento y caracterizacin de una amplia gama de biocatalizadores, que revela mucho acerca de la diversidad natural de las enzimas \ ORV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ VXV IXQFLRQHV Uno de los principales enfoques para la deteccin de nuevos biocatalizadores implica la deteccin funcional lo que requiere la expresin de genes heterlogos generalmente en Escherichia coli. Mediante el enfoque metagenmico se estudian hbitats tan diversos como intestinos de termitas, el rumen de rumiantes como ciervos o vacas, las muestras de suelo GH ORV GHVLHUWRV \ JODFLDUHV DVt FRPR KiELWDWV extremos como giseres, mar abierto de agua o chimeneas hidrotermales de aguas profundas. Es de esperar que la composicin genmica de las poblaciones microbianas en estos hbitats se diferencien unos de otros, y con ella los biocatalizadores y biomolculas que componen las respectivas bibliotecas metagenmicas. La metagenmica industrial se centra principalmente en procariotes, ya que sus genomas puede ser objeto fcilmente de las herramientas de seleccin funcional disponibles en la actualidad, y porque se supone que la mayor diversidad se encuentra entre estos microorganismos. Las enzimas se utilizan en una amplia gama de aplicaciones e industrias. Su versatilidad permite su uso tanto en los proFHVRV SDUD GHJUDGDU SROtPHURV QDWXUDOHV HQWUH HOORV DOPLGyQ FHOXORVD \ SURWHtQDV DVt FRPR SDUD ODV VtQWHVLV HQDQWLRVHOHFWLYD DVLPpWULFD GH SURGXFWRV TXtPLFRV DXQTXH KD\ PXFKDV PiV aplicaciones. En el ao 2000 Rondon y col. publican las primeras bibliotecas de suelos clonados en
YHFWRUHV GH WLSR %$& 6H JHQHUDURQ GRV ELEOLRtecas metagenmicas una con un tamao de inserto promedio de 27 kb y otra de 44.5 kb. Pese a que el tamao de inserto no es mayor al de una biblioteca convencional construida con vectores de tipo csmido o fago lambda, es la primera publicacin en la que se informa el clonado de fragmentos de ese tamao a partir de ODV SREODFLRQHV PLFURELDQDV GH VXHOR $ SDUWLU GH HVWDV ELEOLRWHFDV ORJUDQ LGHQWLFDU FORQHV que expresan fenotipos tales como, lipasas y amilasas. De igual modo Brady y col, recupeUDURQ D SDUWLU GH XQD ELEOLRWHFD FRVPtGLFD GH $'1 GH VXHOR HO FRQMXQWR GH JHQHV QHFHVDULRV SDUD OD VtQWHVLV GH YLRODFHtQD XQ DQWLELyWLFR GH amplio espectro,. $XQTXH ODV ELEOLRWHFDV PHWDJHQyPLFDV constituyen en la actualidad la herramienta ms poderosa para evaluar la diversidad funcional de comunidades microbianas naturales, no cubren los genomas de baja abundancia en ambientes complejos como los suelos. Como resultado, la frecuencia de clones con un fenotipo deseado en una biblioteca puede ser muy baja. Esto implica la bsqueda y seleccin en PLOHV GH FORQHV OR TXH VLJQLFD XQD WDUHD ODUJD y tediosa. En la actualidad se dispone de equiSRV FRQ WHFQRORJtDV TXH IDFLOLWDQ OD UHFROHFFLyQ de colonias, y la inoculacin en placas de numerosos clones al mismo tiempo. Mientras que la industria de alimentos y de detergentes se concentran en un nmero limitado de reacciones enzimticas y sustratos, las LQGXVWULDV TXtPLFD \ IDUPDFpXWLFD WUDEDMDQ FRQ PLOHV GH PROpFXODV TXtPLFD \ HVWUXFWXUDOPHQWH diversas, y la produccin de cada uno de estos requiere soluciones enzimticas individuales. En consecuencia, debido a la riqueza de biocatalizadores potencialmente tiles, el uso de recursos microbianos es cada vez ms difunGLGR HQ ODV LQGXVWULDV TXtPLFDV \ VRQ FRQVLGHUDGRV LQGLVSHQVDEOHV SDUD OD TXtPLFD RUJiQLFD moderna. Es obvio que existe una amplia demanda de nuevos enzimas y biocatalizadores, y la metagenmica aparece como una de las WHFQRORJtDV FRQ PD\RU SRWHQFLDOLGDG SDUD SURveer de las molculas necesarias. Es creciente la conciencia y la percepcin global de que la disponibilidad de combusti-
bles fsiles no renovables no es sostenible en el futuro prximo, y se deber superar esa GHSHQGHQFLD HQHUJpWLFD $GHPiV ODV HPLVLRnes de gases de invernadero como resultado de la quema de combustibles fsiles son una de las causas principales del calentamiento global. Estos factores determinan la bsqueda de combustibles renovables, y amigables para el medio ambiente sea una de las principales prioridades para el mundo. Una fuente de enerJtD HPHUJHQWH HV HO HWDQRO DOFRKRO GH JUDQR un biocombustible de alto octanaje de derivado GH PDt] FDxD GH D]~FDU R GH RWUR WLSR GH IXHQWHV DJUtFRODV (O HWDQRO FHOXOyVLFR VH IDEULFD D partir de la celulosa que se encuentra en el coP~Q GH ORV GHVHFKRV DJUtFRODV WDOHV FRPR OD EUD GH PDt] WDOORV GH PDt] SDMD GH WULJR \ otras como la biomasa derivada del mijo y el miscanthus. Pero el proceso que convierte la FHOXORVD D SDUWLU GH UHVLGXRV DJUtFRODV D HWDnol utilizable depende de un ingrediente esencial: las comunidades microbianas. En primer lugar, varios tipos de microorganismos deben trabajar en conjunto para transformar la celuloVD D SDUWLU GH GHVHFKRV DJUtFRODV HQ D]~FDUHV Luego, los azcares son fermentados-tambin por los microbios- para producir etanol. Las vacas, con la ayuda de las bacterias, VRQ FDSDFHV GH FRQYHUWLU ODV EUDV YHJHWDOHV FHOXORVD HQ HQHUJtD SHUR HVWH HV XQ SURFHVR complejo para mimetizarlo para la produccin de biocombustibles. La enzima que permite que una vaca digiera ORV SDVWRV \ RWUDV EUDV YHJHWDOHV SXHGH VHU XVDGD SDUD FRQYHUWLU RWUDV EUDV YHJHWDOHV HQ D]~FDUHV VLPSOHV 7UDQVIRUPDU ODV EUDV YHgetales en azcar requiere de tres enzimas. Estas tres enzimas han sido recientemente inWURGXFLGDV HQ XQD YDULHGDG GH PDt] GHQRPLnada Spartan III, que deriva de dos versiones anteriores. La primera versin contiene una enzima que procede de un microbio que vive en agua manantial caliente, y que es capaz de WUDQVIRUPDU HO JUDQ SROtPHUR GH FHOXORVD HQ fragmentos de menor tamao. La segunda versin contiene un gen de un hongo natural que FRGLFD SDUD XQD HQ]LPD FDSD] GH FOLYDU HVWRV fragmentos de celulosa en disacridos. En la ~OWLPD YHUVLyQ VH LQWURGXMR HO JHQ FRGLFDQWH de una enzima capaz de catalizar la hidrlisis
de los disacridos en azcares simples. Este gen fue aislado a partir de microbios presenWHV HQ HO UXPHQ GH YDFD 0HGLDQWH LQJHQLHUtD JHQpWLFD HVWH JHQ KD VLGR PRGLFDGR GH IRUPD tal de dirigir el producto de su expresin hacia vacuolas, de esta forma las enzimas digestivas permanecen almacenadas hasta su cosecha (Sticken, 2008). Estos son algunos ejemplos TXH SRQHQ GH PDQLHVWR OD SRWHQFLDOLGDG GH los enfoques metagenmicos tanto en su propsito biotecnolgico como en el anlisis de ODV FRPXQLGDGHV DPELHQWDOHV (Q GHQLWLYD OD metagenmica surge hoy como una disciplina nueva que nos permitir ampliar nuestro conoFLPLHQWR GH OD PLFURELRORJtD KDVWD GLPHQVLRnes an inimaginables. Lecturas recomendadas
$JXLODU 20 0 9 /ySH] 0 'RQDWR % 0RUyQ 0 ( 6RULD'LD] & 0DWHRV $ *LO6HUUDQR & 6RXVD DQG 0 0HJtDV 3K\ORJHQ\ DQG nodulation signal molecule of rhizobial populations able to nodulate common beans -other than the predominant species Rhizobium etli- present LQ VRLOV IURP WKH 1RUWKZHVW RI $UJHQWLQD 6RLO %LRlogy and Biochemistry 38:573-586. $O+DVDQL . 6LPSIHQGRUIHU . :DUGHQ + 9DGRODV - =DLEDN ) 9LOODLQ 5 DQG ,RDQQRX 3$ 'HYHORSPHQW RI D QRYHO EDFWHULDO DUWLFLDO chromosome cloning system for functional studies. Plasmid 49:184-187. Brady SF, Chao CJ, Handelsman J, Clardy J. 2001. Cloning and heterologous expression of a natuUDO SURGXFW ELRV\QWKHWLF JHQH FOXVWHU IURP F'1$. Org Lett 3:1981-1984. Daniel, R. 2005. The metagenomics of soil. Nature 3:470-478. (QWFKHYD 3 /LHEO : -RKDQQ $ +DUWVFK 7 DQG 6WUHLW :5 'LUHFW FORQLQJ IURP HQULFKPHQW cultures, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial consorWLD $SSO (QYLURQ 0LFURELRO Environmental Microbiology ZZZEODFNZHOOV\QHUgy.com/toc/emi/7/12 )XUORQJ 0$ 6LQJOHWRQ '5 &ROHPDQ '& DQG :KLWPDQ :% 0ROHFXODU DQG &XOWXUH%DVHG $QDO\VHV RI 3URNDU\RWLF &RPPXQLWLHV IURP DQ $JULFXOWXUDO 6RLO DQG WKH %XUURZV DQG &DVWV RI WKH (DUWKZRUP /XPEULFXV UXEHOOXV $SSO (Qviron. Microbiol. 68:1265-1279. .QLHWVFK $ %RZLHQ 6 :KLWHG * *RWWVFKDON * and Daniel, R. 2003. ,GHQWLFDWLRQ DQG &KDUDF-
terization of Coenzyme B12-Dependent Glycerol Dehydratase- and Diol Dehydratase-Encoding *HQHV IURP 0HWDJHQRPLF '1$ /LEUDULHV 'HULYHG IURP (QULFKPHQW &XOWXUHV $SSO (QYLURQ Microbiol. 69:3048-3060. /\QQ / :LOOLDPVRQ %5 %RUOHH 5 6FKORVV 3' *XDQ & $OOHQ +. DQG +DQGHOVPDQ - Intracellular screen to identify metagenomic clones that induce or inhibit a quorum sensing ELRVHQVRU $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 6344. 0DMHUQLN $ *RWWVFKDON * 'DQLHO 5 ScreeQLQJ RI (QYLURQPHQWDO '1$ /LEUDULHV IRU WKH Presence of Genes Conferring Na super(+)(Li VXSHU+ VXSHU $QWLSRUWHU $FWLYLW\ RQ Escherichia coli: Characterization of the Recovered Genes and the Corresponding Gene Products . J. Bacteriol. 183:6645-6653. 0DUWtQH] $ .ROYHN 6- <LS &/< +RSNH - %URZQ .$ 0DF1HLO ,$ DQG 2VERXUQH 06 *HQHWLFDOO\ PRGLHG EDFWHULDO VWUDLQV DQG QRYHO EDFWHULDO DUWLFLDO FKURPRVRPH VKXWWOH YHFtors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in mltiSOH H[SUHVLyQ KRVWV $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 70:2452-2463. 0RUL 7 0L]XWD 6 6XHQDJD + $QG 0L\D]DNL . 2008. Metagenomic Screening for Bleomycin 5HVLVWDQFH *HQHV $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 74:6803-6805. 3DFH 15 $ PROHFXODU YLHZ RI PLFURELDO GLversity and the biosphere. Science 276:734-740. 5DGDMHZVNL 6 ,QHVRQ 3 3DUHNK 15 DQG 0Xrrell, J.C. 2000. Stable isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature 403:646-649. 5KHH -. $KQ '* .LP <* DQG 2K -: 1HZ 7KHUPRSKLOLF DQG 7KHUPRVWDEOH (VWHUDVH ZLWK 6HTXHQFH 6LPLODULW\ WR WKH +RUPRQH6HQVLtive Lipase Family, Cloned from a Metagenomic /LEUDU\ $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 5RQGRQ 05 $XJXVW 35 %HWWHUPDQQ $' %UDG\ 6) *URVVPDQ 7+ /LOHV 05 /RLDFRQR .$ /\QFK %$ 0DF1HLO ,$ 0LQRU & et al.. 2000. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Appl Environ Microbiol 66:25412547. 6WDOH\ -7 DQG .RQRSND $ 0HDVXUHPHQW RI in situ activity of nonphotosynthetic microorgaQLVPV LQ DTXDWLF DQG WHUUHVWULDO KDELWDWV $QQX Rev. Microbiol. 39:321-346. Sticklen, M.B. 2008. Plant genetic engineering for ELRIXHO SURGXFWLRQ WRZDUGV DIIRUGDEOH FHOOXORVLF HWKDQRO 1DWXUH 5HYLHZV *HQHWLFV 7XUQEDXJK 3- /H\ 5( 0DKRZDOG 0$ 0D-
grini, V., Mardis, E.R., and Gordon, J.I. 2006. $Q REHVLW\DVVRFLDWHG JXW PLFURELRPH ZLWK LQcreased capacity for energy harvest. Nature 444:1027-1031. 7\VRQ *: &KDSPDQ - +XJHQKROW] 3 $OOHQ E.E., Ram, R.J., Richardson, P.M., Solovyev, 99 5XELQ (0 5RNVKDU '6 DQG %DQHOG J.F. 2004. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature 428:399-428. 7\VRQ *: /R , %DNHU %- $OOHQ (( +XJHQKROW] 3 DQG %DQHOG -) *HQRPH 'LUHFWHG ,VRODWLRQ RI WKH .H\ 1LWURJHQ )L[HU Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from DQ $FLGRSKLOLF 0LFURELDO &RPPXQLW\ $SSO (QYLronm. Microbiol. 71:6319-6324. 8FKL\DPD 7 $EH 7 ,NHPXUD 7 DQG :DWDQDEH . 6XEVWUDWHLQGXFHG JHQHH[SUHVVLRQ RI environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nature 23:88-93. :DNVPDQ 6$ DQG 6WDUNH\ 5/ 7KH VRLO DQG WKH PLFUREH -RKQ :LOH\ 1HZ <RUN 1< :H[OHU 0 %RQG 3/ 5LFKDUGVRQ '- DQG $QGUHZ : % -RKQVWRQ $ ZLGH KRVWUDQJH PHWDJHQRPLF OLEUDU\ IURP D ZDVWH (QYLURQPHQtal Microbiology 7:19171926 :RHVH &5 %DFWHULDO HYROXWLRQ 0LFURELRO Rev. 51:221271.
I. CAPTULO 12 Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal

N Paniego; R Heinz; P Fernndez; V Lia; C Fusari Introduccin /D %LRLQIRUPiWLFD HV XQD GLVFLSOLQD FLHQWtFD que ha evolucionado rpidamente en los ltimos aos respondiendo al avance y a las necesidades de procesamiento, almacenamiento y anlisis de datos biolgicos derivados de las WHFQRORJtDV DVRFLDGDV D ODV micas, para generar nueva informacin y conocimientos en HO iUHD GH OD ELRORJtD (O FDPSR GH OD ELRLQIRUmtica es multidisciplinario abarcando el desarrollo de bases de datos, el alineamiento de secuencias, la prediccin de estructuras proteiFDV OD FRQVWUXFFLyQ GH iUEROHV ORJHQpWLFRV HQWUH RWURV (Q HVWH FDStWXOR QRV GHGLFDUHPRV HVSHFtFDPHQWH D OD ELRLQIRUPiWLFD DSOLFDGD D OD ELRWHFQRORJtD YHJHWDO SDUWLFXODUPHQWH D cultivos agronmicos y plantas modelo, con el propsito de guiar al estudiante de un curVR LQLFLDO GH ELRWHFQRORJtD YHJHWDO R GH ELRORJtD PROHFXODU GH SODQWDV HQ OD DSOLFDFLyQ GH los conceptos y las herramientas bsicas de la bioinformtica, complementando los conceptos introducidos en la primera edicin de este libro. Este material no pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia, el objetivo es motivar el inters de los estudiantes en la exploracin y el uso de recursos y mtodos computacionales bsicos para el desarrollo de VX DFWLYLGDG FLHQWtFD R SURIHVLRQDO IXWXUD 3DUD ello, describiremos en primer lugar algunas baVHV GH GDWRV HVSHFtFDV GH LQLFLDWLYDV JHQymicas de plantas e introduciremos el concepto de anotacin de datos genmicos. La segunda SDUWH GHO FDStWXOR HVWD GHGLFDGD D OD ELRLQIRUmtica aplicada a estudios de expresin, la bsqueda de marcadores moleculares funcionales y el anlisis de su variabilidad gentica. %DVHV GH GDWRV JHQHUDOHV \ HVSHFtFDV de especie (O XVR GH WHFQRORJtDV GH EDVHV GH GDWRV KD
VLGR DGRSWDGR SRU OD FRPXQLGDG FLHQWtFD GHVde el inicio de las iniciativas genmicas para facilitar la organizacin y la difusin de los datos. (VWR KDFH TXH VH GLVWLQJDQ GLVWLQWDV FDWHJRUtDV de bases de datos, entre las principales estn aquellas que son repositorios pblicos a gran HVFDOD \ EDVHV GH GDWRV HVSHFtFDV GH LQLFLDWLvas comunitarias Los repositorios pblicos a gran escala son bases de datos estables, generalmente mantenidas por agencias gubernamentales, que archivan principalmente informacin esttica, XQ HMHPSOR WtSLFR HV *HQEDQN /D LQIRUPDFLyQ disponible en esa base de datos en particular puede ser accedida a travs de ENTREZ, un buscador que combina la interrogacin simultnea de 35 bases de datos disponibles en HO VLWLR 1&%, $OJXQDV GH pVWDV VRQ EDVHV GH datos secundarias que agregan informacin a ORV GDWRV SULPDULRV VHFXHQFLDV QXFOHRWtGLFDV entre las cuales podemos mencionar Gene, UniGene, HomoloGen o RefSeq. Dentro de las bases de datos comunitarias estn aquellas que almacenan datos derivados de estudios sobre especies modelo, generalmente focalizando en una especie o en un grupo de especies relacionadas. La primera EDVH GH GDWRV GH HVWD FDWHJRUtD HVWDEOHFLGD SDUD HVSHFLHV YHJHWDOHV HV 7KH $UDELGRSVLV ,QIRUPDWLRQ 5HVRXUFH 7$,5 TXH UH~QH OD informacin asociada a esta especie modelo HQ UHODFLyQ D VHFXHQFLDV JHQHV \ SURWHtQDV PDUFDGRUHV DOHORV PDSDV YtDV PHWDEyOLFDV OLWHUDWXUD SURWRFRORV PLFURDUUHJORV RQWRORJtD de genes, anotaciones, disponibilidad de germoplasma/semillas y herramientas de anlisis. En los ltimos aos, ha surgido una nueva generacin de bases de datos que integran la informacin de muchas especies para permitir la comparacin de genomas, entre ellas est Gramene que integra recursos para la compaUDFLyQ GH PDSDV JHQpWLFRV \ ItVLFRV GH DUUR] \ RWUDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV /,6 SHUPLWH la comparacin genmica y de transcriptos de GLVWLQWDV HVSHFLHV GH OHJXPLQRVDV QDOPHQWH 3K\WR]RPH KWWSZZZSK\WR]RPHQHW 7RRO IRU green plant comparative genomics) rene la informacin competa de 14 genomas vegetales, agrupamientos de genes ortlogos, parlogos y familias de genes y herramientas de anlisis
FRPR %/$67 SDUD KDFHU FRPSDUDFLRQHV FRQtra los proteomas de cada una de las especies representadas en la base de datos. La Tabla 1 condensa un nmero importante de bases de GDWRV HVSHFtFDV MXQWR FRQ VXV DFFHVRV :HE para facilitar la exploracin de las mismas. $VLPLVPR H[LVWHQ EDVHV GH GDWRV HVSHFtcas de patgenos que afectan cultivos agronmicamente importantes. Estas bases aportan informacin sobre la secuencia del genoma de los patgenos, la cual puede ser asociada a la informacin derivada de estudios funcionales de transcriptos inducidos durante la interaccin con la planta husped, permitiendo el diseo de estrategias de mejoramiento de los cultivos para lograr resistencia. Entre estas bases de datos se pueden mencionar a: Phytophthora Functional Genomics Database y PathoPlant. Anotacin funcional de los datos genmicos El proceso de anotacin de los datos genPLFRV D QLYHO GH SURWHtQDV FRQVLVWH HQ WUDWDU GH deducir a partir de los datos de secuenciacin QXFOHRWtGLFD ODV FDUDFWHUtVWLFDV IXQFLRQDOHV GHO genoma de un organismo, explorando y describiendo los niveles intermedios de organizacin como funciones y procesos moleculares, ceOXODUHV VLROyJLFRV FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ GH las funciones, etc. Este proceso de anotacin demanda una gran integracin de los datos e informacin disponible para la especie o para especies relacionadas, haciendo uso de herramientas de la bioinformtica para la comparacin y la extraccin de datos y de las bases GH GDWRV JHQHUDOHV \ HVSHFtFDV GHO FRQRFLmiento biolgico acumulado en publicaciones y de los anlisis transcriptmicos o genmicos disponibles. Una de las primeras etapas en este proceso es la de tratar de asignar una funcin molecuODU D OD PD\RUtD GH ODV VHFXHQFLDV LQFyJQLWDV mediante la comparacin con genes de funcin conocida. La forma ms precisa para hacer esta comparacin es a nivel de productos de genes, o sea, trabajando con las secuencias de aminocidos obtenidas a partir de la traGXFFLyQ GH ODV VHFXHQFLDV QXFOHRWtGLFDV D ORV seis marcos de lectura posibles. Este mtodo de comparacin de secuencias, que es central
en el proceso de anotacin funcional, se basa HQ OD FDUDFWHUtVWLFD TXH WLHQHQ ODV SURWHtQDV KRmologas de conservar la misma funcin y se sustenta con bases de datos de secuencias de SURWHtQDV FXUDGDV FXLGDGRVDPHQWH FRPR SRU HMHPSOR 6ZLVV3URW R 3,5 No obstante, puede asumirse en general que ODV EDVHV GH GDWRV GH SURWHtQDV DVRFLDGDV D organismos modelo se encuentran correctamente anotadas y pueden usarse como referencia para inferir posibles funciones moleculares. Sin embargo, para que los procesos de anotacin dentro y entre especies en organisPRV QRPRGHOR VHDQ OR PiV HFLHQWH \ FRPSDrable posible, lo ptimo es referir la anotacin asignada a vocabularios estructurados u ontoORJtDV ([LVWHQ GLIHUHQWHV LQLFLDWLYDV SDUD HVtablecer vocabularios controlados, una de las PiV IUHFXHQWHPHQWH XVDGDV HV OD 2QWRORJtD de genes (Gene Ontology, GO), que establece WUHV FDWHJRUtDV R MHUDUTXtDV ODV IXQFLRQHV moleculares, (2) los procesos biolgicos y (3) la localizacin sub-celular o componente celular. El proceso de anotacin es un proceso continuo que debe ser constantemente actualizado FRQ HO Q GH DJUHJDU QXHYD LQIRUPDFLyQ \ UHnar la informacin existente. Anotacin de secuencias en especies de plantas no-modelo $FRUGH D OR PHQFLRQDGR OD DQRWDFLyQ JHQyPLFD OOHYDGD D FDER HQ OD PD\RUtD GH ORV SURyectos y en especial en los proyectos de pequea envergadura dedicados a la caracterizacin de transcriptos o ESTs, se basan en el uso del DOJRULWPR %/$67 /D FDOLGDG GH ORV UHVXOWDGRV en todos los casos depende de los parmetros GHQLGRV SDUD UHFXSHUDU VHFXHQFLDV VLPLODUHV HQ OD FRPSDUDFLyQ XVDQGR %/$67; R %/$673 recomendndose como parmetros ptimos E valores menores de e-10, identidades mayores a 30% y coberturas mayores o iguales a 50%. Las bases de datos contra las cuales se realizan las comparaciones juegan tambin un rol importante en relacin al nmero y calidad de ORV KLWV UHFXSHUDGRV $OJXQDV GH ODV EDVHV GH GDWRV GH QXFOHyWLGRV \ SURWHtQDV PiV XWLOL]DGDV para la anotacin de secuencias de plantas son los ndice de Genes (DFCI: http://compbio.dfci. harvard.edu/tgi/), Unigenes (NCBI) y PlantGDB
KWWSZZZSODQWJGERUJ /DV EDVHV GH GDWRV GH SURWHtQDV TXH VH XWLOL]DQ HQ JHQHUDO VRQ 15 6ZLVV3URW 7UHPEO 8QLSURW 8QLSURWVZ 8QLSURWWU 8QLUHI \ EDVHV GH SURWHtQDV GH SUR\HFWRV HVSHFtFRV 7DEOD En base al mejor valor de similitud obtenido en la comparacin, se asigna una funcin gnica probable a cada secuencia analizada. Posteriormente, dicha anotacin se mapea contra una base de datos de Gene Ontology SDUD QDOPHQWH DQRWDU ORV SURGXFWRV GH JHnes acorde a las normas del Consorcio de 2QWRORJtD *pQLFD *2 2WURV YRFDEXODULRV controlados complementarios a GO, son la Comisin de Enzimas (Enzyme Comisin, EC)
que adjudica una numeracin basada en una FODVLFDFLyQ HVTXHPiWLFD GH HQ]LPDV VHJ~Q OD reaccin que se encuentran catalizando y el &RQVRUFLR .(** 7KH .\RWR (QF\FORSHGLD RI Genes and Genomes) que genera anotacin GH YtDV PHWDEyOLFDV SDUD DTXHOODV HVSHFLHV que presentan su genoma secuenciado o en YtDV QDOL]DFLyQ /D DQRWDFLyQ IXQFLRQDO EDVDGD HQ RQWRORJtDV SXHGH UHDOL]DUVH XVDQGR VRIWZDUH OLEUH SRU HMHPSOR %ODVW*2 R *2WFKD Expresin de Genes El anlisis de patrones de expresin consisWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH WRGRV ORV WUDQVFULStos presentes en una determinada muestra
Tabla 1: %DVHV GH GDWRV JHQyPLFDV HVSHFtFDV GH HVSHFLH

Bases de datos generales NCBI Plant Genomes Central PlantGDB: plant genome database MIPS plants databases Bases de datos multiespecie para genmica comparativa Phytozome: comparative genomics of plants Gramene: a Resource for Comparative Grass Genomics LIS: Legume Information System SALAD: Surveyed Alignment and Associating Dendrogram SGN: Solanaceas genomic network Bases de datos de genomas de iniciativas genmicas completas y parciales TAIR: The Arabidopsis Information Resource Rice Annotation Project Database (RAP -DB) Grain Genes 2.0: a Database for Triticeae and Avena MaizeDB Medicago truncatula: a model for legume research Lotus japonicus genome Wheat Applied Genomics SoyBase and the Soybean Breeder's Toolbox SoyMap: An integrated map of soybean for resolution and dissection of multiple Brassica rapa genome Compositae genomics projec t Cotton Marker Database Dendrome: a collection of forest tree genome databases and other forest genetic International Grape Genome Project Popu lus Genome Integrative Explorer Bases de datos de diversidad PanZea: Molecular and Functional Diversity of the Maize Genome ToL: Tree of Life Web Project www.panzea.org www.tolweb.org www.arabidopsis.org rapdb.dna.affrc.go.jp wheat. pw.usda.gov/GG2/index.shtml www.maizegdb.org www.medicago.org www.kazusa.or.jp/lotus masw heat.ucdavis.edu soybase.org www.soymap.org/ www.brassica -rapa.org/BRGP/index.jsp compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php www.cottonmarker.org dendrome.ucdavis.edu www.vitaceae.org www.popgenie.db.umu.se www.phytozome.net www.gra mene.org www.comparative -legumes.org salad.dna.affrc.go.jp/salad www.sgn.cornell.edu URL www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html www.plantgdb.org mips.gsf.de/proj/plant/jsf/genomes.jsp
GH WHMLGR (O GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV GH DOWR procesamiento de datos ha permitido abordar estudios de expresin gnica en forma concertada para miles de genes a partir de distintos genotipos en determinados rganos, tejidos, y condiciones de crecimiento. El diseo de los H[SHULPHQWRV GH H[SUHVLyQ DVt FRPR ODV KHrramientas de anlisis de la informacin generada constituyen factores claves para obtener LQIRUPDFLyQ FRQ VLJQLFDGR ELROyJLFR Las distintas estrategias que permiten evaOXDU SHUOHV WUDQVFULSFLRQDOHV SXHGHQ GLYLGLUVH en dos grupos. Un primer grupo corresponde a estrategias en las que la estimacin del nivel de la expresin se basa en la intensidad relativa de una seal de hibridacin e incluye los tradicionales experimentos de northern blot \ ORV PLFURDUUHJORV GH $'1F HQ ORV FXDOHV VH toma la intensidad relativa de la seal como medida de la trascripcin. El otro grupo de estrategias se basa en una cuenta directa del nmero de cada transcripto presente en una muestra, incluyendo la secuenciacin de secuencias expresadas o Expressed Sequence Tags (ESTs), el anlisis de la expresin gnica HQ VHULH R 6HULDO $QDO\VLV RI *HQH ([SUHVLyQ 6$*( \ OD VHFXHQFLDFLyQ PDVLYD HQ SDUDOHOR o Massively Parallel Signature Sequencing 0366 (Q HVWH FDStWXOR VH GLVFXWLUiQ ODV HVtrategias de anlisis de expresin que permiten la evaluacin concertada de un gran nmero de genes en forma procesiva. Expressed Sequence Tags (ESTs): /D VHFXHQFLDFLyQ GH PROpFXODV GH $'1 FRPSOHPHQWDULR $'1F VLQWHWL]DGDV D SDUWLU GH $51 PHQVDMHURV REWHQLGRV GH PXHVWUD ELRlgica en particular, realizada a travs de una nica lectura, da origen a un conjunto de secuencias denominadas ESTs, que representan secuencias parciales de las colecciones origiQDOHV GH $'1F $FWXDOPHQWH OD GLYLVLyQ (67 GH *HQ%DQN cuenta con un total aproximado de 6.000.000 secuencias y se encuentran representadas ms de 100 especies de plantas. /D VHFXHQFLDFLyQ GH $'1F FRQVWLWX\y XQD herramienta alternativa de los proyectos genmicos para el descubrimiento de nuevos genes para distintas especies, cuando la secuenciacin de genomas complejos no contaba con
las actuales tcnicas de secuenciacin masiva que prometen en un futuro cercano capacidad de procesamiento elevada a costos accesibles D OD FRPXQLGDG HQ JHQHUDO $~Q FRQ HO DGYHQLmiento de proyectos genmicos de gran escaOD OD VHFXHQFLDFLyQ GH (67V SHUPLWH OD LGHQWLcacin de genes que se expresan en pocos tejidos y/o su expresin es muy baja, mediante la FRQVWUXFFLyQ GH FROHFFLRQHV GH $'1F QRUPDOLzadas o enriquecidas en determinados transcriptos como las colecciones derivadas de tcnicas de hibridacin sustractiva o Suppressed 6XEWUDFWHG +\EULGL]DWLRQ $VLPLVPR HO DJUXpamiento de ESTs derivados de distintas coOHFFLRQHV GH $'1F SDUD XQD GDGD HVSHFLH HQ grupos o clusters de secuencias no redundantes, utilizando rutinas de anlisis como las esquematizadas en la Figura 1 permite estimar el nmero de genes de una especie. Respecto al anlisis de expresin gnica, los ESTs contribuyen a estos estudios a travs GH GRV YtDV OD SURSRUFLyQ GH (67V FRUUHVpondientes a un determinado gen respecto a un conjunto de ESTs generados en distintas FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV UHHMD HO QLYHO GH expresin del mismo; y 2) en segundo lugar las bases de ESTs se utilizan para el diseo de oligonucletidos en experimentos de microarreJORV GH $'1F SDUD HYDOXDU H[SUHVLyQ JpQLFD Los experimentos de microarreglos representan una de las herramientas ms frecuentes para aproximarse a los anlisis de expresin de genes a gran escala. Una vez que se obtienen los resultados surgen interrogantes como Cules son los genes sobre o sub-expresados en el experimento?, Cules son los SHUOHV GH H[SUHVLyQ TXH SXHGHQ UHYHODUVH HQ general a partir de este experimento? En esta VHFFLyQ HMHPSOLFDUHPRV XQ FDVR GH HVWXGLR para ilustrar el proceso de anlisis utilizando programas de libre distribucin basados en el OHQJXDMH HVWDGtVWLFR 5 %LRFRQGXFWRU (Q HO ,QVWLWXWR GH %LRWHFQRORJtD GH ,17$ Castelar (IB) se dise un microarreglo de $'1F FRQWHQLHQGR VHFXHQFLDV GH WLSR ESTs previamente desarrollados en base a VHFXHQFLDV yUJDQRHVSHFtFDV GH XQD OtQHD GH girasol cultivado). Para la impresin de los miFURDUUHJORV GH $'1F VREUH VRSRUWH GH YLGULR VH DPSOLFDURQ SRU 3&5 ORV IUDJPHQWRV UH-
)LJXUD H%LRSLSHOLQH $ YLVWD HVTXHPiWLFD % SiJLQD LQLFLDO PHQ~ GH SURJUDPDFLyQ \ VDOLGDV del programa.
presentativos de los unigenes anotados en las bibliotecas previamente caracterizadas. Estos PLFURDUUHJORV IXHURQ KLEULGDGRV FRQ $51 WRWDO de plantas crecidas en invernculo y sometidas a dos condiciones de estrs abitico difeUHQFLDOHV IUtR \ VDOLQLGDG 8QD YH] LPSUHVRV los vidrios fueron escaneados (usando canaOHV SDUD DPERV XRUyIRURV D WUHV LQWHQVLGDGHV GLIHUHQWHV XVDQGR HO OHFWRU GH XRUHVFHQFLD 9HUV$UUD\ &KLS 5HDGHU %LR5DG /DV LPiJHnes obtenidas fueron analizadas utilizando el SURJUDPD GH DFFHVR OLEUH 6SRWQGHU ZZZ WPRUJVSRWQGHUKWPO FXDQWLFiQGRVH OD LQtensidad de seal para cada spot. Luego, se realiz una integracin de los datos de las imgenes escaneadas (Figura 2). Preprocesamiento de los datos La imagen obtenida a partir de un microarreglo corresponde a la informacin cruda de un H[SHULPHQWR GH HVWDV FDUDFWHUtVWLFDV (V DVt que los algoritmos computacionales convierten la imagen en informacin numrica que cuanWLFD GLFKD H[SUHVLyQ HVWH HV HO SULPHU SDVR en un anlisis de datos de microarreglos, y es fundamental la calidad y la rigurosidad obteni-
da de la misma para la posterior interpretacin que se obtendr como resultado. Normalizacin La normalizacin es un trmino genrico que VH UHHUH D OD UHVROXFLyQ GH HUURUHV VLVWHPiWLFRV \ GHVYtRV SURGXFLGRV HQ XQ PLFURDUUHJOR debido a condiciones experimentales inevitables y propias de la plataforma utilizada. La normalizacin y el anlisis de expresin global se realizaron en este caso a travs de programas generados utilizando el programa R 8QLYHUVLW\ RI $XFNODQG D WUDYpV GH VX YHUVLyQ 5 KWWSZZZUSURMHFWRUJ /RV GDWRV GH cada vidrio fueron normalizados corrigendo la dependencia por intensidad mediante la utilizaFLyQ GHO VXDYL]DGRU QR SDUDPpWULFR /2:(66 (regresin local ponderada). Se realiz una integracin de los datos de las rplicas tcnicas dentro de cada soporte (cada spot fue impreso 4 veces) y las rplicas tcnicas entre soporWHV LQWHUFDPELR GH XRUyIRURV R dye-swap). Luego de este paso el producto obtenido es una matriz de expresin gnica cuyo anlisis VH IRFDOL]D HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV FRQ expresiones diferenciales.
Figura 2: Imagen de una micromatriz de dos canales (Bello y col. 2006)
Limpieza de datos y transformacin Una vez obtenida la matriz de expresin gnica, existe una serie de pasos que se llevan a cabo para asegurar una alta calidad en el anlisis. Ellos son: la remocin de spots dudosos o FRQLFWLYRV DJJHG IHDWXUHV), que se resuelve ya sea eliminando los spots con error aparente (con el consiguiente riesgo de prdida de datos valiosos), o marcndolos para luego referirlos a la imagen original en el momento de su anlisis; la correccin y/o sustraccin del ruido de fondo (correccin o sustraccin de background). La seal de fondo es indicadora de XQD KLEULGDFLyQ LQHVSHFtFD VLHPSUH \ FXDQGR la intensidad del spot de inters sea mayor que la intensidad del ruido de fondo. Si ocurre al revs, existe la posibilidad que est representando un problema local en el microarreglo y la intensidad del spot se convierta en informacin QR FRQDEOH \ SRU ~OWLPR OD WUDQVIRUPDFLyQ ORJDUtWPLFD GH ORV YDORUHV SDUD KDFHU FRQVWDQWH la variabilidad a todos los niveles de intensidad detectados. Anlisis estadstico de los datos Evaluacin de consistencia en las repeticiones Para evaluar las diferencias asociadas a las repeticiones biolgicas de este experimento se obtuvo una ordenacin de las mismas en un plano de ordenacin generado mediante anlisis de componentes principales aplicado a la matriz de expresiones gnicas. Esta aproximacin tuvo en cuenta la informacin de todos los genes simultneamente y permiti establecer VL XQD UHSHWLFLyQ VH FRPSRUWDED GH PDQHUD DWtpica o no. ,GHQWLFDFLyQ GH JUXSRV GH JHQHV FRQ H[SUHsin diferencial. El anlisis de la matriz de expresin gnica VH IRFDOL]y HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV FRQ H[presiones diferenciales. Existen diversas estrategias para obtener un listado de genes candidatos. La estrategia ms sencilla es aplicar una prueba de hiptesis tradicional gen a gen. Esta aproximacin tiene el inconveniente de generar un gran nmero de falsos positivos. Los mtodos correctivos, basados en el control de
la tasa de falsos positivos, presentan a su vez OD GLFXOWDG GH JHQHUDU XQD DOWD WDVD GH IDOVRV QHJDWLYRV 3RU FRQVLJXLHQWH OD PHWRGRORJtD utilizada en este trabajo consisti en complementar las tcnicas de inferencia clsicas con un criterio de seleccin basado en el ordenamiento de genes y tratamientos en el espacio generado por los dos primeros ejes principales obtenidos de un anlisis de componentes principales de la matriz de expresin gnica. Posteriormente, y dentro del conjunto de genes seleccionados en el paso anterior, se realiz el UHFRQRFLPLHQWR GH JUXSRV GH JHQHV FRQ SHUOHV de expresin similar mediante la aplicacin de XQ DOJRULWPR GH FODVLFDFLyQ QR VXSHUYLVDGD k-centroides para nuestro caso de estudio. El anlisis transcripcional mediante la aplicacin de k-centroides permiti detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresin. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostr variacin en sus niveles medios a travs de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenci sobre-expresin respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrs SRU IUtR R SRU VDOLQLGDG 'H PDQHUD DQiORJD 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observ una sub-expresin respecto del control en ambos tratamientos. Obtencin de la lista de genes diferencialmente expresados Para combinar esta aproximacin, basada HQ OD RUGHQDFLyQ GH JHQHV SRU $&3 \ HO FULWHULR clsico de prueba de hiptesis para igualdad de medias, se consideraron slo aquellos genes que para la prueba clsica de anlisis de la varianza tuvieran un p-valor menor o igual a 0,05 y que estuvieran a un distancia del origen en la Figura 3 mayor que 9 (correspondiente, aproximadamente al percentil 70 de la distribucin de distancias al origen). Este criterio de corte se seleccion teniendo en cuenta el gen 7 *HQEDQN $1 %8 TXH KDEtD VLGR previamente validado experimentalmente. Para cada uno de los 80 genes seleccioQDGRV FRPR JHQHV FDQGLGDWRV VH JUDFy HO SHUO GH H[SUHVLyQ VHJ~Q VX FRPSRUWDPLHQWR HQ FDGD WUDWDPLHQWR D WUDYpV GH XQ JUiFR GH colores de expresin diferencial (heatmap) de
Figura 3. Bi-plot que muestra genes con p-valor para un test F< 0,05 y con una distancia al origen < perFHQWLOR GH OD GLVWDQFLD DO RULJHQ GH OD GLVWULEXFLyQ FtUFXORV UHOOHQRV
modo de analizar cualitativamente el gradiente diferencial por tratamiento y por gen mediante XQ JUiFR GH SHUOHV GH H[SUHVLyQ LQGLYLGXDles. De estos resultados surgieron genes candidatos de inters para su anlisis de expresin diferencial, de los cuales 15 fueron seleccionados para validar mediante la tcnica de PCR cuantitativa (qPCR). Este ltimo paso de validacin es de una herramienta indispensable en el anlisis de microarreglos ya que por todo lo expuesto anteriormente podemos inferir que los genes obtenidos son producto de transformaciones numricas y una evaluacin subjetiva al criteULR HVWDGtVWLFR DSOLFDGR (V DVt TXH SRGHPRV FRQFOXLU TXH OD YDOLGDFLyQ H[SHULPHQWDO FRQHre rigurosidad biolgica a un conjunto de supuestos genes candidatos obtenidos a partir de una lista de genes diferencialmente expresa-
dos para las condiciones evaluadas, producto QDO GH XQ DQiOLVLV GH PLFURDUUHJORV Bsqueda de marcadores funcionales en bases de datos genmicos Como mencionamos anteriormente, la secuenciacin completa de los genomas de especies modelo o parcial de especies de inters ha generado una rpida acumulacin de informacin biolgica que es depositada en bases de datos genmicas y es fcilmente accesible a travs de Internet. Esta informacin, que deriva en muchos casos de la caracterizacin de OtQHDV HOLWH GH XQD PLVPD HVSHFLH GH HVSHFLHV de un mismo gnero o de distintas fuentes relacionadas, constituye el recurso que permite sistematizar el desarrollo de marcadores moleculares potencialmente asociados a la variaFLyQ IHQRWtSLFD SDUD FDUDFWHUHV GH LQWHUpV (O
potencial de descubrir marcadores moleculares funcionales analizando las secuencias depositadas en las bases de datos generales, fundamentalmente de ESTs, ha permitido superar una de las limitaciones ms importantes GH ORV PDUFDGRUHV PROHFXODUHV ORFXVHVSHFtco que es el costo inicial de desarrollo. ,GHQWLFDFLyQ LQ silico de SNPs /RV SROLPRUVPRV GH QXFOHyWLGR VLPSOH (SNPs) o los generados por pequeas inserciones/deleciones (Indels) se han convertido en una de las herramientas ms utilizadas para la caracterizacin gentica tanto de plantas como de animales debido a su baja tasa de mutacin y a su gran abundancia, ubicuidad y dispersin en los genomas. Su uso se ha extendido a aplicaciones tales como la construccin de mapas genticos de alta resolucin, mapeo de asociacin, estudios de diversidad JHQpWLFD \ FRQVHUYDFLyQ LGHQWLFDFLyQ \ DQiOLsis de la estabilidad de cultivares, delimitacin \ DVLJQDFLyQ GH JUXSRV KHWHUyWLFRV DQiOLVLV logenticos, seleccin asistida por marcadores y caracterizacin de recursos genticos. Un SNP representa una diferencia en una EDVH QXFOHRWtGLFD HQWUH VHFXHQFLDV GH $'1 y puede ser categorizada como transicin (C/T RU *$ R WUDQVYHUVLyQ &* $7 &$ R 7* GH DFXHUGR D OD VXVWLWXFLyQ QXFOHRWtGLFD REVHUYDda. El uso de marcadores SNP para cualquiera de las aplicaciones mencionadas requiere de una primera etapa de deteccin y desarrollo que puede ser abordada a partir de una estrategia de laboratorio (ej. secuenciacin y comparacin de genes o regiones candidatas en un conjunto de materiales de inters) o bien estar basada en aproximaciones in silico que hacen uso de la informacin de secuencia disponible en las bases de datos biolgicas. En este ltimo caso, el procedimiento de bsqueda generalmente involucra un protocolo de pocos SDVRV 3ULPHUR VH LGHQWLFDQ VHFXHQFLDV FRQ alta similitud entre mltiples individuos a partir de una o varias bases de datos previamente seleccionadas en funcin del organismo o tipo de carcter que se desee estudiar, utilizando habitualmente los algoritmos de bsqueda de VLPLOLWXG GH VHFXHQFLDV GH WLSR %/$67 %DVLF /RFDO $OLJQPHQW 6HDUFK 7RRO 3RVWHULRUPHQWH
se realizan los alineamientos base a base para cada uno de los grupos de secuencias y los mismos son analizados para detectar las difeUHQFLDV QXFOHRWtGLFDV R 613V /D ULJXURVLGDG \ detallada evaluacin de esta instancia es fundamental para encontrar verdaderas variantes allicas dentro de los diferentes grupos. Es por ello que se encuentran disponibles diverVDV KHUUDPLHQWDV HVWDGtVWLFDV TXH SHUPLWHQ GLferenciar los errores de secuenciacin de las verdaderas variantes allicas basndose en el valor de calidad de la base secuenciada y en medidas de exactitud de la secuencia. Los programas desarrollados para la deteccin de SNPs, tanto para uso acadmico (PolyBayes y PolyPhred) como aquellos sujetos a licencias comerciales (Sequencher, Gene Codes Corporation) utilizan los datos de calidad de secuencia para eliminar los falsos positivos o incorporan el concepto de velocidad de mutaciones esperadas para distinguir los verdadeURV 613V $VLPLVPR HVWRV SURJUDPDV RIUHFHQ OD YHQWDMD GH SUHVHQWDU XQD LQWHUIDVH JUiFD y pueden ser usados tanto para comparacin de secuencias cortas como para estimar SNPs dentro de largas regiones genmicas. Muchos grupos han explorado adems mtodos alternativos de deteccin de SNPs basados en el XVR GH PLFURDUUHJORV GH $'1 GH DOWD GHQVLGDG ,GHQWLFDFLyQ LQ silico de SSRs Los microsatlites (repeticiones en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos) son herramientas muy tiles como marcadores JHQRWtSLFRV GHELGR D TXH VRQ UHODWLYDPHQWH abundantes, multiallicos (hipervariables con respecto al nmero de repeticiones), heredados en forma estable y codominantes (se distinguen los alelos de un locus), permitiendo distinguir materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de vista metodolgico, son fciles de detectar mediante PCR, requiriendo SRFD FDQWLGDG GH $'1 SDUD HO DQiOLVLV \ SRFR equipamiento. /D LGHQWLFDFLyQ in silico de SSRs a partir de la abundancia de secuencias genmicas disponibles para genomas vegetales, al igual que para los SNPs, se ha convertido en la alternativa ms econmica de desarrollar este tipo de marcadores haciendo uso de herramientas
FRPSXWDFLRQDOHV HFLHQWHV $VLPLVPR HV PX\ frecuente poder asociar una funcin molecular determinada por similitud a la secuencia que alberga la repeticin convirtindolo en un marcador funcional. Existen distintas herramientas computaFLRQDOHV EDVDGDV HQ OD ZHE SDUD HO GHVFXEULmiento de SSRs y el diseo de iniciadores esSHFtFRV SDUD OD DPSOLFDFLyQ GH ORV PLVPRV Se pueden mencionar como ejemplos el programa SSRPoly accesible desde el sitio http:// acpfg.imb.uq.edu.au/ssrpoly.php, que permite OD LGHQWLFDFLyQ GH 665 SROLPyUFRV TXH VH GLVWLQJXHQ GH ODV YDULDQWHV PRQRPyUFDV SRU la representacin de tamaos variables del miFURVDWpOLWH LGHQWLFDGR HQ DOLQHDPLHQWRV P~OWLples de secuencias representadas en la bases de datos. Otra herramienta valiosa disponible HQ OD ZHE HV &8*, 665 6HUYHU KWWSZZZJHQRPHFOHPVRQHGXFJLELQFXJLBVVU). Anlisis de la variabilidad gentica Finalizada la etapa de desarrollo de marcadores moleculares, la fase siguiente generalPHQWH FRQVLVWH HQ OD JHQRWLSLFDFLyQ GH JUDQGHV FDQWLGDGHV GH LQGLYLGXRV D Q GH GHWHUPLQDU las variantes allicas presentes en cada uno de ellos para cada uno de los marcadores detecWDGRV /D HOHFFLyQ GH OD PHWRGRORJtD PDV DSURpiada depender de los recursos disponibles y del nivel de procesamiento que se desee alcanzar. Entre las ms utilizadas para el caso de los SNPs pueden mencionarse: secuenciacin GLUHFWD DPSOLFDFLyQ DOHORHVSHFLFD SRU UHDFcin en cadena de la polimerasa (PCR), mtodos de digestin enzimtica, hibridacin con ROLJRQXFOHyWLGRV DOHORHVSHFtFRV \ SRU ~OWLPR las plataformas de microarreglos GoldenGate H ,QQLXP GHVDUUROODGDV SRU ,OOXPLQD ,OOXPLQD 6DQ 'LHJR &$ 86$ /D WHFQRORJtD GH 613V SUHVHQWD XQ JUDQ SRWHQFLDO SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ODV IRUPDV DOpOLcas que controlan procesos biolgicos complejos, como la resistencia a los estreses biticos y abiticos que afectan la productividad de los cultivos. Sin embargo, para ser aprovechado en su totalidad, este potencial debe ser comELQDGR FRQ PHWRGRORJtDV DQDOtWLFDV DSURSLDGDV (Q ORV ~OWLPRV DxRV ODV PHWRGRORJtDV GH mapeo por asociacin han surgido como com-
plemento de las aproximaciones convencionales (ej. Mapeo de QTLs) y han ido cobrando cada vez ms importancia como herramientas para alcanzar un mayor grado de resolucin. En pocas palabras, el razonamiento subyacente al mapeo de asociacin consiste en utilizar eventos de recombinacin histricos a lo largo de un linaje, y no solamente aquellos ocurridos en una determinada poblacin de mapeo, para establecer posibles relaciones entre genotipo \ IHQRWLSR /RV SROLPRUVPRV UHVSRQVDEOHV GH OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD QR VRQ REVHUYDGRV HQ forma directa, si no que surgen a partir de inIHUHQFLD HVWDGtVWLFD /D EDVH SDUD OD GHWHFFLyQ de tales correlaciones es la asociacin no aleaWRULD HQWUH XQ SROLPRUVPR GDGR \ OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD SDUD FLHUWR UDVJR GH LQWHUpV HV GHFLU OD LGHQWLFDFLyQ GH GHVHTXLOLEULR GH OLJDPLHQWR (DL) entre las variantes genticas causales de OD YDULDFLyQ GHO FDUiFWHU \ ORV SROLPRUVPRV analizados. Previo a cualquier estudio de mapeo por asociacin, y para realizar un diseo experimental apropiado, es necesario conocer el grado y la estructura genmica del DL en la especie a evaluar, ya que ste es variable tanto entre especies como para las diferentes regiones de un mismo genoma. Las dos medidas preferiGDV HQ OD OLWHUDWXUD SDUD FXDQWLFDU '/ VRQ HO FRHFLHQWH GH GHVHTXLOLEULR HVWDQGDUL]DGR ' y la correlacin de frecuencias allicas al cuadrado (r2). La estimacin del DL generalmente involucra grandes cantidades de marcadores, razn por la cual suelen resultar tiles las heUUDPLHQWDV GH VRIWZDUH TXH SHUPLWHQ VLVWHPDWLzar el clculo de ambas medidas y representar JUiFDPHQWH ODV DVRFLDFLRQHV KDOODGDV SRU HM '1$VS $UOHTXLQ *ROG *ROG6XUIHU El desarrollo de un estudio de mapeo por DVRFLDFLyQ LQYROXFUD OD HYDOXDFLyQ IHQRWtSLFD del carcter agronmico de inters (ej. peso GHO JUDQR FRQWHQLGR GH DFHLWH GtDV D RUDFLyQ $8'3& HWF \ OD JHQRWLSLFDFLyQ GH XQ conjunto apropiado de SNPs para cada una de ODV HQWLGDGHV D FRPSDUDU OtQHDV YDULHGDGHV HWF (O Q~PHUR \ QDWXUDOH]D GH ORV SROLPRUVmos a caracterizar depender de la estrategia de anlisis que se haya seleccionado. Si se GHVHD H[SORUDU WRGR HO JHQRPD JHQRPHZLGH analysis) el nmero de SNPs ser mucho ma-
yor (entre 10.000 y 100.000) que el requerido VL VyOR VH HVWXGLDQ ORV SROLPRUVPRV FRUUHVpondientes a un grupo de genes candidatos. Sin embargo, en este ltimo caso es necesario un conocimiento previo de la base gentica del FDUiFWHU IHQRWtSLFR HQ HVWXGLR 2WUR DVSHFWR importante del diseo experimental es la seleccin de individuos. En humanos generalmente HV OD XWLOL]DFLyQ GH PHWRGRORJtDV EDVDGDV HQ poblaciones de enfermos vs. controles sanos (case-control) o aquellas que involucran individuos relacionados o familias en donde algn individuo es enfermo (Transmission disequilibrium tests). En plantas, los individuos de la poblacin en estudio usualmente incluyen gerPRSODVPD GH GLVWLQWR RULJHQ JHRJUiFR FRQ HO objeto de abarcar la mayor cantidad posible de YDULDFLyQ JHQpWLFD \ IHQRWtSLFD /DV LQIHUHQFLDV HVWDGtVWLFDV GHO PDSHR SRU asociacin para rasgos continuos son generalmente realizadas a travs de anlisis de regresin lineal, si bien tambin son aplicables otras aproximaciones. Dado que existen diversos factores que pueden llevar al establecimiento de asociaciones espurias, se han desarrollaGR PRGHORV HVSHFtFRV HQ GRQGH HV SRVLEOH incorporar las distintas variables intervinientes y controlar su efecto en la deteccin de asociaciones. Entre los procesos que pueden interferir en el anlisis se encuentran: la subestructuracin de las poblaciones estudiadas, las interacciones epistticas y pleiotrpicas, las interacciones entre genotipo y ambiente, el tamao muestral pequeo, la complejidad del carcter en estudio y la calidad de los registros IHQRWtSLFRV (O VRIWZDUH 7DVVHOO HV XQR GH ORV paquetes ms utilizados para los estudios de asociacin en plantas ya que incluye metodoloJtDV TXH SHUPLWHQ WHQHU HQ FXHQWD OD HVWUXFWXUD poblacional y el grado de parentesco entre los individuos analizados. En conclusin, el mapeo por asociacin constituye una poderosa herramienta para la diseccin gentica de caracteres complejos, siendo los SNPs marcadores ideales para la implementacin de tales estudios dada su alta frecuencia y ubicuidad en los genomas.
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PARTE II Mtodos para generar y analizar diversidad
II CAPTULO 1 Polinizacin y fertilizacin in vitro

Susana Cardone, Gladys Prez Camargo, Aurora Picca 1 Introduccin Durante la reproduccin sexual de las Angiospermas los procesos de polinizacin y fecundacin conducen a la unin de las gametas masculina y femenina para formar el embrin, que junto con el endosperma darn origen a la semilla, que generar una nueva planta. La fecundacin contribuye a la diversidad gentica y proporciona la base sobre la que se trabajar HQ WRPHMRUDPLHQWR El hecho ms notable de la fertilizacin in vivo de las Angiospermas es el de la doble fecundacin, que es un fenmeno muy complejo en comparacin con lo que acontece en todos los dems seres vivos. Para que la polinizacin se produzca, durante el desarrollo in vivo, deben ocurrir una serie de interacciones y seales entre el grano de polen y los diferentes tejidos del pistilo. El grano de polen hace contacto con las clulas receptivas del pistilo
(clulas papilares del estigma) que permiten su adhesin, hidratacin y germinacin, extendiendo su intina y generando un tubo polnico, cuya funcin es transportar las clulas espermticas hacia el vulo. En ese momento se desorganiza el ncleo vegetativo mientras que la clula generativa dar lugar a las dos clulas espermticas que se vuelcan en una de las sinrgidas, sta se desorganiza y uno de los ncleos espermticos se fusiona con la osfera para dar el cigoto, que luego producir el embrin. El otro ncleo masculino se reunir con dos ncleos femeninos para dar la clula madre del endosperma que es, por lo tanto, triploide (Fig 1). Durante la evolucin de las plantas superiores, surgieron diferentes barreras de cruzamiento que controlan la transferencia de genes de una especie a otra o dentro de la misma especie. A veces, el polen no puede germinar sobre el HVWLJPD GH OD RU DXQTXH pVWH VH KDOOH UHFHStivo. Este hecho puede deberse a limitaciones JHQpWLFDV R VLROyJLFDV (VWDV EDUUHUDV VH GHnominan de prefertilizacin o precigticas y pueden ser eludidas mediante las tcnicas de polinizacin in vitro.
Figura 1. Corte longitudinal de un vulo mostrando la doble fecundacin en Angiosperma
Otras veces, a pesar de la ocurrencia de la polinizacin, la fecundacin no puede llevarse a cabo, por diversos motivos. El trmino fertilizacin in vitro se utiliza para aquellos casos donde la fusin de las gametas aisladas se logra por distintos mtodos como la electrofusin, altas concentraciones de calcio o elevado pH. En este captulo se utilizarn indistintamente los trminos fecundacin y fertilizacin FRPR VLQyQLPRV UHULpQGRVH D OD XQLyQ GH ODV gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. En ocasiones, la fecundacin ocurre normalmente pero el embrin aborta en forma precoz. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilizacin o poscigticas, que pueden contrarrestarse con tcnicas de rescate embrionario. Frente a todas estas limitaciones, las tcnicas de cultivo in vitro y manipulacin de clulas aisladas resultan apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrin y del endosperma y la obtencin de semillas normales. Una de esas tcnicas, desarrollada por Kanta y colaboradores (1962), demostr que en algunas especies de Papaverceas los granos de polen tenan la capacidad de germinar in vitro, directamente sobre los vulos en cultivo. A partir de la misma, surgen una serie de metodologas que se conocen en general como tcnicas de polinizacin in vitro. Las tcnicas de micromanipulacin desarrolladas durante los aos 80 permitieron el aislamiento y la fusin in vitro de gametas de Angiospermas. La combinacin de estas tcnicas con mtodos de cultivo de clulas nicas, posibilitaron la fertilizacin in vitro. Se pudo entonces concretar el desarrollo de cigotos y de endospermas en forma individual, in vitro, demostrando que son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del tejido materno. Tanto los cigotos obtenidos in vitro como los que son aislados despus de la polinizacin in vivo desarrollan en embriones normales y posteriormente en plantas frtiles. Los sistemas de polinizacin y fertilizacin in vitro pretenden salvar las barreras pre y postfertilizacin para obtener plantas frtiles. Los recientes progresos relacionados con estas metodologas, conjuntamente con los
proyectos de genmica, posibilitarn una mejor comprensin de los procesos de reconocimiento gamtico, fusin y activacin de seales intracelulares que participan en los eventos tempranos de desarrollo del huevo y formacin del cigoto. Estos conocimientos permitirn una DSOLFDFLyQ PiV HFLHQWH GH HVWDV WpFQLFDV HQ ORV SURJUDPDV GH WRPHMRUDPLHQWR 2 Polinizacin in vitro En algunas especies, las barreras de prefertilizacin impiden la autofecundacin o el cruzamiento, por diferentes mecanismos genticos o bioqumicos. La incapacidad del polen de germinar en estigmas propios o extraos se denomina incompatibilidad. Esta puede deberse a varias razones: por ejemplo que el tubo polnico se deshaga en el estilo, o a la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo debido a una lenta velocidad de crecimiento, o a una excesiva longitud del estilo. En estos casos, el ovario aborta antes de que el tubo polnico alcance la base del estilo. Las barreras que obstaculizan los cruzaPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV QR VRQ GHPDVLDGR FRnocidas, aunque es evidente la existencia de interacciones en el proceso de reconocimiento polen-pistilo. Los mecanismos que originan la imposibilidad de los cruzamientos intraespecFRV VRQ PXFKR PiV FRQRFLGRV 3RU HMHPSOR el de la autoincompatibilidad, que involucra interacciones polen-pistilo que determinan la inhabilidad de una planta hermafrodita para producir cigotos, a travs de la autopolinizacin. En este sistema, el intercambio de informacin entre el polen y el tubo polnico permite al estigma y al estilo discriminar el polen de plantas idnticas del proveniente de otros miembros de la misma especie. Existen dos grandes sistemas de autoincompatibilidad, que se diferencian en sus estrategias moleculares y genticas: a) autoincompatilidad esporiftica, en ella, el resultado de la polinizacin est deteminado por el genotipo de la planta en la que se ha formado el grano de polen. En este tipo de incompatibilidad, presente en la familia de las Brasicceas, protenas de bajo peso molecular provenientes del polen, difunden desde la
exina e interactan de manera allica con un receptor quinasa, localizado en las clulas del estigma. Dicha interaccin estimula la actividad fosforilante del receptor y se produce el EORTXHR GH OD KLGUDWDFLyQ HVSHFtFD GHO JUDQR de polen, impidiendo su germinacin. b) autoincompatibilidad gametoftica en la cual, la ocurrencia de la polinizacin est determinada por el genotipo haploide del polen. Bajo este sistema se encuentran dos mecanismos diferentes: Uno es tpico de las Papaverceas. En este, las seales de autoincompatibilidad se traducen por medio de protenas, FRGLFDGDV SRU XQ JHQ HVSHFtFR TXH generan la movilizacin del calcio, fosforilando protenas del polen que desencadenan la muerte celular del tubo polnico. En el otro mecanismo, presente en SolaQiFHDV XQ ORFXV HVSHFtFR HO ORFXV 6 FRGLFD SDUD 51$VDV TXH DFW~DQ VREUH ORV WXERV SROtQLFRV GHJUDGDQGR DO $51 GHO polen propio, inhibiendo su crecimiento.
El injerto del estilo, en la cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. La polinizacin de vulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. En esta tcnica los vulos son separados de su placenta; por esta causa es un procedimiento mucho ms complicado, que ha sido empleado con xito slo en pocas especies de plantas. La polinizacin placental, tcnica en la cual los vulos se ponen en contacto con el polen por remocin de la pared del ovario o a travs de un corte en la parte superior del mismo. En esta metodologa los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los vulos no resultan daados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El cultivo del vulo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rpido desarrollo embrionario.
Para sortear estas incompatibilidades surgieron tcnicas de polinizacin in vitro. La primera, desarrollada en Papaver somniferum, ha sido tambin empleada exitosamente en 14 familias de Angiospermas, resultando ms adecuada su aplicacin en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos vulos. Dentro de las especies de plantas en las que se abord la tcnica se pueden citar Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. Bajo el nombre de polinizacin in vitro se suele englobar a varias metodologas que VXUJLHURQ D SDUWLU GH PRGLFDFLRQHV GHO SURFHdimiento inicial, que si bien poseen puntos en FRP~Q GLHUHQ HQ RWURV (QWUH HVWDV PHWRGRlogas se encuentran: La polinizacin estigmtica, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma.
La polinizacin placental in vitro se ha utilizado con xito para salvar las barreras de incompatibilidad precigticas (autoincompatiELOLGDG H LQFRPSDWLELOLGDG LQWHUHVSHFtFD HQ varias especies, inclusive cuando, experimentalmente, se intent el cruzamiento a partir de vulos de Angiospermas con polen proveniente de Gimnospermas. En este caso, al realizarse el anlisis embriolgico de los vulos de la especie Melandrium album, MDGRV WUHV GtDV despus de la polinizacin con polen de Pinus wallihiana, se observ la presencia de remanentes de tubos polnicos y embriones bicelulares en los sacos embrionarios. La polinizacin con polen mentor Se ha utilizado, en muchas especies de plantas, una estrategia para salvar las barreras de incompatibilidad, involucrando mezclas de polen no compatible con polen compatible muerto (denominado mentor). El rol del polen mentor es proveer alguna funcin, por ejemplo, a travs del aporte de sustancias proteicas,
las que facilitan la polinizacin del polen incompatible. Alguna de las especies en las que se ha utilizado son: Populus, Malus, Petunia y Nicotiana. Finalmente, en todos los casos, la gameta femenina es fecundada por clulas espermticas, liberadas por el tubo polnico, en forma casi idntica a la va natural, con la consiguiente formacin de semilla normal en un medio de cultivo apropiado. En general, todos los medios de cultivo para germinacin de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de cido brico. 1R REVWDQWH SDUD TXH ORV SURFHGLPLHQWRV anteriormente citados sean exitosos es crucial realizar el aislamiento de los vulos y del polen HQ HO HVWDGR VLROyJLFR DGHFXDGR SRU OR TXH es indispensable llevar a cabo la determinacin de la duracin de los distintos estadios del desarrollo de ambos, como por ejemplo: a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinizacin, b) Precisar el momento en que el estigma est receptivo, c) (VSHFLFDU HO LQVWDQWH RSRUWXQR SDUD OD SRlinizacin y d) Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. 3 Fertilizacin in vitro 'XUDQWH DxRV ORV FLHQWtFRV LQWHQWDURQ LPLWDU los mecanismos de fecundacin que acontecen in vivo, utilizando tcnicas de fertilizacin in vitro de gametas aisladas; esta aplicacin fue ms sencilla en animales y en plantas inferiores pero no pudieron ser aplicadas a las plantas superiores hasta comienzos de la dcada de los noventa. Esto se debi a que la fertilizacin in vivo en las plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre en los sistemas animales y de plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre. El primer aislamiento de clulas espermticas vivas fue reportado por Cass en 1973, en el cul se aislaron gametos masculinos de cebada por ruptura de granos de polen en una solucin de sacarosa al 20%. A partir de este aislamiento se pudieron describir las caractersticas celulares de ese gameto. Esto se
repiti luego con xito en varias especies de Angiospermas. Para el aislamiento de gametas femeninas existe un mtodo que se emplea a menudo y que consiste en un tratamiento con enzimas diludas para disolver las paredes celulares, acompaado de la micromanipulacin para separar las otras clulas del saco embrionario. En 1991, Kranz y col. reportaron la primera fusin de gametas de maz in vitro, pudiendo reproducirse actualmente en esta especie el ciclo de vida completo, comenzando con la electrofusin de la clula espermtica con la ovoclula, dando como resultado un cigoto, un emEULyQ \ QDOPHQWH XQD SODQWD 3HVH D TXH VH KD tomado al maz como sistema vegetal modelo, en el cual estudiar los procesos de fusin de gametas y posterior embriognesis, tambin se han realizado trabajos exitosos de fusin de gametas en trigo, donde Kovacs (1995) logr la fusin de gametas in vitro, obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. En los ~OWLPRV DxRV VH KD ORJUDGR QDOPHQWH OD IXVLyQ de gametas en Nicotiana tabacum, la que pudiendo ser una especie modelo en dicotiledneas para estudiar la fertilizacin in vitro, dada su capacidad para la regeneracin de plantas, presenta sin embargo el inconveniente de que las gametas no se fusionan fcilmente. Tradicionalmente, se consider que todas las clulas espermticas tenan igual posibilidad de fusionarse con la clula huevo. Sin embargo, actualmente se sabe que existen mecanismos de fusin preferencial a nivel gamtico, donde un determinado morfotipo de clula espermtica es reconocido. Cuando est presenWH HVWH PHFDQLVPR KD\ XQD LGHQWLFDFLyQ GH las dos clulas espermticas, candidatas para la fusin celular y una eleccin de la que se fusionar con la ovoclula. La discriminacin se basa en las diferencias de las clulas espermWLFDV UHVSHFWR GH VX KHWHURPRUVPR FLWRSODVPiWLFR HQ WDPDxR IRUPD YROXPHQ VXSHUFLH contenido de organelas y asociacin fsica con el ncleo vegetativo. Por otro lado, el contacto del polen con el gameto femenino parece estimular la maduracin del mismo, incluyendo la acumulacin de calcio necesaria, la organizacin de la clula huevo, la migracin nuclear,
y la progresin del ciclo celular. Este ltimo factor parecera ser crtico en la combinacin exitosa de gametas. Adems, hay seales, suministradas por el saco embrionario, que permiten estimular el crecimiento y la maduracin del tubo polnico. Para que la fertilizacin tenga lugar, in vitro, no slo deben aislarse las gametas femeninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse, en ausencia de las clulas asociadas. Para obtener un embrin in vitro, los pasos a seguir son los siguientes: Aislamiento y seleccin de las gametas Se han desarrollado mtodos de aislamiento y seleccin de gametas para una amplia variedad de especies vegetales, entre ellas: maz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne) \ DOJXQDV EUDVLFiFHDV $ Q GH UHDOL]DU HFLHQtemente este paso se debe: &RQRFHU H[KDXVWLYDPHQWH OD PRUIRORJtD Rral de la especie a utilizar, con el objetivo de ubicar el saco embrionario y sus clulas constituyentes. b) Aislar las gametas masculinas, a partir de los granos de polen mediante choque elctrico, osmtico y/o de pH. c) Aislar el saco embrionario y las gametas femeninas mediante microdiseccin individual en asociacin con maceracin enzimtica. Este paso es crtico y limitante ya que pueden obtenerse pocas gametas femeninas y el proceso de manipulacin es muy delicado. El tratamiento de las espigas, previo a la polinizacin con 2,4-D, que induce a la expansin del ovario, facilita el proceso resultando en ovarios ms grandes y vulos ms blandos, incremenWDQGR OD HFLHQFLD HQ HO DLVODPLHQWR GH ODV RYRclulas. Fertilizacin in vitro propiamente dicha Puede realizarse mediante la microinyeccin de clulas espermticas o ncleos espermticos aislados, en clulas individuales obtenidas de los sacos embrionarios, o por electrofusin. En este ltimo caso las gametas se ponen en contacto en una cmara de electrofusin por alineacin dielectrofortica y se fusionan mediante pulsos elctricos (Fig. 2). Los productos de fusin pueden ser entonces cultivados en
Figura 2. Fertilizacin in vitro mediante electrofusin
una solucin con clulas nodrizas y algunos de ellos desarrollarn en proembriones. Fusin de las gametas. En maz, la secuenFLD GH HYHQWRV SDUD TXH VH YHULTXH OD IXVLyQ in vitro es la siguiente: las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de pH en una solucin 0,5 M de manitol. Las ovoclulas y los protoplastos de las clulas centrales del saco embrionario se aislan de los vulos por tratamiento con enzimas celulolticas y microdiseccin manual. Las dos gametas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusin simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2). Para realizar este procedimiento se utilizan microagujas de vidrio que permiten poner en contacto las gametas IHPHQLQDV \ PDVFXOLQDV D Q GH IDFLOLWDU \ GLrigir la fusin. La adhesin y posterior fusin de las gametas es rpida (aproximadamente 10 segundos). A los 20 minutos de realizada la fusin, deja de visualizarse el ncleo masculino y 20 horas despus es posible observar mediante microscopio ptico, con contraste de
fases la presencia de dos ncleos, de manera similar a lo que se observa in vivo. La formacin del endosperma ocurre cuando se fusiona el ncleo de la clula espermtica con los dos ncleos polares. Los estudios in vitro, sobre los primeros eventos despus de la fusin de las clulas y ncleos, indican que las primeras clulas del endosperma resultante desarrollan un tejido caracterstico capaz de auto-organizarse en forma separada del tejido materno. Este proceso se completa, en esta especie, aproximadamente dos horas despus de la fusin in vitro de las clulas que forman el embrin. 4 Cultivo de vulos y embriones in vitro El cultivo de vulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulacin del material es difcil. El vulo es una estructura delicada, muy pequea, altamente hidratada, que puede ser daada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microciruga con rapidez para evitar que los tejidos sufran deVHFDFLyQ GXUDQWH HO SURFHVR 3HVH D ODV GLFXOtades de la tcnica, en algunos cruzamientos LQWHUHVSHFtFRV FRPR ORV UHDOL]DGRV HQ SDSD algodn y Hevea brasiliensis, se comprob que el cultivo de vulos completos es ms exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los vulos de una planta y cultivarlos en un medio estril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal. Esta tcnica es relativamente fcil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de xito son muy EXHQDV /DV GLFXOWDGHV VH LQFUHPHQWDQ FXDQto ms inmaduro sea el embrin a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son ms HVSHFtFRV HQ ODV HWDSDV WHPSUDQDV GH GHVDrrollo del embrin. Factores externos que condicionan el cultivo de vulos y embriones Entre los factores externos ms importantes que afectan el cultivo de vulos y de embriones se citan: el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento.
El vulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varan con el estadio de desarrollo del mismo y que es neceVDULR LGHQWLFDU SDUD FDGD HVSHFLH HQ SDUWLFXlar. Por consiguiente un aspecto fundamental a tener en cuenta en el rescate de embriones es la seleccin correcta del medio de cultivo adecuado para cumplir con los requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario, siendo necesario a veces la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un ptimo crecimiento. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutricin: OD IDVH KHWHURWUyFD en la que el embrin es dependiente del endosperma y dems tejidos maternos que lo rodean, y OD IDVH DXWRWUyFD, en la cual el embrin es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azcares. La etapa crtica de pasaje de una fase a otra vara con las especies.
La introduccin de agua de coco y extractos de endospermas en el medio de cultivo han sido muy tiles ya que activan el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de vulos de algunas especies vegetales. Por otro lado, no existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extrados, sean inmaduros o maduros, excepto en el rol que cumplen en la ruptura de la dormicin. La concentracin osmtica es un factor importante en el desarrollo de vulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no slo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que adems mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Est demostrado que una presin osmtica elevada previene la germinacin precoz de los embriones inmaduros, evitando as la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa.
5HVSHFWR GH ORV UHTXHULPLHQWRV GH WHPSHUDtura, los embriones de la mayora de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25 C a los 30 C. Aunque algunos estudios indican que la luz no es crtica para el crecimiento de los embriones, se demostr que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinacin precoz en los embriones inmaduros. Entre los medios de cultivo ms difundidos para el cultivo de vulos y embriones se pueden citar el de Murashige y Skoog (1962), MonQLHU 5DQGROSK \ &R[ *DPERUJ y col. (1976), Liu y col. (1993). 5 Aplicaciones de las Tcnicas de Fertilizacin in vitro 5.1 Aplicaciones en el Mejoramiento Gentico Vegetal Las tcnicas antes mencionadas han sido utilizadas para salvar algunos obstculos que se le presentan al mejorador de plantas cuando desea realizar cruzamientos, para el logro de ciertos objetivos de mejoramiento. A continuacin se mencionan ejemplos de aplicacin de las metodologas de polinizacin y fertilizacin in vitro: En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinizacin placental in vitro permiti que se superen las barreras de incompatibilidad precigtica, obtenindose embriones hbridos y an plantas hbridas, imposibles de obtener mediante tcnicas convencionales. As se realizaron los cruzamientos de las siguientes especies: Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta. La polinizacin in vitro se emple tambin como va para la obtencin de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrs, acelerando as la obtencin de plantas resistentes. Esta estrategia se desarroll en maz, con polen cosechado de plantas creciendo a temperaturas elevadas y condujo a la obtencin de plantas tolerantes a estrs por calor. En Brassica rapa, la seleccin de polen a baja tempe-
ratura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de fro, logrando acumular ms peso seco que en progenies obtenidas sin la seleccin previa del polen. El cultivo de vulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: rescatar embriones abortivos deULYDGRV GH OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD R LQWHUgenrica, superar problemas de abscisin precoz del fruto, recuperar embriones de cruzas LQWHUHVSHFtFDV TXH FRQGXFHQ D OD REWHQFLyQ de haploides y acortar el perodo de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse, en el endosperma o en la cubierta de la misma, inhibidores del desarrollo del embrin. Los siguientes ejemplos ilustran las diversas aplicaciones: Durante la produccin comercial del triticaOH HVSHFLH REWHQLGD DUWLFLDOPHQWH PHGLDQWH el cruzamiento de trigo y centeno, el cultivo o rescate de embriones se utiliz para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial, ya que los embriones abortaban en estadios tempranos del desarrollo debido a una incompatibilidad con el endosperma. Esta tcnica y la aplicacin de colchicina en plantas hbridas, fueron de fundamental importancia para salvar los problemas que se presentaron en el cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que posea la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologas fue decisiva para la produccin de un gran nmero de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, ORJUDQGR QDOPHQWH XQ DOWR JUDGR GH IHUWLOLGDG Las tcnicas de rescate de embrionario son necesarias como complemento en la producFLyQ DUWLFLDO GH KDSORLGHV (Q HOODV VH FXOWLYDQ embriones que se forman por partenognesis o por eliminacin de cromosomas luego de la KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD R LQWHUJHQpULFD (Q algunos casos los embriones haploides se distinguen morfolgicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro, en medios y condiciones adecuados (ver en este libro Parte IV-Captulo 1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploida. Esta tcnica se ha utilizado con xito en cebada, trigo y tabaco.
Tambin se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra despus de la fecundacin, como en Oenothera biennis x O. muricata o O.biennis x O. lamarckiana. Esta tcnica tambin es de utilidad para sortear barreras de dormicin o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del gnero Manihot. El cultivo in vitro de embriones es tambin una alternativa para el intercambio de semilla a travs de fronteras internacionales. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico, en yuca, desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede HQ 1LJHULD IXH QHFHVDULR WUDVODGDU VWRFNV GH semillas desde Sudamrica al continente africano, el cultivo de embriones result ser un excelente mtodo para transferir germoplasma FRQ PtQLPRV ULHVJRV WRVDQLWDULRV El cultivo de embriones ha ayudado tambin al mejoramiento gentico de especies lexRVDV TXH WLHQHQ GLFXOWDG HQ OD JHUPLQDFLyQ de sus semillas, como en Taxus mairei, o con escasa produccin de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis. El cultivo de embriones inmaduros puede ser aplicado para disminuir el tiempo necesario en la obtencin de un nuevo cultivar. Por ejemplo en soja se requieren unos diez aos SDUD HVWH Q 6L VH FRQVLJXHQ UHDOL]DU YDULDV generaciones por ao, en contraestacin, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorrara, adems, el tiempo de maduracin de la semilla. En este y en cada caso en particular, se debe realizar la evaluacin del EHQHFLR HFRQyPLFR SDUD GHFLGLU OD XWLOL]DFLyQ de estas tcnicas. Cultivo de nucelas En las plantas leosas, los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneracin, se ha inducido entonces con xito la embriognesis somtica
a partir de nucelas de vulos jvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis vinifera, Malus domesticus, Psidium guajava y Pyrus serotina. La tcnica de rescate de vulos fecundados se utiliza tambin en aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en el cruzamiento Trifolium repens x T. hybridum. Las tcnicas de fertilizacin in vitro pueden complementar, adems, las metodologas de transformacin de plantas. Por ejemplo, a travs de la obtencin de un embrin a partir de cigotos transgnicos que han sido manipulados, utilizando un protocolo que involucra la microinyeccin de genes en el cigoto. Esta tcnica evitara la utilizacin de antibiticos y genes de resistencia a herbicidas, como marcadores, durante el proceso de seleccin de las clulas transformadas. Otra ventaja de la fertilizacin in vitro es la posibilidad de realizar cruzamientos entre planWDV TXH VRQ ORJHQpWLFDPHQWH GLVWDQWHV IXVLRnando in vitro sus respectivas gametas para producir cigotos hbridos. Se evitan as los inconvenientes que frecuentemente se observan en la hibridacin somtica, como por ejemplo la ocurrencia de inestabilidad del hbrido respecto GHO Q~PHUR GH FURPRVRPDV R ODV GLFXOWDGHV ncleo e inter-citoplasmticas (ya que en este caso es la clula huevo la que contribuye con el citoplasma del cigoto hbrido. Adems, en la fusin gamtica, el desarrollo temprano del cigoto est regulado por genes pertenecientes a la clula huevo, los que brindan seales celulares propias, haciendo que progrese el ciclo celular en forma exitosa con el resultado de proembriones producto de las sucesivas divisiones celulares. Pese a la potencialidad de la tcnica de hibridacin distante a partir de gametos, es importante la eleccin de especies parentales DGHFXDGDV SDUD PLQLPL]DU ODV GLFXOWDGHV TXH VXUJHQ SURGXFWR GH ODV GLIHUHQFLDV ORJHQpWLFRV VLROyJLFDV \ GHO FLFOR FHOXODU 5.2 Aplicaciones para dilucidar aspectos bsicos del desarrollo en plantas /DV GLFXOWDGHV HQ HO DLVODPLHQWR GH ORV JD-
metos de las plantas superiores ha obstaculizado durante mucho tiempo la comprensin GH OD VLRORJtD JDPpWLFD \ GH ORV PHFDQLVPRV que desencadenan la embriognesis; los embriones cigticos en su medio natural ofrecen GLFXOWDGHV GHELGR D VX WDPDxR SHTXHxR \ DO hecho de estar inmersos en el tejido materno. A partir del aislamiento de clulas espermticas, clulas huevo y cigotas, se han podido realizar estudios moleculares de las clulas germinales, evitando las interferencias que resultan de la interaccin con el tejido somtico. Asimismo se ha facilitado el anlisis de los efectos genticos, epigenticos e interacciones ncleo-citoplasmticas inherentes a los gametos como tambin el estudio del desarrollo del embrin y el endosperma. De este modo, la fertilizacin in vitro de las plantas superiores se ha convertido en un rea de investigacin importante, resultando actualmente uno de los campos principales de la biologa vegetal.
Los estudios sobre la embriognesis somtica WDPELpQ KDQ SHUPLWLGR LGHQWLFDU SDWURQHV de expresin gnica relacionados con este proceso, que se desencadena a travs del cultivo de tejidos. El sistema mejor estudiado, en relacin con la embriognesis somtica, es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remocin del 2,4-D (cido 2, 4-diclorofenoxiactico) del medio de cultivo, genera una respuesta embriognica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen, de a millares, en un medio lquido (ver en este libro Parte II-Captulo 1). Los embriones somticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. Las plantas parecen poseer un programa embriognico preestablecido que se desenFDGHQD HQ UHVSXHVWD D FRQGLFLRQHV HVSHFtcas. El proceso de fertilizacin dispara la em-
Tabla 1 5HVXPHQ GH ORV DYDQFHV PHWRGROyJLFRV SRVLELOLWDGRV SRU ODV WpFQLFDV GH fertilizacin in vitro SDUD HO HVWXGLR GHO SURFHVR GH OD GREOH IHFXQGDFLyQ GH ODV $QJLRVSHUPDV 0RGLFDGR GH :DQJ \ FRO 2006).
Cultivo in vitro de cigotos y embriones
Fusin in vitro de gametas
Aislamiento de clulas generativas
Cada una de estas tcnicas ha posibilitado:
Investigar los requerimientos del embrin durante su desarrollo Investigar los aspectos moleculares de la embriognesis Determinar la rec eptividad del cigoto para la transformacin
Investigar los mecanismos de activacin del cigoto
Estudiar la ultraestructura de las clulas generativas
Hibridar especies distantes Investigar las diferencias entre las clulas del saco embrionario Obtener bibliotecas de ADNc de cigotas Realizar electroforesis de productos de clulas generativas Construir bibliotecas de ADNc de clulas generativas
briognesis cigtica, cuyos estadios normales de desarrollo se muestran en la Fig. 3. Una serie de investigaciones han demostrado que hay requerimientos para que los gametos se fusionen in vivo, por ejemplo la presencia de calcio, elemento que posee una actividad altamente fusognica y que adems activara el desarrollo del cigoto. Adems, al estudiar la ultraestructura celular se han encontrado diferencias en la arquitectura de los microtbulos entre la clula huevo no fertilizada y el cigoto, demostrando que este cambio est inducido por la fertilizacin. El cultivo in vitro y las tecnologas diseadas para estudiar la expresin gnica han permitido analizar por separado la funcin de genes SUHVHQWHV GH PDQHUD HVSHFtFD HQ ODV FpOXODV que participan en el proceso de fertilizacin. Con la utilizacin de tcnicas de especiales de electroforesis bidimensional se han podido LGHQWLFDU SURWHtQDV GH FpOXODV JDPpWLFDV \ FLgticas, encontrndose pocas diferencias entre los patrones proteicos de embriones somWLFRV \ FLJyWLFRV 1LQJ \ FRODERUDGRUHV
Figura 3. Estados de la embriognesis en Arabidopsis thaliana
estudiaron la contribucin de los genes de las clulas espermticas, la clula huevo y la cigota y obtuvieron evidencias de que hay clusters de genes que estn presentes en la clula huevo y espermticas, que persisten en el cigoto, mientras que hay una gran cantidad de genes que son propios del cigoto, produciendo en ste nuevos transcriptos. En el caso particular de la gameta masculina, se sabe que cada una de las funciones para las cuales est destinada (reconocimiento, fusin y adhesin con la gameta femenina), est controlada por la activacin de genes. Por ejemSOR ;X \ FRODERUDGRUHV LGHQWLFDURQ \ caracterizaron dos genes de histonas gcH2A y gcH3 que actan durante la maduracin de la clula espermtica y tambin el gen LGC1 que se expresa exclusivamente en las clulas gamticas masculinas. El producto de este ltimo gen (una protena) fue localizado en la superFLH GH ODV FpOXODV JDPpWLFDV PDVFXOLQDV VXgiriendo un posible rol en la interaccin clula espermtica-clula huevo, en el momento del reconocimiento o sealizacin. Adems, este mismo grupo de investigacin aisl, a partir de XQD ELEOLRWHFD GH $'1F GRV JHQHV 1W6 \ 1W6 TXH FRGLFDQ SDUD XQD SROLJDODFWXURQDVD HQ]LPD TXH WHQGUtD OD IXQFLyQ GH PRGLFDU la pared celular durante la diferenciacin de las clulas espermticas. 3HVH D ODV GLFXOWDGHV TXH SUHVHQWD HO DLVODmiento de las gametas femeninas (hay menor HFLHQFLD HQ OD REWHQFLyQ GH FpOXODV TXH HQ las masculinas), tambin se han logrado progresos en el esclarecimiento de sus funciones. Por ejemplo, recientes investigaciones han esclarecido detalles acerca de la expresin de genes involucrados en el gameto femenino que determinan la gua del tubo polnico y la maduracin de las anteras, como por ejemplo el gen ZmEA1, en maz, que posee una funcin en la atraccin del tubo polnico a la micrpila. Cuando este gen est regulado negativamente, la seal direccional del tubo polnico a OD PLFUySLOD HV LQVXFLHQWH \ QR VH SURGXFH OD fertilizacin. En relacin a la expresin de genes en la HPEULRJpQHVLV GHO PDt] VH KDQ LGHQWLFDGR DOgunos diferencialmente expresados en la clula basal y apical del embrin bicelular. En esta
misma especie la clula huevo mostr un incremento en la abundancia de transcriptos que involucran funciones como la comunicacin celular, el crecimiento y la divisin celular, la sntesis GH $'1 \ IDFWRUHV UHODFLRQDGRV FRQ HVWUHVHV \ transduccin de seales. Por otro lado, las clulas centrales del saco embrionario muestran una abundancia de transcriptos involucrados con los procesos relacionados con el metabolismo de la energa y la sntesis proteica. En cada caso, esWRV SURGXFWRV SDUHFHUtDQ UHHMDU FDWHJRUtDV IXQcionales representadas en el futuro desarrollo del embrin y el endosperma. Como en el caso ya citado de la clula espermtica, se han idenWLFDGR WDPELpQ HQ OD FpOXOD KXHYR \ OD FLJRWD genes de histonas que podran representar un mecanismo regulatorio de varios genes. El nmero de herramientas disponibles en la actualidad para manipular las gametas de las plantas superiores provee numerosas oportuQLGDGHV SDUD UHDOL]DU SURJUHVRV FLHQWtFRV \ tecnolgicos. La investigacin en el rea de la biologa reproductiva de las Angiospermas ha entrado en una nueva fase, donde los mtodos de la biologa molecular permiten responder muchas preguntas acerca de los mecanismos fundamentales de la fecundacin y activacin del desarrollo embriognico temprano. Un resumen de las tcnicas de fertilizacin in vitro que han permitido el acceso a nuevas investigaciones en el rea molecular de este tema, se muestran en la Tabla 1. El desarrollo de sistemas experimentales en varias especies, particularmente en dicotiledQHDV VRQ QHFHVDULRV SDUD FRQUPDU ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV HQ JUDPtQHDV D Q GH FRPSOHmentar la informacin molecular acerca del proceso de fertilizacin y mejorar los mtodos para la produccin de plantas regeneradas frtiles, con combinaciones genticas estables y de alta HFLHQFLD 6 Lecturas recomendadas
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II CAPTULO 2 Hibridacin Somtica

Pablo Polci y Pablo Friedrich 1 Introduccin La mejora gentica de las plantas cultivadas en procura de incrementar la produccin viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de aos, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el homEUH KD HPSOHDGR ORV FUX]DPLHQWRV FRQ HO Q de incrementar la variabilidad gentica, paso inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridacin entre especies diferentes SHUPLWLy DXPHQWDU GH PRGR VLJQLFDWLYR OD SURductividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no result exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad gentica. La hibridacin somtica, es decir, la obtencin de plantas hbridas a partir de la fusin de clulas o de protoplastos derivados de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigtica.. Esta tcnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostr ser til en la mejora gentica de plantas, principalmente por permitir la introgresin limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. Tambin permite la obtencin de citoplasmas hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica y cibridizacin sirve como puente para la transferencia de genes individuales La tcnica de fusin de protoplastos se desarroll en la dcada de 1950-60, a partir de la observacin de que ciertos virus pueden inducir la fusin de clulas animales. Sin embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparicin de mtodos qumicos y elctricos ms apropiados para la fusin de clulas vegetales. La pared presente en estas clulas representa una barrera que normalmente impide la fusin entre ellas. Por
ello, la obtencin de plantas hbridas somticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestin enzimtica de las paredes celulares, para luego proceder a la fusin de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneracin de plantas a partir de los productos de fusin. La hibridacin somtica en plantas comenz a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicacin de mtodos qumicos de fusin, y se extendi en los 80 con el empleo de mtodos de electrofusin. (V UHOHYDQWH GHVWDFDU TXH D ORV QHV GHO mejoramiento gentico, el sistema de protoplastos no slo se emplea para la obtencin de hbridos somticos, sino que tambin constituye un material apropiado para la incorporacin GH $'1 H[yJHQR $VLPLVPR OD IXVLyQ GH SURWRplastos tiene un uso mucho ms amplio que el estrictamente de inters agronmico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biologa celular as como para otras aplicaciones biotecnolgicas, por ejemplo, la produccin de anticuerpos monoclonales. 2 Hibridacin somtica vs. hibridacin sexual En relacin a su potencialidad para producir hbridos, existen diferencias importantes entre la fusin de protoplastos somticos y el cruzamiento sexual: La hibridacin sexual entre organismos de diferentes especies est limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigticas, es decir, no permiten que se produzca la fecundacin. Tal limitante no existe en la fusin de protoplastos, dado que este SURFHVR HV QRHVSHFtFR SHUPLWLHQGR OD fusin de clulas de orgenes muy diversos, incluso de organismos muy distanFLDGRV ORJHQpWLFDPHQWH SRU HMHPSOR clulas animales y vegetales). Ello no VLJQLFD TXH SXHGD UHJHQHUDUVH XQ RUganismo viable y frtil a partir de cualquier tipo de combinacin entre clulas. De hecho, la bsqueda de hbridos de inters agronmico ha demostrado que el principal aporte de esta metodologa es
la introgresin, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas. La hibridacin sexual ocurre normalmente por fusin de clulas haploides (n + n), mientras que en la hibridacin somtica se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo slo parte de su genoma. Otra diferencia est dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastdicos y mitocondriales. Mientras que en la reproduccin sexual el genoma citoplasmtico es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridacin somtica se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmticos.
tencia horizontal a enfermedades y otros son polignicos, por lo que su transferencia es factible por hibridacin somtica pero no por transformacin gentica. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genmica se est avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vas metablicas. Estos podran ser transferidos en conjunto va transgnesis. 4 Tipos de hbridos somticos Cuando se realiza la fusin de protoplastos se obtienen clulas con el aporte de cromosomas de dos o ms ncleos. Si los protoplastos involucrados en la fusin proceden de distintos tipos parentales se originan heterocariones, y si proceden del mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarin ocurre la fusin de los ncleos (cariogamia), se forma una clula hbrida. A partir de una clula hbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, segn cual haya sido el destino del material gentico nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusin, puede ser de tres tipos: 1. Hbrido simtrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Hbrido asimtrico, que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y slo una parte del genoma nuclear del otro parental. 3. Cbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo slo material gentico extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneracin de plantas hbridas ocurra una eliminacin gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, producindose de este modo hbridos asimtricos o cbridos. La prctica de la hibridacin somtica en plantas demostr que, en general, los hbridos asimtricos y cbridos son ms valiosos que los simtricos producidos HQWUH SODQWDV DOHMDGDV ORJHQpWLFDPHQWH 3RU esta razn se han desarrollado mtodos para
3 Hibridacin somtica vs. transformacin gentica La preponderancia que han tomado las tcnicas de transformacin gentica ha relegado a la hibridacin somtica a un papel de menor VLJQLFDFLyQ FRPR KHUUDPLHQWD ELRWHFQROyJLFD aplicada al mejoramiento de los cultivos. Comparando ambas metodologas, podemos destacar las siguientes diferencias: En la transformacin gentica se incorporan uno o pocos genes exgenos en una planta, mientras que en la hibridacin somtica el nmero de genes introGXFLGRV HV PD\RU GDGR TXH VH WUDQVHren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. La hibridacin somtica permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresin de dichos caracteres. Por el contrario, la transformacin genWLFD UHTXLHUH OD SUHYLD LGHQWLFDFLyQ \ DLVlamiento de los genes que determinan la expresin del carcter de inters. Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrs, resis-
inducir la hibridacin asimtrica o cibridacin, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se WUDQVHUH SDUWH GHO JHQRPD GH XQ SURWRSODVWR donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusin, pueden producirse tres tipos de clulas hbridas: 1. Clulas hbridas simtricas, por fusin de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Clula hbrida asimtrica, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su ncleo inviable o slo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentacin de los cromosomas. Una vez producida la fusin, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un hbrido asimtrico. El tratamiento de irradiacin parece no tener efectos deletreos o mutagnicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada clula posee varias copias de ellas. Tambin puede producirse una clula hbrida asimtrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formacin de microncleos por tratamientos con agentes antimicrotbulos. 3. Cbridos, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o con su ncleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmtico. Asimismo, el mtodo de irradiacin con rayos X o Gamma puede generar cbridos en casos en que se produzca la eliminacin total de los fragmentos cromosmicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados pre-
viamente con inhibidores metablicos. En este caso slo pueden sobrevivir, por complementacin metablica, los heterocariones conteniendo el ncleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregacin de los plstidos y mitocondrias de los dos tipos parentales tambin constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneracin de plantas hbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco comn entre plstidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitticas las clulas formadas contengan plstidos provenientes de uno u otro tipo parental. As, una clula hbrida origina una colonia de clulas que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmticos, pero con una mayor frecuencia de clulas que poseen mitocondrias recombinantes y plstidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material gentico nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una poblacin de clulas hbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastdicos y mitocondriales. La Figura 1 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridacin somtica, las cuales son tratadas a continuacin. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de mtodos enzimticos de aislamiento a partir de 1960 brind la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplasWRV YHJHWDOHV (OOR WXYR JUDQ LQXHQFLD HQ GLferentes reas de la biologa y la biotecnologa de plantas, dada la utilidad de los protoplastos FRPR VLVWHPD H[SHULPHQWDO SDUD HVWXGLRV VLRlgicos, bioqumicos y moleculares, as como para su aplicacin al mejoramiento gentico. Los protocolos de aislamiento emplean enzimas fngicas con actividad celulasa y pectinasa, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en
Aislamiento de protoplastos
Protoplastos parentales 1 ?
Protoplastos parentales 2 ?
Modificaciones genmicas para produccin de hbridos simtricos/cbridos y/o pretratamiento para posterior seleccin (opcionales)
Protoplastos parentales 1 (originales o modificados) ? ? ? ? ?
Protoplastos parentales 2 (originales o modificados)
Fusin de protoplastos
? Mezcla de protoplastos parentales y productos de fusin ? ?
Seleccin de clulas hbridas

Protoplastos hbridos ?
Cultivo de protoplastos hbridos y regeneracin de plantas
Cultivo de la mezcla de protoplastos en medio selectivo (opcional) y regeneracin de plantas
Figura 1: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin somtica.
tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las clulas. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilit el aislamiento de protoplastos de prcticamente cualquier tejido vegetal, siempre TXH HO PLVPR QR HVWp OLJQLFDGR 6H KD SRGLGR aislar protoplastos de una gran cantidad de especies vegetales y regenerar plantas a partir de los mismos, permitiendo el uso de este sisWHPD SDUD OD SURSDJDFLyQ FORQDO \ OD PRGLFDcin gentica de plantas. El nmero de protoplastos aislados, su viabilidad y la pureza de la suspensin obtenida dependen de varios factores, debiendo establecerse en forma emprica las condiciones ptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuacin: 1. Seleccin del material de partida. InX\H HQ HO UHVXOWDGR GHO DLVODPLHQWR DVt como en el proceso de regeneracin posterior. Generalmente se emplean hojas y clulas en cultivo lquido o slido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jvenes totalmente expandidas que con hojas viejas (Fig. 2A). Para facilitar el contacto de las enzimas con las clulas, las hojas suelen cortarse HQ WUR]RV SHTXHxRV PX\ QRV HQ HO FDVR de las monocotiledoneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solucin enzimtica, como sucede con las dicotiledoneas. Cuando se emplean clulas en suspensin, se obtienen mejores resultados si se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. 2. Tratamiento enzimtico. La concentracin de la enzima y el tiempo de incubacin requeridos para lograr la liberacin de los protoplastos dependen del producto comercial utilizado. El pH generalmente se ajusta en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura entre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento enzimtico y la relacin volumen de solucin/cantiGDG GH WHMLGR LQX\HQ HQ HO UHQGLPLHQWR
Durante el aislamiento se produce la lisis de algunas clulas, que liberan enzimas hidrolticas y compuestos oxidantes que pueden daar los protoplastos, por lo que se suelen agregar inhibidores de proteasas y antioxidantes tales como el Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un estabilizador osmtico a la solucin enzimtica es esencial para evitar la ruptura de los protoplastos a medida que son liberados, siendo ms estables si la solucin es ligeramente hipertnica. Para ello se utilizan solutos osmticamente activos, comnmente manitol o sorbitol, en concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8 M segn el tipo de protoplasto. La solucin enzimtica es generalmente suplementada con sales, comnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 2B). 3. /LPSLH]D \ SXULFDFLyQ GH ORV SURWRplastos. Una vez lograda la liberacin de los protoplastos, se procede a la remocin de las enzimas y de los restos de tejido y de clulas rotas. La suspensin VH SDVD SRU XQ OWUR GH Q\ORQ R PHWiOL-
Figura 2: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.
co con un dimetro de poro (30-100 Pm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de clulas no digeridas. Posteriormente, se efectan 3 4 lavados centrifugando la suspensin por 5 minutos a baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solucin salina que contenga un estabilizador osmtico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensin es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 2C). Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitmetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro, diaFHWDWR GH XRUHVFHtQD R H[FOXtGRV D]XO de Evan) por las clulas viables; tambin pueden evaluarse la actividad fotosinttiFD HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD \ OD UHVSLratoria (consumo de O2). 6 Mtodos de fusin 6.1 Mtodos qumicos Los primeros casos informados de fusin controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneracin de hbridos somticos se produjeron a principios de la dcada de 1970, empleando nitrato de sodio como agente fusgeno. La frecuencia de formacin de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de clulas del mesOR GH Nicotiana en un medio conteniendo alta concentracin de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusgeno que alcanz mayor aceptacin es el polietilnglicol (PEG) debido a que, en comparacin con los otros agentes qumicos, produce mayor proporcin de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos txico. Adems, el tratamiento con PEG genera una mayor proporcin de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre ms de dos protoplastos. El procedimiento de fusin con PEG ms ampliamente utilizado es esencialmente una
combinacin del mtodo original del PEG y el de Ca++ y pH elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C. La densidad de protoplastos adecuada para la formacin de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensin). La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentracin de PEG con cada lavado. En la fusin de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmticas de protoplastos adyacentes entran en ntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados de las mismas, formndose puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmticas se expanden, provocando la fusin. La carga negativa neta de la VXSHUFLH GH ODV PHPEUDQDV SURGXFH OD UHSXOsin entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH HOHYDGRV QHXWUDOL]D ODV FDUJDV VXSHUFLDOHV favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuara como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmticas que promueven la adhesin y formacin de puentes citoplasmticos entre protoplastos YHFLQRV SURGXFLpQGRVH QDOPHQWH OD IXVLyQ 6.2 Electrofusin En 1973 se descubri que pulsos de elevado potencial elctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duracin conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular. Este efecto se denomin ruptura elctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje mnimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formacin de poros disminuye a mayor duracin del pulso elctrico.
Este fenmeno de ruptura reversible tambin es aplicado en la tcnica de electroporacin, con la que se pueden introducir en las clulas FRQVWUXFFLRQHV GH $'1 \ RWUDV PROpFXODV GH alto peso molecular. El mtodo de electrofusin en esencia involucra dos pasos: Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo elctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una clula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta que la empuja a una regin de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la clula incrementa el campo local no uniforme, atrayendo a las clulas vecinas. Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las lneas de campo aplicadas (Fig. 3A). La fuerza ejercida sobre la clula bajo condiciones dielectroforticas depende (1) de la intensidad de campo elctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto, y (4) de la diferencia entre las constantes dielctricas de la clula y su ambiente (as como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 seg. con una intensidad de campo HOHYDGD D .YFP VXFLHQWH SDUD FDXVDU la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribudo a las molcuODV OLStGLFDV GHELGR D TXH VX FRHFLHQWH GH GLfusin es dos rdenes de magnitud mayor que el de las protenas. Durante este proceso pue-
den formarse puentes lipdicos entre las membranas de las dos clulas. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmtica entre las dos clulas, conducen a un radio de curvatura muy pequeo y a altas WHQVLRQHV VXSHUFLDOHV &RPR FRQVHFXHQFLD se forma una nueva clula esfrica, ya que el proceso es favorecido energticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el nmero y tamao de los poros es pequeo en relacin al WRWDO GH OD VXSHUFLH GH OD PHPEUDQD )XHU]DV de campo supracrticas, as como largos perodos de exposicin, rompen reas mayores de membrana y pueden producir la destruccin total de la clula.
Figura 3: (OHFWURIXVLyQ GH SURWRSODVWRV GH PHVyOR de pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formacin de poros en la membrana, generando puentes entre las membranas de las clulas adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy pequeo. Las altas tensiones superFLDOHV JHQHUDGDV HQ HVH VHFWRU FRQGXFHQ D OD IRUmacin de una nueva clula esfrica.
La frecuencia de fusin depende de varios factores: El genotipo. La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuencias de fusin diferentes, an cuando provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan ms fcilmente que los provenientes de raz o de cultivos celulares. El tamao de los protoplastos. Los ms grandes se fusionan ms facilmente. La densidad de los protoplastos. El nmero, la duracin y la fuerza de los pulsos de corriente directa. La duracin del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiempo requerido para la fusin que sigue a la aplicacin de un pulso vara desde pocos segundos a varios minuntos. Esto probablemente est relacionaGR D OD GLIHUHQFLD GH XLGH] GH OD PHPbrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la clula. El medio de fusin. Un factor limitante en la agregacin dielectrofortica de las clulas es la conductividad elctrica del medio; si sta es muy alta, hay mucho XMR GH FRUULHQWH HQ OD VROXFLyQ \ VH SURducen calentamientos y turbulencias que impiden la formacin de cadenas. El potencial osmtico del medio de fusin. La inclusin de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusin. Sin embargo, existe la limitacin de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad; el medio de fusin usualmente consiste en manitol (cuya concentracin se ajusta segn los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de presin osmtica en el medio de suspensin de los protoplastos puede favorecer el proceso de fusin. La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que adems depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del
campo elctrico y tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas ms largas darn mayor frecuencia de fusin que las cadenas cortas. Pulsos de corriente ms largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusin mltiple; obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. La composicin y propiedades de la membrana plasmtica pueden ser afectadas por la actividad metablica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, inX\HQGR HQ FRQVHFXHQFLD HQ HO SURFHVR de fusin.
Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusin posible (nmero de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporcin de heterocariones (productos de la fusin de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusin de protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusin mltiple (fusin de ms de dos protoplastos). La proporcin de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la VXVSHQVLyQ SXHGH MDUVH D Q GH LQFUHPHQWDU la formacin de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relacin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin de cadenas, los protoplastos ms fusionables estarn mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y stos a su vez estarn ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones -duracin y voltaje de los pulsos- que promuevan slo la fusin de los protoplastos ms fusionables, los productos sern mayormente heterocariones. Sin embargo, an cuando las condiciones de IXVLyQ SXHGDQ MDUVH GH PRGR GH LQFUHPHQWDU la frecuencia de fusin y la proporcin de heterocariones formados, la fusin de protoplastos a gran escala (macrofusin), tanto por mtodos qumicos como elctricos, resultar en una
mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto conlleva la necesidad de emplear mtodos de seleccin de lo hbridos somticos obtenidos. Una tcnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior seleccin de heterocariones, aunque demanda mayor manipulacin, es la microfusin o electrofusin de pares de protoplastos. Esta tcnica se basa en los mismos principios que la electrofusin a gran escala pero est diseada para inducir la fusin en pares seleccionados de protoplastos. Este sisWHPD HPSOHD PLFURHOHFWURGRV GH SODWLQR MDGRV a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusin sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusin, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos elctricos. Despus de la fusin, los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneracin de plantas hbridas. La tasa de fusin es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusin cercanas al 50 %. Ventajas de la electrofusin: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los hbridos pueGHQ VHU IDFLOPHQWH LGHQWLFDGRV \ WUDQVferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el nmero de clulas a ser fusionadas. Las formaciones de dos clulas son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos. Para obtener productos de multifusin deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusin es sincrnico, ya que el pulso provoca la fusin de todas las clulas expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 100 %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las clulas fusionadas es muy buena. 6. Este mtodo ofrece ventajas sobre otros
como el del PEG, que: - requiere condiFLRQHV QR VLROyJLFDV ODV IUHFXHQFLDV de formacin heterocariones binucleados son bajas y variables, - resultan txicos para diversos tipos celulares, - el fusgeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y - bajo rendimiento de clulas fusionadas. 7 Seleccin de heterocariones La fusin de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusin. Si no se efecta una previa seleccin de las clulas hbridas, la regeneracin GH SODQWDV \ OD SRVWHULRU LGHQWLFDFLyQ GH ORV hbridos demandar mucho trabajo y recursos. Dicha seleccin es particularmente necesaria cuando se emplean mtodos qumicos, que producen una baja proporcin (<10%) de clulas hbridas. Por el contrario, los mtodos elctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de seleccin dado que normalmente producen frecuencias de fusin muy elevadas o porque, en el caso de la microfusin, no se generan mezclas heterogneas de protoplastos debido a que se fusionan dos clulas por vez. Cualquiera sea el caso, la conGLFLyQ GH KtEULGR GHEH YHULFDUVH HQ OD SODQWD regenerada mediante diferentes anlisis que se explican ms adelante. La seleccin de clulas hbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes mtodos: Seleccin en base a caracteres morfoVLROyJLFRV. En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos hbridos poseen un color intermedio al de los parentales. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regenerar planta con uno recalcitrante, los hbridos somticos normalmente regeneran plantas, ya que este carcter se comporta como dominante. Si los protoplatos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metablicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y solamente podrn regenerarse los hbridos.
Seleccin por complementacin. La seleccin se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales pero no para el de los hbridos. La complementacin puede lograrse por las siguientes vas: a) Empleando dos parentales con defectos metablicos o genticos no allicos. Si dichos caracteres son recesivos, la fusin produce una clula hbrida en la que los defectos se anulan por complementacin. Por ejemplo, la fusin de dos variedades albinas no allicas (nucleares) de tabaco, permiti obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aaBB (albina)
AaaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos lneas mutantes no DOpOLFDV GH WDEDFR GHFLHQWHV HQ QLWUDWR UHGXFtasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como nica fuente de nitrgeno. b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibiticos o herbicidas. Para ello se emplea una lnea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectundose la seleccin de las clulas hbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las lneas parentales. c) Una lnea que presente una mutacin auWRWUyFD SRU HMHPSOR DOELQLVPR GHFLHQFLD D nitrato reductasa) y un carcter dominante (por ejemplo resistencia a antibiticos o herbicidas) es de gran utilidad para la seleccin. Los hbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mnimo suplementado con el antibitico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales. Seleccin por aislamiento de los heterocariones o clulas hbridas. Es el VLVWHPD PiV FRQDEOH \ GH PiV DPSOLR espectro de aplicacin. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Seleccin mecnica directa utilizando tc-
nicas de micromanipulacin con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las clulas hbridas. Por ejemplo al fusionar protoplastos GHO PHVyOR YHUGHV FRQ SURWRSODVWRV GH VXVpensiones celulares (incoloros). Tambin pueden colorearse las clulas de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. E &LWRPHWUtD GH XMR /RV SURWRSODVWRV SDrentales se marcan con diferentes colorantes XRUHVFHQWHV SRU HMHPSOR URGDPLQD URMR \ XRUHVFHtQD YHUGH DPDULOOHQWR (O DLVODPLHQto de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citmetro de XMR )$&6 XRUHVFHQFHDFWLYDWHG FHOO VRUWHU que es preciso y muy rpido. El equipo posee IRWRFpOXODV TXH GHWHFWDQ XRUHVFHQFLD SXGLHQdo separar los protoplastos marcados con un VROR XRURFURPR SDUHQWDOHV GH DTXHOORV GRblemente marcados (hbridos). 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de clulas y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnologa para la manipulacin gentica y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fcil para las dicotiledneas herbceas, pero ha sido bastante difcil para las monocotiledneas, particularmente las gramneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico. Suelen ser cultivaGRV HQ FDMDV GH 3HWUL FRQ PHGLR DJDULFDGR donde se mezcla la solucin de protoplastos con un medio de cultivo lquido a 40C conteniendo 1,2% de agar, perferentemente agarosa (Fig. 4A). Los protoplastos quedan, as, atrapados en el medio semislido y, luego de varios das, se ven las colonias formadas (Fig. 4B). Sin embargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies solo pueden dividirse en medio lquido, (b) la presin osmtica del medio puede ser fcilmente reducida a los pocos das en cultivo, (c) la densidad celular puede
VHU PRGLFDGD DJUHJDQGR PHGLR GH FXOWLYR R las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradacin de algunos componentes del medio por la poblacin de protoplastos puede producir algunas sustancias citotxicas, cuya concentracin alrededor de las clulas ser menor en HO PHGLR OtTXLGR 8QD WpFQLFD PX\ HFLHQWH TXH combina medio slido y lquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovilizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en contnua agitacin. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 4). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son:
Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azcares, aminocidos, reguladores de crecimiento y tambin con aditivos inesSHFtFRV FRPR OHFKH GH FRFR KLGUROL]Ddo de casena, extracto de levadura, etc. El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la SDUHG FHOXODU 1RUPDOPHQWH VH DMXVWD con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos vara de 104 5 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirn, a partir de cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial GHEH VHU EDMD GH SURWRSODVWRV ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas
Figura 4: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. 3URWRSODVWRV GH PHVyOR B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. Planta regenerada.
densidades de cultivo. Para estos casos se desarroll la tcnica de cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras. Esta tcnica consiste en exponer una suspensin de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la divisin celular pero que quedan metabolicamente activas. Estas FpOXODV VH SODTXHDQ HQ XQ PHGLR DJDULcado, y luego se colocan por sobre stas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarn las colonias. Tambin suele XWLOL]DUVH SDSHO GH OWUR SDUD VHSDUDUODV de las clulas nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 l de medio de cultivo, logrando densidaGHV GH [ 3 protoplastos/ml. Con ayuda de un micromanipulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratacin del medio. Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico estimulan la divisin de los protoplastos.. Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. El origen de los protoplastos: el estado VLROyJLFR GHO WHMLGR GHO FXDO SURYLHQHQ y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada HFLHQFLD HQ OD UHVSXHVWD DO FXOWLYR
,GHQWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV KtEULGDV /D FRQGLFLyQ GH KtEULGR GHEH YHULFDUVH en la planta regenerada an cuando se haya efectuado algn tipo de seleccin para el culWLYR GH ODV FpOXODV KtEULGDV $ WDO Q HV FRQYHniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una mejor caracterizacin del hbrido. Comnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfolgicos. Los hbridos somticos pueden presentar rasgos morfolgicos caractersticos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citolgicos. El anlisis del complemen-
to cromosmico permite revelar si el hbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado ms de dos protoplastos, el grado de aneuploida y posibles translocaciones intergenmicas. Mediante hibridacin in situ HPSOHDQGR VRQGDV GH $'1 UHSHWLWLYR HVSHFtFR GH HVSHFLH SXHGH HYDOXDUVH con ms profundidad la contribucin de los genomas parentales y reestructuraciones cromosmicas en el hbrido. 3. Isoenzimticos. El patrn de bandas isoenzimticas del hbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el anlisis se deben emplear los mismos tejidos u rganos, y en el mismo estado fenolgico. 4. A nivel de ADN. La demostracin de la SUHVHQFLD GH $'1 GH DPERV SDUHQWDOHV es la prueba ms directa de la hibridaFLyQ (O DQiOLVLV GH $'1 HV LQGHSHQGLHQte del tejido empleado y de la edad de la SODQWD 3XHGH OOHYDUVH D FDER SRU 5)/3 SROLPRUVPRV HQ OD ORQJLWXG GH ORV IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ 5$3' SROLPRUVPRV HQ HO $'1 DPSOLFDGR DO D]DU o Southern blot, empleando sondas de $'1 UHSHWLWLYR HVSHFtFR GH HVSHFLH R GH JHQHV GH $51 ULERVRPDO 10 Logros y tendencias de la hibridacin somtica La hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando DVt HO XMR GH JHQHV HQ ORV FXOWLYRV /D WDEOD muestra algunos ejemplos de hbridos somticos que presentan algunas ventajas agronmicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridacin somtica permitiera producir nuevas
Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben algn carcter de inters agronmico
Hbrido Hbridos simtricos

Solanum tuberosum x S. brevidens
Carcter
S. tuberosum x S. circaeifolium S. tuberosum x S. phureja S. melongena x S. integrifolium/S. saintwongseis
Resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de papa (PLRV), al hongo Phytophtora infenstans y a la bacteria Erwinia cartovora. Resistencia a P. infenstans y al nemtodo Globodera pallida. Mayor productividad de tubrculo. Resistencia a la bacteria Pseudomonas solanacearum .
Hbridos asimtricos
Brassica oleracea x B. campestris B. napus x B. carinata/B. juncea Nicotiana tabacum x N. Repanda/N. glutinosa Resistencia al hongo Phoma lingam . Resistencia a P. lingam . Hipersensibilidad al virus del mosaico del tabaco (TMV).
Cbridos
B.campestris (silvestre) x B.napus/B. campestris (cultivar) Resistencia al herbicida atrazina y esterilidad masculina citoplasmtica (CMS).
especies que expresaran las caractersticas deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridacin entre tomate y papa, se busc producir plantas que desarrollaran tomates en la parte area y tubrculos en la raz (pomato). La experiencia mostr que difcilmente puedan lograrse estos hbridos espectaculares, debindose ms bien dirigir la tcnica hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridacin asimtrica o cibridacin, manteniendo las caractersticas generales del cultivo. 8QR GH ORV IDFWRUHV TXH GLFXOWD OD REWHQFLyQ de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los parentales que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de protoplastos permite sortear las barreras precigticas, siguen existiendo barreras genmicas que resultan en la eliminacin espontnea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad ge-
nmica es el estado de diferenciacin de los tipos celulares involucrados en la fusin. Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en fase GH FUHFLPLHQWR DFWLYR FRQ FpOXODV GHO PHVyOR que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas ltimas. Los hbridos somticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen muchas caractersticas no deseadas de la primera, adems de aqullas deseadas. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los hbridos suelen ser estriles. La hibridacin asimtrica y la cibridacin tienen la ventaja de incorporar slo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad.. $OJXQRV FDUDFWHUHV GHVHDEOHV HVWiQ FRGLcados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad citoplasmtica y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridacin dado que es un mtodo simple para transferir estos genes.
11 Algunos ejemplos Se han obtenido hbridos intergenricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al., 1986), Saccharum RIFLQDOLV (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa oryzicola, Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum, Festuca arundinacea (+) /ROLXP PXOWLRUXP. El primer caso de regeneracin de plantas maduras de hbridos intergenricos (simtricos y asimtricos) en gramneas fue el Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicacin de esta estrategia no ha conducido a la obtencin de nuevos hbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los mtodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el inters en la hibridacin somtica. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones ncleocitoplasmticas entre genomas.
12 Lecturas recomendadas
%KRMZDQL 66 5D]GDQ 0. 3URWRSODVW LVRlation and culture. Somatic hybridization and cybridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and 3UDFWLFH &DSLWXORV \ 66 %KRMZDQL \ 0. 5D]GDQ HGV (OVHYLHU $PVWHUGDP SS Lindsey y Jones, 1992. Biologa celular de la ingeniera gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, &DStWXOR (GLWRULDO $&5,%,$ 6$ =DUDJR]D Pp.105-142. Matsumoto, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecnologa Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: 26-28. Zimmermann,U. 1983. Electrofusion of cells: principles and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:149-156.
II CAPTULO 3 Epigentica y evolucin

5: 0DVXHOL \ &) 0DUl 1. Introduccin Uno de los principios bsicos de la biologa es que la variabilidad gentica es un pilar fundamental de la evolucin. Sin variabilidad la seleccin natural no podra actuar y la uniformidad gentica conducira a la poblacin o especie a un callejn sin salida en el proceso evolutivo. Este concepto propuesto por CharOHV 'DUZLQ HQ IXH FRUURERUDGR SRU HO UHdescubrimiento de las leyes de Mendel y por trabajos de genetistas un siglo despus. Sin embargo, la nocin de que la variabilidad gentica se encuentra asentada nicamente en la secuencia de nucletidos ha sido puesta en tela de juicio en los ltimos aos. Trabajos recientes especialmente en el rea de la Gentica Molecular muestran que la variabilidad heredable tambin se explica por cambios que no necesariamente implican alteraciones en las VHFXHQFLDV GH EDVHV GHO $'1 9DULDFLRQHV KHredables en los patrones de expresin gnica se pueden producir debido a mecanismos epigenticos con total ausencia de variabilidad JHQpWLFD (O WpUPLQR HSLJHQpWLFD VH UHHUH D cambios heredables en el fenotipo, y por lo tanto en la regulacin gnica, que no son causaGRV SRU DOWHUDFLRQHV HQ OD VHFXHQFLD GHO $'1 6H KDQ GHVFULWR WUHV PHFDQLVPRV GH FRGLFDcin de la informacin que no estn basados HQ OD VHFXHQFLD GH $'1 (VWRV VRQ D 0HWLODFLyQ GHO $'1 IXQGDPHQWDOPHQWH GH FLWRVLQDV E 0RGLFDFLRQHV SRVWWUDGXFFLRQDOHV GH KLVWRnas (acetilacin, fosforilacin, metilacin, etc) \ F 0HFDQLVPRV EDVDGRV HQ HO $51 $ VX YH] estos tres mecanismos actan en forma conjunta para mantener el grado de compactacin de la cromatina. En esta seccin nos referirePRV HVSHFtFDPHQWH D FRPR OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD SROLSORLGtD LQGXFHQ FDPELRV en los patrones de metilacin y dan lugar a nuevas fuentes de variabilidad. 2. La metilacin del ADN Uno de los mecanismos epigenticos ms estudiados en eucariotas es la incorporacin al
$'1 GH XQ JUXSR PHWLOR HQ OD SRVLFLyQ GHO anillo de citosina (5mC) (Figura 1a). En plantas la 5mC se distribuye en sitios donde se encuentran dinucletidos del tipo CG o trinucletidos &1* GRQGH 1 HV FXDOTXLHUD GH ORV FXDWUR QXFOHyWLGRV $ VX YH] OD PHWLODFLyQ GHO $'1 SXHde dividirse en metilacin de sitios simtricos y asimtricos. En el primer caso la metilacin VH SURGXFH HQ VLWLRV &* \ &1* GRQGH ODV FLtosinas metilables se encuentran de a pares ubicadas en hebras opuestas, mientras que la metilacin en sitios asimtricos se produce en citosina ubicadas en un contexto diferente en HO $'1 /D PHWLODFLyQ VLPpWULFD HV OD PiV FRmn y permite que los patrones de metilacin VH PDQWHQJDQ D WUDYpV GH OD HQ]LPD $'1 PHtiltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil metionina a ODV FLWRVLQDV GHO $'1 (Q Arabidopsis thaliana los genes CMT3 y MET1 FRGLFDQ SDUD ODV HQzimas Cromometiltransferasa 3 y Metiltransferasa 1, respectivamente, la primera metila los JUXSRV &1* \ OD VHJXQGD ORV VLWLRV &* 'HVSXpV GH OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1 VyOR OD KHEUD
Figura 1. A. Agregado del grupo metilo al carbono 5 de la citosina. B. Mantenimiento de los patrones GH PHWLODFLyQ GHO $'1 SRU ODV HQ]LPDV $'1 PHWLOWUDQVIHUDVDV GXUDQWH OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1
molde mantiene el patrn de metilacin origiQDO /DV HQ]LPDV $'1 PHWLOWUDQVIHUDVDV VH HQcargan de metilar la hebra nueva de acuerdo al patrn de metilacin de la hebra molde en los VLWLRV &* \ &1* )LJXUD E (VWH PHFDQLVPR permite que se hereden los patrones de metilacin tanto entre clulas (mitticamente) como entre generaciones (meiticamente). La protena DDM1, la cual es un factor remodelador de la cromatina, tambin participa en el manteniPLHQWR GH SDWURQHV GH PHWLODFLyQ HVSHFtFRV a lo largo del genoma. Los mutantes de Arabidopsis ddm1 ('HFLHQW LQ '1$ 0HWK\ODWLRQ) tienen una reduccin del 70% en los niveles de 5mC, lo cual provoca una amplia variedad de defectos en el desarrollo de las plantas al inducir cambios heredables en otros loci. Si bien los patrones de metilacin son heredables, se ha demostrado que no son estticos y que el estado de desarrollo de la planta y condiciones ambientales alteran estos patrones. Por otro lado, la metilacin est asociada a cambios en la expresin gnica. En general el incremento en la metilacin (hipermetilacin) de un locus no solo produce la reduccin en la expresin o el total silenciamiento del mismo, sino que tambin reprime transcripcionalmente e inactiva transposones capaces de movilizarse a travs del genoma. Se demostr que anulando (knock out) los genes CMT3 y MET1 se desmetila el genoma activndose elementos transponibles y genes que se encontraban silenciados. Estos estudios mostraron que la prdida de metilacin produce aberraciones tales como cambios PRUIROyJLFRV HQ KRMDV \ RUHV FRPR DVt WDPELpQ HQ HO WLHPSR GH RUDFLyQ 3. Mtodos para analizar la variacin epigentica Los mtodos comnmente utilizados para analizar la variabilidad gentica, tales como AFLP ($PSOLHG )UDJPHQW /HQJKW 3RO\PRUphism 5)/3 Restriction Fragment Length Polymorphism 613 Single Nucleotide Polymorphism R 665 0LFURVDWpOLWHV QR VRQ adecuados para medir la variabilidad epigenWLFD 8QD PRGLFDFLyQ GH OD WpFQLFD GH $)/3 llamada MSAP (Methylation Sensitive AmSOLHG 3RO\PRUSKLVP), en la que se reemplaza la enzima de corte frecuente MseI por los
isoesquizmeros HpaII y MspI, sensibles a la metilacin, que permiten detectar la metilacin externa o interna de las citosinas en el sitio de reconocimiento 5-CCGG- 3 de las enzimas (Figura 2). Otro mtodo desarrollado que permite analizar la metilacin es la secuenciacin SUHYLR WUDWDPLHQWR GHO $'1 FRQ ELVXOWR TXH convierte las citosinas no metiladas en uracilo quedando las citosinas metiladas intactas. /XHJR OD VHFXHQFLD WUDWDGD VH DPSOLFD SRU 3&5 UHHPSOD]DQGR ORV XUDFLORV SRU WLPLQDV para su posterior secuenciacin. A travs de estos mtodos es posible analizar el estado de metilacin de secuencias aleatorias (MSAP) o VHFXHQFLDV HVSHFtFDV VHFXHQFLDFLyQ SRU ELVXOWR \ GHWHUPLQDU OD YDULDFLyQ HSLJHQpWLFD HQ poblaciones naturales.
Figura 2. Esquema que representa el anlisis de PHWLODFLyQ GHO $'1 D WUDYpV GH OD WpFQLFD GH 06$3 (0HWK\ODWLRQ 6HQVLWLYH $PSOLHG 3RO\PRUSKLVP). El $'1 VH FRUWD FRQ ODV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ Eco5, \ HpaII/Msp, OXHJR VH OLJDQ DGDSWDGRUHV HVSHFtFRV SDUD ODV HQ]LPDV \ VH DPSOLFDQ ORV IUDJPHQWRV FRQ primers que reconocen la secuencia de los adaptadores. Si las citosinas del sitio de reconocimiento de HpaII (CCGG) se encuentran metiladas, esquema de la derecha, la enzima no corta y por lo tanto no VH DPSOLFD HO IUDJPHQWR JHQHUDQGR SROLPRUVPR
4. Epigentica y variacin natural El grado de metilacin de genes puede variar entre plantas produciendo cambios en la expresin y nuevos fenotipos que son heredaEOHV $ ODV VHFXHQFLDV JpQLFDV TXH GLHUHQ HQ
el grado de metilacin se les llama alelos epigenticos o epialelos. Se han descrito varios ejemplos de epialelos que ocurren naturalmente. Un ejemplo clsico es el gen CYCLOIDEA en Linaria vulgaris TXH FRGLFD SDUD XQ DFWLvador de la transcripcin cuyo efecto es la preVHQFLD GH XQ IHQRWLSR RUDO GH VLPHWUtD UDGLDO y otro de simetra bilateral. A travs del anlisis molecular de este gen se demostr que en la naturaleza existan dos epialelos, uno ms metilado que produce la simetra radial y otro con menor metilacin asociado a la simetra bilateral. Mediciones de los patrones de metilacin entre introducciones de Arabidopsis thaliana muestran variaciones en los patrones de metilacin de ms del 34% siendo menores al 1% las variaciones en metilacin entre plantas dentro de una misma introduccin. En una poblacin natural de la especie silvestre de papa Solanum ruiz-lealli se encontr que plantas que tenan una variacin gentica menor al 1% (medida por AFLP) presentaban variaciones en los patrones de metilacin (medida por MSAP) superiores al 18%. Estas variaciones QR VRQ SURGXFLGDV SRU SROLPRUVPR GH QXFOHytidos sino por variaciones en los patrones de PHWLODFLyQ 5HVXOWDGRV VLPLODUHV VH REWXYLHURQ analizando introducciones de algodn donde la diversidad detectada por MSAP fue superior a OD REWHQLGD DQDOL]DQGR SDWURQHV GH 5)/3 5. Cambios epigenticos producidos por KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ SROLSORLGtD /D KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD SROLSORLGtD son dos mecanismos profundamente relacionados que han jugado roles muy importantes en la evolucin vegetal. Una de sus caractersticas ms sobresalientes es la capacidad de generar una amplia variacin fenotpica de gran importancia en la microevolucin adaptativa. La poliploidizacin implica la generacin de un organismo con un nmero aumentado de complementos genmicos completos. Los juegos cromosmicos adicionales pueden provenir de la misma especie (autopoliploida) o de una especie divergente (alopoliploida), implicando en este ltimo caso un proceso de hibriGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD $ VX YH] OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD VH GHQH FRPR OD IRUPDFLyQ GH un nuevo organismo por cruzamiento entre dos
especies diferentes aunque relacionadas. Tanto en el caso de la alopoliploida como en la KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD GRV JHQRPDV GLYHUgentes se unen en un ncleo hbrido, desencadenando una serie de cambios genticos y epigenticos que dan lugar a una gran variabilidad fenotpica (Figura 3). En hbridos alopoliploides sintticos de Arabidopsis se demostr que se producen inestabilidades fenotpicas asociadas con cambios en la metilacin y en la expresin gnica. Por otro lado en generaciones tempranas de hbridos alopoliploides de trigo y Brassica se reportaron cambios genticos estructurales tales como eliminacio-
Figura 3. Esquema que representa el estrs o shock genmico producido por efecto de la hibriGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD (O FUX]DPLHQWR GH GRV HVpecies que han divergido induce alteraciones en los patrones de metilacin en el ncleo hbrido que producen cambios en la transcripcin y reestructuraciones genticas tales como: movimiento de transposones, rearreglos cromosmicos y cambios en la cromatina.
nes de secuencias. En nuestro Laboratorio VH REWXYR XQ KtEULGR LQWHUHVSHFtFR HQWUH XQ haploide de la papa cultivada Solanum tuberosum (2n=2x=24) y la especie silvestre Solanum kurtzianum (2n=2x=24). Algunas plantas KtEULGDV SUHVHQWDEDQ PDOIRUPDFLRQHV RUDOHV similares a las descritas en Arabidopsis, que LQFOXtDQ FDPELRV HQ OD PRUIRORJtD RUDO SpWDORV GLVHFWDGRV DQWHUDV DWURDGDV \ HVWLORV UHtorcidos entre otras. Por otro lado, los hbridos presentaban nuevos fragmentos de AFLP y 5$3' 5DQGRP $PSOLHG 3RO\PRUSKLF '1$) que no estaban presentes en los padres. As mismo, el anlisis de la metilacin por MSAP
mostr cambios en los patrones de metilacin de las plantas hbridas en relacin a las especies progenitoras. Estos resultados obtenidos HQ GLVWLQWRV KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV VXJLHUHQ que existe una correlacin entre la remodelacin general de la metilacin del genoma hbrido, los cambios genticos y la alteracin de la actividad gnica y el fenotipo. En resumen, tanto la poliploida como la hiEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD LQGXFHQ FDPELRV JHnmicos como producto del estrs generado por la duplicacin gnica o por la reunin de dos genomas divergentes en un ncleo hbriGR $GHPiV GH OD PHWLODFLyQ GHO $'1 RWURV PH-
Figura 4. Anlisis de la segregacin de los patrones de metilacin en plantas de las generaciones F1 y 5&1 $ SRUFLyQ GH ORV SDWURQHV GH DPSOLFDFLyQ 06$3 GH S. tuberosum (tbr), S. kurtzianum (ktz), dos hbridos F1 (H1 y H4 \ WUHV SODQWDV GH OD UHWURFUX]D 5&1) H1 x S. kurtzianum y H4 x S. kurtzianum. El $'1 H[WUDtGR IXH GLJHULGR FRQ Eco5,HpaII (H) y Eco5,MspI (M). El Patrn de metilacin del fragmento 1 cambia en las progenies sucesivas. El fragmento 2 muestra un patrn de metilacin altamente conservado. % LQWHUSUHWDFLyQ JUiFD GH ORV IUDJPHQWRV 06$3 \ GHO SDQHO $ /RV FXDGUDGRV UHSUHVHQWDQ HO VLWLR de reconocimiento doble cadena (CCGG) de los isoesquizmeros HpaII/MspI. Cuadrados negros indican citosinas metiladas.
canismos tales como, acetilacin y metilacin de histonas, activacin de transposones y reJXODFLyQ SRU SHTXHxRV $51V \ $51 GH LQWHUIHrencia pueden causar cambios en la expresin gnica de hbridos y poliploides. 6. Herencia de los patrones de metilacin La obtencin de mutantes que afectan la PHWLODFLyQ GHO $'1 KD SHUPLWLGR XQ DPSOLR GHsarrollo de esta rea. Las anormalidades en el desarrollo observadas en mutantes ddm1 de Arabidopsis son trasmitidas a la progenie, inclusive en lneas que segregan respecto a la mutacin ddm1. Estas observaciones morfolgicas de plantas ddm1 se correlacionan con datos moleculares, ya que la reduccin en la metilacin que afecta a la mayora de las secuencias del genoma de estas plantas, tanto repeticiones como secuencias de bajo nmero de copias, pueden ser heredadas establemente a travs de la mitosis y meiosis. Esto indica que la informacin epigentica, en forma de PHWLODFLyQ GLIHUHQFLDO GHO $'1 SXHGH VHU WUDVmitida en plantas a travs de generaciones de reproduccin sexual. Otro modelo experimental que ha permitido obtener importante informacin acerca de la dinmica en los patrones de metilacin es la obtencin de alopoliploides H KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV VLQWpWLFRV /D REtencin de progenies a travs de cruzamientos sexuales controlados permite una comparacin precisa entre la generacin parental y la desFHQGHQFLD (Q OD )LJXUD VH HMHPSOLFD FyPR a travs de anlisis MSAP se pueden inferir los patrones de metilacin de secuencias CCGG. Estudiando generaciones sucesivas de reproGXFFLyQ VH[XDO )LOLDO ) 5HWURFUX]D 5& etc.) se puede evidenciar si ocurren cambios en la metilacin y qu estabilidad tienen los mismos. Datos obtenidos en hbridos interesSHFtFRV VLQWpWLFRV GLSORLGHV \ SROLSORLGHV GH varias especies indican que en el genoma de las plantas existen secuencias particularmente sensibles a remodelar su metilacin (Fragmento 1 de la Figura 4). Por otro lado, hay secuencias con patrones de metilacin altamente conservados evolutivamente, ya que especies diferentes comparten un mismo patrn, el cual a su vez se hereda invariablemente en todas las plantas obtenidas en generaciones sucesi-
vas de reproduccin sexual (Fragmento 2 de la Figura 4). Desde un punto de vista evolutivo la variabilidad generada por mecanismos epigenticos ampla la variabilidad gentica ya que aparecen nuevos epialelos que pueden ser seleccionados en poblaciones naturales. Adems, las variantes epiallicas son potencialmente reversibles y generaran fenotipos ms H[LEOHV TXH VH DGDSWDUtDQ D DPELHQWHV FDPbiantes. A partir de este tipo de evidencias, un concepto que est ampliamente documentado para fenmenos genticos, debe ser ampliado de manera que abarque la informacin epigentica: en cada generacin se reconstituye un reservorio epigentico enteramente nuevo, del cual surgen los individuos que son los blancos de la seleccin natural en esa generacin. 6. Lecturas recomendadas
$GDPV ./ DQG :HQGHO -) 1RYHO SDWWHUQV of gene expression in polyploid plants. Trends in Genetics 21:569-543. Jablonka E. and Lamb M. 1995. Epigenetic inheritance and evolution. The Lamarckian dimension. 2[IRUG 8QLYHUVLW\ 3UHVV 1HZ <RUN SS Kalisz S. and Purugganan M.D. 2004. Epialleles vs '1$ PHWK\ODWLRQ FRQVHTXHQFHV IRU SODQW HYROXtion. Trends in Ecology and Evolution 19:309-314. Madlung A. and Comai L. 2004. The effect of stress on genome regulation and structure. Annals of Botany 94:481-495. 0DUO &) &DPDGUR (/ DQG 0DVXHOOL 5: Phenotypic instability and epigenetic variability in a diploid potato of hybrid origin, Solanum ruizlealii. BMC Plant Biology 9:21. 5DSS 5$ DQG :HQGHO -) (SLJHQHWLFV DQG SODQW HYROXWLRQ 1HZ 3K\WRORJLVW 5LGGOH 1& DQG %LUFKOHU -$ (IIHFWV RI UHXnited diverged regulatory hierarchies in allopolyploids and species hybrids. Trends in Genetics 19:597-600.
II. CAPTULO 4 Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING

Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban H Hopp 3.1. Mutagnesis clsica 3.1.1. Introduccin El concepto de mutacin en Biologa fue introducido a principios del siglo pasado por de Vries, para designar a los cambios heredables de aparicin sbita. Hoy en da las mutaciones VH H[SOLFDQ SRU DOWHUDFLRQHV HQ HO $'1 TXH YDQ desde cambios en una o unas pocas bases (mutaciones de punto) hasta prdidas, adiciones o WUDQVORFDFLRQHV GH JUDQGHV SRUFLRQHV GH $'1 (cambios estructurales) o incluso cromosomas y genomas enteros; tambin podran incluirse entre ellas las alteraciones heredables de naturaleza epigentica, por ejemplo los cambios HQ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 YHU *UDQW'ZRQWRQ y Dickinson, 2005). Las mutaciones son el origen primario de la variabilidad gentica y, por lo tanto, cierto control sobre su frecuencia y/o espectro puede considerarse una herramienta de gran valor para el mejoramiento de las plantas FXOWLYDGDV $ QHV GH OD GpFDGD GHO 6WDGOHU desarroll magistralmente las bases de la mutagnesis experimental en plantas cultivadas, hecho que fue contemporneo a los trabajos pioneros de Muller sobre mutagnesis en Drosophila. El primer xito comercial consisti en una mutante de tabaco de hoja clara y de gran calidad obtenida por Tollenar (Holanda) que lleg a cubrir una importante rea de cultivo en Indonesia a mediados de la dcada del 30. Hoy en da existen en el mundo miles de cultivares inscriptos obtenidos por esta metodologa. Se incluyen en esta lista, cultivos de gran importancia econmica, como los principales cereales, oleaginosas, as como, numerosas especies de hortalizas y cultivos industriales. Los caracteres que han sido mejorados son muy diversos: tolerancia a herbicidas, a estrs biticos o abiticos, calidad nutricional, industrial, etc. (para ms informacin ver IAEA 1995, Datta 2005). Adems, la ampliacin de la variabilidad disponible por medio de las mutaciones inducidas
ha contribuido considerablemente a dilucidar procesos biolgicos fundamentales para la vida vegetal y para la productividad de los cultivos. Las investigaciones en busca de mejorar la HIHFWLYLGDG \ OD HVSHFLFLGDG GH ORV WUDWDPLHQtos mutagnicos sobre las plantas cultivadas, y de procedimientos de manejo y seleccin ms HFLHQWHV WXYLHURQ XQ JUDQ DXJH HQ ODV GpFDdas del 50, 60 y 70. Hoy existe un renovado inters por esta temtica al que sin duda contribuy el enorme conocimiento generado por la biologa molecular, que alej viejos fantasmas sobre la variabilidad inducida, y el reciente desarrollo de tcnicas moleculares de gran capacidad de anlisis como la tcnica de gentica reversa denominaGD 7,//,1* GHO LQJOpV Targeting Induced Local Lesions in Genomes). A continuacin se discuten los principales IDFWRUHV D WHQHU HQ FXHQWD SDUD OD DSOLFDFLyQ Hciente de la metodologa clsica de mutaciones inducidas en plantas cultivadas. La descripcin detallada de protocolos puede consultarse por HMHPSOR HQ 1HXIIHU ,$($ .RRUQneef, 2002. 3.1.2. Tratamientos mutagnicos 3.1.2.1. Agentes mutagnicos /RV DJHQWHV DUWLFLDOHV XWLOL]DGRV HQ PXWDJpnesis clsica pueden dividirse segn su naturaleza en dos grandes grupos: fsicos o qumicos. 2WUD PDQHUD DUWLFLDO GH LQFUHPHQWDU OD WDVD de mutaciones es a travs de las condiciones especiales del cultivo in vitro de clulas o de tejidos (variacin somaclonal). Tambin existen factores de naturaleza biolgica que causan algn tipo de inestabilidad gentica mayor a la habitual de la especie, como la producida por ejemplo por genes relacionados con los sistePDV GH UHSDUDFLyQ GH $'1 R SRU OD DFWLYDFLyQ de transposones. Agentes fsicos Entre stos tenemos distintos tipos de radiaciones ionizantes como los rayos X, los rayos gamma, los neutrones, los protones y las partculas alfa, cada una de ellas con diferente poder de ionizacin y de penetracin. Las radiaciones ionizantes al atravesar la materia producen iones radicales inestables y electrones libres, que a su vez originan una
serie de reacciones qumicas directas (por ionizacin de un tomo en una molcula), o indirectas (por reaccin de las macromolculas con productos radiolticos, mayormente con los radicales OH del agua). Entre otros cambios TXtPLFRV TXH DIHFWDQ HO $'1 RFXUUH OD GHDPLnacin de bases y produccin de 8-hidroxiadenina y de varios glicoles de timina, oxidacin de alcoholes de la desoxirribosa y roturas de las uniones carbono-carbono. Los tratamientos con radiaciones ionizantes implican habitualmente altos niveles de dao cromosmico, originando roturas simples y dobles de las cadeQDV GH $'1 \ HIHFWRV VLROyJLFRV GHOHWpUHRV que conducen a una alta letalidad celular y a una alta esterilidad de las plantas de la primera generacin, todo lo cual limita la obtencin de una alta tasa de mutaciones en la segunda generacin. La magnitud y el tipo de dao ocasionado por las radiaciones ionizantes son marcadaPHQWH LQXLGRV SRU FLHUWDV FDUDFWHUtVWLFDV GHO material tratado, como el estado metablico y el contenido de agua y de oxgeno. As tambin, los efectos de determinada dosis pueden variar de acuerdo al mayor o menor tiempo en que se aplica (tasa de irradiacin), desde unos pocos segundos o minutos (irradiacin aguda) hasta meses o aos (irradiacin crnica). Los efectos letales de determinada dosis pueden disminuirse, por ejemplo, cuando se aplica repartida en distintos momentos, con intervalos de uno o varios das de recuperacin o incluso dividida en aplicaciones agudas realizadas en aos sucesivos (tratamientos recurrentes). Las radiaciones ionizantes que ms se han XWLOL]DGR SDUD LQGXFLU YDULDELOLGDG FRQ QHV GH WRPHMRUDPLHQWR VRQ ORV UD\RV ; \ ORV JDPPD con longitudes de onda del orden de fracciones de nanmetros (nm) a varios nm. Si bien los rayos gamma tienen mayor poder de penetracin que los X, los dos pueden penetrar desde varios milmetros a centmetros, siendo por lo tanto adecuados para tratamientos aplicados sobre semillas o yemas vegetativas. Ambas son radiaciones de origen electromagntico de baja energa lineal liberada al atravesar la PDWHULD SRU OR TXH VRQ FODVLFDGDV FRPR QR densamente ionizantes, en contraposicin con las densamente ionizantes, como por ejemplo
los neutrones ligeros. Las consecuencias genticas tpicas de las radiaciones ionizantes son las aberraciones cromosmicas, como las deleciones y translocaciones, que han resultado de utilidad para la ubicacin de numerosos genes sobre los cromosomas. Las deleciones producidas por las radiaciones densamente ionizantes son de mayor tamao y se agrupan, formando clusters, siendo ms difciles de reparar. Las de mayor tamao difcilmente sorWHDQ HO OWUR GH OD JDPHWRJpQHVLV SRU OR TXH HQ muchos casos no son transmitidas sexualmente a las progenies. Las deleciones conducen a knock outs gnicos y han sido utilizadas por ejemplo para inactivar genes que promueven la susceptibilidad a algunas enfermedades en trigo. En combinacin con la tecnologa de miFURDUUHJORV SXHGHQ SHUPLWLU OD LGHQWLFDFLyQ de genes candidatos cuya expresin pueden cambiar drsticamente. En muchos casos, las deleciones pueden ser localizadas por medio de Southern blot R 3&5 UHDFFLyQ HQ FDGHQD de la polimerasa). Por otro lado, las propiedades de las radiaciones ionizantes para romper los cromosomas y permitir as translocaciones han sido utilizadas desde hace ms de 50 aos para transferir segmentos cromosmicos entre distintas especies; tcnica que se ha utilizado para mejorar la resistencia a enfermedades en trigo. La luz ultravioleta es tambin una radiacin de origen electromagntico, pero a las longitudes de onda habitualmente utilizadas no se considera ionizante. Su longitud de onda es varios miles de veces superior a la de los rayos X y gamma, y por su baja penetracin slo es utilizable sobre materiales muy delgados, como por ejemplo granos de polen y cultivos celulares o de tejidos. La luz ultravioleta origina XQ GDxR PX\ HVSHFtFR VREUH HO $'1 FRQVWLtuido mayormente por la formacin de dmeros GH WLPLQD TXH D VX YH] VRQ HFLHQWHPHQWH UHparados por sistemas celulares muy especializados. Su efecto biolgico vara considerablemente de acuerdo a la longitud de onda, siendo OD GH PD\RU DEVRUFLyQ SRU HO $'1 DTXHOOD HQ HO rango de 250 a 290 nm. Agentes qumicos Las primeras investigaciones sobre la capacidad mutagnica de las sustancias qumicas
datan de principios del siglo pasado, pero su XVR HQ WRPHMRUDPLHQWR VH FRQFUHWy PXFKRV aos despus a travs de los trabajos que facilitaron el uso al disminuir los requerimientos en equipamientos e instalaciones. Existen muchas sustancias con capacidad mutagnica, sin embargo los ms utilizados FRQ QHV SUiFWLFRV VRQ ORV GHQRPLQDGRV VXpermutgenos, entre ellos varios agentes alquilantes y la azida sdica, que pueden aumentar varios cientos de veces las tasas de mutacin espontnea. A diferencia de los tratamientos con radiaciones ionizantes donde las molculas son afectadas indiscriminadamente, los mutgeQRV TXtPLFRV VXHOHQ VHU PiV HVSHFtFRV /RV ejemplos clsicos son el cido nitroso y los anlogos de bases, productores de sustituciones del tipo transicin, y las acridinas que producen mutaciones de desfase de lectura. Los mutgenos qumicos que ms se han utilizado HQ WRPHMRUDPLHQWR VRQ ORV DJHQWHV DOTXLODQtes, denominados as por incorporar grupos alquilo a las macromolculas. A este grupo pertenecen los alquil alcano sulfonatos, como el etil metano sulfonato (EMS) y el metil metano sulfonato (MMS), los dialquil sulfatos, como el dimetilsulfato (DMS) y el dietilsulfato (DES); y ORV FRPSXHVWRV QLWURVRV FRPR OD 1PHWLO1QLWURVRXUHD 018 R 01+ \ OD 1HWLO1QLWURVR XUHD (18 6H WUDWD GH FRPSXHVWRV HOHFWURflicos que reaccionan con tomos que tienen XQ SDU GH HOHFWURQHV OLEUHV FRPR 6 1 \ 2 HQ ese orden, de mayor a menor fuerza nucleoflica), y de esta manera actan sobre las bases y ORV JUXSR IRVIDWRV GHO $'1 \ WDPELpQ VREUH ODV protenas. Los agentes de mayor reactividad, FRPR HO 006 \ HO '06 WLHQHQ DQLGDG SRU ORV FHQWURV PiV QXFOHRItOLFRV \ HQ HO $'1 DWDFDQ PD\RUPHQWH HO QLWUyJHQR GH OD JXDQLQD 1 G) y muy poco al O6-G o al grupo fosfato. Por el contrario, los agentes de menor reactividad FRPR (18 WLHQHQ XQ PD\RU HVSHFWUR GH VLWLRV de alquilacin y afectan en mayor proporcin al O6-G. Esto tiene su importancia si consideramos que la O6-alquilG sera la principal causa de apareamientos errneos de G con T, mienWUDV TXH OD 1DOTXLO* RULJLQD GHSXULQDFLyQ \ errores de reparacin, que tienden a derivar en roturas cromosmicas y ocasionalmente en
GHOHFLRQHV GH SDUHV GH EDVHV /D 018 WDPbin de baja reactividad, adems de las alquilaciones mencionadas, forma mayor cantidad de fosfodisteres, los que pueden derivar en URWXUDV GH FDGHQDV GH $'1 \ FRQWULEXLU D OD OHtalidad. El mutgeno qumico que ms se ha utilizado es el EMS, que habitualmente se asume como productor de mutaciones de punto del tipo transicin G/C a A/T. En relacin a esto es interesante advertir que hay 5 aminocidos que en sus codones slo tienen G o C en posiciones sinnimas, por ejemplo lisina (AAA o AAG) y tirosina (UAU o UAC), por lo que no podran ser cambiados por otros aminocidos mediante transiciones del tipo G/C a A/T. 8Q PXWiJHQR PX\ HFLHQWH HQ DOJXQDV SODQtas cultivadas, como cebada, arveja, trigo y arroz, es la azida sdica. Esta droga no es de por s mutagnica sino que necesita de la va de la sntesis de L-cistena para transformarse en el metabolito mutagnico azido-alanina. La azida no se ha visto como mutagnica en mamferos y por lo tanto desde el punto de vista de la bioseguridad, no sera peligrosa como mutgeno en humanos, ms all de su reconocida toxicidad como veneno de la respiracin oxidativa. En cebada, la azida sdica induce esencialmente sustituciones de bases, en su mayor parte transiciones, existiendo resultados divergentes en la bibliografa sobre su tipo: G/C a A/T o viceversa. Tanto la azida como el EMS, por su propiedad de inducir mutaciones de punto, son mutgenos indicados para la obtencin de series allicas y ambos han sido utilizados para generar poblaciones para anlisis de gentica reYHUVD FRPR HO 7,//,1* YHU PiV DGHODQWH $FWXDOPHQWH ODV WpFQLFDV GH 7,//,1* HVWiQ DSRUtando una enorme cantidad de informacin sobre el efecto molecular de los mutgenos. Esto ha permitido detectar que ms del 50 % de las mutaciones inducidas por EMS o azida sdica son de sentido cambiado, y ms del 20 % son mutaciones silenciosas. En trminos generales aplicando estos agentes en varias plantas FXOWLYDGDV VH KDQ LGHQWLFDGR SROLPRUVPRV HQ QXFOHyWLGRV VLPSOHV 613V FRQ XQD IUHFXHQFLD que va de 1/50 a 1/500 kb. Se cree importante sealar que adems de las propiedades particulares de los mutgenos
KD\ IDFWRUHV ELROyJLFRV TXH LQX\HQ VREUH OD tasa y el espectro de mutaciones, como la fase en que se encuentre la clula en el momento de ser tratada (G1, S o G2), la composicin de bases y el tamao del gen y, dependiendo del WLSR GH GDxR OD HFLHQFLD GH ORV GLVWLQWRV VLVtemas de reparacin celular y las condiciones en que estos acten. Todo esto hace que dosis similares de un mismo mutgeno puedan tener efectos biolgicos muy dispares. 3.1.2.2. Materiales tratados rganos seleccionados para el tratamiento En el caso de especies propagadas por semillas, stas han sido el rgano preferido a tratar, ofreciendo la ventaja de un manejo sencillo que permite trabajar con grandes cantidades de material en condiciones relativamente fciOHV GH FRQWURODU /D SULQFLSDO GLFXOWDG GHO WUDtamiento de semillas radica en la constitucin multicelular del embrin, que hace que los individuos originados a partir de la semilla tratada resulten quimricos, es decir compuestos por clulas o clones celulares de distinta constitucin gentica. Esto es as porque en cada clula, los cambios genticos o mutaciones que potencialmente puede producir el mutgeno pueden tener muchsimas alternativas diferentes, haciendo cercana a cero la probabilidad de que un grupo de clulas meristemticas muten simultneamente en el mismo gen y posicin nucleotdica Los clones celulares que forman la planta adulta tienen un crecimiento irregular de difcil prediccin que complica el diseo de XQ PDQHMR HFLHQWH GHO PDWHULDO H[SHULPHQWDO A pesar de esto, el tratamiento de semillas ha dado numerossimos xitos aplicados al mejoramiento de diversos cultivos. Como se seal anteriormente los tratamientos fsicos de semillas deben hacerse con radiaciones que tengan VXFLHQWH SHQHWUDFLyQ SRU HMHPSOR UD\RV ; rayos gamma, o neutrones ligeros, as como tambin se deber prestar atencin a los diverVRV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ HO HIHFWR ELROyJLFR de las radiaciones. Por otro lado, los tratamientos qumicos de semillas se aplican mediante inmersin en solucin acuosa y con agitacin constante durante varias horas. Los tratamientos cortos suelen aplicarse despus de un remojo en agua que potencia marcadamente el
efecto de los mutgenos. Luego del tratamiento qumico, la semilla se lava cuidadosamente y se seca, y una vez eliminada la humedad VXSHUFLDO HVWDUi OLVWD SDUD OD VLHPEUD (Q OD semilla tratada se inicia la generacin M1, esta nomenclatura denota la primera generacin de PXWDQWHV \ VH GLIHUHQFLD GH XQD ) HQ TXH 12 es resultado de un cruzamiento, sino de un tratamiento mutagnico. En las plantas de propagacin vegetativa los equivalentes a las semillas son los rganos de multiplicacin como yemas, rizomas, etc. stos son tambin rganos multicelulares y la complejidad de crecimiento de los sectores mutaGRV HV D~Q PD\RU TXH HQ ODV VHPLOODV 1R REVtante, esto no ha sido impedimento para que, en la prctica, se hayan obtenido numerosos cultivares mejorados. En general los rganos vegetativos son ms sensibles que las semillas a los efectos txicos de los mutgenos qumicos y resulta ms difcil lograr aplicaciones homogneas. Por ello, las radiaciones ionizantes FRQ VXFLHQWH SHQHWUDFLyQ KDQ VLGR ODV PiV utilizadas en estos casos. Por medio de irradiacin de yemas con altas dosis puede reducirse el nmero de clulas del vstago y as tender a la obtencin de vstagos mutantes no quimricos. El problema del quimerismo de las plantas M1 puede evitarse tratando rganos unicelulares como vulos, polen o proembriones unicelulares, y en el caso de plantas de multiplicacin vegetativa, por tratamiento de yemas adventicias o de cultivos in vitro de clulas o tejidos. La utilizacin de mutagnesis inducida en combinacin con el cultivo in vitro presenta adems la ventaja de permitir una seleccin sobre un gran nmero de clulas mutagenizadas. Si bien esta seleccin est limitada a caracteres que puedan ser evidenciados en estas condiciones, son varios los casos que han resultado exitosos, por ejemplo con respecto a mejorar la tolerancia a temperaturas extremas y resistencia a algunas enfermedades y herbicidas. Eleccin de los genotipos parentales /D ORVRItD GH OD PXWDJpQHVLV LQGXFLGD DSOLcada al mejoramiento es en cierta medida similar a la de la retrocruza, en el sentido que se
busca cambiar un gen (o unos pocos) conservando un fondo gentico determinado. Por otro lado, se diferencia claramente de ella en que la variante allica de inters es generada de novo y, por lo tanto, puede ser una variante no presente en el germoplasma actual de la especie. Es aconsejable partir de genotipos con un buen fondo gentico, de manera que puedan ser mejorados por cambios en uno o unos pocos genes. Por ejemplo, puede mejorarse la resistencia gentica a determinada enfermedad conservando un fondo gentico de buenas caractersticas agronmicas y/o de calidad industrial o comercial. Tambin por cambios en un solo gen puede adaptarse un genotipo a una nueva regin mediante mutantes para el largo de ciclo, o por ejemplo cambiar drsticamente la calidad industrial por mutantes en las caractersticas del aceite de la semilla. 3.1.3. Evolucin de los daos de los tratamientos mutagnicos 3.1.3.1 Desarrollo de los sectores mutantes Tal como se ha descripto, el tratamiento de rganos multicelulares originar plantas M1 quimricas en las que las mutaciones inducidas slo ocuparn un sector. El tamao y la forma de estos sectores mutantes dependern de varios factores: A) Factores inherentes al material tratado, como el estado de desarrollo y la estructura del embrin o del meristema vegetativo y la ontogenia de la especie. Esto ha sido estudiado principalmente mediante marcadores cloroflicos y mutantes del polen, y ms recientemente por tcnicas basadas en la recombinacin de $'1 SDUD DFWLYDU PDUFDGRUHV HVSHFtFRV (Q plantas con alta capacidad de macollaje, como cebada o trigo, la tendencia general es que el tejido germinativo de las espigas principales provenga de varias clulas iniciales (generalmente de 4 a 12) mientras que puede encontrarse que ms de una espiga lateral provenga de la misma clula inicial. B) Factores relativos al tratamiento como el tipo de mutgeno, dosis y condiciones de aplicacin. En general los tratamientos que inducen alta letalidad celular, como por ejemplo altas dosis de radiaciones ionizantes, reducirn el nmero de clulas meristemticas a partir de
las cuales se formar la planta M1 y por lo tanto en stas tender a aumentar el tamao de cada uno de los clones celulares. C) Factores relativos al mutante inducido, esSHFLDOPHQWH HQ OR TXH VH UHHUH D VX H[SUHVLyQ y competitividad. En especies reproducidas sexualmente los sectores mutantes tendrn TXH VRUWHDU GRV WLSRV GH OWURV VHOHFWLYRV SDUD llegar a la segunda generacin (M2). En esta generacin, salvo excepciones, las plantas tendrn una constitucin gentica homognea en todo el soma. En el caso de plantas autgamas, la segregacin de homocigotas mutantes en M2, permitir la observacin de los alelos mutantes que tengan expresin recesiva. En el caso de las algamas para que esto ocurra ser necesario realizar la autofecundacin forzada de las plantas M1. En el maz, por ser una planta diclino monoica en la que los clones ceOXODUHV TXH IRUPDQ ODV RUHV IHPHQLQDV \ PDVculinas se originan en distintas clulas iniciales de la semilla, la autofecundacin de las plantas M1 slo servir para el control genealgico pero no para la segregacin de homocigotas mutantes en la M2. Esto hace que la aplicacin de mutgenos sobre rganos unicelulares que evitan la formacin de plantas quimricas, como el polen, resulte especialmente interesante en maz. 9ROYLHQGR D ORV OWURV VHOHFWLYRV SULPHUR RFXrrir la seleccin somtica o diplntica a nivel de los tejidos quimricos del soma de la planta M1. La competencia de un sector mutante con su entorno puede comenzar muy temprano a nivel de la clula mutante original. Luego a nivel de la gametognesis de las plantas M1 ocurrir la seleccin gamtica o haplntica. Lo arriba mencionado es vlido para los genes localizados en el ncleo, pero en el caso de genes localizados en las organelas citoplasmticas (plstidos y mitocondrias), que obedecen a UHJODV GH OD KHUHQFLD PiV H[LEOHV HO GHVDUURllo de las quimeras es ms complejo que para los nucleares, sumado a que la competencia del alelo mutante tambin puede ocurrir a nivel intracelular entre los distintos genomas de una organela. Una representacin esquemtica que ilustra la evolucin en uno y otro caso puede encontrarse en Kirk y Tilney-Bassett (1978). En las plantas multiplicadas vegetativamente, la seleccin gamtica y la recombinacin
sexual estarn ausentes, a lo que se agrega que en las yemas, las clulas meristemticas tienen una organizacin del tipo tunica corpus, es decir que estn organizadas en capas histognicas que cubren un cuerpo central y que al crecer se comportan, en cierta manera, como independientes. Por otro lado, estas plantas son comnmente poliploides y con un alto nivel de loci heterocigotas, todo lo cual hace que un espectro muy diferente de mutantes puede estar disponible para el mejoramiento vegetal. La LQXHQFLD GH ORV JHQHV DO HVWDGR KHWHURFLJRWD sobre la expresin de los sectores mutantes a nivel somtico fue estudiada por Prina y Favret (1988) utilizando como modelo la cebada. 3RU RWUR ODGR OD SROLSORLGtD SXHGH LQXLU QRtablemente la expresin y vitalidad de las mutantes, los genotipos poliploides tienen mayor capacidad de soportar cambios drsticos como grandes deleciones de cromosomas o incluso
de cromosomas enteros. En stos habitualmente se observa una menor proporcin de cambios fenotpicos drsticos que en los diploides. 3.1.3.2. Expresin de los distintos daos El esquema de la Figura 1 indica los distintos momentos en que pueden observarse los daos producidos por el tratamiento de semillas (para ms detalles ver Prina, 1989). Las proporciones de los distintos daos tienen tenGHQFLDV GHQLGDV GH DFXHUGR DO PXWiJHQR \ la manera en que se aplique. Si comparamos mutgenos como el EMS y la azida sdica con los rayos X, a iguales niveles de dao en las plantas M1 (sectores somticos, aberraciones cromosmicas, letalidad), con los primeros tendremos tasas de mutaciones muy superiores en la generacin M2. Tal informacin es til para la eleccin de las dosis ms adecuadas en base a observaciones en las plantas M1. En
principio puede pensarse que a mayores dosis se obtendr un mayor nmero de mutantes en la M2, pero la eleccin no es tan sencilla. En el caso de las radiaciones ionizantes suele recomendarse el uso de la dosis letal 50, buscando un compromiso entre la cantidad de plantas sobrevivientes en la M2 y la cantidad de mutaciones que ellas porten. Con los qumicos los efectos letales suelen no tener una correlacin directa con los efectos mutagnicos. Con variaciones importantes entre especies e incluso entre genotipos de una misma especie, las ms recomendables son las concentraciones intermedias. En los tratamientos de azida VH KD YLVWR XQD LQXHQFLD PX\ PDUFDGD GHO S+ de la solucin. Con estos mutgenos, el dao ms limitante suele ser la esterilidad de la M1. Es importante sealar que no siempre es recomendable utilizar los tratamientos que den las ms altas tasas de mutaciones en M2, ya que si bien esto aumenta la probabilidad de obtener una mutante buscada analizando una determinada cantidad de material, tambin aumenta la probabilidad de inducir mutaciones simultneas en una misma clula lo que luego puede requerir un trabajo considerable para eliminar por retrocruza los alelos no deseados. 3.1.4. Manejo y seleccin La semilla M1 usualmente se siembra a campo semilla por semilla para permitir la individualizacin de las plantas a la cosecha. En lo posible, debe realizarse en lote aislado, geoJUiFD \R WHPSRUDOPHQWH GH RWUDV SDUFHODV del cultivo. Para mutantes de efecto marcado que son fcilmente distinguibles a nivel de individuos habitualmente la seleccin comienza en la M2. En el caso de mutantes que conducen a cambios fenotpicos leves o cuya expresin tieQH XQD LPSRUWDQWH LQXHQFLD DPELHQWDO HV PiV FRQDEOH UHDOL]DU OD VHOHFFLyQ HQWUH IDPLOLDV GH generaciones ms avanzadas. (Q IRUPD VLPSOLFDGD SRGHPRV GHVFULELU WUHV tipos bsicos de manejo del material mutagenizado para pasar de M1 a M2: 1-Manejo genealgico por progenies de espigas, panojas o ramas: fue propuesto por Stadler en 1930, en los albores de la mutagnesis experimental. Implica un mayor trabajo inicial, SHUR WLHQH HO EHQHFLR GH TXH SHUPLWH UHFRQR-
cer las mutaciones inducidas por el tratamiento mutagnico de otras preexistentes, o de las originadas por mezcla de semillas o de polen. Por otro lado, en el caso de hallarse mutantes idnticas permite evaluar la probabilidad de que se hayan originado en el mismo o en distintos eventos mutacionales. 2- Manejo por conjunto o pool de 1 semilla por espiga, panoja o rama: en este caso la cosecha se limita a una semilla de cada una de ODV LQRUHVFHQFLDV SULQFLSDOHV GH ODV SODQWDV M1 con las que se formar un conjunto (pool). Se basa en que cada una de las semillas del pool provendr de clulas iniciales diferentes, y por lo tanto en un mismo pool no se encontrarn mutantes provenientes de un mismo evento mutacional. La formacin de varios pools como el descrito aumentar la probabilidad de aislar una mutante determinada pero, por otro lado, no permitir distinguir sobre el origen mutacional de mutantes idnticas que aparezcan en pools diferentes. Este manejo es adecuado cuando se quiere seleccionar mutantes de efectos moderados y/o de expresin altamente LQXLGD SRU HO DPELHQWH SDUD OR TXH HV UHFRmendable comenzar la seleccin en familias de la generacin M3. 3-Manejo en masa: se cosechan en masa o bulk todas las plantas M1 de un mismo tratamiento. Tambin puede limitarse el tamao de los bulks haciendo varios por tratamiento. Para este manejo se recomienda una siembra densa para limitar el crecimiento de las plantas M1 y as aumentar el nmero de los sectores M1 que sern analizados en M2 los que, de esta manera estarn ms homogneamente representados. Este manejo slo es aplicable cuando se dispone de una metodologa de seleccin individual barata y de aplicacin masiva. Al principio es menos laborioso que los anteriores, pero no distingue la variabilidad inducida de la preexistente, ni las mezclas de semilla o polen. Adems, puede incrementar notablemente el trabajo posterior si es que se obtienen muchas mutantes similares y se quiere distinguir si se originaron de manera independiente, o si provienen del mismo evento mutacional. En cuanto a la cantidad de material a tratar es obvio que a mayor cantidad de sectores mutantes representados en el momento de la
seleccin, ser mayor la chance de aislar una mutante determinada. Cada uno de los manejos mencionados estar limitado en forma diferente por el trabajo de conduccin. Los clculos tericos sobre la cantidad de material a manejar en M1 y M2 son de relativa validez dada la multiplicidad de factores a tener en cuenta, muchos de los cuales son slo parcialmente controlables o predecibles. Habitualmente estos clculos se basan en probabilidades de knock out gnicos, considerando a todos los genes con igual chance de ser afectados. La crianza de la M1 habitualmente requiere poco esfuerzo y espacio en comparacin con las otras etapas, por lo que es recomendable criar material DGLFLRQDO SDUD DVHJXUDU XQD SREODFLyQ 0 VXcientemente grande, lo que adems puede permitir seleccionar entre tratamientos de acuerdo a observaciones sobre la M1. Algunos autores sealan que al trabajar con Arabidopsis, a meQXGR VH SUHHUH FULDU JUDQ FDQWLGDG GH SODQWDV M1 y luego someter a la seleccin unas 2000 a 125000 plantas M2. Mientras que en el caso del maz, que por ser algama requiere una autofecundacin controlada para poder seleccionar mutantes recesivas, se considera que 1000 plantas M1 no quimricas obtenidas por trataPLHQWRV GH SROHQ SXHGHQ VHU VXFLHQWHV SDUD tener chance de obtener al menos una mutante recesiva por locus. En autgamas, donde obviamente la autopolinizacin de las plantas M1 no insume un trabajo adicional, es recomendable incrementar el nmero de plantas M1 que pasan a la generacin M2 a varios miles. 3.1.5. Conclusiones Podemos sealar entonces, tres pasos fundamentales y complementarios en la mutagQHVLV LQGXFLGD DSOLFDGD DO WRPHMRUDPLHQWR ellos son: 5HDOL]DU WUDWDPLHQWRV PXWDJpQLFRV DSURpiados para originar una importante cantidad de clulas mutantes, pero en lo posible con una o unas pocas mutaciones cada una (evitando la multiplicidad de cambios mutacionales en una misma clula) y, adicionalmente, con bajos niveles de otros daos que afecten la viabilidad y/o vitalidad de las clulas y/o de los individuos mutantes. +DFHU XQ PDQHMR HFLHQWH GHO PDWHULDO
mutagenizado en funcin del crecimiento de los sectores mutados en las plantas de la primera generacin y, de ser posible, con un control genealgico adecuado, que permita distinguir sobre el origen de mutantes similares. 3) Una vez que los alelos mutantes puedan ser detectados, aplicar una metodologa de seOHFFLyQ HFLHQWH TXH SHUPLWD DQDOL]DU JUDQGHV cantidades de material. Si bien la mutagnesis inducida tradicional es un proceso con un amplio espectro de resultados posibles y dependiente de mltiples factores, que pueden ser relativamente controlados, lejos est de ser una tcnica que depende totalmente del azar. Al xito de esta metodologa contribuirn los conocimientos de la biologa de la especie y del genotipo particular a tratar, la informacin disponible sobre su respuesta a los tratamientos mutagnicos, el conocimiento de las bases genticas del carcter a mejorar, etc. Sin duda que los resultados de esta metodologa se vern potenciados por un WUDEDMR PXOWLGLVFLSOLQDULR GH JHQHWLVWDV VLyORgos y mejoradores, sin descartar el aporte que puedan hacer muchas otras especialidades. El potencial de la mutagnesis clsica sin duda se ve hoy en da enormemente acrecentado por su uso en combinacin con las nuevas tcnicas de la biologa molecular y la biotecnologa. 3.2. TILLING y EcoTILLING 7,//,1* GHO LQJOpV Targeting Induced Local Lesions in Genomes) es una tcnica de bsqueda de mutaciones focalizada en un gen o secuencia nucleotdica conocida, que permite el anlisis de muestras de muchos individuos que provienen de una poblacin previamente PXWDJHQL]DGD HQ IRUPD DUWLFLDO R TXH SXHGHQ portar variacin natural sin necesidad de tratamientos mutagnicos, en este ltimo caso se la GHQRPLQD (FR7,//,1* 'DGR TXH VH OD XWLOL]D para averiguar la funcin de un gen o secuencia incgnita, se la considera como una tcnica GH JHQpWLFD LQYHUVD D SDUWLU GH PRGLFDFLRQHV genotpicas se evalan los efectos fenotpicos de las mismas para descifrar la funcionalidad de la secuencia), con ventajas sobre el knock out tradicional porque los sistemas de reempla]R DOpOLFR VRQ LQHFLHQWHV HQ SODQWDV VXSHULRres. Otra ventaja es que la mutagnesis con
mutgenos como el EMS o la azida sdica no necesariamente anulan completamente la funcin del gen, como s lo hace el knock out o el knock down que se obtiene cuando se utiliza $51 LQWHUIHUHQWH R FXDQGR VH XWLOL]DQ UDGLDFLRnes ionizantes que producen deleciones (como tratamiento mutagnico). Esto, potencialmente, permite evaluar los efectos de reemplazo de cada uno de los nucletidos individuales del gen. (O 7,//,1* SHUPLWH LGHQWLFDU HVWDV PXWDciones puntuales aunque para poder utilizarlo se requiere conocer previamente la secuencia nucleotdica del gen o segmento genmico que se desea estudiar; sin embargo, no es necesario conocer la secuencia completa del genoma. El mtodo fue desarrollado originalmente en Arabidopsis thaliana y su uso se extendi posteriormente a plantas cultivadas como el maz, la papa, el trigo, la soja, el tomate, la lechuga \ HO JLUDVRO +D VLGR PX\ XWLOL]DGD FRQ QHV GH mejoramiento agronmico porque tiene la ventaja de que no conlleva las regulaciones a las que estn sometidas las plantas genticamenWH PRGLFDGDV (QWUH ORV JHQHV HVWXGLDGRV estn los relacionados a la calidad de almidn en granos (en mutantes con mayor amilopectina como los waxy), senescencia, enanismo, resistencia a oidios, larga vida en estante (en WRPDWH \ OHFKXJD UHGXFFLyQ GH LVRDYRQDV \ DOpUJHQRV HQ VRMD PRGLFDFLyQ GH OD FRPSRVLcin de aceites en girasol, etc. (O (FR7,//,1* HQ FDPELR VH RULHQWy D OD XWLlizacin de ecotipos como fuente de diversidad para estudiar genes relacionados a la resistencia a estrs abitico (como por ejemplo los FRGLFDQWHV SDUD GHKLGULQDV R SDUD HQFRQWUDU nuevos marcadores moleculares funcionales GH WLSR 613 SROLPRUVPRV GH XQ VROR QXFOHytido, ver captulo correspondiente en este mismo libro). La tcnica consiste esencialmente de dos pasos: 1) la aplicacin de mutagnesis qumica inducida tradicional como se describi en este captulo, usualmente empleando EMS (etilmetanosulfonato); y 2) la utilizacin de una novedosa estrategia de bsqueda y deteccin de las mutaciones inducidas sobre un determinado gen o secuencia nucleotdica de inters. En la Figura 2 ilustra el proceso. Usualmente se
mutagenizan semillas o granos de polen para inducir la aparicin de mutaciones puntuales a lo largo del genoma. Las plantas derivadas de estas semillas tratadas con mutgenos se denominan M1 y, como ya se mencion, suelen ser quimricas y las mutaciones inducidas se encuentran en heterocigosis. Usualmente a las plantas M1 se las endocra dejndolas autofecundar en el caso de autgamas, o se procede a la autopolinizacin forzada en algamas para poder tener control de las genealogas y asegurar su conservacin. Usualmente se cosecha una semilla por planta M1 para pasar a la prxima generacin, pero esto bien puede hacerse FRQ XQD VHPLOOD SRU LQRUHVFHQFLD SULQFLSDO con muy bajo riesgo de repetir en la muestra dos mutantes provenientes del mismo evento mutacional. Por la endocra de las plantas M1 los genes mutados tendern a hacerse homocigotas, sin embargo no es imprescindible que alcancen la homocigosis para que puedan ser GHWHFWDGRV SRU 7,//,1* /D JHQHUDFLyQ 0 HV segregante: cada individuo podr ser homocigota mutante, heterocigota u homocigota salvaje en cada uno de los genes afectados, pero sern de constitucin gentica homognea en todo su soma, es decir no quimricos. De cada SODQWD 0 TXH GHEH VHU GHELGDPHQWH LGHQWLFDGD VH H[WUDH $'1 GH ODV KRMDV SDUD HO DQilisis de el/los gen/es de inters. Por otro lado, se guardan sus semillas para poder disponer en el futuro de sus descendencias (poblaciones M3). De este modo es posible conservar las mutaciones detectadas mediante el anlisis GH $'1 \ DGLFLRQDOPHQWH GLVSRQHU GH SREODciones que puedan distribuirse internacionalmente entre los consorcios de investigacin de cada especie (es comn que se comparta el material de las poblaciones mutantes de las especies ms estudiadas, como Arabidopsis y maz, entre los consorcios internacionales). 3DUD UHGXFLU FRVWRV ORV $'1V SURFHGHQWHV de distintas plantas M2 (usualmente entre 2 y 10) se pueden mezclar para su anlisis en un mismo tubo. Sobre una parte de la mezcla se UHDOL]DUi XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 XWLOL]DQGR ROLJRQXFOHyWLGRV FRQ VHFXHQFLDV DQTXHDQWHV al segmento genmico de inters (previamente diseados en base a la secuencia conocida). /RV SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ TXH FRQVLV-
tirn en una mezcla de secuencias normales y mutadas, se desnaturalizan sometindolos a alta temperatura y se les permite rehibridar entre s bajando la temperatura. Algunas de las cadenas rehibridadas podrn ser heteroduplexas, es decir, una de las cadenas provendr de una secuencia mutada y otra de una normal produciendo una doble cadena que contiene bases mal apareadas por falta de complementariedad. Estas bases mal apareadas sern reconocidas por la enzima endonucleasa CelI, produciendo un corte donde encuentra la anomala. Los productos de la digestin con Cell se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida, y si los oligonucletidos utilizados HQ OD 3&5 IXHURQ SUHYLDPHQWH PDUFDGRV FRQ XRUyIRURV GH XRUHVFHQFLD URMR \ YHUGH HQ OD JXUD ORV SURGXFWRV GHO FRUWH SRGUiQ VHU LGHQWLFDGRV SRU VX PHQRU WDPDxR FRPSDUDGR FRQ ORV $'1V QR FRUWDGRV YHU JXUD /D XWLOL]DFLyQ GH XRUyIRURV HQ OXJDU GH XQR D\XGD D UHGXcir el nmero de falsos positivos. Sobre esta tcnica bsica se introdujeron PRGLFDFLRQHV FRPR SRU HMHPSOR OD XWLOL]Dcin de geles no desnaturalizantes de poliacrilamida o agarosa y tincin con bromuro de etidio, que funcion muy bien en trigo. En los casos en que se utiliza irradiacin X o gamma para la induccin de mutaciones, el paso de digestin se saltea y se analiza en geles de secuenciacin. A medida que se van reduciendo los costos de secuenciacin y se convierta en rutina la deWHFFLyQ GH 613V SRVLEOHPHQWH UHHPSODFHQ HO tratamiento con CelI HQ OD WpFQLFD GH 7,//,1* Al da de hoy las publicaciones de ultra-deep sequencing en virus, permiten detectar genomas con variaciones en mezclas que contienen muchsimos genomas no mutados. Otra variante utilizada es la DHPLC (del ingls, denaturing high-performance liquid chromatography) basada en la utilizacin de columnas para cromatografa lquida de alta presin que SHUPLWHQ GLIHUHQFLDU $'1 KHWHURG~SOH[ GHO KRmodplex. Para reducir el nmero de muestras DQDOL]DGDV YDULRV SURGXFWRV GH 3&5 \ SRVWHrior digestin con CelI se siembran en el mismo carril de un gel (por ejemplo toda una columna). Por otro lado se siembra tambin toda una OD 'H HVWD PDQHUD OD DSDULFLyQ GH EDQGDV GH
igual tamao en carriles pertenecientes a coOXPQDV \ ODV SHUPLWH LGHQWLFDU OD LQWHUVHFFLyQ HQ OD TXH VH HQFXHQWUD HO SRFLOOR FRQ HO $'1 mutado (de un modo similar al esquema que se propone en la Figura 2). (Q HO (FR7,//,1* PHQRV XWLOL]DGR TXH HO 7,//,1* HQ OXJDU GH DQDOL]DU SREODFLRQHV SURvenientes de mutagnesis inducida, los materiales de partida que se utilizan como fuente de variabilidad suelen ser los almacenados en bancos de germoplasma, o bien ecotipos de especies no domesticadas. Los problemas de este enfoque alternativo son varios: el acceso al material puede ser limitante, los fondos genticos son demasiado variables, las mutaciones que disminuyen la adaptacin de una planta no suelen estar representadas porque son HOLPLQDGDV SRU VHOHFFLyQ QDWXUDO R DUWLFLDO HWF 3.3. Mutagnesis de insercin con transposones y ADN-T Otro sistema utilizado en gentica inversa para el anlisis funcional de genes consiste en la activacin de transposones endgenos (siendo el Ac-Ds de maz el ms emblemtico), mediante cruzamientos entre genotipos que resulten en la activacin de dichos transposones o mediante la introduccin de transposones forneos por ingeniera gentica (por ejemplo, el sistema Ac de maz fue introducido en papa, el Enhancer o SPM de maz en Arabidopsis o el PXWDGRU 5REHUWVRPLDQR Mu en maz). Una de las grandes ventajas de esta tcnica es que el elemento insertado proporciona un marcador molecular de secuencia conocida (tag) en el sitio de insercin (sitio de knock out), que puede facilitar el aislamiento del gen mutado por prdida o ganancia de funcin debido a que la insercin es reversible. Las desventajas principales de esta aproximacin son: que las mutaciones pueden ser inestables (revertir), y que la transposicin tiene frecuencias bajas y no siempre la insercin es totalmente azarosa. Para potenciarla se pueden colocar promotores fuertes como el 35S del virus del mosaico GHO FROLRU &D09 SDUD FRQWURODU OD H[SUHVLyQ del gen de la transposasa. Las ventajas de haFHU HVWR VH UHHMDQ HQ XQ DXPHQWR VLJQLFDWLYR en la tasa de mutacin (hasta 1x10-4 en maz, por ejemplo), y en que provee una secuencia
fornea conocida en el sitio de insercin, lo cual facilita el posterior clonado molecular. Existen algunas variantes de esta tcnica como la captura de genes o de promotor (gene o promotor trapping), en este caso se pueden incluir secuencias forneas de genes reporteros como uidA (GUS), gfp (GFP) y sus variantes de otros colores, o genes involucrados en la sntesis de antocianas (Lc), con o sin pro-
motores funcionales. Si el gen indicador que no contiene promotor se inserta al azar bajo el control de algn promotor endgeno, entonces se activar su expresin y se visualizar fcilmente. Otra ventaja de esta aproximacin HV OD LGHQWLFDFLyQ VHQFLOOD VLQ QHFHVLGDG GH disponer de un fenotipo mutante, lo cual es til cuando existen genes redundantes, heterocigosis o cuando se analizan genes activos
en distintos estadios de desarrollo. La funcin gnica puede caracterizarse posteriormente en las mismas lneas si la insercin ha producido un knock out. /D PXWDJpQHVLV GH LQVHUFLyQ FRQ $'17 (segmento T de transferencia del plsmido Ti) consiste en aprovechar la propiedad del sistema basado en Agrobacterium tumefaciens, para la transformacin gentica de plantas. El segmento T se inserta tericamente al azar en cualquier sitio de la eucromatina de las plantas, permitiendo as generar colecciones de mutantes de insercin con las caractersticas ya mencionadas anteriormente para los transposones; pero con mayor estabilidad que stos y menor preferencia por el sitio de insercin. Sin embargo, como las frecuencias de mutacin son extremadamente bajas, slo se utilizan actualmente en combinacin con transposones. Es decir que se incluye un transposn activo dentro del segmento T para inducir mutagnesis por transposicin en la especie transformada. Una de sus desventajas, es que su uso estar limitado a aquellas especies que son transformadas por agrobacterias. Lecturas Recomendadas
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II. Capitulo 5 Variacin somaclonal

Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique 1 Introduccin El cultivo in vitro representa un momento de estrs para las clulas y tejidos vegetales y puede desencadenar procesos mutagnicos durante el establecimiento del explanto, la induccin de callo y la formacin de embriones o vstagos durante el proceso de regeneracin de plantas. Algunos de los cambios genticos ocurridos en las plantas regeneradas pueden resultar variantes atractivas, con utilidad potencial en el mejoramiento vegetal para el desarrollo de nuevas variedades. /DUNLQ \ 6FRZFURIW OODPDURQ variacin somaclonal a los cambios ocurridos en las plantas regeneradas y que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de cambios reversibles que pueden PRGLFDU OD H[SUHVLyQ GH FLHUWRV JHQHV (Vtos cambios que no implican alteracin en la secuencia nucleotdica se denominan epigenticos (Madlung y Comai, 2004). Algunos autores los consideran variantes somaclonales mientras que otros slo incluyen en la misma aquellos cambios que no revierten en ciclos sucesivos de reproduccin sexual. Los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados. Sin embargo, se han propuesto varias causas de posible incidencia en la ocurrencia de la misma. Entre esas causas se citan: el genotipo, la fuente de explanto, el tiempo en cultivo, las condiciones y composicin del medio de cultivo y la va de regeneracin. La comprensin de estas causas ayudara a mejorar la interpretacin de los procesos celuODUHV GH UHVSXHVWD DO HVWUpV \ SHUPLWLUtD GHQLU como actan en los procesos de evolucin. Entre los fenmenos que ocurren durante el cultivo in vitro se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica e intercambio de cromtidas hermanas, rearreglos gnicos somticos, activacin de elementos genticos transponibles,
DPSOLFDFLyQ \ PHWLODFLyQ GHO $'1 \ FDPELRV HQ HO $'1 GH ODV RUJDQHODV 3RU HOOR DXQTXH los caracteres morfolgicos (como por ejemplo HO KiELWR GH FUHFLPLHQWR OD PRUIRORJtD RUDO etc.) son fciles de evaluar, otros cambios no VH PDQLHVWDQ HQ YDULDQWHV PRUIROyJLFDV HYLdentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no alterar su actividad ELROyJLFD OR VXFLHQWH FRPR SDUD SURGXFLU XQ IHQRWLSR PRGLFDGR SRU OR WDQWR OD YDULDFLyQ debe analizarse a varios niveles. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de variantes no encontradas en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico, permite utilizar este fenmeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado, en algunos casos, para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia econmica, entre los que se incluyen: resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontr resistencia a la oruga militar en un cultivar que reuna otras buenas caractersticas, dando origen al cultivar %UD]RV5 Si bien desde el punto de vista prctico no es XQD WpFQLFD PX\ HFLHQWH GDGR TXH QR HV SRsible predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace menester trabajar con poblaciones grandes de plantas, es necesaria la compresin del mecanismo para evitarlo en casos donde se UHTXLHUH GHOLGDG JHQpWLFD FRPR HQ OD PLFURpropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin de plantas. En algunos casos puede representar una fuente de variacin rpida y de fcil acceso para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados o de base gentica estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas puede ser limitada. Los primeros casos de variacin somaclonal se registraron en plantas de reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa,
pero el fenmeno ha sido observado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal Hemos mencionado, previamente, algunos GH ORV SRVLEOHV IDFWRUHV TXH WLHQHQ LQXHQFLD en la aparicin de variacin somaclonal. En este punto trataremos cada uno por separado. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el mismo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtencin de variedades. El nivel de ploida del genotipo es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrs y en papa se observ que, durante el cultivo de tejidos, las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas. La explicacin ms razonable para este hecho es que los poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantos que tengan su complemento cromosmico completo. Existen evidencias de una mayor inestabiOLGDG HQ KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV FXOWLYDGRV in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los hbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum, donde el cultivo in vitro genera entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que suelen contener slo el genoma de Hordeum vulgare.
Explanto. La variacin observada entre plantas regeneradas puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto VLJQLFD TXH GHQWUR GH XQD PLVPD SODQWD H[LVten diferentes linajes celulares, esto se debe D XQD VHULH GH FDPELRV HQ HO $'1 QXFOHDU GH ciertos tipos celulares producidos durante el desarrollo. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares pueden dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir, a partir de procesos organognicos, o por causas desconocidas. La utilizacin de explantos con tejidos organizados, como esquejes radicales o caulinares, es una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. El cultivo de meristemas aislados minimiza el riesgo de variacin somaclonal. Esto no debe tomarse como regla, ya que utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar variacin en plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. Ell cultivo de protoplastos parecera inducir inestabilidad gentica, como fue observado en papa y tabaco; esto se ha asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos tan pequeos. La va de regeneracin tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variacin observada en cultivos embriognicos fue relativamente menor que la que obtenida en cultivos organognicos. Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin de los embriones, mayor que la requerida en la formacin de vstagos. Se cree que el gran nmero de genes requeridos para la iniciacin y maduracin de embriones cigticos y somticos impedira la acumulacin de mutaciones deletreas. Sin
embargo, tambin se observaron variantes en plantas de caf, apio y caa de azcar regeneradas a travs de embriognesis somtica. En estos casos se advirti que algunos fenotipos anormales de embriones somticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz. La mayor parte de la variacin obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. Los mecanismos de iniciacin de un callo parecen ser similares a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la induccin de en]LPDV \ SURGXFWRV HVSHFtFRV GH VLWXDFLRQHV de estrs. La desdiferenciacin que ocurre durante la induccin del callo, altera procesos celulares que resultan en cambios genmicos, uno de los ms frecuentes es la inestabilidad cromosmica. La naturaleza del callo tambin puede afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias monocotiledneas el callo representa, a menudo, una masa de rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos provenientes de semillas fueron anormales, mientras que las obtenidas SRU FDOORV GH LQRUHVFHQFLDV IXHURQ PX\ VHPHjantes a las plantas de las cuales provenan los explantos. En ocasiones, tambin fue posible observar variacin en plantas obtenidas por regeneracin directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciacin celular ni formacin de callo. El estado fsico del medio de cultivo tamELpQ LQX\H HQ HO QLYHO GH YDULDFLyQ REWHQLGD Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica y/o incrementar el nmero de plantas albinas y tambin la GHFLHQFLD GH R[tgeno que se genera durante el transcurso del cultivo. La tensin de oxgeno a la que estn
H[SXHVWDV ODV FpOXODV VXSHUFLDOHV GHO FDOOR HV diferente a la de las clulas situadas en profundidad. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra comportarse como un mutgeno. Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por las propias clulas durante el cultivo. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico), han sido sealados como inductores de inestabilidad. Estos ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de azcares y en el control de la divisin celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Aparentemente el 2,4-D induce desdiferenciacin y provoca un incremento sustancial en la transcripcin. Esto puede alterar la estructura de la cromatina, por lo cual se lo utiliza en gramneas como inductor de aneuploidas. La relacin auxina:citosina tambin suele afectar en este sentido. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y HO $1$ iFLGR QDIWDOHQDFpWLFR KDQ VLGR VHxDODdos como los responsables de los incrementos en la metilacin de las citosinas, que tienen lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores del $'1 GRQGH ODV FLWRVLQDV VH HQFXHQWUDQ PHWLladas en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la desaminacin de una 5-metilcitosina resulta en un cambio de citosina a timina. Un estudio realizado en papa indicara que el tipo y la concentracin de los reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo in vitro no generara variacin gentica. Los efectos seran ms importantes durante el crecimiento del callo y la iniciacin de los vstagos. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas; de manera que las hormonas induciran inestabilidad gentica sin ser, necesariamente, el origen de la misma. La GHFLHQFLD R H[FHVR GH PLQHUDOHV en el medio de cultivo podran ser causa de variacin. Este fenmeno se ha observado tambin en plantas creciendo en condiciones de campo. Un ejemplo tpico lo constituyen plantas GH OLQR VRPHWLGDV D H[FHVR R GHFLHQFLDV GH
azufre, nitrgeno, fsforo, calcio y magnesio. En estas plantas se observaron cambios genmicos estables y heredables. En este caso los cambios fueron inducidos por una fertilizacin excesiva del suelo, obtenindose as lneas estables, denominadas genotrofos, caracterizaGDV SRU GLIHUHQWH FRQWHQLGR GH $'1 QXFOHDU \ citoplasmtico. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variacin, aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos jvenes. El nmero ptimo de subcultivos podra estimarse empriFDPHQWH OXHJR GH UHDOL]DU SUXHEDV GH GHOLGDG gentica en las plantas regeneradas, a travs de subcultivos subsecuentes. Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la regeneracin. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de WUDEDMR HQ OD 816 HQ FRODERUDFLyQ FRQ HO ,%21( GHPRVWUy TXH HQ SODQWDV PLFURSURSDJDGDV de paraso gigante las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relacin lineal entre el nmero de subcultivos y la cantidad de variacin obtenida. La variacin en este caso se detect mediante OD WpFQLFD GH 5$3'V D OR ODUJR GH GH VXEFXOtivos (Olmos y col., 2002). 3 Cambios genmicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algn momento esa capaciGDG GH DPRUWLJXDFLyQ VH YXHOYH GHFLHQWH \ ORV organismos caen en un estado de crecimiento subptimo que parece inducir mecanismos de cambios genmicos. Las bases metablicas de la interaccin entre el estrs y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia GH DOWHUDFLRQHV D QLYHO GHO $'1 D FRQVHFXHQcia de diferentes estreses ambientales, depen-
diendo de la intensidad del estrs y del estado de diferenciacin de las clulas, en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurriran, en parte, debido a una prdida del control del ciclo celular. Entre las alteraciones genticas se citan mutaciones puntuales, cambios en la estructura o el nmero de cromosomas y activacin de elementos genticos transponibles. Estos ltimos causan reorganizaciones moleculares, no solo por su transposicin, sino tambin SRUTXH JHQHUDQ DPSOLFDFLRQHV \ GHOHFLRQHV El cultivo in vitro tambin incrementa la frecuencia de intercambio entre cromtidas hermanas o crossing over" somtico. Varias hiptesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como son las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones cromosmicas estructurales y numricas, la activacin de transposones y las mutaciones gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) proponen la existencia una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos que comprendera una alWHUDFLyQ HQ ORV SDWURQHV GH PHWLODFLyQ GHO $'1 Estos cambios en la metilacin podran afectar OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HVSHFtFRV LQFOX\HQGR elementos transponibles o podran afectar la estructura de la cromatina de una manera ms global, involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. El mecanismo por el cual suceden estos cambios no ha sido totalmente dilucidado pero se los ha vinculado con una replicacin tarda de la heterocromatina que tambin provocara eventos de ruptura cromosmica. Los cambios en los modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios y en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos FDOLHQWHV GH LQHVWDELOLGDG HQ HO $'1 JHQyPLFR Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de nutrientes o de agua no experimentan el mismo tipo de cambios encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. El cultivo de tejidos podra representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrs, que podra LQGXFLU XQD UHVSXHVWD ~QLFD \ XQ SHUO SDUWLFXODU de mutacin. Un posible efector de esta variacin podran ser los reguladores de crecimiento. En cuanto a los cambios en el nmero de cromosomas, la poliploida es el ms comn de estos fenmenos, y estara relacionada con
fallas en la mitosis, mientras que la aneuploida puede surgir por segregacin desigual en la mitosis o por fragmentacin nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el nmero cromosmico pueden afectar el fenotipo. En papa, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploida o por duplicacin cromosmica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides presentaban cambios fenotpicos evidentes. La variacin somaclonal tambin puede afectar el genoma de los plstidos y las mitocondrias. En plantas de sorgo androestriles obtenidas in vitro se observ restauracin parcial de la fertilidad y en plantas androestriles de maz con citoplasma T (que eran, adems, susceptibles a Helminthosporium maydis) hubo reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad al patgeno. Estos cambios VH FRUUHVSRQGtDQ FRQ PXWDFLRQHV HQ HO $'1 mitocondrial. Otro caso de variacin debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras de Gramneas. En plantas albinas de trigo obtenidas por cultivo de anteras se obserYDURQ GHOHFLRQHV \ UHDUUHJORV HQ HO $'1 GH ORV cloroplastos. Si bien parecera que los tejidos somticos son menos sensibles a la variacin, tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. 4 Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y diversos y, probablemente, actan en simultneo, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de PRGLFDFLRQHV JHQyPLFDV JHQHUDGDV SRU FXOtivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes fuentes de material para seleccionar variantes de inters y desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios bsicos acerca de las causas de la variacin y el posible control de la misma. La ocurrencia de variacin somaclonal puede detectarse con marcadores morfolgicos, bioqumicos y moleculares. La correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmi-
cos es un requisito relevante para su implementacin en los programas de mejoramiento. La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa desde el punto de vista del mejoramiento y citada en varios trabajos de investigacin. El examen visual y la utilizacin de un analizador de imgenes posibilitaron la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes en Pelargonium. Tambin se detectaron cambios en altura, tamao de hojas, nmero y peso de semillas de plantas de man obtenidas in vitro. En anan se observaron cambios estables en el color y textura de las hojas, tamao de los frutos y tasa de proliferacin de vstagos; el cultivo de tejidos de violeta africana result en XQ GH YDULDFLyQ HQ HO FRORU GH ODV RUHV GH plantas regeneradas. A QLYHO VLROyJLFR, tanto en cereales como en frutales se detectaron y seleccionaron variantes que presentaron resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales y condiciones de acidez en el suelo, entre otros. Estos estudios se basaron en la utilizacin de altas presiones de seleccin durante la regeneracin, mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite revelar cambios en el nmero de cromosomas (poliploidas, aneuploidas) y en la estructura de los mismos (translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones). Las alteraciones cariotpicas constituyen una fuente importante de variacin, que muchas veces es subestimada cuando se trabaja con mtodos tradicionales de conteo cromosmico. Las tcnicas de bandeo cromosmico brindan ms informacin acerca de la estructura cromosmica y las alteraciones que pueden surgir en este sentido. Por ejemplo, en plantas de Brachycome dichromosomatica regeneradas a partir de suspensiones celulares, esta tcnica permiti detectar reordenamientos cromosmicos, mientras el nmero cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta y resulta particularmente til para revelar anormalidades en la estructura de los cromosomas.
Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar plantas regeneradas y sus progenies, se encuentran las isoenzimas. Las mismas permitieron detectar variacin en plantas de Populus tremuloides regeneradas a travs de callos. El anlisis se realiz mediante electroforesis en geles de almidn, utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenada (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco-isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6PGD). Los patrones electroforticos permitieron diferenciar las plantas control de las variantes, sin embargo, las plantas albinas obtenidas HQ HVWH HQVD\R QR SUHVHQWDURQ SROLPRUVPRV en los loci estudiados. Tampoco se encontraron variantes cuando se estudiaron lneas de callos derivadas de embriones cigticos y somticos de abeto. Los 25 loci analizados, utilizando 15 sistemas isoenzimticos, mostraron fenotipos isoenzimticos normales. Otro ejemplo, utilizando esta metodologa, se llev a cabo en lneas isognicas de Trifolium pratense L. que diferan en su capacidad de regeneracin. En este caso los patrones isoenzimticos de esas lneas resultaron idnticos para los sistemas GH SHUR[LGDVDV 35; JOXWDPDWR GHVKLGURJHnadas (GDH), alcohol deshidrogenasas (ADH) y esterasas (EST). Si bien las isoenzimas aportan informacin til acerca de la variacin generada in vitro, su DQiOLVLV UHHMD ORV SURGXFWRV GH JHQHV H[SUHsados, cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o VLROyJLFRV 3RU RWUR ODGR VyOR VH WUDQVFULEH \ traduce una pequea proporcin del genoma. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas sobre las isoenzimas ya que permiten detectar mutaciones en diferentes tipos de secuencias y adems, porque no son inXHQFLDGRV SRU HO DPELHQWH QL SRU ORV HVWDGLRV fenolgicos. Los RAPDs IUDJPHQWRV SROLPyUFRV GH $'1 DPSOLFDGRV DO D]DU SHUPLWLHURQ GHWHFWDU OD H[LVWHQFLD GH SROLPRUVPRV HQ SODQWDV de Triticum tauschii obtenidas de callo. Estos marcadores tambin se utilizaron para evaluar OD GHOLGDG JHQpWLFD HQ SODQWDV UHJHQHUDGDV de pino, abeto, festuca, roble y gingseng,. En FDxD GH D]~FDU ORV PDUFDGRUHV 5$3'V SHUPL-
tieron comprobar la susceptibilidad diferencial del genotipo al pasaje por cultivo in vitro, adems de reunir informacin para encarar nuevos cruzamientos en programas brasileros de mejoramiento de esta especie. Existen numerosos ejemplos que indican que la variacin molecular no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa. Por ejemplo en el gnero Musa OD WpFQLFD GH 5$3'V UHYHOy SROLPRUVPRV HQ SODQWDV PLFURSURSDJDGDV GH IHnotipo normal. Del mismo modo, plantas regeneradas de palmera datilera que presentaban IHQRWLSRV RUDOHV DQRUPDOHV WXYLHURQ SDWURQHV moleculares normales. Otros marcadores tiles son los AFLP (poOLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG GH IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV GH $'1 TXH SHUPLWLHURQ GHWHFWDU la existencia de diferencias moleculares entre plantas de banana con fenotipos normales y aberrantes. Los microsatlites o SSRs, iniciales de su nombre en ingls simple sequence repeats, son altamente informativos, ya que son abundantes y estn dispersos a travs del genoma. Estos marcadores se utilizaron para el anlisis de plntulas de lamo, obtenidas por micropropagacin, donde se observaron PLFURVDWpOLWHV SROLPyUFRV HQ SODQWDV IHQRWtSLcamente normales. A veces, para detectar una variante obtenida in vitro es necesario realizar pruebas especFDV 3RU HMHPSOR FXDQGR VH HYDOXDURQ VRmaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernculo y a campo, para resistencia a la RUXJD PLOLWDU 8Q VRPDFOyQ HO %UD]RV5 WHna un rendimiento equivalente al del cultivar madre, pero adems era resistente a dicho insecto. Esto se debe a que produce niveles ms bajos de un estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres agronmicos positivos del cultivar parental, pero tena un cambio en la produccin de un metabolito secundario que confera resistencia a la oruga. 5 La variacin somaclonal y su aplicacin en el mejoramiento gentico La base del mejoramiento gentico es la optimizacin de las interacciones gnicas. Para lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica. Esta
diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones induciGDV ItVLFDV R TXtPLFDV R SURGXFLGDV SRU $'1 T, por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridacin somtica y transformacin gentica. La variacin somaclonal proporcionara una fuente adicional de variabilidad gentica, potencialmente til en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: Es una tcnica poco costosa: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente para cultivos con base gentica estrecha y que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y vegetativa. /DV WDVDV GH PXWDFLyQ VRQ UHODWLYDPHQWH elevadas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 -9 mutaciones por par de nucletidos por generacin. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica durante el cultivo in vitro, permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad gentica. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son HOLPLQDGRV SRU HO OWUR TXH UHSUHVHQWD OD regeneracin de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:
En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica. La baja tasa de regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino. Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica. La regeneracin est limitada a genotiSRV HVSHFtFRV TXH SXHGHQ QR VHU GH mucho inters para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (variacin epigentica). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera FXPSOLU ORV VLJXLHQWHV UHTXLVLWRV Involucrar caracteres agronmicamente tiles. El nivel de expresin del carcter debe superar al de sus progenitores. El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variacin debe ser heredable y estable (sin reversin) en la progenie. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia prctica. El recurso es utilizar cultivaUHV DOWDPHQWH DGDSWDGRV SDUD PRGLFDU unos pocos caracteres, ya que resulta ms sencillo mejorar selectivamente una variedad de uso corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la seleccin de variantes tiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin somaclonal comprenden: a) Obtencin de plantas por cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter deseado.
La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaFORQDO 3DUD HVWH Q VH FXOWLYD OD PHMRU YDULHGDG disponible y se seleccionan, entre las plantas
regeneradas, aquellas que expresen el carcWHU GH LQWHUpV (VWDV SODQWDV JHQHUDFLyQ 5 se emplean para generar progenies sexuales (en el caso de plantas con este tipo de repro-
Figura 1. Estrategia para la produccin comercial de variantes somaclonales (izauierda) y gametoclonales (derecha), en arroz.
duccin), sobre las cuales se vuelve a realizar la seleccin para el carcter agronmico buscado, tratando de mantener a la vez todas las caractersticas favorables de la variedad. En plantas autgamas, como trigo, arroz y cebada, se considera aceptable la evaluacin de la esWDELOLGDG GHO FDUiFWHU KDVWD OD JHQHUDFLyQ 5 $ partir de este momento pueden realizarse cru]DPLHQWRV GH ODV SODQWDV 5 VHOHFWDV FRQ ODV OtQHDV SDUHQWDOHV D Q GH GHWHUPLQDU PHGLDQWH el anlisis de segregacin, la base gentica del carcter mejorado. Posteriormente, cuando se tenga semilla disponible, se realizarn pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expreVLyQ GHO FDUiFWHU (O SURJUDPD QDOL]D FRQ OD etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. 8QD PRGLFDFLyQ SDUD OD SURGXFFLyQ GH QXHvas variedades est basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan clulas haploides de plantas F1, como fuente de explanto, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gaPHWRFORQHV VH UHHUHQ D JHQRWLSRV KDSORLGHV derivados del cultivo de anteras. Por medio de esta metodologa se podran recuperar caracteres recombinados de ambos parentales, adems de los que pudieran surgir in vitro. Las plantas haploides obtenidas son duplicadas mediante la exposicin al alcaloide colchicina. Las evaluaciones a campo se realizan en forma conjunta a medida que los nuevos materiales van siendo multiplicados, de manera de aumentar las replicas bajo diferentes condiciones ambientales. b) Seleccin a nivel celular o seleccin in vitro. Se realiza con el objetivo de obtener resistencia a estreses biticos o abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a: toxinas fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta prctica pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se
procede a la regeneracin de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La seleccin efectuada sobre cultivos celulares, in vitro, puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Seleccin directa en un solo paso, donde el agente de seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples de la MIC (concentracin mnima que produce un 100 % de inhibicin). - Seleccin en varios pasos, donde la concentracin del agente selectivo es gradualmente incrementada en cultivos sucesivos y frecuentes. El primero es un mtodo simple y efectivo, ya que las clulas sensibles al agente morirn, permitiendo el crecimiento de las tolerantes. Sin embargo, elevados niveles de estrs sern deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor nivel de diferenciacin tisular hubiesen sido capaces de regenerar plantas tolerantes. La eleccin de un mtodo u otro depender de un monitoreo preliminar que brinde informacin acerca de la reaccin del tejido vegetal a las concentraciones letales y subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas de la seleccin in vitro. En el ejemplo, diferentes variedades de arroz son evaluadas para tolerancia al aluminio. La induccin y la proliferacin de callo en el medio de cultivo al que se ha adicionado aluminio, es indicadora de la tolerancia del genotipo al metal en cuestin. Una vez regeneradas las plantas, se requieren evaluaciones posteriores realizadas a campo, en suelos con concentraciones elevadas de DOXPLQLR D Q GH FRUURERUDU OD WROHUDQFLD GHmostrada in vitro. La bsqueda de variantes a nivel celular SHUPLWH YHULFDU \ VHOHFFLRQDU IHQRWLSRV DGHcuados entre millones de clulas, con una inversin menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes especies entre las que pueden citarse: arroz, clavel, crtamo, banana, vid, frutilla y trigo. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes expli-
Figura 2. Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio.
caciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenticos, a la naturaleza quimrica del material, al uso de toxinas no HVSHFtFDV HQ HO FDVR GH UHVLVWHQFLD D HQIHUmedades), a la complejidad del carcter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequa) o a la imposibilidad de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian. Para las dos estrategias que se citaron previamente, a y b, la obtencin de resistencia slo ser posible si sta existe en la poblacin original (entonces el cultivo in vitro slo servira para recuperar los genotipos tiles) o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente Dentro de los primeros registros de variacin somaclonal en cultivos de importacia econmica se encuentra la variacin registrada en arroz, donde se inform en detalle la variacin obtenida en la progenie derivada de la autofe-
cundacin de plantas regeneradas. Se lograron avances en el mejoramiento de esta especie en caracteres cuali y cuantitativos. Ejemplos en ste y otros cultivos importantes, con variedades comerciales obtenidas por esta tcnica, se detallan en la Tabla 1. Adems, se pueden mencionar logros en otros cultivos, por ejemplo: En papa, se logr resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solani y a la colonizacin SRU iGRV TXH WUDQVPLWtDQ HO YLUXV < 39< \ HO YLUXV GHO HQUROODPLHQWR GH OD KRMD 3/59 (Q este caso la resistencia surgi a travs del cultivo de protoplastos provenientes de suspensiones celulares cromosmicamente variables GHO FXOWLYDU 5XVVHW %XUEDQN En banana se obtuvo resistencia a Fusarium en cultivares que no haban podido ser mejoUDGRV SRU PpWRGRV WUDGLFLRQDOHV 1R REVWDQWH para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes, se necesit un trabajo posterior que permiti combinar ambas caractersticas en un somacln.
Especie Geranio Batata
Carcter Arquitectura floral Calidad de races y arquitectura del canopeo
Origen Purdue Univ., USA North Carolina Research Service,USA Sugarcane Research Centre,Fiji Molecular Genetic, USA DNA Plant technology of New Jersey, USA DNA Plant technology of New Jersey, USA Plantech Research Institute, Japan Univ. Agricultural Sciences, Hungary ICAR, India
Caa de azcar Resistencia a estrs abitico y a enfermedades Maz Tomate Apio Arroz Contenido de triptfano Contenido de materia seca Contenido de materia seca Resistencia a enfermedades
Mostaza
Rendimiento
Tabla 1. Especies con variedades obtenidas por la estrategia de variacin somaclonal.
En tabaco, se obtuvieron cultivares tolerantes a aluminio y resistentes a herbicidas. Tambin, mediante la aplicacin de esta estrategia se obtuvieron cambios interesantes para su explotacin comercial en especies ornaPHQWDOHV 9DULDFLRQHV HQ HO FRORU GH ODV RUHV OD DUTXLWHFWXUD GH OD SODQWD \ HO Q~PHUR GH RUHV por planta se citaron en gerbera, clavel, crisantemo, tulipn, violeta africana y begonia. Dentro de las especies forrajeras, se han observado variaciones en plantas de alfalfa regeneradas por cultivo in vitro, para caracteres como altura y resistencia a Fusarium oxysporum. En gramneas forrajeras como Lolium y Festuca arundinacea se han citado cambios, en varios caracteres como por ejemplo: morfologa de planta, forma y tamao de hoja y HVSLJD GHVDUUROOR RUDO YLJRU \ VXSHUYLYHQFLD y en pasto bermuda (Cynodon dactylon), resistencia al moteado de la hoja En el laboratorio de Gentica del Dpto. de $JURQRPtD GH OD 816 VH OOHYy D FDER XQ SUR-
yecto para obtener somaclones de pasto llorn. Se trabaj con varios cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de un gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Este PDWHULDO IXH UHJLVWUDGR HQ HO ,QVWLWXWR 1DFLRQDO de Semillas. - Utilizando un tratamiento de duplicacin cromosmica, se trat semilla, de una planta 51 derivada de la planta anterior obteniendo un genotipo tetraploide, altamente sexual, tambin registrado. Estos dos materiales se utilizan actualmente para realizar estudios bsicos acerca del modo de reproduccin (apomixis) y en la generacin de poblaciones de mapeo para el anlisis del modo reproductivo y de caracteres agronmicos de importancia. - Dos plantas heptaploides apomcticas a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Una
de dichas plantas fue registrada como cultivar Don Luis, en honor al Ing. Luis Mroginski. Este cultivar presenta buenas caractersticas agronmicas. La obtencin de variacin in vitro, en trigo, y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En trigo, se ha obtenido resistencia a Helminthosporium sativum. En cebada se encontr tolerancia en somaclones regenerados en medios conteniendo el herbicida glifosato. En sorgo, se obtuvo variacin estable para altura, nmero de macollos, mayor produccin de granos y tolerancia a suelos cidos y a sequa. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones D QLYHO GHO $'1 PLWRFRQGULDO \ GH SURWHtQDV GH la semilla, como las gliadinas. En ambas especies se informaron cambios estables en varios caracteres como por ejemplo: longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de granos, densidad y biomasa de la espiga, contenido de protena en grano, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano, tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al cido abcsico y color de las glumas. Las mutaciones observadas fueron de dominantes a recesivas y viceversa. El nico antecedente en nuestro pas de bsqueda de variacin somaclonal en trigo, es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares con elevados niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas, color del grano y de las JOXPDV WLSR GH DULVWDV QLYHOHV GH FORUROD \ morfologa de la planta. Slo se detect, como consecuencia del cultivo in vitro, una translocacin no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas. En este caso, se concluy que la tcnica no fue efectiva para inducir variacin que pudiera ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996). La variacin somaclonal ha sido vastamente registrada y tratada en la bibliografa. Sin embargo, su utilizacin como estrategia para la obtencin de variantes agronmicamente aproYHFKDEOHV HV GLVFXWLGD 1R REVWDQWH DGHPiV de su aplicacin en la generacin de variabilidad gentica (que resulta particular para cada grupo de plantas, especie, genotipo y condicio-
nes), es un fenmeno a considerar cuando se requiera utilizar cultivo de tejidos para regenerar plantas genotpicamente estables. 7 Lecturas recomendadas
%5(*,7=(5 3 +$/%(57 6 /(0$8; 3 Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theor. Appl. Genet. 96: 421-425. %5(*,7=(5 3 6 =+$1* 0- &+2 3 * LEMAUX. 2002. 5HGXFHG 6RPDFORQDO 9DULDWLRQ LQ %DUOH\ ,V $VVRFLDWHG ZLWK &XOWXULQJ +LJKO\ Differentiated, Meristematic Tissues. Crop Sci. &$66(/6 $& &52.( -7 '2</( %0 (YDOXDWLRQ RI ,PDJH $QDO\VLV )ORZ &\WRPHWU\ DQG 5$3' $QDO\VLV IRU WKH $VVHVVPHQW RI 6RPDclonal Variation and Induced Mutation in Tissue Culture Derived Pelargonium 3ODQWV $QJHZ %RW 71: 125-130. &$5'21( 6 32/&, 3 6(/9$ -3 0(&&+,$ 0 3(66,12 6 +(50$11 3 &$0%, 9 92,*7 3 63$1*(1%(5* * 9 (&+(1,48( 1RYHO JHQRW\SHV RI WKH VXEWURSLFDO JUDVV Eragrostis curvula for the analysis of apomixis (diplospory). Euphytica 151 (2): 263-272. &528*+$1 6 6 48,6(1%(55< 0 (,&++251 -5 3&2/<(5 7 %52:1 5HJLVWUDWLRQ RI %UD]RV5 EHUPXGDJUDVV JHUPplasm. Crop Science. 34: 542. '$ 6,/9$ & & 0$1*2/,1 $ 0277 0 0$&+$DO. *HQHWLF GLYHUVLW\ DVVRFLDWHG ZLWK LQ vitro and conventional bud propagation of Saccharum YDULHWLHV XVLQJ 5$3'6 DQDO\VLV 3ODQW Breeding. Vol 127 (2): 160-165. ($670$1 3 :(%67(5 ) 3,7(/ - 52%(576 D. 1991.Evaluation of somaclonal variation during somatic embryogenesis of interior spruce (Picea glauca engelmannii complex) using culture PRUSKRORJ\ DQG LVR]\PH DQDO\VLV 3ODQW &HOO 5Hports 10: 425-430. (9$16 ' 6+$53 : 6LQJOH JHQH PXWDWLRQV in tomato plants regenerated from tissue culture. Science.221: 949-951. )5$1=21( 3 68$5(= < 62/$5, 5 )$95(7 $ 526 5 '$= 3$/(2 $ 6RPDFORQDO variation in three Argentinean varieties of Triticum aestivum ZLWK GLIIHUHQW NDU\RW\SLF LQVWDELOLW\ 3ODQW Breed. 115: 89-93. *$//(*2 ) 0$571(= , &(/(67,12 & 725,%,2 0 7HVWLQJ VRPDFORQDO YDULDWLRQ XVLQJ 5$3'V LQ Quercus suber L. somatic embryos. Int. J. Plant Sci. 158(5): 563-567. GAUTO ACOSTA M. 2008. Evaluacin a campo de somaclones de Lolium perenne y sus progenies
GH PHGLRV KHUPDQRV 7UDEDMR GH LQWHQVLFDFLyQ para optar al grado de Ingeniero Agrnomo. Facultad de Agronoma. (UBA). 73 pp. *(,(5 7 &KURPRVRPH YDULDELOLW\ LQ FDOOXV produced plants. In Genetics and Breeding of Ornamental Species. 79-106. Harding & Mol. eds. .$(33/(5 6 0 3+,//,36 5 / ,Q 9LWUR Cell Dev.Biol. 29: 125-130. -$,1 6 0LFURSURSDJDWLRQ RI VHOHFWHG VRPDFORQHV of Begonia and Saintpaulia. 1997 J. Biosci. Vol. 1XPEHU .5,.25,$1 $ (VWDELOLGDG JHQRWtSLFD HQ clulas,tejidos y plantas derivados del cultivo in vitro. En Cultivos de tejidos en la Agricultura. &,$7 5RFD : \ 0URJLQVN\ / (GV /$5.,1 3 6&2:&52)7 : 6RPDFORQDO variation - a novel source of variability from cells cultures from plant improvement. Theor. Appl. Genet. 60, 197-214. /,1$&(52 5 )5(,7$6 $/9(6 ( 9$648(= $ +RWVSRWV RI '1$ LQVWDELOLW\ UHYHDOHG through the study somaclonal variation in rye. Theor Appl Genet. 100: 506-511. 0$'/81* $ &20$, O 7KH HIIHFW RI VWUHVV on genome regulation and structure. Annals of Botany. 94:481-495. 2/026 6 * /$9,$ 0 ', 5(1=2 / 052*,16.,9 (&+(1,48( *HQHWLF analysis of variation in micropropagated plants of Melia azedarach L. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant. 38: 617-622.
3(6&+.( 90 3+,//,36 5/ *HQHWLF LPplicationsof somaclonal variation in plants. Adv. *HQHW 6FDQGDOLRV :ULJKW HGV 32':<6=<16.$ 0 6RPDFORQDO YDULDWLRQ in micropropagated tulips based on phenotype observation. Journal of Fruit and Ornamental 3ODQW 5HVHDUFK 9RO SVABOVA L; LEBEDA A. 2005. In Vitro Selection IRU ,PSURYHG 3ODQW 5HVLVWDQFH WR 7R[LQ3URGXFing Pathogens. Journal of Phytopathology. Vol 153: 52-64. 80%(&. 3 % *(1*(1%$&+ 5HYHUVLRQ of male sterile T cytoplasm maize to male fertility in tissue culture. Crop. Science. 23: 584-588. 9(1872 %& &528*+$1 66 3,70$1 :' -(6683 5: 5(1*$1$<$., . %85621 %/ Variation among hexaploid Paspalum dilatatum Poir. regenerants from tissue culture. Australian Journal of Experimental Agriculture. 47:11091116 =$/(:6.$ 0 /(0$580,16.$ - 0,/(5 1 2007. In vitro propagation using adventitious EXGV WHFKQLTXH DV D VRXUFH RI QHZ YDULDELOLW\ LQ Chrysanthemum. Scientia Horticultural. Vol. 113: 70-73.
II. CAPTULO 6 Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal

Marina L. Daz, Diego C. Zappacosta, 3DVFXDO 0 )UDQ]RQH \ 5D~O ' 5tRV 1 Introduccin El mejoramiento gentico vegetal se origin hace aproximadamente 10.000 aos, cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas. En el siglo XX, con la incorporacin de los cruzamientos sexuaOHV HO FRQRFLPLHQWR GH OD ELRORJtD RUDO GH ODV especies, el desarrollo de la gentica y de la estadstica experimental, entre otros avances, se conformaron los mtodos de mejoramiento actualmente utilizados. El mejoramiento gentico convencional se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la manipulacin de la misma mediante la reproduccin sexual. Esto hace que el aprovechamiento de la variabilidad este restringido por barreras de compatibilidad reproductiva. El reciente desarrollo de mtodos de transferencia de genes que no implican cruzamientos, como la transformacin gentica, permite superar esta limitacin, abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. La transformacin gentica o transferencia de genes, tcnica tambin conocida como ingeniera gentica, permite introducir en plantas genes provenientes no solo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Asimismo, a travs de esta WHFQRORJtD HV SRVLEOH PRGLFDU OD H[SUHVLyQ GH genes presentes en el genoma de la planta. Si bien se suele denominar OGMs (organismos JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV D ODV SODQWDV REtenidas mediante esta metodologa, es oportuno considerar que todas las plantas que han sido mejoradas por el hombre a partir de su GRPHVWLFDFLyQ KDQ VLGR PRGLFDGDV JHQpWLFDmente por lo cual son OGMs y consideramos ms apropiado utilizar para las plantas obtenidas mediante transformacin gentica la deno-
minacin de plantas transgnicas. Conviene destacar que la transformacin de plantas es una tecnologa que aporta variabilidad gentica conocida sin alterar el fondo gentico por lo que puede ser considerada como una metodologa conservativa de mejoramiento, similar, en ese sentido, a la mutagnesis inducida o a la retrocruza. Este ltimo aspecto es de gran importancia ya que la creacin de cultivares es un proceso acumulativo, es decir, que se desea introducir caractersticas favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El germoplasma transgnico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento el cual depender de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresin de un transgen (gen introducido por va asexual) en clulas vegetales y al ao siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgnicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacin de esta tecnologa a ms de 120 especies. Las plantas transgnicas se obtienen por diversos mtoGRV ORV TXH KDQ VLGR PRGLFDGRV SDUD FDGD especie en particular, aumentndose de esta IRUPD OD HFLHQFLD GH ORV PLVPRV Entre sus aplicaciones de inters agropecuario se encuentran la obtencin de plantas con resistencia a estreses biticos (virus, insectos, hongos y bacterias), a estreses abiticos (salinidad, sequa, etc.), tolerancia a herbicidas SDUD IDFLOLWDU HO FRQWURO GH PDOH]DV \ PRGLFDcin de la calidad nutricional de los cultivos entre otras. La transformacin gentica tambin constituye una herramienta til para estudios bsicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y funcin de genes esSHFtFRV DVSHFWR SDUWLFXODUPHQWH UHOHYDQWH en la era genmica. 2 Requerimientos para la obtencin de plantas transgnicas Para todas las tcnicas de transformacin desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen a introducir (ste conVLVWH HQ VHFXHQFLDV UHJXODWRULDV \ FRGLFDQWH clonadas en un vector de transformacin) y de XQD PHWRGRORJtD HFLHQWH SDUD VX WUDQVIHUHQcia al genoma vegetal. Luego se induce el de-
sarrollo de plantas mediante distintas tcnicas de cultivo de tejidos y se procede al anlisis molecular de las plantas regeneradas in vitro SDUD LGHQWLFDU DTXHOODV TXH SRUWHQ \ H[SUHVHQ el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, mediante experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgnicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos bsicos que se requieren en trabajos de transformacin gentica en plantas son: 1. 8Q VLVWHPD HFLHQWH GH FXOWLYR GH WHMLGRV que permita regenerar plantas completas y frtiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el clonado del gen de inters y su transferencia al tejido blanco de transformacin. 3. Un protocolo de transformacin, es decir, un sistema de transferencia de genes y de seleccin del material transformado. 4. Herramientas de anlisis molecular para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripcin de los items anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos en una misma clula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula, E (O WUDQVJHQ GHEH LQWHJUDUVH DO $'1 FHOXlar y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que se YHULFDURQ ORV SURFHVRV D \ E Dado que las clulas tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un proWRFROR HFLHQWH GH WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD UHquiere maximizar la cantidad de clulas competentes para todos ellos de manera simultnea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los mtodos de transformacin ms utilizados actualmente se basan en la obtencin de clulas transgnicas y posterior recuperacin de plantas completas y frtiles a partir de las mismas a travs del cultivo y seleccin in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de
totipotencia expresada por las clulas vegetales. En la mayora de las especies se observa XQD LPSRUWDQWH LQXHQFLD GHO JHQRWLSR HQ OD respuesta al cultivo in vitro, razn por la cual es frecuente que se utilizen genotipos modelo GH DOWD UHVSXHVWD FRQ QHV H[SHULPHQWDOHV los cuales no necesariamente presentan inters agronmico. Por ello, cuando se usa esta WHFQRORJtD FRQ QHV GH PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR es muy importante conocer la respuesta morfogentica de distintos genotipos con adaptacin local, de modo de poder transformar directamente genotipos con valor agronmico. Por otra parte, en el cultivo in vitro, un prolongado perodo de subcultivos puede inducir la aparicin de variacin somaclonal no deseable ya TXH HV FRQYHQLHQWH LQWURGXFLU VROR ODV PRGLcaciones que se desean y en forma controlada. 2.2 Construccin del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello, PHGLDQWH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH VH GLJLHUH HO $'1 H[WUDtGR GH XQ RUJDQLVPR cualquiera sea su origen, con enzimas de restriccin. Estas endonucleasas tienen la capaFLGDG GH UHFRQRFHU HQ HO $'1 VHFXHQFLDV HVSHFtFDV FRPSXHVWDV SRU SRFRV QXFOHyWLGRV \ posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este modo, FORQHV GH $'1 UHFRPELQDQWH YHU SDUWH , $Oternativamente, se puede utilizar una tecnologa de clonado basada en el mecanismo de UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GHO IDJR ODPEGD FRQRFLGD FRPR VLVWHPD *$7(:$< ,QYLWURJHQ Un transgen est compuesto por una secuenFLD FRGLFDQWH UHJLyQ WUDGXFLEOH FRPSUHQGLGD entre los codones de iniciacin y terminacin de la traduccin) y por secuencias regulatorias que determinan tanto el momento del desarrollo de la planta como el tejido y el nivel en el que se expresar. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias (procariotas) \ XVXDOPHQWH QR SXHGHQ H[SUHVDUVH HFLHQWHmente en clulas eucariotas. Por lo tanto, resulta necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su
expresin en clulas vegetales. En este contexto, la secuencia ms importante es la coUUHVSRQGLHQWH DO SURPRWRU VLWLR GHO $'1 DO FXDO VH XQH OD HQ]LPD $51SROLPHUDVD SDUD LQLFLDU el proceso de transcripcin (Fig. 1). En la eleccin del promotor a utilizar en la construccin del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrn de expresin pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles, que responden a factores ambienWDOHV \ QDOPHQWH ORV HVSHFtFRV GH WHMLGR TXH permiten la transcripcin en rganos y tejidos particulares (Tabla 1). Los promotores pueden VHU PRGLFDGRV FRQ HO Q GH DXPHQWDU OD H[presin de los genes que regulan. As, pueden truncarse, adicionrseles un intrn o unrseles secuencias de otros promotores. Adems, es necesario que el transgen disponga de una re-
gin no traducida en el extremo 3 del mismo, que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte, el nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado por la posicin del mismo en el genoma de la planta, fenmeno conocido como efecto de posicin. Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas como intenVLFDGRUHV \ VLOHQFLDGRUHV D OD HVWUXFWXUD GH la cromatina, al patrn de metilacin, etc. Este aspecto es particularmente relevante considerando que con los mtodos de transformacin gentica nuclear utilizados actualmente, las inserciones de los transgenes en el genoma de la planta son al azar, As, la cantidad de protena producida por un transgen comnmente vara ms de 100 veces entre individuos transformantes obtenidos en el mismo experimento. La solucin para evitar los efectos de posicin es GLULJLU OD VHFXHQFLD GH LQWHUpV D VLWLRV HVSHFt-
Figura 1: Estructura molecular del transgen
Tabla 1: Promotores usados en la transformacin gentica de plantasv
Constitutivos
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maz) Act 1 (actina de arroz) TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) TobRB 7 (raz de tabaco) patatina (tubrculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequea de Rubisco (luz) alcohol deshidrogenasa-1 (anaerobiosis) protena de shock trmico (calor)
Promotores
Especficos de tejido
Inducibles
cos del genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin adecuado y estable. Esto podra lograrse usando sistemas de recombinacin KHWHUyORJD VLWLRHVSHFtFRV R PHGLDQWH UHHPplazo gnico por recombinacin homloga. 2.3 Mtodos de transformacin La pared celular constituye un obstculo SDUD OD HQWUDGD GHO $'1 D OD FpOXOD TXH WRGRV los mtodos de transformacin gentica tienen que superar de algn modo. Estos mtodos pueden dividirse en: a) Transformacin mediada por Agrobacterium, vector biolgico que participa del proceso de transferencia. b) Mtodos de transformacin gentica directa, tambin llamados fsicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos no biolgiFRV VH LQWURGXFH HO $'1 HQ OD FpOXOD 2.3.1 Transformacin mediada por Agrobacterium Las bacterias del gnero Agrobacterium son Gram-negativas, aerbicas obligadas y viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saproftico o parastico. El gQHUR FRPSUHQGH FXDWUR HVSHFLHV WRSDWRJpQLcas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledneas. La patognesis se inicia a partir de heridas, provocando la proliferacin de las clulas individuales infectadas. As, A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera. La capacidad patognica de estas bacterias est asociada a la presencia de megaplsmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por tumor-inducing o inductor GH WXPRUHV R 5L SRU URRWLQGXFLQJ R LQGXFWRU de races), presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostr que durante la patognesis un fragmento de estos plsmidos llamaGR 7$'1 SRU WUDQVIHU'1$ HV WUDQVIHULGR D OD FpOXOD YHJHWDO GRQGH VH LQWHJUD DO $'1 cromosmico y cuya expresin causa proliferacin de clulas de la planta a travs de la sntesis y alteracin de la respuesta a hormonas
YHJHWDOHV (O 7$'1 FRQWLHQH JHQHV OODPDGRV RQFRJHQHV TXH VH H[SUHVDQ HFLHQWHPHQWH en la clula vegetal infectada y producen sntesis de hormonas vegetales, responsables de la proliferacin anormal del tejido. Adems, contiene los genes responsables de la sntesis de opinas (fuente de carbono y nitrgeno para la bacteria). El sistema mediado por A. tumefaciens es el ms estudiado y utilizado en la transformacin GH SODQWDV (O 7$'1 HVWi GHOLPLWDGR SRU GRV repeticiones directas imperfectas de 25 pares GH EDVHV SE TXH OR DQTXHDQ OODPDGDV ERUdes derecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son los nicos elementos en cis necesarios SDUD GLULJLU HO SURFHVDPLHQWR GHO 7$'1 &XDOTXLHU IUDJPHQWR GH $'1 XELFDGR HQWUH HVWRV bordes puede ser transferido a la clula vegetal. Contrariamente a lo que sucede con otros WLSRV GH VHFXHQFLDV PyYLOHV GH $'1 FRPR ORV WUDQVSRVRQHV DXWyQRPRV HO 7$'1 QR FRGLFD los productos que median su transferencia. El 7$'1 HV XQD UHJLyQ UHODWLYDPHQWH JUDQGH ca. 20 Kb) que contiene genes con secuencias regulatorias (promotores y seales de poliadenilacin) tpicamente eucariticas que permiten VX H[SUHVLyQ HFLHQWH HQ FpOXODV YHJHWDOHV Desde la dcada de 1950 se sabe que los tumores de la agalla de la corona se desarrollan si hay A. tumefaciens patognicas en presencia de heridas. Un aspecto destacable de esta bacteria es que usa la respuesta de la planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) como quimioatractivo y activador del proceso de patognesis. Luego de la adhesin de la bacteria a la clula vegetal, etapa en la que estn involucrados genes cromosmicos bacterianos (chv A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce HO SURFHVDPLHQWR \ OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 mediados por los genes vir (por virulencia) que son inducidos por azcares y compuestos fePlsmido TI salvaje Borde izquierdo
Oncogenes
Genes de opinas
Borde derecho
Plsmido TI modificado Borde izquierdo

Gen de seleccin
Gen de inters
Borde derecho
Figura 2: (VWUXFWXUD GHO 7'1$
nlicos, como la acetosiringona, producidos por clulas vegetales heridas. Se conoce con mucho detalle la etapa de la patognesis que ocurre en la bacteria (ver revisin de Gelvin, 2000). La regin de virulencia (de alrededor de 30 Kb) est organizada en operones esenciaOHV SDUD OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 vir A, vir B, vir D, vir * R TXH SHUPLWHQ LQFUHPHQWDU OD Hciencia de la transformacin (vir C, vir E). El conocimiento de la interaccin de Agrobacterium con las plantas se profundizar a partir de la disponibilidad (2001) de la secuencia nucleotdica completa del genoma de esta bacteria. El desarrollo de la patognesis causada por Agrobacterium representa una situacin nica en la naturaleza: la transferencia de un elePHQWR JHQpWLFR 7$'1 GH XQ RUJDQLVPR SURcariota a un organismo eucariota superior, con su subsiguiente integracin y expresin en el genoma hospedante. Este mecanismo de ingeniera gentica natural es aprovechado para la transferencia de genes de inters a las plantas. Para ello, los oncogenes y los genes de VtQWHVLV GH RSLQDV SUHVHQWHV HQ HO 7$'1 VRQ reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir (Fig. 2). El mtodo llamado del explante (Horsch et al., 1984), consiste en inocular un explante (rgano vegetal) con A. tumefaciens, dejar la bacteria en contacto con el mismo durante un cierto tiempo en el cual se SURGXFH OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 PRGLFDGR 3RVWHULRUPHQWH VH WUDQVHUHQ ORV H[SODQWHV a un medio de cultivo que contiene un antibitico que acta como bacteriosttico para detener el desarrollo de Agrobacterium y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y seleccin in vitro se recuperan las plantas transgnicas (Fig. 3). El anlisis por hibridacin molecular de plantas transgnicas y su progenie ha demostrado que HO 7$'1 VH LQFRUSRUD DO $'1 FURPRVyPLFR \ se hereda en forma estable. Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados, son de gran tamao y resulWD GLItFLO LQWURGXFLU JHQHV HQ VX 7$'1 XVDQGR WpFQLFDV KDELWXDOHV GH $'1 UHFRPELQDQWH 3RU esta razn se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, y los bina-
rios. En los vectores cointegrados la insercin GHO $'1 TXH FRQWLHQH ORV WUDQVJHQHV GHQWUR GHO 7$'1 GH XQ SOiVPLGR 7L GHVDUPDGR VH ORJUD por recombinacin homloga. En el sistema alternativo, sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans, movili]DQGR HO 7$'1 SUHVHQWH HQ RWUR SOiVPLGR VH construyen los denominados vectores binarios TXH FRQWLHQHQ XQ 7$'1 QR RQFRJpQLFR HQ XQ plsmido pequeo con un origen de replicacin funcional en un amplio espectro de hospedantes, caractersticas que permiten su fcil manipulacin gentica en E. coli. La introduccin de un vector binario a una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin 7$'1 OD KDFH DSWD SDUD OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 D ODV FpOXODV YHJHWDOHV 6L ELHQ DPERV WLSRV GH YHFWRUHV VRQ KHUUDPLHQWDV HFLHQWHV para la transformacin se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. /D LQWHJUDFLyQ GHO 7$'1 HQ HO $'1 FURPRsmico de la planta se produce al azar, por recombinacin ilegtima, preferencialmente en regiones genmicas con actividad transcripcional y mediado por protenas de la bacteria y de la planta. Este sistema de transformacin SHUPLWH WUDQVIHULU IUDJPHQWRV GH $'1 GH KDVWD 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen caractersticas tanto de cromoVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV %$&V FRPR de vectores binarios. El uso de estos vectores SHUPLWH FORQDU IUDJPHQWRV GH $'1 GH JUDQ WDmao y posteriormente transferirlos al genoma vegetal va A. tumefaciens. Esta tecnologa es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. Ms de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens. Estas son en su mayora dicotiledneas y gimnospermas y ms raramente monocotiledneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformacin gentica basados en este vector. El inters en el desarrollo de este tipo de tecnologa hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles a este patgeno en condiciones naturales. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de la interaccin Agrobacterium/clula vegetal. As, se
ha puesto nfasis en la utilizacin de A. tumefaciens como vector de transformacin en gramneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maz, cebada, trigo y gramneas forrajeras). Cabe notar que su aplicacin es rutinaria en arroz y maz. La transformacin con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la produccin de races con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacuticos, aditivos alimentarios y cosmticos y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulacin de la rizognesis en especies recalcitrantes, por ejemplo leosas. 2.3.2 Transformacin directa o por mtodos fsicos La primer metodologa de transformacin gentica de plantas desarrollada fue la de A. tumefaciens, pero no result inicialmente de utilidad para abordar la transformacin de especies de gran importancia econmica como los cereales, debido a que stos no son hospedantes naturales de esta bacteria. Esta situacin condujo al desarrollo de los mtodos fsicos de transformacin. En ellos el transgen es introducido en la clula vegetal mediante distintas tcnicas que se detallan a continuacin: Transformacin de protoplastos /D LQWURGXFFLyQ \ H[SUHVLyQ GH $'1 IRUiQHR en protoplastos fue el primer mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas. Se dispona, para algunas especies, GH SURFHGLPLHQWRV HFLHQWHV SDUD OD UHJHQHUDcin a partir de protoplastos, clulas que carecen temporariamente de pared celular que es OD SULQFLSDO EDUUHUD SDUD OD LQWURGXFFLyQ GH $'1 en las clulas vegetales. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso enzimtico que digiere la pared. As se obtiene una suspensin que contiene millones de clulas individuales lo que favorece la transformacin de clulas aisladas. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o liposomas. La transformacin de protoplastos mediada por PEG es el mtodo ms comnmente usado. Tanto el
PEG como la electroporacin producen poros en la membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la misma y por ellos penetra el $'1 IRUiQHR (Q HO ~OWLPR FDVR VH VRPHWH D ORV protoplastos a un campo elctrico. Ambas tcnicas permiten el tratamiento simultneo de un gran nmero de protoplastos. La microinyeccin es un mtodo difcil y laborioso que consiste en OD LQWURGXFFLyQ GH $'1 GHQWUR GH SURWRSODVWRV individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y micromanipulador y con esta metodologa es posible lograr un alto grado de integraFLyQ GHO $'1 IRUiQHR Cabe notar que el cultivo de protoplastos es OD PHWRGRORJtD PiV VRVWLFDGD GH FXOWLYR in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de transformacin directa como la electroporacin de tejidos, HO XVR GH EUDV GH FDUEXUR GH VLOLFLR SDUD IDFLOLWDU OD HQWUDGD GHO $'1 D ODV FpOXODV HQ cultivo y el bombardeo con microproyectiles o micropartculas siendo este ltimo el ms utilizado actualmente dentro de los mtodos fsicos. Bombardeo de micropartculas Es un proceso por el cual micropartculas FXELHUWDV FRQ $'1 VRQ DFHOHUDGDV SRU XQ JDV comprimido e introducidas en clulas vegetales. Inicialmente la fuerza impulsora de las partculas estaba dada por plvora, pero luego fue reemplazada por el sistema de helio comprimido que brinda una mejor regulacin de la fuerza, distribucin de microproyectiles y mayor reproducibilidad entre bombardeos. Se utilizan microproyectiles de oro o tungsteno (qumicamente inertes) cuyos tamaos van desde 0,5 a P TXH DO VHU GLVSDUDGRV D JUDQGHV YHORFLdades pueden atravesar pared y membranas de la clula vegetal bombardeada sin causarle GDxRV VLJQLFDWLYRV .OHLQ et al., 1987). Como blanco de bombardeo se pueden emplear diversos tipos de explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El explante es generalmente sometido a un tratamiento osmtico pre y post bombardeo que produce plasmlisis celular,
evitando que el impacto y la penetracin de las partculas daen las clulas (Fig. 3). Los vectores plasmdicos que se usan en este tipo de procedimiento solo requieren un origen de replicacin que permita un alto nmero de copias de los mismos en E. coli, aspecto que facilita HQ OD SUiFWLFD OD SUHSDUDFLyQ GHO $'1 QHFHVDrio en grandes cantidades para la transformacin gentica por este mtodo. Esta tcnica, sin embargo, tiene limitaciones. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares OLJQLFDGDV R VXSHUFLHV YHOORVDV 6LQ HPEDUgo la principal limitacin del mtodo contina siendo la baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera permanente el transgen. A pesar de esta limitacin, la versatilidad de la aceleracin de partculas para introducir transgenes ha superado muchas de las barreras asociadas a otros mtodos de transformacin, como son el rango de huspedes de Agrobacterium \ ODV GLFXOWDGHV inherentes al cultivo y regeneracin de protoplastos. Este mtodo, conocido tambin como biolstica, ha demostrado ser una buena opcin para la produccin de plantas transgnicas de
soja, sorgo, papaya, esprrago, caa de azcar y trigo, entre otras. 2.3.3 Transformacin directa vs. indirecta Con el transcurso de las investigaciones se ha logrado optimizar los protocolos de transformacin para muchas especies vegetales. Ambas vas de transformacin presentan ventajas y desventajas que las hacen ms o meQRV FRQYHQLHQWHV SDUD ORV GLVWLQWRV QHV (Q la Tabla 2 se presenta una comparacin entre la transformacin del genoma nuclear mediada por A. tumefaciens y el mtodo biolstico como representante de los mtodos de transformacin directa. Uno de los procesos necesarios para obtener plantas transgnicas, es la integracin del WUDQVJHQ DO $'1 FURPRVyPLFR &RQ UHODFLyQ D este proceso existen diferencias entre ambos mtodos. A. tumefaciens posee un mecanismo QDWXUDO PX\ HFLHQWH SDUD WUDQVIHULU DO Q~FOHR FHOXODU HO 7$'1 TXH FRQWLHQH HO WUDQVJHQ \ producir una integracin aleatoria en regiones cromosmicas con actividad transcripcional. Generalmente, los patrones de insercin de transgenes son ms sencillos en comparacin a los producidos por el mtodo biolstico. As el nmero de copias que se incorpora es bajo
Tabla 2: Comparacin entre mtodos de transformacin del genoma nuclear
Agrobacterium Especies a transformar
Mtodo biolstico
dicotiledneas y algunas monocotiledneas alta aleatoria en regiones con transcripcin bajo nmero de copias independientes precisa compleja mayor
sin limitaciones
Eficiencia de transformacin Tipo de integracin en el genoma vegetal
baja aleatoria multicopia en tandem imprecisa simple menor
Construccin de vectores Dependencia del genotipo vegetal
Figura 3: Comparacin de tcnicas de transformacin directa e indirecta
y cuando hay ms de una copia, stas suelen distribuirse en loci independientes, lo que facilita la posterior eliminacin de las copias no deseadas por segregacin. Por otra parte, el PHFDQLVPR LQYROXFUDGR KDFH TXH VH WUDQVHUD XQ VHJPHQWR GH $'1 GHQLGR HO 7$'1 acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el PpWRGR ELROtVWLFR HO $'1 WUDQVIHULGR QR HVWi asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado solo parte del mismo llega al Q~FOHR GRQGH VH SURGXFH FRQ EDMD HFLHQFLD OD LQWHJUDFLyQ DO D]DU HQ HO $'1 FURPRVyPLFR En este mtodo es comn que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en
un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este ltimo aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepcin pblica como el de la optimizacin de la expresin de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples \ ELHQ GHQLGDV PROHFXODUPHQWH (VWR HV SDUticularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales. As, el fenmeno de silenciamiento de transgenes (prdida de su expresin), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. Por otra parte, cuando se utiliza el mtodo biolstico, el seg-
PHQWR GH $'1 SODVPtGLFR TXH VH LQWHJUD DO $'1 FURPRVyPLFR QR HVWi GHQLGR FRPR HQ HO FDVR GH 7$'1 VLQR TXH HV GH ORQJLWXG YDriable. La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el caso del mtodo biolstico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigacin, en los cuales muchas veces se requiere utilizar un nmero considerable de vectores diferentes. Es conveniente destacar que en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma se produce al azar, como consecuencia de ello, diferentes plantas transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. As, la expresin fenotpica de un transgen ser diferente en distintas plantas transgnicas que contienen el mismo transgen, por lo cual para claULFDU OD VLWXDFLyQ VH FRQVLGHUD D FDGD XQD GH ellas como eventos de transformacin distintos. /D HFLHQFLD GH DSOLFDFLyQ GH FXDOTXLHUD GH estos mtodos de transformacin al mejoramiento vegetal, depende en gran medida de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe mencionar que en el caso de A. tumefaciens, debido a que se trata de una interaccin biolgica planta/bacteria, la dependencia del genotipo HV PXFKR PiV DFHQWXDGD \D TXH LQX\HQ WDPELpQ HQ OD HFLHQFLD GH WUDQVIRUPDFLyQ WDQWR HO genotipo de la planta como el de la bacteria.
2.3.4 Genes de seleccin e informadores En el proceso de obtencin de plantas transgnicas, los genes marcadores seleccionables (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia ya sea en forma individual para poner a punto un protocolo de transformacin o como acompaantes del gen de inters que se desea introducir. El gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. (QWRQFHV VL HO JHQ PDUFDGRU FRGLFD SDUD XQD SURWHtQD TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD D DJHQWHV totxicos como antibiticos o herbicidas, las clulas que lo expresen podrn crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las clulas no transgnicas no lo harn (seleccin negativa). En otros casos, la ventaja estar dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. As, el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las clulas no transgnicas (seleccin positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados. Por ello, es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de seleccin a utilizar, as como el agente selectivo y las concentraciones del mismo.
Marcadores
Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina, paromomicina, G418) hph (higromicina) pat o bar (phosphinotricina, bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato)
Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul ndigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde)
Tabla 3: Genes marcadores utilizados comnmente en transformacin de plantas
En la puesta a punto de las metodologas de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observacin directa de las clulas que los expresan (Tabla 3). (VWRV JHQHV FRGLFDQ SDUD SURWHtQDV TXH QR estn presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida observacin. As, el gen gus A proveniente de E. coli FRGLFD SDUD OD enzima -glucuronidasa. Esta protena puede ser detectada cualitativamente por tincin histoqumica. En esta WpFQLFD HQ SUHVHQFLD GH XQ VXVWUDWR HVSHFtFR esta enzima cataliza la produccin de un precipitado azul-ndigo de fcil visualizacin. Este marcador tambin puede ser detectado cuanWLWDWLYDPHQWH XVDQGR WpFQLFDV XRURPpWULFDV Como ejemplo de la aplicacin de estos mtodos de deteccin, podemos mencionar el estudio de la expresin de promotores en plantas. Para ello se puede construir un vector con la VHFXHQFLD FRGLFDQWH GH Jus A bajo el control del promotor en estudio y una secuencia de terminacin de transcripcin, y obtener plantas transgnicas. El estudio de las mismas permite conocer el patrn de expresin espaciotemporal del promotor (en que tipo de clulas y cuando se expresa) por tincin histoqumica y VX QLYHO GH H[SUHVLyQ SRU XRURPHWUtD 3RU RWUD SDUWH HO JHQ GH OD SURWHtQD XRUHVcente verde, gfp JUHHQ XRUHVFHQW SURWHLQ aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde XRUHVFHQWH $O VHU HVWH XQ HQVD\R QR GHVWUXFtivo, es decir que permite conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformacin. 2.4 Tcnicas de deteccin del transgen y sus productos Luego de la seleccin in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas por mtoGRV PROHFXODUHV SDUD LGHQWLFDU DTXHOODV TXH porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como:
- Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): con el uso de primers homlogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta tcnica permite hacer un screening rpido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones. As, un resultado positivo indica solamente que en OD PXHVWUD H[LVWH XQD VHFXHQFLD TXH DPSOLFD con los primers utilizados pero no demuestra que el transgen se encuentre incorporado al genoma de la planta. Para esto ltimo se requiere un estudio de hibridacin molecular o el estudio de la transmisin sexual del transgen. La robustez de esta prueba se maximiza utilizando temperaturas de annealing o apareamiento de primers altas (ms de 60 qC) y primers relativamente largos (ms de 20 nuFOHyWLGRV 8QD YDULDFLyQ GH HVWD WpFQLFD 3&5 en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar el nmero de copias del transgen incorporadas al genoma de la clula vegetal (ver parte I). - Hibridacin molecular o Southern blotting: es una de las herramientas moleculares mas poderosas para caracterizar las plantas transgnicas. Adems de indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin). En la Figura 4 se representa el anlisis de un caso hipottico de transformacin mediante Agrobacterium, aunque este es aplicable tambin a plantas obtenidas por mtodos directos. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de inters y el gen marcador. Si se utiliza FRPR VRQGD HO 7$'1 FRPSOHWR \ OD GLJHVWLyQ GHO $'1 JHQyPLFR VH UHDOL]D FRQ HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ TXH QR FRUWDQ GHQWUR GHO 7$'1 HO nmero de bandas del patrn representa el nmero de sitios de insercin. El tamao de las EDQGDV VHUi PD\RU TXH HO 7$'1 \D TXH VH estn utilizando enzimas que cortan por fuera de este. Plantas transgnicas obtenidas en forma independiente tendrn patrones de hibridacin diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte nico dentro GHO 7$'1 XWLOL]DQGR OD VRQGD DQWHV PHQFLRnada, esta dar dos seales de hibridacin
Hind III
Eco RI
Sal I
Sal I
Hind III
a)
BI
Gen marcador 2 kb b) 1 2 3 4 5 c) 1 2 3 4
Gen de inters 3 kb 5 d) 1 2 3 4 5
Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao cantidad
Ausente dentro del TADN

T-ADN (frag. Hind III)
Uno interno (Eco RI)

T-ADN (frag. Hind III)
Un sitio (EcoRI) entre el marcador y el transgen Gen marcador > 2 kb Igual en en b)
> 5 kb Variable
> 2 kb El doble que en b)
e) 1
f) 1
Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao cantidad
Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Transgen > 3 kb Igual que en d)
Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Fragmento (Sal I) del transgen 1 kb Uno
Figura 4: Patrones de Hidridacin de Southern Blot (Tomado de Bhat y Srinivasan, 2002)
para cada sitio de insercin independiente del 7$'1 F /D DSDULFLyQ GH XQ Q~PHUR LPSDU de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron mltiples copias, ocurrieron rearreglos R VH SURGXMR HO WUXQFDGR GHO 7$'1 6L VH GLgiere la muestra con una enzima de restriccin que posee un sitio nico de corte entre el gen marcador y el gen de inters y utilizando como sonda el gen marcador, se obtendr una sola banda por cada insercin independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de inters (4-e) aparecer un patrn que tendr el mismo nmero de bandas que el anterior. La ausencia de una banda indica la insercin de una copia truncada de uno de los genes y la
prdida del sitio de corte. La aparicin de una EDQGD GHO WDPDxR GHO 7$'1 SXHGH LQGLFDU OD presencia de repeticiones en tandem. Para estimar el nmero de copias del transgen en un locus transgnico, se deben utilizar enzimas de UHVWULFFLyQ FRQ VLWLRV DQTXHDQWHV GHO WUDQVJHQ y como sonda el transgen. Se observar una sola banda del tamao del transgen, sin embargo la intensidad de la seal variar entre las distintas plantas analizadas de acuerdo al nmero de copias del mismo (4-f). Para realizar esta comparacin es necesario utilizar simultneamente estndares conteniendo un nmero conocido de copias del transgen. Esta determinacin no es del todo precisa ya que puede
existir variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestin de las muestras y a OD SRVLEOH GHJUDGDFLyQ GHO $'1 (Q OR TXH UHVSHFWD D OD FXDQWLFDFLyQ HVWD tcnica ha sido reemplazada en gran medida, HQ ORV ~OWLPRV DxRV SRU OD 3&5 HQ WLHPSR UHDO R UHDO WLPH 3&5 DQWHV PHQFLRQDGD GDGR TXH esta ltima resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el anlisis. - Anlisis de ARN: 7DQWR ODV WpFQLFDV GH 57 3&5 WUDQVFULSFLyQ UHYHUVD VHJXLGD GH 3&5 FRPR OD KLGULGDFLyQ GH $51 R 1RUWKHUQ EORWting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters preVHQWHV HQ OD PXHVWUD /D 573&5 SUHVHQWD DOJXQDV YHQWDMDV IUHQWH DO 1RUWKHUQ EORWWLQJ se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil preparacin. Por otra parte, la hibridacin del $51 XWLOL]D FRPR VRQGD HO WUDQVJHQ RIUHFH informacin sobre el tamao del transcripto y SHUPLWH VX FXDQWLFDFLyQ &DEH GHVWDFDU TXH OD 573&5 SXHGH WDPELpQ VHU XWLOL]DGD FRPR WpFQLFD GH FXDQWLFDFLyQ GH WUDQVFULSWRV - ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden ser anaOL]DGDV FRQ HVWDV WpFQLFDV LQPXQROyJLFDV D Q de determinar la presencia de la protena codiFDGD SRU HO WUDQVJHQ /D DFWLYLGDG GH OD SURWHtQD FRGLFDGD SRU HO transgen debe ser medida, ya sea por ensayos ELRTXtPLFRV R SRU ELRHQVD\RV D Q GH LQWHUpretar correctamente el fenotipo de la planta REWHQLGD $GHPiV HV FRQYHQLHQWH FRQUPDU la estabilidad meitica de los transgenes estudiando su transmisin sexual a la generacin siguiente. Estas tcnicas se encuentran descriptas detalladamente en la parte I y su aplicacin para HO DQiOLVLV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV HQ 5HJLVWHU (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). Finalmente el comportamiento de los individuos transgnicos se estudia en laboratorio, invernculo y campo. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernculo y de campo en Argentina es necesario contar con
autoUL]DFLyQ GH OD &RPLVLyQ 1DFLRQDO $VHVRUD GH %LRWHFQRORJtD $JURSHFXDULD &21$%,$ YHU parte VII). 3 Aporte de la transformacin gentica a la variabilidad gentica Como ya se mencion, la transformacin gentica permite introducir variabilidad gentica novedosa en las diferentes especies vegetales. Este aporte puede ser realizado de diferentes maneras: D /D H[SUHVLyQ GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano). b) La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). F /D H[SUHVLyQ GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV presentes en el genoma pero bajo el control de QXHYDV VHFXHQFLDV UHJXODWRULDV TXH PRGLFDQ su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis). d) La inhibicin de la expresin de genes residentes en el genoma. Para lograr la inhibicin de la expresin gnica se pueden usar diferentes tcnicas: cosuSUHVLyQ $51 DQWLVHQWLGR \ OD GHQRPLQDGD LQWHUIHUHQFLD GHO $51 7RGDV HOODV VH EDVDQ HQ XQ proceso denominado silenciamiento gnico que LQYROXFUD OD GHJUDGDFLyQ GHO $51 PHQVDMHUR producido por un gen determinado (ver captulo siguiente). Un inconveniente que se encuentra tanto en el mejoramiento convencional como en la ingeniera gentica es la incorporacin de mltiples genes. A esto se lo llama piramidizacin de genes y es necesario para la expresin de caractersticas complejas de naturaleza polignica (por ej. vas biosintticas), la obtencin de resistencia a enfermedades ms duradera donde se requiere ms de un gen para evitar la cada de la resistencia, para otorgar resistencia conjunta a varios patgenos o la incorporacin de mltiples caractersticas. Algunas estrategias para alcanzar este objetivo son las siguientes: a) cruzamiento de dos plantas transgnicas con distintos transgenes b) re-transformacin en eventos consecutivos
c) co-transformacin en el mismo evento La co-transformacin es la alternativa ms utilizada y ventajosa, ya que los transgenes co-transformados tienden a co-integrarse en la misma posicin en el genoma en la mayor proporcin de los eventos transgnicos. Esto asegurara la no segregacin de los genes, lo cual es muy til cuando se quiere incorporar una caracterstica polignica. La mayora de los procesos metablicos que pueden ser sujetos a manipulacin dependen de la interaccin entre numerosos genes y el XMR GHQWUR GH ODV YtDV ELRTXtPLFDV HV D YHces coordinado con otras vas, por lo que la manipulacin efectiva slo puede ser alcanzada coordinando el grado de expresin de los distintos transgenes. Coordinar la expresin de mltiples transgenes sobre una misma va metablica es muy difcil de alcanzar, ya que la expresin de los transgenes depende del lugar donde se inserten en el genoma. Existen algunas estrategias elegidas para la manipulacin de estas caractersticas: - transgenes policistrnicos (un promotor con varios transgenes) - poliprotenas El avance tcnico en esta rea es uno de los mayores desafos de la biotecnologa vegetal, ya que las nuevas generaciones de transgnicos requieren de la incorporacin de mltiples caractersticas. 4 Obtencin de plantas transplastmicas Las clulas vegetales contienen tres genomas: el nuclear, el plastdico y el mitocondrial. Los mtodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformacin al genoma nuclear. Sin embargo en los ltimos aos la obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin. As, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la transformacin del genoma nuclear: 1. Se pueden obtener altos niveles de expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas
2. 3.
4. 5.
6.
FRGLFDGDV SRU HOORV KDVWD HO GH ODV protenas solubles totales). Cabe notar que el nivel de acumulacin observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. Es posible expresar un transgen opeUyQ FRQ YDULDV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV bajo el control de un mismo promotor. 1R VH REVHUYD HIHFWR GH SRVLFLyQ GHELGR a que la integracin del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto hace que no sea necesario obtener una gran poblacin de transformantes, a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgnicas nucleares. 1R VH REVHUYD VLOHQFLDPLHQWR GH WUDQVgenes. Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los transgenes por el polen debido a la baja de transmisin de los plstidos por el mismo. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar protenas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro gracias a la presencia de protenas chaperonas y sistemas enzimticos endgenos.
Los protocolos existentes para la obtencin de plantas transplastmicas se basan en la transferencia de genes por el mtodo biolstico, XQ HFLHQWH SURFHVR GH FXOWLYR \ VHOHFFLyQ in vitro, y la utilizacin de vectores con secuencias homlogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformacin del genoma nuclear, la integracin dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinacin homloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de LQWHUpV DQTXHDGRV SRU VHFXHQFLDV FRQ DOWD KRPRORJtD DO $'1 SODVWtGLFR /D KRPRORJtD HQWUH HO $'1 GHO YHFWRU \ GHO $'1 GHO FORURplasto determina la potencialidad del plsmido para ser utilizado en la transformacin gentica del plastoma. En este contexto, la existencia de secuencias altamente conservadas en el
plastoma de varias especies es explotada para el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los cloroplastos de numerosas especies. La expresin exclusivamente plastdica de los transgenes queda asegurada a travs de la utilizacin de SURPRWRUHV HVSHFtFRV GHO FORURSODVWR FX\D transcripcin tiene caractersticas tpicamente procariticas. 5 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnologa de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. En los ltimos aos se nota un creciente inters en el control del nivel de expresin de transgenes as como de su regulacin espacial y temporal. La expresin de los genes nucleares eucariticos est controlada en varios niveles que involucran la transcripcin propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su WUDGXFLELOLGDG DVt FRPR OD HVWDELOLGDG PRGLcacin y compartimentalizacin del producto SURWHLFR QDO. Por otra parte, es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresin de transgenes, de modo de disear protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento gnico. En este contexto, est recibiendo notable atencin el estudio de la recombinacin homloga como mecanismo para la transformacin del genoma nuclear. Del anlisis comparativo de mtodos presentado cabe destacar tres aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, contina el inters en extender el uso de la transformacin mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los mtodos de transformacin gentica actualmente en uso requieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en una clara limitacin cuando se desea aplicar esta tecnologa a los materiales usados por los mejoradores, los que generalmente no poseen esta caracterstica. Por ello, se est tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de
transformacin, lo que permitir ampliar el rango de genotipos a los cuales se podr aplicar esta moderna tecnologa. As, se desarroll un PpWRGR HFLHQWH \ UHSURGXFLEOH GH WUDQVIRUPDcin in planta para Arabidopsis thaliana. Este FRQVLVWH HQ LQOWUDU FRQ YDFtR SODQWDV DGXOWDV de esta especie, con una suspensin de A. tumefaciens de modo que los tejidos y rganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. 3RVWHULRUPHQWH VH SURSXVR XQD VLPSOLFDFLyQ de este mtodo que consiste en reemplazar el WUDWDPLHQWR GH YDFtR \ VXPHUJLU OD LQRUHVFHQcia en una suspensin bacteriana que incluye un surfactante. Las plantas transgnicas que se obtienen por autofecundacin de las plantas as transformadas, son hemicigotas y se demostr que esta metodologa produce la transformacin de la gameta femenina. Finalmente, debido a la importante restriccin que puede VLJQLFDU OD XWLOL]DFLyQ GH PpWRGRV GH WUDQVIRUmacin gentica protegidos por patentes, se ha est estudiando el desarrollo de mtodos que utilizan, a partir de herramientas derivadas de Agrobacterium, otras bacterias como vectores alternativos de transformacin. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta PHWDEyOLFD R OD PRGLFDFLyQ GH XQ FDUiFWHU complejo de inters agronmico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fngicas, requiere de la integracin de mltiples transgenes y de la expresin coordinada de los mismos en la planta. Este tema est recibiendo notable atencin. Los mtodos de transformacin que hemos descripto se basan en la utilizacin de genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgnicas TXH VH OLEHUDQ DO DPELHQWH +D\ XQ PDQLHVWR rechazo por parte del pblico con respecto a la utilizacin de genes de resistencia a antibiticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente. Por otra parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos transgenes y con la metodologa convencional no hay ms que un nmero limitado de genes marcadores disponibles. Por ello se
consideran estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido ms esfuerzo hasta ahora, plantea la remocin va cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgnica. Una posibilidad para ello es cotransformar. Esto implica que el transgen de inters y el marcador seleccionable estn presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregacin luego de la reproduccin sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando QR VH GLVSRQH GH XQ SURWRFROR HFLHQWH GH FRtransformacin o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgnica. Otra opcin dentro de esta lnea es la utilizacin del VLVWHPD GH UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GH origen viral Cre/lox. Esta estrategia requiere primero la obtencin de plantas transgncias portadoras del gen de la recombinasa (cre) y posteriormente la introduccin del transgen DQTXHDGR SRU VLWLRV OR[ GH UHFRQRFLPHQWR Ms recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de mtodos de transformacin que no usen marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformacin a travs del uso de genes que promuevan la regeneracin. Finalmente, las plantas transgnicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayora resistentes a herbicidas y a insectos, nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos. A pesar de estos avances en el desarrollo de esta tecnologa, su aplicacin comercial se ve limitada por el elevado costo que tiene el pasaje por el estricto sistema de controles que regula su aplicacin. Esto restringe notoriamente las especies a ser usadas en transformacin y los caracteres a mejorar mediante la misma.
Bhat S., Srinivasan S. 2002. Molecular and genetics analyses of transgenic plants: considerations and approaches. Plant Science 163:673-681. %LUFK 5 3ODQW WUDQVIRUPDWLRQ 3UREOHPV DQG VWUDWHJLHV IRU SUDFWLFDO DSSOLFDWLRQV $QQX 5HY Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 48: 297-326. )UDQoRLV , %URHNDHUW : &DPPXH % 'LIIHUent approaches for multi-transgene-stacking in plants. Plant Science 63: 281-295. Gelvin S. 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the GeneJockeying Tool. Microbiology and Molecular BiRORJ\ 5HYLHZV 0DU *HSWV 3 $ &RPSDULVRQ EHWZHHQ &URS 'Rmestication, Classical Plant Breeding, and GeQHWLF (QJLQHHULQJ &URS 6FL Halpin C. 2005. Gene stacking in transgenic plants WKH FKDOOHQJH IRU st century plant biotechnology. Plant Biotechnology Journal, 3:141-155. +DQLQ 0 3DV]NRZVNL - 3ODQW JHQRPH PRGLFDWLRQ E\ KRPRORJRXV UHFRPELQDWLRQ &XUrent Opinion in Plant Biology 6: 157-162. +RUVFK 5 )UDOH\ 5 5RJHUV 6 6DQGHUV 3 /OR\G $ +RIIPDQ 1 ,QKHULWDQFH RI IXQFWLRQDO foreign genes in plants. Science 223: 496-498. .OHLQ 7 :ROI ( :X 5 6DQIRUG - +LJK YHlocity microprojectiles for delivering nucleic acids LQWR OLYLQJ FHOOV 1DWXUH /HH / \ *HOYLQ 6 7'1$ %LQDU\ 9HFWRUV DQG Systems. Plant Physiology Vol. 146: 325-332. Maliga P. 2004. Plastid transformation in higher SODQWV $QQX 5HY 3ODQW %LRO Puchta H. 2003. Marker-free transgenic plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134. 5HJLVWHU - $SSURDFKHV WR HYDOXDWLQJ WKH transgenic status of transformed plants. TiBTech, 15:141-6. 6PDOO , 51$L IRU UHYHDOLQJ DQG HQJLQHHULQJ plant gene functions. Current Opinion in Biotechnology 18:148-153.
II. CAPTULO 7 Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos.
&HFLOLD 9D]TXH] 5RYHUH $ULHO %D]]LQL &HFLOLD 5RGUtJXH] 1DWDOLD $OPDVLD \ Sebastin Asurmendi El progreso de las disciplinas genmicas ha generado una rpida acumulacin de informacin biolgica relacionada a la estructura de los genomas, su organizacin, su composicin en nmero de genes, su grado de homologa y sus relaciones evolutivas. Esta informacin puede ser aprovechada para el anlisis funcional de genes promoviendo un gran avance en GLIHUHQWHV DVSHFWRV FRPR HO WRVDQLWDULR R HO de respuestas a estreses ambientales, entre otros. Para el estudio de la funcionalidad de genes candidatos existen diversas estrategias. La ms antigua (no por eso menos efectiva o utilizada) consiste bsicamente en sobre-expresar un gen, es decir aumentar la expresin del gen de inters a niveles tan altos que su funcin o actividad puede aumentar y as ser medible u observable mediante tcnicas moleculares o simplemente fenotpicamente. Por ejemplo, la sobreexpresin de genes del metabolismo puede producir un aumento importante en el crecimiento de una planta. La segunda estrategia es antagnica a la primera y consiste es disminuir los niveles de expresin del gen en estudio. Esta reduccin (total o par-
cial) puede tambin mostrar cambios visibles o medibles, los cuales permiten evidenciar la actividad del gen. Por ejemplo si uno reduce la expresin de un gen involucrado en la sntesis de pigmentos, dicha planta puede presentar una disminucin en la coloracin de sus hojas. Esta disminucin depender del grado de reduccin en la expresin del gen, pudiendo presentar desde pequeas manchas amarillentas o hasta la falta total de coloracin foliar (Figura 1). Este captulo considerar nicamente esta segunda estrategia de reduccin de la expresin gnica mediada por el mecanismo denominado silenciamiento gnico. Los mtodos basados en el silenciamiento gnico presentan varias ventajas respecto a otros empleados en el campo de la genmica funcional. Una de ellas es la posibilidad de silenciar varios o todos los miembros de una familia multignica simultneamente. Esto es altamente relevante cuando se realizan estudios de genmica en organismos poliploides, como por ejemplo en el caso del trigo en el cual existe una gran redundancia gentica (Travella y col., 2006). Otra de las ventajas es que permite obtener distintos grados de silenciamiento del gen (dbil, intermedio y fuerte) siendo til para el anlisis de fenotipos asociados a genes cuya disminucin total resultara letal. Finalmente, tambin se puede mencionar la capacidad de generar un VLOHQFLDPLHQWR HFLHQWH D SDUWLU GH VHFXHQFLDV de pequeo tamao permitiendo el estudio de genes cuya secuencia completa se desconoce (Lu y col., 2003). Actualmente existen diversas metodologas basadas en el silenciamiento gnico. Algunas de las mismas requieren de la generacin de
Figura 1. Foto mostrando el blanqueo del tejido de plantas en las cuales se silenci el gen PDS en las especies Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum respectivamente de izquierda a derecha
plantas transgnicas portadoras de una construccin capaz de silenciar al gen candidato, mientras que en otras el silenciamiento se desencadena a partir de la replicacin de un virus que porta en su genoma un fragmento del gen a silenciar. Dependiendo del problema especFR D UHVROYHU VH GHEHUi FRQVLGHUDU OD WHFQRloga disponible ms adecuada. Es importante destacar que no todas las herramientas moleculares pueden utilizarse en todas las especies, es decir que en la eleccin de la metodologa deber tenerse en cuenta la especie con la que se est trabajando. Una de las metas GH OD FLHQFLD DFWXDO HV PDVLFDU HVWDV WpFQLFDV es decir que independientemente del organismo (girasol, papa, hongo, etc.) uno pueda optar por una variedad de tcnicas moleculares para solucionar el problema planteado de la forma ms adecuada. Asimismo, es importante mencionar que el silenciamiento gnico es un mecanismo ampliamente distribuido en los procesos naturales de los seres vivos. Todos los organismos regulan la expresin de sus genes dependiendo de su informacin gnica, del ambiente y del estado de desarrollo, y en los organismos superiores una de las formas de regular negativamente (disminuir) la expresin de sus genes es mediante el silenciamiento. En los ltimos 15 aos el estudio de este mecanismo natural, ha permitido utilizarlo de forPD GLULJLGD D Q GH GLVPLQXLU OD H[SUHVLyQ GH genes endgenos a eleccin. En este captulo se introducirn los conceptos bsicos del mecanismo de silenciamiento y se desarrollarn las distintas metodologas ms frecuentemente empleadas en la actualidad para determinar la funcin de los genes y/o analizar su diversidad funcional. 1. Silenciamiento gnico El silenciamiento gnico hace referencia a diversos procesos que producen la reduccin VHFXHQFLDHVSHFtFD GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD y en los cuales la molcula involucrada es el 51$ /DV PROpFXODV GH 51$ TXH SDUWLFLSDQ del silenciamiento gnico presentan un rango de tamao de 20 a 30 bases nucleotdicas por OR TXH VH ODV GHQRPLQD VPDOO 51$V V51$V SRU VX VLJODV HQ LQJOpV R ELHQ VLOHQFLQJ 51$V debido a su participacin en este fenmeno
%DXOFRPEH \ 2VVRZVNL \ FRO 'LVWLQWDV FODVHV GH V51$V KDQ VLGR GHVFULSWDV dado que se originan por diferentes vas y que poseen funciones celulares diversas (ver tabla 1). A pesar de estas diferencias, los procesos de silenciamiento comparten numerosas etapas en comn. En todos los casos al inicio se SURGXFH OD IRUPDFLyQ GH XQD PROpFXOD GH 51$ GREOH FDGHQD GV51$ OD FXDO HV HVSHFtFDmente clivada por una enzima perteneciente a OD IDPLOLD GH ODV 51DVDV WLSR ,,, VLPLODU D 'LFHU '&/ SRU VX VLJODV HQ LQJOpV )LUH \ FRO la cual genera fragmentos de 21 a 25 nucletidos de ambas polaridades (Baulcombe y col., 2004 y Dorokhov y col., 2007). Las dos cadenas de los fragmentos resultantes son luego separadas presumiblemente por una helicasa y una de las cadenas, denominada hebra gua, es incorporada al complejo enzimtico endJHQR 5,6& SRU VXV VLJODV HQ LQJOHV 51$LQduced silencing complex) el cual es capaz de producir el silenciamiento de aquellos genes que presenten homologa con la secuencia de dicha cadena incorporada. Dentro de este mecanismo general pueden existir variaciones a QLYHO GH OD IRUPDFLyQ GHO GV51$ GH OD FODVH GH '&/ LQYROXFUDGD HQ HO FOLYDMH GHO 51$ \ GH ODV PROpFXODV HIHFWRUDV TXH UHFOXWDQ D ORV V51$V para luego ejercer su accin. Dicha accin pueGH VHU OD PRGLFDFLyQ GHO QLYHO GH PHWLODFLyQ de las secuencias regulatorias del gen blanco, OD GHJUDGDFLyQ GHO 51$ PHQVDMHUR P51$ R ELHQ OD UHGXFFLyQ HVSHFtFD GH VX WUDGXFFLyQ En consecuencia, el silenciamiento gnico es un mecanismo regulatorio que puede actuar en distintos niveles: transcripcional (denominado silenciamiento transcripcional, TGS), post-transcripcional (silenciamiento post-transcripcional, PTGS) y traduccional (Chapman y Carrington, 2007). A continuacin se explicarn brevemente los mecanismos de silenciamiento mencionados: 1.1 Silenciamiento transcripcional En el silenciamiento transcripcional, su accin est dirigida hacia las secuencias regulatorias y como consecuencia el gen ro abajo de dicha regin deja de transcribirse. En este SURFHVR ORV V51$V GLULJHQ PRGLFDFLRQHV HQ HO '1$ R HQ ODV SURWHtQDV DVRFLDGDV D pO SRU
Clase* miRNA
Descripcin Micro RNAs
Biognesis y origen genmico Transcriptos de genes miRNAs forman estructuras secundarias de RNA doble cadena que son procesados por Dicer o por RNAsas tipo III Procesamiento de RNA doble cadena o de estructuras secundarias Por miembros de la familia Dicer Se forman por la actividad de RNA polimerasas RNA dependientes, las cuales generan RNAs doble cadena Transcriptos de genes TAS son clivados por un mecanismo dependiente de miRNAs, luego son convertidos en RNA doble cadena por RdRP, seguido del procesamiento por Dicer Pares de transcriptos sense y antisense son procesados por Dicer
Funcin Regulacin post transcripcional de los transcrip tos de un amplio rango de genes
siRNAs primarios
sRNAs pequeos interferentes
siRNAs sRNAs secundarios pequeos interferentes
tasi RNAs (Trans acting siRNAs)
sRNAs que acta en trans
Unin a RNAs targets complementarios, gua para la iniciacin de siRNas secundarios Regulacin post transcripcional de los transcriptos, formacin y mantenimiento de la heterocromatina. Regulacin post transcripcional de los transcriptos.
natsi RNAs ( natural antisense transcriptderived siRNAs)
siRNAs derivados de transcriptos antisentidos naturales
RNAs que piRNAs ( Piwi - interaccionan con Piwi interacting siRNAs)
El mecanismo de biognesis no se conoce completamente, sera dependiente de argonauta e independiente de Dicer
Regulacin post transcripcional de la expresin de g enes involucrados en mecanismos de defensa y respuesta a stress Supresin de transposones y retroelementos en lneas germinales de moscas y de mamferos.
Tabla 1. &ODVHV GH V51$V \ VX IXQFLyQ VH KDQ PDQWHQLGRV ODV VLJODV HQ LQJOpV 5G53 VLJOD HQ ,QJOpV SDUD 51$ SROLPHUDVD 51$ GHSHQGLHQWH 7DEOD DGDSWDGD GH &DUULQJWRQ \ FRO
ejemplo produciendo la metilacin de los reVLGXRV GH FLWRVLQD GH '1$ \ OD FRQVHFXHQWH PRGLFDFLyQ GH OD FURPDWLQD 6LQ HPEDUJR OD metilacin per-s QR HV VXFLHQWH HQ WRGRV ORV casos para el establecimiento del silenciamiento. A modo de ejemplo puede citarse la existencia de mutantes de los genes sil1 y mom1, para los cuales se ha reportado la prdida del TGS a pesar de que las secuencias se encuentran metiladas (Furner y col., 1998 y Amedeo
y col., 2000). Vaucheret y sus colaboradores propusieron al silenciamiento transcripcional como un sistema de control de la expresin gnica de transposones y accidentalmente de transgenes con caractersticas similares a ellos (2001). 1.2 Silenciamiento post-transcripcional El silenciamiento gnico post-transcripcional (PTGS) es un mecanismo inducible y espec-
FR HQ HO FXDO OD PROpFXOD EODQFR HV HO 51$ mensajero. Se ha propuesto que el PTGS evolucion como un sistema de defensa antiviral en plantas dado que restringe la acumulacin o la diseminacin de los virus dentro de las mismas (Vance y Vaucheret 2001; Dunoyer y col., 2004). Como se mencionara previamente el PTGS se desencadena contra una molcula GH 51$ PHGLDGR SRU OD KRPRORJtD GH VHFXHQFLD GHO V51$ SXGLHQGR UHFRQRFHU WDQWR XQ 51$ GHO SURSLR LQGLYLGXR FRPR HO GH XQ RUJDnismo patgeno, por ejemplo un virus. CuanGR VH SURGXFH HO UHFRQRFLPLHQWR GHO 51$ YLUDO durante la infeccin se produce la degradacin del mismo que con lleva al fracaso de la infeccin. Este mecanismo es tambin responsable del fenmeno de co-supresin de genes endgenos, del silenciamiento de los transge-
nes y recientemente tambin se lo ha ligado a procesos de regulacin de genes endgenos. Si bien se describi por primera vez en plantas, ha sido reportado en hongos (donde se denomina quelling), y en sistemas animales como nematodos, insectos o mamferos (donde se lo denomina interferencia mediada por 51$ R 51$L (Q SODQWDV HO 37*6 HV GHVHQFDGHQDGR HFLHQWHPHQWH SRU LQWHUPHGLDULRV GH GV51$ TXH SXHGHQ WHQHU VX RULJHQ HQ WUDQVgenes nucleares cuyos transcriptos forman naturalmente estructuras tipo horquilla o hairpin KS51$L JHQHV TXH VH H[SUHVDQ HQ DOWRV QLveles, transcriptos aberrantes que pueden ser UHFRQRFLGDV FRPR GV51$ R HVWUXFWXUDV GH GV51$ TXH VH JHQHUHQ GXUDQWH OD UHSOLFDFLyQ de un virus. Cualquiera sea su origen, una vez IRUPDGDV ODV HVWUXFWXUDV GH GV51$ ODV PLVmas son reconocidas por una enzima 51DVD '&/ \ SURFHVDGDV GDQGR OXJDU D VL51$V GH D SE (VWRV VL51$V VH DVRFLDQ DO FRPSOHMR 5,6& HO FXDO HV FDSD] GH GHJUDGDU HVSHFtFDPHQWH WRGR DTXHO 51$ TXH FRPSDUWD KRPRORga con la secuencia que desencaden el proceso y tambin pueden ser utilizados como templado por las polimerasas FHOXODUHV GHSHQGLHQWHV GH 51$ 5G5SV para sintetizar la segunda hebra del gen D VLOHQFLDU DPSOLFDQGR GH HVWD IRUPD OD seal de silenciamiento (Figura 2). $PSOLFDFLyQ \ PRYLPLHQWR GHO PTGS Una de las caractersticas del mecanismo de silenciamiento en plantas es la capacidad de ser sistmico, es decir de poder propagar a toda la planta la reduccin del gen el cual resultara inicialmente disminuido en un nico tejido. Por ello se ha propuesto la existencia de una seal de silenciamiento capaz de moverse a travs del organismo propagando el mismo. Estas vas de moviPLHQWR GH OD VHxDO VH FODVLFDQ VHJ~Q la distancia que alcancen. As, en la va de movimiento de corta distancia los VL51$V JHQHUDGRV HQ XQD FpOXOD VRQ capaces de migrar directamente a clulas adyacentes a travs de los plasmo-
Figura 2. Esquema del silenciamiento gnico inducido por virus, por sobre expresin de transgn o expresin de secuencias duplicadas invertidas. Se detalla como el 51$ HV SURFHVDGR HQ VL51$ GH SE )LJXUD DGDStada de Voinnet 2001)
desmos (conexiones directas entre clulas) y establecer en estas ltimas el silenciamiento. Una vez que en la clula adyacente es degraGDGR HO P51$ KRPyORJR DO VL51$ VH JHQHUDQ QXHYRV VL51$V DPSOLFDQGR DVt OD VHxDO TXH se trasladar por toda la planta. Se ha reportaGR DVLPLVPR TXH HVWD DPSOLFDFLyQ VH JHQHUD D SDUWLU GH OD VtQWHVLV GH GV51$ PHGLDGD SRU XQD 51$ SROLPHUDVD 51$ GHSHQGLHQWH 5G5S (Baulcombe, 2004). En la va de movimiento de larga distancia la seal se traslada a travs GHO RHPD SHUPLWLHQGR HO PRYLPLHQWR D SDUWHV muy distantes del lugar de origen. Esto fue demostrado mediante experimentos que emplean injertos en los que plantas silenciadas para un dado transgen son capaces de producir el silenciamiento de ese transgen en plantas no silenciadas. Si bien an no se conoce cul es la seal de silenciamiento de larga distancia, es muy probable que sea distinta de la seal que migra de clula en clula debido a que los dos procesos pueden ser separados farmacolgica o genticamente (Dunoyer y Voinnet 2008). La dispersin del silenciamiento tiene una gran importancia principalmente en la defensa frente a virus, ya que a partir del sitio inicial de infeccin, donde se indujo el silenciamiento, se produce una seal que genera la defensa antiviral en los tejidos adyacentes que de resultar previa a la llegada del virus limitar la propagacin del mismo al resto de la planta. 1.3 Regulacin gnica por microRNAs Como hemos mencionado, el silenciamiento es un mecanismo natural por el cual se regula la expresin de genes. En particular, los PLFUR51$V PL51$V VRQ XQ WLSR HVSHFtFR GH PROpFXODV GH 51$ de bajo peso molecular (21 pb) que FRQWURODQ OD DFXPXODFLyQ GH P51$ HQGyJHQRV DO UHJXODU QDPHQWH OD expresin de diferentes genes. A diIHUHQFLD GH ORV VL51$V ORV PL51$V
VRQ FRGLFDGRV SRU JHQHV HQGyJHQRV SRU OR WDQWR GLHUHQ HQ VX ELRJpQHVLV /RV PL51$V son genes endgenos completos, con la niFD SDUWLFXODULGDG GH TXH QR FRGLFDQ SDUD QLQJXQD SURWHtQD VLQR TXH VX 51$ PHQVDMHUR HV procesado generando una pequea molcula GH SE DSUR[LPDGDPHQWH /RV PL51$V KDQ sido descriptos slo en organismos eucariontes, desde plantas a humanos (Bartel 2004). 5HVXPLGDPHQWH ORV PL51$V VH RULJLQDQ D partir de transcriptos que se pliegan sobre s mismos dando lugar a una estructura preFXUVRUD GH 51$ GREOH FDGHQD GHQRPLQDGDV SUHPL51$V ODV FXDOHV VRQ SURFHVDGRV GH manera que se produce una nica cadena de PL51$ GH SHTXHxR WDPDxR QW PLHQtras que la cadena complementaria, denominaGD PL51$ HV GHJUDGDGD (Q OD )LJXUD $ VH muestran ejemplos de estructuras secundarias
Estructura del Construccin gentica transcripto de RNA
% PTGS
7 Gen candidato en sentido
27
Gen candidato en antisentid o
25
hpRNA (brazos de gen candidato, gen GUS como secuencia espaciadora)
58
43
hpRNA (brazos de gen candidato, intrn en antisentido como secuencia espaciadora)
65
34
hpRNA (brazos de gen candidato, intrn en sentido como secuencia espaciadora)
96
23
Figura 3. A) Se representan las tpicas estructuras de rulo R VWHPORRS GH ORV PL51$V PL5 GH $UDELGRSVLV \ VXV homlogos de Oryza y Populus. El segmento correspondienWH DO PL51$ PDGXUR VH PXHVWUD HQ FRORU URMR DGDSWDGR GH -RQHV5KRDGHV \ FRO B) (VTXHPD GHO SUHPL5D GH $UDELGRSVLV \ HO SUHPL5*)3 VLQWpWLFR (Q URMR VH HQFXHQWUD HO PL5 PDGXUR \ HQ YHUGH OD SRUFLyQ UHHPSOD]DGD SDUD JHQHUDU HO PL5 DUWLFLDO PL5*)3 PDGXUR 6H PXHVtra la energa libre ('G) y la entalpa ('U) del ensamblado.
GH ORV PL51$V 8QD YH] TXH HO WUDQVFULSWR GHO PL51$ HV SURFHVDGR \ HO PL51$ PDGXUR UHVXOWDQWH HV LQFRUSRUDGR DO FRPSOHMR 5,6& HO FXDO DO GLULJLUVH FRQWUD HO P51$ EODQFR UHSULPH su expresin gnica ya sea mediante degraGDFLyQ HVSHFtFD R LQKLELFLyQ GH OD WUDGXFFLyQ En las plantas el proceso de degradacin es el ms comn, mientras que en el reino animal la inhibicin de la traduccin es el proceso ms frecuente. (Hutvagner y Zamore, 2002; Doench y col. 2003; Zeng y col. 2003). Estas pequeas molculas son extraordinariamente importantes en la regulacin o modulacin de los proFHVRV FHOXODUHV XQ VROR PL51$ SXHGH UHJXODU la expresin muchos genes por lo tanto incidir en la regulacin de mltiples procesos ya que muchos de los genes blancos son factores de trascripcin, porejemplo la alteracin de la exSUHVLyQ GH XQ ~QLFR PL51$ HQ SODQWDV SXHGH cambiar totalmente el fenotipo de la misma. 2. Mtodos que emplean el mecanismo de silenciamiento para disminuir la expresin gnica en plantas Varios mtodos han sido desarrollados para disminuir la expresin de un gen en estudio
basados en el mecanismo de silenciamiento gnico. Entre los mismos se encuentra el uso de molculas antisentido, de molculas con HVWUXFWXUD GH KRUTXLOOD KS51$L GH PL51$6 DUWLFLDOPHQWH GLVHxDGRV \ HO VLOHQFLDPLHQWR gnico inducido por virus (ver Tabla 2). A continuacin se exponen algunos de los mtodos ms usados en la actualidad para lograr establecer el silenciamiento gnico. Cada uno de estos mtodos presenta ventajas y desventajas que determinan que sean ms o menos aptos para el estudio particular del gen asilenciar y en la especie que se desea emplear, con lo que resulta de suma importancia evaluarlas antes de elegir la metodologa. Estas metodologas pueden a su vez agruparse en dos categoras principales de acuerdo a que involucren la produccin de plantas transgnicas o no. Siendo sta una metodologa un tanto lenta y laboriosa. 2.1 Metodologas para el anlisis de genes candidatos que implican transgnesis. La transformacin estable con construcciones capaces de inducir el silenciamiento de un gen candidato es quiz la aproximacin ms
Tabla 2: Mtodos basados en el mecanismo de silenciamiento gnico, para disminuir la expresin de un gen.
Construccin empleada miRNAs artificiales
Antisentido
HpRNAi
VIGS
Requerimiento de transgnesis para obtener un silenciamiento sistmico
Si
Si
Si
No
Construccin empleada
gen blanco
gen blanco
gen blanco
miRNAs
Genoma viral
gen blanco
Origen de dsRNAs que luego son procesados por DCL.
Formacin de dsRNA por apareamiento del transcripto sentido y del antisentido.
Formacin de dsRNA por apareamiento del transcripto sentido y del antisentido.
Explota a los precursores de miRNAs endgenos para generar sRNAs.
Los dsRNAs se forman durante la replicacin viral o bien por estructuras secundarias que adquiere el virus.
ODUJRV IUDJPHQWRV GH GV51$ TXH VRQ HFLHQWHV SUHFXUVRUHV GH VL51$V \ HQ FRQVHFXHQFLD GHO VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR &KXDQJ \ 0H\HURZLW] :HVOH\ \ FRO /D XWLOL]DFLyQ GH esta estrategia requiere un estudio minucioso de la variabilidad de secuencia del gen que se quiere silenciar, por ejemplo si ste forma parte de una familia gnica se debe considerar si desea disminuir la expresin de slo un miembro de la misma o, por el contrario, silenciar a todos los miembros de la familia. Es decir que es muy importante la eleccin de la secuencia que se va a utilizar en la construccin ya que sta 2.1.1 Silenciamiento mediante molculas debe ser muy conservada, de un tamao no menor a 100 pb y no debe presentar homologa con estructura de horquilla Un desarrollo reciente y efectivo para desen- con secuencias de genes que no se desean sicadenar silenciamiento gnico en plantas es el lenciar. Una vez elegida la secuencia, sta se uso de largos precursores que formen estruc- coloca en sentido y en antisentido de manera turas de horquilla, es decir molculas de do- TXH OD GV51$ VH IRUPH IiFLOPHQWH 9HU WDEOD EOH FDGHQD GH 51$ GV51$ 3DUD HOOR VH KDQ 2). Mediante trabajos sistemticos en los que diseado y utilizado construcciones genticas se estudian las caractersticas de las distintas con secuencias repetidas e invertidas del gen construcciones capaces de desencadenar el a silenciar y que al ser transcriptas dan lugar a silenciamiento se ha demostrado que aquellas construcciones que llevan repeticiones invertidas de un fragmento del gen candidato, separadas a su vez por un pequeo Estructura del % Construccin gentica transcripto de RNA PTGS n LQWUyQ VRQ ODV PiV HFLHQWH YHU 7DEOD :HVOH\ \ FRO Esta estrategia ha sido amplia7 27 mente probada en distintas esGen candidato en sentido pecies de plantas tanto dicotiledneas como monocotiledneas y a tal punto que actualmente Gen candidato 4 25 existen plsmidos genricos disen antisentid o ponibles para la generacin de diversas plantas transgnicas hpRNA (brazos de gen KWWSZZZSLFVLURDXUQDL candidato, gen GUS como 58 43 simple y antigua del uso de silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes. Si bien estos mtodos tienen la desventaja de requerir la produccin de plantas transgnicas, la obtencin de las mismas permite que el silenciamiento sea estable siendo incluso posible LGHQWLFDU OtQHDV WUDQVIRUPDQWHV FRQ GLIHUHQWHV niveles de expresin del gen en estudio. Ms D~Q HO XVR GH SURPRWRUHV HVSHFtFRV \R LQGXcibles permiten el estudio de genes cuya disminucin total sera letal en etapas tempranas del desarrollo vegetal.
secuencia espaciadora)
hpRNA (brazos de gen candidato, intrn en antisentido como secuencia espaciadora)
65
34
hpRNA (brazos de gen candidato, intrn en sentido como secuencia espaciadora)
96
23
Tabla 3. (YDOXDFLyQ GH OD HFDFLD GH ODV HVWUXFWXUDV GLVSDUDGRUDV GHO VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR $GDSWDGR GH :HVOH\ \ FRO
2.1.2 Silenciamiento mediante PL51$ DUWLFLDO 8Q PL51$ VLQWpWLFR R DUWLFLDO HV XQ SUHPL51$ DO FXDO VH le permutaron las 21-22 pb del PL51$ PDGXUR \ GHO PL51$ por otras del gen de inters pero manteniendo las caractersticas estructurales lo ms parecidas posibles al original. En estas construcciones es muy impor-
tante realizar un estudio de la energa libre y GH OD HQWDOStD GHO SUHPL51$ VLQWpWLFR \D TXH determinarn la estructura y en consecuencia el reconocimiento de la maquinaria del proceVDPLHQWR 'H HVWD PDQHUD HO PL51$ VLQWpWLco es capaz de reconocer y controlar al gen blanco que se desea silenciar. Utilizando esta estrategia se han reportado el control de transgenes (Parizotto y col. 2004), de genes endgenos que originalmente no eran blancos de PL51$V 6FKZDE \ FRO H LQFOXVR VH KD ORJUDGR FRQIHULU UHVLVWHQFLD D YLUXV 1LX \ FRO 2006) (Ver captulo sobre obtencin de plantas resistentes a virus). En particular nuestro gruSR GH WUDEDMR KD GLVHxDGR XQ YHFWRU GH PL51$ DUWLFLDO EDVDGR HQ OD HVWUXFWXUD GHO PL5D de Arabidopsis thaliana (Figura 3B) logrando controlar la expresin del gen reportero GFP en Nicotiana benthamiana (Fig 4). Si bien esta estrategia requiere de construcciones genticas ms complejas, posee una
gran ventaja frente al silenciamiento clsico ya que minimiza los riesgos de reduccin de la expresin de genes no deseados al emplear solamente 21 pb. Asimismo, si se desea silenciar un gen nico dentro de una familia de varios JHQHV PX\ VLPLODUHV OD XWLOL]DFLyQ GH PL51$V DUWLFLDOHV HV PiV DGHFXDGD TXH OD WpFQLFD GH silenciamiento por horquilla ya que es ms fcil KDOODU SE HVSHFtFDV TXH JUDQGHV SRUFLRQHV (mayores a 100 pb) de secuencias nicas. Para alcanzar mayores niveles de silenciamiento con esta tcnica se puede recurrir a tndems GH PL51$V DUWLFLDOHV GH GLIHUHQWHV SRUFLRQHV de la secuencia blanco del gen a silenciar, aunque esto aumenta la complejidad de las consWUXFFLRQHV JHQpWLFDV QHFHVDULDV 3DUD QDOL]DU OD XWLOL]DFLyQ GH PL51$ DUWLFLDOHV HQ SODQWDV cultivadas es compatible con su uso a bajas temperatura (menor a 15C), mientras que el PTGS por horquilla podra resultar inhibido a estas temperaturas.
Figura 4. (A) y (B) Hoja de N. benthamiana DJURLQOWUDGD FRQ GLVWLQWDV FRPELQDFLRQHV GH *)3 R GV*)3 +F3UR 3 \ PL5*)3 PLFUR DUWLFLDO REVHUYDGD EDMR OX] 89 & 1RUWKHUQ EORW GH 51$ WRWDO H[WUDtGR GH ODV ]RQDV LQOWUDGDV XWLOL]DQGR XQD VRQGD TXH UHFRQRFH DO P51$ GH *)3 ' 'HWHFFLyQ GHO PL5*)3 HQ JHO GH SROLDFULODPLGD GH PDWHULDO H[WUDtGR GH ODV ]RQDV LQOWUDGDV 3 YHFWRU YDFtR
2.2 Determinacin de la actividad de vectores aptos para el silenciamiento de forma WUDQVLWRULD YtD DJURLQOWUDFLyQ Dado que obtener plantas transgnicas es XQD ODERU GLFXOWRVD \ GH ODUJD GXUDFLyQ VH pueden realizar aproximaciones tiles previas al desarrollo de las mismas. As, para analizar OD HFDFLD GH XQD KRUTXLOOD GH VLOHQFLDPLHQWR R HO FRUUHFWR SURFHVDPLHQWR GH XQ PL51$ DUWLFLDO VH SXHGH UHDOL]DU XQ WHVW GH VLOHQFLDmiento local utilizando Agrobacterium tumefaciens. Esta tcnica consiste en realizar coDJURQOWUDFLRQHV JHQHUDOPHQWH GH KRMDV GH N. benthamiana con diferentes agrobacterias transformadas; una conteniendo un plsmido expresando el gen blanco y otra conteniendo el plsmido silenciador a evaluar, es decir la misma secuencia blanco (o parte de la misma) reSHWLGD H LQYHUWLGD R HO PL51$ DUWLFLDO 8QD YH] transcurrido el tiempo necesario para el establecimiento del silenciamiento se analizan, por HMHPSOR PHGLDQWH OD WpFQLFD GH 1RUWKHUQ EORW los indicadores del silenciamiento en la zona DJURLQOWUDGD 'LFKRV LQGLFDGRUHV VRQ HQ SULmer lugar una reduccin en el nivel de acumulacin esperado del gen blanco y en segundo OXJDU OD DSDULFLyQ GH V51$V KRPyORJRV DO JHQ blanco. En la Figura 4B se muestra un tpico enVD\R GH LQGXFFLyQ GH 37*6 PHGLDQWH DJURLQOtraciones de hojas de N. benthamiana utilizando como gen blanco el reportero GFP y como plsmidos silenciadores una construccin con estructura de horquilla que posee la secuencia de GFP en sentido y antisentido separada por un intrn (dsGFP) o bien una construccin TXH H[SUHVD HO PL51$ DUWLFLDO TXH SRVHH SE GH OD VHFXHQFLD GH *)3 PL5*)3 3DUD mayor informacin acerca de la realizacin de experimentos de silenciamiento empleando la WpFQLFD GH DJURLQOWUDFLyQ VH SXHGH FRQVXOWDU el trabajo de Bazzini y col. (2007). KWWSZZZ
scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717 OQJ HV QUP LVR! ,661 0717-3458
2.3 Metodologa para el anlisis de genes candidatos que no requiere transgnesis: silenciamiento gnico inducido por virus (VIGS). El trmino VIGS (silenciamiento gnico indu-
cido por virus, por su sigla en ingls) se aplica a la tcnica que emplea virus recombinantes a Q GH GLVPLQXLU OD H[SUHVLyQ JpQLFD GH XQ JHQ endgeno. La construccin de vectores virales que portan en su genoma insertos derivados de secuencias gnicas vegetales permite silenFLDU HVSHFtFDPHQWH OD VHFXHQFLD HQGyJHQD homloga al inserto introducido en el vector viral. VIGS es una metodologa que no requiere de transgnesis por lo tanto es rpida y verstil, siendo ideal para estudios a gran escala. En los ltimos aos ha ido adquiriendo una gran relevancia debido a la necesidad de analizar la abundante informacin surgida de los proyectos genmicos. Sin embargo, su mayor desventaja radica en que el nivel de silenciamiento es variable y que depende mucho de la especie a utilizar. Brevemente, la metodologa de VIGS consiste en el clonado del gen candidato en un vector viral, la incorporacin de este ltimo en Agrobacterium \ QDOPHQWH HQ OD LQRFXODFLyQ de plantas con el cultivo bacteriano para lo cual existen diversos mtodos Uno de los mtodos PD\RUPHQWH HPSOHDGRV HV OD DJURLQOWUDFLyQ que consiste en inyectar mediante una jeringa sin aguja la solucin de Agrobacterium en la cara abaxial de la hojas de una planta. Otro de los mtodos es el denominado agrodrench que consiste en regar la planta a la altura del tallo con la solucin deseada 5\X \ FRO 2004). Tras la agroinoculacin de las plantas los vectores virales son incorporados a las clulas vegetales donde forman nuevos genomas virales causando la infeccin sistmica de la planta. En cada una de las clulas infectadas se produce la replicacin viral induciendo el VLOHQFLDPLHQWR GHO JHQ FDQGLGDWR 5XL] \ FRO 1998; Liu y col., 2002). Existen varios vectores virales desarrollados para VIGS (que se resumen en la tabla 4), sin embargo el sistema de 9,*6 EDVDGR HQ HO YLUXV 759 HV XQD GH ORV ms utilizados en la actualidad ya que presenta ciertas ventajas frente a otros vectores virales. Este virus ocasiona un nivel menor de sntomas en las plantas, puede infectar meristemas \ WLHQH XQ DPSOLR UDQJR GH KRVSHGDQWHV 759 HV XQ YLUXV GH 51$ GH SRODULGDG SRVLWLYD FRQ XQ JHQRPD ELSDUWLWR 8QR GH HVRV 51$V JHQRPLFDV IXH PRGLFDGR GH PRGR GH HOLPLQDU
Tabla 4: Vectores virales para su uso en VIGS .Tabla adaptada de Godge y col., 2008.
Virus Gnero Hospedantes naturales importantes Nicotiana tabacum Probado en Genes silenciados PDS, PSY Referencias
Tobacco Mosaic Virus Tobacco Rattle virus
Tobamovirus
Tobravirus
Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum Amplio rango N. benthamiana, de hospedantes Arabidopsis, Tomate, especies de Solanum, pimiento Solanum tuberosum Brassicca Campestris Trigo, cebada, maz N. bentahmiana, Solanum tuberosum Trigo, cebada
Kumagai et al (1995)
Potato Virus X
Potexvirus
Varios genes PDS, PSY, GFP, EDS, RAR, NPR1 PDS, GFP
Liu et al (2002b) Ratcliff et al (2001)
Ruiz et al (1998)
Barley stripe mosaic virus Tomato goleen mosaic virus
Hordeivirus
PDS
Holzberg et al (2002) Scofield et la ( 2005) Peele et al (2001)
Begomovirus
Lycopersicum sculetum
N. benthamiana
Su(Sulfur gene)
las protenas no esenciales e incorporar un sitio mltiple de clonado en donde se puede introducir el fragmento del gen candidato que se desea silenciar, dejando las regiones no traduFLEOHV \ OD UHJLyQ FRGLFDQWH GH OD SURWHtQD GH la cpside intactas. Posteriormente este vector fue mejorado por el grupo del Dr. Dinesh Kumar mediante la incorporacin del promotor 35S duplicado el cual incrementa la transcripcin, del terminador de la nopalina sintetasa y de la secuencia de una ribozima que permite VLPXODU HO QDO GHO JHQRPD YLUDO GH IRUPD ms adecuada (Liu y col., 2002). As, la base del silenciamiento inducido por virus puede explicarse fundamentalmente mediante el mecanismo de PTGS. Estudios realizados en N. benthamiana empleando un transgn de la protena reportera GFP muestran que el mecanismo de VIGS puede ser separado en
dos etapas, una de iniciacin y otra de mantenimiento. La primera sera absolutamente dependiente de la presencia del virus, siendo los genes blancos silenciados slo si la planta es infectada por el virus. Mientras que la segunda HWDSD VHUtD LQGHSHQGLHQWH GHO PLVPR 5XL] \ col., 1998, Jones y col., 1999). &RQVLGHUDFLRQHV QDOHV A lo largo de este captulo se describieron algunas de las metodologas empleadas frecuentemente para estudios de gentica reversa basados en el silenciamiento gnico. Como se mencion al inicio del captulo el empleo de estas metodologas presenta ciertas ventajas respecto a otras, sin embargo una de las consideraciones que hay que tener en cuenta al usar los mtodos basado en silenciamiento gQLFR HV OD HVSHFLFLGDG GHO PLVPR FRQ HO Q GH
evitar que se altere la expresin de otros genes no deseados. Estudios realizados en Arabidopsis thaliana indican que al emplear como inserto la regin completa de un gen se alteran aproximadamente la expresin de 4 genes no deseados (Ping Xu y col., 2006). En el ltimo tiempo han surgido varios trabajos en donde se proponen distintos modos de controlar y/o disminuir estos efectos no deseados, entre ellos se encuentran el uso de programas bioinformticos que permiten analizar cul es la mejor regin a emplear de modo de obtener un VLOHQFLDPLHQWR OR PiV HVSHFtFR SRVLEOH 4LX \ col., 2006 y Ping Xu y col., 2006). Sin embargo estas herramientas slo son tiles cuando el genoma del organismo ha sido completamente secuenciado o bien si al menos se dispone de gran parte de su secuencia. Por otro lado tambin se ha desarrollado una estrategia experimental para validar la informacin obtenida OD FXDO HPSOHD JHQHV VLQWpWLFRV TXH FRGLFDQ para el gen candidato, pero que no resultan EODQFR GH OD DFFLyQ GH VL51$V GH HVWH PRGR VL el gen silenciado es el responsable del fenotipo observado, la expresin de los mismos permitira la recuperacin el fenotipo salvaje (Kumar y col., 2006). Brevemente, no hay una tcnica mejor que otra para reducir la expresin gnica, sino que cada una posee sus ventajas y desventajas y queda a merced del investigador elegir la/las ms correcta/s para su sistema, considerando principalmente los tiempos, el costo, la especie a utilizar, las condiciones del ambiente y el grado de reduccin del silenciamiento con el que uno desea trabajar. 8Q PHQVDMH QDO SDUD LQYROXFUDUVH \ OHHU PDV sobre este tema, es que si bien el silenciamiento es un mecanismo de regulacin negativa de la expresin gnicas, se ha tornado uno de los temas ms importantes de las ltimas dcadas en biologa molecular, a tal punto que los descubrimientos iniciales de este mecanismo les SHUPLWLHURQ D ORV FLHQWtFRV 'U $QGUHZ = ),5( \ 'U &UDLJ & 0HOOR REWHQHU HO 3UHPLR 1REHO de Fisiologa o Medicina en el ao 2006. Actualmente se estn desarrollando numerosos estudios en los cuales mediante silenciamiento gnico se logra obtener plantas inmunes a infecciones virales o bacterianas, disminuir la
alergenicidad de vegetales comestibles y estudiar la funcin de los genes. Bibliografa:

$PHGHR 3 +DEX < $IVDU . 0LWWHOVWHQ 6FKHLG 2 3DV]NRZVNL - 'LVUXSWLRQ 2I 7KH 3ODQW *HQH 0RP 5HOHDVHV 7UDQVFULSWLRQDO 6LOHQFLQJ 2I 0HWK\ODWHG *HQHV 1DWXUH 3 %DUWHO '3 0LFUR51$V *HQRPLFV ELRJHQHVLV PHFKDQLVP DQG IXQFWLRQ &HOO %DXOFRPEH '& 51$ 6LOHQFLQJ ,Q 3ODQWV 1DWXUH 3 Bazzini, A.A., Mongelli, V.C., Hopp, H.E., Del Vas, M. And Asurmendi, S. 2007. A Practical Approach 7R 7KH 8QGHUVWDQGLQJ $QG 7HDFKLQJ 2I 5QD 6Llencing In Plants. Electronic Journal Of BioWHFKQRORJ\ H,661 Chapman E. J., Carrington J. C. 2007. SpecializaWLRQ $QG (YROXWLRQ 2I (QGRJHQRXV 6PDOO 5QD 3DWKZD\V 1DW 5HY *HQHW 1RY &KXDQJ &) $QG 0H\HURZLW] ( 0 6SHFLF and heritable genetic interference by doubleVWUDQGHG 51$ LQ $UDELGRSVLV WKDOLDQD 3URF 1DWO Acad. Sci. USA 97, 4985-4990. Doench J.G., Petersen, C.P., And Sharp, P.A. VL51$V FDQ IXQFWLRQ DV PL51$V *HQHV 'HY Dorokhov Iu, L. 2007. Gene Silencing In Plants. Mol Biol (Mosk), 41(4): P. 579-92. Dunoyer P., Lecellier C.H., Parizotto E.A., Himber & 9RLQQHW 2 3URELQJ WKH PLFUR51$ DQG VPDOO LQWHUIHULQJ 51$ SDWKZD\V ZLWK YLUXVHQFRGHG VXSSUHVVRUV RI 51$ VLOHQFLQJ 3ODQW &HOO Dunoyer, P. And O. Voinnet. 2008. Mixing And Matching: The Essence Of Plant Systemic Silencing? Trends Genet, 24(4): P. 151-4. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. And Mello, C. C. 1998. "Potent And 6SHFLF *HQHWLF ,QWHUIHUHQFH %\ 'RXEOH6WUDQGHG 5QD ,Q &DHQRUKDEGLWLV (OHJDQV 1DWXUH9RO 1R 3 Furner, I.J., M.A. Sheikh, And C.E. Collett. 1998. Gene Silencing And Homology-Dependent Gene 6LOHQFLQJ ,Q $UDELGRSVLV *HQHWLF 0RGLHUV $QG Dna Methylation. Genetics, 149(2): P. 651-62. *RGJH 05 3XUND\DVWKD $ 'DVJXSWD , .XPDU PP. 2008. Virus-induced gene silencing for funcWLRQDO DQDO\VLV RI VHOHFWHG JHQHV 3ODQW &HOO 5HS 27(2):209-19. Jones, L. Hamilton A.J, Voinet O, Thomas C.L, 0DXOH $- < %DXOFRPEH '& 5QD'QD Interactions And Dna Methylation In Post-Tran-
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II. CAPTULO 8 Anlisis de Experimentos Biolgicos

6RItD 2OPRV 0LJXHO 'L 5HQ]R 0HUFHGHV ,EDxH] 1pOLGD :LQ]HU 1 La variacin biolgica La variabilidad gentica es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condicin preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento gentico mediante seleccin o hibridacin. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domsticos, como consecuencia de la erosin gentica. La variacin que presentan los individuos de una poblacin puede ser discontinua o continua. Los caracteres cualitativos de variacin discontinua, como los marcadores moleculaUHV SHUPLWHQ FODVLFDU D ORV LQGLYLGXRV VLQ DPbigedades, ya que estos caracteres estn regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestacin fenotpica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la mayora de los caracteres de inters agronmico, presentan variacin continua y los fenotipos, que estn determinados por poligenes y por efectos ambientales, VRQ GLItFLOHV GH FODVLFDU HQ FDWHJRUtDV GLVFUHtas. Para su anlisis deben emplearse mtodos biomtricos, que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosmicos HVSHFtFRV VLQR GH WRGR HO JHQRPD Durante los ltimos aos ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la seleccin de caracteres cuantitativos (MAS, Marker Assisted Selection). La biotecnologa ha colaborado mediante la construccin de mapas genticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar regiones de DFWLYLGDG FXDQWLWDWLYD 47/V 4XDQWLWDWLYH 7UDLW Loci). De esta manera un carcter de variacin
continua puede ser manejado como si se tratara de un carcter de herencia mendeliana mediante la introgresin de un fragmento de FURPRVRPD FRQWHQLHQGR XQ 47/ SRU UHWURFUXzamientos sucesivos en las variedades comerFLDOHV /RV 47/V UHSUHVHQWDQ XQ QXHYR VLVWHma de enfocar el estudio bsico y el manejo prctico de los sistemas polignicos y de la gentica cuantitativa. ([SHULPHQWR FLHQWtFR La ciencia, que tiene como objetivo la explicacin y la prediccin de los hechos, cuenta con el PpWRGR FLHQWtFR como un procedimiento que contempla XQ SURFHVR HQ XMR desde los hechos observados hasta la proposicin de hiptesis explicatorias. Un requisito fundamental en toda ciencia fctica es la contrastacin de las hiptesis planteadas, poniendo a prueba las mismas mediante una confrontacin con la experiencia. El diseo experimental FUHD DUWLFLDOPHQWH ODV FRQGLFLRQHV para la contrastacin de la hiptesis y brinda la metodologa estadstica correspondiente para el anlisis de los datos. El H[SHULPHQWR FLHQWtFR, que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la validez de una hiptesis, se basa en la reproduccin de ciertos fenmenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el efecto TXH SURGXFH OD PRGLFDFLyQ GH XQR R YDULRV factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente. El ensayo, cuidadosamente diseado, deber ser lo ms simple posible, evitando los errores tendenciosos y sistemticos (bias=sesgo) de manera tal que los datos recabados provean conclusiones con un amplio rango de vaOLGH] 3RU RWUD SDUWH SDUD PDJQLFDU HO HIHFWR de los tratamientos y disminuir el error experimental, se procura minimizar el efecto de otros IDFWRUHV QR FRQWURODGRV TXH HMHUFHQ LQXHQFLD en las observaciones. Esto se logra utilizando materiales y condiciones experimentales lo ms homogneas posibles. De esta manera, las variaciones observadas se debern casi exclusivamente a los tratamientos. Para conocer el efecto de los factores controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material experi-
mental es necesario formular claramente una hiptesis, utilizar un diseo experimental apropiado y analizar e interpretar los resultados obtenidos. Por ejemplo, la aplicacin de distintos tratamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante = causa), producen variaciones sobre una caracterstica de inters (ej. rendimiento = efecto):
relacin causal causa:
tratamientos
efecto:
cambios en la variable de inters
(VWR SXHGH JUDFDUVH GH HVWD PDQHUD
variable (rendimiento)
tratamientos (dosis fertilizantes) Y = f (x) rendimiento = f (dosis fertilizante)
Terminologa - Factor: Es la causa cuyo efecto se quiere medir (ej. fertilizante, insecticida, medio de cultivo, genotipo, ambiente) - Nivel: Es cada una de las categoras o alternativas del factor en estudio (ej. dosis de un fertilizante, dosis de insecticida, sales y pH de los medios de cultivo, variedades, diferentes aos y localidades). - Tratamiento: Es cada nivel del factor en estudio. Si se estudia el factor fertilizante, cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se prueba el efecto de concentraciones crecientes de un fertilizante los tratamientos tendran un orden natural (discreto ordinal); pero si se prueban distintas combinaciones de fertilizantes
13. QR KDEUtD XQ RUGHQ HQWUH ORV WUDWDPLHQtos (discreto nominal). Cuando se estudian dos (o ms) factores simultneamente, los distintos tratamientos resultan de la combinacin de cada nivel de un factor con cada nivel del otro factor. Por ejemplo, si se estudia el efecto de fertilizante y competencia, cada tratamiento resulta de la combinacin de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada. - Variable independiente: es la causa que afecta los resultados del experimento y est representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques). - Variable dependiente: variable respuesta o simplemente variable es el carcter de inters (datos u observaciones) cuya variacin SHUPLWH FXDQWLFDU HO HIHFWR GH OD YDULDEOH LQGHpendiente. Ejemplos de variables dependientes: a) rendimiento (kg/ha) y dimetro de colonia (mm): cuantitativas continuas, b) tiempo a panojamiento (das), tamao de camada, nmero de colonias (nmero): cuantitativas discretas, c) marcadores moleculares (presencia/ ausencia): cualitativa binaria, d) grado de respuesta a un estrs o a un patgeno (tolerante, intermedio, susceptible): cualitativa ordinal. - Unidad experimental: es un individuo o grupo de individuos, objetos, porcin de material o terreno (parcela) al que se le asigna un tratamiento experimental y sobre la cual se observa una respuesta. - Repeticin: es el nmero de unidades experimentales a las que se les asigna el mismo tratamiento. 3 Hiptesis Estadstica Como se indicara previamente, el experiPHQWR FLHQWtFR HV XQ HQVD\R GHVWLQDGR D SURbar la validez de una hiptesis. Las hiptesis estadsticas plantean supuestos referentes a algn parmetro poblacional. Por lo general se utiliza la hiptesis nula +R TXH VH UHHUH a la igualdad entre los parmetros probados. Frente a la Ho se plantea una hiptesis alternativa (Ha). Para determinar si un tratamiento tuvo algn efecto, se considera a la Ho como la ausencia de efectos, lo que equivale probar la igualdad entre las medias de los tratamientos. La
Ha plantea que al menos una de las medias GLHUH VLJQLFDWLYDPHQWH GHO UHVWR R VHD TXH al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de inters. Las hiptesis estadsticas tambin prueban otras caractersticas poblacionales, como por ejemplo OD LJXDOGDG HQWUH YDULDQ]DV R HQWUH FRHFLHQWHV de regresin. (O HQVD\R \ ODV SUXHEDV GH VLJQLFDQFLD SHUmiten calcular probabilidades bajo el supuesto de que la hiptesis nula sea cierta. Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un QLYHO GH VLJQLFDQFLD SUHHVWDEOHFLGR GH SRU HMHPSOR OD +R QR VH UHFKD]D \ VH LQHUH TXH QR KD\ GLIHUHQFLDV VLJQLFDWLYDV HQWUH ODV medias de los tratamientos. Se concluye que ORV WUDWDPLHQWRV QR WLHQHQ HIHFWR VLJQLFDWLYR en la variabilidad del carcter estudiado y las diferencias observadas no son mayores que las que se produciran por azar. En cambio si la probabilidad calculada es pequea (Pd0,05) VH UHFKD]D OD +R \ VH LQHUH GH DFXHUGR FRQ OD +D TXH KD\ GLIHUHQFLDV VLJQLFDWLYDV HQWUH ORV tratamientos. Si Pd0,01 se dice que las diferenFLDV VRQ DOWDPHQWH VLJQLFDWLYDV
Ho verdadera erro tipo I Rechazo Ho No rechazo Ho correcto Ho falsa correcto error tipo II
son equivalentes, t2 = F. La prueba F, que es un cociente de varianzas, es una generalizacin de la prueba t, especialmente til cuando se comparan ms de dos tratamientos. En el DQiOLVLV GH OD YDULDQ]D $129$ SRU HMHPSOR VH XWLOL]D OD SUXHED ) SDUD YHULFDU OD LJXDOGDG de medias. Prueba F Una prueba F consiste en un cociente entre dos varianzas: F = s2entre / s2dentro Para realizar la prueba F resulta necesario descomponer la varianza total (s2total) en dos componentes: s2entre y s2dentro El anlisis de la varianza es un procedimiento aritmtico que permite la descomposicin de la varianza total en varianzas parciales. El cociente entre las varianzas permite obtener un valor de F calculado (Fc) el cual se compara con un F de tabla (Ft) para un determinaGR QLYHO GH VLJQLFDFLyQ SRU HMHPSOR D=0.05) y los grados de libertad de los tratamientos y del error. Los programas estadsticos estiman directamente el P, la probabilidad de obtener un valor de F mayor que Fc si Ho fuera cierta. Los supuestos bsicos en que se fundaPHQWD HO $129$ VRQ HUURUHV LQGHSHQGLHQWHV normalmente distribuidos, aditividad de efectos y varianzas homogneas para todos los tratamientos. Cuando no se cumplen se ve afectaGR HO QLYHO GH VLJQLFDFLyQ OD VHQVLELOLGDG GH la prueba de F y la discrepancia real de la Ho. Varianza total Se puede considerar a la variacin total como la resultante de dos fuentes de variacin: una fuente de variacin debida a las diferencias entre grupos o tratamientos, sealadas por los promedios de stos y otra debida a la diferencia dentro de los tratamientos (entre repeticiones), que se calcula en base a las diferencias entre las observaciones o repeticiones de cada tratamiento. Varianza entre tratamientos Para aislar la variacin entre los grupos ne-
El QLYHO GH VLJQLFDQFLD, generalmente designado por D, representa hasta qu punto, en trminos de probabilidad, estamos dispuestos a aceptar un error de tipo I, es decir, rechazar una Ho que sea verdadera. Esto conlleva a que aceptemos una Ho como verdadera con una SUREDELOLGDG 6L VH MD D=0.05 estamos dispuestos a aceptar el error tipo I aproximadamente una de cada 20 veces. 4 Anlisis univariado Los anlisis univariados emplean una variable dependiente, mientras que los anlisis multivariados comparan muestras sobre la base de varias variables que estn relacionadas. /D VLJQLFDQFLD HVWDGtVWLFD GH XQD GLIHUHQFLD HQWUH GRV PHGLDV SXHGH YHULFDUVH PHGLDQWH una prueba t o mediante una prueba F. Ambas
cesitamos suprimir la variacin dentro de los tratamientos (entre repeticiones). Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de un mismo grupo iguales entre s e iguales a la media del grupo. Mediante esta operacin, la variacin entre los grupos no se PRGLFD PLHQWUDV TXH WRGD OD YDULDFLyQ GHQWUR del grupo queda anulada. Varianza dentro de tratamientos Para obtener la varianza dentro de los grupos debemos tener en cuenta solamente la variacin entre las observaciones de un mismo tratamiento (entre repeticiones). La variacin dentro de un tratamiento se debe a las desviaciones que presentan los valores individuales en ese grupo en relacin con la media de ese grupo. 5 Anlisis multivariado El anlisis multivariado brinda los mtodos estadsticos para el anlisis conjunto de varias variables que pueden estar interrelacionadas. Esta rama de la estadstica comprende procedimientos y tcnicas para la sntesis, la presentacin y el anlisis multidimensional de variables, tanto cualitativas como cuantitativas, obtenidas a partir de un nmero de individuos, OTU (Operational Taxonomic Unit), objetos o tratamientos. Debido a que las variables se consideran en forma simultnea estas tcnicas permiten realizar interpretaciones ms complejas a las que surgen mediante la utilizacin de mtodos univariados. El anlisis multivariado colabora en la comprensin ms adecuada y completa de las ciencias biolgicas, por tal motivo en este FDStWXOR VH EULQGDUi XQ SDQRUDPD VLPSOLFDGR y algunos comentarios sobre las tcnicas ms XVXDOHV FRQ OD QDOLGDG GH SRGHU GLVFHUQLU \ elegir la metodologa ms apropiada para analizar la informacin que se disponga. +D\ DOJXQDV UD]RQHV TXH MXVWLFDQ HO DQiOLsis conjunto de diferentes variables en lugar de analizar cada variable separadamente por mtodos univariados. Por ejemplo, cuando se trata de probar hiptesis mediante procedimientos de inferencia estadstica. En este caso, la aplicacin del anlisis univariado a cada una de las variables aumenta el error Tipo I mien-
tras que la aplicacin del anlisis multivariado SUHVHUYD HO YDORU GH \ DXPHQWD HQ PXFKRV casos la potencia del test. El anlisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los objetos que el mtodo univariado directamente no considera. El anlisis multivariado aprovecha estas relaciones para buscar en los datos patrones o estructuras enriqueciendo as la descripcin de los mismos. En el captulo siguiente se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas, seleccionndose aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. $QiOLVLV H[SORUDWRULR \ FRQUPDWRULR Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario, en primer lugar, realizar un anlisis exploratorio. Posteriormente, mediante las inferencias realizadas a partir de este anlisis y con la informacin que se pueda disponer acerca de los mecanismos que originan el proceso biolgico, es posible desarrollar un anOLVLV FRQUPDWRULR y as plantear un modelo descriptivo de causalidad el que, a su vez, es FRQUPDGR PHGLDQWH XQD SUXHED GH ERQGDG de ajuste. En otras palabras, toda investigacin llevada a cabo especialmente en reas nuevas, donde existen pocos antecedentes, comienza con una exploracin de los datos con el objeto de reconocer cualquier estructura o patrn no aleatorio que requiera una explicacin. En una segunda etapa, es posible que surja la necesidad de formular la pregunta, lo cual es a menudo ms interesante que buscar la respuesta subsiguiente, ya que el objetivo primordial es, en primer lugar, generar hiptesis interesantes que promuevan estudios ms avanzados. En este caso, los mtodos que estn diseados para UHVSRQGHU D SUHJXQWDV HVSHFtFDV QR VHUtDQ necesarios. En cambio resultaran apropiados aquellos mtodos que puedan detectar un patrn de comportamiento no previsto en los datos y que, adems, abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso. Estas tcnicas generalmente se caracterizan por el nfasis puesto en la utilizacin de representaciones viVXDOHV \ JUiFDV \ SRU OD FDUHQFLD GH PRGHORV
HVWRFiVWLFRV GRQGH OD VLJQLFDFLyQ HVWDGtVWLFD de los resultados pierde importancia. /D DSOLFDFLyQ GH ORV DQiOLVLV FRQUPDWRULRV se vuelve mas apropiada cuando el investigaGRU WLHQH HQ PHQWH KLSyWHVLV ELHQ GHQLGDV (V DTXt GRQGH ODV SUXHEDV GH VLJQLFDFLyQ HVWDdstica son necesarias. Sin embargo, no existe una divisin muy estricta entre tcnicas exploUDWRULDV \ FRQUPDWRULDV 3RU HOOR VHUtD LPSRUtante que el investigador tenga una perspectiva H[LEOH \ SUDJPiWLFD SDUD DQDOL]DU VXV GDWRV \ XQD H[SHULHQFLD VXFLHQWH TXH OH SHUPLWD HOHgir la herramienta analtica adecuada. El error ms grave que se podra realizar en este sentido sera arribar a conclusiones que expliquen causas a partir de datos exploratorios y descriptivos sin haber realizado ningn tipo de diseo experimental para probarlos. Se plantea como causa probable de esta tendencia generalizada el mal uso semntico entre las terminologas estadsticas y las biolgicas. El uso estadstico de trminos como efectos o variable independiente no implica causalidad. Sntesis de mtodos: objetivos y limitaciones Los anlisis multivariados ms comnmente adoptados, en orden decreciente, son: anlisis de componentes principales (ACP), anlisis de funciones discriminantes (AD), anlisis de agrupamientos (conglomerados o clusters), UHJUHVLyQ P~OWLSOH 50 DQiOLVLV PXOWLYDULDGR GH OD YDULDQ]D 0$129$ DQiOLVLV GH FRUUHVpondencia (AC), anlisis de coordenadas principales (ACOOP), anlisis factorial (AF), correlacin cannica (CC), modelos logartmicos lineales (LOGL), escalamiento multidimensional (0' \ OD UHJUHVLyQ ORJtVWLFD P~OWLSOH 5/ En la Tabla 1 se mencionan los objetivos generales de los mtodos de anlisis multivariado ms utilizados. Los procedimientos numerados del 1 al 7 utilizan combinaciones lineales de las variables, estos mtodos son ms HFLHQWHV FRQ YDULDEOHV FRQWLQXDV PLHQWUDV que aquellos mtodos numerados del 8 al 11, comprenden mtodos no lineales y son ms apropiados cuando se cuenta con variables cualitativas y el mtodo 12 es adecuado para variables cuantitativas, cualitativas o la mezcla de ambas.
Los mtodos lineales son apropiados cuando se quiere interpretar combinaciones ptimas de variables (por ejemplo, componentes principales en el anlisis de componentes principales, factores en el anlisis factorial, funciones discriminantes en el anlisis discriminante. 4XLHQHV DSOLFDQ PpWRGRV OLQHDOHV XVXDOPHQWH asumen que los valores de las variables incrementan o decrecen regularmente y que entre ellas no hay interacciones. Estas relaciones no lineales en el anlisis multivariado de la varianza aparecen en los trminos de las interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el anlisis de datos experimentales. 3DUD H[DPLQDU FRQ PD\RU HFLHQFLD GDWRV ELnarios (presencia/ausencia) y datos en rangos, se pueden usar otros modelos, donde las variables se relacionan mediante funciones no lineales. Cuando se utilizan combinaciones de YDULDEOHV KD\ TXH FRQVLGHUDU TXH HO FRHFLHQWH que afecta a una variable representa la contribucin de esta variable a la combinacin lineal y que este valor depende de las otras variables LQFOXLGDV HQ HO DQiOLVLV 1R VH FRQVLGHUD FRUUHFWR HO HPSOHR GH HVWRV FRHFLHQWHV LQGLYLGXDOHV para la interpretacin de dichas contribuciones. Antes de aplicar cualquier tcnica de anlisis resulta imprescindible realizar un examen inicial de los datos. El examen inicial, bsicamente, consiste en la evaluacin de datos faltantes \ OD UHSUHVHQWDFLyQ JUiFD GH ORV GDWRV OR TXH SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ GH RXWOLHUV GDWRV fuera del rango o fuera de tipo), tendencias y/o agrupamientos preliminares e hipotetizar posibles modelos para su anlisis. Adems, cuando el anlisis multivariado a emplear as OR UHTXLHUD VH GHEH YHULFDU VL VH FXPSOHQ ORV supuestos bsicos de normalidad multivariada, homogeneidad en la estructura de variacin y covariacin, independencia de errores y linealidad. Por otro lado, y al igual que en el anlisis univariado, hay que tener cuidado con el uso del QLYHO GH VLJQLFDQFLD ) que se adopte, de las subsiguientes inferencias estadsticas y de las conclusiones a que se arriba luego del anlisis. /DV FRQFOXVLRQHV FRQUPDWRULDV VRODPHQWH VH MXVWLFDQ VL ORV HVWXGLRV HVWXYLHURQ EDVDGRV HQ XQ PXHVWUR DSURSLDGR (VWR VLJQLFD TXH OD LQIHUHQFLD HVWi MXVWLFDGD HQ UHODFLyQ D OD IRUPD
Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de anlisis multivariados ms comnmente utilizados.

Anlisis 1. Regresin mltiple (RM) Objetivos Estudiar la relacin funcional entre una variable dependiente (Y) y varias variables independientes (X1, X2 ... Xn). Predecir una variable dependiente a partir de variables independientes. Si los modelos estn basados en experimentacin, investigar causalidad y efectos. Limitaciones Una buena prediccin no habilita por si sola a hacer inferencias sobre causalidad. La prediccin debe ser realizada slo en situaciones similares a aquellas de donde el modelo fue derivado (dentro del dominio de los valores experimentados). El procedimiento slo considera funciones lineales de las variables analizadas. La RM es apropiada para variables Y continuas e independientes; en el caso que se busque realizar inferencias estadsticas, los errores deben ser normales, las varianzas homogneas el muestreo debe ser aleatorio. El MANOVA debe cumplir con los supuestos de independencia de las observaciones, homogeneidad de matrices de varianza y covarianza para todos los grupos de tratamientos y distribucin normal multivariada para todas las variables dependientes. En algunos casos con un gran nmero de vari ables dependientes el poder estadstico del ANOVA excede al obtenido con un simple MANOVA. El procedimiento est indicado para vari ables independientes continuas, siendo inef iciente para variables que no estn corregidos por varianzas o covarianzas. Con AD slo se encontrarn las combinaciones de variables que sean lineales. Los grupos deben ser definidos a priori. El procedimiento es propuesto principalmente para variables continuas, es ineficiente para datos que no estn corregidos por varianzas o covarianzas. Con ACP slo se encontrarn las combinaciones de variables que sean lineales.
2. Anlisis multivariado de varianza (MANOVA)
Explorar la relacin entre distintas variables independientes cualitativas (tratamientos) y varias variables dependientes cuantitativas. Es un mtodo bsicamente inferencial.
3. Anlisis discriminante (AD)
4. Anlisis de componentes principales (ACP)
5. Anlisis de coordenadas principales (ACOOP)
6. Anlisis Factorial (AF)
7. Anlisis de correlaciones cannicas (CC)
Los resultados dependen del ndice de di stancia elegido. El anlisis produce un nuevo sistema coordenado que, a diferencia de otros mtodos, no puede indicar combin aciones de variables porque slo emplea la matriz de distancia entre objetos. Los mtodos exploratorios de anlisis de Reproducir una matriz de correlacin entre factores son tan estructurados que las variables originales suponiendo la existencia interpretaciones son subjetivas. El de uno o ms factores no evidentes (latentes). Descubrir est ructuras subyacentes procedimiento es ineficiente para datos que no estn corregidos mediante correlaciones, en grupos de datos mediante la por lo que no resulta ideal para relaciones no interpretacin de estos factores. lineales o datos binarios. El anlisis es ineficiente para datos que no Analizar la correlacin existente entre dos estn corregidos mediante correlaciones o grupos de variables del mismo grupo de objetos. Esto se hace en forma simultnea en combinaciones lineales, por lo que no resulta ideal para relaciones no lineales o datos lugar de calcular correlaciones de a pares. binarios. No se pueden hacer rotaciones como en el caso del AF lo cual dificulta la interpretacin de las combinaciones lineales encontradas. Brinda una estimacin de la varianza entre combinaciones lineales y no
Describir las situaciones multigrupales, encontrar las combinaciones lineales ptimas entre variables que permitan discriminar grupos de objetos. La ecuacin de la funcin discriminante lineal puede ser usada para clasificar observaciones o para predecir a que grupo pertenece una nueva observacin. Describir una matriz de datos de objetos y variables en una dimensin ms reducida, usualmente mediante una representacin grfica (biplot); fijar combinaciones lineales no correlacionadas de las variables originales maximizando sus varianzas. Sugerir nuevas combinaciones de variables para estudios posteri ores. Describir los datos mediante la reduccin de las dimensiones entre objetos y mostrarlas mediante una representacin grfica. Se puede hacer con variables cuantitativas, cualitativas o con la mezcla de ambas.
varianza entre combinaciones lineales y no de la varianza extrada de las variables. 8. Regresin logst ica (RL) Modelar la relacin entre una variable respuesta binaria (Y) y una o ms variables X cuantitativas y/o categricas. La RL tambin sirve para investigar la asociacin entre una variable X con otra variable en la presencia de otras variables X. Si los modelos de causalidad estn basados en experimentacin se podra estudiar causas y efectos. La RL brinda una alternativa para el AD entre dos grupos cuando las variables son categricas. Investigar las relaciones conjuntas entre variables categricas. Una buena prediccin por s sola no permite hacer inferencias de causalidad. Las predicciones slo deberan ser llevadas a cabo en situaciones similares a aquellas utilizadas por el modelo propuesto (dentro del dominio de los valores experimentados).
9. Modelos logartmicos lineales LOGL 10. Anlisis de correspondencia AC 11. Escalamiento multidimensional EMD
Las variables deben ser categricas o bien se requiere una transformacin a categricas.
12. Anlisis de agrupamientos o conglomerados
Explorar grficamente las relaciones contenidas en las tablas de contingencia. El A C permite sugerir nuevas combinaciones de variables para estudios posteriores. Describir los datos me diante la redu ccin de las dimensiones a travs de una representacin grfica, con el objetivo de encontrar relaciones no lineales entre objetos. Clasificar objetos o variables por su semejanza o diferencias en base a mediciones de similitud o distancia. Los agrupamientos se representan en un dendrograma.
Es una tcnica descriptiva aconsejable para anlisis exploratorios. Es muy sensible a la presencia de outliers. El anlisis solamente utiliza informacin que est ordenada en rangos.
Si bien este mtodo puede ser usado para las vari ables cuantitativas y/o cualitativas, los resultados dependen de las medidas de di stancias y de los algoritmos elegidos para formar los agrupamientos.
en que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado, ms que en la tcnica de anlisis en s misma. /DV LQIHUHQFLDV VyOR HVWiQ MXVWLFDGDV FXDQdo los datos son tomados de una muestra granGH \ ELHQ GHQLGD &XDQGR HVWR QR RFXUUH ORV valores de probabilidad tal vez directamente no se deberan informar y las conclusiones a las que se arriba slo deberan limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en las que se desarroll el experimento. De la misma manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios VH UHDOL]DQ VREUH FDVRV SDUWLFXODUHV R HVSHFtcos que no son representativos. $ PHQXGR VXFHGH TXH HO LQYHVWLJDGRU SUHHre o necesita interpretar las variables en forma separada cuando maneja un grupo de variables correlacionadas. En estos casos sera ms apropiado utilizar mtodos univariados, con el complemento de pruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embargo, cuando sea posible, la consideracin conjunta de las variables, mediante la
aplicacin del anlisis multivariado, puede brindar conclusiones ms fuertes que las logradas a travs de un grupo de comparaciones simples. Si se tiene cuidado durante el proceso de interpretacin de resultados, las combinaciones de variables (componentes, factores, etc.) podran VHU GH VLJQLFDWLYD LPSRUWDQFLD SDUD HVWXGLDU XQ proceso. El uso racional de la estadstica multivariada, el ajuste de un modelo y el conocimiento biolgico pueden ayudar al investigador a disear con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes. Como dijimos anteriormente, el anlisis multivariado aprovecha las relaciones entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. En este sentido, podra encontrarse un origen de patrones cuando se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. Pueden existir casos donde no se conoce a priori si los grupos estn ya formados, cuantos son, o cuales objetos pertenecen a cada grupo, es all donde habra que ver que tipo de anlisis es ms apropiado.
En general, en esta etapa se podran usar mtodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reduccin de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones). Otra posibilidad es hacer anlisis de agrupamientos donde los objetos VH FODVLFDQ HQ FDWHJRUtDV MHUiUTXLFDV VREUH OD base de matrices de similitud entre los mismos. En el primer caso, los objetos son represenWDGRV HQ XQ HVSDFLR JUiFR HQ ORV FXDOHV ORV ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. El mtodo de anlisis de componentes principales, que es un ejemplo de DQiOLVLV SRU RUGHQDPLHQWR XWLOL]D SDUD WDO Q ODV estructuras de los autovectores (tambin llamados eigens races latentes) de la matriz de correlacin o bien de una matriz de varianzacovarianza entre las variables originales. El anlisis de componentes principales y el anlisis factorial tienen como objetivo encontrar una estructura ms simple reduciendo la dimensionalidad de las variables sin perder LQIRUPDFLyQ 3DUD VLPSOLFDU HO DQiOLVLV GH ORV datos se reduce el nmero de variables a un pequeo nmero de ndices o factores. Algunas diferencias entre estas dos tcnicas son TXH ODV FRPSRQHQWHV SULQFLSDOHV HVWiQ GHQLdas como una combinacin lineal de las variables originales y no estn basadas en un modelo estadstico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. En el anlisis factorial las variables estn expresadas como una combinacin de factores, est basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de distintos supuestos. Por otra parte mediante el anlisis de componentes principales se busca explicar una gran parte de la varianza total, mientras que con el anlisis factorial se enfatiza el estudio en las relaciones entre las variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. El anlisis factorial resulta apropiado cuando el objetivo consiste en encontrar un grupo de variables similares, altamente correlacionadas, y postular que esas similitudes provienen del hecho de que stas son variables latentes o factores que actan en forma particular sobre el proceso estudiado. El anlisis de componentes principales es muy utilizado para el anlisis de ensayos multiambientales comparativos de rendimiento,
donde a partir de la interaccin genotipo-amELHQWH \ 47/DPELHQWH VH SXHGHQ LGHQWLFDU DGDSWDFLRQHV HVSHFtFDV HVWDELOLGDG LGHRtipos y subregiones o mega-ambientes. Los JUiFRV ELSORW DFRPSDxDQ ORV UHVXOWDGRV GHO anlisis de componentes principales, y a travs GH HVWRV VH JUDFDQ GH PDQHUD VLPXOWiQHD OD variabilidad de las observaciones y de las variables. (O LQYHVWLJDGRU LQWHUHVDGR HQ GHQLU JUXSRV homogneos de objetos o de variables, basados en la similitud o diferencias, y estudiar la estructura natural de las observaciones o de las variables puede aplicar el anlisis de agrupamientos. Este anlisis ha sido tradicionalmente utilizado para propsitos exploratorios. Dado que no es una tcnica de inferencia estadstica, para que los grupos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciacin entre grupos slo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no sean multicolineales. En este anlisis, se deben incluir aquellas variables que contribuyan a caracterizar los objetos y que se encuentren relacionadas con los objetivos del anlisis. Se recomienda que un anlisis de agrupamientos sea posteriormente complementado con un anlisis de funciones discriminantes sobre ORV JUXSRV SUHYLDPHQWH LGHQWLFDGRV El escalamiento multidimensional, involucra una serie de tcnicas que ayudan al analisWD D LGHQWLFDU GLPHQVLRQHV VXE\DFHQWHV HQ OD evaluacin de objetos. Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento, ya que SHUPLWH LGHQWLFDU GLPHQVLRQHV QR FRQRFLGDV que afectan el comportamiento. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparacin son desconocidas o LQGHQLEOHV 6H WUDQVIRUPD HO FRPSRUWDPLHQWR de quienes perciben los objetos en distancias, ODV TXH QDOPHQWH VH UHSUHVHQWDQ HQ XQ HVSDcio multidimensional. Si bien mediante el anlisis de agrupamientos los objetos se agrupan de acuerdo a sus caractersticas, con el escalamiento multidimensional no se enfoca el inters en los objetos en s sino ms bien, en como estos son percibidos. Esta tcnica mide la correlacin o covarianza de los estmulos derivados de las caractersticas de los objetos a ser evaluados. As, las representaciones gr-
FDV HQIDWL]DQ ODV UHODFLRQHV HQWUH ORV HVWtPXlos que se estudian. El anlisis de correspondencia es un procedimiento de ordenacin apropiado para datos de tablas de contingencia (frecuencias). Las obVHUYDFLRQHV PXOWLYDULDGDV VH JUDFDQ HQ SODQRV ELSORW SDUD LGHQWLFDU ODV DVRFLDFLRQHV GH PDyor peso entre las modalidades de varias variables cualitativas. El anlisis de funciones discriminante se utiliza cuando los objetos o individuos se re~QHQ HQ GRV R PiV JUXSRV GHQLGRV a priori, frecuentemente se plantea el problema de cmo describir las diferencias entre grupos sobre la base de un conjunto de variables. El propsito bsico del anlisis de funciones discriminantes es estimar la relacin que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs hembras o genotipos resistentes vs genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribucin normal. Lo mismo que en el caso de anlisis de componentes principales y anlisis factorial, el anlisis de funciones discriminantes se basa en la posibilidad de encontrar una combinacin lineal de las variables originales. Como caracterstica, el anlisis de funciones discriminantes SHUPLWH LGHQWLFDU DTXHOORV JUXSRV \D IRUPDGRV a los cuales pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita DGHPiV OD LGHQWLFDFLyQ GH FXDO R FXDOHV GH ODV variables independientes contribuye ms a la diferenciacin entre grupos. El anlisis multivariado de la varianza es un procedimiento de inferencia estadstica usado SDUD HYDOXDU OD VLJQLFDQFLD GH OD GLIHUHQFLD HQtre los grupos, que se hallan delimitados sobre la base de las distintas variables independientes discretas o tratamientos. Es una extensin del $129$ VyOR TXH ODV GLIHUHQFLDV VH HVWDEOHFHQ teniendo en cuenta varias variables dependientes cuantitativas de distribucin normal. Por ello este anlisis es particularmente til cuando los datos provienen de diseos experimentales. Tambin puede ser considerado como una extensin del anlisis de funciones discriminantes, aunque en ste la nica variable dependiente es categrica y las variables independientes son cuantitativas, mientras que el anlisis multivariado de la varianza involucra un grupo de varia-
bles dependientes cuantitativas y las variables independientes son cualitativas. Las correlaciones cannicas reducen las dimensiones de dos grupos de variables provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan estudiar las relaciones conjuntas entre los grupos. Es similar al anlisis de funciones discriminantes slo que en las correlaciones cannicas las variables (no los objetos o individuos) son divididas en grupos por lo que el inters se centra sobre las relaciones entre los grupos de variables. Por ejemplo, las correlaciones cannicas se pueden utilizar cuando interesa conocer la relacin existente entre los patrones de marcadores moleculares, que representan diferentes genotipos, y algunas caractersticas ambientales donde viven los individuos muestreados. La regresin mltiple se considera el mtodo apropiado cuando se presume que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras variables. Esta tcnica, que explora todo tipo de relaciones dependientes, tiene como objetivo predecir los cambios en una variable dependiente cuantitativa en respuesta a los cambios en las distintas variables independientes o predictoras. Los modelos de regresin mltiple constituyen la base para la estimacin de parmetros en gentica cuantitativa. Son ejemplos de su aplicacin la descomposicin del valor genotpico en el efecto medio de cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis, el clculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposicin de la interaccin genotipo ambiente, el parecido entre parientes, OD XELFDFLyQ \ OD XWLOL]DFLyQ GH 47/ PHGLDQWH marcadores moleculares. La ecuacin de regresin es una combinacin lineal de las variables independientes que mejor predicen la variable dependiente. La seleccin de las variables con mayor poder de prediccin se realiza mediante aproximaciones secuenciales, llamadas estimaciones steSZLVH SDVRV LQWHOLJHQWHV 0HGLDQWH ORV FRHcientes de regresin estandarizados es posible determinar la importancia relativa de cada variable predictora. Las variables independiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien, mediante transformaciones previas, es posible
incluir variables independientes no mtricas. La aplicacin del anlisis regresin logstica permite predecir una variable dependiente binaria (0,1) empleando tanto variables categricas como cuantitativas. Es importante tener en cuenta que para asignar causalidad en IRUPD MXVWLFDGD HV QHFHVDULR GLVSRQHU GH XQD cantidad adecuada de datos biolgicos experimentales. Si se cumplen los supuestos bsicos, en especial la normalidad de las variables, no hay mayores diferencias entre la regresin logstica y el anlisis de funciones discriminantes, slo que en el caso que sea posible formar ms de dos grupos, este ltimo resulta el ms apropiado. Los modelos logartmicos lineales comprenden a otros anlisis que permiten mostrar las relaciones que existen entre variables categricas. 6 Estudio de la interaccin QTL-ambiente con ANOVA y ACP La seleccin asistida por marcadores es una inmediata aplicacin de la biotecnologa que puede ser usada por los mejoradores para ORFDOL]DU XQ JHQ HVSHFtFR R XQ VHJPHQWR GH cromosoma que regula el fenotipo estudiado y que est presente en un individuo o en la poblacin de inters. En algunas poblaciones de mapeo (poblaciones segregantes con desequilibrio de ligamienWR HQWUH ORV PDUFDGRUHV JHQpWLFRV \ ORV 47/V WDOHV FRPR ODV 5,/ OtQHDV HQGRFULDGDV UHFRPbinantes) y en especial las DH (doblehaploides) es posible multiplicar genotipos prcticamente sin variabilidad gentica y probarlos en ensayos multiambientales. Los ensayos multiambientales en general brindan la posibilidad de explorar las interacciones genotipo-ambiente *( \ 47/DPELHQWH 4( 6L ELHQ HO HIHFWR GH DOJXQRV 47/V H[SOLFD XQD DOWD SURSRUFLyQ GH OD varianza fenotpica estimada en los diferentes DPELHQWHV HO HIHFWR GH RWURV 47/V HV GHWHFWDdo de manera poco consistente debido a la asoFLDFLyQ FRQ DPELHQWHV HVSHFtFRV JHQHUDQGR XQD IXHUWH LQWHUDFFLyQ 47/DPELHQWH Se ha encontrado que en el maz tropical las temperaturas de los diferentes sitios afectan la H[SUHVLyQ GH GLVWLQWRV 47/V DGDSWDFLyQ HVSHFtFD GHELGD DO PHQRV HQ SDUWH DO HIHFWR GH
OD VHOHFFLyQ DUWLFLDO \ D OD VXVWLWXFLyQ DOpOLFD ocurrida en diferentes loci. El anlisis de los SDWURQHV GH LQWHUDFFLyQ 47/DPELHQWH SHUPLWH YLVXDOL]DU ORV HIHFWRV SULQFLSDOHV GH ORV 47/V 4 GHQWUR \ D WUDYpV GH ORV DPELHQWHV R PHJD DPELHQWHV H LGHQWLFDU DTXHOORV TXH DXPHQWDQ la efectividad de la seleccin y la retrocruza asistida por marcadores. Frecuentemente, los modelos que se aplican para estudiar la inteUDFFLyQ 47/DPELHQWH VRQ ORV PLVPRV R VLPLODres a los utilizados para estudios de interaccin genotipo-ambiente, tales como el modelo AMMI (Additive Main Effects and Multiplicative InteracWLRQ R HO PRGHOR 65(* 6LWHV 5HJUHVVLRQ (O DQiOLVLV 65(* FRPELQD OD WpFQLFD GHO $129$ \ GHO $&3 HQ XQ VyOR PRGHOR (O $129$ SHUPLWH estudiar el efecto principal de ambiente, mientras que la interaccin genotipo-ambiente ms el efecto principal de genotipo (G) es tratado de forma multivariada mediante el ACP. De manera anloga con el mtodo GGE biplot (evaluacin simultnea del G + GE), se GHVFULEH HO 44( ELSORW 4 4( TXH UHGXFH la dimensionalidad de la informacin obtenida VREUH P~OWLSOHV 47/V HQ P~OWLSOHV DPELHQtes. En este mtodo se representan los paWURQHV GH LQWHUDFFLyQ 47/DPELHQWH D SDUWLU GH XQD WDEOD GH GRV YtDV 47/V \ DPELHQWHV y por lo tanto es posible visualizar los efectos GH ORV 47/V GHQWUR \ D WUDYpV GH DPELHQWHV o mega-ambientes. Esta tabla se descompone en componentes principales y los dos primeURV FRPSRQHQWHV SULQFLSDOHV VH JUDFDQ SDUD 47/V \ DPELHQWHV HQ OD IRUPD GH XQ ELSORW (O UHVXOWDGR GHO 44( ELSORW FRQWLHQH LQIRUPDFLyQ VREUH ORV HIHFWRV SULQFLSDOHV GH ORV 47/V R efecto aditivo, resumido como el efecto medio a travs de ambientes e informacin sobre la LQWHUDFFLyQ 47/DPELHQWH UHODFLRQDGD FRQ OD HVWDELOLGDG GH ORV 47/V (O SULPHU DQiOLVLV GH ORV 44( ELSORW FRQVLVWH HQ GHWHUPLQDU VL H[LVten diferentes mega-ambientes. Si es as, se SRGUiQ JHQHUDU P~OWLSOHV 44( ELSORWV \ ORV SDtrones de interaccin se investigarn en cada mega-ambiente. 3DUD LQWHUSUHWDU OD PHWRGRORJtD GHO 44( ELSORW VH XWLOL]y XQD WDEOD 47/DPELHQWH <DQ \ 7LQNHU FRQ RFKR 47/ 4 D 4 \ RFKR ambientes (E1 a E8) (Tabla 2). El biplot fue realizado con el programa Infogen (Balzarini y Di
5LHQ]R HQ EDVH DO HIHFWR DGLWLYR GH ORV 47/V

Tabla 2. (IHFWRV DGLWLYRV GH RFKR 47/V 4 D 4 en ocho ambientes (E1 a E8).
Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8
E1 1 -2 2 2 3 0 -6 3
E2 2 -2 -2 4 -2 0 -5 -3
E2 2 -2 -2 4 -2 0 -5 -3
E3 2 -3 -1 3 -2 0 -4 4
E4 2 -4 -2 1 -3 0 -3 4
E5 1 2 -3 1 -4 -3 0 3
E6 1 3 -2 4 -3 -4 0 -3
E7 0 4 -1 2 -3 -5 0 4
E8 1 6 -2 1 -3 -6 0 -4
(O HIHFWR SULQFLSDO GH 4 GH ( \ GH OD 4( H[plicaron 40, 3 y 57% de la variacin total, respectivamente. El biplot de las CP1 y CP2 explicaron el 79% de la variacin total (Figura 1). El 44( ELSORW SHUPLWH YLVXDOL]DU GLVWLQWRV WHPDV relacionados con la evaluacin y utilizacin de ORV 47/ QTLs mayores vs menores: La distanFLD GH ORV 47/V DO RULJHQ SHUPLWH YLVXDOL]DU OD PDJQLWXG GH VXV HIHFWRV $Vt 4 4 4 4 \
Figura 1. 44( ELSORW REWHQLGR FRQ ORV HIHFWRV DGLWLvos de la Tabla 2.
4 SXHGHQ VHU FRQVLGHUDGRV 47/V FRQ HIHFWRV mayores. Los restantes no son necesariamente menores porque sus efectos podran aparecer en la CP3 o CP4. Similitud entre QTLs: La distancia y el nJXOR HQWUH GRV 47/V HV XQ LQGLFDGRU GH OD VLmilitud en sus respuestas a los ambientes. As SRU HMHPSOR 4 HV PX\ GLIHUHQWH GH 4 4 \ 4 /RV 47/V FRQ SDWURQHV VLPLODUHV SXHGHQ ser tratados de la misma forma en la seleccin asistida por marcadores. 6LPLOLWXG HQWUH DPELHQWHV \ FODVLFDFLyQ de mega-ambientes: La distancia y el ngulo entre dos ambientes miden la similitud en la H[SUHVLyQ GH ORV 47/V (Q OD )LJXUD VH REservan dos grupos de ambientes, E1 a E4 vs E5 a E8. Los ambientes dentro de cada grupo son similares (ngulos pequeos) pero los dos grupos son independientes (ngulo recto). Por OR WDQWR VH LGHQWLFDQ GRV PHJDDPELHQWHV Esto implica, que la seleccin de genotipos en un mega-ambiente es independiente del otro, y que las estrategias de seleccin requeridas en cada mega-ambiente deben ser distintas. Efecto principal y estabilidad de los QTL a travs de ambientes: El punto que representa el ambiente promedio (AP) se obtiene con la PHGLD GH ORV FRHFLHQWHV &3 \ &3 D WUDYpV de los ambientes. La lnea que pasa a travs del ambiente promedio y el origen del biplot es llamada eje x del ambiente promedio y las pro\HFFLRQHV VREUH HVWH HMH FXDQWLFDQ HO HIHFWR GH ORV 47/V $Vt ORV HIHFWRV SULQFLSDOHV GH ORV 47/V D WUDYpV GH DPELHQWHV VRQ 4 ! 4 ! ! 4 ! 4 /D OtQHD SHUSHQGLFXODU DO $3 TXH pasa por el origen se llama eje y del ambiente promedio. Las mayores proyecciones de los 47/V VREUH HO HMH y indican poca estabilidad GH ORV PLVPRV $Vt 4 4 \ 4 VRQ SRFR HVWDEOHV \ 4 4 4 \ 4 VRQ UHODWLYDPHQWH estables a travs de los ambientes. Para una PHMRU LQWHUSUHWDFLyQ GH 4 TXH WRPD YDORUHV LQWHUPHGLRV VH SRGUtD UHDOL]DU XQ JUiFR FRPplementario con las CP3 vs CP4. Uso de los QTLs en la seleccin asistida por marcadores en diferentes mega-ambientes: (O ELSORW 44( WDPELpQ LQGLFD OD PHMRU FRPELQDFLyQ GH ORV DOHORV GH ORV 47/V SDUD OD mxima expresin de los caracteres en cada mega-ambiente. Por ejemplo, la Figura 1 su-
giere que para la mxima expresin del carcter en el mega-ambiente que contiene de E1 D ( GHEHQ VHU VHOHFFLRQDGRV ORV DOHORV 4 \ 4 GHO SDUHQWDO \D TXH SUHVHQWDQ ORV YDORres ms altos y positivos. Los mega-ambientes pueden ser examinados en biplots separados para una mejor interpretacin. Utilidades del biplot QQE: Los caracteres cuantitativos y aquellos regidos por pocos JHQHV HVWiQ VXMHWRV D LQWHUDFFLRQHV 4( /DV plantas portadoras de genes para resistencia a enfermedades o para enanismo son ejemplos clsicos de genotipos adaptados para responGHU D DPELHQWHV HVSHFtFRV SRU HMHPSOR OD presencia de patgenos o altas tasas de fertilizante. Por lo tanto, es necesario entender los SDWURQHV GH ORV 47/DPELHQWH DQWHV GH XVDU ORV 47/ HQ OD VHOHFFLyQ DVLVWLGD SRU PDUFDGRres.
Balzarini, M.; Di 5LHQ]R - ,QIR*HQ 6RIWZDUH para anlisis estadstico de datos genticos. UniYHUVLGDG 1DFLRQDO GH &yUGRED &yUGRED $UJHQtina. Everitt, B.S.; Dunn, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. +DLU -) $QGHUVRQ 5( 7DWKDP 5/ %ODFN :& 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. PrenWLFH +DOO 8SSHU 6DGGOH 5LYHU 1HZ -HUVH\ James, F.C.; McCulloch, C.E. 1990. Multivariate analysis in ecology and systematic: Panacea or 3DQGRUD
V ER[" $QQXDO UHYLHZ RI HFRORJ\ DQG systematics, 21: 129-166. Manly, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. 5HQFKHU $& 0HWKRGV RI 0XOWLYDULDWH $QDO\VLV - :LOH\ DQG 6RQV ,QF 1HZ <RUN <DQ : 7LQNHU 1$ $ ELSORW DSSURDFK IRU LQYHVWLJDWLQJ 47/E\HQYLURQPHQW SDWWHUQV 0Rlecular Breeding 15: 31-43.
II. CAPTULO 9 Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica

1pOLGD :LQ]HU 0LJXHO 'L 5HQ]R 6RItD 2OPRV Mercedes Ibaez. 1 Introduccin La informacin procesada a partir de las tcnicas que se desarrollan en este libro puede ser de diversos tipos y puede tratarse por otro lado, del anlisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada individuo o muestra. Los anlisis estadsticos a utilizar dependen de estos dos aspectos, tipo de datos y nmero de variables, y, adems, de qu objetivo se haya planteado el investigador. Si se trata de una sola variable se podrn aplicar las tcnicas aprendidas en un curso bsico de estadstica (comparacin de dos medias, Anlisis de la Varianza, Anlisis de 5HJUHVLyQ SUXHEDV FKLFXDGUDGR HWF R ELHQ alguna de sus generalizaciones. En este captulo se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas. Se han seleccionado aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Los datos multivariados se ordenan en una PDWUL] $ HIHFWRV GH XQLFDU HO OHQJXDMH VH FRQVLGHUDUi TXH FDGD OD GH OD PDWUL] UHSUHVHQWDUi un individuo, una muestra, una especie; en deQLWLYD XQD 278 Operational Taxonomic Unit). Las columnas representarn los caracteres o variables que se observan en cada OTU. 2 Tipo de datos DATOS DOBLE ESTADO: Son los tambin llamados datos binarios o dicotmicos. Estos datos se presentan cuando el carcter puede tomar slo dos estados posibles. Habitualmente se FRGLFDQ FRPR y Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios. a) Datos de presencia o ausencia. Slo se registra la presencia ausencia del carcter. Ejemplo: Presencia o no de una banda en
una corrida electrofortica de isoenzimas o marcadores moleculares. b) Datos doble estado excluyentes. El carcter tiene slo dos estados posibles y la asignacin del "0" el "1" es indistinta. (MHPSORV &DUiFWHU 6H[R &RGLFDFLyQ Hembra = 0, Macho = 1, Hembra = 1, Macho = 0 Tipo de Fruto: dehiscente indehiscente. &ODVLFDFLyQ GH KRMDV SDULSLQDGDV y LPSDripinadas. La distincin entre uno u otro tipo de dato binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociacin. Datos Multiestado Cualitativos: El carcter SXHGH WRPDU XQ FRQMXQWR QLWR GH HVWDGRV Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado, lobulado, entero. &RORU GH OD RU EODQFD URMD R URVDGD Disposicin de fololos en el raquis: alternos, subopuestos, opuestos. ,GHQWLFDFLyQ GH ORV QXFOHyWLGRV SUHVHQWHV HQ XQD GHWHUPLQDGD VHFXHQFLD GH $'1 $ & T, G. ,GHQWLFDFLyQ GH ORV DPLQRiFLGRV HVHQFLDOHV presentes en una protena: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp, Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg. Clases de embriones somticos: globular, acorazonado, torpedo, cotiledonar. Datos Multiestado Cuantitativos Discretos: Estn asociados a valores de conteo. (MHPSORV 1~PHUR GH KLOHUDV SRU HVSLJD Q~PHUR GH PDFROORV SRU SODQWD Q~PHUR GH LQRrescencias. Datos Multiestado Cuantitativos Continuos: 5HSUHVHQWDQ SURSLHGDGHV TXH VH SXHGHQ H[presar en una escala continua. Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de semillas, longitud de partes verdes, concentracin de protena del grano, frecuencia relativa de un alelo. 3 Medidas de asociacin y distancia Un objetivo frecuente suele ser la descripcin del grado de parecido que hay entre las
OTUs. Para ello ser necesario medir ese grado de similitud. Se describirn a continuacin algunas de las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura. Hay dos tipos de medidas: los ndices de asociacin y las distancias. Los primeros miden el grado de similitud: cuanto ms parecidas sean dos muestras mayor ser su asociacin. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto ms parecidas son dos muestras menor ser su distancia. Para datos binarios es usual trabajar con medidas de asociacin. Entonces, para caracterizar a dos OTUs existen cuatro valores a considerar: D 1 GH FDUDFWHUHV GRQGH DPEDV 278V FRinciden en el "1"; E 1 GH FDUDFWHUHV GRQGH OD SULPHUD 278 tiene un "1" y la otra un "0"; F 1 GH FDUDFWHUHV GRQGH OD SULPHUD 278 tiene un "0" y la otra un "1"; G 1 GH FDUDFWHUHV GRQGH DPEDV 278V FRinciden en el "0" . La suma de estos cuatro valores dar el total de caracteres medidos.
OTU 1 1 0 a b c d
Es la proporcin de caracteres presentes que comparten, respecto al total de caracteres presentes en las dos OTUs. Dice
D12
2a 2a b c
a (a b) (a c) 2
OTU 2
1 0
Si los datos son de presencia/ausencia, un criterio vlido es considerar que dos OTUs son ms parecidas cuantos ms "unos" compartan. La coincidencia de "ceros" no aporta a la similitud porque puede estar generado por falta de LQIRUPDFLyQ OD QR DPSOLFDFLyQ GH XQ IUDJPHQWR 5$3' SXHGH VHU GHELGD D OD FDUHQFLD GHO sitio de hibridacin del cebador por ausencia completa de la secuencia complementaria o como consecuencia de una mutacin de punto HQ GLFKR VLWLR R ELHQ D XQD IDOOD HQ OD DPSOLFDcin por ejemplo). Dos de los ndices que comparten este criterio son Jaccard y Dice. -$&&$5' a
J12
abc
Es la proporcin de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU. Se puede probar que Jaccard siempre dar un valor de asociacin menor que Dice, salvo cuando toman el valor 0 1, caso en que siempre coinciden. Ms aun, ambos estn relacionados mediante la ecuacin J = D/(2-D) D = 2J/(1+J). Esta relacin tiene como consecuencia, entre otras, que en un Anlisis de Agrupamientos, cuando se usa ligamiento Simple o Completo, den los mismos grupos slo que con distintos valores de asociacin. Ejemplo: Como resultado de la aplicacin de OD WpFQLFD 5$3' VREUH VHLV PXHVWUDV VH UHJLVtr la informacin de la Tabla 1 sobre la presencia o ausencia de ocho bandas generadas por un cebador. Este es un proceso tpico en el anlisis de la informacin a partir de bandas. Primero se coGLFD OD LQIRUPDFLyQ VH FRQVWUX\H OD PDWUL] GH datos y, en este caso, se calcularon las matrices de asociacin de Jaccard y Dice a efectos de observar las caractersticas mencionadas ms arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en comn, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra muestra comparten 3. As Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4.5 por lo que la asociacin de Dice da (3/4.5) = 2/3 = 0.667. Se observa tambin que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice.
Tabla 1: 0DWUL] GH GDWRV FRQVWUXLGD HQ EDVH D FHEDGRUHV 5$3'V

A 1 2 3 4 5 6 7 8
Bandas 4 1 1 0 0 1 1
F
1 2 3 4 5 6 7 8
1 1 0 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1
E F
A 1 1 0 1 1 0 1 0
7 1 0 0 0 1 1
A
B 0 1 1 1 1 0 0 0
8 0 0 1 0 0 1
B
C 0 0 1 0 0 1 0 1
D 1 1 1 0 0 0 0 0
E 1 1 0 1 1 0 1 0
F 0 1 1 1 1 1 1 1
A B C D E F
A A B C D E F B C D
3 0 1 1 1 0 1
5 1 1 0 0 1 1
6 0 0 1 0 0 1
1 0.5 0 0.333 1 0.5 0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571 0 0.167 1 0.2 0 0.429 0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25 1 0.5 0 0.333 1 0.5 0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1
A B C D E F
1 0.667 0 0.5 1 0.667
0.667 0 0.5 1 0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727 0.286 1 0.333 0 0.6 0.571 0.333 1 0.5 0.4 0.667 0 0.5 1 0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1
Adems, ambas matrices son simtricas: la asociacin entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociacin. Esta observacin ser vlida para todas las medidas que se presenten en este captulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, dos muestras debern considerarse ms asociadas tanto cuando comparten XQRV FRPR FHURV \D TXH OD FRGLFDFLyQ TXH se les asigna es indistinta. Este es un proceso tpico en el anlisis de la informacin a partir de bandas. Primero se coGLFD OD LQIRUPDFLyQ VH FRQVWUX\H OD PDWUL] GH datos y, en este caso, se calcularon las matrices de asociacin de Jaccard y Dice a efectos de observar las caractersticas mencionadas ms arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en comn, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra
muestra comparten 3. As Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4.5 por lo que la asociacin de Dice da (3/4.5) = 2/3 = 0.667. Se observa tambin que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. Adems, ambas matrices son simtricas: la asociacin entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociacin. Esta observacin ser vlida para todas las medidas que se presenten en este captulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, dos muestras debern considerarse ms asociadas tanto cuando comparten XQRV FRPR FHURV \D TXH OD FRGLFDFLyQ TXH se les asigna es indistinta. Un ndice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: 6,03/( 0$7&+,1*
SM12 ad abcd
Simplemente es la proporcin de caracteres que comparten las dos muestras. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a ocho caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociacin con el ndice de Simple Matching dar:
A A B C D E F B C D E F
/RV SXQWRV 3 \ 4
( p1 , p 2 ,..., p m )
( q1 , q 2 ,..., q m ) estn sobre una
0.625 1
0 0.375 1
0.5 0.625 0.5 1
1 0.625 0 0.5 1
0.5 0.625 0.5 0.250 0.5 1
esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une esos dos puntos. 3DUD HO FDVR P VH YH HQ HO JUiFR OD distancia cuerda entre los puntos P = (0.3, 0.7) \ 4 /RV SXQWRV RULJLQDOHV VRQ OOHvados a la esfera (crculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia habitual entre esos dos puntos: d = 0.5324.
1
Se observa que A y E comparten todos los caracteres, por lo tanto tienen la mxima asociacin. En cambio C y E no coinciden en ninguno, su asociacin es 0. La asociacin entre C y D y HQWUH ' \ ( HV OR TXH VLJQLFD TXH FRLQFLGHQ en la mitad de los caracteres evaluados. $GHPiV GH ODV TXH VH KDQ GHQLGR KDVta ahora existen muchas otras medidas para GDWRV ELQDULRV 7DPELpQ VH SXHGHQ GHQLU PHdidas de distancia o asociacin para distintos tipos de datos multiestado. Para no extender en demasa esta seccin se presentarn alguQDV GLVWDQFLDV GHQLGDV HVSHFtFDPHQWH SDUD frecuencias allicas. 4 Distancias Genticas 6H SXHGHQ FODVLFDU HQ GRV JUXSRV ODV EDsadas en un modelo geomtrico (Cavalli-Sfor]D \ 5RJHUV \ ODV EDVDGDV HQ PRGHORV ELROyJLFRV 1HL Si se tienen dos poblaciones de las que se cuenta con la informacin sobre los loci para m alelos y las frecuencias correspondientes, stas pueden expresarse de la siguiente manera: Pob. 1: p1, p2, ... , pm Pob. 2: q1, q2, ... , qm Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y EDWARDS (1967):
m 2 1 pi q i ) i1
P*
0.8
P
0.6
Q*
0.4
0.2
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Si se consideran simultneamente varios loci la distancia Cuerda se calcula as:

r 2 1 i1 mi
d12
j 1
pijq ij )
Distancia de ROGERS (1972):
R12
1 r ri1
(p
j 1
mi
ij
q ij ) 2
(Q HO JUiFR pVWD HV OD GLVWDQFLD KDELWXDO HQWUH ORV SXQWRV 3 \ 4 Distancia de Estndar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biolgica. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idnticos, con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma poblacin. Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias allicas de un locus:
d12
se puede interpretar como la probabilidad que dos alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la poblacin 1 y el otro de la poblacin 2.
i i
p q
2 i
es la probabilidad que dos alelos elegidos al azar de la poblacin 1 sean iguales; es la probabilidad que dos alelos elegidos al azar de la poblacin dos sean iguales. Los dos ltimos trminos equivalen a un estado de homocigosis en la poblacin 1 y 2, respectivamente. 1HL GHQH SULPHUR OD Identidad normalizada (vara entre 0 y 1):
2 i
p q
I
i 1 m i 1
i i m
pi2 qi2
i 1
y luego la Distancia Estndar: D12 = - ln I. Si se usan varios loci se trabaja con el proPHGLR DULWPpWLFR GH ODV SUREDELOLGDGHV GHQLdas anteriormente resultando:
D12
ln
p q
i 1 j 1 2 pij i 1 j 1 r mi r
mi
ij ij mi
q
i 1 j 1
2 ij
Ejemplo: Para la informacin de la Tabla 2, en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.
En las poblaciones naturales una de las formas de realizar el agrupamiento jerrquico de las mismas en grupos (variedades, lneas, genotipos), es mediante el empleo de medidas de divergencia gentica. Es en este campo donde las llamadas distancias genticas tienen su mayor aplicacin. Las distancias genticas basadas en modelos biolgicos son las ms empleadas en estudio de gentica poblacional debido a que resumen los conocimientos obtenidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a los cambios genticos es decir, mediante mutaciones y deriva gentica. La medida de distancia gentica estndar de 1HL HV PiV FRQDEOH FXDQGR VH XWLOL]DQ GDWRV provenientes de muchos alelos. La distancia GH 1HL HVWi IRUPXODGD SDUD XQ PRGHOR GRQGH se asume que las mutaciones ocurren en forPD LQQLWD FRQ OD PLVPD SUREDELOLGDG SDUD WRdos los alelos a una tasa de mutacin neutral, y que la variabilidad gentica inicial en la poblacin est en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva gentica, siendo el tamao efectivo de la poblacin, en cada una, constante. Basndose en estos supuestos, y en que todos los loci sean equivalentes entre s, se espera que la Distancia de 1HL VH LQFUHPHQWH OLQHDOPHQWH FRQ HO WLHPSR 6L las frecuencias allicas en cada poblacin han sido estimadas con pocas muestras se pueden XWLOL]DU HQ FDPELR DOJXQDV PRGLFDFLRQHV D OD 'LVWDQFLD (VWiQGDU GH 1HL FRPR ODV SURSXHVWDV SRU 1HL \ +LOOLV /D GLVWDQFLD GH &DYDOOL6IRU]D \ (GZDUGV SRU HO FRQWUDULR DVXme que las diferencias entre las poblaciones no provienen de mutaciones sino que son slo consecuencia de la deriva gentica. Adems, no asume que el tamao poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones. Considera que el tamao de la poblacin cambia en forma lineal pero no con el tiempo sino FRQ 1 GRQGH 1 HV HO WDPDxR HIHFWLYR GH OD poblacin. As, en estos casos, los conocimientos bsicos de gentica poblacional brindarn las herramientas necesarias en el momento de la eleccin del mtodo ms apropiado para el anlisis de nuestros datos. 5 Anlisis de coordenadas principales Si se tiene una matriz de distancias entre 1 PXHVWUDV VHUi SRVLEOH UHSUHVHQWDU FDGD
Tabla 2: Datos de frecuencias allicas de dos loci SDUD HO FiOFXOR GH OD 'LVWDQFLD (VWiQGDU GH 1HL
muestra mediante un punto de manera tal que las distancias resultantes reproduzcan las de la matriz?. Veamos dos ejemplos: (i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A, B y C: 1 .447 0 D 1 0 .707 .447 .707 0 se podran hacer algunos de los siguientes JUiFRV
1.4 1.2 1.0 B 0.8 0.6 0.4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A
Si se calcula la distancia eucldea entre los SXQWRV HQ XQR FXDOTXLHUD GH HVWRV JUiFRV VH ve que se han reproducido exactamente los valores de la matriz D. Por ejemplo: d E (A, B) (1.444 0.445)2 (0.881 0.94)2 1
HQ HO JUiFR , (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre las muestras P1, P2 y P3: Es fcil ver que es imposible representar en un plano puntos separados por estas distancias porque si P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.9, no hay manera de ubicar un punto P3 que est a 0.5 de P1 y a 0.3 de P2.
D# 0 0.9 0.5 0.9 0 0.3 0.5 0.3 0
I
C
P1------------------------------------P2 P1---------------P3? P3?---------P2 Se van a considerar, por ahora, distancias como las del ejemplo (i). Esto es, distancias para las que se puedan encontrar puntos que reproduzcan esas distancias. Otro aspecto a considerar es el nmero de coordenadas necesarias para representar esos puntos. Es intuitivo que si slo hay dos muestras a una distancia dada se pueden graFDU HQ XQD UHFWD GLPHQVLyQ VL KD\ WUHV PXHVWUDV \D VH YLR TXH VH SXHGHQ JUDFDU HQ un plano (dimensin = 2); si se tuvieran cuatro muestras seran necesarias tres coordenadas GLPHQVLyQ \ VL VH WLHQHQ 1 PXHVWUDV VH QHFHVLWDUiQ HQ JHQHUDO 1 FRRUGHQDGDV &RQ OR FXDO VL VH TXLHUHQ JUDFDU PXHVWUDV sern necesarias 39 coordenadas!!! Es evidente que esto no es cmodo si el obMHWLYR HV REWHQHU XQD UHSUHVHQWDFLyQ JUiFD GH los puntos o muestras. Lo ideal sera obtener GRV FRRUGHQDGDV SXHV VH SRGUtDQ JUDFDU HQ XQ SODQR R ELHQ WUHV SDUD JUDFDU HQ WUHV GLmensiones. El problema, entonces, es encontrar las dos mejores coordenadas ( las tres mejores) para obtener esta representacin. Ese es el objetivo del Anlisis de Coordenadas Principales (ACOOP): encontrar las k mejores coorde-
0.5 0.3 C 0.1 -0.1 -0.3 -0.5 -1.0 B A
II
-0.5
0.0
0.5
1.0
0.5 0.3 0.1 -0.1 C -0.3 -0.5 -1.0 A B
III
-0.5
0.0
0.5
1.0
Coordenadas de A, B y C: I: (1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179) II: (0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111, 0.179) III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,0.179).
nadas para las muestras de manera tal que si se calculan las distancias eucldeas entre ellas reproduzcan lo mejor posible una matriz de distancias dada. Habitualmente k = 2 3, a stas VH ODV OODPD &RRUGHQDGDV 3ULQFLSDOHV 1DWXUDOmente se perder la informacin de las restantes coordenadas. Como se mostr en el ejemplo (i) hay muchas representaciones posibles. Ah se han dado tres pero se podran haber dado muchas ms. Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estn centrados en el origen, como en II III. Se explicar el mtodo de obtencin de las Coordenadas Principales partiendo de una matriz de Asociacin S. En este caso las distancias TXH VH YDQ D UHSURGXFLU VRQ ODV GHQLGDV SRU d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij (1)
donde Six HV HO SURPHGLR GH OD OD i de S, Sx j es el promedio de la columna j y Sxx es el promedio de todos los elementos de S. En el PASO 2 se encuentran: D XQD PDWUL] 1u1 GRQGH FDGD FROXPQD HV un vector de longitud uno. Son los autovectores. E 1 Q~PHURV RUGHQDGRV HQ IRUPD GHFUHciente: los autovalores. Estos elementos son caractersticos de cada matriz S0. Por eso tambin se los conoce como vectores y valores caractersticos. Cada autovector est asociado a un autovalor. Si la matriz de distancias es representable (como la del ejemplo (i) los autovalores sern positivos o ceros (el ms chico es siempre cero para estas matrices representables). En el PASO 3, si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores y se multiplican por la raz del autovalor respectivo. El primer autovector da la primera coordenada de todas las muestras, el segundo la segunda coordenada y as siguiendo hasta la k-sima. Si VyOR VH GHVHDQ GRV FRRUGHQDGDV SDUD JUDFDU los puntos en un plano se toman los dos primeros autovectores (k=2). En la Tabla 3 se presenta un ejemplo sencillo. (O JUiFR FRUUHVSRQGLHQWH HV HO *UiFR ,, que se mostr ms arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la muestra 3. Las distancias (2) calculadas a partir de la matriz de asociacin S dan la matriz de Distancias D. Por esa razn ambas matrices tienen la misma representacin.
2 d12
donde Sij es la asociacin entre la muestra i y la j. Si la asociacin de una muestra consigo misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con la mayora de los ndices, la ecuacin se reduce a: d2(i, j) = 2(1- Sij ). (2)
Se detallarn los pasos que se deberan realizar para hacer este anlisis al simple efecto de poder manejar con idoneidad los programas estadsticos de que se dispongan. Los pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos programas. El usuario deber, fundamentalmente, indicarle qu asociacin o distancia desea calcular y cuntas coordenadas quiere. PASO 1) Centrar doblemente la matriz S o S0. PASO 2) Calcular los autovalores y autovectores de S0. PASO 3) Calcular las coordenadas de los puntos representativos de las muestras. PASO 4 *UDFDUORV El PASO 1 WLHQH FRPR Q KDFHU TXH ORV SXQtos resultantes estn centrados. Cada elemento de la matriz de asociacin S se centra por ODV \ SRU FROXPQDV
2(1 S12 )
2(1 0.5) 1 d12
2 d13 2(1 S13 ) 2(1 0.9) 0.2
d13 0.447
0.707
d2 23
2(1 S23 )
2(1 0.75) 0.5 d 23
0 Sij
Sij Six Sx j Sxx
(3)
2%6(59$&,1 &RPR HQ HO HMHPSOR VyOR hay tres muestras los autovectores tienen tres componentes. Si se trabajara con una matriz de asociacin entre 40 muestras, los autovec-
tores tendran 40 componentes, una por cada muestra. 2%6(59$&,1 3DUD OD PDWUL] 6 VH KDQ reconstruido totalmente las distancias porque VyOR VRQ WUHV PXHVWUDV 6L KXELHUD PiV 1 por ejemplo) slo se reconstruiran totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si slo se usan las dos primeras se reconstruye, en general, slo un porcentaje de las distancias. Hay dos tipos de porcentajes que se pueden calcular: Porcentaje de Dispersin:
En este algoritmo se ve que lo que se est comparando son las asociaciones originales, 0 0* sij , con las reconstruidas, sij , una a una. Para el clculo de 2 se usa la primera frmula por lo que el lector no debe traumatizarse con la segunda.
0.2111 0.239 0.028 0.239 0.3111 0.072 0.028 0.072 0.0444
0.5 0.9 1 S 0.5 1 0.75 0.9 0.75 1
Doble S centrado
Autovalores de S0: O1 = 0.5167 O2 = 0.05 O3 = 0
D1
O1 O 2 u100% O1 O N
si slo se usan dos coordenadas. Este porcentaje se interpreta teniendo en cuenta que: 1 O1 + ... + O1 ) =
v1
v3
Autovectores de S0 : Columnas de
2 ij
, sumando sobre todos los pares de muestras. En cambio, la suma del cuadrado de las distancias reconstruidas con las dos coordenaGDV HV LJXDO D 1 O1 + O2). Por lo tanto, este porcentaje mide cunto se reconstruye del cuadrado de todas las distancias. Si se usan ms de dos coordenadas se van sumando los autovalores correspondientes en el numerador. En nuestro ejemplo: D1 = 100% Porcentaje de Distorsin:
0.6173 V 0.7716 0.1543
0.5344 0.2674 0.8019
0.57735 0.57735 0.57735
Primeras 2 Coordenadas:
O1 v1
Muestra 1 0.4437 Muestra 2 -0.5546 Muestra 3 0.1109
O 2 v2
-0.1195 -0.0598 0.1793
D2
2 2 O1 O 2 u100% 2 O1 O 2 N
Tabla 3. Clculo de autovalores y autovectores para HO JUiFR GH FRRUGHQDGDV SULQFLSDOHV
Este valor mide cunto se acercan los valores de la matriz de asociacin reconstruida respecto de la matriz de asociacin original S0. Ms exactamente:
S0 S0* 1 2 S0
2
D2
u100%
0 0* (sij sij ) 2 1 u100% 0 2 (sij )
2%6(59$&,1 6L VH KXELHUDQ REWHQLGR autovalores negativos la primera medida no es recomendable. Hasta podra darse el caso que 1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por otro lado, no se podran calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se puede calcular
Oi
La aparicin de autovalores negativos no es necesariamente un problema grave para la representacin siempre que los autovalores negativos sean pocos y pequeos. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO 2 se obtendrn 50 autovalores, de los cuales uno, seguramente, es cero. Para la representacin en el plano se usan slo los dos primeros. Si los ltimos 10 son negativos no se vern afectados los clculos de las coordenadas. Hay asociaciones y distancias que nunca dan autovalores negativos, entre ellos se enFXHQWUDQ -DFFDUG 2FKLDL 5XVVHOO \ 5DR 6LPple Matching y la distancia eucldea. Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son:
Por otro lado, tambin es lcito cambiar, por alguna razn, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser til cuando se quieren comparar Anlisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjuntos de muestras. Ejemplo: Presentamos la caracterizacin de 8 cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentacin mediante anlisis izoenzimtico de semillas de Amaranthus. Estas accesiones pertenecen a siete especies: A. caudatus, A. cruentus, A. hypochondriacus, A. mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus 'L 5HQ]R et al., 2001). Del total de 43 cultivares, 31 fueURQ SROLPyUFRV FRQ VLVWHPDV LVRHQ]LPiWLFRV (Tabla 4). Se aplic anlisis de coordenadas principales a los datos de presencia/ausencia GH ODV EDQGDV SROLPyUFDV (Q OD JXUD SXHde observarse el nivel de diversidad gentica dentro de este germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este anlisis agrup la mayora de los cultivares de acuerdo a su FODVLFDFLyQ WD[RQyPLFD \ PRVWUy TXH H[LVten relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el anlisis isoenzimtico de semillas fue efectivo para caracterizar los cultivares destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus.
sij
2 d ij
(4)
y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores. 2%6(59$&,1 &DGD DXWRYHFWRU GH 60 es un vector de longitud 1 en una cierta direccin. Pero por cada direccin podemos tener dos vectores: v y -v. Por ejemplo:
v2
0.5344 0.2674 0.8019
v2
0.5344 0.2674 0.8019
A.cruen. 0.6
A.hypoch
A.caudat.
A.manteg.
A.dubius
A.tricolor
A.hybrid.
38-39 40-43 0.4
Cualquiera de estos dos vectores pueden usarse como segundo autovector y, ms aun, algunos programas pueden dar como resultado el primero y otros el segundo. Como conseFXHQFLD GH HVWD VHOHFFLyQ VH REWHQGUi HO JUico II el III. Se ve que el nico efecto de usar XQR X RWUR YHFWRU HV XQD UHH[LyQ GHO JUiFR respecto del primer eje. Si se cambia el signo de v1 VH REWHQGUi XQD UHH[LyQ UHVSHFWR GHO VHJXQGR HMH 1LQJXQR GH HVWRV FDPELRV PRGLFD OD GLVWDQFLD HQWUH ORV SXQWRV 1R GHEH FDXVDU VRUSUHVD HQWRQFHV TXH FRQ XQ SURJUDPD VH REWHQJD XQ JUiFR \ FRQ RWUR HO PLVPR JUiFR SHUR FRQ XQD UHH[LyQ VREUH uno u otro eje, o sobre los dos.
6-9-10-11 2 0.2 14 5 0.0 12 15 7 8 29-30 31 3 28 1 35 13 34 27 4
41 42
37
17 36
-0.2
18-22 32-33
20 16 25 26 21 23 24
19
-0.4
-0.6 -0.6
-0.4
-0.2
0.2
0.4
0.6
Al slo efecto de que el lector pueda repasar algunos clculos en la Tabla 5 se dan los primeros diez elementos de los dos primeros autovectores y las dos primeras coordenadas principales.
6 Anlisis de agrupamientos (cluster) Esta tcnica tiene como objetivo formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que sean similares entre s y diferentes a los elementos de los otros grupos. (O SULPHU SUREOHPD HV MDU HO FULWHULR SDUD GHcidir cundo dos elementos son similares. Si se WXYLHUD XQ PD]R GH FDUWDV FyPR IRUPDU JUXSRV" SRU HO YDORU GH OD FDUWD" SRUTXH FRPparten el palo?. Segn el criterio que se aplique los grupos que se formen sern distintos. En la seccin anterior hemos visto distintas PDQHUDV GH GHQLU OD VLPLOLWXG R GLVLPLOLWXG HQtre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no se han presentado aqu, plantean distintos formas de medir la similitud entre los elementos a agrupar. Existen, adems, muchos mtodos para formar los grupos. Uno de los ms usados son los agrupamientos jerrquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez ms pequeos. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos como elementos se tienen y se van agrupando segn su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro PpWRGR VH SXHGHQ UHSUHVHQWDU HQ XQ JUiFR denominado dendrograma. En esta seccin se tratarn solamente los mtodos jerrquicos aglomerativos. $TXt VH SODQWHD XQ VHJXQGR SUREOHPD 4Xp tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una vez realizado el primer agrupamiento, cmo se GHQH OD GLVWDQFLD HQWUH HVH JUXSR \ ORV UHVWDQtes elementos?. Supongamos que en un primer paso se han agrupado los elementos A y B porque son los que presentan la menor distancia entre s. La distancia entre el nuevo grupo AB y otro elePHQWR & VH SXHGH GHQLU VHJ~Q GLVWLQWRV FULterios:
LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mn {d(A, C), d(B, C)}, LIGAMIENTO COMPLETO: d(AB,C) = mx {d(A, C), d(B, C)}, LIGAMIENTO PROMEDIO: d({A,B},C) =
el elemento elemento C y cada elemento del grupo formado AB. En cambio, el ligamiento FRPSOHWR OD QXHYD GLVWDQFLD VH GHQH WRPDQGR la mxima distancia entre C y cada elemento del nuevo grupo. Si A, B y C fueran grupos formados en pasos anteriores, se usan los mis1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 5 6 9 10 11 12 13 14 15 19 16 20 21 28 27 1 2 3 23 24 25 26 29 30 31 32 33 18 22 7 17 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 4 8
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
Tabla 4. Matriz de datos de anlisis isoenzimtico de 8 cultivares de Amaranthus.

V1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -0.127 -0.107 -0.123 -0.005 -0.220 -0.232 -0.125 -0.125 -0.232 -0.232 ... V2 0.031 0.137 0.091 0.074 0.070 0.162 -0.112 -0.097 0.162 0.162 ... CP1 -0.279 -0.235 -0.270 -0.010 -0.483 -0.509 -0.273 -0.274 -0.509 -0.509 ... CP2 0.055 0.246 0.163 0.134 0.126 0.291 -0.202 -0.174 0.291 0.291 ...
Autovalores: 4.81258 3.22431 1 = 46.85 2 = 78.2
d(A, C) d(B, C) 2
En el caso del ligamiento simple, la nueva GLVWDQFLD VH GHQH HV OD PtQLPD GLVWDQFLD HQWUH
Tabla 5. 5HVXOWDGRV GH DXWRYHFWRUHV \ FRRUGHQDdas principales del anlisis isoenzimtico de 8 cultivares de Amaranthus.
AE B C D F
AE 0 1 1.41 1.15 1.1

AE BF C D
B 1 0 1.29 1.10 0.93

AE 0 1 1.41 1.15
C 1.41 1.29 0 1.26 1.07
D 1.15 1.10 1.26 0 1.22
F 1.1 0.93 1.07 1.22 0

D 1.15 1.10 1.26 0 D 1.10 1.26 0 D 1.10 0
BF 1 0 1.07 1.10 AEBF AEBF 0 C 1.07 D 1.10
C 1.41 1.07 0 1.26 C 1.07 0 1.26 AEBFC AEBFC 0 D 1.10
AE BF C D
AE 0 1.1 1.41 1.15

AEBF C D
BF C D 1.1 1.41 1.15 0 1.29 1.22 1.29 0 1.26 1.22 1.26 0 AEBF C D 0 1.41 1.22 1.41 0 1.26 1.22 1.26 0 AEBFD C AEBFD 0 1.41 C 1.41 0
BF 1.05 0 1.18 1.16
AEBF 0 1.295 1.155
AE BF C D
AE 0 1.05 1.41 1.15

AEBF C D
C 1.41 1.18 0 1.26

C 1.295 0 1.26
D 1.15 1.16 1.26 0

D 1.155 1.26 0
AEBFD C
AEBFD C 0 1.277 1.277 0
Tabla 6. Diferentes clases de agrupamiento en base a la matriz de distancias.
mos algoritmos en el caso del ligamiento simple o completo. Para el ligamiento promedio hay que promediar todas las distancias entre elementos de AB y de C: donde dij es la distan-
d
d(AB, C)
i, j
ij
n AB n C
cia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; nAB y nC son los nmeros de elementos en el grupo AB y C, respectivamente.
Este ligamiento promedio se conoce tamELpQ SRU ODV VLJODV 83*0$ 8QZHLJKWHG 3DLU *URXSV 0HWKRG ZLWK $ULWKPHWLF $YHUDJHV Consideremos el ejemplo de la Tabla 6. Primero se realizar un agrupamiento aplicando ligamiento simple. En primer lugar se agrupan los elementos A y E porque estn a menor distancia (son iguales). Formado ese primer grupo habra que calcular las nuevas distancias del grupo AE a los restantes elementos pero como d(A, U) = d(E, U) para todos los restantes elementos U se mantienen esas distancias.
En el segundo paso se observa que la menor distancia es la de B a F; se forma ese grupo y se recalculan las distancias del nuevo grupo a ORV UHVWDQWHV < DVt KDVWD TXH VH KDQ DJUXSDGR WRGRV 7DPELpQ VH SXHGH GHWHQHU HO SURFHVR jando algn otro criterio para ello. Por ejemplo, cuando se ha alcanzado una GLVWDQFLD Pi[LPD MDGD SUHYLDPHQWH A continuacin se aplica el ligamiento completo. Los dos primeros agrupamientos coinciden en este ejemplo, por lo que slo se muestran los tres ltimos pasos. Por ltimo se ven los pasos cuando se aplica un ligamiento promedio. Los mismos mtodos se pueden aplicar sobre matrices de asociacin cambiando los conceptos de "menor distancia" por el de "mayor asociacin". En general, el ligamiento simple produce agrupamientos en cadena: a los grupos formados inicialmente se van acoplando los restantes elementos. En cambio, el ligamiento completo tiende a generar muchos grupos chicos que se reunirn en los ltimos pasos. El anlisis de Agrupamientos slo debe tomarse como un mtodo exploratorio. Si originalmente los datos forman grupos bien separados cualquier mtodo de agrupamiento dar, aproximadamente, los mismos resultados. Pero si las muestras forman un continuo, cada mtodo y cada medida de distancia pueden conducir a resultados muy dispares. En este caso las conclusiones deben realizarse con cautela. A veces es conveniente realizar un Anlisis de Coordenadas Principales para determinar si H[LVWHQ JUXSRV FODUDPHQWH GHQLGRV R QR
&DYDOOL6IRU]D // (GZDUGV $:) 3K\ORgenetic analysis: models and estimation procedures. Am J Hum. Gen 19: 233-257. 'L 5HQ]R 0 %RQDPLFR 1 *HVXPDULD - Characterisation of amaranth accessions by isozymic patterns. Seed Sci Technol 29 (1): 227-238. Everitt, B.S.; Dunn, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. +DLU -) $QGHUVRQ 5( 7DWKDP 5/ %ODFN :& 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. PrenWLFH +DOO 8SSHU 6DGGOH 5LYHU 1HZ -HUVH\ +LOOLV ' 0LVXVH DQG PRGLFDWLRQ RI 1HL
V JHnetic distance. Syst Zool 33: 238-240. Manly, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. 1HL 0 *HQHWLF GLVWDQFHV EHWZHHQ SRSXODWLRQV $P 1DW 1HL 0 (VWLPDWLRQ RI DYHUDJH KHWHUR]\JRVLW\ and genetic distance from small number of individuals. Genetics 76: 379-390. 5HQFKHU $& 0HWKRGV RI 0XOWLYDULDWH $QDO\VLV - :LOH\ 6RQV ,QF 1HZ <RUN
PARTE III Mtodos para acelerar programas de mejoramiento H LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO
III. CAPTULO 1 Obtencin de Plantas Doblehaploides

Polci, Pablo; Conti, Vernica; Miranda, Rubn; Gear, Nicols
1 Introduccin Comentarios generales sobre los haploides Para referirnos al trmino haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha GHQRPLQDFLyQ \ GHQLU DOJXQRV FRQFHSWRV Eisicos sobre el tema. Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie, no estaramos incluyenGR HQ HVWD FODVLFDFLyQ D DTXHOORV LQGLYLGXRV derivados de especies poliploides, cuya constitucin gentica es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un autopoliploide AAAA (2n = 4x) dara lugar a individuos haploides AA (n = 2x), que por tener dos juegos cromosmicos (AA) no podran ser LQFOXLGRV HQ OD GHQLFLyQ 3RU OR WDQWR XQD VRlucin sera denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamando polihaploides a aquellos individuos con una composicin cromosmica igual que la gamtica normal de la especie, que tengan dos o ms juegos cromosmicos (n > x). Otra posibilidad sera considerar el trmino haploide en un sentido ms amplio, comprendiendo en ste a todos los individuos que posean una constitucin cromosmica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaramos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. De aqu en adelanWH D ORV QHV SUiFWLFRV \ HQ FRQFRUGDQFLD FRQ OD VHJXQGD GHQLFLyQ QRV UHIHULUHPRV DO WpUPLno haploide indistintamente del nivel de ploida de la especie en cuestin, como a aquellos individuos que poseen la mitad del nmero cromosmico normal contenido en las clulas somticas de la especie.
,GHQWLFDFLyQ GH +DSORLGHV Varios procedimientos facilitan la bsqueda de haploides en muestras grandes en nmero de individuos. Algunos de ellos son: Morfologa: las plantas haploides son, en general, ms pequeas que las diploides, tanto en sus partes vegetativas FRPR RUDOHV (VWR VH GHEH SULQFLSDOmente a la disminucin en el tamao de VXV FpOXODV (V OyJLFR SHQVDU TXH HO IHnotipo ms pequeo de las plantas puede ser una primera aproximacin en la bsqueda de haploides. Si esta disminucin de tamao fuera notable en las semillas, sera muy fcil realizar una seleccin mecnica, aunque esto sucede en pocas especies. Poliembriona: la presencia de poliembriona facilita la deteccin de embriones haploides. No obstante, debe realizarse HO FRQWURO FLWROyJLFR FRUUHVSRQGLHQWH (O porcentaje de embriones gemelos observados vara con la especie y el genotipo. Genes marcadores FRQ HVWH Q SXHGH utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean IiFLOPHQWH GLVWLQJXLEOHV (Q OD SUiFWLFD conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula y de esta manera hacer una seleccin ms econmica en WLHPSR \ HVIXHU]R 3DUD LGHQWLFDU KDploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia ser heterocigota (diploide), con fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo seran haploides, obtenidos por partenognesis o andrognesis, segn sea el fenotipo recesivo materno o paterno, respectivamente. Antecedentes (O YDORU GH ORV KDSORLGHV VH FRQRFH GHVGH 1922, cuando se descubri la produccin espontnea de los mismos, siendo superior a cien el nmero de especies vegetales capaces de producirlos in-vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja, con valores que van de 0,001 a 0,01%. (QWUH ORV FDVRV GH haploida espontnea es comn la poliembriona, que, con una gran va-
riacin entre los distintos genotipos, ocurre en una amplia gama de especies, gneros y famiOLDV (Q HVWRV FDVRV HV IUHFXHQWH OD DSDULFLyQ de haploides procedentes de una sinrgida del saco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las clulas antpodas degeneran antes de la fecundacin. (Q *XKD \ 0DKHVKZDUL GHVFXEULHURQ que las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in-vitro. (VWH SURFHVR FRQUPDGR SRVWHULRUPHQWH SRU 1LWVFK \ 1LWVFK HQ WDEDFR VH KD XWLOLzado para producir haploides en numerosas HVSHFLHV (Q HO FDVR GH Datura innoxia, las frecuencias de induccin son casi del 100% y el rendimiento es de ms de mil plntulas o callos SRU DQWHUD HQ FRQGLFLRQHV ySWLPDV JXUD (Q HVWXGLRV GH DQGURJpQHVLV in-vitro se ha detectado especial facilidad para regenerar haploides a partir de anteras aisladas o de granos de polen en miembros de la familia de las solanceas Tambin se han encontrado resultados sorprendentes en numerosos gneros de las crucferas, gramneas y ranunculceas, aunque resulta comn observar diferencias signiFDWLYDV LQFOXVR GHQWUR GH XQ PLVPR JpQHUR No se ha logrado, sin embargo, el mismo xito en especies arbreas y arbustivas.
Figura 1. Obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras.
Importancia de los haploides y aplicaciones en el mejoramiento vegetal Los mtodos tradicionales para el mejoramiento vegetal han sido practicados por cientos de aos. Actualmente se ha llegado a una etaSD HQ GRQGH HVWRV PpWRGRV VRQ LQVXFLHQWHV
para hacer frente a las demandas mundiales de produccin. A pesar de que cada ao se liberan al mercado numerosas variedades, estas no persisten demasiado. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrn ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad geQpWLFD TXH SXHGD VHU XWLOL]DGD FRQ HVWRV QHV y que existan mtodos que acorten el tiempo necesario para la obtencin de variedades. (O DGYHQLPLHQWR GH ODV WpFQLFDV ELRWHFQROygicas y los avances en biologa molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. (QWUH pVWDV OD SURGXFFLyQ GH KDSORLGHV \ GRblehaploides son herramientas interesantes ya que permiten acortar el tiempo requerido para la obtencin de nuevas variedades, siendo un buen complemento para los programas de mejora tradicionales. Al carecer de genotipos heterocigotas, las poblaciones doblehaploides (DH) necesarias para encontrar genotipos raros pueden ser mucho menos numerosas, especialmente en el caso de caracteres recesivos, ya que stos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Las poblaciones DH, si se las compara con poblaciones segregantes, presentan mayor variacin gentica aditiva y ausencia de varianza gentica debida a la dominancia. (V GHFLU TXH FXDQGR VH XWLOL]DQ SREODFLRQHV GRblehaploides se eliminan las complejidades del estado heterocigota y se facilita enormemente el anlisis gentico. De esta manera pueden distinguirse las mutaciones recesivas de forma inmediata, haciendo que el proceso de seleccin sobre una poblacin de haploides resulte PiV HFLHQWH JXUD La produccin de haploides es una alternativa biotecnolgica de gran importancia y ha resultado exitosa en varios cultivos, entre ellos cebada, arroz, maz y trigo. Un sistema de produccin de DH debe cumplir con tres requisitos bsicos para su utilizacin en programas de mejoramiento: 1. 'HEH SURGXFLU OtQHDV '+ HFLHQWHPHQWH D partir de todos los genotipos. 2. Los DH obtenidos deben ser normales y estables. 3. stos deberan representar una muestra al azar del conjunto de gametos parentales. (QWUH ODV DSOLFDFLRQHV PiV LPSRUWDQWHV GH los doblehaploides en el mejoramiento vegetal podemos citar:
Figura 2. Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento FXDQGR ORV FXOWLYDUHV SDUHQWDOHV GLHUHQ WHyULFDPHQWH HQ dos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemplo el doble recesivo aabb, por autofecundacin convencional VH WLHQH XQD SUREDELOLGDG GH GH HQFRQWUDUOR 6L VH LQduce haploida, el mismo genotipo tendr una probabilidad de ocurrencia de 1/4 porque no se producirn los genotipos heterocigotas.
1. Acortamiento de los programas de mejora: el desarrollo de nuevos cultivares por los mtodos tradicionales actuales comprende tres etapas fundamentales: a) generacin de variabilidad gentica, ya sea por medio de hibriGDFLRQHV VH[XDOHV LQWUD H LQWHUHVSHFtFD SRU induccin de mutaciones, o por transformacin gentica; b) recuperacin de progenies homocigotas a travs de generaciones repetidas de autofecundacin o retrocruzamiento, seleccionando a favor de los caracteres de inters; c) evaluacin del comportamiento de los nuevos materiales en ensayos comparativos a campo. (VWRV SDVRV VRQ EiVLFRV HQ XQ SURJUDPD GH mejora, pudiendo existir otras etapas en funcin del modo reproductivo de la especie. As por ejemplo, el tiempo requerido para la obtencin de un nuevo cultivar de trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez aos, a WUDYpV GHO PHMRUDPLHQWR WUDGLFLRQDO JXUD La biotecnologa se presenta como una alternativa atractiva, no slo para reducir el tiempo de obtencin de los genotipos deseados, sino tambin para lograr una economa de mano de obra y espacio en el campo experimental.
(Q ODV SODQWDV autgamas, con los mtodos convencionales de mejoramiento, la homocigosis prctica se logra recin luego de seis a ocho generaciones de autofecundacin. Mientras que con una tcnica de produccin de haploides seguida de duplicacin cromosmica, es posible llegar a homocigosis completa en solo una generacin. (Q ODV SODQWDV algamas, la produccin de homocigotas resulta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinizacin cruzada se favorece naturalmente la heterocigosidad, y, de ser posible la autofecundacin, la obtencin de KRPRFLJRWDV VH YH GLFXOWDGD SRU OD endogamia. (Q SODQWDV bulbosas, rboles frutales y forestales la homocigosis juega un rol muy importante en el aceleramiento de los programas de mejora. Debido al prolongado tiempo requerido para alcanzar la fase adulta, el proceso de mejora resulta extremadamente largo, an siendo posible la autopolinizacin.
2. Generacin de poblaciones de mapeo: para el mapeo gentico de plantas, diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas. La seleccin del tipo de poblacin a usar se realiza en funcin de los objetivos de la investigacin y del tiempo y recursos disponibles. Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de informacin son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos individuos homocigoWRV FRQWUDVWDQWHV (Q ODV SODQWDV ) REWHQLGDV el desequilibrio de ligamiento es mximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas ) SURFXUDQ H[SORUDU HVWH GHVHTXLOLEULR 3DUD especies de autofecundacin o que toleran la autofecundacin pueden utilizarse poblaciones ) )Q 5,/V Recombinant Imbred Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad gentica entre los progenitores OXHJR GH RFXUULGD XQD VROD PHLRVLV ) \ VRQ especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL (Quantitative Trait Locus), ya
Figura 3. Representacin esquemtica de los pasos requeridos para la obtencin de lneas puras en un programa de mejoramiento tradicional.
que al obtenerse genotipos 100% homocigotas se dispone de poblaciones estables o inmortales de mapeo, permitiendo analizar la misma poblacin en diferentes aos y localidades, debido a la constante disponibilidad de semilla. 3. Estudio de especies poliploides: la induccin de haploides en plantas poliploides facilita el trabajo de investigacin y mejora, ya que permite manejar niveles de ploida menores para los estudios de herencia y la combinacin de caracteres de inters. 4. Fusin de protoplastos: al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtencin de XQ KtEULGR LQWHUHVSHFtFR R LQWHUJHQpULFR VLHQdo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridacin somtica. 5. Variacin gametoclonal: la andrognesis in-vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel esporoftico, la variacin debida a recombinacin y segregacin meitica. Las variantes gametoclonales expresan el carcter recesivo en la R0, a diferencia de las somaclonales, que requieren de autofecundacin y anlisis de progenie. Algunos logros de esta tcnica: )UXWRV GH WRPDWH FRQ PD\RU FRQWHQLGR GH slidos. Plantas enanas de arroz con granos ms largos y con elevados niveles de protenas de reserva y ms macolladoras. Plantas de Datura innoxia con contenidos ms elevados de alcaloides en las hojas. Plantas de tabaco con mayor resistencia
a bajas temperaturas. Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del cido ercico en ODV KRMDV (VWH DFHLWH VH XVD FRPR OXEULcante en la industria. 6. Mutagenesis: si se aplica mutagnesis a un sistema de haploides, se obtienen mutantes slidos, logrndose la homocigosis del mutado rpidamente luego de la duplicacin FRQ FROFKLFLQD (QWUH ORV DJHQWHV PXWDJpQLFRV ms frecuentemente utilizados se encuentra la 1PHWLO1QLWURVXUHD P0 ORV UD\RV krad) y el etil metil sulfonato. 7. Transformacin gentica: rige el mismo principio que para mutagnesis. La transformacin de haploides permite la obtencin del transgn en homocigosis luego de la duplicaFLyQ FRQ FROFKLFLQD 3XHGH UHDOL]DUVH FRQ 3(* (polietilenglicol), microinyeccin o utilizando Agrobacterium tumefaciens. 8. Produccin de plantas homogamticas: $VSDUDJXV RIFLQDOLV es una especie cultivada, dioica, en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. De esta manera, para obtener una poblacin de plantas deben cruzarse ambos tipos, lo que dar una SURJHQLH FRQVWLWXLGD SRU GH SODQWDV ;; \ GH SODQWDV ;< 6LQ HPEDUJR GHVGH HO punto de vista del productor, es deseable la obtencin de una poblacin constituida solamente por plantas XY, que tienen un menor conteQLGR GH EUD \ VRQ SRU OR WDQWR SUHIHULGDV SRU los consumidores. Para solucionar este problema y obtener 100% de plantas masculinas se ide un sistema que consiste en el cultivo de anteras y diploidizacin de plantas YY, llamadas supermachos. La ventaja de estas plantas es que, al ser cruzadas con plantas XX darn 100% de plantas XY, como se muestra en el esquema 1. Con este sistema, en 1990 fue liberada una variedad llamada Andrea (un hbrido obtenido como se mencionara anteriormente). Andrea es una variedad muy homognea, de alto rendimiento y de excelente calidad. 2EWHQFLyQ GH +DSORLGHV Como se mencionara anteriormente, las plantas haploides aparecen en muy baja frecuencia en la naturaleza, siendo necesaria la
Progenitor masculino XY Formacin de gametos X Plantas haploides X Homocigotos, hembra y supermacho Y Duplicacin cromosmica Y Cultivo de anteras
XX
YY
Gametos
Formacin de gametos
XY Hbrido
Esquema 1.
posterior ocurrencia de duplicacin cromosmica para la obtencin de semillas. Por ello, la SURGXFFLyQ DUWLFLDO GH KDSORLGHV UHVXOWD VLHPpre ms efectiva. - Origen de los haploides I. Ginognesis: desarrollo de un gameto femenino no fecundado. Se logra por: 1. &DVWUDFLyQ \ DLVODPLHQWR GH ODV RUHV Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum. 2. Polinizacin retrasada: la castracin de ODV RUHV \ OD SRVWHULRU SROLQL]DFLyQ HQ HO lmite de la madurez receptiva del estigPD SHUPLWHQ REWHQHU KDVWD XQ GH haploides en trigo. Presencia de dos clulas espermticas con diferente velocidad de desarrollo: el mecanismo involucrado en la generacin de haploides estara basado en la falta de fertilizacin de la oosfera durante la doble fertilizacin. 4. Polinizacin con polen inviable: a) utilizando polen extrao (tpico de cruzaPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV LQFDSD] GH IH-
cundar a la especie en cuestin, puede servir de estmulo para inducir haploida, como sucede en el cruzamiento entre Solanum tuberosum x S. phureja (papa VLOYHVWUH (O SROHQ GH OD SDSD VLOYHVWUH contiene slo un ncleo generativo, producto de una gametognesis anormal, por lo cual la fertilizacin doble no logra producirse, pero se forman embriones haploides por partenognesis; b) utilizando polen previamente irradiado. &XOWLYR GH RYDULRV SXHGH VHU HFD] SDUD obtener haploides a partir de cruzamienWRV LQWHUHVSHFtFRV ,I. Andrognesis: desarrollo de un gameto masculino. Se logra por: 1. Cultivo de anteras: se ha inducido haploida en mono y dicotiledneas, siendo PiV IiFLO HQ ODV ~OWLPDV (V XQD WpFQLFD simple que, dependiendo del genotipo y de las condiciones de cultivo permite obtener elevados nmeros de plantas en tiempos relativamente cortos. Ha sido ms difcil en los cereales, no obstante se obtuvieron haploides de arroz, trigo,
FHEDGD FRQ GLIHUHQWHV JUDGRV GH GLFXOtad. 2. Cultivo de microsporas: en 1974 Nitsch indujo la regeneracin de plantas haploides de Nicotiana terbium y Datura inoxia a partir de cultivos en suspensin de microsporas, previo choque trmico a baja WHPSHUDWXUD GH ODV RUHV (VWH PpWRGR tiene la ventaja de producir haploides masivamente (ms de 7000 plantas por ERWyQ RUDO HQ WDEDFR \ GH SHUPLWLU OD aplicacin de diferentes tratamientos a las microsporas como transformacin o mutagnesis para luego obtener plantas por embriognesis partiendo de una nica clula inicial. Para conseguir diferenciar plantas a partir de microsporas es necesario quebrar el mecanismo responsable de la asimetra en la primera mitosis del polen. 7pFQLFD GH JDPHWRWR LQGHWHUPLQDGR (ig HQ - / .HUPLFOH GHVDUUROOy XQD tcnica en maz basada en la ocurrencia de una mutacin espontnea, encontraGD HQ OD OtQHD : (O JHQ ig provoca una GLVUXSFLyQ HQ HO GHVDUUROOR GHO JDPHWRWR femenino, generando, luego del proceso de polinizacin, que los ncleos espermticos ocasionalmente se desarrollen DQGURJHQpWLFDPHQWH (O GHVDUUROOR HPbrionario de los ncleos espermticos en el citoplasma materno resulta en la formacin de haploides androgenticos, o haploides paternos. III. A partir de alguna clula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinrgidas o antpodas). ,9 &UX]DPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV R LQWHUgenricos con eliminacin cromosmica: se produce la fertilizacin de manera de que se forme un cigoto diploide, que a lo largo de las sucesivas divisiones mitticas, va perdiendo el genoma del individuo que aport el gameto masculino, como sucede en los cruzamientos entre Hordeum vulgare y H. bulbosum. V. Interaccin ncleo-citoplasma: utilizando lneas de sustitucin y restauracin nuclear se encontr que los individuos con citoplasma de Aegilops caudata y ncleo de Triticum aestivum o Triticale mostraban una frecuencia de
KDSORLGtD GHO \ GHO UHVSHFWLYDPHQWH (VWR VH GHEH D TXH FLHUWDV LQWHUDFFLRQHV HQtre un citoplasma y un ncleo extrao inducen haploida. VI. Semigamia: el ncleo del gameto masculino penetra en la ovoclula pero sin fusionarse con el ncleo femenino. Ambos ncleos comienzan a dividirse independientemente, produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno. - Mtodos ms utilizados para la obtencin de plantas haploides (QWUH ORV PpWRGRV GLVSRQLEOHV DFWXDOPHQWH para la obtencin de doblehaploides, los ms XWLOL]DGRV VRQ OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD H intergenrica, la andrognesis, y recientemente la ginognesis en maz. I. Cultivo de Anteras: consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de induccin donde las microsporas competentes originarn callos, que sern luego transferidos a un medio DSURSLDGR SDUD OD UHJHQHUDFLyQ GH SODQWDV JXUD (Q DOJXQDV HVSHFLHV GH GLFRWLOHGyQHDV el nmero de plantas obtenidas por cada cien DQWHUDV FXOWLYDGDV HV PX\ HOHYDGR (Q FDPELR en las gramneas la tcnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en los mtodos de cultivo in-vitro durante las ltimas dcadas han permitido obtener buenos resultados con JUDPtQHDV JXUD D~Q HQ DTXHOODV FRQVLGHradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad andrognica, puede ser evaluada a travs de la produccin de callos y de plantas verdes, y VX HFLHQFLD HV DOWDPHQWH GHSHQGLHQWH GH 1. (O JHQRWLSR HV TXL]iV HO IDFWRU PiV LPportante que afecta al cultivo de anteras. (Q OD QDWXUDOH]D OD KDSORLGtD HV FRQWURlada por el gen hap, llamado gen inhibiGRU GH OD KDSORLGtD ([LVWH VXFLHQWH HYLdencia que sugiere que la andrognesis in-vitro tambin est bajo control gnico, y que este carcter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y D~Q GHQWUR GH HOODV (Q FHEDGD \ WULJR ORV caracteres induccin de callos y regeneracin de plantas son altamente hereda-
Figura 4. Produccin de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. (A) Callo EODQFR \ FRPSDFWR VREUH XQD DQWHUD HFKD % Detalle del callo sealado en (A). (C) Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. (D) Plntula de trigo regenerada a partir de callo, con VLVWHPD UDGLFXODU HQ IRUPDFLyQ ( 3ODQWD KDSORLGH FRPSOHWD QDOL]DQGR OD HWDSD GH UXVWLFDFLyQ FUHciendo sobre sustrato inerte (Perlita).
bles, y se ha sugerido que ambos caracteres estaran controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad andrognica no parece difcil, VLHQGR OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQRWLSRV FRQ gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporacin en los bloques de cruzamiento. 2. (O GH DOELQLVPR OD RFXUUHQFLD GH SODQtas albinas representa un serio problema para la aplicacin del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende, no slo de la especie, sino tambin de la varieGDG FLWiQGRVH YDORUHV GH \ para tres variedades diferentes de arroz. Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicacin del
material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plstidos, lo cual conducira a la produccin de fenotipos albinos. De acuerdo a este autor, el desarrollo de un sistema fotosinttico funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con fro reduce incidencia de albinismo. Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad andrognica de las mismas. Los factores ambientales ms crticos son el fotoperodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutricin y la concentracin de CO2 (VWRV IDFWRUHV LQFLGLUtDQ en la capacidad de producir las divisiones celulares morfognicas que conducen al desarrollo de embrioides y la reJHQHUDFLyQ GH SODQWDV (VWH ~OWLPR SDVR es crtico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo, y est asociado fuertemente a toda OD KLVWRULD SUHYLD GHO FXOWLYR (Q JHQHUDO se ha informado que la utilizacin de anWHUDV GH ODV SULPHUDV RUDFLRQHV IDYRUHce la respuesta andrognica, mientras TXH ODV FROHFWDGDV DO QDO GH OD HVWDFLyQ muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de HPEULRLGHV (Q Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la produccin de embrioides obtenidos a partir de anteras. 4. (O HVWDGR GH GHVDUUROOR GH ODV PLFURVSRras: en la fase gametoftica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las microsporas sufren inicialmente una divisin mittica asimtrica que da origen a dos clulas de distintos tamaos: la generativa (ms pequea y con un ncleo altamente condensado) y la vegetativa (ms grande y con un ncleo difuso). (Q ODV JUDPtQHDV HO Q~FOHR JHQHUDWLYR se divide nuevamente originando dos ncleos espermticos. Uno generar el endosperma triploide al fusionarse con
los dos ncleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizar a la osfera produciendo el cigoto diploide, que constituir el primer paso de la nueva fase esporoftica. Los embrioides haploides se originan in-vitro a partir de una de las vas que se enuncian a continuacin. Cuando la primera divisin mittica de la micrspora es asimtrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la clula vegetativa, de la geQHUDWLYD R GH DPEDV (Q FDPELR FXDQGR la primera divisin mittica es simtrica, ambas clulas resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una clula gamtica masculina puede revertir su desarrollo gametoftico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un QXHYR LQGLYLGXR (Q JHQHUDO ODV PLFURVporas que se encuentran en la primera divisin mittica son las que mejor resSRQGHQ (VWR YDUtD OHYHPHQWH FRQ OD HVpecie vegetal, pero esta reversin no es posible luego de iniciada la deposicin GH DOPLGyQ (O HVWDGtR PiV DSURSLDGR para los cereales es el de micrspora uninucleada media y tarda. Los pretratamientos: distintos tipos de estrs aplicados durante el estado adecuado pueden enmascarar el programa gametoftico e inducir la expresin de JHQHV HVSHFtFRV GHO GHVDUUROOR HVSRUftico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, tambin otros pueden estimular la andrognesis, como el calor, el choque osmtico, la centrifugacin de las anteras o hasta una incisin en la parte VXSHULRU GH OD LQRUHVFHQFLD GRQDQWH Tambin se citan la poda, la pulverizacin con etrel, la irradiacin, la reduccin en la presin atmosfrica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmsfera saturada de agua y la aplicacin de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas RUDOHV MyYHQHV R VREUH ODV DQWHUDV JHneralmente estimulan la embriognesis. (O IUtR HVWLPXOD OD GLYLVLyQ PLWyWLFD VLPpWULFD GH ODV PLFURVSRUDV (VWR VH GHEH-
ra a una alteracin en la orientacin del huso que conducira a una primera mitosis anormal del grano de polen. Por otra parte, se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera, lo cual aumentara la supervivencia y la viabilidad del SROHQ (Q JHQHUDO ODV WHPSHUDWXUDV FLWDdas varan entre 2 y 10 C y la duracin GHO WUDWDPLHQWR GH D GtDV (V LPSRUtante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, an para variedades dentro de la misma especie. (Q DOJXQDV HVSHFLHV WDOHV FRPR Capsicum annun, avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado xito con un choque con alta temperatura. Temperaturas GH & GXUDQWH ORV SULPHURV D das del cultivo ayudaron a inducir la andrognesis en varias especies de gnero Brassica. La composicin del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el xito en el cultivo de anteras. No existe una recomendacin general y las variaciones dependen de la especie a cultivar. a) Medios de induccin: dos tipos de estrs, osmtico y nutricional, han sido LGHQWLFDGRV FRPR FDXVDV GLVSDUDGRUDV de la induccin de embriognesis en las microsporas de mono y dicotiledneas. (Q WDEDFR HO FXOWLYR GH ODV DQWHUDV HQ XQ medio carente de sacarosa durante los SULPHURV GtDV GH OD HWDSD GH LQGXFFLyQ permiti una mxima respuesta andrognica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de induccin, ya que actan como osmolito y FRPR QXWULHQWH /RV DJHQWHV JHOLFDQWHV representan otro aspecto importante en la evolucin de los medios de induccin. Tradicionalmente se utiliz agar como JHOLFDQWH GH ORV PHGLRV GH FXOWLYR GHELdo a su disponibilidad y bajo costo. Pero HQ VH GHWHFWy XQD PHMRU UHVSXHVWD andrognica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio soliGLFDGR FRQ DJDU \ VXSOHPHQWDGR FRQ FDUEyQ DFWLYDGR (Q PHGLRV OtTXLGRV OD DGLFLyQ GH )LFROO SROtPHUR VLQWpWLFR GH
sacarosa, inerte, no inico y de alto peso molecular) incrementa la tensin superFLDO \ OD YLVFRVLGDG GHO PHGLR 'H HVWD PDQHUD ODV DQWHUDV \ FDOORV RWDQ VREUH el medio lquido y se desarrollan en condiciones aerbicas, permitiendo elevadas tasas de embriognesis y de producFLyQ GH SODQWDV YHUGHV (Q FXDQWR D ORV reguladores de crecimiento, la mayora de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endgenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la induccin en trigo es indispensable el XVR GH ' HQ FRQFHQWUDFLRQHV GH D PJO ([LVWHQ RWUDV VXVWDQFLDV TXH adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulacin de la andrognesis, como la glutamina y el inositol. Tambin VH FLWDQ RWURV FRPSXHVWRV LQHVSHFtcos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de HQGRVSHUPDV GH DUUR] \ GH PDt] (Q ocasiones, si el medio es suplementado con leche de coco los granos de polen desarrollan directamente en embrioides. b) Medios de regeneracin: la variedad de medios de regeneracin citada es menor cuando se la compara con la de los medios de induccin. Los ms utili]DGRV VRQ PRGLFDFLRQHV GHULYDGDV GHO medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicioQDOHV JO GH VDFDURVD XWLOL]DQGR DJDU FRPR JHOLFDQWH DX[LQDV PHQRV poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas 7. Las condiciones de incubacin: las caractersticas ideales de cultivo son esSHFtFDV SDUD FDGD HVSHFLH \ D~Q SDUD cada genotipo dentro de una misma esSHFLH (VWDV DIHFWDQ SDUWLFXODUPHQWH OD WDVD GH DEVRUFLyQ QDO GH QXWULHQWHV \ OD regeneracin de plantas verdes. La duracin e intensidad lumnica, la temperatura y la orientacin de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.
II. Cultivo de Microsporas: comprende la obtencin de individuos haploides a partir de microsporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las microsporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarn embriones haploides que sern luego transferidos a un medio de regeneracin para originar SOiQWXODV JXUD (VWH VLVWHPD HV FRQVLGHrado el de mayor potencial para la produccin de doblehaploides, debido a que induce a las PLOHV GH PLFURVSRUDV TXH FRQWLHQH XQD RU D dividirse y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podra mejorar la nutricin y eliminar las restricciones fsicas para la DQGURJpQHVLV (O FXOWLYR GH PLFURVSRUDV WLHQH la ventaja de originar embriones de similar taPDxR \ HWDSD VLROyJLFD GHELGR D TXH SXHGHQ separarse las microsporas de tamaos semejantes por centrifugacin diferencial. La optimizacin de los diferentes pasos crticos para el xito de esta tcnica puede llevar a la obtencin de una alta cantidad de plantas verdes FRQ PHQRUHV FRVWRV \ HVIXHU]RV (QWUH ORV IDF-
Figura 5. (O GLDJUDPD PXHVWUD ODV GLIHUHQWHV HWDSDV del cultivo de anteras y de microsporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtencin de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema RUDO SUHYLR D OD DQWHVLV E DQWHUDV F DQWHUDV en cultivo, 1d) y 1e) proliferacin de las anteras, 1f) callo haploide, 1g) diferenciacin de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de microsporas aisladas: D \HPD RUDO SUHYLR D OD DQWHVLV E PLFURVSRUDV DLVODGDV GH XQD DQWHUD F FXOWLYR GH PLFURVSRUDV G HVWDGR PXOWLQXFOHDGR H \ I HPEULyQ HQ GHsarrollo.
WRUHV GHWHUPLQDQWHV GH OD HFLHQFLD GHO PpWRGR podemos citar: 1. Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo de microsporas, en contraste con otros menos respondedores. 2. Albinismo: al igual que en el cultivo de anteras, el nmero de plantas albinas depende del genotipo, y tambin se ve LQXLGR SRU OD GHQVLGDG GH FXOWLYR GH ODV microsporas. Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de las plantas en condiciones controladas de fotoperodo y temperatura es esencial y debe ser ajustado en funcin de la especie. Se han citado excelentes resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas en ambientes libres de patgenos, FRQ DOWD KXPHGDG UHODWLYD IRWRSHUtRGR GH KV GH OX] \ DGHFXDGR rgimen de fertilizacin y riego. Cuando las plantas crecen estresadas, ya sea por riego excesivo, sequa, enfermedades, o la aplicacin de algn plaguicida, la respuesta al cultivo de microsporas es menor. 4. (VWDGLR GH ODV PLFURVSRUDV FRPR VH FLtara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo del estadio correcto de las microsporas para que conserven su capacidad andrognica. Pretratamientos: los ms utilizados consisten en el uso de fro, estrs osmtico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles para las microsporas durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. Densidad de cultivo de las microsporas: la densidad de las microsporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el nmero de microsporas que entrarn en GLYLVLyQ ([LVWH XQD FRQFHQWUDFLyQ PtQLma para el desarrollo de las microsporas, y una densidad ptima para una mayor regeneracin. Las condiciones ms favorables deben ser ajustadas en cada caso
y para cada genotipo en particular. 7. Medio de induccin: se han estudiado diferentes concentraciones de azcares, distintas fuentes de nitrgeno orgnico, y la adicin de diferentes de auxinas al PHGLR (Q JHQHUDO VH VXJLHUH OD VXVWLWXcin de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos, la disminucin de la concentracin de nitrato de amonio, el agregado de glutamina, y el empleo de APA (cido fenil actico) como auxina para favorecer la induccin. 8. Medio de regeneracin: la composicin del medio de regeneracin puede afectar el vigor y supervivencia de las plntulas. .DVKD HW al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este mtodo una PDQHUD HFLHQWH GH SURGXFFLyQ GH '+ con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de microsporas haploides en un HVWDGR VLROyJLFR XQLIRUPH TXH FRQVWLWXyen excelentes blancos para la mutagnesis, la seleccin y la transformacin. ,,, +LEULGDFLyQ ,QWHUHVSHFtFD H ,QWHUJHQprica: en este caso los haploides se originan a travs de la eliminacin del genoma del poliQL]DGRU (O VLVWHPD GH KLEULGDFLyQ GH WULJR [ Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y empleado con xito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tres razones: 1. La produccin de haploides es ms fcil. 2. (O WLHPSR UHTXHULGR SDUD OD UHJHQHUDFLyQ de plantas es menor. /D HFLHQFLD HQ OD UHJHQHUDFLyQ GH SODQtas parece ser mayor. La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayora de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. bulbosum involucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan en base a criterios agronmicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamien-
tos con H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes, se ha sugerido como alternativa realizar los cruzamientos de trigo utilizando maz como polinizador JXUD /XHJR GH OD IHUWLOL]DFLyQ GHO vulo de trigo por el polen de maz, durante las primeras mitosis del cigoto, los cromosomas del maz son eliminados. (VWR VH GHEH D XQD LQFRPSDWLELOLGDG HQtre los cinetocoros de estos cromosomas \ ODV EUDV GH ORV KXVRV DFURPiWLFRV TXH hace que en las primeras anafases los cromosomas de maz vayan quedando
UH]DJDGRV HQ HO FLWRSODVPD GRQGH QDOPHQWH VRQ GHJUDGDGRV (O UHVXOWDGR de este proceso es un embrin haploide de trigo. Seguidamente, los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. A travs de las cruzas con maz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al mtodo de trigo x maz, por lo que sera menos dependiente del genotipo.
Figura 6. Produccin de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maz (Zea mayz). $ (VSLJDV GH WULJR FRUWDGDV HQ HO FDPSR \ FDVWUDGDV HQ HO ODERUDWRULR % 3ODQWDV GH PDt] GRQDQWHV de polen) crecidas en invernculo. (C) Desgrane de espigas para realizar la desinfeccin de los granos y SRVWHULRU UHVFDWH GH HPEULRQHV ' *UDQR FRQ GRV HPEULRQHV KDSORLGHV SROLHPEULRQtD ( (PEULRQHV inmaduros rescatados y creciendo in-vitro ) 3ODQWD UXVWLFDGD * \ + 3ODQWDV FRQ PDFROORV FRQ sus races sumergidas en solucin de colchicina para la duplicacin cromosmica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cmara de crecimiento
IV. Ginognesis LQ YLYR en maz: el empleo de lneas con elevada frecuencia de haploides como polinizadores motiv al desarrollo de la tecnologa para la obtencin de haploides maternos in-vivo (VWH KDOOD]JR DEULy QXHYDV posibilidades para el empleo de polinizadores seleccionados en funcin de su capacidad de incrementar las frecuencias de haploides. Lneas inductoras fueron desarrolladas a partir GHO JHUPRSODVPD GH 6WRFN GH HOHYDGD KDSORLGtD (O PHFDQLVPR LQYROXFUDGR HQ OD JHQHracin de haploides estara basado en la falta de fertilizacin de la oosfera durante la doble IHUWLOL]DFLyQ (Q UHODFLyQ D HVWH IHQyPHQR VH KD planteado la hiptesis en que se asume que las lneas inductoras de haploida presentan dos clulas espermticas con diferente velocidad GH GHVDUUROOR JXUD (O PpWRGR GH JHQHUDFLyQ GH KDSORLGHV PDWHUnos in-vivo involucra los siguientes pasos: 1. Generacin del cruzamiento del cual se desean obtener lneas homocigotos (Generacin parental). 2. )HFXQGDFLyQ GH OD ) FRQ SROHQ SURYHniente del inductor de haploida. ,GHQWLFDFLyQ GH JUDQRV KDSORLGHV
4. Duplicacin de los individuos haploides. Autofecundacin de las plantas haploides duplicadas. /D LGHQWLFDFLyQ GH ORV JUDQRV KDSORLGHV VH realiza mediante el empleo de genes marcadores de color en embrin y endosperma, siendo el alelo rojo navajo Navajo crown (R-nj) el ms frecuente. Aquellos cariopses con un embrin haploide (r-nj), resultantes de la falta de fecundacin de la osfera, pueden distinguirse claramente debido a la falta de expresin del marcador antocinico dominante R-nj en el emEULyQ (V GHFLU TXH OD H[SUHVLyQ HVSHFtFD GHO gen R-nj en el endosperma (Navajo crown) y en el embrin permite de manera rpida y preFLVD LGHQWLFDU DTXHOORV JUDQRV FRQ OD SRWHQFLDOLGDG GH SURGXFLU SODQWDV KDSORLGHV JXUD Duplicacin cromosmica Despus de la duplicacin cromosmica, ya sea espontnea o inducida, se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que no SRGUtD SURGXFLU VHPLOODV (QWUH ODV WpFQLFDV TXH han sido utilizadas para la duplicacin de haploides cabe mencionar: 1. La duplicacin espontnea durante la etapa de callo o de rescate de embriones. 2. La regeneracin de plantas doblehaploides a partir de callos de mdula de plantas haploides de tabaco. Sustancias qumicas: aunque se conocen casos utilizando agentes qumicos tales como acenafteno, hidrato de cloral, sulfanilamida, etc., la mayor HFDFLD VH KD ORJUDGR FRQ OD colchicina y el xido nitroso. La aplicacin del xido nitroso EDMR SUHVLyQ DWPyVIHUDV resulta de especial inters por su fcil penetracin en los tejidos y la rpida desaparicin de los mismos cuando cesa la preVLyQ 3XHGH XWLOL]DUVH HQ RUHV recin polinizadas. La ventaja que presenta este tratamiento es que, al poder ser aplica-
Figura 7. Generacin de haploides in-vivo a travs de fecundacin incompleta. La clula espermtica se une a los ncleos poODUHV GDQGR FRPR UHVXOWDGR OD IRUPDFLyQ GHO HQGRVSHUPD Q La otra clula no logra fecundar a la osfera produciendo un embrin haploide (n)
Figura 8. Marcadores de color en embrin y endosperma que permiten la seleccin de granos haploides
do durante la primera divisin mittica del vulo fecundado, se ve reducida la aparicin de quimeras. Por otro lado, los residuos de este agente resultan menos txicos para la planta que otros que se aplican en forma lquida, aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muy elevada. La accin de la colchicina fue GHVFXELHUWD HQ \ GHVGH HQWRQFHV ha pasado a ser prcticamente el agente GLSORLGL]DQWH PiV LPSRUWDQWH (VWD GURJD acta impidiendo el autoensamblaje de la tubulina, inhibiendo as la formacin de los microtbulos del huso y, en consecuencia, la segregacin anafsica de las cromtides. Afecta por lo tanto slo a las clulas que se encuentran en divisin. Puede aplicarse a plntulas, plantas adultas, semillas, microsporas y anteras. (O WUDWDPLHQWR SXHGH UHDOL]DUVH XWLOL]DQdo una solucin acuosa donde se sumergen las races, dejando fuera la parte area. Tambin se puede hacer llegar la solucin al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyeccin), o por absorcin de la solu-
cin a travs de los tallitos decapitados, sobre los que se vierte. Otra forma es tratar los callos con colchicina antes de trasladarlos al medio de regeneracin. (VWH ~OWLPR PpWRGR SHUPLWH OD REWHQFLyQ de gran nmero de doblehaploides, pero presenta la desventaja de que la mayora de las plantas as obtenidas son mosaicos cromosmicos. Otra alternativa, para microsporas y anteras, es la adicin del agente duplicador directamente en el medio de induccin, antes de la primer mitosis. La diploidizacin en este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo, maz, Tritordeum y DUUR] (O SUREOHPD GH OD VXSOHPHQWDFLyQ del medio de induccin con colchicina es que reduce la embriognesis en trigo, si bien en Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. La duracin del tratamiento y la concentracin de la solucin varan para cada especie. Cualquiera sea el mtodo con que se dupliTXH OD SODQWD XQ PDFROOR R VyOR XQD \HPD Rral, lo importante es lograr que las semillas que stas produzcan sean viables. &RQVLGHUDFLRQHV QDOHV La eleccin de los progenitores y la seleccin son etapas decisivas en un programa de mejoramiento que avanzar luego, generacin tras generacin, hacia una homocigosis que permita entrar en las etapas de evaluacin. *DQDU WLHPSR HQ HVWRV FDVRV SXHGH VLJQLcar una reduccin de costos muy importante y una ms temprana entrada en el mercado de OD QXHYD YDULHGDG (Q HO FDVR GH XQD HVSHcie autgama, como el trigo, es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un ao, especialmente en aquellos cultivares de FRUWR FLFOR YHJHWDWLYR (VWR VLQ HPEDUJR GLculta la observacin de algunas caractersticas agronmicas importantes, que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condicioQHV DWHQWDQGR FRQWUD XQD VHOHFFLyQ HFLHQWH Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalizacin, esta ganancia de generaciones no es posible o es compleja. La produccin de individuos
doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluacin agronmica se plantea como una solucin promisoria a este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos. Muchos interrogantes quedan an sin resolver, limitando la aplicacin extensiva de esta tecnologa a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: (Q TXH JHQHUDFLyQ VHJUHJDQWH VH DSOLFD HO mtodo de doblehaploides? Cul es el nmero de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamtica creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con el mtodo convencional de seleccin a campo? Cmo superar la escasa cantidad de semilla producida? (V XQD WpFQLFD DOWHUQDWLYD R FRPSOHPHQWDria del mejoramiento tradicional? /D HFLHQFLD HQ OD SURGXFFLyQ GH GREOHKDSORLGHV MXVWLFD VX DOWR FRVWR GHQWUR GH XQ SODQ de mejora? 'H DFXHUGR D 0XMHE.D]L ODV JHQHraciones segregantes adecuadas para producir GREOHKDSORLGHV VRQ OD ) \ ) 6L HOLJLpUDPRV LQGLYLGXRV ) TXH \D FXHQWDQ FRQ XQ DxR GH VHOHFFLyQ D FDPSR GXUDQWH OD ) JHQHUDFLyQ que ha mostrado la mayor varianza gentica entre los dos padres- estaramos evitando producir un gran nmero de plantas doblehaploides que no sern agronmicamente promisorias. No obstante, debemos considerar que seran necesarios varios cientos de individuos DH para que el proceso tenga posibilidades de xito agronmico. (Q JHQHUDO OD SURGXFFLyQ GH GREOHKDSORLGHV resulta en un gasto excesivo en comparacin a los mtodos tradicionales de mejoramiento, por lo cual en la mayora de los programas slo genotipos lite son sometidos a este sistema. Si bien el costo de produccin de los DH depende GLUHFWDPHQWH GHO PpWRGR HOHJLGR \ OD HFLHQFLD lograda, la aplicacin de esta metodologa al mejoramiento vegetal se vislumbra ms bien como una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que de ningn modo intentara reemplazarlo.
Atanassov, A.; Zagorska, P.; Boyadjiev, P.; Djilianov, ' In vitro production of haploid plants. :RUOG -RXUQDO RI 0LFURELRORJ\ %LRWHFKQRORJ\ vol. 11, 400-408. %KRMZDQL 66 5D]GDQ 0. +DSORLG 3URGXFWLRQ (Q 3ODQW 7LVVXH &XOWXUH 7KHRU\ DQG 3UDFWLFH &DSLWXOR 66 %KRMZDQL \ 0. 5D]GDQ HGV (OVHYLHU $PVWHUGDP SS &RH ( + -U 1HXIIHU 0 * +RLVLQJWRQ ' $ 7KH *HQHWLFV RI &RUQ (Q &RUQ DQG FRUQ ,PSURYHPHQW UD (GLFLyQ 6SUDJXH & ) 'XGOH\ - : HGV SJ $6$ &66$ 666$ 0DGLVRQ :LQVFRQVLQ SS /DFDGHQD -5 9DULDFLRQHV FURPRVyPLFDV QXPHULFDV (Q *HQpWLFD &DStWXOR /DFDGHQD -5 HG $*(6$ 0DGULG SS 6QDSH - 6LPSVRQ ( 3DUNHU % )ULHGW : )RURXJKL:KHU % &ULWHULD IRU WKH VHOHFWLRQ and use of doubled haploid systems in cereal EUHHGLQJ SURJUDPPHV (Q *HQHWLF PDQLSXODWLRQ LQ SODQW EUHHGLQJ 3URF ,QW 6\PS (XFDUSLD : +RUQ & -HQVHQ : 2GHQEDFK 2 6FKLHGHU (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217-229.
III. CAPTULO 2 Aplicaciones de los marcadores moleculares

Alicia Carrera; Gabriela Tranquilli; Antonio Garayalde; Marcelo Helguera Los marcadores moleculares, herramientas bsicas de la biotecnologa vegetal descriptas HQ 3DUWH , &DStWXOR GH HVWH OLEUR VH XWLOL]DQ en la actualidad en numerosas reas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el anlisis de la biodiversidad. A continuacin se describen algunas de esas aplicaciones. Cada uno de estos campos posee una base terica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren del uso de programas de estadstica avanzada. De este modo, el presente captulo debe ser considerado como una introduccin a los temas presentados. ,GHQWLFDFLyQ GH JHQRWLSRV 3XUH]D varietal (O FRQWURO GH OD SXUH]D YDULHWDO \ OD GLVFULPLnacin de variedades protegidas requieren de XQD DGHFXDGD LGHQWLFDFLyQ GH ORV PDWHULDOHV (VWD LGHQWLFDFLyQ VH KD EDVDGR WUDGLFLRQDOmente en el uso de caracteres morfolgicos y VLROyJLFRV 'HVDIRUWXQDGDPHQWH OD XWLOL]DFLyQ de recursos genticos de origen comn en diferentes programas de mejoramiento ha reduFLGR OD HFLHQFLD GH GLVFULPLQDFLyQ SRU PDUFDdores fenotpicos (descriptores), que si bien son importantes, presentan limitaciones (bajo SROLPRUVPR LQXHQFLD DPELHQWDO GHSHQGHQcia del estadio de desarrollo de planta, etc.). Como alternativa para resolver este problema, los marcadores moleculares resultan de gran utilidad por su nmero virtualmente ilimitado y por su habilidad para explorar variabilidad gentica a nivel del ADN. ,67$ International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection Des Obtenions Vegtales) son entidades internacionales que han distribuido informacin para estandarizar los anlisis de ODERUDWRULR SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH FXOWLYDUHV y para reglamentar la utilizacin de diferencias moleculares en la evaluacin de homogeneidad intra-varietal, la discriminacin de varie-
dades y el otorgamiento de nuevas patentes. (Q OD DFWXDOLGDG VH GLVSRQH GH SDWURQHV PRleculares varietales para una extensa lista de HVSHFLHV )UHFXHQWHPHQWH XQ JUXSR GH loci SROLPyUFRV GH XQ PDUFDGRU PROHFXODU WDOHV FRPR PLFURVDWpOLWHV R $)/3V $PSOLHG )UDJment Length Polymorphism HV VXFLHQWH SDUD JHQHUDU XQ SHUO PROHFXODU GH LGHQWLFDFLyQ R huella dactilar de ADN, nica para cada cultivar. Como ejemplo, podemos mencionar al trigo pan (Triticum aestivum L.) para el que se GHVDUUROOy XQD 0DWUL] GH ,GHQWLFDFLyQ 9DULHWDO en base a marcadores microsatlites de ADN, que permite la individualizacin de las distintas variedades argentinas. Por otro lado, a partir de datos moleculares es posible obtener distintos ndices de similitud o distancia gentica y generar dendrogramas que ponen en evidenFLD ODV UHODFLRQHV HQWUH ORV PDWHULDOHV (VWD LQformacin puede ser altamente valiosa en caso de litigios por derechos de obtencin. Para PiV GHWDOOHV VREUH LGHQWLFDFLyQ GH JHQRWLSRV VH UHFRPLHQGD OD OHFWXUD GH 3DUWH ,,, &DStWXORV \ GH HVWH OLEUR La pureza varietal es uno de los principales UHTXLVLWRV GH OD VHPLOOD FRPHUFLDO (Q OD SURGXFcin de semilla hbrida la heterogenidad intralote puede originarse por falta de uniformidad en las lneas parentales, polinizacin cruzada espontnea o mezcla de semillas durante la siembra, cosecha o embolsado. Los individuos IXHUD GH WLSR SXHGHQ LGHQWLFDUVH PHGLDQWH HO patrn molecular. Del mismo modo, pueden establecerse las relaciones de descendencia entre una serie de lneas parentales y sus hbridos. Asimismo, la caracterizacin molecular de lneas puras permite conocer el nivel de variabilidad gentica presente en la coleccin, conUPDU KRPRFLJRFLV SUHFLVDU OD LGHQWLFDFLyQ \ DVLVWLU HQ OD SODQLFDFLyQ GH ORV FUX]DPLHQWRV destinados a producir hbridos de caractersticas superiores. Bancos de germoplasma (O SURFHVR GH VHOHFFLyQ SDUD PHMRUD \ ODV prcticas de la agricultura moderna han generado una prdida notable de diversidad en la PD\RUtD GH ODV HVSHFLHV FXOWLYDGDV (O UHHPplazo paulatino de las variedades primitivas por los nuevos cultivares de indudables ventajas econmicas ha producido una reduccin en el nmero de genotipos que se cultivan. La ero-
sin gentica puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relacin FRQ VX YXOQHUDELOLGDG VDQLWDULD (VWH SURFHVR puede ser atenuado mediante la creacin de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo, in-vitro o criopreVHUYDGDV (VWD DFWLYLGDG VH YXHOYH SDUWLFXODUmente relevante para el Continente Americano y el Caribe, que constituyen los centros de origen de cultivos importantes como maz, poroto, cacao, papa, man, pimiento, tomate, zapallo, adems de numerosas medicinales, aromticas, frutales y forestales. Los recursos genticos de una especie cultivada comprenden: i) cultivares antiguos y de reciente obtencin; ii) poblaciones locales mantenidas por los productores, landraces; iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza; iv) especies relacionadas. Los marcadores moleculares permiten caracterizar accesiones cultivadas y silvestres, estudiar el proceso de domesticacin, establecer UHODFLRQHV ORJHQpWLFDV \ FRQWULEXLU HQ OD WRPD de decisiones para la eleccin de estrategias GH FRQVHUYDFLyQ (O SURFHGLPLHQWR FRQVLVWH Eisicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN, y calcular PHGLGDV GH GLYHUVLGDG QLYHO GH SROLPRUVPR riqueza allica, presencia de alelos nicos) y GH VLPLOLWXG JHQpWLFD (VWD LQIRUPDFLyQ OXHJR VH LQWHJUD D GDWRV JHRJUiFRV SURFHGHQFLD GH las accesiones, distribucin), pedigr, taxonoma y variabilidad en caracteres morfolgicos, IHQROyJLFRV VLROyJLFRV HWF 8QD JUDQ SDUWH GH ORV SROLPRUVPRV PROHFXODUHV VH HQFXHQWUD HQ UHJLRQHV QR FRGLFDQWHV del genoma, carece de expresin fenotpica y HV VHOHFWLYDPHQWH QHXWUD (Q FRQWUDVWH ORV JHQHV TXH FRGLFDQ ORV UDVJRV PRUIROyJLFRV \R agronmicos poseen un fuerte efecto fenotpico y han estado sometidos a intensas presiones de seleccin en las distintas etapas del mejoramiento. Por lo tanto, estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuerzas de cambio a lo largo del proceso de domesticacin. Los marcadores moleculares combinados con datos morfolgicos, agronmicos y de origen, conforman una base de
datos integral que permite describir la variacin gentica en colecciones de germoplasma. 9HDPRV DOJXQRV HMHPSORV (Q FDVRV FRPR el girasol (Helianthus annuus), originario de (VWDGRV 8QLGRV HO DQiOLVLV GH GLYHUVLGDG KD demostrado que el proceso de domesticacin ha reducido considerablemente la base gentica de los materiales cultivados en relacin a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea), las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en Amrica y (XURSD UHVSHFWLYDPHQWH /D FRPSDUDFLyQ HQtre los materiales silvestres y cultivados de una HVSHFLH SHUPLWH DGHPiV LGHQWLFDU ORV OXJDUHV de origen del cultivo, conocidos como centros de domesticacin. Una vez que los recursos genticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cules seran los cruzamientos que ms contribuiran a la expansin de la base gentica. Aunque frecuentemente el proceso de domesticacin involucra una prdida importante de diversidad que es revelada por marcadores moleculares dispersos en el genoma, los camELRV PiV VLJQLFDWLYRV HQ HO SDVR GH IRUPDV VLOvestres a cultivadas pueden ser explicados por unos pocos genes. Por ejemplo, Dubcovsky y Dvorak (2007) describen un fenmeno llamado sndrome de domesticacin, que es mayoritariamente adjudicado a genes que controlan la arquitectura morfolgica de la espiga y el mecanismo de dispersin de las semillas. Uno de ellos es el gen Br (brittle raquis) que determiQD XQ UDTXLV TXHEUDGL]R DQFHVWUDO R UPH GH la espiga; otro es el gen Tg (tenacious glume) TXH GHWHUPLQD JOXPDV UPHPHQWH DGKHULGDV DO grano (ancestral) o granos desnudos y el tercero es el gen Q, que gobierna el libre desgrane de la semilla madura y la forma cuadrada de la HVSLJD (O DOHOR q produce una espiga piramidal de raquis elongado (espeltoide) cuyas semillas no se desgranan fcilmente al madurar. La espiga del trigo moderno es la resultante de la combinacin de los alelos br UDTXLV UPH tg (grano desnudo) y Q, que generan una espiga cuadrada, que permite el libre desgrane de la semilla madura desnuda, facilitndose enormemente la cosecha del grano.
Desde el punto de vista del mejoramiento, la informacin generada por los marcadores resulta de inmediata aplicacin en los procesos de acopio (dnde colectar, qu intercamELRV UHDOL]DU FRQVHUYDFLyQ LGHQWLFDFLyQ GH duplicados en las colecciones, monitoreo de los cambios en la composicin gentica que puedan ocurrir durante la multiplicacin o conservacin de los materiales), caracterizacin (diversidad gentica de la coleccin) y distribuFLyQ HFLHQWH GH ORV UHFXUVRV JHQpWLFRV KDFLD los usuarios. Mapas Genticos Un mapa gentico de una especie animal o vegetal muestra la distribucin lineal de marcadores en cada uno de los cromosomas que FRQVWLWX\HQ HO JHQRPD GH XQ RUJDQLVPR (VWH mapa esta basado en el concepto clsico de ligamiento: si dos o ms genes o marcadores estn fsicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se transmiten usualmente juntos a travs de la meiosis. Las proporciones en que estos genes segregan en una poblacin se apartan de las esperadas bajo la ley de segregacin independiente. La mayor parte de los gametos contendrn las mismas combinaciones allicas que los padres; slo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromtides no hermanas o crossover generarn gametos con combinaciones allicas diferentes de las parentales (recombinantes). (O IXQGDPHQWR GHO PDSHR JHQpWLFR UHVLGH HQ la relacin entre la frecuencia de recombinacin y la distancia fsica entre los loci. La frecuencia de recombinacin entre dos genes se convierte en una estimacin de la distancia de mapa que los separa. La unidad de medida de los mapas genticos es el "centimorgan" (cM), que es una medida de la cantidad de eventos de recombinacin entre marcadores, ocurridos en una poblacin segregante (de mapeo). Para ms detalles sobre construccin de mapas geQpWLFRV VH UHFRPLHQGD OD OHFWXUD GHO &DStWXOR 3DUWH , GH HVWH OLEUR (O DSRUWH GH ORV PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HQ la construccin de mapas genticos es fundamental, ya que han permitido incrementar OD SUREDELOLGDG GH LGHQWLFDU UHJLRQHV FURPRsmicas que determinan rasgos agronmica-
mente importantes, en comparacin con los mapas obtenidos mediante el uso de marcadores morfolgicos o isoenzimticos. Consecuentemente, cuanto mayor sea el nmero de marcadores incorporados a un mapa gentico mayor ser su capacidad de resolucin y utilidad como marco de referencia para incorporar genes asociados a caractersticas de inters econmico. Para incorporar un carcter de inters agronmico en un mapa gentico es necesario cumplir con las siguientes etapas: 1. Desarrollar una poblacin segregante para el carcter agronmico en cuestin. 2. Caracterizar la poblacin segregante utilizando marcadores moleculares poliPyUFRV FRQ GLIHUHQFLDV HQ OD VHFXHQcia de ADN entre los parentales). Para construir un mapa mnimo es deseable disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada cromosoma del genoma en estudio. (YDOXDU IHQRWtSLFDPHQWH HO FDUiFWHU DJURnmico sobre los individuos de la poblaFLyQ VHJUHJDQWH (VWH SXQWR HV FUXFLDO ya que si la evaluacin del carcter en la poblacin de mapeo no es precisa, el mapeo del carcter ser errneo o irrealizable. 4. ,GHQWLFDU PDUFDGRUHV OLJDGRV DO FDUiFWHU agronmico en cuestin (co-segregacin entre fenotipo del carcter y fenotipo del marcador). Para esta instancia, al igual que para la construccin del mapa gentico, se pueden utilizar herramientas LQIRUPiWLFDV HVSHFtFDV WDOHV FRPR ORV programas Mapmaker, MapmakerQTL, Genemap, etc. Cuanto mayor sea la distancia gentica entre los parentales que darn origen a la poblacin de mapeo, mayor ser la probabilidad de GHWHFWDU PDUFDGRUHV SROLPyUFRV TXH HV XQ SXQWR FUtWLFR SDUD LGHQWLFDU PDUFDGRUHV OLJDdos al carcter en estudio. (Q HO FRQWH[WR GHO PHMRUDPLHQWR YHJHWDO ORV mapas genticos posibilitan: La cobertura y anlisis de genomas completos. La localizacin de regiones genmicas
que controlan caracteres de importancia agronmica o industrial. /D FXDQWLFDFLyQ GHO HIHFWR GH HVWDV UHgiones en la caracterstica estudiada. La descomposicin de caracteres genticos complejos (QTLs) en componentes mendelianos.
(Q ORV ~OWLPRV DxRV KD FRPHQ]DGR D XVDUVH una nueva estrategia de mapeo denominada mapeo por asociacin, que utiliza el concepWR GH GHVHTXLOLEULR GH OLJDPLHQWR /' GHQLGR como la asociacin no al azar de alelos de diferentes loci. La hiptesis de base considera que en poblaciones grandes, con apareamientos al azar (panmixis), con los loci segregando independientemente y en ausencia de seleccin, mutacin, o migracin, los loci SROLPyUFRV estn en equilibrio: la frecuencia de un cierto haplotipo depende del producto de las frecuenFLDV DOpOLFDV HQ FDGD ORFXV (Q HVWH FDVR HO /' ser cero. La existencia de ligamiento fsico aumenta los niveles de LD, aunque procesos de seleccin y migracin generan igualmente valores de LD distinto de cero. Una ventaja importante de este mtodo es que puede prescindir de poblaciones de mapeo clsicas, tales FRPR ) R 5,/V Recombinant Inbred Lines) pudiendo utilizarse la variacin en poblaciones naturales de una especie o colecciones de culWLYDUHV SURGXFWR GHO PHMRUDPLHQWR (VWH HQfoque aprovecha la historia de recombinacin natural de la especie y los procesos ocurridos de seleccin, lo cual incrementa el grado de asociacin entre los marcadores y el carcter de inters. Si un marcador resulta estar asociado a un gen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de este marcador resulta en la seleccin indirecta del gen de inters. La comparacin de mapas genticos entre especies genera informacin bsica sobre la estructura y evolucin de los genomas. Por otro lado un mapa gentico constituye el punto de partida para proyectos de clonado de genes. Seleccin asistida por marcadores (O GHVDUUROOR GH P~OWLSOHV WpFQLFDV PROHFXlares ha facilitado el anlisis gentico de caracteres de inters agronmico y la seleccin
de individuos con caractersticas ventajosas. La seleccin asistida por marcadores (MAS) es un proceso de seleccin indirecta basado en la existencia de co-segregacin entre marFDGRUHV \ XQ JHQ GHWHUPLQDGR 6X HFLHQFLD depende de la distancia entre el marcador y el gen, y de la contribucin de ese gen al fenotiSR (Q WpUPLQRV DPSOLRV HO PDUFR GH DSOLFDcin que brindan los marcadores moleculares comprende la introduccin y seguimiento de genes o QTLs (Quantitative Trait Locus) de inters, as como la agilizacin del proceso de recuperacin de homocigosis en fondos genWLFRV SDUWLFXODUHV (Q HO SULPHU FDVR OD HVWUDtegia se basa en focalizar el anlisis sobre el gen de inters en una poblacin segregante mediante el uso de marcadores previamente desarrollados sobre porciones de secuencias de dicho gen, o con marcadores localizados en las regiones adyacentes que se encuentren ligados al carcter en cuestin. (O VHJXQGR FDVR tiene que ver con que la transferencia de genes de inters se realiza comnmente mediante cruzas amplias, que requieren luego del cruzamiento inicial, una serie de retrocruzas hacia el SDUHQWDO HOLWH R UHFXUUHQWH (O SURGXFWR QDO HV un material que posee el fondo gentico original con la nueva caracterstica incorporada. (Q este caso, la estrategia se basa en un anlisis ms amplio de la poblacin segregante, ya que el uso de marcadores no slo se aplicar para OD LGHQWLFDFLyQ GHO JHQ DVRFLDGR D OD FDUDFWHrstica de inters, sino que tambin se caracWHUL]DUiQ RWUDV UHJLRQHV GHO JHQRPDV D Q GH LGHQWLFDU DTXpOODV TXH SURYHQJDQ GHO SDUHQWDO elite. Las herramientas moleculares permiten acelerar este proceso, dado que poseen alta densidad y cubren en forma uniforme el genoma. Con relacin al seguimiento de genes de inters, un argumento frecuentemente utilizado en contra de la seleccin asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple no precisa de marcadores para seleccin si los fenotipos son fcilmente LGHQWLFDEOHV 6L ELHQ HVWR HV FRUUHFWR an en estos casos, la utilizacin de marcadores moleculares en un programa de mejoramiento puede representar una ventaja importante, y es que la seleccin se independiza del fenotipo
\ HO DPELHQWH (VWDV FDUDFWHUtVWLFDV SHUPLWHQ LGHQWLFDU UiSLGDPHQWH JHQRWLSRV ~QLFRV HQ poblaciones segregantes e incorporar varios genes de inters en un fondo gentico, proceso tambin denominado "piramidizacin" o "apilamiento" de genes. Por lo descripto anteriormente, puede decirse que la utilidad potencial de los marcadores moleculares en el proceso de mejoramiento gentico es alta. Sin embargo, factores de orden tcnico y/o econmico han limitado su adopcin. Dentro de los primeros, corresponde mencionar la disponibilidad de marcadores moleculares que permitan, por un lado, mejorar la cobertura del genoma en cuestin, y por otro lado, que resulten factibles de ser implementados bajo procesos automatizados, tales como extraccin de ADN o reacciones de DPSOLFDFLyQ D JUDQ HVFDOD (Q HVWH VHQWLGR es importante destacar que cada vez es mayor la cantidad y variedad de marcadores moleculares desarrollados para cultivos de importancia econmica. Por otro lado, la implementacin de un marcador para la seleccin de un carcter agronmico en un programa de mejoramiento requiere de una serie de estudios previos relacionados con: (1) material a utilizar YDULHGDGHV SREODFLRQHV ) UHWURFX]DV OtQHDV avanzadas, etc.), (2) condiciones ptimas de la UHDFFLyQ GH 3&5 Polymerase Chain Reaction- (nmero de ciclos de PCR, temperatura y extensin de cada ciclo, concentracin de los componentes que conforman la reaccin de 3&5 HWF GHWHFFLyQ GHO PDUFDGRU JHOHV de agarosa, acrilamida, secuenciado, etc.), (4) tipo de informacin a obtener (marcador domiQDQWH R FRGRPLQDQWH SRVLELOLGDG GH HYHQtos de recombinacin entre marcador y carcter, etc., proceso que se denomina validacin. Desde el punto de vista del mejoramiento, sin dudas el mejor marcador es aquel que deWHFWD VLWLRV SROLPyUFRV TXH HVWDQGR GHQWUR GHO gen son los determinantes de la variacin fenoWtSLFD REVHUYDGD (VWRV PDUFDGRUHV WDPELpQ llamados de diagnstico o funcionales, pueden VHU XVDGRV HQ IRUPD FRQDEOH HQ SREODFLRQHV en las que no se hayan mapeado previamente, sin correr el riesgo de que la informacin de inters se pierda por recombinacin. Como ejemplo podemos mencionar un marcador de-
sarrollado para el gen Pinb-D1 GH WULJR (VWH JHQ FRGLFD XQD GH ODV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV con textura de grano y se ha demostrado que el cambio de un aminocido (glicina a serina) da origen a una variante allica cuyo fenotipo es un grano con textura dura. Tanquilli y col. (1999) desarrollaron un marcador que detecta dicha mutacin en cualquier poblacin segreJDQWH TXH VHD SROLPyUFD SDUD HO JHQ Pinb-D1 y es de gran utilidad para el mejoramiento de WULJRV EODQGRV JXUD 'HVDIRUWXQDGDPHQWH la disponibilidad de marcadores funcionales se ve restringida por el limitado nmero de genes caracterizados molecularmente que controlan caracteres agronmicos. Sin duda, la disponibilidad de marcadores funcionales aumentar progresivamente a partir del conocimiento generado de los proyectos de genmica en especies modelo (Arabidopsis, arroz) as como del Q~PHUR FUHFLHQWH GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV mapeadas y caracterizadas. Dentro de los factores de ndole econmico, la principal limitante en la adopcin generalizada de esta tecnologa ha sido la relacin entre el costo del dato molecular (data point) y el YDORU FRPHUFLDO GH OD VHPLOOD PHMRUDGD (Q ORV programas de mejoramiento de aquellas especies donde el material de cultivo es hbrido, en general se observa mayor uso de seleccin DVLVWLGD SRU PDUFDGRUHV PROHFXODUHV (V HVSHrable que esta limitante se vaya superando con el tiempo por el permanente avance tecnolJLFR (Q HVWH VHQWLGR HO DPSOLR GHVDUUROOR GH PDUFDGRUHV EDVDGRV HQ DPSOLFLDFLyQ 665V Simple Sequence Repeats 613V Single Nucleotide Polymorphisms-) ha permitido simSOLFDU ODV PHWRGRORJtDV D DSOLFDU HQ FRPparacin con aquellos marcadores basados HQ KLEULGDFLyQ 5)/3V 5HVWULFWLRQ )UDJPHQW Length Polymorphism-, por ejemplo), reducienGR FRVWRV \ WDPELpQ DXPHQWDQGR OD HFLHQFLD en el proceso de seleccin. Para mas detalles sobre seleccin asistida por marcadores se recomienda la lectura de 3DUWH ,,, &DStWXOR GH HVWH OLEUR Mapas comparativos (O WDPDxR GHO JHQRPD GH SODQWDV HV PX\ variable entre especies, y gran parte de esa diferencia est dada por secuencias de ADN
A
5'- AAACAACATTGAAAAC ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA GCT CTC CTT GCT CTT GTA GCG AGC ACA ACC TTC GCG CAA TAC TCA GAA GTT GGC GGC TGG TAC AAT GAA GTT GGC GGA GGA GGT GGT TCT CAA CAA TGT CCG CAG GAG CGG CCG AAG CTA AGC TCT TGC AAG GAT TAC GTG ATG GAG CGA TGT TTC ACA ATG AAG GAT
Gly
TTT CCA GTC ACC TGG CCC ACA AAA TGG TGG AA G GGC GGC TGT GAG CAT GAG AAG AGC GGC
Ser
GTT CGG GAG AAG TGC TGC AAG CAG CTG AGC CAG ATA GCA CCA CAA TGT CGC TGT GAT TCT ATC CGG CGA GTG ATC CAA GGC AGG CTC GGT GGC TTC TTG GGC ATT TGG CGA GGT GAG GTA TCA AAG TGC TTC AAA CAA CTT CAG AGG GCC CAG AGC CTC CCC
AAC ATG GGC GCC GAC TGC AAG TTC CCT AGT GGC TAT TAC TGG
TGA TGATATAGCCTC TATTCGTGCCAATAAAATGTCACATATCATAGCAAGTGGCAAATAAGAGTGCTGAGTGATGATCTATGAA TAAAATCACCCTTGTATATTGATCTGTGTTCGAGAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3
B
1 2 3 4 5 6 M
500 bp 400 bp 300 bp 200 bp
Figura 1. (A) Secuencia nucleotdica del gen pinb-D1 PRVWUDQGR HO FDPELR GH DPLQRiFLGR *OLFLQD 6HULQD *O\ 6HU UHVXOWDQWH GH OD PXWDFLyQ GH OD EDVH JXDQLQD G) a adenosina (A) que diferencia a los alelos asociados a texturas blandas y duras, respectivamente. Con un recuadro se indican las zonas donde hibridan los primers, y en negritas y subrayado las bases que forman el sitio de restriccin de Bsr%, *$*&** &&*&7& SUHVHQWH HQ HO DOHOR DVRFLDGR D WH[WXUD GXUD HQ JUDQR GH WULJR % )RWRJUDItD GH HOHFWURIRUHVLV HQ JHO GH DJDURVD GH SURGXFWRV GH 3&5 DPSOLFDGRV FRQ primers VHxDODGRV HQ JXUD DQWHULRU GLJHridos con la enzima de restriccin Bsr%, (Q FDOOHV \ SDWUyQ GHO DOHOR GH pinb-D1 asociado a textura EODQGD HQ FDOOHV \ SDWUyQ GHO DOHOR GH pinb-D1 asociado a textura dura.
UHSHWLWLYR TXH GLHUH HQWUH HVSHFLHV HVSHFLH HVSHFtFR &RQWUDVWDQGR FRQ HVWD VLWXDFLyQ los genes tienden a ser altamente conservados a nivel de secuencia de ADN y esta caracterstica permite utilizar los genes como sondas SDUD LGHQWLFDU VHFXHQFLDV GH JHQHV RUWyORJRV (genes con funciones similares, presentes en diferentes especies, que derivan de una secuencia ancestral). A partir de esta informacin (presencia/ausencia de genes ortlogos) se construyen los denominados mapas comparativos (Q JHQHUDO DO FRPSDUDU PDSDV JHQpticos de dos especies emparentadas, se han detectado regiones cromosmicas donde los genes mantienen el orden y las relaciones de ligamiento, fenmeno conocido como colinearidad o sintenia (VWD VLQWHQLD VH YD SHUGLHQGR D medida que se comparan especies ms alejaGDV ORJHQpWLFDPHQWH (MHPSORV GH JHQRPDV con regiones colineares se han observado en grupos de especies pertenecientes a la familia Solanaceae (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsis sp. y cultivos del gnero Brassica, y tambin dentro de las gramneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeae (trigo, cebada, centeno) as como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz, maz y sorgo. La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista. Por un lado, aportan informacin valiosa para detectar cambios producidos en la estructura cromosmica, que ocurrieron durante el proceso evolutivo, ya que cuando se comparan la posicin y el nmero de loci entre los mapas de dos especies se hace evidente la ocurrencia de rearreglos como inversiones, translocaciones \ GXSOLFDFLRQHV (Q RWURV FDVRV VH KD SRGLGR detectar la ocurrencia de eventos de poliploidizacin muy antiguos. Por ejemplo, el maz presenta un comportamiento meitico que corresponde al de una especie diploide tpica. Sin embargo, el mapa molecular muestra que numerosos loci 5)/3 GH DUUR] HVWiQ SUHVHQWHV dos veces en el genoma de maz por lo que actualmente se considera que el maz desciende de un poliploide ancestral. Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de informacin molecular de especies modelo con genomas simples,
completamente secuenciados, tales como Arabidopsis y arroz (Arabidopsis *HQRPH ,QLWLDWLYH ,QWHUQDWLRQDO 5LFH *HQRPH 6HTXHQFLQJ 3URMHFW D HVSHFLHV FRQ JHQRPDV ms complejos tales como trigo, cebada, aveQD HWF (VWH KD VLGR WDO YH] HO REMHWLYR SULQFLSDO para impulsar el desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postul el uso de especies modelo, a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento de genomas ms complejos. Asimismo, partiendo del supuesto de que los genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biologa vegetal muy probablemente estn conservados entre distintas especies, y el hecho que la variacin en el tamao de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variaFLyQ HQ OD FDQWLGDG GH $'1 QR FRGLFDQWH \ QR a una variacin en el nmero de genes, la idea GH OOHJDU D OD LGHQWLFDFLyQ FORQDGR \ FDUDFWHULzacin de genes en las especies modelo se ha visto fortalecida. De este modo la informacin generada podra hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivaGDV (Q HVWH VHQWLGR OD LQIRUPDFLyQ PROHFXODU proveniente de los genomas de Arabidopsis y arroz ha sido clave para clonar genes de inters agronmico en especies de genomas complejos como el trigo, como por ejemplo, Vrn-1, Vrn-2, Q, Ph1, Ppd-D1, Lr10, etc. Clonado posicional (O FORQDGR SRVLFLRQDO FRQVLVWH HQ HO DLVODmiento de un gen responsable de un carcter particular a partir del conocimiento de su ORFDOL]DFLyQ HQ HO JHQRPD (O SURFHVR XWLOL]D informacin gentica (modo de herencia del carcter y ubicacin del gen/es en una regin HVSHFtFD GH XQ PDSD PROHFXODU VHFXHQFLD nucleotdica de aquellos genes presentes en la regin cromosmica asociada con el carcter), y de funcin o expresin de los genes. (O SULPHU SDVR SDUD ORJUDU HVWR HV VHOHFFLRnar parentales que sean contrastantes para el carcter vinculado al gen en cuestin, por ejemplo, una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja. Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una poblacin segregante, la ms sencilla es una
) D SDUWLU GH OD FXDO VH FRQVWUX\H XQ mapa gentico utilizando marcadores moleculares, \ VREUH HVWH PDUFR VH LGHQWLFDQ ODV UHJLRQHV cromosmicas asociadas al control de dicha resistencia. 8QD YH] LGHQWLFDGD GLFKD UHJLyQ SDUD avanzar hacia el clonado posicional, es necesario mejorar el grado de resolucin del mapa HQ HVD ]RQD (VWR VH ORJUD VDWXUDQGR GLFKD regin con nuevos marcadores moleculares e incrementando el nmero de individuos de la SREODFLyQ D Q DXPHQWDU ODV SRVLELOLGDGHV GH encontrar recombinantes entre marcadores esWUHFKDPHQWH OLJDGRV (O REMHWLYR HV UHGXFLU HO intervalo del genoma analizado al fragmento mnimo posible que contenga al gen de inters. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo en regiones cromosmicas ortlogas de especies emparentadas FRQ JHQRPDV PHQRV FRPSOHMRV (Q HO FDVR GH trigo, seran arroz, cebada, sorgo, Triticum monococcum, Triticum tauschii, etc. Una vez reducido al mnimo el intervalo de genoma portador del gen de inters, el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotdica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosmica, para lo cual es necesario contar con un mapa fsico (secuencia nucleotdica) de la regin. Para el ejemplo que estamos considerando, la caminata se inicia seleccionando de una "biblioteca" del genoma de trigo (BAC library) aquellos clones (tomos) TXH KLEULGHQ FRQ ORV PDUFDGRUHV TXH DQquean al intervalo portador del gen. Los clones seleccionados en la hibridacin contra la biblioteca son digeridos con enzimas de restricFLyQ SDUD LGHQWLFDU HQ FDGD FDVR IUDJPHQWRV compartidos y no compartidos. Se estima que los clones seleccionados con un mismo marcador deben tener en comn al menos un fragmento de digestin (el fragmento que posee la secuencia del marcador). Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos clones parcialmente solapados entre s. (VWRV H[WUHPRV VH XWLOL]DQ FRPR QXHYRV PDUcadores para extender la caminata cromosmica hacia el gen, reiniciando la bsqueda de FORQHV HQ OD ELEOLRWHFD JHQyPLFD (VWH SURFHVR se hace simultneamente en ambos sentidos, hasta lograr que el mapa fsico (secuencia nu-
cleotdica) que se ha iniciado desde cada marFDGRU DQTXHDQWH IRUPH XQ FRQWLQXR R contig" GH IUDJPHQWRV GH $'1 JHQyPLFR GH WULJR (VWH contig contiene la secuencia del gen en estuGLR (O SDVR VLJXLHQWH FRQVLVWH HQ OD VHFXHQciacin del contig. A partir de esta informacin, y por anlisis de secuencia con herramientas bioinformticas, se determinan los genes presentes y aquellos posibles candidatos del caUiFWHU HQ HVWXGLR /D SUXHED GHQLWLYD SDUD HVtablecer el hallazgo del gen en cuestin es la SUXHED GH FRPSOHPHQWDFLyQ (VWR FRQVLVWH HQ transformar una planta que carece del carcter en estudio (siguiendo con el ejemplo, una variedad de trigo susceptible) con cada uno de los genes candidatos y determinar cual de ellos OH FRQHUH HO FDUiFWHU HQ HVWH FDVR UHVLVWHQFLD al patgeno). A partir de la secuenciacin completa del genoma de arroz es posible obtener una primera estimacin de los genes presentes en nuestro contig, con algunas salvedades, como son la SUHVHQFLD GH JHQHV HVSHFtFRV GH DUUR] TXH no estarn en el contig de trigo) y trigo (que no estarn en el genoma de arroz), ruptura de la colinearidad de genes entre genomas por rearreglos cromosmicos, etc. Como ejemplo, en el clonado posicional del gen Vrn-1 en Triticum monococcum se utiliz una poblacin de LQGLYLGXRV ) SDUD OOHJDU D GHOLPLWDU XQ LQWHUYDOR GH F0 HQ HO FURPRVRPD $m que contena dos genes candidatos. Posteriormente, mediante estudios de expresin de estos genes se observ que slo uno de ellos (Ap1) presentaba un patrn de expresin idntico al gen Vrn-1. Para llegar a esto se trabaj con marcadores provenientes de las bibliotecas de los genomas de cebada, sorgo, arroz y Triticum monococcum JXUD Distribucin de la variabilidad gentica en poblaciones naturales y conservacin Las especies estn constituidas por unidades o demos ms o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. (Q JHQHUDO DGRSWD XQD GLVWULEXFLyQ HQ SDUFKHV (O Q~PHUR GH LQGLYLGXRV HQ FDGD SREODFLyQ HO modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinizacin
JUDYHGDGDQHPyODHQWRPyOD OD DFFLyQ GHO hombre en la fragmentacin del hbitat y el origen (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribucin de la variacin gentica propia de cada especie. Los programas de conservacin utilizan a menudo informacin acerca de la distribucin de la variacin gentica para establecer prioridades y estrategias de manejo. Las variaciones dentro y entre poblaciones colaboran en OD GHQLFLyQ GH ODV XQLGDGHV D FRQVHUYDU \ VH convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la protecFLyQ GH OD ELRGLYHUVLGDG (V GHVHDEOH TXH ODV poblaciones seleccionadas para formar parte de las reas protegidas, contengan la mayor diversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas y microsatlites, pueden obtenerse parmetros de diversidad: P, nmero de loci SROLPyUFRVQ~PHUR WRWDO GH loci analizados; A, nmero promedio de alelos por locus; Ho, heterocigocidad observada; y He, heteroFLJRFLGDG HVSHUDGD Si2, pi: frecuencia allica del alelo i). Dado que los genotipos homo y heterocigotos pueden ser reconocidos, es posible probar si la poblacin se encuentra en equilibrio de Hardy Weinberg. Con los datos de frecuencias allicas disponibles se calculan ndices tales como Nei, Rogers, o Prevosti y se construyen matrices de distancia gentica (D), a partir de las cuales es posible realizar anlisis de agrupamientos que permiten visualizar las semejanzas o diferencias genticas entre poblaciones. (Q HO FDVR GH PDUFDGRUHV dominantes como los RAPD (5DQGRP $PSOLFDWLRQ RI 3RO\PRUphic DNA R $)/3 $PSOLHG )UDJPHQW /HQJth Polymorphism) el genotipo heterocigoto no puede ser reconocido y se asume para una especie diploide que cada banda corresponde D XQ ORFXV FRQ GRV DOHORV $ \ D (O KRPRFLgoto dominante (AA) y el heterocigoto (Aa) corresponden a la presencia de la banda y la ausencia corresponde al homocigoto recesivo (aa). Los parmetros de diversidad pueden ser
estimados: P de la misma manera que para marcadores codominantes; A es dos, por deQLFLyQ VyOR HV SRVLEOH FDOFXODU +H D SDUWLU GH las frecuencias allicas estimadas, asumienq 2 donde q es GR HTXLOLEULR (QWRQFHV q la frecuencia del alelo a y q2 la frecuencia de individuos con ausencia de banda; luego p = T VLHQGR p la frecuencia del alelo A. Con estos datos, para calcular la He se procede de la misma manera que para marcadores codominantes. (O HVWXGLR GH YDULDELOLGDG FRQ PDUFDGRUHV dominantes no permite determinar si una poblacin est o no en equilibrio de Hardy Weinberg. Las diferencias genticas entre poblaciones pueden igualmente ser estimadas con mtodos que no utilizan frecuencias allicas y que por lo tanto no asumen equilibrio. Uno de estos mtodos se basa en el clculo de distancias binarias entre pares de individuos, que consideran la proporcin de bandas compartiGDV (O SDVR VLJXLHQWH FRPSUHQGH XQ DQiOLVLV de la varianza molecular (AMOVA) que permite particionar esta varianza en sus componentes dentro y entre poblaciones a diferentes niveOHV (O SURJUDPD *HQ$O([ GLVSRQLEOH HQ http:// ZZZDQXHGXDX%R=R*HQ$O([, permite realizar AMOVA y otros anlisis de variabilidad, distancia gentica y correlaciones a partir de datos moleculares. Posee un slido soporte terico, es de acceso libre y de fcil manejo dado que se agrega a la barra de herramientas 2IFH ([FHO (O VLJXLHQWH HV XQ HMHPSOR VLPSOLFDGR GH uso de este programa. Paso 1) Confeccin de la tabla de datos en IRUPDWR SDUD *HQ$O([ FRQWHQLHQGR UHJLVWUR GH marcadores RAPD de dos poblaciones vegetales. - Nmero de loci RAPD: 11 (A1) - Nmero de individuos totales: 10 (B1) - Nmero de poblaciones: 2 (C1) 1~PHUR GH LQGLYLGXRV GH OD SREODFLyQ $ (D1) 1~PHUR GH LQGLYLGXRV GH OD SREODFLyQ % (
1 2
3
A 11
ind
B 10
pob
C 2
D 5
E 5
P2 240 P2 260 P2 330 P2 400 P2 440 P6 520 P6 550 P6 590 P6 650 P6 660 P6 800
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A A A A A B B B B B
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 1 1 1 1 0 1 1 0 1
1 0 1 0 1 0 0 0 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 1 1 0 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 1 0 1 1
Paso 2) Clculo de las distancias binarias entre individuos. *HQ$O([ Distance Genetic (binary) 2.
A 1 2
3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
D E 2 5 5 Hoja1 Binary D Pop1 Pop2 1 2 3 4 5 0 3 0 3 2 0 2 1 3 0 3 2 0 3 0 5 4 6 5 6 5 2 4 3 4 4 1 3 2 3 2 1 3 2 3 5 2 4 3 4 1 10
F 1 6
G 10 7
H 8
I 9
J 10
0 2 3 3 2
0 3 3 0
0 2 3
0 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3DVR $ SDUWLU GH OD PDWUL] GH GLVWDQFLD VH UHDOL]D HO DQiOLVLV GH YDULDQ]D PROHFXODU *HQ$O([ AMOVA (tri or square distance matrix; 999 permutations) 2.
Percentages of Molecular Variance
Among Pops 33%
Within Pops 67%
Summary AMOVA Table --------------------------------------------------Source df SS MS Est. Var. % --------------------------------------------------Among Pops 1 4,00 4,00 0,57 33% Within Pops 8 9,20 1,15 1,15 67% Total 9 13,20 1,72 100% --------------------------------------------------Stat Value P (rand >= data) PhiPT 0,331 0,020
Del anlisis se concluye que la diferenciacin molecular entre las poblaciones representa un GH OD YDULDQ]D WRWDO \ TXH HVD GLIHUHQFLD HV VLJQLFDWLYD S /D GLYHUVLGDG JHQpWLFD FXDQWLFDGD SRU marcadores moleculares puede mostrar, por ejemplo, que en una especie nativa de inters forestal todas las poblaciones presentan altos niveles de variabilidad gentica y son bastante VLPLODUHV HQWUH VL (Q HVWH FDVR OD GHFLVLyQ GH
cules poblaciones formarn parte del programa de conservacin podra basarse en consideraciones exclusivamente prcticas ya que las poblaciones son genticamente equivalentes. Por el contrario, una especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado de diferenciacin entre poblaciones, requerir que los esfuerzos de proteccin sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya
que cada una de ellas posee una identidad gentica diferente. Poblaciones de especies endmicas, con niveles de diversidad gentica extremadamente bajos y un reducido nmero de individuos, son normalmente ingresadas a la categora de especies en peligro de extincin. (Q HVWH SXQWR HV LPSRUWDQWH UHFRUGDU TXH los marcadores moleculares representan variacin gentica esencialmente neutra, es decir se encuentran sometidos a la accin de fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva R XMR JpQLFR /DV GHFLVLRQHV QDOHV GH XQ SURgrama de conservacin deberan por lo tanto combinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluacin GH FLHUWRV UDVJRV PRUIROyJLFRV VLROyJLFRV R reproductivos, que son crticos en el proceso de adaptacin y supervivencia de las poblaciones en su hbitat. Las malezas de mayor impacto en la agricultura mundial son en general especies introduFLGDV (Q HO QXHYR WHUULWRULR OLEUH GH SUHVLRQHV selectivas tales como especies competidoras o patgenos caractersticos del ecosistema de origen, la especie introducida es capaz de establecerse y colonizar todos los territorios que renan determinadas condiciones ambientales. La caracterizacin gentica de las poblaciones de malezas puede aportar informacin de utilidad en los programas de control. Mediante marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienen de un solo evento de introduccin, con unos pocos individuos iniciales o por el contrario, ocurrieron mltiples eventos de introduccin. Adems, determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisin cul es el lugar de origen de las poblaciones introducidas, y en este caso rastrear enemigos naturales que pudieran ser tiles en el control biolgico de la especie invasora. (O WLSR GH UHSURGXFFLyQ GH XQD HVSHFLH YHgetal determina en gran parte la distribucin de variabilidad gentica entre poblaciones. Los PHFDQLVPRV UHSURGXFWLYRV SXHGHQ FODVLFDUVH en los tres tipos bsicos: alogamia, autofecunGDFLyQ \ DSRPL[LV (Q UHDOLGDG H[LVWHQ FRPELnaciones de estos tipos bsicos, con porcentajes variables de cada uno de ellos segn las
especies y an dentro de las poblaciones, con IRUPDV REOLJDGDV R IDFXOWDWLYDV (O HVWXGLR GH marcadores moleculares en diferentes plantas de una poblacin y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproduccin de numerosas especies vegetales (VWLPDFLyQ GHO XMR JpQLFR (O XMR JpQLFR HQWUH SREODFLRQHV YHJHWDOHV ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen que la contribucin de estas GRV YtDV DO XMR WRWDO YDUtH GH DFXHUGR D OD HVpecie. Los marcadores moleculares permiten FXDQWLFDU FDGD XQR GH HVWRV SURFHVRV 6L HO XMR JpQLFR VH SURGXFH EiVLFDPHQWH D WUDYpV de polen, los marcadores de ADN de organelas, como por ejemplo cloroplastos, no sern transferidos de una poblacin a otra porque este tipo de informacin es slo heredada va PDWHUQD (Q FRQWUDVWH VL HO XMR JpQLFR VH UHDliza principalmente a travs de semillas, tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia biparental o nuclear, sern transmitidos entre poblaciones. Mediante el uso GH PDUFDGRUHV DOWDPHQWH SROLPyUFRV FRPR los microsatlites es posible determinar cul ha sido la planta donadora del polen de cada semilla de una planta madre, por ejemplo en HVSHFLHV DUEyUHDV (Q HVWH FDVR SRU XQ ODGR se obtiene informacin acerca de la distancia de transporte de polen y adems constituye un test de paternidad. /D HVWLPDFLyQ GHO XMR JpQLFR KD FREUDGR especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de ORV PDWHULDOHV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 'H esta manera, es factible analizar la posibilidad de que poblaciones silvestres cercanas a las formas cultivadas, adquieran el transgn mediante fecundacin cruzada, generando cambios en la dinmica poblacional, competitividad o relacin con otros miembros de la comunidad bitica tales como polinizadores, patgeQRV HWF (VWD SRWHQFLDO WUDQVIHUHQFLD GH JHQHV VH WRUQD SUHRFXSDQWH FXDQGR VH WUDWD GH Xjo gnico hacia poblaciones silvestres cataloJDGDV FRPR PDOH]DV (Q HVWH HVFHQDULR ORV marcadores moleculares de ADN o isoenzimas
constituyen herramientas muy tiles. Los individuos de una determinada poblacin pueden ser analizados y comparados con su progenie, producto de una polinizacin libre. Los alelos que no estaban presentes en la poblacin materna son atribuidos al ingreso externo de polen GHO FXOWLYR (YDOXDQGR SREODFLRQHV D GLVWDQFLDV crecientes desde una determinada fuente de SROHQ HO XMR JpQLFR SXHGH VHU FXDQWLFDGR \ cuando esta informacin se complementa con datos de compatibilidad sexual, polinizadores y clima se arriba a una serie de conclusiones que pueden aplicarse al cultivo en gran escala de variedades transgnicas. Se trate de variedades transgnicas o no, los procesos de hibridacin de formas cultivadas y silvestres, alteran los niveles de diversidad gentica de las poblaciones naturales, produciendo una erosin de los recursos genticos vegetales, con potencial aplicacin en mejora. 1XHYDPHQWH OD HVWLPDFLyQ GHO XMR JpQLFR \ OD determinacin de la variabilidad gentica mediante marcadores pueden contribuir a atenuar los procesos de "homogenizacin" gentica y dar tiempo a la evaluacin de las poblaciones naturales en cuanto a rasgos como resistencia a enfermedades o parmetros de calidad. Filogenia /D ORJHQLD LQWHQWD UHFRQVWUXLU ODV UHODFLRQHV jerrquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta informacin FRPR FULWHULR GH FODVLFDFLyQ ELROyJLFD (O FRQRFLPLHQWR GH OD ORJHQLD \ GLYHUVLGDG JHQpWLca de los recursos silvestres permite optimizar los procesos de hibridacin con los materiales cultivados. Cultivos importantes como trigo, girasol, tomate, poroto, o arroz cuentan con numerosas especies o gneros silvestres relacionados, con potencial uso en el mejoramiento gentico mediante cruzamientos. Los marcadores moleculares han aportado nuevas formas de anlisis para la resolucin GH LQFyJQLWDV ORJHQpWLFDV R WD[RQyPLFDV /RV PDUFDGRUHV 5)/3 VRQ SDUWLFXODUPHQWH ~WLOHV dado que estn basados en reacciones de hibridizacin, lo que garantiza la homologa de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa. RAPDs no requiere un conocimiento previo del genoma en estudio y puede
ser aplicado a diferentes especies pero la interpretacin de los datos parte de asumir que ORV SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ GH LJXDO WDPDxR son homlogos. 8QR GH ORV PpWRGRV GH DQiOLVLV ORJHQpWLco a partir de marcadores, consiste en calcular un ndice de distancia gentica en base al nmero de bandas en comn, y luego realizar un anlisis de agrupamiento (UPGMA) o rbol ORJHQpWLFR 1HLJKERXU -RLQLQJ TXH UHHMH ODV relaciones entre los taxa (VWDEOHFHU FXiO HV HO rbol correcto entre todos los posibles es una tarea difcil que en parte es resuelta mediante el uso de mtodos estadsticos, como tcnicas de re-muestreo, que generan ndices de FRQVLVWHQFLD R FRQDELOLGDG SDUD FDGD iUERO Las relaciones establecidas de este modo se FRWHMDQ OXHJR HQ UHODFLyQ D ODV YtDV ORJHQpWLcas propuestas a partir de datos citogenticos, morfolgicos, ecolgicos, cruzamientos, etc. Por otro lado, la comparacin de mapas moleculares entre especies ha permitido conocer el tipo de reorganizacin genmica que ha operado durante el proceso de especiacin. Cuando se compara el orden de los marcadores moleculares del girasol, Helianthus annuus, y especies relacionadas como H. petiolaris o H. argophyllus se observa que estas especies poseen zonas colineares y zonas no colineares, originadas estas ltimas en cambios estructurales. Cuando se incluy en el mapeo comparativo a H. anomalus se pudo inferir que: i) esta especie ha surgido por hibridacin entre H. annuus y H. petiolaris; ii) conserva el nmero cromosmico de las especies parentales (especiacin homoploide); iii) cambios en la estructura cromosmica han sido un mecanismo importante en la evolucin de las especies anuales de Helianthus . Mediante marcadores es posible elucidar las especies parentales ancestrales de una especie alopoliploide, como el tabaco o el algodn. Basta con examinar las variantes moleculares de las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada. (O PRGR HQ TXH VHJUHJD XQ PDUFDGRU FRGRPLQDQWH HQ XQD SURJHQLH LQWHUHVSHFtFD SHUPLWH inferir el comportamiento dismico o polismico, lo que permite caracterizar una especie en cuanto a su origen alo- o autopoliploide, respectivamente.
(Q OD HYROXFLyQ GHO JpQHUR Citrus ha operado la hibridacin natural a travs de reproduccin sexual pero tambin estn presentes mecanismos apomcticos que constituyen barreras al intercambio de genes. La taxonoma de este grupo resulta particularmente compleja ya que no puede ser aplicado el concepto biolgico de especie. Marcadores de ADN han permitido HVFODUHFHU ODV UHODFLRQHV GH HVWH SROLPyUFR grupo que incluye naranjas, limones, limas y mandarinas. Los estudios moleculares ms recientes han colocado al tomate, previamente denominado Lycopersicon esculentum, dentro del gnero Solanum, cambiando su denominacin por Solanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los mapas de ligamiento constituyen evidencias de que el tomate y la papa comparten un antecesor comn PX\ UHFLHQWH (VWD LQIRUPDFLyQ UHVXOWD GH JUDQ aplicacin en el mejoramiento de estos cultivos as como en la comprensin de la evolucin de los genomas. (Q ORV ~OWLPRV DxRV KD WRPDGR JUDQ LPSRUWDQFLD OD ORJHQLD EDVDGD HQ GDWRV GH VHcuencias de ADN, en la que cada base de un grupo de secuencias alineadas, constituye un carcter a comparar. La velocidad de cambio GHO $'1 D OR ODUJR GHO SURFHVR HYROXWLYR GLHre en las distintas porciones de un genoma, encontrndose algunas secuencias altamente conservadas y otras con elevadas tasas de sustitucin. Si los taxones a comparar han divergido recientemente, ser conveniente utilizar secuencias altamente variables, que hayan H[SHULPHQWDGR VXFLHQWHV FDPELRV HQ FRUWRV perodos de evolucin. Por el contrario, si las especies a comparar llevan mayores tiempos de divergencia (especies poco relacionadas) deben utilizarse secuencias ms estables, con menores tasas de sustitucin. Por otro lado, la existencia de genomas nucleares, mitocondriales y plastdicos que evolucionan a tasas espeFtFDV UHSUHVHQWDQ KHUUDPLHQWDV DGLFLRQDOHV SDUD HVWXGLDU ODV UHODFLRQHV ORJHQpWLFDV HQWUH especies con distintos grados de parentesco.
$QGHUVHQ - 5 /EEHUVWHGW 7 )XQFWLRQDO markers in plants. Trends in Plant Science, 8, Angiolillo A, Mencuccini M, Baldoni L. 1999. Olive JHQHWLF GLYHUVLW\ DVVHVVHG XVLQJ DPSOLHG IUDJment polymorphisms. Theor. Appl. Genet., 98, 411-421. $UDELGRSVLV *HQRPH ,QLWLDWLYH $QDO\VLV RI WKH JHQRPH VHTXHQFH RI WKH RZHULQJ SODQW Arabidopsis thaliana 1DWXUH %DJJH 0 ;LD ; /EEHUVWHGW 7 )XQFWLRQDO PDUNHUV LQ ZKHDW &XUUHQW 2SLQLRQ LQ 3ODQW %LRORJ\ Buerkle C. A, Rieseberg L.H. 2008. The rate of genome stabilization in homoploid hybrid species. (YROXWLRQ &DUUHUD $ 3L]DUUR * 3RYHUHQH 0 )HLQJROG 6 %HUry S, Len A. 2002. Variability among inbred lines DQG 5)/3 PDSSLQJ RI VXQRZHU LVR]\PHV *HQHWLFV DQG 0ROHFXODU %LRORJ\ 'HYRV .0 DQG *DOH 0' *HQRPH UHODWLRQships: The grass model in current research. The 3ODQW &HOO 'XEFRYVN\ - DQG 'YRUDN - *HQRPH SODVWLFLW\ D NH\ IDFWRU LQ WKH VXFFHVV RI SRO\SORLG ZKHDW XQGHU GRPHVWLFDWLRQ 6FLHQFH *RGW 0 +DPULFN - $OOR]\PH GLYHUVLW\ LQ WKH JUDVVHV (Q *3 &KHSOLFN HG 3RSXODWLRQ ELROogy of grasses. Cambridge University Press. pp +XII '5 3HDNDOO 5 6PRXVH 3( 5$3' YDULDWLRQ ZLWKLQ DQG DPRQJ QDWXUDO SRSXODWLRQV RI RXWcrossing buffalograss Buchloe dactyloides (Nutt) (QJHOP 7KHRUHWLFDO DQG $SSOLHG *HQHWLFV ,QWHUQDWLRQDO 5LFH *HQRPH 6HTXHQFLQJ 3URMHFW 7KH PDSEDVHG VHTXHQFH RI WKH ULFH JHQRPH 1DWXUH 0DQLIHVWR 00 6FKODWWHU $5 +RSS +( 6XiUH] (< DQG 'XEFRYVN\ - 4XDQWLWDWLYH HYDOXDWLRQ RI JHQHWLF GLYHUVLW\ LQ ZKHDW JHUPSODVP XVLQJ PROHFXODU PDUNHUV &URS 6FLHQFH Moore G. 2001. Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. 7UHQGV LQ *HQHWLFV Paterson A, Tanksley S, Sorrells M. 1991. DNA markers in plant improvment. Advances in AgronRP\
3HDNDOO 5 6PRXVH 3( *HQ$O([ *HQHWLF DQDO\VLV LQ ([FHO 3RSXODWLRQ JHQHWLF VRIWZDUH IRU WHDFKLQJ DQG UHVHDUFK 0ROHFXODU (FRORJ\ 1RWHV Rieseberg L, Seiler G, 1990. Molecular evidence and the origin and development of the domestiFDWHG VXQRZHU Helianthus annuus, AsteraceDH (FRQRPLF %RWDQ\ 6KHUU\ $ )OLQW*DUFLD -HIIU\ 0 7KRUQVEHUU\ DQG (GZDUG 6 %XFNOHU ,9 6WUXFWXUH RI OLQNDJH disequilibrium in plants. Annu. Rev. Plant Biol., 6ROWLV ( 6ROWLV 3 &RQWULEXWLRQ RI SODQW PRlecular systematics to studies of molecular evoluWLRQ 3ODQW 0ROHFXODU %LRORJ\ 6WHLQ 1 & )HXLOOHW 7 :LFNHU ( 6FKODJHQKDXI DQG % .HOOHU 6XEJHQRPH FKURPRVRPH ZDONLQJ LQ ZKHDW $ NE SK\VLFDO FRQWLJ LQ 7ULWLFXP monococcum L. spans the Lr10 resistance locus LQ KH[DSORLG ZKHDW 7ULWLFXP DHVWLYXP / 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$ 7RKPH - *RQ]DOH] ' %HHEH 6 'XTXH 0 $)/3 DODO\VLV RI JHQH SRROV RI D ZLOG EHDQ FRUH FROOHFWLRQ &URS 6FL Yan, L., Loukoianov, A., Tranquilli, G., Helguera, M., )DKLPD 7 DQG - 'XEFRYVN\ 3RVLWLRQDO FORQLQJ RI ZKHDW YHUQDOL]DWLRQ JHQH 951 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$
III. CAPTULO 3 Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos

&DUORV 6DOD 0DULDQR %XORV $QDOLD )UHVFR (PLOLDQR $OWLHUL
Introduccin
(O PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR HV XQ FRQMXQWR GH SULQFLSLRV FLHQWtFRV PpWRGRV WpFQLFDV \ HVtrategias aplicadas a la obtencin de genotipos o grupos de genotipos con caractersticas deVHDEOHV VHJ~Q REMHWLYRV SUHYLDPHQWH GHQLGRV (O SURFHVR IXQGDPHQWDO TXH VXE\DFH HQ el mejoramiento es el de cambio adaptativo por sustitucin allica bajo seleccin. La mutacin, OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD WUDQVJpQHVLV pueden aportar nuevos caracteres a la diversidad de un cultivo, no obstante el proceso fundamental, luego que tales caracteres son LQFRUSRUDGRV DO JHUPRSODVPD QR VH PRGLFD (O PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR HV XQ SURFHVR FtFOLFR (Q FDGD FLFOR VH HYDO~DQ WRGRV ORV LQdividuos de una poblacin determinada. Como resultado de esta evaluacin, se seleccionan los individuos deseables y los restantes son GHVFDUWDGRV )LQDOPHQWH ORV LQGLYLGXRV VHOHFtos se cruzan entre s (se recombinan) para dar origen a una nueva generacin en que se reinicia un nuevo ciclo. Un excelente medio para organizar una discusin en torno a cmo maximizar el progreso JHQpWLFR \ GLVWULEXLU HFLHQWHPHQWH ORV UHFXUVRV dentro de un programa de mejoramiento es la ecuacin de ganancia gentica por seleccin: Gy = N \
2 A P
(VHQFLDOPHQWH HVWD HFXDFLyQ LQGLFD TXH HO progreso gentico de cualquier programa de mejora (Gy) es directamente proporcional a la YDULDELOLGDG KHUHGDEOH 2A) disponible y a la intensidad de seleccin que se aplique (k). La YDULDELOLGDG JHQpWLFD GLVSRQLEOH UHHMD HO JUDGR de diversidad de los materiales genticos que SRVHH HO SURJUDPD GH PHMRUD (Q HO H[WUHPR
XQ SURJUDPD TXH FDUHFH GH YDULDELOLGDG 2A 0) no tendr posibilidad de generar nuevos genotipos por recombinacin y seleccin por lo que su progreso gentico se ver severamente GLVPLQXLGR *\ 3RU RWUD SDUWH HO SURJUHso por seleccin es inversamente proporcional al nmero de aos que se tarda en completar un ciclo de seleccin (y) y al desvo fenotpico P (O GHVYtR IHQRWtSLFR UHHMD EiVLFDPHQWH el grado de interaccin entre el genotipo y el DPELHQWH SDUD H[SUHVDU XQ GDGR IHQRWLSR (Q otras palabras, es una medida de la correlacin existente entre genotipo y fenotipo. Consideremos un determinado carcter (por ejemplo, la resistencia a una enfermedad) el cual est gobernado por un solo gen con dos alelos, el alelo de resistencia es incompletamente dominante, el patgeno est siempre presente y las condiciones ambientales para que se produzca la infeccin son siempre favorables. Por lo tanto, si se observa una planta sin sntomas puede concluirse que la misma HV KRPRFLJRWD SDUD HO DOHOR GH UHVLVWHQFLD (Q forma similar, si se observa una planta muy afectada por la enfermedad se concluir que la planta es homocigota para el alelo que conHUH VXVFHSWLELOLGDG \ WRGDV ODV SODQWDV TXH muestren fenotipos intermedios podran consiGHUDUVH KHWHURFLJRWDV (Q HVWH FDVR LGHDO HO fenotipo estara indicando exactamente cul es el genotipo de cada individuo, la correlacin entre fenotipo y genotipo tendera a 1 y el desvo fenotpico tendera a cero. Bajo esas condiciones el progreso gentico por eleccin sera mximo. Lamentablemente, en la prctica este tipo de ejemplo jams ocurre. Los caracteres de importancia econmica no siempre estn gobernados por un nico gen, sino por varios, y las relaciones de dominancia y de epistasis (interaccin entre genes) suelen ser bastante complicadas. Asimismo, el patgeno puede o no estar presente, y el ambiente puede o no ser favorable para el desarrollo de la enfermedad. Por todas esas razones, la asociacin entre fenotipo y genotipo es en general escasa, lo que hace que al evaluar individuos a travs de su fenotipo no se est seleccionando el genotipo adecuado y la recombinacin incluir muchas cruzas entre individuos que no portan HOORV JHQHV GHVHDGRV (O UHVXOWDGR HV TXH HO
incremento de los alelos favorables dentro de la poblacin se hace a tasas ms lentas y, por ende, el progreso gentico es mucho menor. La tecnologa de marcadores moleculares se SXHGH DSOLFDU SDUD RSWLPL]DU R KDFHU PiV Hciente todos y cada uno de los factores determinantes de la ganancia gentica o del progreso gentico por seleccin. As, los marcadores moleculares pueden utilizarse para: Organizar, mantener e incrementar la diversidad gentica. De este modo se ver incrementado el numerador de la ecuacin y, por ende, el progreso gentico. Disminuir la interaccin genotipo/ambiente. Si en lugar de seleccionar por el fenotipo se seleccionara por el genotipo de cada individuo, tendera a disminuir drsticamente el denominador de la ecuacin de ganancia gentica, con el consiguiente incremento del progreso SRU VHOHFFLyQ (VWH WLSR GH VHOHFFLyQ VH GHQRmina seleccin asistida por marcadores moleculares o, simplemente, seleccin asistida. Disminuir el tiempo requerido para completar los ciclos de seleccin. Si para incorporar un carcter dentro del germoplasma del cultivo VH WDUGD XVXDOPHQWH D JHQHUDFLRQHV ORV marcadores moleculares permiten acortar esos SOD]RV D JHQHUDFLRQHV SRU OR TXH HO SURJUHVR gentico se ver incrementado. Adicionalmente, los marcadores permiten la introgresin de tales caracteres con un mnimo de incorporacin de genes provenientes del individuo dador, garantizando de ese modo, que no se reduzcan las medias poblacionales para aquellos caracteres que no estn relacionados con el JHQ LQWURGXFLGR (VWH WLSR GH PpWRGR GH LQFRUporacin de variabilidad al germoplasma se denomina retrocruzas asistidas por marcadores moleculares o, simplemente, conversiones. A lo largo de este captulo se analizarn con mayor detalle los modos de implementacin de los marcadores moleculares en todas estas reas lo que, en ltima instancia, contribuye a maximizar el progreso gentico. Seleccin asistida por marcadores moleculares La aplicacin de marcadores moleculares en el mejoramiento de cultivos fue inicialmente propuesta al comienzo de la dcada de
1980 cuando se utilizaron algunos marcadores isoenzimticos para acelerar la introgresin de caracteres monognicos desde el germoplasma extico hacia trasfondos cultivados. Pocos DxRV GHVSXpV %HFNPDQQ 6ROOHU GHVFULELHURQ HO XVR GH PDUFDGRUHV 5)/3V ResWULFWLRQ )UDJPHQW /HQJWK 3RO\PRUSKLVP) en el mejoramiento de cultivos, incluyendo los aspectos tericos relacionados con las retrocruzas asistidas por marcadores para el meMRUDPLHQWR GH FDUDFWHUHV FXDOLWDWLYRV /DQGH Thompson (1990) fueron los primeros en considerar los aspectos tericos de la seleccin asistida por marcadores (MAS, por su acrnimo ingls) para los caracteres cuantitativos, y catalizaron una serie de publicaciones de estudios de simulacin en la dcada del 90. Ms recientemente, se han publicado resultados de la aplicacin de MAS en programas de mejora y algunas consideraciones tericas adicionales, incluyendo la optimizacin de los sistemas de retrocruzas asistidas por marcadores (MABC, por su acrnimo ingls); y las estrategias para la piramidizacin o apilamiento de alelos favorables en esquemas de seleccin recurrente. Todos estos estudios han contribuido a nuestro entendimiento de muchos aspectos bsicos a tener en cuenta al implementar MAS, tales como el tipo de poblaciones, el tamao de la muestra, el tamao genmico, y el nmero de marcadores. Asimismo, hay varias revisiones que comparan el uso de distintos tipos de marcadores en mejoramiento. /D JXUD PXHVWUD ORV SDVRV SDUD UHDOL]DU seleccin utilizando marcadores moleculares microsatlites (si bien, cualquier otro tipo de marcador podra ser usado). Bsicamente, de cada planta a evaluar se extrae su ADN, se DPSOLFD HO PDUFDGRU TXH HVWp DVRFLDGR DO JHQ de inters utilizando la tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), y el producto de amSOLFDFLyQ VH VRPHWH D XQD FRUULGD HOHFWURIRUptica en geles para su observacin. Se muestra un ejemplo de seleccin asistida para desarrollar resistencia a una enfermedad denominada Mancha ojo de rana producida por Cercospora sojina HQ VRMD (Q HO JHO TXH VH PXHVWUD D OD derecha del esquema pueden observarse los fragmentos de ADN obtenidos para un progenitor resistente (R), un individuo susceptible (S)
Figura 1. (WDSDV GH OD VHOHFFLyQ DVLVWLGD SRU PDUcadores moleculares. Los individuos a evaluar son muestreados y el material foliar es acondicionado de acuerdo al mtodo que se utilice para la extracFLyQ GHO $'1 (O $'1 REWHQLGR HV XWLOL]DGR FRPR PROGH SDUD UHDOL]DU HO SURFHVR GH DPSOLFDFLyQ SRU PCR del marcador elegido. Los fragmentos obtenidos para cada individuo son resueltos mediante electroforesis. Los resultados son ledos e interpretados para decidir la seleccin de los individuos que presenten el alelo de inters. Actualmente, una o ms etapas de este proceso pueden ser automatizadas.
y varios descendientes de la primera retrocuza con el padre resistente. Tales descendientes muestran el fragmento que indica la presencia del gen de resistencia, o bien, ambos fragmentos, lo que indica que son heterocigticos para el gen de resistencia. ([LVWHQ DOJXQRV DVSHFWRV LPSRUWDQWHV TXH deben considerarse para la implementacin de la seleccin asistida por un carcter en XQ SURJUDPD GH PHMRUD (OORV VRQ D HO WLSR de marcador elegido; b) la distancia gentica entre el marcador y el gen de inters; c) la/s fuente/s posible/s para el carcter o gen de inters. Respecto del primer punto, cuando se practica seleccin asistida por marcadores es necesario evaluar cientos o miles de plantas en IRUPD HFLHQWH \ HOOR GHWHUPLQD OD HOHFFLyQ GH los mismos. Cierto tipo de marcadores (como por ejemplo aquellos basados en la hibridacin GHO $'1 FRPR ORV 5)/3V QR VH DGDSWDQ ELHQ
D HVWH Q GDGR TXH VRQ WpFQLFDPHQWH PiV ODERULRVRV (Q JHQHUDO ORV PDUFDGRUHV EDVDGRV en PCR son los ms indicados para este tipo de aplicacin. Por esta razn, en muchas oporWXQLGDGHV VH FRQYLHUWHQ PDUFDGRUHV 5)/3V HQ marcadores basados en PCR. Dentro de los marcadores basados en PCR, los marcadores PXOWLSXQWR FRPR ORV $)/3V $PSOLHG )UDJment Length Polymorphism 5$3'V Ramdon $PSOLFDWLRQ RI 3RO\PRUSKLF '1$ R ,665V Inter Simple Sequence Repeats-) presentan GRV GLFXOWDGHV VRQ HQ JHQHUDO GRPLQDQWHV \ QR HV HFLHQWH DPSOLFDU \ OHHU P~OWLSOHV IUDJmentos para detectar slo el que nos interesa. (VWD ~OWLPD GLFXOWDG VH UHVXHOYH GLVHxDQGR marcadores SCAR (Sequence Characterized $PSOLHG 5HJLRQ) a partir del fragmento poOLPyUFR TXH HVWi DVRFLDGR DO JHQ R FDUiFWHU GH LQWHUpV 'H HVWH PRGR OD DPSOLFDFLyQ GHO $'1 FRQ FHEDGRUHV HVSHFtFRV SURGXFH SDWURnes simples y de fcil lectura. Sin embargo, los SCARs son en general dominantes, lo que inYROXFUD XQD GLFXOWDG DGLFLRQDO 6L HO PDUFDGRU es codominante, como el que se muestra en el ejemplo de la JXUD VH SXHGH GHWHUPLQDU inmediatamente si cada individuo resistente es homocigtico o heterocigtico para el gen en cuestin. Si, en cambio, el marcador fuese dominante, nicamente se podran distinguir los individuos portadores del gen de resistencia de DTXHOORV TXH QR OR SUHVHQWDQ (Q HVRV FDVRV posteriormente se deber determinar si cada individuo es o no homocigtico mediante anlisis de la descendencia de cada planta. Para solucionar este inconveniente lo que se hace es disear un marcador CAPs (Cleaved AmSOLHG 3RO\PRUSKLF 6HTXHQFH) o bien utilizar OD WpFQLFD GH 3&5 HQ WLHPSR UHDO (O VHJXQGR punto importante se relaciona con la distancia gentica existente entre el marcador molecuODU \ HO JHQ GH LQWHUpV ,GHDOPHQWH VH GHEHUtDQ XWLOL]DU PDUFDGRUHV HVSHFtFRV GH DOHOR No obstante, en general no es posible disponer de tales tipos de marcadores. A medida que la distancia entre el marcador y el gen de inters se acrecienta, mayor ser la probabilidad de cometer errores de evaluacin (tomar a un individuo como positivo cuando en realidad no OR HV (VWD GLFXOWDG SXHGH VROXFLRQDUVH GH GRV IRUPDV EiVLFDV (Q SULPHU OXJDU VH GHEH
tratar de saturar la regin de inters con un mayor nmero de marcadores para hallar uno que est ms cercano al gen. Si ello no fuera posible o los nuevos marcadores hallados no se HQFXHQWUHQ VXFLHQWHPHQWH FHUFDQRV DO JHQ GH inters, se puede optar por utilizar dos marcadores -uno por encima y otro por debajo del gen en cuestin- para reducir la probabilidad de FRPHWHU HUURUHV GH HYDOXDFLyQ )LQDOPHQWH OD tercera consideracin a realizar es acerca de la fuente del carcter o gen de inters. Cuando en un dado cultivo un carcter o un gen tienen un solo ancestro dador (o sea, hay una sola fuente original), existir un solo tamao de fragmento para el alelo de inters y uno o varios fragmentos de diferente tamao para los otros alelos. (Q FRQVHFXHQFLD ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV GH la poblacin de mapeo del carcter en cuestin son inmediatamente utilizables o trasladables a otras poblaciones y lneas. No obstante, lo usual es que existan diferentes fuentes. Si esto es as, primero hay que determinar los tamaos de fragmento tanto para las diferentes fuentes de resistencia como para aquellos individuos que no portan el alelo de inters, ya que en muchas oportunidades el tamao de fragmento puede variar entre diferentes fuentes de resistencia. Asimismo, en otras poblaciones o en otro sector del germoplasma, un marcador detectado preYLDPHQWH FRPR SROLPyUFR HQ OD SREODFLyQ GH PDSHR RULJLQDO SXHGH VHU PRQRPyUFR HQWUH individuos contrastantes para el carcter, lo que puede inducir a errores de evaluacin. -XVWLFDFLRQHV SDUD HO XVR GH VHOHFFLyQ asistida por marcadores en mejoramiento gentico. /DV MXVWLFDFLRQHV SDUD HO GHVDUUROOR \ XVR GH MAS en mejoramiento gentico pueden agruSDUVH HQ FDWHJRUtDV GLIHUHQWHV ODV FXDOHV VRQ relevantes para casi todos los cultivos: Cuando la heredabilidad del carcter que se est evaluando es baja (o sea, cuando la expreVLyQ GH XQ FDUiFWHU VH KDOOD DOWDPHQWH LQXLGD por el ambiente) ya sea porque la gentica del carcter es compleja, la penetrancia es baja o la expresividad es variable. Cuando no hay mtodos efectivos, precisos o rutinarios de seleccin fenotpica o convencional, o stos son caros, su determinacin es en-
gorrosa, o bien depende de ambientes especFRV R HVWDGRV GH GHVDUUROOR TXH LQXHQFLDQ OD expresin del fenotipo. Asimismo, para el caso de resistencia a enfermedades, cuando el patgeno est ausente en el lugar donde se realiza la seleccin o su frecuencia de aparicin (su incidencia) vara mucho entre aos. Cuando se necesita un elevado nmero de individuos para evaluar fenotpicamente el carcter en cuestin (ejemplo: calidad panadera en trigo), los marcadores permiten realizar tal evaluacin sobre un solo individuo y en las primeras generaciones de endocra. Cuando es necesario apilar o piramidizar varios genes o QTLs que determinan un solo carcter, como por ejemplo la resistencia a roya de la hoja o a la fusariosis de la espiga en trigo, lo que puede ser muy engorroso o virtualmente imposible si se utilizan mtodos fenotpicos solamente. &XDQGR VH QHFHVLWD LQGLYLGXDOL]DU HFD]mente las fuentes de resistencia a patgenos existentes en el germoplasma y buscar nuevas IXHQWHV SDUD FRPSOHPHQWDU ODV DQWHULRUHV (VWD prospeccin de recursos genticos mediante el uso de marcadores no est limitada a las resistencias a patgenos sino que puede emplearse para otros caracteres, como por ejemplo la calidad del producto. /RV PDUFDGRUHV PROHFXODUHV QDOPHQWH GHbido a que permiten determinar la gentica subyacente detrs de un dado fenotipo garantizan la generacin del mismo en forma recurrente. (Q RWUDV SDODEUDV ORV PDUFDGRUHV SHUPLWHQ UH obtener las combinaciones de genes o QTLs cuya interaccin gobierna un determinado fenotipo, proceso que -si librado al azar- sera de una ocurrencia altamente improbable. (Q OD WDEOD VH HMHPSOLFDQ DOJXQRV GH ORV caracteres en distintos cultivos cuya seleccin se realiza por medio de marcadores moleculares. Como puede apreciarse, estos caracteres van desde resistencias a enfermedades hasta caracteres que estn relacionados con la calidad del producto, incluyendo caracteres de herencia simple (por ejemplo, la resistencia a Cercospora sojina en soja) hasta caracteres de herencia compleja (por ejemplo, la calidad panadera en trigo o la resistencia a la virosis conocida como Mal de Ro Cuarto en maz).
Tabla 1. (MHPSORV GH FDUDFWHUHV SDUD ORV FXDOHV VH UHDOL]D VHOHFFLyQ DVLVWLGD XWLOL]DQGR PDUFDGRUHV PRleculares agrupados por rasgo. Los ejemplos fueron escogidos para representar la diversidad de mbitos donde esta metodologa encuentra aplicacin. 5HI *XR HW DO 7KHRU $SSO *HQHW 'HGU\YHU HW DO *HQRPH 6DOD HW DO 6RO 3DW $UJ ,13, $5 3DQNRYLF HW DO 3ODQW %UHHG =KX HW DO &URS 6FL 6XWND (XSK\WLFD /HH HW DO 7KHRU $SSO *HQHW 0DJDOKDHV HW DO *HQHWLFV <DQ HW DO 31$6 0RKOHU HW DO (XSK\WLFD 6DOYL HW DO 3ODQW 0RO %LRO (OOLV HW DO 7KHRU $SSO *HQHW $KPDG 7KHRU $SSO *HQHW 'LVWHOIHOG HW DO 1HZ 3K\WRORJLVW /LOOHPR 5LQJOXQG 3ODQW %UHHG .LP HW DO (XSK\WLFD %LO\HX HW DO &URS 6FL *XQQDU HW DO 0RO %UHHG 6DOD HW DO &URS 6FL HQ SUHQVD <DQJ HW DO - $JULF )RRG &KHP 7HUU\ +DUULV (XU )RRG 5HV 7HFKQRO
Tipo de Rasgo
Cultivo Soja
Ejemplos Resistencia a Nematodo del Quiste Resistencia a Roya de la hoja Resistencia a Mal de Rio IV Resistencia a Plasmopara Resistencia a insectos Tolerancia a heladas Tolerancia a salinidad Tolerancia a aluminio Requerimiento de fro para florecer Requerimiento fotoperidico para florecer Das a floracin Enanismo Calidad panadera Porcentaje de protena en el grano Dureza del grano Inhibidor de tripsina (Kunitz) Bajo contenido de cido linolnico
Marcador Ref SSR SCAR SSR CAPS SSR RFLPAFLP SSR RFLP RFLP AFLPSCAR AFLP SCAR SCAR SCAR CAPS SSR SNP SCAR INDEL SCAR SCAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Resistencias a enfermedades y plagas
Trigo Maz Girasol Soja Trigo
Resistencias a estrs abitico
Soja Sorgo Trigo Trigo
Adaptacin
Maz Trigo Trigo Trigo
Calidad del producto
Trigo Soja Soja
Girasol Alto contenido de cido oleico Resistencia a herbicidas Girasol Resistencia a imidazolinonas Maz Soja Resistencia a glifosato Resistencia a glifosato
Conversiones Se denomina retrocruza asistida por marcadores moleculares o conversin al proceso de introgresar un carcter controlado por uno o pocos genes desde un genotipo dador o donante a un genotipo recurrente, de modo tal de obtener el trasfondo gentico del recurrente con el carcter deseado. Los marcadores se utilizan para realizar la seleccin por el carcter de inters y, an ms importante, para seleccionar las plantas de modo tal de recuperar ms rpidamente el trasfondo gentico del padre recurrente. Para entender mejor la importancia de este mtodo como as tambin su implementacin, lo mejor es comenzar por analizar el mtodo convencional o tradicional de retrocruzas.
El mtodo de mejoramiento por retrocruzas (O PpWRGR GH UHWURFUX]DV HV XQ PpWRGR PX\ antiguo de mejoramiento y consiste en el cruzamiento repetido de la progenie hbrida derivada GH XQD FUX]D FRQ XQR GH VXV SDUHQWDOHV (O REjetivo principal es mejorar a una lnea, cultivar o variedad ya existente por una o ms caractersticas SDUD OD FXDO HV GHFLHQWH Por ejemplo, una variedad de soja tiene buen rendimiento y estabilidad del rendimiento, pero es susceptible a una enfermedad importante de herencia simple, mientras que otra variedad es resistente a tal enfermedad pero es deFLHQWH HQ PXFKRV RWURV aspectos. Un objetivo del mejoramiento podra ser obtener una nueva variedad con las caractersticas deseables de rendimiento Figura 2. 0pWRGR GH UHWURFUX]DV $ (VTXHPD GHO PpWRGR WUDGLFLRQDO y estabilidad de la primera de retrocruzas. (B) Comparacin de los niveles de recuperacin del y con el/los gen/es de retrasfondo gentico del padre recurrente utilizando el mtodo tradicional sistencia de la segunda. de retrocruzas y el asistido por marcadores. (C) Comparacin de los (O HVTXHPD JHQHUDO GH niveles de eliminacin del arrastre por ligamiento utilizando retrocruzas implementacin del mconvencionales y asistidas por marcadores. D progenitor donante del todo de retrocruzas es el FDUiFWHU D LQFRUSRUDU 5 SURJHQLWRU UHFXUUHQWH %& %& %& JHQHUDVLJXLHQWH JXUD $ 8QD ciones sucesivas de retrocruzas hacia el progenitor recurrente.
lnea pura (el padre recurrente, R) de muy bueQDV FDUDFWHUtVWLFDV DJURQyPLFDV SHUR GHFLHQWH para un carcter, se cruza con un individuo que exhibe el carcter en cuestin (individuo dador, ' \ VH REWLHQHQ GHVFHQGLHQWHV ) (VWDV SODQWDV ) VH UHWURFUX]DQ FRQ HO SURJHQLWRU 5 /D progenie obtenida se denomina retrocruza 1 %& (Q HVWD JHQHUDFLyQ %& VH VHOHFFLRQDQ las plantas que muestran el carcter de inters y se retrocruzan con R, obtenindose la retrocruza 2 (BC2). Se repite de nuevo este proceso de seleccin por el carcter y retrocruzamiento con el progenitor R hasta llegar a una geneUDFLyQ XVXDOPHQWH OD UHWURFUX]D %& HQ OD cul se han recuperado todas las caractersticas del progenitor R, se seleccionan los individuos que presenten el carcter de inters y se auWRIHFXQGDQ (Q OD SUy[LPD JHQHUDFLyQ %&) se seleccionan aquellas plantas homocigticas para los genes que gobiernan el carcter en cuestin y se autofecundan de nuevo. De este modo, se ha obtenido la lnea R original con el FDUiFWHU GHO GDGRU LQFRUSRUDGR /D JXUD % HV un esquema en el que se puede apreciar lo desFULWR HQ IRUPD JUiFD 6H VLPEROL]D FRQ XQD ED-
rra vertical el genotipo de cada individuo, negro para el dador y blanco para el recurrente. Como SXHGH REVHUYDUVH OD ) WLHQH XQD FRQWULEXFLyQ GH GH FDGD SURJHQLWRU (Q OD %& OD FRQWULEXFLyQ GHO GDGRU KD GLVPLQXLGR D XQ 2 sea, en promedio, la generacin BC1 presenta HO GH FRQWULEXFLyQ JHQpWLFD GHO UHFXUUHQWH (la ecuacin que permite calcular la proporcin del genotipo del padre recurrente recuperado 535 OXHJR GH XQ Q~PHUR GHWHUPLQDGR GH Q generaciones de retrocruzas es, en ausencia de VHOHFFLyQ \ OLJDPLHQWR 535 (n+1))*100). La generacin BC2 a su vez presentar, en SURPHGLR XQ GH FRQWULEXFLyQ GHO UHFXrrente. De esta forma, en cada generacin de retrocruzas la contribucin gentica del dador va decreciendo a la mitad de la generacin preYLD 'H HVWD IRUPD DO OOHJDU D %& OD SREODFLyQ de plantas tendr, en promedio, el 99,2% de los genes del progenitor recurrente y, en la prctica, se considera que cada individuo es igual al reFXUUHQWH VDOYR SRU HO FDUiFWHU LQFRUSRUDGR (VWH mtodo de mejora fue originalmente propuesto por Harlan y Pope en 1922, pero hasta hace pocos aos no fue extensivamente utilizado en ORV SURJUDPDV GH WRPHMRUDPLHQWR /D UD]yQ GH esta baja adopcin es bastante simple: la incorporacin del carcter (o sea, la recuperacin del trasfondo gentico del progenitor elite R con el carcter en cuestin suministrado por D) tarda ms o menos 7 generaciones, lo que para cultivos anuales implica 7 aos si no se pueden cultivar generaciones de contra-estacin. Por lo tanto, al cabo de 7 aos se obtendr el mismo material gentico, pero que expresa un carcter adicional. Como resulta lgico, durante este perodo el trabajo de mejoramiento en el mismo programa en el que se obtuvo a R habr producido nuevos materiales que superen ampliamente a ese genotipo. Ms an, se pueden haber obtenido genotipos nuevos que expresen el carcter que se deseaba incorporar mediante cruzas simples y posterior seleccin. (Q UHVXPLGDV FXHQWDV OD DSOLFDFLyQ GHO PpWRdo convencional de retrocruzas habr obtenido un genotipo viejo con un carcter nuevo o, en palabras de muchos mejoradores, se habr detenido el progreso gentico por 7 generaciones. Los marcadores moleculares permiten acelerar este proceso, como se explica a continuacin.
Retrocruzas asistidas por marcadores Para realizar una retrocruza asistida por marcadores se sigue un esquema de trabajo VLPLODU DO SUHVHQWDGR HQ OD JXUD HQ OD FXDO se describen los pasos utilizados para implementar dicha conversin. Luego de obtener la BC1 entre una lnea recurrente y una lnea dadora del gen de inters, se extrae el ADN GH FDGD VHJUHJDQWH (Q SULPHU OXJDU VH VHOHFFLRQD SRU HO FDUiFWHU GH LQWHUpV (VWD VHOHFFLyQ puede ser fenotpica o, ms comnmente, mediante marcadores ligados al gen/es de inters (seleccin asistida por marcadores). Se descartan todos los individuos que no presentan el/los alelos de inters y, a partir del ADN de ORV UHVWDQWHV LQGLYLGXRV VH SURFHGH D DPSOLcar los marcadores para todas las regiones del JHQRPD SDUD ODV FXDOHV GLHUHQ ORV SDUHQWDOHV D y R (o sea, para todos los marcadores poliPyUFRV HQWUH ODV OtQHDV ' \ 5 /XHJR GH OHHU los geles, se calculan las similitudes genticas de cada individuo segregante con respecto al padre recurrente y se seleccionan aquel/aquellos individuos con los mayores porcentajes de VLPLOLWXG (VRV LQGLYLGXRV VRQ ORV TXH VH UHWURcruzan con el padre recurrente para obtener la generacin BC2. Como se describi previamente, los porcentajes de recuperacin del genotipo recurrente en cada generacin de retrocruzas son valores promedio de toda la poblacin. De hecho, existe una gran variabilidad entre individuos UHVSHFWR GH HVWH SRUFHQWDMH $Vt HQ OD JXUD VH PXHVWUD SDUD HO FDVR GHO PDt] HO SRUcentaje de similitud de los segregantes en BC1 con respecto al padre recurrente, evaluados por medio de un gran nmero de marcadores moleculares dispersos a travs de todo el genoma. Se puede observar, como ejemplo, que HQ OD %&) KD\ LQGLYLGXRV TXH VyOR SUHVHQWDQ un 40% de similitud con el recurrente, mientras TXH KD\ RWURV TXH PXHVWUDQ PiV GHO ,Qdividualizando y cruzando slo los individuos que presentan los mayores niveles de similitud para obtener la siguiente generacin de retrocruzas, se logra disminuir el nmero de generaciones necesarias para recuperar el trasfondo gentico del padre recurrente. Obsrvese que si se elige el individuo con GH VLPLOLWXG SDUD UHWURFUX]DU HO PtQLPR
resto del genoma. De esta forma, se habr obtenido la lnea recurrente convertida por el carcter de inters en slo dos generaciones de retrocruzas. /D JXUD & PXHVWUD ORV UHsultados obtenidos en el laboratorio de los autores para el caso del cultivo de maz, luego de convertir decenas de lneas endocriadas por mutantes (por ejemplo, resistencia a herbicidas), transgenes (resistencia a insectos) o QTLs (Quantitative Trait Locus) para resistencia a enfermedades. Como norma, la recuperacin del trasfondo gentico del padre recurrente se logra en BC2, 4 generaciones antes de lo que requerido por el mtodo tradicional. De hecho, los porcentajes de similitud promedio de las mejores plantas seleccionadas de la %& IXHURQ GHO \ GH OD %& GHO Figura 3. Conversiones asistidas por marcadores moleculares. La descripcin anterior del $ (WDSDV GHO SURFHVR GH DQiOLVLV GH OD JHQHUDFLyQ %& GXmtodo de retrocruzas se ha rante una conversin asistida por marcadores. (B) Porcentaje realizado considerando que el de recuperacin del trasfondo gentico del progenitor recurrente carcter en cuestin es de hea travs de las generaciones para el mtodo convencional de rencia monognica, que el esretrocruzas (terico) y el mtodo asistido por marcadores (obtetado favorable del carcter est nido). (C) Las conversiones dentro de un programa de mejora. controlado por el alelo domiSe inician mltiples conversiones para un mismo carcter sonante, y que la seleccin puede bre distintos trasfondos genticos, con el objetivo de obtener los UHDOL]DUVH DQWHV GH TXH RUH]mismos genotipos con el carcter incorporado. Como estrategia para obtener genotipos nveles con el carcter incorporado, es FDQ ODV SODQWDV (Q HVWH FDVR posible iniciar la recombinacin en etapas intermedias del prola implementacin del mtodo ceso de conversin. de retrocruzas (supongamos que se desea incorporar la reporcentaje de similitud que, en promedio, ten- sistencia a una enfermedad a una variedad de drn los individuos en la BC2 ser del 92% (se- WULJR HV UHODWLYDPHQWH VLPSOH (Q OD SUiFWLFD gn el nmero de plantas que se obtengan se real del mejoramiento, los casos son en general pueden lograr individuos con el 98-99% de si- un poco ms complicados. As, por ejemplo, si militud). Repitiendo el mismo procedimiento en se desea incorporar un carcter controlado por la BC2, se autofecundan los individuos con los un alelo dominante que se expresa en la semimayores porcentajes de similitud para obtener lla (ejemplo: alto contenido de cido oleico en OD %&) (Q HVWD JHQHUDFLyQ VH WHUPLQDQ GH la semilla de girasol), no se pueden seleccionar seleccionar los segregantes que presentan el las plantas en cada generacin de retrocruzas gen de inters en estado homocigtico e iden- DQWHV GH TXH pVWDV RUH]FDQ (Q HVWH FDVR VH tidad gentica con el padre recurrente para el deben hacer todos los cruzamientos posibles
con el padre recurrente y evaluarlos cuando se obtengan las semillas de cada planta. Recin en ese momento se podrn descartar aquellas cruzas con las plantas que no presentaban el FDUiFWHU GH LQWHUpV /D PD\RU GLFXOWDG HQ HVWH ejemplo radica en la cantidad de cruzamientos que se deben realizar para asegurar que al menos una de las plantas que se retrocruzan lleve el carcter en cuestin. Ahora bien, si el carcter que se desea incorporar est controlado por un alelo recesivo (por ejemplo, la dureza del grano en trigo), no slo se debe retrocruzar cada planta con el padre recurrente, sino tambin autofecundarla (o hacerle un cruzamiento de prueba o testcross) para determinar cul de las plantas de cada generacin de retroFUX]DV OOHYD HO FDUiFWHU HQ FXHVWLyQ (Q HVWH caso, no slo se deben hacer gran cantidad de cruzas sino tambin perder una generacin adicional entre cada generacin de retrocruzas SDUD HYDOXDU HO FDUiFWHU GH LQWHUpV ([LVWH nalmente, otro tipo de complicaciones. Todos ORV FDVRV DQWHULRUHV VH UHHUHQ D HMHPSORV HQ los que el fenotipo de cada planta se puede DQDOL]DU HQ IRUPD LQGLYLGXDO ([LVWHQ PXFKRV ejemplos (uno de ellos es la calidad panadera en trigo) donde se necesitan cientos de semiOODV SDUD HYDOXDU HO IHQRWLSR (Q HVWRV FDVRV para evaluar cada individuo en las generaciones de retrocruzas, se deberan obtener dos generaciones de autofecundaciones antes de decidir cules son los individuos con los determinantes genticos correctos para continuar retrocruzando. (O HPSOHR GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV UHGXce notablemente las complejidades descriptas ya que todos los ejemplos mencionados (seOHFFLRQDU LQGLYLGXRV GHVSXpV GH OD RUDFLyQ hacer cruzamientos de prueba, o multiplicar la semilla para poder evaluar) se reducen al caso ms simple de seleccionar el carcter de inteUpV SRU PDUFDGRUHV DQWHV GH OD RUDFLyQ El arrastre por ligamiento y su eliminacin Cuando se incorpora un carcter desde un genotipo dador a una lnea recurrente, todos los genes ligados al gen incorporado pasan FRQ pVWH GH JHQHUDFLyQ HQ JHQHUDFLyQ (VH arrastre por ligamiento puede que no tenga consecuencias fenotpicas o bien, como ocurre
generalmente, puede deprimir el rendimiento potencial o la calidad del producto, dependiendo de las caractersticas del genotipo dador (si es una especie silvestre se esperan mayores consecuencias fenotpicas que si el dador es una lnea elite). As, por ejemplo, cuando se WUDQVULy DO WULJR HO JHQ Lr TXH FRQHUH UHsistencia a roya de la hoja desde Thinopyrum ponticum, tambin se incorpor un gen ligado (Y) que determina el amarillamiento de la harina, un carcter indeseable para la industria alimenticia. Otro ejemplo es el de la transferencia a trigo de la resistencia a varias enfermedades conferidas por distintos genes en el cromosoma 1R de centeno (Secale cereale L.), el cual tambin presenta genes que disminuyen diversos parmetros de la calidad panadera. (Q HO PpWRGR FRQYHQFLRQDO GH UHWURFUX]DV OD eliminacin del arrastre por ligamiento se va logrando por la erosin del segmento incorporado a travs de recombinacin por entrecruzamiento. Se ha estimado a travs de experimentos de simulacin que este proceso puede tarGDU KDVWD JHQHUDFLRQHV JXUD & (O XVR de marcadores, en cambio, permite eliminar el arrastre por ligamiento en slo dos generaciones de retrocruzas siempre que se disponga de un mapa saturado de esa regin genmica \ GHO VXFLHQWH Q~PHUR GH SODQWDV HQ FDGD JHQHUDFLyQ GH UHWURFUX]DV (Q XQD SULPHUD JHQHracin de retocruzas, por ejemplo, se pueden eliminar todos los individuos que presenten alelos del genotipo dador para los marcadores VLWXDGRV D PiV GH F0 UtR DUULED GHO JHQ (Q la segunda generacin de retrocruzas se hace lo mismo pero ro abajo del gen deseado. De esta manera el arrastre por ligamiento disminuye drsticamente hasta niveles aceptables en tan solo dos generaciones de retrocruzas, WDO FRPR VH PXHVWUD HQ OD JXUD & 8QD YH] incorporado el gen con esta metodologa, la lnea obtenida se utiliza como fuente para los sucesivos proyectos de conversin, de modo tal que el arrastre por ligamiento alrededor de ese gen en particular no constituye un problema adicional en los proyectos posteriores. Estimaciones de diversidad gentica Las estimaciones de diversidad gentica de un programa de mejoramiento son fundamen-
WDOHV SDUD SODQLFDU ORV FUX]DPLHQWRV HQWUH SDrentales. As, la diversidad dentro del programa SXHGH LQFUHPHQWDUVH VL VH SODQLFDQ FUX]DV entre individuos que exhiban escaso parecido gentico. La genealoga de los individuos o su parecido fenotpico son de escaso valor para determinar si dos individuos estn o no estrechamente relacionados genticamente. Las estimas de similitudes genticas basadas en marcadores, en cambio, proveen un indicador bastante ajustado de las similitudes o distanFLDV JHQpWLFDV UHDOHV 6H SXHGH FXDQWLFDU OD diversidad global que presentan los genotipos en estudio a partir de las huellas dactilares (QJHUSULQWLQJ) de ADN de los individuos a analizar, las cuales incluyen un gran nmero de marcadores. Mediante los algoritmos de nGLFH GH &RQWHQLGR GH 3ROLPRUVPR 3,& 3,& = 1- 6 pi) se puede determinar cules son los marcadores ms discriminantes de los indiviGXRV HQ HVWXGLR $Vt XQ 3,& LJXDO D LQGLFD TXH HO PDUFDGRU HQ FXHVWLyQ HV PRQRPyUFR \ XQ 3,& DOWR SRU HMHPSOR PD\RU D LQGLFD que el marcador en cuestin es altamente poOLPyUFR \ TXH WDO SROLPRUVPR HVWD GLVWULEXLGR uniformemente entre los individuos estudiados. (O YDORU SURPHGLR GH 3,& SDUD WRGRV ORV PDUcadores analizados permite realizar estimaciones de Diversidad Gentica (D) (D = 1- 6 6 pi). Mediante la comparacin de sucesivos valores de D, es posible determinar si la diversidad ha cambiado a travs del tiempo, o si se ha moGLFDGR SRU OD LQWURGXFFLyQ DO FXOWLYR GH QXHYR germoplasma. La utilizacin de un gran nmero de marcadores adecuadamente dispersos en el genoma permite construir Matrices Bsicas de Datos (MBD). Mediante programas estadsticos apropiados se calculan a partir de ellas relaciones tales como la de similitud JHQpWLFD HQWUH JHQRWLSRV (VWD UHODFLyQ SXHGH obtenerse usando el 6LPSOH 0DWFKLQJ &RHIFLHQW (SMC) (SMC = m/(m+n)), el cual se deQH FRPR HO Q~PHUR GH DOHORV GH PDUFDGRUHV que dos genotipos tienen en comn (m) sobre el nmero total de alelos analizados (m+n). De este modo, se pueden generar matrices de similitud gentica entre genotipos sobre las que, mediante programas de anlisis multivariado, se construyen dendrogramas que comparan JUiFDPHQWH ODV UHODFLRQHV JHQpWLFDV HQWUH ORV
LQGLYLGXRV (OOR SHUPLWH DJUXSDU D DTXHOORV TXH exhiben mayor similitud gentica en conjuntos coherentes. (Q OD JXUD $ VH FRPSDUDQ ODV HVWLPDFLRnes de similitud gentica entre individuos basadas en el uso marcadores moleculares con aquellas derivadas de informacin fenotpica. /D JUiFD PXHVWUD OD UHODFLyQ HQWUH OD GLVWDQFLD morfolgica (abscisas) y la distancia molecular RUGHQDGDV SDUD OtQHDV GH VRUJR JUDQtIHro (Sorghum bicolor). Puede apreciarse que se obtiene un diagrama tpico de dispersin triangular: si dos individuos estn muy relacionados a nivel de marcadores es muy probable que tambin lo estn a nivel morfolgico. Por el contrario, una gran distancia molecular entre dos individuos no permite realizar ninguna inferencia acerca de su parecido morfolgico
Figura 4. (VWLPDFLRQHV GH GLYHUVLGDG JHQpWLFD PHdiante el uso de marcadores moleculares. (A) Relacin entre las distancias evaluadas sobre la base de LQIRUPDFLyQ PRUIROyJLFD \ PROHFXODU SDUD OtQHDV de sorgo granfero. (B) Anlisis de agrupamiento para 214 variedades argentinas de soja utilizando marcadores microsatlites.
pVWH SXHGH VHU PX\ DOWR R PX\ EDMR (VWD UHlacin puede explicarse por el determinismo generalmente polignico de los caracteres que se utilizan en la estimacin de las distancias morfolgicas, que puede conducir a fenmenos de convergencia. Por ejemplo, si se considera que un carcter esta controlado por 4 loci biallicos con efectos iguales y se denotan respectivamente + y - los alelos favorables y los desfavorables, las lneas portadoras de las combinaciones de alelos ++-- y --++ presentarn el mismo fenotipo pero diferirn para los 4 loci FRQVLGHUDGRV (Q VtQWHVLV OR DQWHULRU LQGLca que el parecido morfolgico entre materiales genticos tiene escaso valor para realizar XQ PDQHMR HFLHQWH GH OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD de un cultivo. (O DQiOLVLV GH DJUXSDPLHQWR TXH VH PXHVWUD HQ OD JXUD % VH UHDOL]y HYDOXDQGR JHQRtipos de soja representativos del germoplasma disponible en Argentina analizados a travs de loci de microsatlites seleccionados por su capacidad discriminante. Luego de calcularse la similitud entre los genotipos, se realiz el anlisis de agrupamiento cuyo dendrograma VH PXHVWUD HQ OD JXUD 3XHGHQ GHQLUVH WUHV grandes grupos, los cuales estn asociados a los grupos de madurez al que pertenecen los cultivares. De esta forma, los cultivares de ORV JUXSRV GH PDGXUH] 9 \ 9, HVWiQ PiV DVRciadas entre s que con los individuos de los JUXSRV GH PDGXUH] ,,, \ ,9 (VWR LQGLFD TXH ORV diferentes grupos de madurez tienen ancestros GLIHUHQWHV \ UHHMD XQD SUiFWLFD FRP~Q HQ HO mejoramiento de la soja consistente en cruzar cultivares del mismo grupo de madurez al desarrollar nuevas variedades. La conclusin de este tipo de anlisis es que para incrementar la diversidad gentica y, por ende, el progreso gentico en soja, se deberan realizar cruzas entre genotipos pertenecientes a distintos grupos de madurez. (VWRV VRQ VyOR DOJXQRV HMHPSORV GH ORV HVWXdios de variabilidad que se pueden realizar para monitorear la diversidad gentica de un cultivo y el impacto que, sobre la misma, pueden tener diferentes estrategias de mejoramiento. Diseo de genotipos y de germoplasma Se denomina diseo de genotipos o de
germoplasma a la utilizacin de todas las herramientas previamente descriptas para la obtencin de cultivares o germoplasma de alto potencial de rendimiento (creados por seleccin convencional en ambientes agronmicos de alta oferta potencial con respecto a agua, nutrientes, fungicidas e insecticidas) a los que se le introducen caracteres por seleccin asistida y conversiones que incrementan su estabilidad (resistencia a enfermedades o a estrs DPELHQWDO FDOLGDG GHO SURGXFWR QDO \R UDQJR de adaptacin (como por ejemplo, obtencin de cultivares de ciclo ms corto o ms largo dependiendo de la estacin de crecimiento). (O GLVHxR GH JHUPRSODVPD FRPSUHQGH HO uso de genotipos dadores que presentan caracteres de inters (resistencias o mejor calidad) pero que, en general, son agronmicaPHQWH PX\ GHFLHQWHV UHSUHVHQWDGD HQ FRORU QHJUR HQ OD JXUD & (VWRV GDGRUHV VH XWLOLzan para introgresar tales caracteres en lneas elite de alto potencial de rendimiento que no los poseen (representadas con diferentes toQRV GH JULVHV HQ OD JUiFD SDUD VHxDODU VXV GLferencias genticas). Por otra parte, las lneas elite, se eligen de modo tal que exhiban entre ellas escaso parecido gentico. A medida que el proceso de conversin de cada lnea avanza (o sea, se minimiza la contribucin gentica GHO GDGRU FRPR VH DSUHFLD HQ OD JUiFD GHVGH ) KDFLD %& VH FRPLHQ]DQ D FUX]DU HQWUH s a las lneas elite en proceso de conversin de modo de obtener recombinantes entre los materiales elite y que lleven el gen de inters UHSUHVHQWDGDV HQ OD JUiFD FRPR LQGLYLGXRV que presentan combinaciones de colores de diferentes lneas y la regin del genoma que lleva el gen de inters de la lnea dadora). De esta forma, si bien las conversiones continan de modo tal de obtener cultivares aptos para el mercado, se genera al mismo tiempo germoplasma de alto rendimiento con los genes DSRUWDGRV SRU OD OtQHD GDGRUD (VH JHUPRSODVma ingresa al programa de mejora convencional para continuar el proceso de mejoramiento del rendimiento por seleccin. Por todo lo expuesto anteriormente, el mejoramiento gentico en la actualidad debe ser el resultado de la estrecha colaboracin y del sinergismo entre los programas de mejora
convencional y molecular. Como se ha mostrado previamente, los ciclos de evaluacin, seleccin y recombinacin del mejoramiento convencional continan siendo el corazn del proceso, pero ahora cuentan con el aporte de la tecnologa de marcadores moleculares a travs de la seleccin asistida y del anlisis de OD GLYHUVLGDG GHO JHUPRSODVPD JXUD 7DOHV DSRUWHV FRQWULEX\HQ D XQD PHMRUD VLJQLFDWLYD del progreso gentico por seleccin a travs del mantenimiento e incremento de la diversidad y de la reduccin de la interaccin genotipo x ambiente. Por otro lado, la base gentica puede actualmente enriquecerse en forma continua con nuevos genotipos y con nuevos caracteres por medio de las conversiones asistidas por marcadores.
$YLVH -& 0ROHFXODU PDUNHUV QDWXUDO KLVWRU\ and evolution. 2nd HG 6LQDXHU $VVRFLDWHV ,QF Sunderland, MA. %HFNPDQQ -6 DQG 6ROOHU 0 5HVWULFWLRQ IUDJment length polymorphisms in plant genetic imSURYHPHQW 2[IRUG 6XUY 3ODQW 0RO &HOO %LRO %HUQDUGR 5 0RUHDX / DQG &KDUFRVVHW $ 1XPEHU DQG WQHVV RI VHOHFWHG LQGLYLGXDOV LQ marker-assisted and phenotypic recurrent selecWLRQ &URS 6FL &KDUFRVVHW $ DQG *DOODLV $ ,QWpUrW GHV PDUTXHXUV HQ VpOHFWLRQ ,Q /HV PDUTXHXUV PROpFXlaires en gntique et biotechnologies vgtales. GH 9LHQQH ' HG ,15$ 'XEFRYVN\ - 0DUNHUDVVLVWHG VHOHFWLRQ LQ SXEOLF EUHHGLQJ SURJUDPV 7KH ZKHDW H[SHULHQFH &URS 6FL (FKDUWH 0 %XORV 0 5RVVL 5 )HUUDUL % 6DOD * and Sala C. 2004. Pattern of molecular genetic GLYHUVLW\ LQ $UJHQWLQH VR\EHDQ JHUPSODVP 9,, :RUOG 6R\EHDQ 5HV &RQI )R] GR ,JXDVVX %UDVLO SS )HKU : 3ULQFLSOHV RI &XOWLYDU 'HYHORSPHQW 7KHRU\ DQG 7HFKQLTXH 0F*UDZ+LOO )ULVFK 0 DQG 0HOFKLQJHU $( 0DUNHUDVVLVted backcrossing for simultaneous introgression RI WZR JHQHV &URS 6FL )ULVFK 0 DQG 0HOFKLQJHU $( 6HOHFWLRQ theory for marker-assisted backcrossing. Genetics, 170, 909-917. Gimelfarb A. and Lande R. 1994. Simulation of marker-assisted selection for non-additive traits. GeQHW 5HV Gimelfarb A. and Lande R. 1994. Simulation of marker-assisted selection in hybrid populations. GeQHW 5HV *LPHOIDUE $ DQG /DQGH 5 0DUNHUDVVLVWHG selection and marker-QTL associations in hybrid SRSXODWLRQV 7KHRU $SSO *HQHW *XLPDUmHV (3 5XDQH - 6FKHUI %' 6RQQLQR $ DQG 'DUJLH -' 0DUNHUDVVLVWHG VHOHFWLRQ current status, and future perspectives in crops, OLYHVWRFN IRUHVWU\ DQG VK )$2 5RPH Harlan H.V. and Pope M.N. 1922. The use and vaOXH RI EDFNFURVVHV LQ VPDOO JUDLQ EUHHGLQJ - +HUHG +RVSLWDO ) 0DUNHUDVVLVWHG EDFNFURVV EUHHding: A case study in genotype building theory. pp ,Q 06 .DQJ HG 4XDQWLWDWLYH JHQH-
Figura 5. ,QWHUDFFLyQ HQWUH HO PHMRUDPLHQWR FRQYHQFLRQDO \ HO PHMRUDPLHQWR PROHFXODU (Q HO UHFXDGUR se esquematiza la naturaleza cclica del mejoramiento convencional y, por fuera del mismo, los aportes proporcionados por el mejoramiento molecular.
WLFV JHQRPLFV DQG SODQW EUHHGLQJ &$%, 3XEOLVhing. +RVSLWDO ) DQG &KDUFRVVHW $ 0DUNHUDVVLVted introgression of quantitative trait loci. GeneWLFV +RVSLWDO ) *ROGULQJHU , DQG 2SHQVKDZ 6 (IFLHQW PDUNHUEDVHG UHFXUUHQW VHOHFWLRQ IRU PXOWLSOH TXDQWLWDWLYH WUDLW ORFL *HQHW 5HV 1181-1189. .RHEQHU 50 0DUNHU DVVLVWHG VHOHFWLRQ LQ WKH FHUHDOV 7KH GUHDP DQG WKH UHDOLW\ SS ,Q 3. *XSWD DQG 5. 9DUVKQH\ HG &HUHDO JHQRPLFV .OXZHU $FDGHPLF 'RUGUHFKW 7KH Netherlands. .RRUQQHHI 0 DQG 6WDP 3 &KDQJLQJ SDUDGLJPV LQ SODQW EUHHGLQJ 3ODQW 3KLVLRO .XPOD\ $0 %DHQ]LJHU 36 *LOO .6 6KHOWRQ '5 *UD\ERVFK 5$ /XNDV]HZVNL $- DQG :HVHQEHUJ '0 8QGHUVWDQGLQJ WKH (IIHFW RI 5\H &KURPDWLQ LQ %UHDG :KHDW &URS 6FL /DQGH 5 DQG 7KRPSVRQ 5 (IFLHQF\ RI marker-assisted selection in the improvement of TXDQWLWDWLYH WUDLWV *HQHWLFV Paterson A.H., Tanksley S. and Sorrells M. 1991. DNA markers in plant improvement. Advances in Agronomy, 44, 19-89. 3ULQV 5 0DUDLV *) 3UHWRULXV =$ -DQVH %-+ 0DUDLV $6 $ VWXG\ RI PRGLHG IRUPV RI the Lr WUDQVORFDWLRQ RI FRPPRQ ZKHDW 7KHRU $SSO *HQHW 5LEDXW -0 DQG +RLVLQJWRQ ' 0DUNHUDVVLVWHG VHOHFWLRQ 1HZ WRROV DQG VWUDWHJLHV 7UHQGV 3ODQW 6FL 6DOD & %XORV 0 DQG (FKDUWH 0 $JURELRtecnologa. Curso de grado para estudiantes de biologa y agronoma. Mentaberry A. (ed) Universidad de Naciones Unidas, Programa Biolac. 6HUYLQ % 0DUWLQ 2& 0p]DUG 0 DQG +RVSLWDO ) 7RZDUG D WKHRU\ RI PDUNHUDVVLVWHG JHQH S\UDPLGLQJ *HQHWLFV 6LPPRQGV 1: 3ULQFLSOHV RI &URS ,PSURYHPHQW /RQJPDQ 8. 7DQNVOH\ 6' 0ROHFXODU PDUNHUV LQ SODQW EUHHGLQJ 3ODQW 0RO %LRO 5HS 7DQNVOH\ 6' DQG 5LFN &0 ,VR]\PH JHQH linkage map of tomato: Applications in genetics DQG EUHHGLQJ 7KHRU $SSO *HQHW :KLWWDNHU -& +DOOH\ &6 DQG 7KRPSVRQ 5 2SWLPDO ZHLJKWLQJ RI LQIRUPDWLRQ LQ PDUNHUDVVLVWHG VHOHFWLRQ *HQHW 5HV
;X < *OREDO YLHZ RI 47/ 5LFH DV D PRGHO SS ,Q 06 .DQJ HG 4XDQWLWDWLYH JHQHWLFV JHQRPLFV DQG SODQW EUHHGLQJ &$%, 3XEOLVKing. ;X < 'HYHORSLQJ PDUNHUDVVLVWHG VHOHFWLRQ strategies for breeding hybrid rice. Plant Breed. 5HY ;X < 0F&RXFK 65 DQG =KDQJ 4 +RZ FDQ ZH XVH JHQRPLFV WR LPSURYH FHUHDOV ZLWK ULFH DV D UHIHUHQFH JHQRPH" 3ODQW 0RO %LRO <D]GL 0+ 6RQHVVRQ $. :RROOLDPV -$ DQG 0HXZLVVHQ 7+ &RPELQHG GHWHFWLRQ DQG introgression of quantitative trait loci underlying GHVLUDEOH WUDLWV - $QLP 6FL Young N.D. and Tanksley S.D. 1989. Restriction fragment length polymorphism maps and the concept of graphical genotypes. Theor. Appl. Genet., Zhang W. and Smith C. 1992. Computer simulation of marker-assisted selection utilizing linkage disHTXLOLEULXP 7KHRU $SSO *HQHW =KDQJ : DQG 6PLWK & 6LPXODWLRQ RI PDUNHU assisted selection utilizing linkage disequilibrium: The effects of several additional factors. Theor. $SSO *HQHW
III. CAPTULO 4 ,GHQWLFDFLyQ \ UHJLVWUR GH variedades

Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y Mara Alicia Loray El registro de variedades en la Repblica Argentina Introduccin (Q OD 5HS~EOLFD $UJHQWLQD OD OHJLVODFLyQ HQ PDWHULD GH VHPLOODV \ FUHDFLRQHV WRJHQpWLFDV HV OD HVWDEOHFLGD SRU OD /H\ 1 VX 'HFUHWR 5HJODPHQWDULR 1 \ OD /H\ 1 GH DSUREDFLyQ GHO &RQYHQLR ,Qternacional para la Proteccin de las ObtencioQHV 9HJHWDOHV (O RUJDQLVPR HQFDUJDGR GH DSOLFDU HVWD OHJLVODFLyQ HV HO ,QVWLWXWR 1DFLRQDO GH 6HPLOODV ,1$6( (Q OR UHIHULGR D YDULHGDGHV YHJHWDOHV HVWD OHJLVODFLyQ ODV GHQH FRPR el conjunto de plantas de un solo taxn botnico del rango PiV EDMR FRQRFLGR TXH SXHGD GHQLUVH SRU OD expresin de los caracteres resultantes de un cierto genotipo o de una cierta combinacin de genotipos y pueda distinguirse de cualquier otro conjunto de plantas por la expresin de XQR GH HVRV FDUDFWHUHV SRU OR PHQRV. AsiPLVPR VH GHQH HO WpUPLQR REWHQWRU FRPR OD persona que crea o descubre y desarrolla una YDULHGDG 3RU RWUD SDUWH VH GHQH HO WpUPLQR FUHDFLyQ WRJHQpWLFD FRPR WRGD YDULHGDG R cultivar, cualquiera sea su naturaleza gentica, obtenido por aplicacin de conocimientos cienWtFRV DO PHMRUDPLHQWR KHUHGDEOH GH ODV SODQWDV 'HFUHWR 1 5HJODPHQWDULR de la Ley N 20.247, de semillas y creaciones WRJHQpWLFDV (VWRV WpUPLQRV \ GHQLFLRQHV QRV SHUPLWHQ reconocer claramente a dos partes integrantes de un sistema de propiedad intelectual que se conoce internacionalmente como Derecho de obtentor, siendo la variedad vegetal el objeto de ese derecho y el obtentor el sujeto del mismo. Se trata de un sistema de propiedad intelectual independiente, conocido como sistema VXLJHQHULV \D TXH KD VLGR HVSHFtFDPHQWH
diseado para el objeto de proteccin al que se aplica: las variedades vegetales. (V VDELGR TXH DO WUDWDUVH GH VLVWHPDV ELROygicos, las variedades vegetales presentan caractersticas particulares (ya sea en cuanto a VLRORJtD SURSDJDFLyQ HWF TXH QR SRGUtDQ VHU equiparadas a las que presentan otros objetos de derecho. De all la necesidad de contar con XQ VLVWHPD GH SURSLHGDG HVSHFtFR \ DFRUGH D las necesidades de los obtentores y usuarios. (VWH VLVWHPD QR HV QXHYR 'HULYD GH OD &RQvencin de Pars en materia de propiedad inWHOHFWXDO \ VX $FWD HVSHFtFD HV OD GH OD 8QLyQ ,QWHUQDFLRQDO SDUD OD 3URWHFFLyQ GH ODV 2EWHQciones Vegetales (UPOV) que data del ao /D 8329 HV OD RUJDQL]DFLyQ LQWHUQDcional intergubernamental, de donde emanan las directrices tanto tcnicas como jurdicas en materia de derecho de obtentor. Los miembros GH HVWD 8QLyQ VRQ ORV (VWDGRV \X RUJDQL]DFLRnes intergubernamentales (como por ejemplo la 8QLyQ (XURSHD \ FXHQWD FRQ XQD RUJDQL]DFLyQ HVSHFtFD TXH HV OD 2FLQD GH OD 8329 FRQ sede en Ginebra, Suiza, integrada por un Secretario General, un Vice-Secretario General, su cuerpo tcnico y su personal administrativo. La Repblica Argentina actualiz en el ao 1991 su legislacin en materia de derecho de obtentor mediante el Decreto Reglamentario 1 VH OD FRQRFH FRPR $FWD GH GH la UPOV). De esta forma pudo acceder a ser miembro de la UPOV en el ao 1994. Vale hacer esta aclaracin ya que luego, fue adoptada y puesta en vigencia una tercera versin del Acta de UPOV que es la que se conoce como Acta de 1991, a la que Argentina an no adhiri. ,QGHSHQGLHQWHPHQWH GH HVWR GH ORV miembros parte de UPOV a diciembre de 2007, 24 son parte del Acta 1978 -incluido ArgentiQD HV SDUWH GHO $FWD GH \ PLHPbros son parte del Acta de 1991. Todas estas Actas cuentan con principios bsicos que son comunes y nuevas regulaciones que se han incorporado como consecuencia de los avances tcnicos y tecnolgicos en la obtencin de vaULHGDGHV YHJHWDOHV 0LHPEURV GH OD 8QLyQ ,Qternacional para la Proteccin de las ObtencioQHV 9HJHWDOHV 6WDWXV DO GH MXQLR GH 8329 'HVGH VX DGKHVLyQ DO &RQYHQLR GH 8329 Acta de 1978, la Repblica Argentina participa
activamente en los diferentes rganos de decisin de la UPOV: Consejo; Comit Consultivo; &RPLWp $GPLQLVWUDWLYR \ -XUtGLFR \ &RPLWp 7pFnico, como as tambin en los diferentes cuerSRV WpFQLFRV HVSHFtFRV \ JUXSRV GH WUDEDMR Registro de variedades La Ley N 20.247, cre dos Registros Nacionales referidos a variedades vegetales, el primero es el Registro Nacional de Cultivares (RNC) y el segundo es el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares (RNPC). (O 51& HV GH FDUiFWHU REOLJDWRULR SDUD WRGR FXOWLYDU TXH VH LGHQWLFD SRU YH] SULPHUD \ VH va a exponer al pblico o entregar a usuarios D FXDOTXLHU WtWXOR FRQ XQ UyWXOR LGHQWLFDWRULR (VWH 5HJLVWUR 1DFLRQDO QR GD QLQJ~Q GHUHFKR de propiedad sobre el cultivar en cuestin, pero habilita a la comercializacin del mismo. (O 513& HV RSWDWLYR (V HO 5HJLVWUR 1DFLRQDO por el que se inscribe una variedad concedindole un Ttulo de Propiedad a su obtentor. Por si slo no habilita a que una variedad pueda comercializarse, pero reconoce el derecho que su obtentor posee sobre la misma. Consecuentemente, si una persona desea poder comercializar su variedad y, a la vez, tenerla protegida mediante el sistema de derecho de obtentor, en ese caso deber realizar el trmite de inscripcin en ambos Registros 1DFLRQDOHV (VWR QR VLJQLFD XQ WUiPLWH SRU GXplicado, sino que la misma solicitud de inscripcin, prev la opcin de inscripcin en ambos Registros. Examen tcnico Todo cultivar que se registra, es objeto de un examen, tanto de los aspectos formales (exaPHQ GH IRUPD FRPR GH ORV WpFQLFRV HVSHFtFDPHQWH H[DPHQ WpFQLFR R '+( La solicitud de inscripcin de una variedad vegetal, cuenta con diferentes Anexos, entre los que podemos destacar el de la Descripcin DVSHFWRV PRUIROyJLFRV VLROyJLFRV IHQROyJLcos, de comportamiento sanitario y de caractersticas industriales) que va a permitir, mediante la combinacin de la expresin de los diferentes caracteres que la integran, la idenWLFDFLyQ GH HVD YDULHGDG 2WURV $QH[RV WpFQLcos de importancia son el del origen gentico y
la historia del mejoramiento de la variedad; el del procedimiento para el mantenimiento de la pureza varietal y el que solicita la informacin correspondiente a la expresin OGM (organisPR JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGR GH OD YDULHGDG y su evento incorporado, en el caso en que FRUUHVSRQGD ,1$6( )RUPXODULRV JHQHUDOHV SDUD LQVFULSFLyQ GH FXOWLYDUHV 9DPRV D UHIHULUQRV HVSHFtFDPHQWH DO H[Dmen tcnico de la solicitud, ya que tanto para la inscripcin en el RNC como para RNPC, es condicin que todo cultivar sea sometido a este examen. (O H[DPHQ WpFQLFR HV FRQRFLGR LQWHUQDFLRQDOPHQWH FRPR H[DPHQ '+( R '86 SRU VXV VLJODV HQ LQJOpV \ VH UHHUH D GHWHUPLQDU ODV condiciones de Distincin, Homogeneidad y (VWDELOLGDG GHO FXOWLYDU FX\D SURWHFFLyQ VH SUHtende. (VWDV FRQGLFLRQHV SURYLHQHQ GH ORV UHTXLVLtos internacionales para conceder un derecho de obtentor, que exigen que la variedad cumpla con los siguientes: Novedad: en sentido comercial. Distincin: que permita distinguirla claramente por medio de una o ms caractersticas de otra variedad cuya existencia sea materia de conocimiento general al momento de completar la solicitud. +RPRJHQHLGDG: que sujeta a las variaciones previsibles originadas en los mecanismos particulares de su propagacin, mantenga sus caractersticas hereditarias ms relevantes en IRUPD VXFLHQWHPHQWH XQLIRUPH Estabilidad: que sus caractersticas hereditarias ms relevantes permanezcan conforme D VX GHQLFLyQ OXHJR GH SURSDJDFLRQHV VXFHVLvas o, en el caso de un ciclo particular de proSDJDFLyQ DO QDO GH FDGD XQR GH GLFKRV FLFORV Adems, la variedad debe contar con una denominacin genrica que permita su identiFDFLyQ VLQ LQGXFLU D HUURU R FRQIXVLyQ UHVSHFWR de la identidad de otras variedades u obtentores, ni sobre las caractersticas que esta poVHH HQWUH RWUDV FRQGLFLRQHV &RQYHQLR ,QWHUnacional para la Proteccin de las Obtenciones 9HJHWDOHV 8329 $FWDV GH \ (Q FRQFUHWR ODV GLIHUHQWHV 2FLQDV GH 3URteccin se ocupan de determinar los aspectos referidos a la novedad, la denominacin y efec-
WXDU HO H[DPHQ '+( 3DUD HVWR ~OWLPR H[LVWHQ diferentes posibilidades y alternativas para los (VWDGRV D Q GH SRGHU OOHYDU DGHODQWH HO H[DPHQ WpFQLFR '+( Una opcin es la que se conoce como exaPHQ RFLDO HQ HO TXH HV OD PLVPD RFLQD OD que se encarga de conducir el ensayo a campo (coleccin de variedades), agrupar a la variedad indita con las ms parecidas en virtud de los caracteres de agrupamiento que el obtentor informa, tomar las observaciones y expresiones de cada carcter siguiendo la gua tcnica correspondiente, determinando su distincin y SURGXFLU OD GHVFULSFLyQ RFLDO GHO FXOWLYDU 3DUD esta opcin, es necesario contar con recursos econmicos y humanos, estaciones de evaluacin en diferentes localidades, personal de campo, etc. La mayora de los pases europeos utilizan esta forma de examen tcnico. Otra opcin es la reconocida como examen realizado por terceras partes, en el que SHUVRQDO DFUHGLWDGR SRU OD RFLQD R HO PLVPR obtentor, es el encargado de llevar adelante los ensayos de campo, tomar los datos, comparar las variedades similares, presentar una descripcin completa del cultivar (morfolgica, VLROyJLFD IHQROyJLFD GH FRPSRUWDPLHQWR VDnitario y de cualidades industriales si corresSRQGH FRQ ODV YHULFDFLRQHV HIHFWXDGDV SRU HO SHUVRQDO WpFQLFR GH OD RFLQD SDUD VX FRQWURO (Q HVWH FDVR OD RFLQD \D QR QHFHVLWD FRQWDU con recursos econmicos tan elevados como en el caso anterior, ni con sitios de realizacin de ensayo ni personal de campo. Un cuerpo de tcnicos especializados en los diferentes grupos de especies, puede efectuar los controles QHFHVDULRV D Q GH YHULFDU HO FXPSOLPLHQWR GH las condiciones de proteccin. Los pases latinoamericanos y centroamericanos miembros de UPOV, utilizamos esta forma de examen WpFQLFR DO LJXDO TXH &DQDGi (VWDGRV 8QLGRV de Amrica y Australia, entre otros. Examen tcnico en Argentina (Q HO FDVR QDFLRQDO HO VROLFLWDQWH X REWHQtor, debe presentar debidamente completos los formularios de solicitud de inscripcin y sus Anexos a la Direccin de Registro de VariedaGHV GHO ,1$6( (VWD 'LUHFFLyQ HV HO UHD WpFnica responsable de conducir el RNC y RNPC,
y est organizada mediante grupos de especies con un profesional tcnico responsable de cada uno: cereales, oleaginosas, forrajeras, industriales, hortcolas, frutales, forestales, ornamentales. 1. Cada tcnico evala la solicitud en sus aspectos de forma y de fondo, la denominacin propuesta para el cultivar y, las caractersticas diferenciales del mismo en comparacin con las descripciones de todos los cultivares de la misma especie, ya registrados o en trmite de registro. (VWD SULPHUD FRPSDUDFLyQ GH FDUDFWHUHV se efecta mediante un programa que permite la comparacin entre las diferentes expresiones de los caracteres que forman parte de un descriptor. 2. (VWRV FDUDFWHUHV SXHGHQ VHU PiV R PHQRV LQXHQFLDEOHV GH DFXHUGR FRQ ODV condiciones del medio en el que se est efectuando la descripcin. As, existen caracteres de tipo cualitativo que son ORV PHQRV LQXHQFLDGRV SRU FRQGLFLRQHV externas y, consecuentemente, ms deseables para poder efectuar la comparacin. Los otros caracteres, denominados cuantitativos pueden variar o varan en virtud del ambiente (por ejemplo, altura de planta; largo de hoja, etc.). Consecuentemente, luego de efectuada la comparacin primera, el tcnico examinador debe analizar el resultado y, de VHU QHFHVDULR YHULFD D FDPSR ORV FDracteres y sus expresiones diferenciales o incluso, est facultado para efectuar HQVD\RV RFLDOHV 4. (VWRV ~OWLPRV VRQ HIHFWXDGRV SRU ORV tcnicos de la Direccin de Registro de Variedades en los casos en que poder establecer la distincin se haya convertido en un estudio no del todo sencillo, como es el caso de la soja, para la que GHVGH HO DxR HO ,1$6( FRQGXFH sus propios ensayos por medio de la Direccin de Registro de Variedades, cuyos resultados luego son comparados con los declarados por el obtentor. (VWRV HQVD\RV \ YHULFDFLRQHV D FDPSR tambin son efectuados para otras especies FRQ HO Q GH SRGHU FRUURERUDU ODV GHFODUDFLRQHV
de los obtentores y realizar el seguimiento del mantenimiento de la pureza varietal a lo largo de los aos. (Q FXDQWR D ORV GHVFULSWRUHV YDULHWDOHV H[LVte uno por especie y todos ellos incluyen los caracteres utilizados a nivel internacional para HIHFWXDU ORV H[iPHQHV '+( (VWDV GLUHFWULFHV tcnicas de la UPOV, son efectuadas por los expertos de los diferentes miembros que partiFLSDQ GH ORV JUXSRV WpFQLFRV HVSHFtFRV (Q ODV mismas, se explica claramente la forma de ejecucin del examen, la toma de observaciones y datos y las expresiones de cada carcter en base a las observaciones efectuadas. Todos los descriptores estn integrados por caracteres que son, como ya dijimos, de tipo morfolgico, VLROyJLFR IHQROyJLFR GH FRPSRUWDPLHQWR D HQfermedades y que, en determinadas especies, incluyen a los referidos a calidad industrial. Cada variedad, cuenta con su descriptor, que no es ni ms ni menos que la combinacin de las expresiones de cada carcter que lo integra. (VD FRPELQDFLyQ GH FDUDFWHUHV QRV GD OD H[presin de la identidad varietal. Hace que esa variedad sea esa y no otra. Nos permite idenWLFDUOD PHGLDQWH HVWRV FDUDFWHUHV FRQWHQLGRV en el descriptor y la combinacin de sus expresiones. Cuando el tcnico que realiza el examen '+( FRPSDUD OD GHVFULSFLyQ GH YDULHGDG LQpGLta contra todas las anteriormente registradas o en trmite de registro, lo que est haciendo HV FRPSDUDU LGHQWLGDGHV PRUIROyJLFDV VLROygicas, fenolgicas, etc. para poder establecer el cumplimiento de una condicin previamente HVWDEOHFLGD OD GLIHUHQFLDFLyQ 7* ,QWURGXFFLyQ *HQHUDO D ODV 'LUHFWULFHV GH H[DPHQ 8329 (Q HVWH VHQWLGR \ KDVWD OD IHFKD OD 8329 KD UHFRPHQGDGR TXH ORV H[iPHQHV '+( VH HIHFten mediante la utilizacin de caracteres de tipo morfolgico, hasta tanto se pueda establecer la tcnica y qu tipo de marcadores moleculares podran ser utilizados a efectos de la diferenciacin. Para ello, y en el seno de la UPOV, se encuentran trabajando el grupo de tcnicas biomoleculares (BMT) y subgrupos de trabajo HVSHFtFR SDUD GLIHUHQWHV HVSHFLHV D Q GH poder establecer estas premisas. La UPOV s se ha manifestado respecto del uso de tcnicas
PROHFXODUHV SDUD GHWHUPLQDU OD LGHQWLGDG (Q este sentido se ha recomendado la posibilidad de uso de estas metodologas. (Q HO FDVR GH OD 5HS~EOLFD $UJHQWLQD HO H[DPHQ '+( FRPR YLPRV DQWHULRUPHQWH VH HIHFta mediante marcadores morfolgicos es deFLU FDUDFWHUHV PRUIROyJLFRV IHQROyJLFRV VLRlgicos, etc. An no se utilizan tcnicas moleculares a efectos de establecer la diferenciacin entre cultivares. Pero s, aceptamos que como informacin complementaria a la descripcin, el obtentor presente el patrn molecular de su indito, indicando la metodologa tcnica y los marcadores utilizados. As y ante un eventual FRQLFWR HO REWHQWRU \D FXHQWD FRQ HVWD LQIRUPDFLyQ PROHFXODU HQ HO ,1$6( \ SRGUtD XWLOL]DUOD D HIHFWRV GH OD LGHQWLFDFLyQ GH VX FXOWLYDU llegado el caso. (Q VHVLRQHV UHFLHQWHV GH OD 8329 GH ORV Cuerpos de decisin, se ha considerado el tema referido a la utilizacin de las tcnicas PROHFXODUHV SDUD RWURV QHV DGHPiV GHO GH OD LGHQWLFDFLyQ FRPR SRU HMHPSOR HQ OD GHWHUPLnacin de variedades esencialmente derivadas. Por supuesto que las recomendaciones de la UPOV son guas tcnicas que cada miembro puede tomar e incorporar en su pas, no siendo obligatorias per-se, pero es sumamente importante que en ese mbito se est discutiendo en los cuerpos tcnicos correspondientes, la utilidad de las tcnicas moleculares con miras a que el sistema de derecho de obtentor cuente con otra herramienta que colabore en su implementacin y ejercicio. 3RU ~OWLPR OD )HGHUDFLyQ ,QWHUQDFLRQDO GH 6HPLOODV ),6 TXH QXFOHD D ORV REWHQWRUHV SDUticipan dos organizaciones argentinas), consiGHUD TXH KDVWD WDQWR QR VH SXHGDQ GHQLU GLVtancias mnimas para la distincin, el impacto que esas tcnicas tendrn en los requisitos de uniformidad y estabilidad y, la disponibilidad de marcadores pblicos, no es posible que puedan VHU XWLOL]DGRV SDUD HO H[DPHQ '+( SRU Vt VRORV 3HUR OD ),6 FRQVLGHUD TXH Vt SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH XQD YDULHGDG SURtegida y/o en la determinacin de una variedad HVHQFLDOPHQWH GHULYDGD )HGHUDFLyQ ,QWHUQDFLRQDO GH 6HPLOODV 'RFXPHQWRV GH SRsicin VREUH SURSLHGDG LQWHOHFWXDO
La nocin de variedad esencialmente derivaGD DSDUHFH HQ HO DUWtFXOR GHO &RQYHQLR ,QWHUQDFLRQDO SDUD OD 3URWHFFLyQ GH ODV 2EWHQFLRQHV 9HJHWDOHV 8329 $FWD GH (Q HVH VHQWLGR Se considerar que una variedad es esencialmente derivada de otra variedad la variedad inicial si i) se deriva principalmente de la variedad inicial, o de una variedad que a su vez se deriva principalmente de la variedad inicial, conservando al mismo tiempo las expresiones de los caracteres esenciales que resulten del genotipo o de la combinacin de genotipos de la variedad inicial; ii). se distingue claramente de la variedad inicial, y iii) salvo por lo que respecta a las diferencias resultantes de la derivacin, es conforme a la variedad inicial en la expresin de los caracteres esenciales que resulten del genotipo o de la combinacin de genotipos de la variedad LQLFLDO Por otra parte, pero en ese mismo sentido, el Convenio agrega que: Las variedades esencialmente derivadas podrn obtenerse, por ejemplo, por seleccin de un mutante natural o inducido o de un variante somaclonal, seleccin de un individuo variante entre las plantas de la variedad inicial, retrocruzamienWRV R WUDQVIRUPDFLRQHV SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD &RQYHQLR ,QWHUQDFLRQDO SDUD OD 3URWHFFLyQ GH ODV 2EWHQFLRQHV 9HJHWDOHV $FWD (VWD QRFLyQ SUHWHQGH LQWURGXFLU XQD PHMRU relacin de derechos entre obtentores y tituODUHV GH GHUHFKR (O &RQYHQLR WDO FRPR HVWi contiene en todas sus versiones vigentes, una excepcin al derecho del obtentor, reconocida como H[FHSFLyQ GHO WRPHMRUDGRU o breeder's exemption. Por esta excepcin al GHUHFKR XQ WRPHMRUDGRU SXHGH WRPDU FRPR fuente de variacin inicial el material de propagacin de una variedad que se encuentra con titularidad vigente (inscripta en el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares en el caso de la Repblica Argentina) y sin solicitar autorizacin al titular de ese derecho vigente (el obtentor) utilizar ese material de propagacin de esa variedad protegida como fuente de variacin a partir de la que podr obtener una nueva variedad, siempre y cuando no deba utilizar en cada nuevo ciclo de produccin de su nueva variedad, al material de propagacin de la variedad protegida.
Si pensamos, por ejemplo en variedades obtenidas por recombinacin de ADN, se podra suscitar una relacin de desequilibrio en cuanto a los derechos de obtentores y titulares de otros derechos. As, el obtentor de una variedad protegida, queda exceptuado de su derecho ante la utilizacin de su variedad como IXHQWH GH YDULDFLyQ LQLFLDO SDUD RWUD PHMRUD (Q cambio, el titular de un derecho de, por ejemSOR SDWHQWH VREUH XQ JHQ PRGLFDGR SURGXFWR o procedimiento determinado, podr ejercer su derecho ante la utilizacin de un tercero. Sin duda, el desbalance entre derechos y titulares es notable. Por esta razn, el Acta de 1991 de la UPOV introduce la nocin de variedad esencialmente derivada por el que: En la prctica, el nuevo sistema ha creado un marco dentro del cual, las partes interesadas pueden negociar: a) aquel que desea emprender una seleccin mejorante (con inclusin de un trabajo de transformacin mediante ingeniera gentica) sobre una variedad protegida, concertar un acuerdo con el obtentor de esta variedad antes de comenzar sus trabajos (esos acuerdos ya se han concertado entre empresas de ingeniera gentica y obtentores tradicionales); b) cuando un trabajo de seleccin resulte de forma imprevista en la creacin de una variedad esencialmente derivada, los dos obtentores se entendern sobre la explotacin de esta ltima si constituye un verdadero mejoramiento; el precio que ha de pagar el usuario no ser una regala doble, sino una suma determinada por las leyes del mercado (por la competencia). Si no hay mejoramiento, o bien el obtentor de la variedad esencialmente derivada decidir que no la va a explotar, o bien el obtentor de la variedad inicial ejercer su derecho para negar al segundo obtentor el derecho a explotar la variedad; c) los obtentores de variedades resultantes de una seleccin innovante y los inventores de productos o de procedimientos que dan lugar a variedades esencialmente derivadas tienen derechos de valor sensiblemente equivalente y, por consiguiente, se ven obligados a concertar acuerdos equilibrados (Ley tipo sobre la proteccin de las obtenciones veJHWDOHV 8329 La nocin de variedad esencialmente derivada hace intervenir el grado de semejanza
entre una de las variedades parentales (la variedad inicial) y la variedad derivada. Para que exista derivacin esencial, este grado de semejanza debe ser muy grande y el nmero de caracteres heredados del segundo genitor (si lo hay) debe ser muy pequeo; en ltima insWDQFLD VH PRGLFD XQ VyOR FDUiFWHU (Ley tipo sobre la proteccin de las obtenciones vegetaOHV 8329 3DUD ODV RFLQDV GH SURWHFFLyQ GH YDULHGDdes, la situacin es clara: si una variedad es nueva, diferente, homognea, estable, cuenta con una adecuada denominacin y ha cumplido con las formalidades administrativas, esa 2FLQD QR WLHQH PRWLYR SDUD QR RWRUJDU HO WtWXOR de obtentor o de propiedad de variedades vegetales. Al momento en que el obtentor de la variedad esencialmente derivada, pretenda realizar alguno de los actos a los que se extiende el derecho del obtentor de la variedad inicial sobre sta, es en ese caso en que deber solicitar permiso para ello al obtentor de esa variedad inicial. Todas las partes interesadas se han puesto de acuerdo en que las relaciones de dependencia debern ser administradas por los propios obtentores, sin que intervengan las autoridades encargadas de administrar el sistema de proteccin de las obtenciones vegetales. Las grandes organizaciones nacionales e internacionales de obtentores, estn elaborando ya recomendaciones sobre las condiciones prcticas en las que una variedad ser considerada FRPR HVHQFLDOPHQWH GHULYDGD (Ley tipo sobre OD SURWHFFLyQ GH ODV REWHQFLRQHV YHJHWDOHV 8329 Marcadores moleculares y la UPOV Antecedentes A la luz de los avances en biologa molecular y en las tcnicas de mejoramiento, la UPOV decidi que era necesario incorporar un nuevo grupo que pudiera estudiar la aplicacin de los PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HQ ORV HVWXGLRV '+( (Q HO DxR VH OOHYy D FDER OD SULPHUD UHunin del Grupo de Trabajo en Tcnicas BioTXtPLFDV \ 0ROHFXODUHV \ GH SHUOHV GH $'1 en particular, conocido como Grupo BMT.
(O %07 HV XQ JUXSR GH H[SHUWRV HQ HO H[DPHQ '+( HVSHFLDOLVWDV HQ WpFQLFDV ELRTXtPLcas y moleculares, y obtentores cuya funcin actual consiste en: 1. ([DPLQDU OD HYROXFLyQ JHQHUDO GH ODV WpFnicas bioqumicas y moleculares. 2. ,QIRUPDU DFHUFD GH ODV DSOLFDFLRQHV SHUWLnentes de las tcnicas bioqumicas y moOHFXODUHV DO WRPHMRUDPLHQWR (VWXGLDU OD SRVLEOH DSOLFDFLyQ GH ODV WpFnicas bioqumicas y moleculares al exaPHQ '+( H LQIRUPDU VREUH VXV FRQFOXsiones al Comit Tcnico. 4. Si procede, elaborar directrices para metodologas bioqumicas y moleculares y su armonizacin y, en particular, contribuir a la elaboracin de un documento UHIHULGR D QXHYRV FDUDFWHUHV (VWDV GLrectrices se elaborarn en colaboracin con los Grupos de Trabajo Tcnico (o sus siglas en ingls TWP). ([DPLQDU ODV LQLFLDWLYDV GH ORV *UXSRV GH Trabajo Tcnico sobre el establecimiento GH VXEJUXSRV VREUH FXOWLYR HVSHFtFRV tomando en consideracin la informacin disponible y la necesidad de mtodos bioqumicos y moleculares. (ODERUDU GLUHFWULFHV HQ UHODFLyQ FRQ OD gestin y la armonizacin de bases de datos sobre informacin bioqumica y molecular, en colaboracin con el Grupo de Trabajo en Computacin (TWC). 7. Recibir informes de los Subgrupos sobre Cultivos y del Grupo de Consulta del BMT. 8. Constituir un foro para debatir la utilizacin de tcnicas bioqumicas y moleculares en el examen de las variedades HVHQFLDOPHQWH GHULYDGDV \ OD LGHQWLFDcin de las variedades. 8329 7& (Q OD WD 5HXQLyQ GHO %07 OOHYDGD D FDER HQ $QJHUV )UDQFLD HQ PDU]R GH HO *UXpo BMT consider que existan (y existen an) una serie de problemas de tipo legal y poltico referidos al uso de estas tcnicas, que deberan ser discutidos en el mbito de un grupo HVSHFtFR (Q RFWXEUH GHO PLVPR DxR HO &$acept la formacin de dicho grupo, y en 2001
se acord el mandato de lo que se denomin 6XEJUXSR (VSHFLDO GH ([SHUWRV 7pFQLFRV \ -Xrdicos sobre Tcnicas Bioqumicas y Moleculares o tambin conocido como Grupo de Consulta del BMT, y que contiene los puntos que se describen a continuacin. 1. (O *UXSR GH &RQVXOWD GHO %07 GHEHUi evaluar los posibles modelos de aplicacin propuestos por el Comit Tcnico, sobre la base de los trabajos realizados por el BMT y los subgrupos sobre cultivos, para la utilizacin de las tcnicas bioqumicas y moleculares en el examen de la distincin, la homogeneidad y la estabilidad en relacin con: a). la conformidad con el Convenio de la UPOV. b). las posibles repercusiones en la HFDFLD GH OD SURWHFFLyQ FRPSDUDGD con la obtenida mediante los mtodos actuales del examen, y pronunciarse sobre la eventual disminucin de la HFDFLD GH OD SURWHFFLyQ RIUHFLGD mediante el sistema de la UPOV. 2. Al realizar su evaluacin, el Grupo de Consulta del BMT podr remitir cuestiones concretas al Comit AdministratiYR \ -XUtGLFR R DO &RPLWp 7pFQLFR SDUD proveer de aclaraciones o informacin complementaria, segn se considere apropiado. (O *UXSR GH &RQVXOWD GHO %07 LQIRUPDUi DO &RPLWp $GPLQLVWUDWLYR \ -XUtGLFR VRbre su evaluacin, tal como consta en el prrafo 1, pero esta evaluacin no ser vinculante para la postura del Comit AdPLQLVWUDWLYR \ -XUtGLFR 4. 8329 7& &$- $ OR ODUJR GH ORV DxRV GH H[LVWHQFLD GHO grupo BMT, se han formado diversos subgruSRV GH WUDEDMR HVSHFtFRV SRU FXOWLYR R JUXSRV de cultivos, denominados formalmente Subgrupos de Cultivos. Los que existen actualmente son los siguientes: papa; rosa; caa de azcar; trigo y cebada; maz; colza; raigrs; soja; tomate y el grupo horizontal de cultivos de propagacin vegetativa. (VWRV JUXSRV DQDOL]DQ HO WHPD VHJ~Q ODV FDUDFWHUtVWLFDV HVSHFtFDV GH FDGD HVSHFLH R
grupo de especies, facilitando la discusin y agilizando la toma de decisiones. Modelos para la posible introduccin de WpFQLFDV PROHFXODUHV HQ ORV HVWXGLRV '+( (Q HO DxR GXUDQWH OD PD VHVLyQ GHO Grupo BMT, ste consider de importancia que el Grupo de Consulta del BMT pudiera tomar sus decisiones legales y polticas sobre la base de diversos modelos para el uso de marcadoUHV PROHFXODUHV HQ ORV HQVD\RV '+( \ TXH DGHPiV pVWRV GHEHUtDQ HVWDU GHQLGRV SRU ORV expertos de los Subgrupos de Cultivos. Los modelos para el uso de tcnicas bioTXtPLFDV \ PROHFXODUHV HQ ORV HVWXGLRV '+( aceptados son los siguientes: 1. Las caractersticas moleculares como predictivas de caractersticas tradicionales. Utilizacin de caracteres moleculares que se vinculan directamente con los caracteres tradicionales (marcadores geQpWLFRV HVSHFtFRV ORV PDUFDGRUHV PRleculares que se vinculan directamente con los caracteres tradicionales pueden resultar tiles para examinar los caracteres tradicionales que no pueden observarse fcilmente o de manera coherente en el terreno, o requieren disposiciones especiales adicionales (por ejemplo, los caracteres de resistencia a las enfermedades). Deber demostrarse que existe XQ YtQFXOR DEOH HQWUH HO PDUFDGRU \ OD expresin del carcter. Por ejemplo el carcter de tolerancia a herbicidas, introGXFLGR SRU PRGLFDFLyQ JHQpWLFD (VWH modelo tiene una serie de supuestos: el ensayo para el marcador debe realizarse sobre el mismo nmero de plantas individuales, la misma cantidad de aos y los mismos criterios que para los ensayos a campo. GHEH YHULFDUVH TXH UHDOPHQWH HO PDUFDdor est ligado al gen. si se tienen distintos marcadores para la misma caracterstica, stos se considerarn como distintos mtodos para evaluar esa caracterstica. VL VH WLHQHQ GLVWLQWRV JHQHV TXH FRQHUHQ la misma caracterstica, stos se considerarn como distintos mtodos para
evaluar la misma caracterstica. fenotpica entre dos variedades. Luego, si existen distintos marcadores ligados se establece la diferencia entre variedaa diferentes elementos regulatorios para des utilizando una distancia molecular. Si el mismo gen, estos marcadores sern la correlacin entre ambas distancias es considerados como distintos mtodos IXHUWH VH YHUi DOJR VLPLODU D OD JXUD para evaluar la caracterstica. (Q HVWH FDVR HO XPEUDO GH 'LVWLQFLyQ 3OXV Sobre estos dos ltimos puntos se deja asen- para marcadores moleculares, puede ser extado que se podrn hacer consideraciones, en trapolado a partir del umbral basado en caractanto que pueden existir distintos mecanismos tersticas tradicionales. De esta forma, se tode accin de los genes (que otorguen ciertas marn las mismas decisiones sin importar cual diferencias) y que algunos elementos regulato- GH ORV PpWRGRV KD\D VLGR HO XWLOL]DGR (Q ORV rios son comunes a varios genes. casos reales, las correlaciones no son tan bue2. Comparacin de niveles de umbral para nas, observndose una nube de puntos mas caracteres moleculares con la distancia GLVSHUVD JXUD mnima en caracteres tradicionales para Los mtodos no coinciden en el grado de el manejo de colecciones de referencia: distincin para los pares de variedades que la clave consiste en determinar si pares de variedades, que no se consideran distintas utilizando caracteres tradicionales, pueden juzgarse distintas al utilizarse caracteres moleculares, y si dichas decisiones podran ser aceptables para conservar el valor de la proteccin. Las propuestas presentadas debern basarse en una evaluacin de la distancia gentica en lugar de en un enfoque carcter por carcter y podrn ser utilizadas en la gestin de las colecciones de referenFLD (V GHFLU OR TXH EXVFD HVWD RSFLyQ es llevar menor cantidad de variedades de la coleccin a campo, de manera de Figura 1. $GDSWDGR GH 7& &$- minimizar costos. Lo importante de este $QH[R SiJLQD sistema es que se debe establecer un nivel de distincin, que se denomina Distincin Plus, en el que la diferencia entre dos variedades sea altamente evidente. Aquellas variedades que resulten no distintas en esta primera evaluacin, sern evaluadas en un examen a campo, donde se podr determinar si realmente son distintas o no a las variedades nuevas que se requiere ensayar. La propuesta de esta opcin es la obtencin de un umbral de Distincin Plus basado HQ FDUDFWHUtVWLFDV PROHFXODUHV (Q esta propuesta, el primer paso es evaluar las caractersticas tradicioFigura 2. $GDSWDGR GH 7& &$- $QH[R SiJLQD nales y establecer una diferencia
FDHQ GHQWUR GH ORV FXDGUDQWHV \ 3DUD ORV pares de variedades que caen dentro de los cuadrantes 1 y 2, las decisiones tomadas no tendrn impacto en la proteccin. Respecto del FXDGUDQWH ODV GHFLVLRQHV WDPSRFR WHQGUiQ impacto en la proteccin, ya que esos pares de variedades debern pasar por la evaluacin a FDPSR (Q HO FDVR GHO FXDGUDQWH ORV SDUHV de variedades estn por debajo del umbral de distincin tradicional (por lo tanto seran similares), pero resultan distintas utilizando caractersticas moleculares. Para evitar posibles inconvenientes al poner en prctica este mtodo, ambos sistemas deben ser corridos en paralelo \ VH GHEHUiQ GHWHUPLQDU XPEUDOHV OR VXFLHQtemente altos (con marcadores moleculares) GH PDQHUD GH PLQLPL]DU HVWRV FDVRV (VWH VLVWHPD KD VLGR FDOLEUDGR HQ )UDQFLD SDUD HO FDVR del maz utilizando caracteres basados en protenas. Los supuestos de esta opcin son los siguientes: Se supone que las diferencias calculadas entre variedades utilizando marcadores moleculares, incluyen a las diferencias encontradas dentro de las variedades. (VWD RSFLyQ VHUi XWLOL]DGD SDUD HVWDEOHcer la Distincin Plus para el manejo de las colecciones de referencia. /D PHWRGRORJtD XWLOL]DGD HV OR VXFLHQWHmente robusta y repetible. Creacin de un nuevo sistema: esta opcin se basa en la utilizacin de caracteres moleculares del mismo modo en que se utilizan los caracteres no moleculares H[LVWHQWHV (VWH HQIRTXH VLJQLFD TXH las diferencias claramente distinguibles en los caracteres moleculares se consideraran niveles de umbral para evaluar la Distincin. Para esta opcin es fundamental analizar las repercusiones que podra tener el nuevo sistema, en el nivel de la proteccin, en comparacin con el VLVWHPD DFWXDO (VWR VH SXHGH OOHYDU D cabo mediante la revisin de las posibles diferencias en las decisiones tomadas XWLOL]DQGR XQR X RWUR VLVWHPD (VWH QXHYR sistema se ha ensayado utilizando fundamentalmente marcadores SSR (Short Sequence Repeat o microsatlites) y ms recientemente marcadores SNP (Single
1XOFHRWLGH 3RO\PRUSKLVP R SROLPRUVPR de nuclotido simple) en rosa y tambin existen algunos ejemplos en trigo y vid, ninguno de ellos actualmente aceptado por la UPOV. Como ejemplo, a continuacin se describe brevemente como sera el ensayo en el caso de rosa. Para esta especie se han preseleccionado 7 marcadores SSR. La prueba se lleva a cabo sobre dos plantas individuales de cada variedad candidata. Si sta tiene al meQRV EDQGDV R SLFRV GLIHUHQWHV UHVSHFWR de las otras variedades, se la considera distinta, y se podr luego realizar el ensayo a campo para evaluar la estabilidad \ OD KRPRJHQHLGDG (Q HO FDVR GH TXH no sea distinta, se la evaluar con otros 7 marcadores SSR. Si se encuentran al PHQRV EDQGDV R SLFRV GH GLIHUHQFLD entonces se la considerar distinta y se la evaluar a campo para determinar si es homognea y estable. Si no se logra la distincin, se considera que es una variedad ya existente o una mutante y se la evaluar a campo tanto para determinar la homogeneidad y la estabilidad como para determinar la distincin, siempre utilizando caractersticas no moleculaUHV (O ULHVJR HQ FXDQWR D PDQWHQHU HO nivel de proteccin, de esta opcin es que puede ocurrir que variedades que no hayan sido consideradas distintas usando las caractersticas tradicionales, sean consideradas distintas basndose en esta opcin. Si bien la probabilidad de que eso ocurra es baja, la UPOV an no ha aceptado a este nuevo sistema 8329 7& &$- Otros modelos de uso de las tcnicas bioqumicas y moleculares (O JUXSR %07 WLHQH GHQWUR GH VX DOFDQFH OD SRVLELOLGDG GH GLVFXWLU WHPDV GH LGHQWLFDFLyQ de variedades y referidos a las variedades esencialmente derivadas. Adems de la posibilidad de usar a los marcadores moleculares SDUD ORV H[iPHQHV '+( pVWRV WDPELpQ SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH YDULHGDGHV D Q GH GDU UHVSXHVWD D GRV WHPDV GH gran inters para la UPOV:
a. Hacer valer el derecho del obtentor. b. (YDOXDU OD GHULYDFLyQ HVHQFLDO (VWRV SRVLEOHV XVRV GH ORV PDUFDGRUHV GH $'1 WLHQHQ XQD GHQLFLyQ PiV UHFLHQWH HQ HO mbito de la UPOV, discutindose las diferentes propuestas tcnicas dentro del grupo BMT. Hacer valer el derecho del obtentor, tcnicaPHQWH VLJQLFD TXH VH GHEHUi HVWDEOHFHU XQ VLVWHPD WDO TXH VH SXHGD UHDOL]DU XQD LGHQWLcacin nica de cada variedad de inters (por ejemplo todas las de la coleccin de referencia de un pas, o una regin o ms ambiciosamente, a nivel mundial). Para esto es necesario contar no slo con material original (provistos por las empresas criadero o por los organisPRV RFLDOHV VLQR WDPELpQ GH PDUFDGRUHV tcnicamente validados, en lo posible en el mbito regional o mundial. Los marcadores a utilizar debern ser de uso pblico, as como tambin las metodologas de anlisis y se utilizarn la menor cantidad de marcadores posiEOH WDO TXH VH SXHGD LGHQWLFDU D ODV YDULHGDGHV que ya tengan ttulo de propiedad, a la vez que haya un margen para que se puedan incorporar QXHYDV YDULHGDGHV DO VLVWHPD (VWRV VLVWHPDV requerirn la construccin de bases de datos compatibles entre pases para poder realizar cualquier intercambio de informacin. $FWXDOPHQWH HQ HO iPELWR GH ,67$ ,QWHUQDtional Seed Testing Association), se estn llevando a cabo ensayos de validacin de marcadores SSR sobre 4 especies de inters econmico mundial. (Q HO FDVR GH OD GHULYDFLyQ HVHQFLDO VH EXVca determinar si una variedad deriva de otra TXH \D WLHQH WtWXOR GH SURSLHGDG (VWR DFWXDOmente es posible realizarlo llevando a cabo un HQVD\R D FDPSR TXH SXHGH GXUDU HQWUH \ aos. Los marcadores de ADN pueden acortar estos tiempos a unos pocos meses si se cuenta con un sistema adecuado de evaluacin de la derivacin. (Q HVWH FDVR OD SURSXHVWD HV HYDOXDU JUDQ FDQWLGDG GH PDUFDGRUHV QR PHQRV GH D 200 marcadores) de manera tal de saturar el genoma y as determinar el grado en que se distinguen una variedad de la otra. Para eso debe GHQLUVH XQ XPEUDO GH GLVWLQFLyQ TXH VH HVWDEOHce usando pares de variedades de genealoga conocida o pares de aquellas que han sido pro-
ducidas usando los mtodos que pueden llevar a derivacin, y calculando la similitud. Su magnitud depender de la especie, de la variabilidad gentica y del proceso de mejoramiento. Si al evaluar dos plantas, la similitud de las mismas est por debajo del umbral, se puede decir que las plantas son distintas. Pero si la similitud supera al umbral, estaremos en una zona de posible derivacin y entonces se debern OOHYDU D FDER ORV HQVD\RV D FDPSR JXUD
Figura 3. (VTXHPD GH XPEUDOHV GH GLVWLQFLyQ SDUD variedades esencialmente derivadas. (Adaptado de Le Buanec, 2007).
Seleccin de marcadores moleculares y construccin de bases de datos: directrices del BMT Durante la 8va sesin del grupo BMT en VH HQWHQGLy TXH HUD QHFHVDULR FRPHQ]DU a armonizar metodologas para la generacin GH GDWRV PROHFXODUHV D Q GH DVHJXUDU OD FDOLdad de los datos producidos y para que stos DGHPiV VHDQ DFHSWDGRV XQLYHUVDOPHQWH D Q de ser usados en la caracterizacin de variedades. Tambin se consider fundamental poder establecer normas o ejemplos de diseos de EDVHV GH GDWRV HVSHFtFDV SDUD GDWRV PROHFXODUHV GH GLVWLQWR WLSR (VWDV FRQVLGHUDFLRQHV se plasmaron en los borradores de las Directrices del BMT. (VWH WH[WR TXH D~Q VLJXH HQ GLVFXVLyQ FRQtiene lo siguiente: GHQLFLRQHV JHQHUDOHV criterios bsicos para la seleccin de metodologas adecuadas. criterios generales para la seleccin de PDUFDGRUHV \ FULWHULRV HVSHFtFRV SRU tipo de marcador. consideraciones sobre el origen y tipo de material a analizar y sobre la cantidad de
plantas o semillas requeridas en cada caso (tamao de muestra segn tipo de propagacin del material). consejos sobre el uso de materiales de referencia y la calidad de ADN requerido. Consejos sobre la forma de interpretacin de los datos y de los resultados.
(Q HVWH VHQWLGR OD $VRFLDFLyQ ,QWHUQDFLRQDO GH $QiOLVLV HQ 6HPLOODV ,67$ FRPHQ]y HQ 2007 a conducir ensayos inter-laboratorio con QHV GH LGHQWLFDFLyQ GH YDULHGDGHV PHGLDQWH la tcnica de microsatlites (SSR) para cuatro especies de inters comercial mundial: trigo, soja, maz y arroz. &RQVLGHUDFLRQHV QDOHV La postura de la UPOV respecto de los marcadores moleculares es objeto de evaluacin continua debido a la evolucin constante de estas tcnicas y a las nuevas posibilidades que ofrecen en lnea con los criterios del organismo. Conforme a la actual postura de la UPOV, es posible aplicar los planteamientos del punto 1. (las caractersticas moleculares como cualidades predictivas de caractersticas tradicionales) ya que basndose en las premisas de la propuesta, sta est en conformidad con el &RQYHQLR GH OD 8329 \ QR PHUPDUtD OD HFDcia de la proteccin suministrada en virtud del actual sistema. Tambin es posible aplicar lo descrito en el punto 2. (comparacin de niveles de umbral para caracteres moleculares con la distancia mnima en caracteres tradicionales), ya que cuando se utilizan para la gestin de colecciones de referencia est en conformidad con las disposiciones del Convenio de la UPOV \ QR PHUPDUtD OD HFDFLD GH OD SURWHFFLyQ VXministrada en virtud del sistema actual. Sin embargo, la UPOV considera que no se ha alcanzado un acuerdo respecto de los planWHDPLHQWRV GHO SXQWR FUHDFLyQ GH XQ QXHYR sistema basado en marcadores de ADN). Se ha observado que no existe consenso en relacin con la aceptacin de dicha opcin ya que se considera que no hay conformidad con el Convenio de la UPOV. Tampoco hay acuerdo UHVSHFWR GH VL PHUPDUtD OD HFDFLD GH OD SURWHFcin suministrada en virtud del actual sistema. Asimismo se ha expresado la preocupacin de que si se adopta dicho enfoque, podran utilizarse un nmero ilimitado de marcadores para encontrar diferencias entre variedades que estn en el plano gentico que no necesariamenWH VH UHHMHQ HQ FDUDFWHUHV PRUIROyJLFRV FDracteres en los que se basa el sistema actual de la UPOV). )LQDOPHQWH VH KDQ REVHUYDGR XQD VHULH GH cuestiones generales, como por ejemplo la ac-
A continuacin se presenta un resumen de los diversos puntos sobre seleccin y uso de marcadores de ADN para poder generar datos de calidad y que sean universalmente aceptados: a. considerar un anlisis basado en estudios de especie por especie. b. acordar el tipo de marcador. c. acordar sobre el equipamiento a utilizar y la plataforma de deteccin. d. acordar sobre los laboratorios que se incluyan en un posible ensayo entre laboratorios.
e. acordar sobre criterios de calidad. f. YHULFDU OD IXHQWH GHO PDWHULDO YHJHWDO FRQ el que se trabaja. g. acordar qu marcadores se utilizarn en un primer ensayo colaborativo, cules laboratorios y sobre qu plataformas distintas. h. conducir un ensayo colaborativo. i. desarrollar un protocolo para evaluar los datos moleculares. j. acordar sobre el material vegetal y el grupo de materiales de referencia a ser analizado y el origen del mismo (por especie). k. analizar la coleccin de referencia en diferentes laboratorios, con diferentes sistemas de deteccin, realizando anlisis por duplicado, e intercambiando muestras y extracciones de ADN si ocurre algn problema. l. utilizar variedades, muestras de ADN y/o alelos de referencia en los anlisis. m. YHULFDU FDGD HWDSD LQFOX\HQGR OD HQWUD GD GH GDWRV (Q OR SRVLEOH DXWRPDWL]DU n. llevar adelante un ensayo ciego en diferentes laboratorios utilizando la base de datos. o. adoptar un procedimiento de manera tal de poder incluir nuevos datos. (UPOV BMT Guidelines-proj-8, 2007) (Q GHQLWLYD HVWH WH[WR LQGLFD TXH ORV HQVDyos que se realicen utilizando marcadores de ADN, deben estar validados a travs de un ensayo inter-laboratorio.
cesibilidad a las tcnicas protegidas por patentes, la necesidad de tener en cuenta la relacin FRVWRVEHQHFLRV GH HVWRV QXHYRV HQIRTXHV la importancia de la relacin que existe entre los caracteres fenotpicos y las tcnicas moleFXODUHV \ QDOPHQWH OD QHFHVLGDG GH H[DPLQDU WDPELpQ OD +RPRJHQHLGDG \ OD (VWDELOLGDG en los mismos caracteres que se utilizan para H[DPLQDU OD 'LVWLQFLyQ 8329 7& Lecturas recomendadas
'HFUHWR 1 5HJODPHQWDULR GH OD /H\ 1 GH 6HPLOODV \ &UHDFLRQHV )LWRJHQpWLFDV )HGHUDFLyQ ,QWHUQDFLRQDO GH 6HPLOODV 'RFXmentos de posicin sobre propiedad intelectual. ,1$6( )RUPXODULRV JHQHUDOHV SDUD LQVFULScin de cultivares. ,QDVHJRYDU ZZZLQDVHJRYDU Le Buanec, M. 2007. Use of Molecular techniques in relation to essential derived varieties. ProFHHGLQJV RI WKH ,QWHUQDWLRQDO 6\PSRVLXP RQ the application of molecular techniques for plant breeding and plant variety protection. Seoul, noviembre de 2007. 8329 7* ,QWURGXFFLyQ *HQHUDO D ODV Directrices de examen. 8329 &RQYHQLR ,QWHUQDFLRQDO SDUD OD 3URteccin de las Obtenciones Vegetales.
8329 &RQYHQLR ,QWHUQDFLRQDO SDUD OD 3URteccin de las Obtenciones Vegetales. 8329 /H\ WLSR VREUH OD SURWHFFLyQ GH ODV REtenciones vegetales. 8329 7& &$- $G +RF subgroup of technical and legal experts on biochemical and molecular techniques (The BMT UHYLHZ JURXS 8329 7& &$- $G +RF subgroup of technical and legal experts on biochemical and molecular techniques (The BMT UHYLHZ JURXS $QH[R SiJLQD 8329 7& ,QIRUPH GHO &RPLWp 7pFQLco. 8329 7& 7pFQLFDV 0ROHFXODUHV 8329 0LHPEURV GH OD 8QLyQ ,QWHUQDFLRQDO para la Proteccin de las Obtenciones Vegetales. 6WDWXV DO GH -XQLR GH
PARTE IV Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma
IV. CAPTULO 1 Micropropagacin

Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano 1 Introduccin La micropropagacin consiste en la propaJDFLyQ GH SODQWDV HQ XQ DPELHQWH DUWLFLDO FRQtrolado, empleando un medio de cultivo adecuado. El cultivo es as una herramienta muy til en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn sujetas a los estmulos adecuados. As, las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la competencia que posea y al estmulo que reciban . Dependiendo de las caractersticas de la planta que se pretenda propagar y del objetivo perseguido, la micropropagacin puede realizarse a travs de tres vas de regeneracin: brotacin de yemas adventicias preexistentes, produccin de yemas de novo y embriognesis somtica. 2 Etapas de la micropropagacin La micropropagacin presenta cuatro etapas principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos o embriones, 3) enraizamiento y 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En el caso de la embriognesis somtica, el enraizamiento es reemplazado por una etapa de maduracin y germinacin de los embriones para la diferenciacin de los pices caulinar y radicular. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa de preparacin de los explantos para el establecimiento.
Etapa 0: Preparacin del material vegetal La correcta eleccin y preparacin del explanto incide directamente sobre la calidad del mismo y su respuesta frente a los dos principales problemas que afectan al establecimiento del cultivo, que son la contaminacin con microorganismos y la oxidacin del explanto. /RV IDFWRUHV TXH LQX\HQ VREUH OD FDOLGDG GHO explanto son: el tipo de rgano que sirve como H[SODQWR OD HGDG RQWRJpQLFD \ VLROyJLFD GHO mismo, la estacin en la cual se colecta el material vegetal, el tamao y el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse en base a una seleccin masal positiva para las caractersticas agronmicas deseables. Una vez seOHFFLRQDGRV ORV LQGLYLGXRV HV SUHFLVR GHQLU HO tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios problemas de contaminacin. $ Q GH ORJUDU H[SODQWRV GH ySWLPD FDOLGDG es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relaWLYD D Q GH UHGXFLU OD SUROLIHUDFLyQ GH patgenos. /RV SURFHVRV PRUIRJpQLFRV GH RUDFLyQ GRUPLFLyQ \ EXOELFDFLyQ VRQ FRQWURODGRV SRU HO fotoperodo y la temperatura. Controlando estos factores tambin es posible obtener plantas
donantes y explantos ms homogneos durante todo el ao. Pueden aplicarse adems pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, as como tambin a los explantos mismos. En especies leosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersin de los explantos primarios en soluciones con citoFLQLQDV D Q GH LQGXFLU OD EURWDFLyQ GH \HPDV Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. El xito est determinado por la calidad del explanto a utilizar. En esta etapa los principales procesos a controlar son la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de los explantos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemticos jvenes, ya sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbceas y aquellos tejidos meristemticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leosas. En este sentido, es importante sealar que el empleo de yemas adventicias (tambin llamadas yemas formadas de novo) est asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagacin basados en la regeneracin a partir de yemas axilares o embriones somticos. La obtencin de cultivos axnicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos. Una accin preventiva la FRQVWLWX\H HO HPSOHR GH PpWRGRV GH YHULFDcin de patgenos en los explantos. Esto puede UHDOL]DUVH PHGLDQWH DQiOLVLV HVSHFtFRV SDUD las enfermedades del cultivo, tales como DASELISA o PCR, anlisis generales para patgenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y honJRV \ PpWRGRV HVSHFtFRV SDUD OD GHWHFFLyQ H LGHQWLFDFLyQ GH SDWyJHQRV LQWUDFHOXODUHV FRPR virus, viroides y bacterias. La realizacin de estos anlisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los sntomas ms marcados de la enfermedad, en segundo lugar,
la carga de patgenos es mayor y por lo tanto la precisin del sistema de deteccin aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden tratarse con tcnicas adecuadas para la eliminacin de patgenos como la termoterapia, la quimioterapia a travs de la aplicacin de antibiticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemas. /D GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO LQFOX\H YDULRV SDsos: el lavado de los explantos con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetracin y actividad. Posteriormente, los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estril. Algunos patgenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patJHQRV LQFOX\HQ ORV SDWyJHQRV VXSHUFLDOHV GHO material vegetal, los patgenos endgenos y los patgenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambin pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilizacin y por patgenos endgenos latentes dentro del sistema vascular, resultado de una esterilizacin inefectiva de los explantos. Estos patgenos latentes podran manejarse mediante el empleo de bacteriostticos o antibiticos en el medio de cultivo. Etapa 2: Multiplicacin El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos (subcultivos) y poder destinar parte de ellos a la siguiente HWDSD GH SURGXFFLyQ HQUDL]DPLHQWR EXOELFDcin, etc.). Ambas vas de regeneracin, organognesis y embriognesis, pueden darse en forma directa o indirecta. Esta ltima implica la formacin de callo. En general, la organognesis conduce a la produccin de vstagos unipolares que enrazan en etapas sucesivas, mientras que por embriognesis somtica se forman embriones bipolares a travs de etapas ontognicas similares a la embriognesis cigtica. Es importante sealar que cualquiera sea la va de regeneracin empleada, es convenien-
te evitar la formacin de callo para disminuir el riesgo de variacin somaclonal. Los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido giberlico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crtico sobre la multiplicacin clonal de los explantos. La organognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La induccin de yemas axilares comprende la multiplicacin de yemas preformadas, usualmente sin formacin de callo. La induccin de yemas adventicias comprende la induccin de tejido meristemtico localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciacin del primordio y desarrollo del vstago, esto ltimo generalmente en ausencia del regulador de crecimiento que indujo la organognesis. La principal desventaja del primer mtodo es que el nmero de yemas axilares por explanto limita la cantidad de vstagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicacin con los sucesivos subcultivos. La formacin de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la produccin de vstagos, ya que ocurre en sitios distintos al de los meristemas.
La embriognesis somtica es una va ms conveniente porque permite saltar las etapas de formacin de yemas y enraizamiento, regenerando plantas en una forma mucho ms rSLGD \ HFLHQWH $ VX YH] OD GLVSRQLELOLGDG GH protocolos para la obtencin de embriones somticos es clave para la automatizacin de la micropropagacin y la consecuente reduccin de costos para su implementacin a escala comercial. Los biorreactores son equipos que contienen aproximadamente 2 litros de medio de cultivo lquido estril y donde los embriones somticos pueden regenerar y madurar a partir de suspensiones celulares, sustentados por la circulacin permanente de nutrientes y de aire (Fig.1). Hoy en da, el empleo de biorreactores para la micropropagacin a gran escala est limitado por dos motivos crticos. En primer lugar, el declinamiento de las lneas celulares (clones) por efecto de la variacin somaclonal y segundo, por los altos costos asociados con la conversin de estos embriones somticos en plntulas. Las condiciones culturales en las cuales crece el explanto son el resultado de la interaccin de tres factores: el estado del explanto o material vegetal, determinado en parte por el medio de cultivo, el recipiente de cultivo y el ambiente externo o condiciones de crecimiento del cuarto de cultivo. La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo cambia con el nmero de subcultivos, el tipo de explanto subcultivado y el mtodo del repique. Por esto mismo, el medio de cultivo debe RSWLPL]DUVH D Q GH ORJUDU OD mayor tasa de multiplicacin vegetativa. Comnmente se emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicioFigura 1: Embriognesis somtica en zanahoria. A partir de cnan adems reguladores de OXODV GHO RHPD VH REWLHQHQ ORV HPEULRQHV VRPiWLFRV TXH VRQ crecimiento, tanto del tipo de un excelente sistema de propagacin clonal. Los bioreactores auxinas como de citocininas. permiten el cultivo a gran escala de los mismos.
La etapa de multiplicacin generalmente comprende dos perodos, la fase de induccin y la fase de multiplicacin propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas ms que citocininas) para favorecer la desdiferenciacin. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciacin y multiplicacin celular. En este caso el sistema es ms dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formacin de embriones somticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduracin y de germinacin respectivamente, cuya duracin vara entre 1 a 2 semanas. Para la etapa de maduracin se adiciona ABA (cido absccico) al medio basal HQ UDQJRV GH D 0 VHJXLGR GHO VXEFXOWLYR a un medio basal conteniendo AG (cido gibeUpOLFR HQ FRQFHQWUDFLRQHV GH 0 FX\R Q HV ORJUDU OD JHUPLQDFLyQ GH ORV HPEULRQHV obtenidos. Los tipos de auxinas ms empleados son IBA, 2,4-D, AIA, ANA y picloram, y las citocininas BA, CIN, ZEA, 2ip y TDZ. El rango de concentracin empleado vara con el regulador del crecimiento, as es que el 2,4-D, por ejemplo se utiliza en concentraciones de 4-35 M mientras que otra auxina como el IBA, tiene un rango de 0,1 a 2 M. Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicacin determinada. Las condiciones de incubacin de los cultivos in vitro dependen de las especies con que se trabaje. En el caso de las especies subtropicales, por ejemplo, los cultivos se incuban en luz a 27r2 C con 14 horas de fotoperodo e intensidad lumnica moGHUDGD PRO P-2 s-1). La presencia de compuestos fenlicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrs, tales como aquel provocado por el dao mecnico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre o durante la transformacin. Los compuestos fenlicos liberados al medio pueden inhibir el crecimiento e incluso matar
al explanto. Para minimizar el dao de estos compuestos se emplean agentes adsorbentes de fenoles en el medio de cultivo, tales como el carbn activado y la polivinilpirrolidona o anWLR[LGDQWHV FRPR HO iFLGR DVFyUELFR OD PRGLcacin del potencial redox con agentes reductores, la inactivacin de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reduccin de su activiGDG R DQLGDG SRU HO VXVWUDWR XWLOL]DQGR XQ EDMR pH, bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad. Es recomendable adems lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea ptima, evitndose la acumulacin de CO2 y de etileno. En este sentido el sellado del recipiente es importante, el intercambio gaseoso es ms limitado con el HPSOHR GH XQD WDSD GH SOiVWLFR TXH FRQ XQ OP de polietileno extensible. La utilizacin de una tapa perforada con tapn de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. 2). El principal problema que puede presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro es la YLWULFDFLyQ /D FXDO FRQVLVWH HQ XQ SURFHVR GH morfognesis anormal con cambios anatmiFRV PRUIROyJLFRV \ VLROyJLFRV TXH SURGXFHQ
Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un recipiente de vidrio con tapa metlica perforada y tapn de gomaespuma, que evita la acumulacin de CO2, etileno y excesiva humedad en el ambiente de cultivo.
hojas de una apariencia vidriosa. Este fenmeno est regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y DIHFWD D GRV SURFHVRV VLROyJLFRV IXQGDPHQtales, la fotosntesis y la transpiracin. Debido a la disfuncin metablica asociada, las plantas se vuelven completamente hetertrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomtico y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal FRQVHFXHQFLD GH OD YLWULFDFLyQ HV OD EDMD VXpervivencia de las plntulas obtenida durante la aclimatizacin ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfognico normal (parcialmente auttrofo) in vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgnicos e inorgnicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja humedad relativa, elevada irradiacin, la remocin de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliacin de las plantas para estimular la formacin de hojas nuevas estimulan la fotosntesis y otras actividades metablicas de las hojas en forma normal. Otras estrategias para lograr un ptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formacin de hojas nuevas despus del transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la YtD GH OLJQLFDFLyQ \ SUHYHQLU OD YLWULFDFLyQ D travs de la inhibicin de la hiperhidratacin, la KLSROLJQLFDFLyQ \ OD IRUPDFLyQ GH DHUpQTXLPD Etapa 3: Enraizamiento y aclimatizacin En esta etapa se produce la formacin de races adventicias. En las especies herbceas es relativamente fcil mientras que en muchas especies leosas resulta ms complicada por su limitada capacidad rizognica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de substratos y reguladores de crecimiento (principalmente auxinas) para promover la rizognesis. /RV VXEVWUDWRV LQFOX\HQ PHGLR VROLGLFDGR FRQ agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con PHGLR QXWULWLYR R DJXD (Q XQ PHGLR VROLGLFDdo con agar, los nutrientes se reducen de
a de la composicin original, y la sacarosa VH UHGXFH D XQD FRQFHQWUDFLyQ QDO GH Medios con baja concentracin salina, como el WPM (Lloyd & McCown, 1981) y GD (Gresshoff & Doy, 1972) incrementan el porcentaje de enraizamiento de vstagos axilares en plantas latifoliadas. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizognesis. Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecera al producirse una rizognesis ms sincrnica como resultado del contacto ntimo de las estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las races producidas por este mtodo son usualmente engrosadas y no poseen pelos radiculares. Adicionalmente, el empleo de agar est asociado con la formacin de callo en la base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre races y vstagos. &RP~QPHQWH D Q GH SURFHGHU D VX HQUDLzamiento, los vstagos de buen tamao provenientes de la etapa de multiplicacin y provistos de al menos 4-5 yemas, se colocan durante periodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas. La auxina ms utilizada es el IBA, que puede utilizarse a conFHQWUDFLRQHV GH 0 GXUDQWH SRFDV KRUDV Alternativamente se pueden emplear niveles PiV EDMRV GH DX[LQDV D 0 SHUR PDQWHniendo la induccin por un periodo ms prolongado (3 a 7 das). Luego los vstagos se transHUHQ D XQ PHGLR GH FXOWLYR EDVDO GHVSURYLVWR de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las races. Aproximadamente 20 das despus del tratamiento de induccin, es posible la obtencin de una adecuada cantidad de races funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatizacin. Es importante acentuar que el uso de auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formacin de callo en la base de las estacas. Por ello para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizognesis que minimice la formacin de callo y maximice la tasa de rizognesis y supervivencia de las plantas. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatizacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando as una
conexin vascular continua entre el vstago y la raz. Sin embargo, el estrs asociado a la transpiracin acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cmaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas que permitan lograr la rusticacin de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes substratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales convienen que estn debidamente desinfectados. 3 Propagacin de especies leosas El empleo de clones en programas de reforestacin de muchas especies genera al menos un 10 % de incremento en ganancia gentica en relacin al empleo de plantas regeneradas por semillas de rboles selectos. Sin embargo, la mxima ganancia gentica puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagacin sexual y agmica. La reproduccin sexual es importante para la introduccin de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de genes. La reproduccin asexual por otro lado permite la multiplicacin de individuos o grupos de individuos seleccionados de una poblacin elite, que exhiben una VLJQLFDWLYD JDQDQFLD JHQpWLFD GHELGD D HIHFtos no aditivos de genes. Tradicionalmente, las especies forestales fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en conferas, as como por injertos. La propagacin por estacas de Cryptomeria japonica (cedro japons), Populus spp. (lamos) y Salix spp. (sauces) ha sido llevada a cabo durante siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la mayora de los rboles propagados por estacas se observa una rpida prdida de capacidad de rizognesis al aumentar la edad de la planta donante de las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de la micropropagacin es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicacin optimizados para multiplicar rboles adultos que han demostrado ser fenotpicamente superiores.
Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron, en el ao 1940, a la formacin de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la dcada del 40 se publicaron logros adicionales en al produccin separada de vstagos y races en especies latifoliadas. En 1950 se public por primera vez la obtencin de organognesis en conferas, con la formacin de vstagos a partir de callos de Sequoia sempervirens. En la dcada 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de lamo (Populus tremuloides) y Pinus palustris. En ambos casos la formacin de plntulas se logr va organognesis. Luego del ao 1975 la micropropagacin de especies latifoliadas se realiz a travs de la regeneracin indirecta, pasando por una etapa de callo. El principal mtodo utilizado para especies latifoliadas es la brotacin de yemas adventicias, empleando pices de vstagos, yemas laterales y microestacas. En las conferas, la elongacin de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen las yemas y vstagos en activo crecimiento ms que las yemas en estado de dormicin. Los vstagos se colectan en primavera y a principios del verano D Q GH REWHQHU PDWHULDO FRQ UHGXFLGR QLYHO GH contaminacin. Alternativamente las yemas en dormicin pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas. Para la induccin de vstagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas. La ms usada es la N6-benciladenina (BA) o tambin llamada 6-bencil amino-purina (BAP) y el tidiazurn (TDZ). Los medios basales ms usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog, 1962) o el WPM (Lloyd & McCown, 1981). Para el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrgeno resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. La induccin de yemas adventicias es el mtodo ms empleado para gimnospermas y angiospermas. En este caso, las yemas se inducen directamente sobre el explanto en ge-
neral sin previo pasaje por una etapa de callo. En general, cuanto ms joven es el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organognesis de novo. Los explantos ms frecuentes son embriones cigticos maduros, seguido de cotiledones y epictilos de plntulas. Generalmente se utiliza BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como nica fuente de induccin o en combinacin con otras citocininas. La adicin GH DX[LQDV SXHGH VHU EHQHFLRVD DXQTXH HQ conferas se ha encontrado que promueve la formacin de callo y reduce el proceso de organognesis. En algunos casos, como en Populus spp., la formacin de yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El mtodo llamado multiplicacin mediante ndulos meristemticos es un mtodo tambin utilizado para Pinus radiata y lamo. En este caso se obtiene bsicamente un tejido meristemtico (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego inducir la produccin de vstagos. La disponibilidad de protocolos va embriognesis somtica para especies forestales es an limitada. En la angiospermas los primeros embriones somticos se obtuvieron de Santalum album, donde sin embargo no fue posible la obtencin de plantas completas. Recin 20 aos despus pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies), una gimnosperma. En las gimnospermas los mayores xitos se lograron empleando como explantos embriones cigticos maduros e inmaduros. En la mayora de los casos los embriones se originan en forma indirecta a partir de callos embriognicos o bien, directamente desde el explanto. En las conferas puede ocurrir un proceso de poliembriona previa formacin de callo que conduce a una alta tasa de multiplicacin inicial. En general, los medios de cultivo ms efectivos SDUD HVWRV QHV FRQWLHQHQ HOHYDGRV QLYHOHV GH sales y suministran nitrgeno tanto como NH4+ y NO3-. Las auxinas ms comnmente empleadas en el medio de induccin son el 2,4-D y el $1$ HQ FRQFHQWUDFLRQHV PD\RUHV GH 0 (Q algunos casos es necesario adems el empleo de alguna citocinina, generalmente en concen-
WUDFLRQHV PD\RUHV D 0 VL VH WUDWD GH %$ \ HQWUH 0 HQ HO FDVR GHO 7'= Los explantos jvenes de especies leosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o negros. Se observa tambin, que en los explantos de rboles adultos el problema se acenta. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. Los tipos de explantos ms utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones cigticos y plntulas obtenidas de semillas de origen sexual. La desinfeccin de los mismos se logra mediante inmersin en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido de una solucin de lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de cloro activo durante 5-30 minutos. En la mayora de los casos se emplean agentes tensoactivos, tales como Triton Tween 20, adicionados en la solucin de lavandina. En todos los casos ORV H[SODQWRV VRQ ODYDGRV QDOPHQWH YDULDV YHces con agua destilada estril. Los medios basales ms empleados son el MS, formulado por Murashige & Skoog (1962), diluido a la mitad o a un cuarto de su formulacin original o el WPM, formulado por Lloyd & McCown (1981). Como medios de multiplicacin se emplean adems el BTM (broadleaved tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Prinet y Lalonde (1983). Los reguladores de crecimiento ms utilizados son ANA y BA. Tambin han sido efectivas auxinas como IBA y 2,4-D, y citocininas como 2iP, CIN, ZEA y TDZ. En la Fig. 3 se muestran las etapas de la micropropagacin de plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002). 3.1 Problemas asociados a la micropropagacin de especies leosas Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es posible extraer explantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los te-
Figura 3: Etapas de la micropropagacin en plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002): A) Huerto semillero de paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad, provincia de Misiones, Danzer Forestacin S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblacin de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparacin del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vstagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 das sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962 06 VXSOHPHQWDGR FRQ 0 EHQFLO DPLQRSXULQD %$3 0 iFLGR JLEHUpOLFR *$3 0 cido 3-indolbutrico (IBA). D) Etapa de Multiplicacin: vstagos luego de 30 das sobre medio de multiSOLFDFLyQ PHGLR 06 VXSOHPHQWDGR FRQ 0 %$3 HVWRV YiVWDJRV IXHURQ HPSOHDGRV FRPR H[SODQWRV para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la HWDSD GH PXOWLSOLFDFLyQ FRQ SUREOHPDV GH YLWULFDFLyQ \ SUHVHQFLD GH FDOOR (Q HVWRV FDVRV HO PHGLR GH PXOWLSOLFDFLyQ SDUD ORV FXOWLYRV VXEVLJXLHQWHV IXH PRGLFDGR UHGXFLHQGR OD FRQFHQWUDFLyQ GH %$3 D 0 ) 9iVWDJR HQUDL]DGR HQ PHGLR GH 06 FRQ OD FRQFHQWUDFLyQ VDOLQD UHGXFLGD D OD PLWDG VXSOHPHQWDGR FRQ 0 ,%$ GXUDQWH GtDV VHJXLGR SRU HO VXEFXOWLYR HQ PHGLR EDVDO GXUDQWH GtDV KDVWD HVWDU OLVWR para pasar a la etapa de aclimatizacin.
jidos ms juveniles dentro de un rbol o, 2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol donante antes de aislar los explantos. Para seleccionar el material ms juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenmeno de WRSyVLV Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo indivi-
duo est determinado por la posicin que ocupaba en la planta adulta. Esto es ocasionado SRU HIHFWR GHO HQYHMHFLPLHQWR VLROyJLFR H LPplica que los explantos ms reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las reas basales del tronco y races. A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso de reversin temporaria de las caractersticas
adultas que permite lograr material vegetal en HVWDGR GH MXYHQLOLGDG (Q JHQHUDO D Q GH FRQWUDUUHVWDU ORV HIHFWRV GHELGRV D OD WRSyVLV VH recomienda emplear tejidos juveniles, y un tamao de explanto muy pequeo. La juvenilidad puede lograrse por dos mtodos. En primer lugar, mediante el empleo de rganos juveniles separados de plantas adultas, la utilizacin de estacas enraizadas o bien de brotes epicrmicos. En segundo lugar mediante el rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciacin de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un nuevo ciclo ontognico), del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de crecimiento (como citocininas como el BA), por la poda severa (recepado de rboles adultos) y, a travs del cultivo in vitro de meristemas. Tanto los atributos de supervivencia a campo, como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlacin directa con la calidad de los vstagos durante el cultivo in vitro. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagacin es la calidad diferencial de las races de las plantas regeneradas en relacin a aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las plantas regeneradas de Pinus elliottii suelen teQHU XQD UDt] SULQFLSDO QR UDPLFDGD \ JUXHVD (Q cambio, las plantas obtenidas a travs de semillas tienen races ms delgadas y de mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos. 4 Propagacin de especies herbceas La micropropagacin de especies herbceas est orientada a proveer material libre de patgenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conVHUYDU OD GLYHUVLGDG HVSHFtFD HQ EDQFRV GH germoplasma, obtener material para estudios VLROyJLFRV \ JHQpWLFRV \ VHQWDU ODV EDVHV SDUD la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica. Existe una gran variedad de protocolos, desarrollados en funcin de la especie y de los objetivos de la propagacin. Existen protocolos generales para monocotiledneas como en el caso ciertos cereales (trigo, maz, cebada, ave-
na, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrs, pasto llorn) y hortcolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledneas que incluyen especies hortcolas (tomate, papa, pimientos y zanahorias) y leguminosas forrajeras (alfalfa, man, trbol blanco) y protocolos para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las formas de propagacin son las mismas. Se emplean vas de regeneracin por formacin de yemas axilares, yemas adventicias y embriognesis somtica. En los dos primeros casos, el sistema de propagacin a travs de la organognesis directa asegura la estabilidad gentica de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagacin clonal a gran escala. La embriognesis u organognesis indirecta, con formacin de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento. En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las etapas de la micropropagacin incluyen tanto la multiplicacin de yemas axilares por el cultivo de meristemas, la formacin directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formacin indirecta de yemas adventicias y/o embriones somticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, brotes, placa basal races). En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y man la micropropagacin es llevada a cabo por la va de la embriognesis somtica, donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecolos) como explantos. En algunos casos como pasto llorn (Eragrostis curvula) es posible la regeneracin de plantas mediante embriognesis, organognesis y regeneracin directa a partir de los explantos. 5 Lecturas Recomendadas
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IV. CAPTULO 2 Semilla Sinttica

Hebe Y. Rey y Luis A. Mroginski Concepto: Resulta difcil tratar de determinar el origen de la idea de la produccin de semillas sinttiFDV R DUWLFLDOHV (V XQR GH ORV UHVXOWDGRV GH la aplicacin en la Agricultura de los embriones somticos descriptos por primera vez en 1958, por Jakob Reinert y por F.C. Steward y colaboradores. Sin embargo, un gran propulsor de su utilizacin para la propagacin en gran escala de plantas fue Toshio Murashige quien en un Simposio realizado en 1977 en Ghent (Blgica) present formalmente la idea de la produccin de las semillas sintticas, entendiendo como tal a un simple embrin somtico encapsulado. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrin es somtico (producido por el fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no cigtico y que si WLHQH HQGRVSHUPD \ FXELHUWD pVWRV VRQ DUWLciales (Fig.1a y b). Esta semilla, puesta en condiciones adecuadas, germina (Fig.1c) y se convierte en una planta (Fig.1d). Muchos grupos de investigacin han contribuido al desarrollo de las semillas sintticas. Entre ellos se deben destacar el grupo liderado por Keith Walker de la Compaa Monsanto que a partir de mediados de la dcada del 70 trabajaron especialmente con alfalfa. Tambin hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Carbide quienes comenzaron los trabajos con especies forestales, lechuga y apio. Otros investigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muy importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de sodio podan ser utilizados para SURGXFLU VHPLOODV DUWLFLDOHV TXH SRGtDQ JHUPLnar en condiciones de invernadero. Hay que aclarar que adems del concepto GH VHPLOOD VLQWpWLFD GHQLGR PiV DUULED WDPbin es factible que en lugar de encapsular embriones somticos, se encapsulen yemas. Este
Fig. 1.- a) Partes de una semilla sinttica .b,c y d) Obtencin de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintticas (las barras verticales indican 3 mm)
tipo de semillas sintticas - de una utilizacin muy restringida- no ser tratado en este captulo. Tipos de semillas sintticas Las semillas sintticas pueden fabricarse de diferentes maneras (Fig.2). Bsicamente se pueden usar embriones hidratados (tal como resultan de la embriognesis somtica) o bien pueden ser desecados. En algunos casos estos embriones estn protegidos por cubiertas protectoras. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos bsicos de semillas sintticas. 1) Semillas sintticas con embriones desecados (Tipo 1 de la Fig. 2) sin cubierta: Es un sistema muy simple, los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de humedad de 8- 20%. En este caso los embriones no estn provistos de ningn tipo de cubierta protectora. Embriones de alfalfa sometidos al desecamiento mostraron porcentajes de con-
5) Semillas sintticas con embriones somticos hidratados y provistos de una cubierta protectora (Tipo 5 de la Fig. 2). Es el sistema ms usado. Cuadro 1: Semillas sintticas de algunas especies basadas en la desecacin Por esta razn, de de embriones sin cubierta protectora aqu en adelante cuando se mencione semilla sinttica se referir a este tipo. Tiene la ventaja de que los embriones no estn sujetos a la desecacin que constituye la princi2) Semillas sintticas con embriones so- pal causa de los bajos valores de conversin mticos desecados y provistos de cubierta en plantas. Si bien se han ensayado numeroprotectora (Tipo 2 de la Fig. 2). Los embrio- sas sustancias para encapsular a los embriones de zanahoria y apio fueron recubiertos con nes somticos (agar, gelrite, gomas), una de polyoxietileno y luego desecados. Los resulta- la tcnicas ms usadas consiste en lograr la dos han mostrado que si bien es factible lograr formacin de una cubierta protectora de algique los mismos sobrevivan, la conversin en nato de calcio que es un compuesto que adeplantas es realmente baja. ms de no ser txico para el embrin permite 3) Semillas sintticas con embriones hi- una rpida formacin de la cubierta. El procedratados sin cubierta (Tipo 3 de la Fig. 2). so es muy simple (Fig. 3) y consiste bsicaEs el sistema ms simple, consiste en utilizar mente en sumergir los embriones somticos los embriones somticos tal como resultan del en una solucin de alginato de sodio (2%) y proceso de la embriognesis somtica sin nin- luego sumergirlo en un agente acomplejante gn tipo de cubierta protectora. Este sistema [por ejemplo 100 mM de Ca (NO ) ]. Con esta 3 2 ha sido desechado en la prctica por la escasa tcnica se genera una semilla sinttica consisconversin de embriones en plantas. tente de un embrin somtico con una cubierta 4) Semillas sintticas con embriones soVHPLQDO \ XQ HQGRVSHUPD DUWLFLDO )LJD \ mticos hidratados suspendidos en un gel b). Eventualmente estas cpsulas pueden ser YLVFRVR XLG GULOOLQJ 7LSR GH OD )LJ recubiertas por sustancias tales como el poInicialmente fue desarrollado en zanahoria y lioxietilenglicol que sirven para mantener una ms recientemente con batata. adecuada hidratacin de las cpsulas y embriones. Este procedimiento ha posibilitado la obtencin de semillas sintticas de numerosas especies de inters econmico entre los que se pueden mencionar la alfalfa, la zanahoria, el apio y especies forestales como Picea abies, Pinus radiata, Santalum album y Pseudotsuga menziesii. versin en plantas de hasta el 95% (Cuadro 1), adems es posible mantenerlos viables por cerca de un ao en condiciones de laboratorio. Produccin de semillas sintticas En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que se deben tener en cuenta para la produccin y manipulacin de las semillas sintticas. En primera instancia es necesario contar con XQ HFLHQWH VLVWHPD TXH DVHJXUH OD LQGXFFLyQ in vitro de la embriognesis somtica que brin-
Fig.2.- Tipos de semillas sintticas
Fig.3.- Induccin de la embriognesis somtica (a-d); seleccin de embriones somticos (e); inmersin de los embriones en alginato de sodio (f); acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semilla sinttica (i)
de la produccin de embriones sin la necesidad de la fusin de gametas. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con un polo que genere el vstago y el otro la raz) capaces de convertirse (germinar) en plantas enteras. Si bien la existencia de embriognesis somtica ha sido informada en centenares de especies de Angiospermas y Gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad para iniciar la produccin de semillas sintticas debido a la baja tasa de produccin deembriones aptos para la encapsulacin. En los ltimos aos se han hecho notables avances en el conocimiento de los factores que regulan la embriognesis somtica. Sin embargo an se dista mucho de conocer las bases genticas de este fenmeno cuya ocurrencia, in vitro, si bien ha sido descripta en centenares de especies de Angiospermas y casi otro tanto de Gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad para iniciar la produccin de las semi-
Fig. 4. Etapas en la produccin de las semillas sintticas
llas sintticas, por su baja tasa de produccin de embriones aptos para ser encapsulados. El segundo paso consiste en lograr una produccin sincronizada y en gran escala de los embriones. Es fundamental contar con embriones simples que no se fusionen entre s y que en un momento determinado se encuentren en estado cotiledonar y que no generen embriones secundarios. Diferentes procedimientos EDVDGRV HQ OWURV \ HTXLSRV FODVLFDGRUHV DXtomticos) han sido desarrollados para seleccionar estos embriones. Para la produccin en gran escala se han desarrollado varios diseos de bioreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las particularidades de cada especie. Se trabaja mucho para lograr una adecuada maduracin de los embriones que es un proceso esencial para la obtencin de altos valores de conversin en el suelo. Investigaciones hechas con alfalfa han mostrado la utilidad del empleo de tratamientos con cido abscsico, maltosa y del pretratamiento con temperaturas bajas (4C). El almacenamiento de las semillas sintticas es otro aspecto importante a tener en cuenta. Lo ideal sera que las semillas sintticas tuvieran un comportamiento similar al de la mayora de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. Los resultados obtenidos con semillas sintticas de muchas especies muestran que an hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. Las tcnicas de la cryopreservacin con nitrgeno lquido podran resolver este punto. Por ltimo lo ideal es que la semilla sinttica sea sembrada directamente al suelo con un alto porcentaje de conversin en plantas. Muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra. Por ahora en la mayora de los casos, las semillas sintticas son sembradas primeramente en cmaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo. Calidad de la semilla sinttica Un aspecto de gran importancia tecnolgica es el contar con semillas sintticas que, adems de no generar variantes somaclonales, tengan un alto porcentaje de conversin en plantas cuando las mismas son sembradas en
el suelo. Este aspecto est afectado por vaULRV IDFWRUHV HQWUH ORV TXH JXUDQ HO WLSR GH embrin, la calidad del endosperma sinttico, la dureza de la cpsula y la proteccin contra agentes patgenos. El tipo de embrin es quizs el factor ms imSRUWDQWH TXH LQX\H HQ OD FDOLGDG GH OD VHPLOOD sinttica. Deben poder generarse rpidamente, en grandes cantidades, no fusionarse entre s, ni formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rpidamente en plantas. Es altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o mantenidos en refrigeradores comerciales. Generalmente la falta de embriones de calidad es el factor limitante de la produccin de semillas sintticas. El endosperma sinttico tiene que proteger y nutrir al embrin hasta que germine y pueGD FUHFHU DXWRWUyFDPHQWH (Q HVWH SXQWR HV preciso recordar que si bien los embriones somticos son muy similares a los embriones cigticos, carecen de las sustancias de reserva necesarias para su conversin en plntulas. El endosperma sinttico generalmente est compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la germinacin in vitro de los embriones. Estos medios contienen macro y micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sustancias reguladoras de crecimiento. La composicin de este endosperma lo hace susceptible al ataque de patgenos, por lo que tambin se incorporan compuestos de accin fungicida y bactericida. Es comn el agregado de 1-5 mg/L de benomyl y de algunos antibiticos como cefatoxina o ampicilina. La dureza de la cpsula puede afectar, por DFFLyQ PHFiQLFD R SRU GLFXOWDU OD UHVSLUDFLyQ la conversin de los embriones en plantas. Es reconocido que la dureza debe ser del orden de 0,2 y 2 Kg/cm2 de presin, la que puede obtener mediante una adecuada manipulacin de la concentracin del alginato y de los tiempos de la reaccin del acomplejamiento. Ventajas del empleo de semillas sintticas La mayora de las plantas de inters econmico son propagadas mediante semillas verdaderas. stas constituyen excelentes propgu-
los que pueden ser producidos a bajo costo, en forma rpida, y pueden ser sembrados mecnicamente. Adems la mayora de ellas pueden ser conservadas fcilmente por mucho tiempo. Sin embargo hay muchas plantas que no se propagan mediante las semillas verdaderas y lo hacen a travs de partes vegetativas (Es el caso entre otras de la caa de azcar, mandioca, ajo, frutilla, papa, batata, varios rboles y plantas ornamentales). Otras especies tienen semillas de poca calidad (Muchas conferas). En algunos casos si bien las plantas pueden SURSDJDUVH SRU VHPLOODV SUHVHQWDQ GLFXOWDdes para su germinacin (por ej. yerba mate) o bien debido al alto grado de heterocigosis las poblaciones derivadas de semillas son muy
heterogneas (t, yerba mate, paraso) y es recomendable su propagacin asexual. Tambin es el caso de muchos hbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgnicas. En todas estas situaciones el uso de semillas sintticas es ventajosa. Las plantas sern clonadas, es decir cada planta derivada de una semilla sinWpWLFD VHUi XQD FRSLD HO GH OD SODQWD PDGUH utilizando sembradoras similares a las que hoy se emplean con las semillas verdaderas. Adicionalmente las semillas sintticas podrn actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento, microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar durante la siembra, los costos de los transplantes se vern redu-
Cuadro 2. Necesidad de contar con semillas sintticas en algunas plantas leosas subtropicales de inters para Argentina y Estado actual de su desarrollo.v
cidos, las poblaciones sern genticamente uniformes y podrn ser comercializadas ciertos hbridos de plantas resultantes de costosas manipulaciones manuales. En el Cuadro 2 se sealan algunas especies para las cuales sera necesario contar con unsistema de semilla sinttica. La falta de una difusin ms masiva de esta tecnologa en la actualidad obedece por un lado a razones tcnicas (En muchas especies D~Q QR VH KD ORJUDGR LQGXFLU HFLHQWHV VLVWHmas que permitan la generacin de grandes cantidades de embriones somticos de calidad) y econmicos (Clculos hechos en alfalfa indican que su costo de produccin supera en casi cien veces el costo de produccin de la semilla verdadera. Sin embargo, este costo es casi similar o incluso inferior al de la produccin de semillas verdaderas de algunos hbridos de alcaucil, geranio y gerbera. CONCLUSIONES Si bien an el uso de la semilla sinttica en la $JULFXOWXUD HV LQVLJQLFDQWH \ VyOR HV XWLOL]DGD en cierto grupos de rboles forestales, hay coincidencia en el mundo en que esta tecnologa se va a convertir en un futuro cercano en el principal mtodo de propagacin de las plantas. Los progresos logrados en los ltimos 20 aos han sido notables. Sin embargo hay que incrementar las investigaciones bsicas sobre embriognesis somtica para luego abordar los aspectos industriales de la produccin en gran escala de las semillas sintticas. En la Argentina, si bien esta tecnologa podra ser usada tericamente en todas las Angiospermas y Gimnospermas, en la actualidad la mayor demanda de su utilizacin proviene de productores de plantas leosas, con los cuales un rpido diagnstico de lo que sucede en el rea subtropical (Cuadro 2) nos ubica a Argentina en un estado de desarrollo inicial, con capacidad tcnica y humana para encarar la produccin de las semillas sintticas.
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IV. CAPTULO 3 Conservacin de Germoplasma in vitro.

Adriana Scocchi y Hebe Rey Abreviaturas usadas en este captulo: '062 'LPHWLOVXOIy[LGR 393 3ROLYLQLOSLUUROLGRQD 396 JOLFHURO HWLOHQJOLFRO 15% DMSO, 0.04M sacarosa), TTC (Cloruro 2,3,5Trifenil-Tetrazolio), PEG (Polietilenglicol). Introduccin Desde sus inicios, el hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa. Al aumentar rpidamente la poblacin, se ha hecho necesario implantar tcnicas de explotacin, en particular agropecuarias, que han contribuido a la destruccin de las poblaciones pioneras vegetales que fueron producto de siglos de evolucin. Por otro lado, las tcnicas modernas de produccin de variedades mejoradas altamente homogneas han provocado la reduccin de la variabilidad gentica de las especies cultivadas, ocasionando una erosin gentica. En este contexto es cuando se recurre a las fuentes genticas originales de la variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente. Cuando se habla de preservacin de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas. Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma: La estrategia a seguir para la conservacin de germoplasma, depende de la naturaleza del PDWHULDO YHJHWDO \ HVWi GHQLGD SRU OD GXUDFLyQ de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. De acuerdo con estas caractersticas se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de reas de reservas. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible
y en otros casos resulta sumamente costoso y los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales son muy altos. Por lo tanto, se busc implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genticos en forma ms HFLHQWH Los mtodos de conservacin de germoplasma se pueden dividir en: Mtodos de Conservacin in situ; Mtodos de Conservacin ex situ. Los primeros se basan en la conservacin de las plantas en sus habitats naturales e incluyen la conservacin en Parques Nacionales y en Reservas Ecolgicas, los cuales requieren un considerable espacio fsico, altos costos asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas estn expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra parte, los mtodos de conservacin ex situ se basan en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros, jardines botnicos). En general, los bancos de semillas constituyen uno de los mtodos ms convenientes para la conservacin de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad gentica en forma econmica y prctica. Para la conservacin de semillas la International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Este protocolo de conservacin es en general el ms recomendado para la mayora de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecacin sin que ello implique prdida de viabilidad. A las semillas que presentan estas caractersticas se las denominan semillas ortodoxas como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este mtodo de conservacin no es aplicado, porque la especie se propaga, en la prctica, vegetativamente (como la mandioca, papa, caa de azcar, pltanos y bananos) o bien porque sus semillas pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin. A estas semillas se
las denominan semillas recalcitrantes. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categora, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras. Otro mtodo de conservacin de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la totipotencialidad de las clulas vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes, ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). Recin en 1980 se reconoci el potencial de los mtodos del cultivo in vitro para la conservacin de especies de plantas "difciles". Este trmino se UHHUH D ODV HVSHFLHV SURSDJDGDV YHJHWDWLYDmente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes. En estos casos, la conservacin de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de pices caulinares o de nudos. (O PDQWHQLPLHQWR GH ORV UHFXUVRV WRJHQpWLcos mediante los mtodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar el crecimiento de las clulas y de los tejidos. El objetivo es aumentar al mximo el perodo de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que estimul algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este mtodo cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos (meristemas, semillas, embriones somticos, embriones cigticos, hojas, tallos, races, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en XQ PHGLR GH FXOWLYR DUWLFLDO GHQLGR EDMR FRQdiciones ambientales controladas. Esta tcnica ha sido usada para mantener colecciones en crecimiento mnimo, para lo cual se requiere: reducir la temperatura, reducir las condiciones GH OXPLQRVLGDG PRGLFDU HO PHGLR GH FXOWLYR adicionar al mismo inhibidores osmticos o re-
tardantes del crecimiento, deshidratadores de WHMLGR R PRGLFDU OD IDVH JDVHRVD GHO UHFLSLHQWH GH FXOWLYR /D PRGLFDFLyQ GH XQR R PiV GH HVtos factores es usada para la conservacin de numerosas especies, como por ejemplo para la conservacin de microestacas de Manihot esculenta; de vstagos de especies de Fragaria, Ipomoea, Rubus, Musa, Saccharum, Zingiber, Ananas, Coffea, Dioscorea y de microtubrculos de Solanum. Estas tcnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. En el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botnica del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, desde hace varios aos se llevan a cabo experimentos referidos a la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach). Utilizando como explantes meristemas de clones selectos de paraso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad se logr mantener con xito y regenerar plantas de paraso que actualmente se encuentran en evaluacin a campo (Fig. 1). Asimismo en el IBONE, se realizan experimentos tendientes a optimizar las tcnicas de conservacin in vitro a largo plazo que consisten en el almacenamiento a temperatura del nitrgeno lquido (-196C) crioconservacin- con lo cual se consigue la supresin del crecimiento hasta llegar a un estado de "suspensin animada". En el Laboratorio del IBONE se ha logrado con xito la crioconservacin de meristemas de paraso aplicando la tcnica de encapsulacindesidratacin (Fig. 1). Las tcnicas de conservacin de germoplasma mediante el uso de la crioconservacin ofrecen varias ventajas en relacin con las tcnicas tradicionales de conservacin, pues permiten la conservacin a largo plazo (aos), presenta bajos costos de mantenimiento, una fcil manipulacin de las muestras y no dependen del suministro elctrico. Desde que en 1968 se informara acerca de la crioconservacin de clulas de lino y luego de los resultados satisfactorios que se obtuvie-
Figura 1: Estrategias para la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach L.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro GH 7HMLGRV 9HJHWDOHV ,%21( )DFXOWDG GH &LHQFLDV $JUDULDV 811(
ron con la crioconservacin de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnologa de Plantas en Sakatoon - Canad, se iniciaron en 1985 algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta tcnica con el cultivo de meristemas de mandioca. A partir de estos estudios, numerosos trabajos dan muestra de la importancia de esta tcnica, de sus usos y aplicaciones.
La crioconservacin consta de siete pasos: 1.- Seleccin del material a crioconservar: Cuando se realiza la seleccin del material a crioconservar, se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtienen plantas completas. El explante seleccionado depende del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado con el tipo de pro-
pagacin de la especie. Por ejemplo en el caso de la mandioca, la cual se propaga principalmente por va asexual (mediante estacas), se conserva su germoplasma in vitro en el CIAT mediante el cultivo de microestacas y tambin de meristemas con lo cual paralelamente a la conservacin se consigue el saneamiento de los cultivares. Adems, se estn realizando estudios para la crioconservacin de meristemas. 2.- Deshidratacin: La deshidratacin del explante es un paso crucial para el xito de la crioconservacin, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando as las posibles prdidas por congelacin. La deshidratacin del tejido puede realizarse en una cmara a 0C o en cmaras hermticamente cerradas utilizando sustancias higroscpicas como por ejemplo: silica gel, glicerol (5 - 20%), o sometiendo al explante a una corriente de DLUH HQ XQ XMR ODPLQDU GH DLUH HVWpULO 3.- Aclimatacin: La aclimatacin se puede realizar en forma rpida o lenta. La aclimatacin rpida consiste en colocar el explante directamente en el nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de crioprotectores; mientras que la aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente pues una deshidratacin excesiva de las clulas puede exponerlas a una alta concentracin interna de los solutos. Por esta razn generalmente el material se congela lentamente, a una velocidad adecuada hasta alcanzar una temperatura prxima a los -40C y luego se lleva a nitrgeno lquido (-196C). Para preparar (aclimatar) al explante a las bajas temperaturas se utilizan sustancias crioprotectoras como azcares (sacarosa, glucosa); alcoholes (glicerol, etilenglicol, manitol y VRUELWRO '062 393 R WDPELpQ SXHGHQ XWLOL]DUVH VROXFLRQHV GH YLWULFDFLyQ TXH VRQ XQD combinacin de crioprotectores tal como el 396 7DQWR ORV FULRSURWHFWRUHV FRPR ODV VROXFLRQHV GH YLWULFDFLyQ DFW~DQ IXQGDPHQWDOPHQte como agentes anti-congelantes, aumentan-
do la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las clulas. 4.- Almacenamiento: De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas: -Sistemas Secos: comprende todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin. -Sistemas Hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin por lo que se requiere una proteccin exgena. Esta proteccin puede estar dada por el uso de crioprotectores R ELHQ SRU OD XWLOL]DFLyQ GH VROXFLRQHV GH YLWULcacin. Los sistemas secos, por ser ms resistentes necesitan menor preparacin para su almacenamiento y comprende aquellas especies que habitan zonas fras y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son ms susceptibles al fro y estn representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no estn adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0C, por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exgenamente mediante el uso de crioprotectores. 5.- Descongelamiento y Rehidratacin: Cuando se desea recuperar al explante del nitrgeno lquido, se puede realizar un descongelamiento rpido a Bao Mara (generalmente 1-2 min. a 30 40C) o en forma lenta sometiendo al explante a temperatura de laboratorio R D XQD FRUULHQWH GH DLUH HQ HO XMR ODPLQDU GH aire estril. 6.- Test de Viabilidad: Los tests de viabilidad nos permiten comprobar las zona/s del tejido que ha/n muerto y cual/es ha/n sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el recultivo y determinando la capacidad de regeneracin, utilizando TTC que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin; o midiendo la conductividad
elctrica, que permite estimar el dao producido en las membranas celulares. En la ltima dcada, han surgido numerosas tcnicas que combinan el uso de crioprotectoUHV \ GH VROXFLRQHV GH YLWULFDFLyQ FRQ WpFQLFDV de deshidratacin y encapsulacin, las cuales
bsicamente pueden resumirse en tcnicas de: - Encapsulacin-Deshidratacin 9LWULFDFLyQ (QFDSVXODFLyQ9LWULFDFLyQ - Desecacin - Precultivo
Cuadro N 1: Utilizacin de tcnicas de crioconservacin en diferentes explantes de algunas especies de inters agronmico.
- Precultivo-Desecacin - Gotita Congelada. En el Cuadro N 1 se detallan las especies y explantes en los cuales cada una de estas tcnicas ha sido empleada con resultados satisfactorios. Encapsulacin-Deshidratacin: La tcnica de encapsulacin-deshidratacin esta basada en el desarrollo de la metodologa aplicada a las semillas sintticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solucin de cloruro de calcio formando un gel alrededor del explante de alginato de calcio. Una vez llevada a cabo la encapsulacin, se realizan pre-tratamientos generalmente con sacarosa (desde 0.3 hasta 1.5M), que acta como crioprotector del explante. En especies tolerantes al fro, la exposicin de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas previas a la criopreservacin, incrementa la supervivencia. La deshidratacin puede llevarse a cabo sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el XMR ODPLQDU R H[SRQLpQGRODV HQ FiPDUDV KHUmticamente cerradas con silica gel. Las cpsulas as deshidratadas pueden ser llevadas directamente a inmersin en nitrgeno lquido o bien a un descenso lento de temperatura. 9LWULFDFLyQ: Esta tcnica, involucra el pre-tratamiento de ODV PXHVWUDV FRQ VROXFLRQHV GH YLWULFDFLyQ Ejemplos de estas soluciones muy utilizadas HQ HO PXQGR VRQ HO 396 R ELHQ RWUD FRPSXHVta por 40% etilenglicol, 15% sorbitol y 6% albmina srica bovina. Luego de la exposicin a las soluciones de YLWULFDFLyQ JHQHUDOPHQWH D XQD WHPSHUDWXUD GH & SDUD GLVPLQXLU ORV ULHVJRV GH WRWR[LFLdad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o llevadas a un descenso lento de temperatura. Las soluciones crioprotectoras usadas en los protocolos de viWULFDFLyQ VRQ JHQHUDOPHQWH Wy[LFDV SDUD ODV clulas y el tiempo de exposicin a la solucin
debe estar relacionado con el tamao del explante y la misma debe ser removida rpidamente luego del descongelado. Encapsulacin-9LWULFDFLyQ: /D WpFQLFD GH HQFDSVXODFLyQYLWULFDFLyQ HV una combinacin de las tcnicas de encapsuODFLyQGHVKLGUDWDFLyQ \ YLWULFDFLyQ /DV PXHVtras son encapsuladas en alginato de calcio \ VRPHWLGDV D YLWULFDFLyQ GXUDQWH HO HQIULDmiento. Comparada con la tcnica de encapsulacin-deshidratacin tiene un 30% ms de supervivencia. Esto puede explicarse debido a que las cpsulas de alginato de calcio reducen OD WR[LFLGDG GH ODV VROXFLRQHV GH YLWULFDFLyQ Desecacin: La tcnica de desecacin es un proceso muy simple que slo requiere la deshidratacin del material vegetal, la cual es crucial para el xito de la crioconservacin. Esta tcnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en XQ XMR ODPLQDU R HQ FiPDUDV KHUPpWLFDPHQWH cerradas conteniendo silica gel; luego de lo cual se realiza un enfriado rpido, sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido. Precultivo: La tcnica del pre-cultivo, involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del enfriamiento; como por ejemplo la adicin de altas dosis de sacarosa para la crioconservacin de meristemas de Musa spp.; la utilizacin de PEG y DMSO en embriones cigticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilizacin de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigticos, polen y anteras de Oryza spp. y la utilizacin de cido abscsico para la conservacin de lneas celulares y de callos de Oryza sativa. Precultivo-Desecacin: Esta tcnica es una combinacin de dos tcnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rpido o lento. Generalmente en el precultivo se
emplean azcares (sacarosa, glucosa) y con un tiempo de duracin variable desde horas como en el caso de la conservacin de embriones maduros de Cocos nucifera, en el cual el precultivo tuvo una duracin de 11-20 hs., hasta 7 das como fue aplicado con xito en embriones somticos de Elaeis guineensis. Gotita Congelada: La tcnica de la microgota congelada ha sido aplicada con xito en pices de Solanum tuberosum, la misma consiste en pretratar (2-3 hs) con DMSO en medio lquido y formar una microgota (2.5 Pl) la cual se suspende sobre papel de aluminio y se la lleva a inmersin directa en nitrgeno lquido. Este procedimiento es una adaptacin de la tcnica clsica desarrollada para meristemas de mandioca. Esta tcnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum con un porcentaje de supervivencia del 40%. Conclusiones: /RV UHFXUVRV WRJHQpWLFRV FRQVWLWX\HQ XQ reservorio de informacin gentica imprescindible para la solucin de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura. Los mtodos para asegurar su conservacin son diversos y cada uno de ellos posee sus ventajas e inconvenientes. Por ello, se considera que el conjunto de tcnicas de conservacin in situ y ex situ, son mtodos complementarios, no excluyentes, para lograr el objetivo comn GH SUHVHUYDU ORV UHFXUVRV WRJHQpWLFRV FRPR parte esencial de una estrategia global para la conservacin de la biodiversidad. En la ltima dcada se han producido avanFHV VLJQLFDWLYRV HQ HO GHVDUUROOR GH WpFQLFDV in vitro de conservacin. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro, tanto en condiciones de crecimiento lento como la conservacin a temperaturas ultrabajas (crioconservacin), han contribuido a dicho avance. Algunos ejemplos de conservacin de germoplasma en crecimiento lento son usados como rutina en Centros Internacionales, como por ejemplo, para la conservacin de germoplasma de mandioca en el CIAT Cali, Colombia y para la conservacin de germoplasma de papa en el CIP (Centro Internacional de la Papa) en Per. Adems, es
importante resaltar que las tcnicas de crioconservacin ofrecen una alternativa muy valiosa FXDQGR VH SLHQVD HQ FRQVHUYDU ORV UHFXUVRV togenticos por tiempo ilimitado (aos), si bien hasta el momento solo se aplica como rutina para la conservacin de lneas celulares en laboratorios de investigacin y para la conservacin de algunos genotipos pertenecientes a los gneros Rubus spp., Pyrus spp., Solamun spp. y Elaeis guineensis. Lecturas Recomendadas:
Engelmann, F. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. Engelmann, F. (ed.) IPGRI :1-63. Engelmann, F. and H. Takagi. 2000. Cryopreservation of tropical plant germoplasm. Current research progress and application. Engelmann, F. and H. Takagi (eds.) JIRCAS-IPGRI pp 496. Mroginski, L.A., W.M. Roca, K.K. Kartha. 1991. Criopreservacin del Germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca W. M. y L. A. Mroginski (eds.) CIAT (32):715-730. Roca, W.M., D.I. Arias y R. Chvez. 1991. Mtodos de conservacin in vitro de germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31):697-714.
PARTE V Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetal
V. CAPTULO 1 Aportes de la citogentica al estudio de genomas vegetales

Lidia Poggio, Gonzlez Graciela, Ferrari Mara Rosa, Garca Ana Mara, Wulff Arturo, Greizerstein Eduardo, Tmas Pablo y Schrauf Gustavo. Dedicado a la memoria del Dr. Carlos Alberto Naranjo. 1.- Introduccin /D &LWRJHQpWLFD IXH GHQLGD FRPR OD GLVFLSOLQD TXH HVWXGLD HO FRPSRUWDPLHQWR \ OD HVWUXFtura de los cromosomas y su relacin con la transmisin y recombinacin de los genes. La FLWRJHQpWLFD FOiVLFD SURSRUFLRQD GLIHUHQWH QLYHO de anlisis que la citogentica molecular, y ambas contribuyen a los estudios taxonmicos, evolutivos y de genmica estructural y funcioQDO DSOLFDEOHV HQ SURFHVRV GH PHMRUDPLHQWR gentico convencionales o biotecnolgicos. /RV SULQFLSDOHV HVWXGLRV GH OD FLWRJHQpWLFD clsica se basan en la determinacin de las caUDFWHUtVWLFDV GHO FDULRWLSR \ OD LGHQWLFDFLyQ FURmosmica mediante tcnicas de tincin convencionales y bandeo cromosmico. Tambin, se evala el tamao del genoma y se analiza el FRPSRUWDPLHQWR PHLyWLFR GH ORV FURPRVRPDV HQ UD]DV HVSHFLHV KtEULGRV \ SROLSORLGHV /RV HVWXGLRV FLWRJHQpWLFRV SHUPLWHQ DQDOL]DU OD SUHVHQFLD GH FURPDWLQD LQWURJUHVDQWH HQ FXOWLYRV \ HVSHFLHV QDWXUDOHV FRQWULEX\HQGR DO HVWXGLR GH OD WUDQVIHUHQFLD GH JHQHV HQ SURJUDmas de mejoramiento. En el rea agronmica, SRU HMHPSOR IDFLOLWDURQ OD FRQVWUXFFLyQ GH YDliosos stocks de trigo como monosmicos, ditelosmicos, dobles ditelosmicos, nulismicos \ OtQHDV FRQ GHOHFLRQHV TXH IXHURQ ~WLOHV SDUD UHDOL]DU HVWXGLRV JHQpWLFRV \ PDSDV ItVLFRV (Q SODQHV GH FRQVHUYDFLyQ GH OD ELRGLYHUVLdad la citogentica evala los daos genticos TXH ORV WD[RQHV SXHGDQ VXIULU SRU HO VLVWHPD GH SUHVHUYDFLyQ GH ODV VHPLOODV R SRU HO LPSDFWR GH OD SROXFLyQ DPELHQWDO Las tcnicas de citogentica molecular (hibridacin in situ) combinan informacin citolgica clsica con informacin molecular de las
VHFXHQFLDV \ SHUPLWHQ UHDOL]DU HVWXGLRV GH PDSHR \ GH GLVWULEXFLyQ ItVLFD GH VHFXHQFLDV DQDOL]DU UHODFLRQHV HYROXWLYDV HQWUH HVSHFLHV \ estudiar la organizacin del genoma y la arquitectura nuclear. Los resultados que se obtienen PHGLDQWH OD DSOLFDFLyQ GH HVWDV WpFQLFDV IDFLOLWDQ HVWXGLRV GH VLVWHPiWLFD ORJHQLD ELRGLversidad, evolucin, mejoramiento y biotecnologa. Las tcnicas de hibridacin in situ (ISH) se UHHUHQ DO ),6+ )OXRUHVFHQW In Situ Hybridization) o GISH (Genomic In Situ Hybridization), segn que se utilicen como sonda secuencias SDUWLFXODUHV R $'1 JHQyPLFR WRWDO UHVSHFWLYDPHQWH \ VHUiQ H[SOLFDGDV HQ HO DSDUWDGR GH pVWH FDStWXOR 5HVXOWDGRV REWHQLGRV SRU QXHVWUR JUXSR GH WUDEDMR TXH VH H[SRQGUiQ HQ HO SUHVHQWH FDStWXOR HMHPSOLFDQ FRPR OD FLWRJHQpWLFD SHUPLWH SURIXQGL]DU HQ HO FRQRFLPLHQWR GHO RULJHQ \ HYROXFLyQ GH FURPRVRPDV \ JHQRPDV FRPSOHtos, localizar genes o regiones cromosmicas GH LQWHUpV DJURQyPLFR \ UHVROYHU SUREOHPDV VLVWHPiWLFRHYROXWLYRV (VWRV DSRUWHV FRQWULEX\HQ DO GHVDUUROOR GH SURJUDPDV GH FRQVHUYDcin de recursos genticos y biodiversidad. 2.- Anlisis del cariotipo (O FRPSOHPHQWR FURPRVyPLFR GH XQD HVSHFLH R FDULRWLSR VH UHHUH D OD DSDULHQFLD IHQRWtSLFD GH ORV FURPRVRPDV HQ PHWDIDVH PLWyWLFD tomando en cuenta las siguientes caractersticas: Nmero bsico (x), nmero gamtico (n) y nmero somtico (2n). Tamao absoluto y relativo de los cromosomas. Posicin de los centrmeros. 1~PHUR WLSR \ SRVLFLyQ GH ODV UHJLRQHV organizadoras del nucleolo. Cantidad y distribucin de heterocromatiQD GHWHFWDGD SRU EDQGHR FURPRVyPLFR Tamao del genoma. ,GHQWLFDFLyQ FURPRVyPLFD PHGLDQWH OD localizacin fsica de secuencias (FISH). El nmero bsico (x), es el nmero menor de FURPRVRPDV QHFHVDULR SDUD TXH HO RUJDQLVPR VHD YLDEOH \ UHSUHVHQWD HO PtQLPR GH FURPRVRPDV GH XQD VHULH SROLSORLGH (O Q~PHUR JD-
mtico (n), es el nmero de cromosomas que OOHYDQ ODV JDPHWDV \ SXHGH FRLQFLGLU R QR FRQ el nmero bsico, de acuerdo con el nivel de SORLGtD GH OD HVSHFLH TXH VH WUDWH (O Q~PHUR somtico (2n), es el nmero de cromosomas que llevan las clulas somticas. /DV FDUDFWHUtVWLFDV GHO FDULRWLSR VRQ JHQHUDOPHQWH FRQVWDQWHV HQ XQ JUXSR GH HVSHFLHV \ D~Q GH JpQHURV SHUR D PHQXGR RFXUUHQ YDULDFLRQHV HVWUXFWXUDOHV \R QXPpULFDV TXH SXHGHQ FDPELDU HO Q~PHUR WDPDxR \ SRVLFLyQ FHQWURmrica de los cromosomas y concomitantePHQWH OD VLPHWUtD GHO FDULRWLSR /RV SULQFLSDOHV UHDUUHJORV FURPRVyPLFRV UHVSRQVDEOHV GH ODV GLIHUHQFLDV FDULRWtSLFDV HQWUH JUXSRV WD[RQyPLFRV SXHGHQ PRGLFDU la forma de los cromosomas sin cambiar su Q~PHUR FRPR SRU HMHPSOR WUDQVORFDFLRQHV LQYHUVLRQHV SHULFpQWULFDV QR VLPpWULFDV GXSOLFDFLRQHV \ GHFLHQFLDV 7DPELpQ RFXUUHQ UHDUUHJORV TXH PRGLFDQ WDQWR OD IRUPD FRPR HO nmero y tamao de los cromosomas sin alterar la informacin gentica, como las fusiones \ ODV VLRQHV FURPRVyPLFDV (VWRV FDPELRV VH GHQRPLQDQ GLVSORLGHV D GLIHUHQFLD GH ORV DQHXSORLGHV TXH SURGXFHQ SHUGLGD R JDQDQFLD GH FURPRVRPDV HQWHURV 3RU HMHPSOR HQ OD IDmilia Asteraceae el nmero bsico ancestral es [ SHUR KD\ JpQHURV HQ OD WULEX $VWHUHDH FRQ JUXSRV GH HVSHFLHV TXH WLHQHQ [ \ RULJLQDGDV SRU FDPELRV GLVSORLGHV 6L HVWRV UHDUUHJORV HQ FRQGLFLyQ KHWHURFLJRWD SRVHHQ PHQRU YDORU DGDSWDWLYR TXH HQ FRQGLFLyQ KRPRFLJRWD HVWRV ~OWLPRV VH SXHGHQ MDU HQ SREODFLRQHV SHTXHxDV FRQ HOHYDGD HQGRFUtD GDQGR OXJDU D SURFHVRV GH HVSHFLDFLyQ FURPysomica. (O Q~PHUR FURPRVyPLFR WDPELpQ SXHGH YDULDU SRU SROLSORLGtD PDQWHQLpQGRVH FRQVWDQWH HO Q~PHUR EiVLFR (O WULJR [ HMHPSOLFD XQD VHULH SROLSOyLGH FRPSXHVWD SRU HVSHFLHV FRQ Q \ (Q OD IDPLOLD )DEDFHDH ORV SURFHVRV GH GLVSORLGtD FUHFLHQWH \ GHFUHFLHQWH WDQWR D QLYHO GLSORLGH FRPR SROLSORLGH RULJLQDURQ Q~PHURV EiVLFRV VHFXQGDULRV \ VHULHV SROLSORLGHV PRGLFDGDV /DV IXVLRQHV \ VLRQHV FURPRVyPLFDV DVt como hibridacin entre taxones con distinto Q~PHUR FURPRVyPLFR WDQWR D QLYHO GLSORLGH
FRPR SROLSORLGH VHUtDQ HQ PXFKRV FDVRV OD causa del surgimiento de nuevos nmeros bsicos. Brassica napus Q SRVHH XQ Q~PHUR EiVLFR GHULYDGR [ \ VH RULJLQy SRU el cruzamiento entre B. campestris (x=10) y B. oleracea [ \ SRVWHULRU SROLSORLGL]DFLyQ Es interesante destacar que los rearreglos HVWUXFWXUDOHV PHQFLRQDGRV DO PRGLFDU OD SRVLFLyQ GH ORV JHQHV SXHGHQ FDPELDU WDPELpQ OD funcionalidad de stos aunque no se detecten FDPELRV QRWRULRV HQ OD PRUIRORJtD GHO FDULRWLSR 'LVWLQWDV HVSHFLHV SXHGHQ HVWDU DLVODGDV UHSURGXFWLYDPHQWH VL HO KtEULGR HQWUH HOODV SRsee rearreglos en condicin heterocigota que RFDVLRQHQ GLVWXUELRV HQ HO DSDUHDPLHQWR PHLyWLFR TXH GHWHUPLQHQ HVWHULOLGDG (VWDV HVSHFLHV SXHGHQ SRVHHU SRFDV GLIHUHQFLDV D QLYHO ELRTXtPLFR PROHFXODU R PRUIROyJLFR SHUR VXV diferencias cromosmicas las mantendran aisODGDV UHSURGXFWLYDPHQWH HVSHFLHV FUtSWLFDV Cuando se realizan estudios cromosmiFRV FRPSDUDGRV QR KD\ OH\HV R SULQFLSLRV TXH SHUPLWDQ LQIHULU FDUDFWHUtVWLFDV DQFHVWUDOHV R GHULYDGDV GHO FDULRWLSR \D TXH VH SXHGHQ HQFRQWUDU JUDQGHV GLIHUHQFLDV FDULRWtSLFDV HQWUH HVSHFLHV UHODFLRQDGDV (VWDV YDULDFLRQHV VRQ dinmicas y no estn relacionadas con comSOHMLGDG JHQpWLFD X RUJDQtVWLFD 8Q DQiOLVLV PiV SUHFLVR GH OD YDULDFLyQ FDULRWtSLFD VH REWLHQH HPSOHDQGR WpFQLFDV GH EDQdeo cromosmico (C o DAPI, entre otros) que UHYHODQ VHFXHQFLDV GH $'1 DOWDPHQWH UHSHWLdas y regiones organizadoras del nuclolo, las TXH SXHGHQ XWLOL]DUVH FRPR PDUFDGRUHV FURmosmicos. La heterocromatina constitutiva es XQ FRPSRQHQWH DGLWLYR GHO JHQRPD \ SUHVHQWD HQ PXFKRV JUXSRV YDULDFLyQ LQWUD H LQWHUHVSHFtFD OD FXDO SXHGH UHYHODUVH SRU ODV GLYHUVDV tcnicas de bandeo cromosmico. Aunque las regiones heterocromticas no contienen genes DFWLYRV SRGUtDQ WHQHU LPSRUWDQFLD HQ HYHQWRV UHJXODWRULRV \ HQ HO GHVDUUROOR \ OD GLVSRVLFLyQ HVSDFLDO GH ORV FURPRVRPDV HQ HO Q~FOHR )Lgura 1 A y B). Las tcnicas de bandeo cromosmico ofreFHQ PDUFDGRUHV TXH SHUPLWHQ LGHQWLFDU JHQRPDV \R FURPRVRPDV VLQ HPEDUJR QR HV SRVLEOH FRQRFHU ODV VHFXHQFLDV FRPSUHQGLGDV HQ dichos marcadores. Por lo tanto, las bandas C TXH VRQ VLPLODUHV HQ WDPDxR \ SRVLFLyQ SXHGHQ
GLIHULU HQ OD FRPSRVLFLyQ GH VXV VHFXHQFLDV ODV FXDOHV SXHGHQ VHU GLVFULPLQDGDV XWLOL]DQGR tcnicas de hibridacin in situ (Figura 2 E y F).
Figura 1: A: Bandeo C en Metafase mittica de Z. m. VVS mexicana. /D HFKD LQGLFD XQD EDQGD & B: %DQGHR '$3, HQ FHQWHQR /D HFKD PXHVWUD XQD banda de heterocromatina telomrica. C: Dos gruSRV GH ELYDOHQWHV 'LDFLQHVLV GH PDt] % &URPRsoma B. N: nucleolo. D: &RQJXUDFLyQ PHLyWLFD HQ Diacinesis de maz x Z. perennis (F1), se observan , ,, ,,, \ DJUXSDFLyQ HVSDFLDO GH ORV ,, , XQLvalentes, II: bivalentes y III: trivalentes. E: Dos gruSRV DVLQFUyQLFRV GH ,, FDGD HQ $QDIDVH , GH PDt] F: 3XHQWHV \ IUDJPHQWRV HQ $QDIDVH , GH WULFHSLUR /DV HFKDV PXHVWUDQ ORV IUDJPHQWRV \ ODV FDEH]DV GH HFKD LQGLFDQ ORV SXHQWHV G: Asociacin secundaria de bivalentes en Metafase I de Senecio madagascariensis /D HFKD PXHVWUD GRV ,, DJUXSDGRV H: 'HVLQDSVLV HQ 3URIDVH , GH Z. luxurians x Z. m. VVS mexicana (F1). N: nucleolo. Barra: 10 um en Fig. A-F y H. Barra: 3 um en Fig. G.
3.- Contenido de ADN. Variacin intra e LQWHUHVSHFtFD HQ HO WDPDxR GHO JHQRPD El contenido de ADN se evala en general SRU PLFURGHQVLWRPHWUtD FRQ WLQFLyQ GH )HXOJHQ R SRU FLWRPHWUtD GH XMR 6H GHQRPLQD YDORU
& DO FRQWHQLGR GH $'1 GHO JDPHWR KDSORLGH \ & D OD FDQWLGDG GH $'1 JHQyPLFR TXH VH encuentra en el ncleo de clulas somticas no UHSOLFDGDV 'DGR TXH OD SROLSORLGLD HV XQ LPSRUWDQWH PRGR GH HVSHFLDFLyQ \ PXFKDV SODQWDV FRQVLGHUDGDV GLSORLGHV PDt] Arabidopsis) han PRVWUDGR VHU SROLSORLGHV DQWLJXRV ORV WHUPLQRV YDORU & \ WDPDxR GHO JHQRPD SXHGHQ UHVXOWDU DPELJXRV HQ HVWRV FDVRV (Q XQ GLSORLGH ambos trminos seran sinnimos. Sin emEDUJR HQ XQ SROLSORLGH HO YDORU & UHSUHVHQta el contenido de ADN de todos los genomas ancestrales que lleva el ncleo gamtico. En estos casos es necesario conocer el conteniGR GH $'1 GHO JHQRPD EiVLFR &[ \D TXH OD SROLSORLGtD VyOR DXPHQWD HO YDORU & SHUR QR HO &[ /R HVSHUDGR HQ XQ SROLSORLGH HV TXH HO YDORU & DXPHQWH HQ IRUPD GLUHFWD FRQ HO QLYHO GH SORLGtD \ TXH HO &[ SHUPDQH]FD FRQVWDQWH 6LQ HPEDUJR HQ PXFKRV SROLSORLGHV VH REVHUYy TXH HO &[ WLHQGH D GLVPLQXLU D PHGLGD TXH DXPHQWD HO QLYHO GH SORLGtD (VWR VXJLHUH que ocurre disminucin del tamao del genoPD OXHJR GH OD IRUPDFLyQ GHO SROLSORLGH \ TXH HVWH IHQyPHQR SRGUtD HVWDU UHODFLRQDGR FRQ HO SURFHVR GH GLSORLGL]DFLyQ FURPRVyPLFD \ JHnmica. /DV SULQFLSDOHV FDXVDV GH YDULDFLyQ LQWUD R LQWHUHVSHFtFD GHO FRQWHQLGR GH $'1 GHVFDUWDQGR OD YDULDFLyQ HQ HO QLYHO GH SORLGtD VRQ DQHXSORLGtD SROLPRUVPR QXPpULFR SDUD FURmosomas accesorios (cromosomas B), reesWUXFWXUDFLRQHV FURPRVyPLFDV FRQ SpUGLGD R GXSOLFDFLyQ GH PDWHULDO JHQpWLFR \ YDULDFLyQ HQ HO Q~PHUR GH FRSLDV GH VHFXHQFLDV QR FRGLcantes. El tamao del genoma es muy variable enWUH JUXSRV GH SODQWDV (Q $QJLRVSHUPDV RVFLOD HQWUH SJ HQ Cardamine amara \ SJ en Fritillaria assyriaca, variacin que no se encuentra necesariamente relacionada con nivel GH SORLGtD /D YDULDFLyQ GHO WDPDxR GHO JHQRma se encuentra, a grandes rasgos, relacionaGD FRQ GLIHUHQFLDV HQ OD FRPSOHMLGDG RUJDQtVPLFD ORV YLUXV SRU HMHPSOR WLHQHQ JHQRPDV PiV SHTXHxRV TXH ODV EDFWHULDV \ pVWDV D VX vez menores que los eucariotas. Sin embargo, HQ RUJDQLVPRV VXSHULRUHV VH HQFRQWUy TXH HO DXPHQWR HQ HO YDORU & QR HV H[SOLFDEOH SRU OD
existencia de mayor nmero de genes funcionales, ya que el contenido de ADN de un alga XQLFHOXODU SXHGH VHU LJXDO DO GH XQD DQJLRVSHUPD OHxRVD (VWD SDUDGRMD GHO YDORU& IXH UHsuelta cuando estudios moleculares mostraron TXH JUDQ SDUWH GHO JHQRPD FRQVLVWH HQ $'1 UHSHWLGR TXH WLHQH HO SRWHQFLDO GH FDPELDU UiSLGDPHQWH HQ Q~PHUR GH FRSLDV \ DOWHUDU HO WDPDxR GHO JHQRPD HQ UHVSXHVWD D HYHQWRV ELyWLFRV y abiticos. Actualmente, est demostrado que cambios en el tamao del genoma involucran SpUGLGD R JDQDQFLD GH VHFXHQFLDV UHSHWLGDV HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV UHWURHOHPHQWRV PLcrosatlites, macrosatlites, etc). Estas se loFDOL]DQ HQ UHJLRQHV LQWHUJpQLFDV \ SXHGHQ HVWDU GLVSHUVDV HQ HO JHQRPD R HQ DUUHJORV HQ tandem $XQTXH ORV HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV VRQ WUDQVFULSFLRQDOPHQWH LQDFWLYRV SXHGHQ DFtivarse en condiciones de variacin o estrs DPELHQWDO (O HVWUpV JHQyPLFR SURGXFLGR SRU OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD SROLSORLGL]Dcin, en la naturaleza o como consecuencia de SUiFWLFDV GH PHMRUDPLHQWR SXHGH HQ DOJXQRV FDVRV SURGXFLU OD DPSOLFDFLyQ GH HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV (Q JHQHUDO OD UHODFLyQ $'1 JpQLFR QR Jpnico disminuye con el aumento del tamao del JHQRPD \ HQ DOJXQDV $QJLRVSHUPDV FRQ HOHYDGR FRQWHQLGR GH $'1 ODV VHFXHQFLDV UHSHWLGDV SXHGHQ UHSUHVHQWDU KDVWD HO GHO $'1 WRWDO (VWD UHODFLyQ SODQWHD LQWHUURJDQWHV DFHUFD GHO RULJHQ \ IXQFLyQ GHO $'1 UHSHWLGR QR FRGLFDQte. Se han analizado las relaciones que existen entre el contenido de ADN y algunas caractersticas celulares y organsmicas, denominnGRVH SDUiPHWURV QXFOHRWtSLFRV D DTXHOORV DVSHFWRV GHO $'1 QXFOHDU TXH DIHFWDQ DO IHQRWLSR LQGHSHQGLHQWHPHQWH GHO $'1 FRGLFDQWH (Q YDULRV JUXSRV GH SODQWDV VH KD REVHUYDGR TXH las variaciones en el contenido de ADN nuclear HVWiQ FRUUHODFLRQDGDV SRVLWLYDPHQWH FRQ YRlumen y/o longitud cromosmica, rea y/o voOXPHQ FHOXODU SRUFHQWDMH GH KHWHURFURPDWLQD ORQJLWXG GHO FRPSOHMR VLQDSWRQpPLFR GXUDFLyQ del ciclo mittico y meitico, latitud y altitud de FUHFLPLHQWR 6H KDQ HQFRQWUDGR GDWRV TXH SHUPLWHQ VXSRQHU TXH GLIHUHQFLDV HQ HO WDPDxR GHO JHQRPD SRVHHQ VLJQLFDGR DGDSWDWLYR HQ OD HYROXFLyQ GLYHUVLFDFLyQ \ DGDSWDFLyQ D GLVWLQWRV DPELHQWHV $OJXQRV DXWRUHV SRVWXODQ TXH
existen mecanismos moleculares que generan $'1 UHSHWLGR QR FRGLFDQWH TXH DFW~D FRPR mutgeno y/o agente regulador. /D YDULDFLyQ LQWUDHVSHFtFD HQ HO FRQWHQLGR GH $'1 HV D~Q XQ WySLFR GLVFXWLGR DXQTXH existen casos, como el del gnero Zea, donde ha sido demostrada inequivocamente. En maz (Zea mays VVS mays) las diferencias en el taPDxR GHO JHQRPD UDGLFDQ SULQFLSDOPHQWH HQ el nmero de cromosomas accesorios (cromosomas B) y en el contenido de heterocromatina GH ORV FURPRVRPDV GHO FRPSOHPHQWR UHJXODU TXH HVWi UHSUHVHQWDGD HQ JUDQ SDUWH SRU EORTXHV KHWHURFURPiWLFRV GHQRPLQDGRV NQREV (VWXGLRV FLWRJHQpWLFRV FOiVLFRV UHDOL]DGRV SRU QXHVWUR JUXSR GH LQYHVWLJDFLyQ HQ UD]DV QDWLvas del Noroeste argentino (NOA), revelaron OD H[LVWHQFLD GH XQD FRUUHODFLyQ SRVLWLYD HQWUH cromosomas B y altitud de cultivo, sugiriendo XQ VLJQLFDGR DGDSWDWLYR SDUD HVWRV FURPRVRmas accesorios. Adems, el anlisis de la variabilidad microsatlite en estas razas de maz FRQUPy OD SDUWLFLSDFLyQ GH IXHU]DV VHOHFWLYDV HQ HO PDQWHQLPLHQWR GH OD FRUUHODFLyQ GHVFULSWD /D SUHVHQFLD GH FURPRVRPDV DFFHVRULRV TXH VRQ KHWHURFURPiWLFRV QR FRGLFDQWHV \ VLQ IXQFLRQHV YLWDOHV SDUD HO RUJDQLVPR VRQ IUHFXHQWHV HQ UD]DV QDWLYDV GH SODQWDV FXOtivadas tales como maz y centeno. El modo SDUWLFXODU GH KHUHQFLD GH HVWRV FURPRVRPDV FRQ PHFDQLVPRV GH LPSXOVR TXH KDFHQ TXH VH KHUHGHQ FRQ PD\RU IUHFXHQFLD TXH OD HVSHUDGD SRU KHUHQFLD PHQGHOLDQD DEUH XQ QXHYR FDPSR GH LQYHVWLJDFLyQ HQ OR TXH VH UHHUH D VX XWLOL]DFLyQ FRPR SRUWDGRUHV GH JHQHV ~WLOHV HQ SURJUDPDV GH PHMRUD Es interesante sealar que no hay relacin HQWUH HVSHFLDFLyQ \ FRQWHQLGR GH $'1 3RU HVH PRWLYR VH SRVWXOy TXH OD HVSHFLDFLyQ GHSHQGtD IXQGDPHQWDOPHQWH GH FDPELRV HQ ORV JHQHV FRGLFDQWHV 6LQ HPEDUJR OD JHQyPLFD FRPSDUDWLYD KD UHYHODGR FRQVWDQFLD HQ HVtos genes informacionales. En las gramneas, SRU HMHPSOR HO FRQWHQLGR GH JHQHV \ HO RUGHQ de los mismos estn altamente conservados, PLHQWUDV TXH OD FDQWLGDG GH $'1 UHSHWLGR KD cambiado considerablemente. Estos hallazgos llevan a investigar el rol de las secuencias de $'1 UHSHWLGR HQ ORV SURFHVRV GH HVSHFLacin.
4.- Anlisis meitico en hbridos y poliploides 8QD HVSHFLH GLSORLGH FRQ UHSURGXFFLyQ VH[XDO HV IpUWLO VL SRVHH XQ FRPSRUWDPLHQWR PHLyWLFR QRUPDO R VHD EXHQ DSDUHDPLHQWR entre cromosomas homlogos, el cual se ve UHHMDGR HQ OD IRUPDFLyQ GH ELYDOHQWHV ,, HQ meiosis (Profase I). Ello determina que exista buena segregacin y formacin de gametos EDODQFHDGRV \ IpUWLOHV (O JUDGR GH DSDUHDmiento meitico es una medida de la homologa que existe entre los cromosomas. Por lo cual la homologa genmica entre dos enWLGDGHV SXHGH HYDOXDUVH HVWXGLDQGR HO FRPSRUWDPLHQWR PHLyWLFR GH VXV KtEULGRV ) 6L HO KtEULGR DQDOL]DGR SRVHH IRUPDFLyQ GH ,, \ HV IpUWLO VH SXHGH FRQFOXLU TXH KD\ DQLGDG KRPRORJtD HQWUH VXV JHQRPDV SDUHQWDOHV 6LQ HPEDUJR SRGUtD RFXUULU TXH DXQTXH ODV HVSHFLHV SDUHQWDOHV WXYLHUDQ XQD HOHYDGD KRPRORJtD HQ cuanto a las secuencias de ADN, los hbridos fueran estriles, con formacin de univalentes , HQ VX PHLRVLV (VWD HVWHULOLGDG SRGUtD GHEHUVH D OD DFFLyQ GH JHQHV TXH LQWHUHUHQ FRQ HO SURFHVR QRUPDO GH DSDUHDPLHQWR IRUPDFLyQ GHO FRPSOHMR VLQDSWRQpPLFR RFXUUHQFLD \R SRVLFLyQ GH VREUHFUX]DPLHQWRV R TXH DOWHUDQ OD GLVSRVLFLyQ HVSDFLDO GH ORV JHQRPDV HQ HO Q~FOHR SURYRFDQGR GH HVWD PDQHUD DVLQDSVLV R GHVLQDSVLV )LJXUD ) /D HVWHULOLGDG SRGUtD GHEHUVH WDPELpQ DO FRPSRUWDPLHQWR PHLyWLFR LUUHJXODU FDXVDGR SRU GLIHUHQFLDV HQ UHDUUHJORV HVWUXFWXUDOHV HQWUH ODV HVSHFLHV SURJHQLWRUDV de un hbrido. Por lo tanto, si el hbrido entre dos taxones es estril habr que analizar si el DLVODPLHQWR UHSURGXFWLYR SRVWFLJyWLFR REHGHFH a causas gnicas o cromosmicas. Si las causas fueran cromosmicas se observara formaFLyQ GH , \ HO SROLSORLGH GHULYDGR WHQGUtD PHLRVLV UHJXODU FRQ IRUPDFLyQ GH ,, &RQJXUDFLRQHV PHLyWLFDV DQRUPDOHV FRPR , ,, KHWHURPyUFRV o multivalentes en Profase-Metafase I (Figuras ' \ * \ HQ HVWDGLRV SRVWHULRUHV SXHQWHV fragmentos, cromosomas con cromtidas desLJXDOHV PLFURQ~FOHRV HWF SXHGHQ GHEHUVH D KHWHURFLJRVLV SDUD GLVWLQWRV WLSRV GH UHDUUHJORV estructurales (Figura 2F). Si la esterilidad fuese GH RULJHQ JpQLFR SRGUtDQ REVHUYDUVH GLVWXUELRV PHLyWLFRV GH GLVWLQWR WLSR FRPR DVLQDSVLV GHVLQDSVLV DOWHUDFLyQ HQ OD IRUPDFLyQ GHO KXVR
etc.; los cuales se observaran tambin en el SROLSORLGH GHULYDGR (Q HVWRV FDVRV OD PHLRVLV LUUHJXODU \ OD HVWHULOLGDG QR HVWDUtDQ UHHMDQGR necesariamente falta de homologa entre geQRPDV SDUHQWDOHV 3RU OR DQWHV PHQFLRQDGR VH deduce que el grado de irregularidades meiticas observadas en el hbrido sera una estimacin de diferencias gnicas y/o estructurales TXH SRVHHQ ODV HQWLGDGHV SURJHQLWRUDV 8Q IHQyPHQR IUHFXHQWH HQ KtEULGRV GLSORLGHV HQWUH GLVWLQWDV HVSHFLHV HV TXH DXQTXH SUHVHQWHQ IRUPDFLyQ UHJXODU GH ELYDOHQWHV \ desarrollo normal de los estados II de la meioVLV SRVHDQ HOHYDGD HVWHULOLGDG 3RGHPRV HQFRQWUDU HMHPSORV GH HVWH IHQyPHQR HQ KtEULGRV HQWUH GLVWLQWDV HVSHFLHV GH ORV JpQHURV Amaranthus, Prosopis, Hypochaeris y Bromus, entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a HVWH IHQyPHQR KLEULGH] HVWUXFWXUDO FUtSWLFD TXH SXHGH RFXUULU FXDQGR ODV HVSHFLHV SURJHQLWRUDV VH GLIHUHQFLDQ HQ SHTXHxRV UHDUUHJORV estructurales. En estos casos si bien se forman bivalentes, se segregan combinaciones gnicas inviables a los gametos. Esto indica que la formacin de bivalentes no se debe neceVDULDPHQWH D TXH ORV JHQRPDV SDUHQWDOHV TXH FRQIRUPDQ XQ KtEULGR LQWHUHVSHFtFR VHDQ KRmlogos. El estudio meitico de hbridos entre taxoQHV FRQ GLVWLQWR QLYHO GH SORLGtD DSRUWD PD\RU LQIRUPDFLyQ TXH HO UHDOL]DGR HQ KtEULGRV GLSORLGHV (Q OD QDWXUDOH]D SRGHPRV HQFRQWUDU DXWR \ DORSROLSORLGHV (Q ORV DXWRSROLSORLGHV UHFLHQWHV VH HVSHUD XQD HOHYDGD IUHFXHQFLD GH PXOWLYDOHQWHV PLHQWUDV TXH HQ ORV DORSROLSORLGHV pVWD GHSHQGH GH VL VH WUDWD GH DORSROLSORLGHV WtSLFRV IRUPDGRV SRU KLEULGDFLyQ HQWUH HVSHFLHV FRQ JHQRPDV PX\ GLIHUHQWHV \ SRVWHULRU DXWRGXSOLFDFLyQ R DORSROLSORLGHV VHJPHQWDULRV RULJLQDGRV SRU KLEULGDFLyQ HQWUH HVSHFLHV PX\ DQHV \ SRVWHULRU DXWRGXSOLFDFLyQ /DV FRQguraciones meiticas (frecuencia de I, II y mulWLYDOHQWHV SHUPLWH HVWXGLDU OD UHODFLyQ HQWUH ORV JHQRPDV SDUHQWDOHV GH XQ DORSROLSOyLGH 6LQ HPEDUJR HO DSDUHDPLHQWR FURPRVyPLFR HQ SROLSORLGHV SXHGH HVWDU DIHFWDGR SRU IDFWRUHV que aumentan o disminuyan la frecuencia de PXOWLYDOHQWHV LQGHSHQGLHQWHPHQWH GH OD DQLGDG GH ORV JHQRPDV FRPR SRU HMHPSOR JHQHV similares al gen Ph GH WULJR TXH LQKLEHQ HO DSD-
reamiento homelogo, o genes que afectan la VLQDSVLV \ OD IUHFXHQFLD \R ORFDOL]DFLyQ GH VRbrecruzamientos. En el gnero Zea el anlisis de las asociaFLRQHV PHLyWLFDV HQ HVSHFLHV H KtEULGRV KD UHYHODGR OD QDWXUDOH]D DORWHWUDSORLGH GHO PDt] Q \ GH VXV HVSHFLHV VLOYHVWUHV UHODFLRQDGDV WHRVLQWHV FRQ XQ Q~PHUR EiVLFR [ /DV HVSHFLHV FRQ Q SUHVHQWDQ ,, HQ Profase-Metafase I, mientras que Zea perennis (2n=40) muestra, con frecuencia elevada, ,9 ,, (Q KtEULGRV FRQ Q FURPRVRmas (Z. diploperennis (2n=20) x Z. perennis, Z. luxurians (2n=20) x Z. perennis (2n=40) y Z. mays VVS mays x Z. perennis), realizados DUWLFLDOPHQWH SRU QXHVWUR JUXSR GH LQYHVWLJDFLyQ OD FRQJXUDFLyQ PHLyWLFD REVHUYDGD PDV IUHFXHQWHPHQWH IXH ,,, ,, , (VWDV FRQJXUDFLRQHV PHLyWLFDV LQGLFDURQ OD SUHVHQFLD GH GRV JHQRPDV DQFHVWUDOHV $ \ % GH FURPRVRPDV FDGD XQR \ SHUPLWLHURQ SRVWXODU ODV IyUPXODV JHQyPLFDV SDUD ORV WD[RQHV GH Zea FRQ Q $[$[ %[%[ SDUD Zea perennis $S$S$S$S %S%S %S%S \ SDUD ORV KtEULGRV Q $S$S$[ %S%S %[ 1XHVWUR JUXSR GH LQYHVWLJDFLyQ KD HQFRQWUDGR DGHPiV en teosintes, razas nativas de maz e hbridos FRQ Q IRUPDFLyQ IUHFXHQWH GH GRV JUXSRV GH ,, FDGD XQR PXFKDV YHFHV DVRFLDGRV D husos acromticos distintos. Este doble huso sera una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. Este fenmeno est asociado a una leve DVLQFURQtD GH ORV GRV JUXSRV GH ,, GXUDQWH el desarrollo meitico (Figura 1E). Este fenmeno ha sido observado con alta frecuencia HQ OtQHDV DORSOiVPLFDV REWHQLGDV SRU QXHVWUR JUXSR GH WUDEDMR FUX]DQGR PDt] FRPR SURJHnitor masculino y teosinte (Z. mays VVS mexicana FRPR SURJHQLWRU IHPHQLQR (VWDV OtQHDV DORSOiVPLFDV SUHVHQWDURQ FRPSRUWDPLHQWR meitico regular con formacin de 10 II que se GLVWULEX\HURQ HQ GRV JUXSRV GH FLQFR ,, FDGD XQR (VWR VXJLHUH TXH OD LQWHUDFFLyQ FLWRSODVPD GH WHRVLQWHQ~FOHR GH PDt] LQXHQFLD OD GLVWULEXFLyQ HVSDFLDO GH ORV FURPRVRPDV HQ HO Q~FOHR SURPRYLHQGR OD VHSDUDFLyQ GH ORV GRV genomas ancestrales de 10 cromosomas cada XQR /D SUHVHQFLD GH GRV JUXSRV DVLQFUyQLFRV GH ,, FDGD XQR SHUPLWLy LQIHULU OD QDWXUDOH]D
SROLSOyLGH GH Zea (Figura 1E). En Zea y otros SROLSORLGHV FRPR Senecio se observ asociacin secundaria de II, sugiriendo la existencia de homeologa entre los genomas ancestrales. (Q HO SUHVHQWH DSDUWDGR VH KD HMHPSOLFDGR FyPR HO DQiOLVLV PHLyWLFR SHUPLWH GLOXFLGDU HO RULJHQ \ SRVWXODU ORV PRGRV GH HVSHFLDFLyQ GH DOJXQDV HVSHFLHV $GHPiV GH OD XWLOLGDG HQ HVWXdios taxonmicos y evolutivos, el conocimiento GH OD PHLRVLV HV GH LPSRUWDQFLD IXQGDPHQWDO HQ HVWXGLRV DSOLFDGRV \D TXH HQ OD SURGXFFLyQ GH KtEULGRV R SROLSORLGHV GH LPSRUWDQFLD DJURQyPLca se debe lograr un mximo de fertilidad y esto HVWi UHODFLRQDGR FRQ HO FRPSRUWDPLHQWR FURPRsmico durante la formacin de sus gametos. 5.- Citogentica molecular La Citogentica Molecular (ISH: Hibridacin In Situ) combina informacin acerca de la morfologa nuclear o cromosmica con la informaFLyQ PROHFXODU GH ODV VHFXHQFLDV \ SHUPLWH UHDOL]DU HVWXGLRV GH PDSHR \ GH GLVWULEXFLyQ fsica de las mismas, analizar relaciones evoOXWLYDV HQWUH HVSHFLHV \ HVWXGLDU OD RUJDQL]Dcin del genoma y la arquitectura nuclear. Por OR WDQWR OD FLWRJHQpWLFD PROHFXODU DSRUWD LPSRUtantes resultados a los estudios de sistemtiFD ORJHQLD ELRGLYHUVLGDG HYROXFLyQ PHMRUDmiento y biotecnologa. Las tcnicas de ISH consisten en hibridar cromosomas con secuencias de ADN marcaGDV FRQ XRURFURPRV. (VWDV WpFQLFDV DSOLFDGDV GHVGH XWLOL]DEDQ PpWRGRV GH PDUFDFLyQ \ GHWHFFLyQ UDGLRDFWLYRV (Q SODQWDV VH FRPHQ]DURQ D DSOLFDU D QHV GH OD GpFDGD GHO GHELGR D OD JUDQ GLVSRQLELOLGDG GH VHFXHQFLDV FORQDGDV SDUD VHU XWLOL]DGDV FRPR sonda, y a los nuevos sistemas no radioactivos de marcacin y deteccin. Esta metodologa es til en estudios de la estructura, funcin, organizacin y evolucin de los genomas \ SHUPLWH FRQRFHU VX FRPSRVLFLyQ D QLYHO GH secuencias. 3DUD UHDOL]DU HVWD WpFQLFD VH SXHden utilizar una gran variedad de sondas: desde ADN genmico total (GISH: Hibridacin In Situ *HQyPLFD KDVWD VHFXHQFLDV HVSHFtFDV FISH (Hibridacin In Situ Fluorescente), tales como sondas de cromosomas individuales o IUDJPHQWRV FURPRVyPLFRV REWHQLGDV SRU PLFURGLVHFFLyQ VHFXHQFLDV GH $'1 UHSHWLGR HQ
tandem UHWURWUDQVSRVRQHV VHFXHQFLDV GH JHQHV ~QLFRV R GH EDMR Q~PHUR GH FRSLDV 8QD GH ODV DSOLFDFLRQHV GHO ),6+ HV OD REWHQFLyQ GH PDSDV ItVLFRV IXQFLRQDOHV \ HVWUXFturales de los genomas, mediante la localizacin cromosmica de secuencias de distinto origen. El anlisis de la localizacin de secuenFLDV GLYHUVDV SHUPLWH LGHQWLFDU FURPRVRPDV analizar la arquitectura nuclear del genoma y YHULFDU KLSyWHVLV DFHUFD GH OD UHODFLyQ HQWUH SRVLFLyQ \ IXQFLyQ GH GHWHUPLQDGDV VHFXHQFLDV $SOLFDQGR HVWD PHWRGRORJtD VH SXHGHQ REWHQHU FDULRWLSRV ),6+ SDUD GHWHUPLQDGDV HVSHFLHV \ GHWHFWDU ORV UHDUUHJORV LQWHUJHQyPLcos que ocurrieron en su evolucin. Por otra SDUWH ORV H[SHULPHQWRV GH ),6+ SHUPLWHQ GHWHUPLQDU OD GLVWULEXFLyQ \ SRVLFLyQ GH PDWHULDO FURPRVyPLFR H[WUDHVSHFtFR OD H[LVWHQFLD GH DSDUHDPLHQWR \ UHFRPELQDFLyQ LQWHUJHQyPLFR \ OD VHJUHJDFLyQ SUHIHUHQFLDO GH GHWHUPLQDGRV cromosomas o segmentos cromosmicos. 3RU VX SDUWH HO *,6+ HQ HO TXH VH XWLOL]D ADN genmico total como sonda, revela homoORJtDV HVSHFtFDV GHO $'1 SULQFLSDOPHQWH HQ OR TXH UHVSHFWD D VHFXHQFLDV UHSHWLGDV (VWD WpFQLFD IDFLOLWD SRU HMHPSOR HO UHFRQRFLPLHQWR GH HVSHFLHV SDUHQWDOHV \ HO DQiOLVLV GH OD RUJDQL]DFLyQ QXFOHDU HQ KtEULGRV \ SROLSORLGHV \ OD GHWHUPLQDFLyQ GH OD QDWXUDOH]D GH VX DSDreamiento meitico (auto o alosindtico). AdePiV SHUPLWH GHWHFWDU FURPRVRPDV R VHJPHQtos cromosmicos introgresantes en hbridos y generaciones segregantes, lo cual es de gran XWLOLGDG HQ SODQHV GH PHMRUDPLHQWR SXHV HV SRVLEOH UHDOL]DU HO VHJXLPLHQWR GH ORV VHJPHQtos o cromosomas introgresados a lo largo de generaciones segregantes, retrocruzadas y en OtQHDV UHFRPELQDQWHV 3RU RWUD SDUWH HV ~WLO HQ HO DQiOLVLV GH DQLGDGHV JHQyPLFDV LQWHUHVSHFtFDV HQ HVWXGLRV HYROXWLYRV \ WD[RQyPLFRV (V LPSRUWDQWH VHxDODU TXH ODV UHODFLRQHV REWHQLGDV PHGLDQWH *,6+ QR VRQ DIHFWDGDV SRU JHQHV TXH SURGXFHQ GLVWXUELRV HQ HO DSDUHDPLHQWR PHLyWLFR DVLQDSVLV GHVLQDSVLV DSDreamiento homelogo o heterlogo), siendo de JUDQ XWLOLGDG SDUD DQDOL]DU KRPRORJtDV GH KtEULGRV R SROLSORLGHV TXH SUHVHQWDQ HVWHULOLGDG JpQLFD $GHPiV HO ),6+ \ HO *,6+ SURSRUFLRQDQ informacin acerca de la localizacin cromosmica y genmica de loci transgnicos, nmero
\ SRVLFLyQ GH FRSLDV LQVHUWDV \ VX FRUUHODFLyQ FRQ OD H[SUHVLyQ \ OD UHJXODFLyQ Para los casos en que las secuencias a deWHFWDU VRQ PX\ FRUWDV PHQRUHV D SE VH KDQ GHVDUUROODGR GLVWLQWDV PRGLFDFLRQHV GH la tcnica de FISH que consisten en sistemas GH DPSOLFDFLyQ GH ODV VHxDOHV GH KLEULGDFLyQ ),6+ VREUH EUDV GH $'1 ),6+ VREUH FURPRVRPDV SDTXLWpQLFRV R GHVFRQGHQVDGRV $GHms, se han utilizado variantes como PRINS (Primed In Situ Hybridization) y C-PRINS (Cycling PRINS), entre otras. La tcnica de PRINS VH EDVD HQ HO DSDUHDPLHQWR GH ROLJRQXFOHyWLGRV LQLFLDGRUHV D VHFXHQFLDV FRPSOHPHQWDULDV HQ cromosomas desnaturalizados in situ, seguiGR GH OD HORQJDFLyQ GHELGD D OD LQFRUSRUDFLyQ PHGLDQWH XQD $'1 SROLPHUDVD GH QXFOHyWLGRV marcados. En el C-PRINS intervienen una serie de ciclos termales anlogos a la reaccin en FDGHQD GH OD SROLPHUDVD En estudios realizados en nuestro laboratorio, la hibridacin in situ SHUPLWLy UHYHODU OD FRPSRVLFLyQ JHQyPLFD GHO WULKtEULGR WULFHSLUR que es un cereal sinttico de origen trigenrico: WULJR FHQWHQR \ DJURSLUR \ FX\D FRPSRVLFLyQ genmica y cromosmica, luego de varios aos GH VHOHFFLyQ HUD GHVFRQRFLGD (O WULFHSLUR VH RULJLQy SRU HO FUX]DPLHQWR GH WULWLFDOH Q [ WULJRSLUR Q FX\D ) SRVHtD Q OXHJR de varias generaciones de seleccin este hbrido se estabiliz en 2n=42. Los estudios de GISH realizados sobre los cromosomas de triFHSLUR 'RQ 5HQp ,17$ HPSOHDQGR VRQGDV GH ADN genmico de centeno (Figura 2A) y de Thinopyrum PRVWUDURQ FURPRVRPDV SHUWHQHFLHQWHV DO JHQRPD 5 GH FHQWHQR \ SHTXHxDV zonas de introgresin de Thynopyrum. Con la QDOLGDG GH LGHQWLFDU OD WRWDOLGDG GH ORV FURPRVRPDV GHO WULFHSLUR VH HPSOHDURQ ODV VRQdas pSc119.2 (aislada de centeno y que hibriGD FRQ SDWURQHV FDUDFWHUtVWLFRV VREUH WRGRV ORV cromosomas de los genomas R y B de trigo y sobre algunos cromosomas de los genomas A y D de trigo), pAs1 (aislada de Aegilops squarrosa y que hibrida sobre los cromosomas del genoma D de trigo), y pTa71 (aislada de trigo y que revela zonas organizadoras del nucloOR SRUTXH FRQWLHQH JHQHV ULERVRPDOHV (VWRV H[SHULPHQWRV PRVWUDURQ OD SUHVHQFLD GH ]Rnas de ADN ribosomal, 2 en cromosomas de
centeno y 4 en cromosomas trigo (Figura 2B), PLHQWUDV TXH OD FRORUDFLyQ FRQ SODWD $J125 indic que slo 4 de ellas eran activas formaGRUDV GH QXFOpRORV 6H FRPSUREy HQWRQFHV XQ IHQyPHQR GH VXSUHVLyQ LQWHUJHQyPLFD TXH OOHv al silenciamiento de los genes ribosomales GH FHQWHQR HQ SUHVHQFLD GHO JHQRPD GH WULJR DQSODVWtD 3RU OR H[SXHVWR VH SXHGH GHGXcir que el uso conjunto de las tcnicas clsicas \ GH ,6+ SHUPLWLy HVWDEOHFHU TXH OD FRPSRVLFLyQ JHQyPLFD \ FURPRVyPLFD GH WULFHSLUR 'RQ Ren INTA es AABBRR, con introgresin de Thinopyrum HQ HO FURPRVRPD $ )LJXUD $. 3RU RWUD SDUWH H[SHULPHQWRV GH ),6+ XWLOL]DQGR ODV PLVPDV VRQGDV QRV SHUPLWLHURQ FDracterizar distintas lneas de Triticale obtenidas HQ QXHVWUR SDtV (Q OD JUDPtQHD SDWDJyQLFD Bromus pictus Q KHPRV UHDOL]DGR H[SHULPHQWRV GH GISH que han demostrado que Bromus setifolius Q HV XQR GH VXV SURJHQLWRUHV )LJXra 2C). Esta informacin evolutiva es relevante SDUD HO PHMRUDPLHQWR \ OD GRPHVWLFDFLyQ GH HVWD SRWHQFLDO HVSHFLHV IRUUDMHUD Elymus scabrifolius DJURSLUR FULROOR HV XQD JUDPtQHD SHUHQQH VXGDPHULFDQD GH DOWR YDORU IRUUDMHUR TXH SRVHH XQ RULJHQ KtEULGR DORWHWUDSORLGH Q [ 6H KD SRVWXODGR XQD IyUPXOD JHQyPLFD 66++ FX\R JHQRPD SDUHQWDO 6 SHUWHQHFH D Pseudoroegneria y H a Hordeum. Para determinar el origen de los genomas FRPSRQHQWHV GHO DJURSLUR FULROOR VH UHDOL]DURQ H[SHULPHQWRV GH ,6+ DVRFLDGRV D HVWXGLRV FLWRJHQpWLFRV FOiVLFRV TXH SHUPLWLHURQ FRQUPDU TXH XQD HVSHFLH GH Hordeum es uno de sus SDUHQWDOHV GHWHFWDU UHRUJDQL]DFLRQHV LQWHUJHQyPLFDV \ REWHQHU PDSHRV ItVLFRV GH VHFXHQFLDV UHSHWLGDV )LJXUD ' (Q HVWD HVSHFLH OD FRPELQDFLyQ GHO DQiOLVLV FOiVLFR GHO FDULRWLSR *,6+ \ ),6+ SHUPLWLy LGHQWLFDU D FDGD XQR GH ORV FURPRVRPDV \ VX SHUWHQHQFLD D FDGD JHQRPD SDUHQWDO OR FXDO VHUi GH JUDQ XWLOLGDG HQ ORV SODQHV GH PHMRUD HQ HMHFXFLyQ Las distintas razas de maz y de teosintes SUHVHQWDQ YDULDFLyQ HQ HO WDPDxR Q~PHUR \ FRPSRVLFLyQ GH VXV UHJLRQHV KHWHURFURPiWLFDV GHQRPLQDGDV NQREV TXH VRQ FLWROyJLcamente observables mediante bandeo C y DAPI. (VWRV SXHGHQ HVWDU FRQVWLWXLGRV SRU GRV IDPLOLDV GH $'1 DOWDPHQWH UHSHWLGR HQ tandem
SE \R 75 (Q QXHVWUR ODERUDWRULR UHDOL]DPRV H[SHULPHQWRV GH ),6+ SDUD GLOXFLGDU OD FRPSRVLFLyQ GH VHFXHQFLDV GH ODV GLVWLQWDV EDQGDV KHWHURFURPiWLFDV R NQREV '$3, (VWRV QRV SHUPLWLHURQ REVHUYDU TXH H[LVWH JUDQ YDULDELOLGDG HQ OD FRPSRVLFLyQ GH VHFXHQFLD GH ORV GLVWLQWRV NQREV OR FXDO UHVXOWy GH JUDQ XWLOLGDG SDUD FDUDFWHUL]DU ODV OtQHDV \ UD]DV GH maz y teosintes estudiadas hasta el momento (Figuras 2G y 2H). En maz y teosintes los mtodos de GISH y ),6+ QRV SHUPLWLHURQ DQDOL]DU ODV DQLGDGHV genmicas existentes entre los distintos xones de Zea 8Q HMHPSOR GH HVWR HV HO HVWXGLR GH ODV DQLGDGHV D QLYHO GH VHFXHQFLDV UHSHWLGDV HQWUH HO PDt] \ VX VXSXHVWR SURJHQLWRU VLOYHVWUH Zea mays VVS parviglumis. Adems, se analizaron las homologas entre los taxones de Zea con 2n=20 y Zea perennis con 2n=40. Mediante hibridacin in situ utilizando secuencias marFDGRUDV HVSHFtFDV KHPRV SRGLGR UHVROYHU OD FRQVWLWXFLyQ FURPRVyPLFD GH ODV FRPSOHMDV FRQJXUDFLRQHV PHLyWLFDV TXH VH REVHUYDQ HQ los hbridos de Zea con 2n=30 cromosomas )LJXUDV ( \ ) (VWRV UHVXOWDGRV SHUPLWLHURQ FRUURERUDU ODV IyUPXODV JHQyPLFDV SODQWHDGDV SDUD ODV GLVWLQWDV HVSHFLHV GH Zea, avalando HO RULJHQ SROLSORLGH GHO PDt] \ GH VXV HVSHFLHV silvestres relacionadas. 2WUR DVSHFWR TXH VH KD GHVDUUROODGR ~OWLPDmente dentro de la citogentica molecular es el de la microdiseccin y clonado de cromoVRPDV R VHFFLRQHV FURPRVyPLFDV (Q SODQtas, es muy til como fuente de sondas y se DSOLFD SDUD DQDOL]DU JHQRPDV SDUD HVWDEOHFHU UHODFLRQHV HQWUH FURPRVRPDV \ JUXSRV GH OLJDPLHQWR HVSHFtFRV ORFDOL]DU JHQHV GH LQWHUpV y relacionar las distancias fsicas y genticas HQ PDSDV GH OLJDPLHQWR 3RU WRGR OR H[SXHVWR SRGHPRV FRQFOXLU TXH la citogentica molecular es de gran utilidad en estudios evolutivos, sistemtico-taxonmicos \ DSOLFDGRV \D TXH HQ HO HVWXGLR GH ODV UHODFLRQHV JHQyPLFDV HQWUH HVSHFLHV PXHVWUD ODV similitudes entre sus genomas y la distribucin ItVLFD GH ODV VHFXHQFLDV UHSHWLGDV TXH FRPSDUWHQ (Q HO DQiOLVLV GH KtEULGRV \ SROLSORLGHV QDWXUDOHV R DUWLFLDOHV SHUPLWH FRQRFHU GHO RULJHQ GH KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV GHWHUPLQDU HO origen genmico de los cromosomas involu-
FUDGRV HQ GLVWLQWDV FRQJXUDFLRQHV PHLyWLFDV establecer las relaciones genmicas entre las HVSHFLHV SDUHQWDOHV DQDOL]DU ORV GRPLQLRV FURPRVyPLFRV GH FDGD JHQRPD SDUHQWDO VX DUquitectura nuclear), detectar cromosomas y/o introgresadas y translocaciones intra e intergenmicas. Agradecimientos: A la SECyT, a la Agencia de Promocin &LHQWtFD \ 7pFQLFD \ DO &21,&(7 SRU QDQFLDU ORV SUR\HFWRV 3,&7 3,3 \ PICT 14170; a la Universidad de Buenos Aires SRU HO RWRUJDPLHQWR GH ORV VXEVLGLRV (; \ (; $VLPLVPR DJUDGHFHPRV D OD )DFXOWDG de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) donde VH OOHYDQ D FDER OD PD\RU SDUWH GH ODV WDUHDV GH LQYHVWLJDFLyQ $O 6U 'LHJR )LQN SRU OD FRQfeccin de las lminas. Literatura recomendada Artculos
)HUUDUL 05 *UHLU]HVWHLQ + ( 3DFDSHOR $ 1DUDQMR C.A., Cuadrado A., Jouv, N. and Poggio L. 2004. 7KH JHQRPLF FRPSRVLWLRQ RI 7ULFHSLUR D V\QWKHWLF IRUDJH FURS *HQRPH 48 *RQ]iOH] * &RPDV & &RQIDORQLHUL 9 1DUDQMR &$ DQG 3RJJLR / *HQRPLF DIQLWLHV between maize and Zea perennis using classical and molecular cytogenetic (GISH-FISH). Chomosome Research 14 *RQ]iOH] * &RQIDORQLHUL 9 &RPDV & 1DUDQMR &$ DQG 3RJJLR / *,6+ UHYHDOV FU\SWLF JHQHWLF GLIIHUHQFHV EHWZHHQ PDL]H DQG LWV SXWDWLYH ZLOG SURJHQLWRU Zea mays VVS parviglumis. Genome 47 3RJJLR / *RQ]iOH] * &RQIDORQLHUL 9 &RPDV & DQG 1DUDQMR &$ The genome organization DQG GLYHUVLFDWLRQ RI PDL]H DQG LWV DOOLHG VSHFLHV revisited: evidences from classical and FISH-GISH cytogenetics analysis. Review. Cytogenetics and Genome Research 109, 259-267. Poggio L., Rosato M., Chiavarino, A.M. and Naranjo & $ *HQRPH VL]H DQG HQYLURQPHQWDO correlations in maize (Zea mays VVS mays). Annals of Botany 82 Poggio L., Rosato M. and Naranjo C. A. 1997. 0HLRWLF EHKDYLRU LQ DOORSODVPLF OLQHV RI Zea mays VSS mays. Genome 40, 723-729.
Libros
%HQQHWW 0 ' DQG /HLWFK ,- *HQRPH VL]H HYROXWLRQ LQ SODQWV ,Q 7KH HYROXWLRQ RI WKH JHQRPHV *UHJRU\ 75 HG (OVHYLHU ,QF SS %HQQHWW 0 ' 7KH GHYHORSPHQW DQG XVH RI genomic in situ hibridization (GISH) as a new tool LQ SODQW ELRV\VWHPDWLFV ,Q .HZ &KURPRVRPH &RQIHUHQFH ,9 %UDQGKDP 3( DQG %HQQHWW 0' HGV 5R\DO %RWDQLF *DUGHQV .HZ SS *XHUUD 0 HG ),6+ &RQFHLWRV H $SOLFDo{HV na Citogentica. Sociedade Brasileira da *HQHWLFD SS /DFDGHQD -5 &LWRJHQHWLFD (GLWRULDO &RPSOXWHQVH 0DGULG SS Liehr T. (ed.). 2009. Fluorescence In situ +\EULGL]DWLRQ ),6+ $SSOLFDWLRQ *XLGH 6SULQJHU SS 3XHUWDV 0- DQG 1DUDQMR 7 HGV 3ODQW &\WRJHQHWLFV .DUJHU SS Ran J.Sinht (ed.). 2002. Plant Cytogenetics. 2 (GLWLRQ &5& 3UHVV SS Ryan Gregory T. (ed.) 2004. The evolution of the *HQRPH (OVHLYHU SS 6KDUPD $. DQG 6KDUPD $ HGV &KURPRVRPH 3DLQWLQJ 3ULQFLSOHV 6WUDWHJLHV DQG 6FRSH .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 5HSULQWHG from Methods in Cell Science 23 SS 6ROWLV '( 6ROWLV 36 DQG 'R\OH - 0ROHFXODU 6\VWHPDWLFV RI 3ODQWV ,, '1$ 6HTXHQFLQJ .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV SS Stebbins G.L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison-Wesley Publ. Reading. 0DVVDFKXVHWWV SS Summer A.T. 1990. Chromosome banding. London 8QZLQ +\PDQ SS 6FKZDU]DFKHU 7 DQG +HVORS+DUULVRQ 3 HGV 2002. Practical in situ +\EU\GL]DWLRQ 6SULQJHU 9HUODJ SS 6\EHQJD - &\WRJHQHWLFV LQ SODQW EUHHGLQJ 0RQRJUDSKV RQ 7KHRUHWLFDO DQG $SSOLHG *HQHWLFV 6SULQJHU9HUODJ SS
V. CAPTULO 2 Mejoramiento de Plantas Forrajeras en la Era Genmica

*HUPDQ 6SDQJHQEHUJ 0DXUR 0HLHU \ 9LYLDQD (FKHQLTXH 1 Introduccin Si bien el mejoramiento gentico convencioQDO KD WHQLGR XQ JUDQ LPSDFWR HQ HO LQFUHPHQto del rendimiento, la calidad y la resistencia a SODJDV \ HQIHUPHGDGHV HQ FHUHDOHV \ ROHDJLQRVDV HQ ODV HVSHFLHV IRUUDMHUDV ORV SURJUHVRV KDQ VLGR VLJQLFDWLYDPHQWH PHQRUHV HVSHFLDOmente en lo referido al rendimiento. Esto obeGHFH D YDULRV IDFWRUHV FRPR XQ SURFHVR PiV UHFLHQWH GH GRPHVWLFDFLyQ OD FRPSOHMLGDG GH REMHWLYRV SUREOHPDV UHSURGXFWLYRV GH PHUFDdo y las menores inversiones realizadas en el rea. Las herramientas biotecnolgicas desarrolladas en los ltimos 20 aos ofrecen inteUHVDQWHV DOWHUQDWLYDV TXH SXHGHQ FRQWULEXLU D mejorar esta situacin. (Q ORV ~OWLPRV DxRV OD ELRWHFQRORJtD KD DSRUWDGR YDULDV PHWRGRORJtDV SDUD FRPSOHPHQWDU ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR FRPR HO cultivo de tejidos, la hibridacin somtica, la variacin somaclonal y la transgnesis. Esta ~OWLPD UHVXOWD PX\ SURPLVRULD HVSHFLDOPHQWH SDUD LQFUHPHQWDU OD FDOLGDG GHO IRUUDMH SHUVLVWHQFLD UHVLVWHQFLD D SODJDV \ HQIHUPHGDGHV WROHUDQFLD D HVWUHVHV DELyWLFRV \ SDUD PDQLSXlar el crecimiento y desarrollo. Los marcadores PROHFXODUHV EULQGDQ VX XWLOLGDG SDUD OD LGHQWLcacin y seleccin de caracteres agronmicos FRPSOHMRV 0iV UHFLHQWHPHQWH OD JHQyPLFD SHUPLWH LGHQWLFDU D JUDQ HVFDOD JHQHV GH LQWHUpV SDUD VX LQWURGXFFLyQ HQ ORV IRUUDMHV 7RGDV HVWDV WHFQRORJtDV FRQX\HQ HQ HO PHMRUDPLHQWR PROHFXODU TXH SHUPLWLUi REWHQHU QXHYRV FXOWLYDUHV SDUD VDWLVIDFHU ODV GHPDQGDV DFWXDOHV GH SURGXFFLyQ (Q HVWH FDStWXOR VH GHVFULEHQ ODV DSOLFDFLRQHV DFWXDOHV \ IXWXUDV \ HO LPSDFWR de la biotecnologa en el mejoramiento de esSHFLHV IRUUDMHUDV 2 Transgnesis /D WHFQRORJtD JpQLFD \ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV EULQGDQ OD SRVLELOLGDG GH JH-
nerar variacin gentica cuando esta es inexistente o tiene una heredabilidad muy baja. En OD DFWXDOLGDG VH GLVSRQH GH PHWRGRORJtDV HFLHQWHV SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ GH IRUUDMHUDV \D sean gramneas o leguminosas (Figura 1). La utilizacin de la biolstica o la transforPDFLyQ PHGLDGD SRU Agrobacterium SHUPLWH la regulacin de nuevos genes, o de genes SUHH[LVWHQWHV TXH FRGLFDQ SDUD ODV HQ]LPDV que intervienen en las distintas vas metabOLFDV SDUD TXH HVWRV VH H[SUHVHQ HQ PD\RU R menor grado. En la actualidad se encuentran HQ HWDSD GH HYDOXDFLyQ D FDPSR GLVWLQWDV HVSHFLHV IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV FRQ FDUDFWHUHV
Figura 1. Transformacin de trbol blanco para resistencia virus. A-H) 6LVWHPD SUROtFR GH UHJHQHUDFLyQ GH SODQWDV UHVLVWHQWHV DO YLUXV GHO PRVDLFR GH OD DOIDOID $09 \ DO YLUXV GHO PRVDLFR GHO WUpERO EODQFR :&09 D SDUWLU GH H[SODQWRV FRWLOHGRnales. La transformacin se llev a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens, utilizando npt2 como marcador de seleccin. I) T-ADN del vector binario conteniendo el gen quimrico npt2 y el gen de la SURWHtQD GH OD FiSVLGH GHO $09 AMV4). J) AnliVLV SRU 3&5 SDUD OD LGHQWLFDFLyQ SUHOLPLQDU GH ODV SODQWDV WUDQVIRUPDGDV XWLOL]DQGR LQLFLDGRUHV SDUD el gen npt2. K) ,GHP DQWHULRU SHUR XWLOL]DQGR LQLFLDGRUHV SDUD HO JHQ AMV4. L) Anlisis de Southern blot utilizando una sonda dirigida al gen AMV4. M) Anlisis de Northern EORW GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WUpERO EODQFR H[SUHVDQGR HO JHQ TXLPpULFR AMV4.
VLPSOHV PRGLFDGRV 6L ELHQ DOJXQRV DVSHFWRV GH OD JHQpWLFD VLRORJtD \ ELRTXtPLFD GH PXFKRV SURFHVRV YHJHWDOHV FRPSOHMRV QR KDQ VLGR D~Q FRPSOHWDPHQWH GLOXFLGDGRV OR FXDO SRGUtD GHPRUDU DOJXQDV GH ODV DSOLFDFLRQHV GH la transgnesis en el mejoramiento vegetal, la WHFQRORJtD JpQLFD HV XQD SRGHURVD KHUUDPLHQWD SDUD DPSOLDU ORV FRQRFLPLHQWRV HQ JHQpWLFD molecular. (O Q~PHUR GH JHQHV GLVSRQLEOHV SDUD ORV PHMRUDGRUHV GH SODQWDV KD DXPHQWDGR UiSLGDPHQWH FRQ HO DGYHQLPLHQWR GH ORV JUDQGHV SURJUDPDV GH VHFXHQFLDFLyQ GH HVSHFLHV FRPR Lolium perenne y el trbol blanco; o en la seFXHQFLDFLyQ FRPSOHWD GHO JHQRPD GH HVSHFLHV modelo como Medicago trunculata L., Lotus japonicus L. y arroz (Oryza sativa L.).En conVHFXHQFLD ODV DSOLFDFLRQHV GH OD WUDQVJpQHVLV HQ HO PHMRUDPLHQWR GH HVSHFLHV IRUUDMHUDV HVtn orientadas hacia el desarrollo de eventos de transformacin con variacin gentica nica y a la diseccin gentica de vas metablicas y SURFHVRV GH GHVDUUROOR UHOHYDQWHV SDUD OD SURduccin de forrajes. Los mejores candidatos en cuanto a caracWHUHV SDUD OD DSOLFDFLyQ GH WUDQVJpQHVLV HQ SODQWDV IRUUDMHUDV VRQ FDOLGDG GHO IRUUDMH UHVLVWHQFLD D SODJDV \ HQIHUPHGDGHV WROHUDQFLD D HVWUHVHV DELyWLFRV \ OD PDQLSXODFLyQ GHO FUHcimiento y desarrollo. 2.1 0RGLFDFLyQ JHQpWLFD GH OD calidad del forraje El mejoramiento molecular basado en transJpQHVLV SDUD PHMRUDU OD FDOLGDG GHO IRUUDMH HVWi dirigido al tratamiento de los subcaracteres involucrados, a saber: digestibilidad de la materia seca, contenido de carbohidratos solubles, FRQWHQLGR GH SURWHtQDV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV DOFDORLGHV HWF /D PRGLFDFLyQ GH OD PD\RUtD GH ORV SDUiPHWURV GH FDOLGDG VH DVRFLD D FLHUWDV YtDV PHWDEyOLFDV R D OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV HVSHFtFDV /D WHFQRORJtD JpQLFD SHUPLWH LGHQWLFDU ODV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV \ ODV HQ]LPDV FODYH D VHU PDQLSXODGDV HO DLVODPLHQWR GH ORV JHQHV FRUUHVSRQGLHQWHV \ OD PDQLSXODFLyQ GH VX H[SUHVLyQ HQ SODQWDV WUDQVgnicas. A continuacin desarrollaremos ejemSORV GH GLVWLQWDV DSOLFDFLRQHV
2.1.1 Manipulacin de la biosntesis de lignina (O SULQFLSDO REMHWLYR WHQGLHQWH PHMRUDU HO YDORU QXWULWLYR GH ODV JUDPtQHDV IRUUDMHUDV SDUD la industria lechera es el incremento de la digestibilidad de la materia seca, la cual declina PDUFDGDPHQWH ! D PHGLGD TXH HVWDV crecen y maduran, reduciendo el valor nutritivo del forraje. Dado que la heredabilidad de este FDUiFWHU HV EDMD \ HO PLVPR HVWi FRQWURODGR SRU XQ JUDQ Q~PHUR GH JHQHV HO SRWHQFLDO SDUD XQ UiSLGR PHMRUDPLHQWR SRU PpWRGRV WUDGLFLRQDOHV es reducido. 6H HVWLPD TXH SHTXHxRV LQFUHPHQWRV HQ OD GLJHVWLELOLGDG WHQGUiQ XQ HIHFWR VLJQLFDWLYR HQ la calidad del forraje y concomitantemente en OD SURGXFFLyQ DQLPDO $Vt LQFUHPHQWRV GHO en la digestibilidad de la materia seca in vitro FRQGXFHQ D LQFUHPHQWRV SURPHGLR GHO HQ JDQDQFLD PHGLD GH SHVR YLYR /D OLJQLQD HV XQ FRPSRQHQWH LPSRUWDQWH GH OD SDUHG FHOXODU GH SODQWDV YDVFXODUHV \ GXUDQWH PXFKR WLHPSR KD VLGR UHFRQRFLGD SRU VX LPSDFWR QHJDWLYR VREUH OD FDOLGDG GHO IRUUDMH HQ OD IDEULFDFLyQ GH SDSHO \ PiV UHFLHQWHPHQWH HQ OD REWHQFLyQ GH ELRFRPEXVWLEOHV D SDUWLU de celulosa. Durante las ltimas dos dcadas, genetistas y bioqumicos han avanzado en el FRQRFLPLHQWR GH OD UHODFLyQ HQWUH OLJQLFDFLyQ \ digestibilidad de los forrajes. Los efectos negativos de la lignina sobre la GLJHVWLELOLGDG GHSHQGHQ GH VX FRQWHQLGR FRPSRVLFLyQ GH PRQyPHURV \ JUXSRV IXQFLRQDOHV \ GHO JUDGR GH HQWUHFUX]DPLHQWR FRQ ORV SROLVDFiULGRV GH OD SDUHG FHOXODU /D OLJQLFDFLyQ HV XQ SURFHVR DOWDPHQWH FRRUGLQDGR \ UHJXODGR SRU XQ FRQMXQWR GH HYHQWRV PHWDEyOLFRV TXH UHVXOWDQ HQ OD ELRVtQWHVLV GH SUHFXUVRUHV de la lignina (monolignoles). Existen tres niveOHV GH FRQWURO SDUD OD PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD GH ligninas, a saber: la sntesis de monolignoles, HO WUDQVSRUWH GH ORV PLVPRV GHVGH HO VLWLR GH VtQWHVLV DO GH SROLPHUL]DFLyQ \ HO GH SROLPHUL]DFLyQ GH PRQROLJQROHV SDUD GDU ORV SURGXFWRV QDOHV 8QD GH ODV HVWUDWHJLDV PiV H[SORUDGDV SDUD PHMRUDU OD GLJHVWLELOLGDG GH OD OLJQLQD HV OD regulacin negativa de las enzimas involucradas en la biosntesis de monolignoles. En funcin de los resultados de varios estuGLRV UHODFLRQDGRV FRQ OD PDQLSXODFLyQ GH OLJ-
nina se ha encontrado que los genes pal, c4h, c3h y 4cl QR VRQ EXHQRV EODQFRV SDUD OD PDQLSXODFLyQ HVSHFLFD GH ELRVtQWHVLV GH PRQROLJQROHV \D TXH SURGXFHQ HIHFWRV DGYHUVRV VREUH otras funciones biolgicas (Figura 2 A). Estos JHQHV FRGLFDQ ODV HQ]LPDV IHQLODODQLQD DPLno ligasa (PAL), cinamato-4-hidroxilasa (C4H), p-cumarato 3-hidroxilasa (C3H) y 4-cumarato CoA ligasa (4CL).
Figura 2. A) 9LD ELRVLQWpWLFD GH OD OLJQLQD 3$/ IHnilalanina amonio liasa; TAL: tirosina amonio liasa; C4H: cinamato-4-hidroxilasa; C3H: p-cumarato 3-hiGUR[LODVD &207 FDIHDWR2PHWLOWUDQVIHUDVD )+ IHUXODWRKLGUR[LODVD &/ FXPDUDWR &R$ OLJDVD CC3H: cumaroil CoA hidroxilasa; CCOMT: cafeoilCoA-O-metiltransferasa; CCR: cinamoil-CoA-reductasa; CAD: cinamoil alcohol deshidrogenasa. Las HFKDV SXQWHDGDV LQGLFDQ UHDFFLRQHV TXH QR KDQ VLGR YHULFDGDV H[SHULPHQWDOPHQWH
ms fcil de extraer qumicamente, en otros HVWD WHFQRORJtD WUDMR DSDUHMDGDV DOWHUDFLRQHV HQ HO GHVDUUROOR GH OD SODQWD FRPR UHGXFFLRQHV HQ HO WDPDxR \ FRODSVR GH ODV FpOXODV GHO [LOHPD SHUR HQ JHQHUDO HVWRV UHVXOWDGRV LQGLcan que la introduccin de genes de esta va metablica en construcciones de ARN sentido R DQWLVHQWLGR SHUPLWHQ PHMRUDU OD GLJHVWLELOLGDG de la materia seca, sin alterar el desarrollo norPDO GH OD SODQWD /RV HIHFWRV REVHUYDGRV HQ SODQWDV FRQ UHgulacin negativa de alguna de estas enzimas son similares a aquellos encontrados en la naWXUDOH]D HQ XQ WLSR GH PXWDQWHV GH PDt] OODPDdos brown midrib (bmr FX\RV JHQHV FRGLFDQ SDUD HQ]LPDV PHQRV DFWLYDV (O HQIRTXH WUDQVJpQLFR EULQGD OD SRVLELOLGDG GH REWHQHU SODQWDV FRQ OLJQLQDV GLIHUHQWHV ORJUDQGR XQD PD\RU YDULHGDG GH IHQRWLSRV TXH OD H[LVWHQWH en la naturaleza, a travs de la regulacin negativa de varias enzimas y a la utilizacin de SURPRWRUHV HVSHFtFRV (Q UDLJUiV SHUHQQH VH KD ORJUDGR FORQDU \ caracterizar tres genes clave en la va de biosntesis de monolignoles: cad, 4cl y ccr (cinamoil CoA reductasa, CCR). Estos genes han VLGR PDSHDGRV HQ ORV FURPRVRPDV GH UDLJUDV (Figura 2 B) y se encuentran en evaluacin SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH HVWD HVSHFLH FRQ HVWRV genes regulados en sentido y antisentido. La regulacin negativa de OMT en Festuca increPHQWy HQ XQ OD GLJHVWLELOLGDG OR FXDO HV XQ UHVXOWDGR PX\ LPSRUWDQWH GH HVWD WHFQRORJtD
Por otro lado, comt, ccoaomt y cad son bueQRV EODQFRV SDUD DOWHUDU HO FRQWHQLGR \ FRPSRVLFLyQ GH OLJQLQDV \ FRGLFDQ ODV HQ]LPDV O-metil transferasa del cido cafeico (COMT), cafeoil CoA-3-O-metiltransferasa (CCoAOMT) y cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD). Las LQYHVWLJDFLRQHV UHDOL]DGDV XWLOL]DQGR SODQWDV modelo como tabaco y lamo demostraron TXH OD UHJXODFLyQ QHJDWLYD GH OD H[SUHVLyQ GH COMT, CAD y 4CL conduce a una alteracin HQ OD FRPSRVLFLyQ GH OD OLJQLQD R D XQD GLVPLnucin de su contenido, con incrementos signiFDWLYRV HQ OD GLJHVWLELOLGDG GH OD PDWHULD VHFD En algunos de estos casos la lignina result
Figura 2. B) 0DSHR GH ORV JHQHV FRUUHVSRQGLHQWHV D OD YtD GH ELRVtQWHVLV GH OLJQLQD HQ ORV JUXSRV GH OLJDPHQWR /* \ /* GH UDLJUiV SHUHQQH
(Q HVWD HVSHFLH WDPELpQ VH UHJXODURQ QHJDWLvamente las enzimas CAD y COMT. Dado que los genes estructurales involucrados en la biosntesis de lignina se encuentran UHJXODGRV D QLYHO GH WUDQVFULSFLyQ RWUD HVWUDWHJLD SDUD OD PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD LQYROXFUD OD PDQLSXODFLyQ GH IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ GH WLSR 0<% (O UHFLHQWH LQWHUpV HQ OD SURGXFFLyQ GH ELRFRPEXVWLEOHV D SDUWLU GH FHOXORVD KD LPSXOVDdo la ingeniera gentica de ligninas, utilizando como sistemas modelo cultivos energticos como Populus trichocarpa y Brachypodium distachyon. La gran cantidad de biomasa que SURSRUFLRQDQ ORV IRUUDMHV HV XQD DOWHUQDWLYD DWUDFWLYD SDUD HVWH Q (Q (VWDGRV 8QLGRV VH EXVFD XWLOL]DU HO SDVWR YDULOOD R switchgrass (Panicum virgatum) como una alternativa. Se trata GH SURGXFLU PRGLFDFLRQHV JHQpWLFDV TXH UHdunden en baja cantidad de lignina o diferente calidad de la misma. De esta manera se facilitara la liberacin de celulosa y hemicelulosa GH OD PDWUL] GH OD SDUHG FHOXODU \ TXHGDUtDQ PiV DFFHVLEOHV SDUD HO WUDWDPLHQWR HQ]LPiWLFR SRVWHULRU 2.1.2 Manipulacin del metabolismo de fructanos /RV IUXFWDQRV VRQ PROpFXODV GH SROLIUXFWRVD SURGXFLGDV SRU YDULDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV SDUD ODV FXDOHV FRQVWLWX\HQ OD SULQFLSDO IRUPD de almacenamiento de carbohidratos solubles. Observaciones realizadas en lneas de raigrs que almacenan concentraciones elevadas de carbohidratos solubles indicaron que stas no sufren disminuciones en la digestibilidad durante el verano, ya que estos carbohidratos SDUHFHQ FRQWUDUUHVWDU ODV GLVPLQXFLRQHV HQ GLJHVWLELOLGDG GHELGDV D OLJQLFDFLyQ IDYRUHciendo adems la asimilacin del forraje y de SURWHtQDV HQ HO UXPHQ \ FRQFRPLWDQWHPHQWH JHQHUDQGR LQFUHPHQWRV HQ HO SHVR YLYR Un alto contenido de fructanos en los forraMHV HV GH JUDQ YDORU \D TXH SXHGHQ VHU PRYLOL]DGRV IiFLOPHQWH SDUD PDQWHQHU HO UHEURWH LQPHGLDWDPHQWH GHVSXpV GH OD GHIROLDFLyQ DVt FRPR SRU DxDGLU YDORU QXWULWLYR SDUD OD DOLPHQtacin del ganado. La sntesis de fructosa en gramneas involucra la accin concertada de al menos tres enzi-
mas: sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST), fructano:fructano 1- fructosiltransfeUDVD ))7 \ VDFDURVDIUXFWDQR IUXFWRVLOWUDQVIHUDVD 6)7 TXH VLQWHWL]DQ OD PH]FOD PiV FRPSOHMD GH IUXFWDQRV OLJDGRV TXH VH HQFXHQWUD HQ SDVWRV \ FHUHDOHV 9DULRV GH ORV JHnes involucrados en esta va metablica han sido aislados y caracterizados, como el 6-SFT de cebada, el 6G-FFT de cebolla y el 1-SST de DOFDXFLO 6X LQWURGXFFLyQ HQ SODQWDV GHVSURYLVtas de fructanos nativos conduce a la acumuODFLyQ GH ROLJRIUXFWDQRV \ HQ SODQWDV TXH ORV SURGXFHQ SURYRFDQ OD DFXPXODFLyQ GH QXHYDV variedades de los mismos. /D LQWURGXFFLyQ GH XQ JHQ PLFURELDQR SDUD OD fructosiltransferasa (gen SacB) de Bacilus subtilis HQ SODQWDV GH WDEDFR \ SDSD TXH FDUHFHQ de fructanos y acumulan almidn, condujo a la acumulacin de cantidades considerables de IUXFWDQRV GH HOHYDGR SHVR PROHFXODU TXH OHV FRQULHURQ XQ PHMRU UHQGLPLHQWR HQ VLWXDFLRQHV de estrs. Esto demuestra que la sacarosa, el VXVWUDWR SDUD OD IUXFWRVLOWUDQVIHUDVD SXHGH VHU UHGLUHFFLRQDGD HQ HVSHFLHV TXH QR DFXPXODQ fructanos. /D PDQLSXODFLyQ GH OD ELRVtQWHVLV GH IUXFWDQRV HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV SDUD PHMRUDU OD calidad del forraje y la tolerancia a estreses DELyWLFRV HVWi VLHQGR H[SORUDGD HQ OHJXPLQRsas como Trifolium repens y Medicago sativa, y en gramneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. 6H KD UHSRUWDGR OD REWHQFLyQ GH SODQWDV GH L. PXOWLRUXP con alteraciones en el metabolismo GH IUXFWDQRV SRU OD LQWURGXFFLyQ GH JHQHV TXLmricos de levansacarasa bacteriana. Tambin VH GLVSRQH GH $'1F GH JHQHV KRPyORJRV GH OD IUXFWRVLOWUDQVIHUDVD GH UDLJUiV SHUHQQH (VWRV han sido aislados, caracterizados y utilizados SDUD OD GLVHFFLyQ JHQpWLFD GH OD ELRVtQWHVLV GH fructanos en gramneas transgnicas. Tambin se han aislado y caracterizado otros genes de OD YtD TXH KDQ VLGR LQWURGXFLGRV \ H[SUHVDGRV en leguminosas y gramneas. Por medio del anlisis de secuencias, utilizando la tcnica de microarreglos y Northern blot VH GHWHUPLQDURQ ORV SHUOHV GH H[SUHVLyQ de los genes involucrados en la va de frucWDQRV HQ UDLJUiV SHUHQQH /D RUJDQL]DFLyQ GH ORV JHQHV HO Q~PHUR GH FRSLDV \ VX XELFDFLyQ
HQ HO PDSD JHQpWLFR VH GHWHUPLQDURQ XWLOL]DQdo marcadores moleculares. Tambin se consWUX\HURQ YHFWRUHV SDUD OD UHJXODFLyQ PHGLDQWH ARN sentido y antisentido de los genes menFLRQDGRV /DV FRUUHVSRQGLHQWHV SODQWDV WUDQVJpQLFDV VH XWLOL]DQ SDUD OD GLVHFFLyQ PROHFXODU GHO PHWDEROLVPR GHO IUXFWDQRV \ SDUD FRPSUHQGHU VX URO VLROyJLFR HQ ODV SODQWDV \ WDPELpQ SDUD PHMRUDU HO YDORU QXWULWLYR SHUVLVWHQFLD \ FDOLGDG XWLOL]DQGR JHQHV GH OD PLVPD HVSHFLH (VWRV HVWXGLRV WDPELpQ DSRUWDUiQ LQIRUPDFLyQ acerca de su rol funcional en la tolerancia al fro \ OD VHTXtD (VWH FRQRFLPLHQWR HV FODYH SDUD HO GLVHxR GH H[SHULPHQWRV WHQGLHQWHV D OD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ PHMRU FDOLGDG de forraje y tolerancia a estreses abiticos. 2.1.3 Expresin transgnica de protenas rumen by-pass Los aminocidos azufrados metionina y cistena son limitantes en la nutricin animal. (VWRV LQX\HQ HQ HO FUHFLPLHQWR GH OD ODQD HQ ODV RYHMDV \ VX DSRUWH HV UHGXFLGR HQ FRQGLFLRQHV QDWXUDOHV GH SDVWRUHR \ SRU OD IHUPHQWDFLyQ HQ HO UXPHQ \D TXH OD PLFURRUD GHJUDGD ODV SURWHtQDV \ HQ DOJXQDV FLUFXQVWDQFLDV UHVLQWHWL]D SURWHtQDV GH PHQRU YDORU QXWULWLYR /RV VXSOHPHQWRV SRVWUXPLQDOHV GH PHWLRQLQD \ FLVWHtQD UHVXOWDQ HQ LQFUHPHQWRV GHO DO HQ OD WDVD GH FUHFLPLHQWR GH OD ODQD (VWRV HIHFWRV SRVLWLYRV WDPELpQ VH KDQ REVHUvado en bovinos, donde han redundado en una PD\RU SURGXFFLyQ GH OHFKH \ XQD PD\RU WDVD GH FUHFLPLHQWR HQ DQLPDOHV SDUD FDUQH 3RU OR tanto la ingestin de forrajeras que contengan SURWHtQDV ULFDV HQ DPLQRiFLGRV D]XIUDGRV UHlativamente estables en el rumen (rumen bypass LQFUHPHQWDUtD HO DSRUWH GH DPLQRiFLGRV HVHQFLDOHV SDUD OD QXWULFLyQ GH ORV UXPLDQWHV FRQGXFLHQGR D XQD PD\RU SURGXFFLyQ DQLPDO SDUWLFXODUPHQWH HQ OR TXH D ODQD VH UHHUH *HQHV TXH FRGLFDQ SURWHtQDV GH HVWH WLSR fueron aislados, caracterizados e introducidos HQ SODQWDV GH IHVWXFD DOWD DOIDOID WUpERO EODQFR \ WUpERO VXEWHUUiQHR (VWDV SURWHtQDV VHUtDQ OD RYRDOE~PLQD GH SROOR OD DOE~PLQD GH DUYHMD \ de semilla de girasol. &RPR HMHPSOR SXHGH FLWDUVH HO FDVR GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH Festuca arundinacea IHVWXFD DOWD TXH H[SUHVDQ JHQHV TXLPpULFRV FRQVWLWXLGRV SRU VHFXHQFLDV GH
$'1F GH OD DOE~PLQD GH JLUDVRO 6)$ FRQ OD VHxDO .'(/ GHO UHWtFXOR HQGRSOiVPLFR EDMR HO FRQWURO GH GLIHUHQWHV SURPRWRUHV (VWDV SODQWDV H[SUHVDQ HO WUDQVFULSWR HVSHUDGR \ DFXPXODQ OD SURWHtQD 6)$ D QLYHOHV VXSHULRUHV DO GHO WRWDO GH SURWHtQD VROXEOH 6LQ HPEDUJR GHVGH HO SXQWR GH YLVWD QXWULFLRQDO ORV YDORUHV REWHQLGRV D~Q HVWiQ OHMRV GHO ySWLPR TXH GHEHUi VHU GHO DO GHO WRWDO GH SURWHtQD VROXEOH (V FUXFLDO SRU OR WDQWR GHVDUUROODU HVWUDWHJLDV TXH SHUPLWDQ DOFDQ]DU HVWRV QLYHOHV D Q GH H[SORWDU HO Pi[LPR SRWHQFLDO GH OD WpFQLFD 2.1.4 Manipulacin de la biosntesis de taninos condensados /RV WDQLQRV FRQGHQVDGRV SURDQWRFLDQDV VRQ FRPSXHVWRV SROLPpULFRV GHULYDGRV GHO PHWDEROLVPR IHQLOSURSDQRLGH VLQWHWL]DGRV SRU OD YtD PHWDEyOLFD GH ORV DYRQRLGHV 'HVGH HO SXQWR GH YLVWD DJURQyPLFR VRQ LPSRUWDQWHV HQ ODV OHJXPLQRVDV IRUUDMHUDV GRQGH SXHGHQ FRQVLGHUDUVH EHQHFLRVRV R SHUMXGLFLDOHV GH DFXHUGR D ORV QLYHOHV HQFRQWUDGRV HQ OD SODQWD 1LYHOHV GH WDQLQRV FRQGHQVDGRV VXSHULRUHV DO GHO SHVR VHFR VRQ SHUMXGLFLDOHV DFWXDQdo como factores antinutritivos y generando reFKD]R SRU SDUWH GHO DQLPDO (Q FDQWLGDGHV PRGHUDGDV PHMRUDQ OD FDOLGDG GHO IRUUDMH \D TXH UHGXFHQ HO PHWHRULVPR HPSDVWH SRU GLVUXSFLyQ GH OD HVSXPD FDXVDGD SRU ODV SURWHtQDV HQ HO UXPHQ GLVPLQX\HQ OD SpUGLGD GH SURWHtQDV GHELGDV D GHVDPLQDFLyQ PLFURELDQD \ UHGXFHQ OD FDUJD GH SDUiVLWRV HQ HO DQLPDO /DV HVWUDWHJLDV PROHFXODUHV XWLOL]DGDV SDUD OD PDQLSXODFLyQ GH OD ELRVtQWHVLV GH WDQLQRV VH han orientado hacia la introduccin de taninos condensados en alfalfa y trbol blanco, y a su reduccin en leguminosas que tienen altos contenidos. Estas estrategias se basan en la GLVSRQLELOLGDG GH JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD ELRVtQWHVLV GH DQWRFLDQDV TXH DIHFWDQ ODV HWDSDV FRPXQHV HQ OD ELRVtQWHVLV GH DYRQRLGHV \ OD VXSRVLFLyQ GH TXH pVWRV IXQFLRQDUiQ HQ OD ELRsntesis de taninos. El estudio de mutantes de la va metablica GH ORV DYRQRLGHV HQ Arabidopsis SURSRUFLRQy abundante informacin acerca de la identidad de las enzimas involucradas en la sntesis de WDQLQRV HQ HVWD HVSHFLH (VWR SHUPLWLy HO FORnado, entre otros, de los genes CHS, CHI, F3H
y DFR \ GH OD LGHQWLFDFLyQ \ FORQDGR GHO JHQ BAN (BANYULS TXH SDUHFH VHU HVSHFtFR de la va de biosntesis de taninos. Por otro lado se ha intentado la regulacin negativa o SRVLWLYD GH HQ]LPDV FODYH TXH UHJXODQ HVWD YtD chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 UHGXFWDVD /$5 R OD H[SUHVLyQ GH JHQHV UHJXODGRUHV TXH WLHQHQ XQ DFFLRQDU SOHLRWUySLFR FRQ HIHFWRV D YDULRV QLYHOHV IHQRWtSLFRV 8Q HMHPSOR GH HVWR OR FRQVWLWX\H OD WUDQVIRUPDFLyQ GH SODQWDV GH Lotus corniculatus con el gen regulatorio Sn de maz, que result en una disminucin del contenido de taninos en hojas, conjuntamente con un aumento del nivel de los mismos en raz. La alfalfa carece de taninos condensados HQ KRMDV \ WDOORV SRU HOOR SXHGH FDXVDU PHWHRrismo en los rumiantes que la consumen. La SUHVHQFLD GH HVWRV DYRQRLGHV HQ ODV VHPLOODV GHPXHVWUD TXH HVWD HVSHFLH FRQWLHQH WRGRV ORV JHQHV QHFHVDULRV SDUD OD VtQWHVLV GH ORV PLVPRV /D LGHQWLFDFLyQ \ HO FORQDGR GH ORV JHnes involucrados en la biosntesis de taninos HQ VHPLOODV GH DOIDOID SHUPLWLUiQ PDQLSXODU VX H[SUHVLyQ HQ KRMDV 2.2 Resistencia a plagas y enfermedades /RV SDWyJHQRV \ ODV SODJDV SXHGHQ GLVPLQXLU FRQVLGHUDEOHPHQWH OD SURGXFFLyQ OD SHUVLVWHQFLD HO YDORU QXWULWLYR \ OD SDODWDELOLGDG GH ODV SODQWDV IRUUDMHUDV (Q ORV ~OWLPRV GLH] DxRV VH KDQ GHVDUUROODGR YDULDV HVWUDWHJLDV SDUD PDQLSXODU OD UHVLVWHQFLD $ FRQWLQXDFLyQ hablaremos GH DOJXQRV HMHPSORV 2.2.1 Transgnesis para incrementar la resistencia a enfermedades fngicas El ataque de hongos a las hojas y sistePDV UDGLFDOHV SURYRFDQ GDxRV TXH DIHFWDQ HO establecimiento, disminuyen el rendimiento, OD FDOLGDG \ OD SHUVLVWHQFLD GH ODV SODQWDV /D H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH JHQHV TXH FRGLFDQ SURWHtQDV DQWLI~QJLFDV $)3V HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV EDMR SURPRWRUHV HVSHFtFRV GH yUJDQR R LQGXFLEOHV SRU HO SDWyJHQR VH KD ORJUDGR en leguminosas, como alfalfa y trbol blanco. (VSHFtFDPHQWH VH REWXYLHURQ SODQWDV GH DOIDOID TXH H[SUHVDQ XQD TXLWLQDVD GH DUUR] TXH SRGUtD KDFHUODV UHVLVWHQWHV DO DWDTXH GH Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii.
Hongos como Phytophthora clandestina, Kabatiella caulivora, Rhizoctonia solani y Fusarium VSS TXH DWDFDQ D YDULDV HVSHFLHV GH WUpboles, donde no existen fuentes de resistencia QDWXUDO SURYRFDQ FXDQWLRVDV SpUGLGDV HFRQyPLFDV HQ $XVWUDOLD 6H KDQ LGHQWLFDGR FXDWUR SURWHtQDV DQWLI~QJLFDV GLIHUHQWHV TXH HQ HQVDyos in vitro, demostraron ser efectivas contra HVWRV SDWyJHQRV /RV JHQHV FRGLFDQWHV VH XWLOL]DURQ LQGLYLGXDOPHQWH R FRPELQDGRV SDUD REWHQHU SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WUpERO VXEWHUUiQHR (VWR EULQGDUtD XQD PD\RU SURWHFFLyQ VXVWDQFLDO FRQWUD XQ DPSOLR HVSHFWUR GH KRQJRV SDWyJHQRV 5HFLHQWHPHQWH VH REWXYLHURQ SODQWDV GH IHVtuca alta con elevados niveles de resistencia a R. solani y a P. grisea, mediante la transformacin gentica simultanea con cuatro genes: DOIDOID , 3 glucanasa AGLU1, fago T4 lisozima, dermaseptin rana, y arroz Pi9. 2.2.2 Transgnesis para incrementar la resistencia a enfermedades virales La mayora de los mtodos clsicos utilizaGRV SDUD SUHYHQLU ODV LQIHFFLRQHV YLUDOHV VRQ ODboriosos y econmicamente inviables. Se han LGHQWLFDGR IXHQWHV SRWHQFLDOHV GH WROHUDQFLD R UHVLVWHQFLD HQ DOIDOID \ HQ XQDV SRFDV HVSHFLHV de Trifolium SHUR QR H[LVWH XQD UHVLVWHQFLD QDtural a estos virus que sea transferible, efectiva \ GXUDEOH \ TXH SXHGD VHU LQFRUSRUDGD D FXOWLvares de leguminosas forrajeras. La tecnologa JpQLFD HV XQD RSFLyQ DWUDFWLYD SDUD ORJUDU HVWH REMHWLYR \D TXH SHUPLWH VRUWHDU EDUUHUDV LQWHUHVSHFtFDV GHVDUUROODU UHVLVWHQFLDV PXOWLJpQLFDV \ PDQLSXODU QLYHOHV \ VLWLRV GH H[SUHVLyQ /D WUDQVJpQHVLV VH KD XWLOL]DGR SDUD GHVDUUROODU UHVLVWHQFLD HIHFWLYD \ GXUDEOH HQ XQ DPSOLR UDQJR GH HVSHFLHV YHJHWDOHV 9LUXV FRPR HO GHO PRVDLFR GH OD DOIDOID DOIDPRYLUXV $09 HO GHO PRVDLFR GHO WUpERO EODQFR SRWH[YLUXV :&09 \ HO GHO DPDULOODPLHQWR GH ODV QHUYDGXUDV SRW\YLUXV &<99 DIHFWDQ negativamente el crecimiento y desarrollo de las leguminosas. Se estima que combinados FDXVDQ SpUGLGDV D OD LQGXVWULD UXUDO DXVWUDOLDQD SRU PiV GH PLOORQHV GH GyODUHV SRU DxR Cada uno de ellos infecta individualmente a un JUDQ Q~PHUR GH HVSHFLHV GLVWULEXLGDV SRU WRGR HO PXQGR 8QD LQWHUHVDQWH DSOLFDFLyQ GHO PHMRramiento molecular fue el desarrollo de trbol EODQFR LQPXQH DO YLUXV $09
Los virus que se encuentran con frecuencia en gramneas forrajeras son el de enanismo, GH DPDULOODPLHQWR GH OD FHEDGD %,'9 \ HO PRVDLFR GHO UDLJUiV 509 /D LQIHFFLyQ GH %,'9 SURYRFD GLVPLQXFLRQHV HQ HO UHQGLPLHQWR GH KDVWD XQ PLHQWUDV TXH HO UDQJR GH 509 YD GHO DO /D LQIHFFLyQ FRQ 509 WDPELpQ UHGXFH OD FRPSHWLWLYLGDG GHO UDLJUiV SHUHQQH como resultado de un mal establecimiento y XQD UHGXFLGD SHUVLVWHQFLD 2.2.3 Transgnesis para incrementar la resistencia a plagas /DV SODJDV SXHGHQ GDxDU D ODV SODQWDV GLUHFtamente al alimentarse del follaje o las races, R LQGLUHFWDPHQWH SRU WUDQVPLVLyQ GH SDWyJHQRV PLHQWUDV DFFLRQDQ VREUH OD SODQWD (Q SDVWXUDV LQIHFWDGDV SRU GHQVDV SREODFLRQHV GH LQVHFWRV SODJD VH SURGXFHQ GLVPLQXFLRQHV HQ OD SURGXFFLyQ GH PDWHULD VHFD TXH YDQ GHO DO 9DULRV LQVHFWRV FRPR Wiseana spp, Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus, Sminthurus viridis, Sitona spp, Coleophora spp, Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp SXHGHQ FDXVDU GDxRV VLJQLFDWLYRV D OHJXPLQRVDV \ JUDPtQHDV $ Q GH LQFUHPHQWDU OD UHVLVWHQFLD D los mismos se han utilizado distintos enfoques transgnicos. Uno de ellos es la utilizacin de OD SURWHtQD FULVWDOLQD H LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV de Bacillus thuringiensis (Bt 3RU HMHPSOR VH REWXYLHURQ SODQWDV GH WUpERO EODQFR TXH H[SUHsan un gen quimrico Bt cry %D PRGLFDGR \ acumulan en las hojas la delta endotoxina soluble. La alimentacin de larvas de Wiseana con KRMDV GH HVWDV SODQWDV SURPRYLy OD LQKLELFLyQ en la ingesta, redujo el crecimiento de las larYDV \ RFDVLRQy PD\RU PRUWDOLGDG DO FRPSDUDUODV FRQ ODUYDV DOLPHQWDGDV FRQ SODQWDV FRQWURO En alfalfa (Medicago sativa L.) tambin se KD ORJUDGR REWHQHU SODQWD WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ HQ JHQ cryIA FRQ HO Q GH UHGXFLU HO DWDque de la isoca de la alfalfa (Colias lesbis F.). 2WUR HMHPSOR OR FRQVWLWX\H OD XWLOL]DFLyQ GH LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV FRPR HO LQKLELGRU GH WULSVLQD SDQFUHiWLFD ERYLQD R DSURWLQLQD HQ WUpERO EODQFR GRQGH OD H[SUHVLyQ HQ KRMD D QLYHOHV GH GH SURWHtQD VROXEOH UHGXFH HO DWDTXH SRU ODV ODUYDV GH Wiseana. 2WUD HVWUDWHJLD SDUD SURWHJHU FRQWUD LQVHFWRV SODJD VHUtD OD WUDQVIRUPDFLyQ LQGLUHFWD HQ JUDPtQHDV XWLOL]DQGR XQ HQGyWR PLFURRUJD-
nismo que vive y se desarrolla dentro de los WHMLGRV GH OD SODQWD PRGLFDGR FRPR SRGUtD ser Neotyphodium. /DV FHSDV PRGLFDGDV UHVXOWDUtDQ VHJXUDV SDUD ORV UXPLDQWHV TXH ODV FRQVXPDQ SHUR VHUtDQ FDSDFHV GH H[SUHVDU \ VHFUHWDU SURWHtQDV LQVHFWLFLGDV WDOHV FRPR WR[Lnas Bt o LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV TXH SURWHMDQ D ODV JUDPtQHDV IRUUDMHUDV GH ODV SODJDV 2.3 Crecimiento y desarrollo 2.3.1 Manipulacin de alergenos del polen /D HEUH GHO KHQR \ HO DVPD DOpUJLFR HVWDFLRQDO GHELGR DO SROHQ GH ODV JUDPtQHDV VRQ HQIHUPHGDGHV DPELHQWDOHV TXH DIHFWDQ DO GH OD SREODFLyQ HQ FOLPDV WHPSODGR IUtRV (O SROHQ GH UDLJUiV HV XQR GH ORV PiV DEXQGDQWHV HQ HVWDV UHJLRQHV VLHQGR HO SULQFLSDO DOHUJHQR SDUD PiV GHO GH ORV SDFLHQWHV DOpUJLFRV (VWH SROHQ FRQWLHQH SRU OR PHQRV FODVHV SULQFLSDOHV GH SURWHtQDV DOHUJpQLFDV FDGD XQD GH ODV FXDOHV HVWi FRQVWLWXLGD SRU P~OWLSOHV isoformas inmunolgicamente indistinguibles que involucran 17 alergenos de tamao variaEOH $O PHQRV XQD SURWHtQD GH FDGD XQD GH HVtas clases ha sido aislada y caracterizada en GHWDOOH 6H KDQ DLVODGR FORQHV GH $'1F SDUD HO SULQFLSDO DOHUJHQR GHO UDLJUiV Lolp1, Lolp2 y Lolp5 (Q VH REWXYLHURQ ODV SULPHUDV SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH UDLJUiV WUDQVIRUPDGDV con versiones antisentido de los genes Lolp1 y Lolp2 EDMR HO FRQWURO GH XQ SURPRWRU HVSHFtFR GHO SROHQ D Q GH REWHQHU XQD UHJXODFLyQ QHgativamente los alergenos del mismo. Estudios UHDOL]DGRV FRQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV Lolp1 y Lolp2 revelaron una disminucin en los niveles GH H[SUHVLyQ GH ORV DOHUJHQRV HQ HO SROHQ /DV SODQWDV GH UDLJUiV WUDQVIRUPDGDV FRQ Lolp1 HYLGHQFLDURQ XQ GHVDUUROOR UHSURGXFWLYR QRUPDO \ SROHQ YLDEOH (VWRV HVWXGLRV SHUPLWLUiQ FRPSUHQGHU D~Q PDV HO URO IXQFLRQDO GH HVWRV DOHUJHQRV HQ OD SODQWD \ H[SORUDU HO SRWHQFLDO SDUD OD REWHQFLyQ GH FXOWLYDUHV GH UDLJUiV KLSRDOHUJpQLFR 2.3.2 Manipulacin de cambio de fase y RUDFLyQ La disminucin del valor nutritivo en algunas IRUUDMHUDV SHUHQQHV VH HQFXHQWUD DVRFLDGD FRQ HO FRPLHQ]R GHO FUHFLPLHQWR GH ODV FDxDV RUDOHV OD RUDFLyQ \ OD VHQHVFHQFLD 3RU OR WDQWR OD FDOLGDG GHO IRUUDMH SRGUtD PHMRUDUVH LQKLELHQGR
OD SURGXFFLyQ GH FDxDV RUDOHV TXH VRQ SRFR digeribles, o retardando la senescencia. 6H KDQ LQIRUPDGR PRGLFDFLRQHV HQ HO WLHPSR GH RUDFLyQ HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV D WUDYpV GH OD UHJXODFLyQ GH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD LQLFLDFLyQ GHO PHULVWHPD RUDO /D H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH JHQHV GH Arabidopsis thaliana como LEAFY o APETALA1 FRQGXFHQ D XQ GHVDUUROOR SUHFR] FRPR VH KD REVHUYDGR HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH iODPR En A. thaliana, mutaciones en uno o ms de los genes involucrados en la determinacin GH LGHQWLGDG GHO PHULVWHPD RUDO FRQGXFHQ D XQ GHVDUUROOR RUDO LQFRPSOHWR R QXOR (VWR KD OOHYDGR D SHQVDU HQ OD SRVLELOLGDG GH FRQWURODU R LQKLELU OD RUDFLyQ HQ IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV UHJXODQGR QHJDWLYDPHQWH OD H[SUHVLyQ GH ORV ortlogos (genes que tienen la misma estructura y funcin, y un origen comn) de LEAFY o APETALA1. 8Q HMHPSOR HQ IRUUDMHUDV IXH OD LGHQWLFDFLyQ GH HO JHQ WHUPLQDO GH OD RUDFLyQ HQ L. perenne (LpTFL1 GH H[SUHVLyQ HVSHFLFD GH FLHUtos tejidos en Arabidopsis 2WUR EODQFR SDUD OD PDQLSXODFLyQ GHO GHVDUUROOR UHSURGXFWLYR HQ forrajeras es el gen indeterminate 1 (ID1). Este JHQ GHVHPSHxD XQ URO LPSRUWDQWH HQ HO FRQWURO GH OD LQLFLDFLyQ RUDO \ HQ HO PDQWHQLPLHQWR GH XQ HVWDGR RUDO GHWHUPLQDGR HQ PDt] 6X mutacin es la nica conocida en monocotileGyQHDV TXH EORTXHD HVSHFtFD \ VHYHUDPHQWH OD WUDQVLFLyQ KDFLD XQ FUHFLPLHQWR UHSURGXFWLYR Recientemente se aisl y caracteriz un ADNc GH SODQWDV GH UDLJUiV SHUHQQH KRPyORJR GH HVWH JHQ 6HUtD HVSHUDEOH TXH OD LQKLELFLyQ GH la transicin del estado vegetativo a la formaFLyQ GH FDxDV RUDOHV H LQRUHVFHQFLDV HQ JUDmneas incremente la calidad del forraje y, en consecuencia tambin disminuya la cantidad GH DOHUJHQRV GHO SROHQ /D LQKLELFLyQ R HO FRQWURO GH OD RUDFLyQ HQ IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV D WUDYpV GH VXSUHVLyQ antisentido de ortlogos de ID1 o LEAFY y APETALA1 SRGUtD LQFUHPHQWDU OD FDOLGDG \ PHMRUDU ORV SDWURQHV GH FUHFLPLHQWR HVWDFLRQDO 3RU RWUR ODGR UHSUHVHQWDUtDQ XQD YtD SDUD OD FRQWHQFLyQ GH WUDQVJHQHV 3DUD OD SURGXFFLyQ GH VHPLOOD HVWH EORTXHR GH OD RUDFLyQ GHEHUtD VHU UHYHUWLGR 8QD SRVLELOLGDG SDUD ORJUDU HVWH Q VHUtD OD XWLOL]DFLyQ GH XQ SURPRWRU LQGXFLEOH SDUD FRQWURODU OD VXSUHVLyQ
6H KDQ XWLOL]DGR GLIHUHQWHV HQIRTXHV SDUD OD PDQLSXODFLyQ GHO GHVDUUROOR UHSURGXFWLYR TXH SRGUtDQ FRQGXFLU D XQ EORTXHR GH OD RUDFLyQ DO GHVDUUROOR GH OD DSRPL[LV WLSR GH UHSURGXFFLyQ DJiPLFD FRP~Q HQ FLHUWDV HVSHFLHV GH gramneas) y androesterilidad (esterilidad de OD SDUWH PDVFXOLQD GH OD SODQWD TXH DGHPiV SRVLELOLWDUtDQ HO PDQWHQLPLHQWR GH ORV WUDQVJHQHV (VWR HV GH SDUWLFXODU LPSRUWDQFLD SDUD IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV GH SROLQL]DFLyQ DELHUWD PHGLDGD SRU HO YLHQWR \D TXH OD GLVSHUVLyQ GHO SROHQ HV XQ IDFWRU LPSRUWDQWH HQ OD HYDOXDFLyQ de riesgo de las gramneas genticamente moGLFDGDV 2.3.3 Manipulacin de la senescencia 6H KD REVHUYDGR HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH OD SURGXFFLyQ DXWRUUHJXODGD GH FLWRFLQLnas inhibe la senescencia foliar (envejecimiento de la hoja que culmina en la muerte de la misma). Este sistema se basa en la utilizacin GH XQ SURPRWRU HVSHFtFR GH VHQHVFHQFLD GH A. thaliana HO 6$* TXH FRQWUROD OD H[SUHVLyQ WUDQVJpQLFD GH XQ JHQ SDUD OD LVRSHQWHnil transferasa (ipt) de Agrobacterium tumefaciens. (O SURGXFWR GH HVWH JHQ FDWDOL]D XQ SDVR HQ OD ELRVtQWHVLV GH FLWRFLQLQDV /DV SODQWDV TXH H[SUHVDQ HVWH JHQ SUHVHQWDQ XQ UHWUDVR HQ OD senescencia foliar y no exhiben anomalas de QLQJ~Q WLSR (Q WUpERO EODQFR JHQHV DQiORJRV de ipt quimricos EDMR HO FRQWURO GH SURPRWRUHV UHJXODGRV SRU GHVDUUROORV DVRFLDGRV D VHQHVFHQFLD UHWDUGDQ VLJQLFDWLYDPHQWH OD VHQHVFHQFLD /DV SODQWDV WUDQVIRUPDGDV SUHVHQWDURQ un aumento relativo en nmero de hojas, en la longitud de los estolones y en el rea foliar WRWDO HQ FRPSDUDFLyQ FRQ SODQWDV FRQWURO 2WUR FDVR HV OD WUDQVIRUPDFLyQ GH SODQWDV GH Festuca arundinacea con el mismo gen ipt Estas SODQWDV PRVWUDURQ XQ DXPHQWR FRQVLGHUDEOH HQ el nmero de macollos, en los niveles de cloUROD D \ E \ HQ OD WROHUDQFLD DO IUtR OR FXDO VH WUDGXMR HQ SODQWDV PiV YLJRURVDV \ TXH D EDMDV WHPSHUDWXUDV SHUPDQHFHQ YHUGHV SRU PiV WLHPSR 2.4 Agricultura molecular /DV SODQWDV WUDQVJpQLFDV SXHGHQ VHU XWLOL]DGDV SDUD H[SUHVDU SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV heterlogas y biomolculas, siendo sta una
DOWHUQDWLYD LQWHUHVDQWH HQ UHHPSOD]R GH ORV VLVWHPDV PLFURELDQRV /D SHUHQQLGDG OD SURGXFFLyQ SRWHQFLDO GH ELRPDVD OD FDSDFLGDG GH MDU HO QLWUyJHQR ELROyJLFR \ OD KDELOLGDG SDUD FUHFHU HQ iUHDV PDUJLQDOHV TXH SRVHHQ ODV IRUUDMHUDV HQ SDUWLFXODU ODV OHJXPLQRVDV ODV KDFH DWUDFWLYDV SDUD HVWH Q /D GLVSRQLELOLGDG GH WHFQRORJtDV TXH SHUPLWDQ DOFDQ]DU QLYHOHV GH H[SUHVLyQ HOHYDGRV \ FRQWHQHU ORV WUDQVJHQHV SHUPLWLUtD XWLOL]DU D ODV IRUUDMHUDV FRPR ELRUUHDFWRUHV SDUD OD REWHQFLyQ GH HQ]LPDV LQGXVWULDOHV SURGXFWRV IDUPDFpXWLFRV YDFXQDV DQWLFXHUSRV \ SOiVWLFRV ELRGHJUDGDEOHV HQWUH otros. La alfalfa tiene ciertas caractersticas que la convierten en un interesante bioreactor. (QWUH HOODV VH GHVWDFDQ OD SHUHQQLGDG \ OD FDSDFLGDG GH SURGXFLU GRV y WUHV FRVHFKDV HQ HO ao, existiendo adems la tecnologa adecuaGD SDUD H[WUDHU ODV SURWHtQDV GH LQWHUpV GHMDQGR XQ UHVLGXR XWLOL]DEOH SDUD OD DOLPHQWDFLyQ GHO JDQDGR 6H KDQ GHVDUUROODGR \ HYDOXDGR SODQWDV GH DOIDOID WUDQVJpQLFDV SURGXFWRUDV GH HQzimas microbianas involucradas en la degradacin industrial de lignina y celulosa, entre otros. (VWH FXOWLYR WDPELpQ KD VLGR XWLOL]DGR SDUD OD SURGXFFLyQ GH SROtPHURV ELRGHJUDGDEOHV FRPR HO SROLKLGUR[LEXWLUDWR 3+% PHGLDQWH OD LQWURduccin de tres genes de Ralstonia eutropha. (YDOXDFLyQ D FDPSR GH SODQWDV IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV $ Q GH GHWHUPLQDU OD HVWDELOLGDG HQ OD H[SUHVLyQ GH ORV WUDQVJHQHV HYDOXDU ORV QXHYRV IHQRWLSRV H LGHQWLFDU ORV HYHQWRV GH WUDQVIRUPDFLyQ DGHFXDGRV SDUD HO GHVDUUROOR GH JHUPRSODVPD \ FXOWLYDUHV WUDQVJpQLFRV HV QHFHVDULR UHDOL]DU HQVD\RV GH FDPSR SODQLFDGRV HQ SULQFLSLR HQ SHTXHxD HVFDOD 6ROR GHVSXpV GH KDEHU UHDOL]DGR HVWDV HYDOXDFLRQHV VH SXHGHQ LQWHJUDU HVWRV PDWHULDOHV HQ SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR PROHFXODU SDUD HO GHVDUUROOR GH FXOWLYDUHV WUDQVJpQLFRV 8Q HMHPSOR LOXVWUDWLYR GH XQ GLVHxR SDUD HQVD\RV GH FDPSR HQ HVFDOD UHGXFLGD HV HO GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WUpERO EODQFR LQPXQHV al virus del mosaico de la alfalfa. En este enVD\R VH WXYLHURQ HQ FXHQWD LPSRUWDQWHV FDUDFWHUtVWLFDV GH ELRVHJXULGDG FRPR SRU HMHPSOR OD SUHVHQFLD GH XQD ]RQD GH GRV KHFWiUHDV sembradas con leguminosas forrajeras que
se sabe que no se cruzan con el trbol blanco. El uso de leguminosas forrajeras como el trbol rojo, trbol de Persia y alfalfa en esta zona buffer, sembradas en bandas alternadas, asegura que haya un elevado nmero de OHJXPLQRVDV QR WUDQVJpQLFDV RUHFLHQGR HQ HO HQVD\R HQ HO SHUtRGR FUtWLFR HQ TXH HVWiQ RUHFLHQGR ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV PRWLYR GHO H[SHULPHQWR /DV GLPHQVLRQHV GH HVWD ]RQD buffer fueron diseadas teniendo en cuenta consideraciones tales como la conducta de ODV DEHMDV FRPR SROLQL]DGRUDV GHO WUpERO EODQFR OD GLVSHUVLyQ GHO SROHQ \ GHWHUPLQDFLRQHV GH XMR JpQLFR XWLOL]DQGR XQ JHQ PDUFDGRU GH fcil trazabilidad (denominado Feathermark). A Q GH GHWHUPLQDU HO XMR JpQLFR GRV KLOHUDV GH trbol blanco no transgnico se incluyeron en HO GLVHxR URGHDQGR HO SHUtPHWUR GHO HQVD\R \ ODV SDUFHODV FHQWUDOHV FRQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV /DV VHPLOODV FRVHFKDGDV GH ODV SODQWDV de trbol blanco no transgnico de estas dos hileras se analizaron utilizando una combinacin de resistencia a antibitico (resistencia a * PHGLDGD SRU XQ JHQ npt2 ubicado en el 7$'1 LQWHJUDGR HQ HO JHQRPD GH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV \ 3&5 SDUD GHWHFWDU OD SUHVHQFLD del gen marcador de seleccin. Los resultados GH HVWH DQiOLVLV FRQUPDURQ TXH HVWH GLVHxR GH FDPSR HV DGHFXDGR SDUD OD HYDOXDFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV )LJXUD ,QWHJUDFLyQ GH SODQWDV IRUUDMHUDV WUDQVJpQLFDV HQ SURJUDPDV GH mejoramiento y desarrollo de cultivares WUDQVJpQLFRV /RV HMHPSORV FLWDGRV PiV DUULED DFHUFD GHO desarrollo de una serie de eventos de transformacin en leguminosas y gramneas forrajeras FRQVWLWX\HQ XQD SUXHED IHKDFLHQWH GH OD IXQcionalidad de esta tecnologa. El desafo actual es utilizar esta tecnologa y las herramientas PROHFXODUHV DFWXDOHV SDUD WUDQVIHULU JHQHV YDOLRVRV GH PDQHUD P~OWLSOH R LQGLYLGXDO 6H WUDWD de generar variabilidad gentica y obtener gerPRSODVPD WUDQVJpQLFR elite H LQFRUSRUDU HVWRV IDFWRUHV HQ SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR SDUD REWHQHU FXOWLYDUHV +R\ H[LVWHQ HVWUDWHJLDV HFLHQWHV SDUD OD LQWURJUHVLyQ GH WUDQVJHQHV elite SDUD OD REWHQFLyQ GH FXOWLYDUHV VLQWpWLFRV )LJXra 3B). En la Figura 3B se muestra la estrategia
HQWUH OD SURJHQLH 7 (WDSD LGHQWLFDFLyQ SRU 3&5 FXDQWLWDWLYD R FUX]D GH SUXHED GH ODV SODQWDV 7 TXH VRQ KRPRFLJRWDV SDUD ORV WUDQVJHQHV (WDSD 3RU ~OWLPR ODV SODQWDV elite KRPRFLJyWLFDV SDUD ORV WUDQVJHQHV VRQ VHPEUDGDV SDUD VX VHOHFFLyQ HQ XQ FULDGHUR MXQWR FRQ OtQHDV SDUHQWDOHV elite no transgnicas. De HVWD PDQHUD VH LGHQWLFDUiQ ORV QXHYRV SDrentales de los cultivares sintticos transgniFRV H[SHULPHQWDOHV TXH SRVWHULRUPHQWH VHUiQ evaluados en distintos ambientes. 3 Genmica (O PHMRUDPLHQWR GH OD SODQWDV IRUUDMHUDV KD HQWUDGR HQ OD HUD JHQyPLFD OR FXDO VLJQLFD que se cuenta con gran cantidad de nuevas KHUUDPLHQWDV \ WHFQRORJtDV SDUD HO GHVFXEULPLHQWR GH JHQHV \ SDUD HO DQiOLVLV JOREDO GH ORV JHQRPDV 7RGR HVWR DSRUWDUi LQIRUPDFLyQ DFHUFD GH WRGRV ORV DVSHFWRV GHO FUHFLPLHQWR YHJHWDO GHVDUUROOR GLIHUHQFLDFLyQ \ UHVSXHVWDV a estreses biticos y abiticos, revolucionando HO PHMRUDPLHQWR YHJHWDO \ OD SURGXFFLyQ 0LOHV GH HWLTXHWDV GH VHFXHQFLDV H[SUHVDGDV (67V Expressed Sequence Tag KDQ VLGR HO SXQWR GH SDUWLGD SDUD GLOXFLGDU OD IXQFLyQ GH PLOHV GH JHQHV YHJHWDOHV SHUPLWLHQGR OD FUHDFLyQ GH EDVHV GH GDWRV GH ORV SULQFLSDOHV FXOWLYRV SRVLELOLWDQGR OD LGHQWLFDFLyQ FDUDFWHUL]DFLyQ IXQFLRQDO \ XVR GH JHQHV YDOLRVRV SDUD ORV VLVWHPDV GH SURGXFFLyQ GH IRUUDMH 3.1 Descubrimiento de genes y microarreglos para el anlisis de la H[SUHVLyQ GH JHQHV HQ SODQWDV IRUUDMHUDV /DV HVSHFLHV PRGHOR SDUD ODV FXDOHV VH KDQ HQFDUDGR SUR\HFWRV GH JHQyPLFD EDVDGRV HQ ESTs son Lotus japonicus y Medicago truncatula. Se han generaron mas 220.000 ESTs de M. truncatula SRU FRQVRUFLRV LQWHUQDFLRQDOHV QDQFLDGRV SRU HO P~OWLSOHV HQWHGLGDV GH GLYHUVRV SDtVHV 2WUR SURJUDPD HQWUH Agriculture Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch Limited (Nueva Zelanda) gener mas de 100.000 (67V GH FXOWLYRV IRUUDMHURV FODYH SDUD OD DJULFXOWXUD GH FOLPD WHPSODGR FRPR VRQ HO UDLJUiV SHUHQQH L. perenne) y el trbol blanco (T. repens). Para ello se secuenciaron a gran escala clones seleccionados al azar de genotecas de $'1F TXH UHSUHVHQWDEDQ XQ DPSOLR UDQJR GH
Figura 3. A) (VTXHPD GH OD OLEHUDFLyQ D FDPSR D SHTXHxD HVFDOD GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WUpERO EODQFR LQPXQHV D $09
Figura. B) (VWUDWHJLD SDUD HO GHVDUUROOR GH JHUPRSODVPD HOLWH WUDQVJpQLFR GH WUpERO EODQFR LQPXQH D $09 EDVDGD HQ OD XWLOL]DFLyQ GH 3&5 FXDQWLWDWLYD SDUD GHWHFWDU ODV SODQWDV KRPRFLJRWDV SDUD ORV transgenes (npt2 y AMV4).
XWLOL]DGD SDUD OD REWHQFLyQ GH SODQWDV GH WUpbol blanco elites LQPXQHV D $09 KRPRFLJRWRV SDUD ORV WUDQVJHQHV ,QYROXFUD FUX]DV LQLFLDOHV de los eventos de transformacin elegidos lueJR GH VX HYDOXDFLyQ D FDPSR FRQ SODQWDV elite QR WUDQVJpQLFDV (WDSD VHOHFFLyQ SRU UHVLVWHQFLD D DQWLELyWLFR GH OD SURJHQLH TXH OOHYD HO transgn y est ligado al gen marcador npt2, o DQiOLVLV SRU 3&5 VHJXLGR SRU FUX]DV GLDOpOLFDV
rganos, estados de desarrollo y tratamientos H[SHULPHQWDOHV 0iV GH VHFXHQFLDV GH $'1 GH UDLJUiV SHUHQQH IXHURQ FDWHJRUL]DGDV funcionalmente. 'HQWUR GH HVWH SURJUDPD VH UHDOL]DURQ PLcroarreglosde ADNc de alta densidad (con JRWDVDUUHJOR SDUD VX XWLOL]DFLyQ HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH VHFXHQFLDV GH WUpEROHV \ raigrases (Figura 4). 8QD GH ODV DSOLFDFLRQHV GH HVWRV PLFURDUUHJORV EDVDGRV HQ (67V GH SODQWDV IRUUDMHUDV HV OD IHQRWLSLFDFLyQ PROHFXODU (VWR FRPSUHQGH HO DQiOLVLV GH SDWURQHV GH H[SUHVLyQ JOREDO R SDWURQHV GH H[SUHVLyQ HVSHFtFRV XWLOL]DQGR KLEULGDFLyQ FRQ VRQGDV FRPSOHMDV GH JHQRWLSRV FRQWUDVWDQWHV R SREODFLRQHV \ DPELHQWHV FRQWUDVWDQWHV 7RGR HVWR SXHGH XWLOL]DUVH SDUD integrar los datos de microarreglos con aqueOORV GH VHOHFFLyQ IHQRWtSLFD FRQYHQFLRQDO (O DQiOLVLV FRPSDUDWLYR GH VHFXHQFLDV \ datos de microarreglos de raigrs y trboles con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjunWDPHQWH FRQ ORV SURJUDPDV GH GHVFXEULPLHQWR
Figura 4. B) Anlisis de la imgen de los microarreJORV GH HWLTXHWDV H[SUHVDGDV GH $'1 (67V ,PDGene Software).
Figura 4. C) Microarreglos de ADNc de trbol blanFR XWLOL]DQGR 51$ GH KRMDV \ UDt] &RQUPDFLyQ SRU 1RUWKHUQ GH OD H[SUHVLyQ GH ORV JHQHV SDUD OD GLJLGURDYRQRO UHGXFWDVD \ XQD SURWHtQD HPEULyQLFD
Figura 4. A) 3HUOHV GH H[SUHVLyQ D WUDYpV GH PLFURDUUHJORV GH $'1 XWLOL]DQGR GRV FRORUDQWHV XRUHVFHQWHV &\ \ &\ SDUD PDUFDU GRV PXHVWUDV GH 51$ WRWDO SURYHQLHQWHV GH GLVWLQWDV VLWXDFLRQHV GH FUHFLPLHQWR R GHVDUUROOR SRU HMHPSOR SODQWDV FUHFLHQGR HQ OX] &\ \ SODQWDV FUHFLHQGR HQ RVFXULGDG &\ /XHJR GH OD KLEULGDFLyQ ORV SXQWRV marcados en verde indican los genes que se enFXHQWUDQ UHJXODGRV SRVLWLYDPHQWH FXDQGR ODV SODQtas se encuentran en condiciones de luz, aquellos PDUFDGRV HQ URMR FRUUHVSRQGHQ D ORV UHJXODGRV SRVLWLYDPHQWH FXDQGR VH KDOODQ HQ RVFXULGDG \ ORV TXH HVWiQ HQ DPDULOOR FRUUHVSRQGHUtDQ D DTXHOORV JHQHV TXH HVWiQ UHJXODGRV SRVLWLYDPHQWH HQ DPbas situaciones.
Figura 4. D) 3HUOHV GH H[SUHVLyQ GH JHQHV GH UDLJUiV FRPSDUDQGR JHQHV TXH VH H[SUHVDQ HQ WDOOR y raz.
de ESTs en M. Truncatula KDQ DSRUWDGR LQIRUPDFLyQ DFHUFD GH ORV DVSHFWRV FRQVHUYDGRV y divergentes en la organizacin y funcin del genoma de gramneas y leguminosas. 6LPELR \ SDWRJHQyPLFD Las leguminosas y gramneas ofrecen la SRVLELOLGDG GH HVWXGLDU D QLYHO JHQyPLFR LQWHUDFFLRQHV GH GLVWLQWRV WLSRV FRPR SRU HMHPSOR SODQWDSDWyJHQR VLPELRVLV OHJXPLQRVDEDFWHULD MDGRUD GH QLWUyJHQR DVRFLDFLRQHV OHJXminosa/microrriza y endosimbiosis gramnea/ HQGyWR /D LQIRUPDFLyQ REWHQLGD HQ HVWRV HVWXGLRV VHUi GH JUDQ YDORU SDUD GHVDUUROODU UHVLVWHQFLD D SDWyJHQRV \ PHMRUDU ODV DVRFLDFLRQHV EHQHFLRVDV HQ ODV IRUUDMHUDV El trabajo de descubrimiento de genes en M. truncatula est orientado a estudiar la resSXHVWD GH OD SODQWD DQWH ORV SDWyJHQRV \ D FDUDFWHUL]DU GLIHUHQWHV VLVWHPDV SDWRJpQLFRV TXH incluyen hongos como Colletotrichum trifolii y Phytophthora medicaginis, y bacterias como Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae. Para mediados del 2000 el US M. truncatula Functional Genomics Project gener 27.000 VHFXHQFLDV GH $'1 TXH LQFOXtDQ (67V de hojas infectadas con Colletotrichum, ESTs de hojas infectadas con Phytophthora, (67V GH PLFRUUL]DV GH UDt] \ DSUR[LPDGDPHQWH VHFXHQFLDV GH raz de diferentes estadios luego de la inoculacin con Sinorhizobium meliloti, y de ndulos maduros y senescentes. 3RU RWUR ODGR H[LVWH XQ SUR\HFWR GH JHQymica funcional integrado tendiente a dilucidar los eventos conducentes a la nodulacin en las leguminosas utilizando L. japonicus como modelo. (VWH SURFHVR GH QRGXODFLyQ LQYROXFUD OD LQWHUDFFLyQ FRPSOHMD HQWUH JHQHV EDFWHULDQRV \ VXV SURGXFWRV FRQ SURFHVRV GH GHVDUUROOR HQ OD SODQWD TXH LQYROXFUDQ SHUFHSFLyQ \ transmisin de seales y morfognesis. El obMHWLYR HV FRPSUHQGHU OD FRQWULEXFLyQ JHQpWLFD GH OD SODQWD D HVWD VLPELRVLV D Q GH PHMRUDU ODV DVRFLDFLRQHV QDWXUDOHV EHQHFLRVDV SDUD OD agricultura y el ambiente. Este y otros recursos genticos de M. truncatula y L. japonicus conWULEXLUiQ VLJQLFDWLYDPHQWH D FRQRFHU \ FRPSUHQGHU ODV UHVSXHVWDV D SDWyJHQRV \ HVWUpV \ las interacciones de la rizsfera con las leguminosas forrajeras.
Agriculture Victioria-DNRE tambin ha enFDUDGR XQ SURJUDPD GH JHQyPLFD GH HQGyWRV de gramneas, focalizado en el descubrimiento GH JHQHV JUDPtQHDHQGyWR HQ OD DVRFLDFLyQ Festuca arundinacea/Neotyphodium coenophialum $ WUDYpV GH HVWH SURJUDPD VH KDQ JHQHUDGR DSUR[LPDGDPHQWH VHFXHQFLDV del hongo que se analizaron a travs de software GH E~VTXHGDV SRU KRPRORJtD \ VH FDUDFWHUL]DURQ IXQFLRQDOPHQWH (O SULQFLSDO LQWHUpV est dirigido al descubrimiento de genes invoOXFUDGRV HQ OD FRORQL]DFLyQ GHO KXpVSHG HQ HO DSRUWH GH QXWULHQWHV SDUD HO KRQJR HQGRItWLFR y en la biosntesis de metabolitos secundarios DFWLYRV \ VX UHJXODFLyQ (VWH SUR\HFWR WDPELpQ DSRUWDUi LQIRUPDFLyQ DFHUFD GH OD LQWHUDFFLyQ HQGyWRKXpVSHG DVt FRPR GH ORV PHFDQLVPRV VLROyJLFRV FRQGXFHQWHV D XQ LQFUHPHQWR HQ HO YLJRU GH OD SODQWD \ D XQD PD\RU WROHUDQcia a estreses. Estas herramientas genmicas \ HO FRQRFLPLHQWR JHQHUDGR SRVLELOLWDUiQ HO GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV SDUD PDQLSXODU OD DVRFLDFLyQ JUDPtQHDHQGyWR \ DVt LQFUHPHQWDU HO UHQGLPLHQWR GH OD SODQWD PHMRUDU OD WROHUDQFLD D HVWUHVHV ELyWLFRV \ DELyWLFRV \ DOWHUDU OD HVSHFLFLGDG HQGyWR KXpVSHG D Q GH EHQHFLDU D OD LQGXVWULD GHO FpVSHG \ GHO IRUUDMH (Q RWUR SUR\HFWR VLPLODU VH KDQ WUDWDGR GH aislar y caracterizar genes involucrados en la ELRVtQWHVLV GH LQGROGLWHUSHQRV \ HUJRSHSWLQDV en la asociacin Lolium perenne-N. lolii. Estos FRPSXHVWRV VRQ Wy[LFRV SDUD ORV PDPtIHURV Actualmente se conoce la base gentica de la YDULDFLyQ IHQRWtSLFD GH FLQFR FHSDV GH N. lolii FRQ GLIHUHQWHV SHUOHV GH H[SUHVLyQ GH OD WR[LQD /D SURWHFFLyQ GH ORV PHULVWHPDV GH Lolium GH XQ H[FHVR GH KHUELYRUtD HV YLWDO SDUD HO p[LWR UHSURGXFWLYR \ OD GLVWULEXFLyQ GH HVWD \ RWUDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV (O GHVDUUROOR GH DVRFLDFLRQHV VLPELyWLFDV HQWUH JUDPtQHDV \ HQGyWRV GHO JUXSR Epichlo/ Neotyphodium UHSUHVHQWD XQD IRUPD ~QLFD GH SURWHFFLyQ GRQGH HO KXpVSHG \ HO VLPELRQWH KDQ FRHYROXFLRQDGR SDUD EHQHFLR PXWXR (O KRQJR OH DSRUWD SURWHFFLyQ DO KXpVSHG D WUDYpV GH OD SURGXFFLyQ GH PHWDEROLWRV ELRSURWHFWRUHV HQ UHWULEXFLyQ SRU ORV QXWULHQWHV SDUD VX FUHFLPLHQWR El clonado de los genes de estas vas meWDEyOLFDV HV XQ REMHWLYR LPSRUWDQWH \D TXH VH FRQRFH SRFR DFHUFD GH OD HQ]LPRORJtD GH OD
biosntesis de toxinas y de las condiciones SDUD OD VtQWHVLV HQGRItWLFD GH HVWRV PHWDEROLWRV ex planta. ;HQRJHQyPLFD /D JHQyPLFD FRPSDUDWLYD EDVDGD HQ HO DQiOLVLV GH (67V GH YDULDV SODQWDV WROHUDQWHV D HVWUHVHV DELyWLFRV SHUPLWLUi OD LGHQWLFDFLyQ de redes de genes asociados con estreses ambientales tales como alta salinidad, sequa y EDMDV WHPSHUDWXUDV DVt FRPR OD GHWHUPLQDFLyQ de vas bioqumicas conservadas involucradas HQ ODV UHVSXHVWDV /D LQYHVWLJDFLyQ JHQyPLFD XWLOL]DQGR HVSHcies vegetales exticas, conocida como xenogenmica, incluye el descubrimiento de genes a travs del secuenciado de ESTs a gran esFDOD \ HO DQiOLVLV GH OD H[SUHVLyQ JOREDO GH JHnes con microarreglos basados en las mismas. (VWR SRVLELOLWDUi OD REWHQFLyQ GH JHQHV FODYH \ YDULDQWHV GH JHQHV GH SODQWDV H[yWLFDV PXchos de ellos nuevos y la determinacin de sus SDWURQHV GH H[SUHVLyQ HQ UHVSXHVWD D HVWUHVHV DELyWLFRV HVSHFtFRV 8Q SURJUDPD GH [HQRJHQyPLFD OOHYDGR D FDER SRU Agriculture Victioria-DNRE se encuentra abocado a seleccionar gramneas y leguminosas australianas nativas y exticas, DGDSWDGDV D HVWUHVHV DPELHQWDOHV H[WUHPRV
En este marco se han aislando y caracterizaGR JHQHV TXH SHUPLWHQ D HVWDV HVSHFLHV WROHrar estreses abiticos como sequa, salinidad y suelos de baja fertilidad. (QWUH ODV HVSHFLHV HVWXGLDGDV VH LQFOX\HQ gramneas australianas nativas, tales como las halotolerantes Agrostis adamsonii y A. robusta \ OD HVSHFLH WROHUDQWH D DOXPLQLR Microlaena stipoides 7DEOD 7DPELpQ LQFOX\H HVSHFLHV exticas como Deschampsia artanctica, una de ODV GRV ~QLFDV SODQWDV YDVFXODUHV QDWLYDV GH OD Antrtida. Estos descubrimientos facilitarn el desarrollo de estrategias efectivas de mejoraPLHQWR PROHFXODU TXH SHUPLWLUiQ LQFUHPHQWDU OD tolerancia a estreses abiticos en forrajeras y otros cultivos. 4 Resumen y conclusiones (Q ORV ~OWLPRV DxRV VH KD UHDOL]DGR XQ considerable progreso en el establecimiento de las metodologas requeridas para el mejoramiento molecular de plantas forrajeras. Numerosas estrategias biotecnolgicas estn siendo consideradas en relacin al mejoramiento de la calidad nutritiva a travs de la alteracin en la biosntesis de lignina, carbohidratos solubles y protoantocianas, y de la expresin regulada de protenas ricas en
aminocidos esenciales, resistentes al rumen. Tambin se pretende incrementar la resistencia a patgenos y plagas, PDQLSXODU HO FUHFLPLHQWR \ GHVDUUROOR D Q de incrementar la persistencia y demorar VHQHVFHQFLD LPSHGLU OD RUDFLyQ UHJXODU negativamente los alergenos del polen. Ms recientemente el creciente inters en la produccin de biocombustibles a partir de celulosa ha impulsado a la ingeniera gentica de ligninas para facilitar la liberacin de celulosa y hemicelulosa. Las primeras plantas forrajeras transgnicas estn siendo evaluadas a campo y se han seleccionado eventos de transformacin para el desarrollo de nuevos cultivares. /DV KHUUDPLHQWDV JHQyPLFDV SHUPLWHQ FRPSUHQGHU PHMRU OD JHQpWLFD VLRORJtD \ ELRTXtPLFD GH YDULRV SURFHVRV YHJHWDOHV FRPSOHMRV \ DFHOHUDU OD DSOLFDFLyQ GH HVWUDWHJLDV GH WHFQRORJtD JpQLFD SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH SODQWDV forrajeras. /D DSOLFDFLyQ GH KHUUDPLHQWDV \ PHWRGRORJtDV PROHFXODUHV SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH HVWDV HVSHFLHV FRPSOHPHQWD HQ JUDQ PHGLGD D OD VHOHFFLyQ HPStULFD EDVDGD HQ HO IHQRWLSR (VWDV HVWUDWHJLDV VRQ SURPLVRULDV VRODPHQWH FXDQGR VH ODV FRQVLGHUD GHQWUR GH XQ SURJUDPD GH PHMRUDPLHQWR /RV SURJUDPDV PiV H[LWRVRV VRQ DTXHOORV TXH LQFOX\HQ HTXLSRV PXOWLGLVFLSOLQDULR FX\R HVIXHU]R UHVXOWDUi FUtWLFR SDUD HO GHVDUUROOR GH FXOWLYDUHV GHVWLQDGRV DO PHUFDGR \ SDUD GH SODQWDV IRUUDMHUDV GHVWLQDdas a otros usos. /D LQYHVWLJDFLyQ JHQyPLFD HQ ODV SODQWDV IRUUDMHUDV SHUPLWH HO GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV TXH YDQ PiV DOOi GH ORV VLVWHPDV GH SURGXFFLyQ GH IRUUDMHV LQFUHPHQWDQGR VLJQLFDWLYDPHQWH HO YDORU GH ODV VHPLOODV \ GH ORV SURGXFWRV DJUtFRODV /D LQQLGDG GH JHQHV YHJHWDOHV TXH VH GHVFXEUHQ FRQWLQXDPHQWH UHSUHVHQWDQ un recurso invalorable. 5 Lecturas Recomendadas
Austin-Phillips S. and Ziegelhoffer, T. 2000. The SURGXFWLRQ RI YDOXHDGGHG SURWHLQV LQ WUDQVJHQLF DOIDOID ,Q 6SDQJHQEHUJ * HG 0ROHFXODU EUHHGLQJ RI IRUDJH FURSV .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 'RUGUHFKW &DSLWXOR Casler MD. y Kaeppler HF. 2000. Molecular EUHHGLQJ IRU KHUEDJH TXDOLW\ LQ IRUDJH FURSV
,Q 6SDQJHQEHUJ * HG 0ROHFXODU EUHHGLQJ RI IRUDJH FURSV .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 'RUGUHFKW &DSLWXOR Forster JW.; Jones ES.; Koelliker R.; Drayton MC.; Dumsday JL.; Dupal MP.; Guthridge KM.; Mohoney NL.; Van Zijll de Jong E. and Smith K 'HYHORSPHQW DQG LPSOHPHQWDWLRQ RI PROHFXODU PDUNHUV IRU IRUDJH FURS LPSURYHPHQW ,Q 6SDQJHQEHUJ * HG 0ROHFXODU EUHHGLQJ RI IRUDJH FURSV .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 'RUGUHFKW &DSLWXOR Gresshoff PM.; Men AE.; Maguire T.; Grimmond S.; Lohar D.; Ayanru S.; Meksem K.; Lightfoot D. and Stiller J. 2000. An integrated functional JHQRPLFV DQG JHQHWLFV DSSURDFK IRU WKH SODQWV IXQFWLRQ LQ V\PELRWLF QRGXODWLRQ ,Q 6SDQJHQEHUJ * HG 0ROHFXODU EUHHGLQJ RI IRUDJH FURSV .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 'RUGUHFKW &DSLWXOR Humphreys M. O 0ROHFXODU EUHHGLQJ IRU WKH JHQHWLF LPSURYHPHQW RI IRUDJH FURSV DQG WXUI Wageningen Academic Publishers, Netherlands. +XPSKUH\V 0: <DGDY 5 6 &DLUQV $- 7XUQHU /% +XPSKUH\V - \ 6NRW / 5HYLHZ $ changing climate for grassland research. New 3K\WRORJLVW Kalla R.; Chu P. y Spangenberg G. 2000. Molecular breeding of forage legumes for virus resistance. ,Q 6SDQJHQEHUJ * HG 0ROHFXODU EUHHGLQJ RI IRUDJH FURSV .OXZHU $FDGHPLF 3XEOLVKHUV 'RUGUHFKW &DSLWXOR Li X., Weng J., and Chapple C. ,PSURYHPHQW RI ELRPDVV WKURXJK OLJQLQ PRGLFDWLRQ 7KH 3ODQW -RXUQDO
V. CAPTULO 3 &DUDFWHUL]DFLyQ PROHFXODU GH OD apomixis y su aplicacin en la agricultura

Silvina C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz Qu es la apomixis $OJXQDV SODQWDV FRQ RUHV SUHVHQWDQ XQ PRGR DVH[XDO GH UHSURGXFFLyQ OODPDGR apomixis. Consiste en la formacin de semillas que contienen embriones genticamente idnWLFRV D OD SODQWD PDGUH VLQ TXH LQWHUYHQJDQ ORV SURFHVRV GH PHLRVLV \ IHFXQGDFLyQ /D DSRPL[LV IXH GHVFULSWD SRU SULPHUD YH] HQ HQ OD SODQWD DXVWUDOLDQD Alchornea ilicifolia SRU - 6PLWK &XDQGR XQ HMHPSODU IHPHQLQR GH HVWD HVSHFLH GLRLFD IXH OOHYDGR D ORV .HZ *DUGHQV GH /RQGUHV GHVGH $VLD OD SODQWD DLVODGD RUHFLy \ SURGXMR VHPLOODV HQ DEXQGDQFLD HQ DXVHQFLD GH XQ SURJHQLWRU PDVFXOLQR SRQLHQGR al carcter en evidencia. Paradjicamente, los SULPHURV H[SHULPHQWRV FRQ SODQWDV DSRPtFWLFDV IXHURQ UHDOL]DGRV HQ IRUPD LQYROXQWDULD SRU *UHJRU 0HQGHO TXLHQ XWLOL]y FUX]DV LQWHUHVSHFtFDV GH Hieracium SDUD LQWHQWDU FRQUPDU los resultados obtenidos en sus famosos estudios sobre la herencia en las arvejas de jardn. 0HQGHO DWULEX\y HUUyQHDPHQWH D XQD VXSXHVWD IUHFXHQWH DXWRSROLQL]DFLyQ OD IDOWD GH VHJUHgacin observada en varios cruzamientos. Hoy VDEHPRV TXH PXFKDV HVSHFLHV GHO JpQHUR Hieracium VRQ DSRPtFWLFDV 6H FRQVLGHUD TXH OD DSRPL[LV KD HYROXFLRQDGR FRPR XQ VLVWHPD GH UHSURGXFFLyQ DOWHUQDWLvo a la sexualidad a travs de la reformulacin GH VXV SURJUDPDV GH GHVDUUROOR 3RU HVR SDUD FRPSUHQGHU PHMRU VX IXQFLRQDPLHQWR HV QHFHVDULR FRPSDUDUOD FRQ OD UHSURGXFFLyQ VH[XDO /D VH[XDOLGDG HQ ODV DQJLRVSHUPDV FRPSUHQde la alternancia cclica entre los estados de HVSRUyWR OD SODQWD PLVPD Q \ JDPHWyWR HO JUDQR GH SROHQ \ HO VDFR HPEULRQDULR Q /D PHLRVLV TXH RFXUUH HQ ODV RUHV SRVLELOLWD la recombinacin y reduccin del contenido geQpWLFR \ GD OXJDU D OD IRUPDFLyQ GH ODV HVSRUDV IHPHQLQDV PHJiVSRUDV HQ HO yYXOR \ PDVFXOLQDV PLFUyVSRUDV HQ ODV DQWHUDV (Q OD PHJDV-
SRURJpQHVLV VH JHQHUDQ FXDWUR FpOXODV KDSORLGHV D SDUWLU GH XQD FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD TXH VH GLIHUHQFLD HQ OD QXFHOD GHO yYXOR (Q OD PD\RU SDUWH GH ODV DQJLRVSHUPDV WUHV GH HVWDV FpOXODV KDSORLGHV GHJHQHUDQ PLHQWUDV TXH OD UHVWDQWH FRQVWLWX\H OD PHJiVSRUD IXQFLRQDO 3RU HO SURFHVR GH PHJDJDPHWRJpQHVLV (una serie acotada de mitosis ordenadas), esta FpOXOD GHVDUUROOD XQ PHJDJDPHWyWR FRQRFLGR FRPR VDFR HPEULRQDULR (O VDFR HPEULRQDULR PiV FRP~Q HV HO GH WLSR Polygonum, formado SRU Q~FOHRV KDSORLGHV Q FRQWHQLGRV HQ VLHWH clulas, a saber: la ovoclula, dos sinrgidas, XQD FpOXOD FHQWUDO ELQXFOHDGD \ WUHV DQWtSRGDV 3RU RWUD SDUWH HQ ODV DQWHUDV ODV PLFUyVSRUDV GHVDUUROODQ ORV JUDQRV GH SROHQ PHGLDQWH XQ SURFHVR GH PLFURJDPHWRJpQHVLV (O SROHQ PDGXUR HVWi WtSLFDPHQWH LQWHJUDGR SRU WUHV FpOXODV KDSORLGHV Q GRV GH ODV FXDOHV FRQVWLWXyen los gametos masculinos. La otra tiene una funcin relacionada con el crecimiento del tubo SROtQLFR /D IRUPDFLyQ GH OD VHPLOOD UHTXLHUH GHO SURceso de doble fecundacin: un gameto masFXOLQR Q VH IXVLRQD FRQ OD RYRFpOXOD Q SDUD RULJLQDU DO FLJRWR Q $ SDUWLU GH HVWH FLJRWR se desarrolla el embrin. La clula central del VDFR HPEULRQDULR FRQ VXV GRV Q~FOHRV Q Q VH IXVLRQD FRQ HO RWUR JDPHWR PDVFXOLQR SDUD RULJLQDU HO HQGRVSHUPR $Vt OD IXVLyQ GH GRV JDPHWRV KDSORLGHV ~QLFRV GHULYDGRV GH OD GLVtribucin al azar del material gentico durante las meiosis masculina y femenina resulta en la JHQHUDFLyQ GH SURJHQLHV JHQpWLFDPHQWH GLYHUVDV (Q UHVXPHQ HQ OD UHSURGXFFLyQ VH[XDO OD PHLRVLV SURGXFH OD UHFRPELQDFLyQ JHQpWLFD GH ORV FDUDFWHUHV GH DPERV SURJHQLWRUHV \ JDPHWRV KDSORLGHV /D IHFXQGDFLyQ IXVLRQD GH PDnera aleatoria un gameto masculino con uno IHPHQLQR SDUD RULJLQDU XQ QXHYR LQGLYLGXR FRQ una constitucin gentica nica. /D DSRPL[LV HOXGH OD UXWD VH[XDO HYLWDQGR OD reduccin meitica y la fecundacin. El vulo desarrolla una semilla cuyo embrin contiene H[DFWDPHQWH HO PLVPR JHQRWLSR TXH OD SODQWD que lo origina. Por lo tanto este carcter (tambin llamado agamospermia KD VLGR GHQLGR como reproduccin asexual a travs de semillas /D DSRPL[LV IXH GHVFULSWD HQ PiV GH HVSHFLHV GH SODQWDV SHUWHQHFLHQWHV D IDPL-
lias diferentes, entre las que se destacan las *UDPtQHDV ODV &RPSXHVWDV ODV 5RViFHDV \ ODV 5XWiFHDV 3UHVHQWD IRUPDV GLYHUVDV \ SDUHFH KDEHU VXUJLGR YDULDV YHFHV LQGHSHQGLHQtemente durante la evolucin. Brevemente, los HPEULRQHV DSRPtFWLFRV SXHGHQ IRUPDUVH D WUDvs de una ruta esporoftica o gametoftica. (Q OD DSRPL[LV esporoftica, tambin llamada embriona adventicia, los embriones surgen directamente de una clula somtica de la nucela o de los tegumentos del vulo. Comnmente VH IRUPDQ HPEULRQHV P~OWLSOHV D SDUWLU GH FpOXODV QXFHODUHV HVSRURItWLFDV TXH FRPSDUWHQ el vulo junto con el embrin de origen sexual \ XWLOL]DQ VX HQGRVSHUPR SDUD GHVDUUROODUVH (VWD IRUPD GH DSRPL[LV DSDUHFH FRP~QPHQWH en los ctricos, los cuales se convirtieron en un VLVWHPD PRGHOR SDUD HVWXGLDU HO SURFHVR (Q la apomixis gametoftica VH IRUPDQ VLHPSUH VDFRV HPEULRQDULRV TXH GLHUHQ HQ DOJXQRV DVSHFWRV GHO JDPHWyWR IHPHQLQR KDSORLGH Q JHQHUDGR D SDUWLU GH OD PHJiVSRUD IXQFLRQDO 6X SULQFLSDO GLIHUHQFLD HV SUHFLVDPHQWH HO KHFKR GH VHU GLSORLGHV Q \D TXH ORV Q~FOHRV TXH ORV FRQIRUPDQ QR KDQ SDVDGR SRU HO SURFHVR PHLyWLFR \ SRU OR WDQWR QR KDQ UHGXFLGR VX contenido de ADN. Por eso se dice que estos VDFRV HPEULRQDULRV R PHJDJDPHWyWRV VXUJHQ SRU XQ SURFHVR GH apomeiosis DSR SUHMR JULHJR GH VLJQLFDFLyQ QHJDWLYD 'H DFXHUGR con el origen de la clula que genera al saco HPEULRQDULR \ DO HPEULyQ OD DSRPL[LV JDPHWRItWLFD SXHGH VHU FODVLFDGD FRPR diplospora, FXDQGR HO VDFR HPEULRQDULR VH RULJLQD D SDUWLU GH OD FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD PLVPD \D VHD SRU PLWRVLV R OXHJR GH XQD IDOOD HQ OD PHLRsis o apospora, cuando el saco embrionario VH RULJLQD GLUHFWDPHQWH SRU PLWRVLV D SDUWLU GH una clula somtica cercana, usualmente una clula de la nucela. Los sacos embrionarios, VHDQ pVWRV DSRVSyULFRV R GLSORVSyULFRV FRQtienen un gameto femenino 2n, la ovoclula, a SDUWLU GH OD FXDO VH GHVDUUROOD GLUHFWDPHQWH HO HPEULyQ SRU SDUWHQRJpQHVLV VLQ TXH H[LVWD IHFXQGDFLyQ $Vt PLHQWUDV HQ HO SURFHVR VH[XDO OD UHGXFFLyQ PHLyWLFD VH FRPSOHPHQWD FRQ OD IHFXQGDFLyQ TXH UHVWDXUD HO QLYHO GH SORLGtD Q HQ OD DSRPL[LV JDPHWRItWLFD OD DXVHQFLD GH UHGXFFLyQ VH FRPSOHPHQWD FRQ OD SDUWHQRJpQHVLV /D DSRPL[LV JDPHWRItWLFD IXH HVWXGLDGD
PiV SURIXQGDPHQWH TXH OD DSRPL[LV HVSRURItWLFD SULQFLSDOPHQWH SRU VHU HO WLSR SUHVHQWH HQ ODV JUDPtQHDV GRQGH PXFKDV HVSHFLHV FRQ YDORU DJURQyPLFR SUHVHQWDQ HVWH PRGR GH UHSURGXFFLyQ (Q OD )LJXUD VH PXHVWUD XQ HVTXHPD FRPSDUDWLYR VLPSOLFDGR GH ODV YtDV GH UHSURGXFFLyQ VH[XDO \ DSRPtFWLFD HQ DQJLRVSHUPDV /RV GLIHUHQWHV PHFDQLVPRV GH DSRPL[LV REVHUYDGRV HQ GLVWLQWRV JpQHURV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ HO SURFHVR VH[XDO GH PHJDgametognesis, fueron esquematizados en la Figura 2. 5HFRUGHPRV TXH HQ ODV DQJLRVSHUPDV H[LVWH XQD GREOH IHFXQGDFLyQ (Q OD DSRPL[LV JDPHWRItWLFD OD SDUWHQRJpQHVLV H[FOX\H LQYDULDEOHPHQWH XQD GH ODV HWDSDV GH HVWD GREOH fecundacin: la unin de los gametos masculinos con los femeninos. Sin embargo, no necesariamente se anula la fecundacin de los Q~FOHRV SRODUHV $XQTXH HQ DOJXQRV FDVRV HO HQGRVSHUPR SXHGH GHVDUUROODUVH HQ IRUPD DXtnoma (sin la unin de un gameto masculino FRQ ORV Q~FOHRV SRODUHV GHO VDFR HPEULRQDULR DSRVSyULFR R GLSORVSyULFR HQ PXFKDV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV FRPR HQ OD PD\RUtD GH ODV JUDPtQHDV WURSLFDOHV HV QHFHVDULR TXH XQ JDmeto masculino se fusione con el o los ncleos SRODUHV GH OD FpOXOD FHQWUDO GHO VDFR HPEULRQDULR SDUD IRUPDU HO HQGRVSHUPR $ HVWH SURFHVR se lo llama pseudogamia. &DVL WRGRV ORV VDFRV HPEULRQDULRV GLSORVSyULFRV FRQ H[FHSFLyQ GH ORV GH Eragrostis) FRQVHUYDQ OD WtSLFD HVWUXFWXUD GH ORV VDFRV HPbrionarios de origen meitico, generalmente con siete clulas y ocho ncleos. Sin embargo, HQ OD DSRVSRUtD ORV VDFRV PXHVWUDQ SRU OR JHneral una constitucin muy variable, tanto en taxones diferentes como dentro de un mismo WD[yQ )LJXUD 3RU HMHPSOR HQ JUDPtQHDV WURSLFDOHV R VXEWURSLFDOHV HO VDFR DSRVSyULFR VH IRUPD SRU GRV PLWRVLV FRQVHFXWLYDV FRQ SHUPDQHQFLD GH ORV FXDWUR Q~FOHRV HQ XQ VROR SROR FHOXODU $Vt VH RUJDQL]D XQ PHJDJDPHWyWR FRQ XQD RYRFpOXOD DQTXHDGD SRU GRV VLQpUgidas y una clula central uninucleada y extensamente vacuolizada. Esta estructura de saco DSRVSyULFR IXH GHVFULSWD SRU SULPHUD YH] SDUD Panicum maximum \ SRU HVD UD]yQ D ORV PHJDJDPHWyWRV FRQ HVWD PRUIRORJtD VH ORV FRQRFH FRPR VDFRV DSRVSyULFRV GH WLSR Panicum.
Figura 1: Rutas biolgicas de reproduccin sexual y apomctica. Durante la sexualidad una clula de OD QXFHOD GHO yYXOR VH GLIHUHQFLD FRPR FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD \ OXHJR GH VXIULU XQ SURFHVR GH PHLRVLV GD RULJHQ D FXDWUR PHJiVSRUDV KDSORLGHV 7UHV GH HVWDV PHJiVSRUDV GHJHQHUDQ \ OD FXDUWD GD RULJHQ D la formacin de un saco embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los ncleos celulares esWiQ UHGXFLGRV Q /D RYRFpOXOD \ ORV Q~FOHRV SRODUHV GHO VDFR VRQ IHFXQGDGRV SRU ORV Q~FOHRV JHQHUDWLYRV GHO SROHQ SDUD JHQHUDU HO FLJRWR \ HO Q~FOHR SULPDULR GHO HQGRVSHUPD UHVSHFWLYDPHQWH (O FLJRWR GD RULJHQ DO HPEULyQ D WUDYpV GH VXFHVLYDV PLWRVLV /D DSRPL[LV FRQVLVWH HQ OD IRUPDFLyQ GH XQ HPEULyQ D SDUWLU GH XQD FpOXOD QR UHGXFLGD TXH QR KD VXIULGR PHLRVLV (Q OD DSRPL[LV JDPHWRItWLFD VH REVHUYD OD IRUPDFLyQ GH XQ PHJDJDPHWRWR FRQ FpOXODV QR UHGXFLGDV FX\D RYRFpOXOD Q JHQHUD XQ HPEULyQ SRU SDUWHQRJpQHVLV (Q OD HPEULRQtD DGYHQWLFLD HO HPEULyQ HV JHQHUDGR GLUHFWDPHQWH D SDUWLU GH XQD FpOXOD GH OD QXFHOD HQ XQ SURFHVR VLPLODU D OD HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD
6LQ HPEDUJR HQ ODV HVSHFLHV DSRVSyULFDV GH Paspalum XQ JpQHUR WDPELpQ SHUWHQHFLHQWH a la tribu Panceas igual que Panicum, existe una caracterstica en la constitucin de los saFRV DSRVSyULFRV TXH ORV GLIHUHQFLD QHWDPHQWH GHO WLSR Panicum: en Paspalum los sacos generalmente tienen una clula central con dos Q~FOHRV SRODUHV \ D YHFHV WUHV )LJXUD (VWD FDUDFWHUtVWLFD HV LPSRUWDQWH SRUTXH GHELGR D OD SVHXGRJDPLD OD UHODFLyQ JHQyPLFD PDWHUQDSDWHUQD GHO HQGRVSHUPR HV GLVWLQWD HQ ODV SODQWDV VH[XDOHV \ HQ ODV DSRVSyULFDV (Q ODV VH[XDOHV KD\ XQD UHODFLyQ PDWHUQRSDWHUQR PDGUH Q Q SDGUH Q PLHQWUDV TXH HQ ODV DSRVSyULFDV HVD UHODFLyQ HV JHQHUDOPHQWH PDGUH Q Q SDGUH Q (Q Panicum la relacin es 2/1 tanto en las sexuales como en las DSRVSyULFDV Q QQ HQ ODV VH[XDOHV \ QQ HQ ODV DSRVSyULFDV
Otros aspectos sustanciales del carcter apomixis +D\ YDULDV FDUDFWHUtVWLFDV SDUWLFXODUHV GH HVWH PRGR GH UHSURGXFFLyQ TXH PHUHFHQ VHU UHPDUFDGDV 3RU XQD SDUWH OD DSRPL[LV XVXDOmente no altera la formacin del microgameWyWR \ OD PHLRVLV RFXUUH HQ ODV DQWHUDV JHQHUDQGR SROHQ UHGXFLGR DXQTXH D YHFHV VH REservan tasas inferiores de viabilidad. Adems, DSRPL[LV \ VH[XDOLGDG QR VRQ SURFHVRV PXWXDPHQWH H[FOX\HQWHV \D TXH SXHGHQ DSDUHFHU simultneamente sacos reducidos (meiticos) \ QR UHGXFLGRV SURYHQLHQWHV GH DSRPL[LV HQ XQD PLVPD SODQWD HQ XQD PLVPD LQRUHVFHQFLD \ D~Q HQ XQ PLVPR yYXOR 8QD SODQWD DSRPtFWLFD TXH HV FDSD] GH JHQHUDU DO PHQRV XQD SDUWH GH VX SURJHQLH SRU PHGLRV VH[XDOHV VH FRQRFH FRPR IDFXOWDWLYD 3RU OR WDQWR HQ ORV JHQRWLSRV DSRPtFWLFRV IDFXOWDWLYRV ODV SURJH-
Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante el proceso de apomixis. En la PD\RUtD GH ODV SODQWDV DQJLRVSHUPDV VH[XDOHV OD FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD UHDOL]D XQ SURFHVR GH PHLRVLV \ JHQHUD FXDWUR PHJiVSRUDV KDSORLGHV WUHV GH ODV FXDOHV GHJHQHUDQ /D FXDUWD PHJiVSRUD OOHYD D FDER XQD VHULH GH WUHV GLYLVLRQHV PLWyWLFDV SDUD IRUPDU XQ VDFR HPEULRQDULR UHGXFLGR \ RFWDQXFOHDGR (Q HO SURFHVR GH HPEULRQtD DGYHQWLFLD OD IRUPDFLyQ GHO VDFR VH[XDO HV QRUPDO SHUR ODV FpOXODV QXFHODUHV DG\DFHQWHV GHVDUUROODQ HPEULRQHV VRPiWLFRV TXH FRH[LVWHQ FRQ HO HPEULyQ GH RULJHQ VH[XDO (Q OD DSRPL[LV GLSORVSyULFD OD FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD UHDOL]D XQD VHULH GH PLWRVLV SDUD JHQHUDU XQ VDFR HPEULRQDULR QR UHGXFLGR R LQLFLD XQ SURFHVR GH PHLRVLV TXH IDOOD \ VH JHQHUD XQ VDFR HPEULRQDULR QR UHGXFLGR (Q OD DSRPL[LV DSRVSyULFD FpOXODV GH OD QXFHOD FHUFDQDV D OD FpOXOD PDGUH GH OD PHJiVSRUD UHDOL]DQ YDULDV PLWRVLV FRQVHFXWLYDV SDUD JHQHUDU XQ VDFR HPEULRQDULR QR UHGXFLGR FX\D FDUDFWHUtVWLFD PiV QRWDEOH HV OD DXVHQFLD GH DQWtSRGDV
QLHV VHJUHJDQ FRPR FODVHV PDWHUQDV Q \ QRPDWHUQDV R DEHUUDQWHV +D\ WUHV WLSRV GLIHUHQWHV GH LQGLYLGXRV DEHUUDQWHV TXH SXHGHQ HQFRQWUDUVH HQ OD SURJHQLH GH XQD SODQWD DSRPtFWLFD KtEULGRV %,,, Q Q TXH UHVXOWDQ GH la fecundacin de una ovoclula no reducida, KtEULGRV %,, Q Q TXH UHVXOWDQ GH OD IH-
cundacin de una ovoclula reducida y 3) haSORLGHV Q JHQHUDGRV SRU SDUWHQRJpQHVLV D SDUWLU GH XQD RYRFpOXOD UHGXFLGD 3RU RWUD SDUWH OD DSRPL[LV JDPHWRItWLFD VH UHODFLRQD IXHUWHPHQWH FRQ OD SROLSORLGtD (Q JHQHUDO ODV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV SUHVHQWDQ UD]DV GH EDMRV QLYHOHV GH SORLGtD XVXDOPHQWH
Figura 3: 0LFURIRWRJUDItDV GH VHFFLRQHV GH yYXORV GH UD]DV WHWUDSORLGHV GH Paspalum notatum. $ yYXOR FRQWHQLHQGR XQ VDFR HPEULRQDULR PHLyWLFR ODV GRV VLQpUJLGDV \ DOJXQDV GH ODV DQWtSRGDV QR VH REVHUYDQ SRUTXH HVWiQ HQ XQD VHFFLyQ DG\DFHQWH DO FRUWH GHO yYXOR % yYXOR FRQWHQLHQGR GRV VDFRV HPEULRQDULRV DSRVSyULFRV FRQ GRV Q~FOHRV SRODUHV 5HIHUHQFLDV D DQWtSRGDV H RYRFpOXOD S Q~FOHRV SRODUHV EDUUD PLFUDV
GLSORLGHV TXH VH UHSURGXFHQ SRU VH[XDOLGDG \ RWUDV GH PD\RU QLYHO GH SORLGtD SRU HMHPSOR WUL WHWUD R SHQWDSORLGHV TXH VH UHSURGXFHQ SRU DSRPL[LV (VWRV FRPSOHMRV LQWHJUDGRV SRU LQGLYLGXRV VH[XDOHV \ DSRPtFWLFRV GH GLVWLQWR QLYHO GH SORLGtD VH FRQRFHQ FRPR FRPSOHMRV DJiPLFRV \ VH FRQVLGHUDQ HVWUXFWXUDV UHSURGXFWLYDV FRPSOHMDV \ HYROXFLRQDGDV GRQGH OD VH[XDOLGDG SHUPLWH OD JHQHUDFLyQ GH QXHYRV JHQRWLSRV \ OD DSRPL[LV OD SURSDJDFLyQ FORQDO PX\ HFLHQWH GH ODV FRPELQDFLRQHV JHQpWLFDV VXSHULRUHV $O PHQRV SDUD DOJXQDV HVSHFLHV SRU HMHPSOR P. notatum y P. rufum) existen evidencias que sugieren que la diversidad geneUDGD D QLYHOHV PHQRUHV GH SORLGtD SXHGH VHU LPSXOVDGD KDFLD ORV QLYHOHV SROLSORLGHV SRU PHGLR GH HYHQWRV VXFHVLYRV GH KLEULGL]DFLyQ Q Q /D UHODFLyQ GH OD DSRPL[LV FRQ OD SROLSORLGtD HV HVWUHFKD \D TXH H[LVWHQ PX\ SRFRV FDVRV UHSRUWDGRV GH GLSORLGHV TXH PXHVWUDQ UHSUR-
GXFFLyQ DSRPtFWLFD ([LVWHQ YDULDV WHRUtDV TXH H[SOLFDQ OD EDMD IUHFXHQFLD GH DSRPL[LV D QLYHO GLSORLGH 8QD IXH SURSXHVWD SRU 1RJOHU \ VRVWLHQH TXH XQ DOHOR GRPLQDQWH $ UHVSRQVDEOH GH OD DSRVSRUtD QR SXHGH VHU WUDQVPLWLGR D WUDYpV GH JDPHWDV KDSORLGHV FRQ OR FXDO OD DSRPL[LV QR SXHGH VHU HQFRQWUDGD HQ GLSORLGHV QDWXUDOHV 2WUD IXH SODQWHDGD SRU 0RJLH \ VRVtiene la existencia de un fenmeno de dosaje JpQLFR SDUD XQ DOHOR PXWDQWH D HQ SUHVHQFLD GHO DOHOR VDOYDMH D SDUD TXH HO FDUiFWHU VH H[SUHVH 'H DFXHUGR D HVWD WHRUtD OD DXVHQFLD GH DSRPL[LV HQ ORV GLSORLGHV QDWXUDOHV VH GHEH PiV ELHQ D XQD IDOWD GH H[SUHVLyQ HQ OXJDU GH OD QRWUDQVPLVLyQ SURSXHVWD SRU 1RJOHU 0RJLH VXJLHUH TXH VH QHFHVLWDQ GRV FRSLDV GHO DOHOR D IUHFXHQFLD PD\RU D SDUD OD H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV (Q FRQWUDVWH FRQ HVWD WHRUtD 1RLURW SURSRQH TXH HO DOHOR D QR GHEHUtD HVWDU SUHVHQWH HQ XQD IUHFXHQFLD PD\RU GH
La demostracin del carcter dominante del DOHOR GHWHUPLQDQWH GH OD DSRPL[LV HQ PXFKDV HVSHFLHV DSRVSyULFDV FRQWUDGLFH HVWDV ~OWLPDV KLSyWHVLV 6LQ HPEDUJR HQ HO JpQHUR Paspalum se demostr que debe existir cierto efecto de GRVDMH UHODFLRQDGR FRQ OD SROLSORLGtD \D TXH OD VROD GXSOLFDFLyQ FURPRVyPLFD FRQ FROFKLFLQD GH GLSORLGHV VH[XDOHV LQGXMR DO PHQRV HQ DOJXQRV FDVRV OD REWHQFLyQ GH WHWUDSORLGHV DSRPtFticos. En base a esas observaciones, Quarin y FRODERUDGRUHV SRVWXODURQ TXH HO GHWHUPLQDQWH JHQpWLFR UHVSRQVDEOH GH OD DSRPL[LV H[LVWLUtD D QLYHO GLSORLGH SHUR TXH VX H[SUHVLyQ HVWDUtD FRQGLFLRQDGD SRU XQR R YDULRV JHQHV DGLFLRQDOHV VXMHWRV D HIHFWRV GH GRVDMH 8QD KLSyWHVLV DOWHUQDWLYD SRGUtD VHU TXH XQD FRQGLFLyQ HSLJHQpWLFD DVRFLDGD FRQ OD SROLSORLGtD SRVLELOLWDUD OD H[SUHVLyQ GHO DOHOR GHWHUPLQDQWH GHO FDUiFWHU $Vt D QLYHO GLSORLGH HO DOHOR GHWHUPLQDQWH GH OD DSRPL[LV HVWDUtD HYHQWXDOPHQWH SUHVHQWH SHUR VyOR VHUtD FDSD] GH H[SUHVDUVH HQ IRUPD DSUHFLDEOH HQ HQWRUQRV SROLSORLGHV TXH SURYHDQ XQ SDLVDMH HSLJHQpWLFR SURSLFLR Mejoramiento gentico de especies naturalmente apomcticas $OJXQDV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV WLHQHQ XQ YDORU DJURQyPLFR PX\ LPSRUWDQWH FRPR HV el caso de varias gramneas forrajeras, los ciWUXV HO PDQJR \ ODV IUHVDV +DVWD HO SUHVHQWH VyOR VH GLVSRQH GH SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQto avanzados en algunas gramneas forrajeUDV HQWUH ODV TXH VH HQFXHQWUDQ HVSHFLHV GH los gneros Brachiaria, Cenchrus, Eragrostis, Panicum, Paspalum, Pennisetum y Poa. En SULQFLSLR ODV SODQWDV DSRPtFWLFDV IDFXOWDWLYDV SXHGHQ VHU PHMRUDGDV SRU PHWRGRORJtDV GH FUX]DPLHQWR FRQYHQFLRQDOHV \D TXH SURGXFHQ al menos algunos sacos embrionarios meitiFRV TXH SRVLELOLWDQ OD KLEULGDFLyQ \ VHOHFFLyQ (Q FDPELR HQ ORV DSRPtFWLFRV REOLJDGRV TXH VH UHSURGXFHQ FRPSOHWDPHQWH R FDVL FRPSOHtamente en forma clonal), la hibridacin y el DQiOLVLV GH VHJUHJDFLyQ VRQ LPSUDFWLFDEOHV /DV SURJHQLHV GH WDOHV SODQWDV H[KLEHQ VLHPSUH HO IHQRWLSR PDWHUQR R SXHGHQ RFDVLRQDOPHQWH DSDUHFHU YDULDQWHV TXH SUREDEOHPHQWH surjan de mutaciones ms que de segregacin VH[XDO 3RU HOOR OD GLVSRQLELOLGDG GH LQGLYLGXRV sexuales o con algn grado de sexualidad
DSRPtFWLFRV IDFXOWDWLYRV GHO PLVPR QLYHO GH SORLGtD HQ HO FXDO VH H[SUHVD OD DSRPL[LV HV XQ UHTXLVLWR IXQGDPHQWDO SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH HVWDV HVSHFLHV (VWRV LQGLYLGXRV SUHVHQWDQ XQ FLHUWR JUDGR GH YDULDELOLGDG FRPR SDUD DXPHQWDU ODV SRVLELOLGDGHV GH VXSHUYLYHQFLD IUHQWH D FDPELRV DPELHQWDOHV \ DSRUWDQ DVLPLVPR JHUPRSODVPD ~WLO SDUD HO PHMRUDPLHQWR 8QR GH ORV SULQFLSDOHV UHTXLVLWRV SDUD OOHYDU DGHODQWH XQ SURJUDPD GH PHMRUDPLHQWR GH XQD HVSHFLH DSRPtFWLFD HV OD FROHFFLyQ GH JHUPRSODVPD GLYHUVR GHVGH ODV IXHQWHV GH RULJHQ 8QD EXHQD FROHFFLyQ SRVLELOLWD DPSOLDU OD EDVH JHQpWLFD GLVSRQLEOH \ HYHQWXDOPHQWH LGHQWLFDU LQWURGXFFLRQHV VH[XDOHV R DOWDPHQWH VH[XDOHV DSRPtFWLFDV IDFXOWDWLYDV FRQ DOWD H[SUHVLyQ GH VH[XDOLGDG /D HYDOXDFLyQ GH HVSHFLHV UHODFLRQDGDV HV WDPELpQ XQD DOWHUQDWLYD LPSRUWDQWH FXDQGR QR VH GLVSRQH GH SODQWDV VH[XDOHV GH OD HVSHFLH GH LQWHUpV (MHPSORV GH FUX]DPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV H LQFOXVR LQWHUJHQpULFRV HPSOHDGRV FRPR SXQWR GH SDUWLGD HQ SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR VH HQFXHQWUDQ en Brachiaria, Zea x Tripsacum y Pennisetum, entre otros. (O DGHFXDGR FRQRFLPLHQWR GH OD ELRORJtD RUDO FLWRJHQpWLFD \ PRGR GH UHSURGXFFLyQ GH ORV PDWHULDOHV GLVSRQLEOHV HV XQ UHTXLVLWR IXQGDPHQWDO SDUD FXDOTXLHU HVWUDWHJLD GH PHMRUDmiento. Como se ver mas adelante, los estuGLRV UHDOL]DGRV SDUD GHWHUPLQDU OD EDVH JHQpWLFD GH OD DSRPL[LV HQ YDULDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV LQGLFDQ TXH HO FDUiFWHU SUHVHQWD XQ WLSR GH KHUHQFLD UHODWLYDPHQWH VLPSOH KDFLHQGR SRVLEOH HQWRQFHV VX XWLOL]DFLyQ HQ SURJUDPDV GH mejoramiento una vez que son detectados indiYLGXRV VH[XDOHV R DSRPtFWLFRV IDFXOWDWLYRV (Q HVWRV FDVRV ORV JHQRWLSRV DSRPtFWLFRV REOLJDGRV FRQ FDUDFWHUtVWLFDV GHVHDEOHV SXHGHQ VHU XVDGRV FRPR GDGRUHV GH SROHQ 'HELGR D TXH los gametos masculinos son reducidos y que OD PD\RUtD GH ODV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV VRQ DOtamente heterocigotas, los cruzamientos entre LQGLYLGXRV VH[XDOHV XWLOL]DGRV FRPR SURJHQLWRUHV IHPHQLQRV \ DSRPtFWLFRV HPSOHDGRV FRPR GDGRUHV GH SROHQ SXHGHQ FRQGXFLU D OD JHQHUDFLyQ GH SURJHQLHV )1 variables donde es SRVLEOH VHOHFFLRQDU +D\ TXH WHQHU HQ FXHQWD que si bien son necesarios individuos sexuaOHV R FRQ DGHFXDGD H[SUHVLyQ GH VH[XDOLGDG
SDUD UHDOL]DU ODV FUX]DV HQ HO PRPHQWR GH OD seleccin habr que usar el criterio contrario, HV GHFLU VHOHFFLRQDU ORV PHMRUHV IHQRWLSRV TXH FRQWHQJDQ XQ DOWR JUDGR GH H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV (VWR FRQGXFLUi D OD REWHQFLyQ GH nuevas variedades genticamente estables. El REMHWLYR QDO GH XQ SURJUDPD GH PHMRUDPLHQWR GH XQD HVSHFLH DSRPtFWLFD HQ HO FXDO KD VLGR SRVLEOH REWHQHU UHFRPELQDFLyQ JHQpWLFD HV OD LGHQWLFDFLyQ HQ OD SREODFLyQ VHJUHJDQWH GH ORV JHQRWLSRV VXSHULRUHV FRQ UHSURGXFFLyQ FRPSOHWDPHQWH R FDVL FRPSOHWDPHQWH DSRPtFWLFD TXH SXHGDQ VHU WUDQVIRUPDGRV HQ FXOWLYDUHV PHGLDQWH VX PXOWLSOLFDFLyQ SRU VHPLOODV (O FDPLQR QR HV VHQFLOOR SRUTXH HQ FDGD JHQHUDFLyQ HV QHFHVDULR GLVWLQJXLU HQ OD SURJHQLH FXiOHV VRQ ORV LQGLYLGXRV JHQHUDGRV SRU VH[XDOLGDG \ FXiOHV SRU DSRPL[LV 'HQWUR GH ORV JHQHUDGRV SRU VH[XDOLGDG KDEUi TXH VHOHFFLRQDU ORV TXH DO PLVPR WLHPSR SRVHDQ ODV PHMRUHV FDUDFWHUtVWLFDV DJURQyPLFDV \ SUHVHQWHQ XQ DOWR JUDGR GH H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV 2WUR DVSHFWR D WHQHU HQ FXHQWD HV HO QLYHO GH SORLGtD GH ORV SURJHQLWRUHV TXH VHUiQ HPSOHDGRV HQ ORV FUX]DPLHQWRV /RV SULPHURV HVWXGLRV GH KLEULGDFLyQ indicaron la necesidad de realizar cruzas entre HVSHFLHV VH[XDOHV \ DSRPtFWLFDV FRQ HO PLVPR QLYHO GH SORLGtD \D TXH YDULRV LQWHQWRV UHDOL]DGRV HQWUH GLSORLGHV VH[XDOHV \ SROLSORLGHV HQ JHQHUDO WHWUDSORLGHV DSRPtFWLFRV FRQGXMHURQ D OD JHQHUDFLyQ GH SURJHQLHV HVWpULOHV (Q ODV JUDPtQHDV WURSLFDOHV \ VXEWURSLFDOHV se ha hecho un buen uso del carcter en el meMRUDPLHQWR HVSHFLDOPHQWH HQ OD GRPHVWLFDFLyQ GH DOJXQDV HVSHFLHV 7UHV OtQHDV GH WUDEDMR KDQ VLGR OOHYDGDV DGHODQWH HQ HVWRV SURJUDPDV la seleccin de los mejores genotipos naturales partiendo de una amplia coleccin de germoplasma y estudiando caractersticas como la SURGXFWLYLGDG GH ELRPDVD FDOLGDG GH IRUUDMH DGDSWDELOLGDG DO FXOWLYR \ D GLVWLQWDV FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV FDSDFLGDG GH SURGXFFLyQ GH VHPLOOD SHUVLVWHQFLD DO SDVWRUHR \ RWUDV +D\ QXPHURVRV HMHPSORV GH FXOWLYDUHV GH SDVWRV IRUUDMHURV DSRPtFWLFRV TXH VH PHMRUDURQ XVDQGR HVWH WLSR GH VHOHFFLyQ $Vt VH REWXYLHURQ YDULHGDGHV DSRPtFWLFDV GH Paspalum, Brachiaria, Panicum, Themeda, Eragrostis y Melinis. 7RPDQGR FRPR HMHPSOR DO JpQHUR Paspalum, HQ SULPHU OXJDU VH VHOHFFLRQDURQ DOJXQDV HV-
SHFLHV FRPR P. notatum DSRPtFWLFR ; P. dilatatum DSRPtFWLFR ; P. plicatulum, P. atratum \ OXHJR VH HOLJLHURQ DOJXQRV HFRWLSRV SRU VXV FXDOLGDGHV DJURQyPLFDV \ VX DGDSWDELlidad al cultivo. En el sur de los Estados Unidos VH KDQ SRSXODUL]DGR DOJXQDV YDULHGDGHV WHWUDSORLGHV DSRPtFWLFDV GH P. notatum (Argentine, Paraguay, Paraguay 22, Wilmington, Tifton 7 y otras). Tambin se cultivan algunas variedades DSRPtFWLFDV GH 'DOOLVJUDVV P. dilatatum) selecFLRQDGDV GH OD PLVPD PDQHUD (Q QXHVWUR SDtV VH FXOWLYDURQ GXUDQWH PXFKR WLHPSR GRV YDULHGDGHV DSRPtFWLFDV GH P. guenoarum: el Pasto 5RMDV \ HO 3DVWR 5DPtUH] VHOHFFLRQDGDV SRU este mtodo en Paraguay. Recientemente se KDQ LQVFULSWR RWUDV GRV YDULHGDGHV TXH KDQ VLGR seleccionadas en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional del Nordeste: el Pasto Camb (P. atratum) y el Pasto Chan (P. guenoarum 2WUR HMHPSOR HV HO GH Eragrostis curvula SDVWR OORUyQ FX\RV FXOWLYDUHV SURYLHQHQ GH VHOHFFLRQHV SUDFWLFDGDV VREUH PDWHULDOHV QDWLYRV GH 7DQ]DQLD \ 6XGiIULFD (O SDVWR OORUyQ IXH LQWURGXFLGR HQ $UJHQWLQD DSUR[LPDGDPHQWH HQ HQ XQD HVWDQFLD GH OD SURYLQcia de San Luis. De ah, en 1947, semillas del cultivar Tanganyika SULPHU FXOWLYDU DGDSWDGR IXHURQ UHPLWLGDV D OD (VWDFLyQ ([SHULPHQWDO ,17$ $QJXLO GRQGH IXHURQ PXOWLSOLFDGDV FRQVWLWX\HQGR OD EDVH GH OD LQWHQVLFDFLyQ GHO FXOWLYR HQ QXHVWUR SDtV OD VHJXQGD SRVLELOLGDG GH mejoramiento, en la que an se ha avanzado SRFR FRQVLVWH HQ realizar cruzamientos con genotipos sexuales poliploides naturales, que VRQ PX\ UDURV 8Q EXHQ HMHPSOR GH HVWR VRQ las variedades Nueces y Llano de Buffelgrass (Pennisetum ciliaris) desarrolladas en EEUU en OD GpFDGD GHO D SDUWLU GH FUX]DPLHQWRV HQWUH XQD UDUD SODQWD [ VH[XDO QDWXUDO SRU SODQWDV DSRPtFWLFDV [ TXH VRQ ODV FRPXQHV HQ HVWD HVSHFLH 7DPELpQ VH SXHGHQ FRQVHJXLU SODQWDV ; VH[XDOHV SRU GXSOLFDFLyQ FURPRVyPLFD GH XQD SODQWD GLSORLGH VH[XDO 0HGLDQWH HVWH WLSR GH WUDWDPLHQWRV VH KDQ REWHQLGR SODQWDV WHWUDSORLGHV VH[XDOHV HQ B. ruziziensis, E. curvula, P simplex, P. notatum y P. hexastachium. /D GLVSRQLELOLGDG GH HVWDV SODQWDV DGHPiV GH IDFLOLWDU ORV SODQHV GH FUX]DPLHQWRV SHUPLWLy OD realizacin de estudios detallados de la herenFLD GHO FDUiFWHU DSRPL[LV HQ DOJXQDV GH HVWDV
HVSHFLHV $FWXDOPHQWH SREODFLRQHV VHJUHJDQtes de P. notatum REWHQLGDV D SDUWLU GHO FUX]DPLHQWR HQWUH LQGLYLGXRV WHWUDSORLGHV VH[XDOHV JHQHUDGRV H[SHULPHQWDOPHQWH \ DSRPtFWLFRV QDWXUDOHV HVWiQ VLHQGR HYDOXDGDV HQ SUXHEDV D FDPSR HQ )ORULGD ((88 8QD WHUFHU HVWUDtegia de mejoramiento consiste en la obtencin de variantes somaclonales a partir del cultivo in vitro de tejidos. Esta metodologa se basa HQ OD DSDULFLyQ GH YDULDFLRQHV KHUHGDEOHV HQ ODV SODQWDV UHJHQHUDGDV in vitro (conocidas FRPR YDULDQWHV VRPDFORQDOHV TXH SXHGHQ XWLOL]DUVH HQ HO PHMRUDPLHQWR 3RU HMHPSOR HQ HO ODERUDWRULR GH *HQpWLFD GHO 'HSDUWDPHQWR GH Agronoma de la Universidad Nacional del Sur, Baha Blanca, Argentina, se obtuvieron varios VRPDFORQHV GH SDVWR OORUyQ (Eragrostis curvula) HQWUH HOORV XQD OtQHD WHWUDSORLGH DSRPtFWLFD registrada como cultivar Don Luis (RC9191, HQ KRQRU DO ,QJ /XLV $ 0URJLQVNL XQR GH ORV SLRQHURV HQ HO GHVDUUROOR GHO FXOWLvo in vitro GH WHMLGRV YHJHWDOHV HQ QXHVWUR SDtV Don Luis se distingue de los otros materiales de Eragrostis curvula SRU VX Q~PHUR FURPRVyPLFR Q HO DQFKR GH VXV KRMDV HO FRlor azul de las mismas y su resistencia a bajas WHPSHUDWXUDV (Q HVWDGR UHSURGXFWLYR VH GLIHUHQFLD SRU HO PD\RU WDPDxR GH ODV SDQRMDV HQ relacin a otros cultivares. Usos potenciales de la apomixis en el mejoramiento de plantas naturalmente sexuales La ausencia de recombinacin durante la megagametognesis y de fecundacin de la RYRFpOXOD SRU XQ JDPHWR PDVFXOLQR SRVLELOLWD OD JHQHUDFLyQ GH HPEULRQHV TXH SUHVHQWDQ XQD FRQVWLWXFLyQ JHQpWLFD LGpQWLFD D OD GH OD SODQWD PDGUH /D DSRPL[LV HV XQ FDUiFWHU XWLOL]DEOH HQ HO PHMRUDPLHQWR GH SODQWDV \ OD SURGXFFLyQ GH DOLPHQWRV \D TXH SXHGH FRQVWLWXLU XQD KHUUDPLHQWD YHQWDMRVD SDUD OD HVWDELOL]DFLyQ GH JHQRWLSRV VXSHULRUHV \ OD MDFLyQ GH FRPELQDFLRQHV KtEULGDV /D SHUVSHFWLYD PiV DWUDFWLYD TXH UHSUHVHQWD OD DSRPL[LV SDUD OD DJULFXOWXUD HV OD SRVLELOLGDG GH REWHQHU \ SURSDJDU SRU VHPLOODV QXHYRV KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV H LQWHUJHQpULFRV SHUPLWLHQGR HO GHVDUUROOR GH JHQRWLSRV PHMRU DGDSWDGRV D ORV GLVWLQWRV DPELHQWHV y con altos rendimientos. En teora cualquier
combinacin gentica que lleve los factores deWHUPLQDQWHV GH OD DSRPL[LV SRGUtD VHU PDQWHQLGD \ PXOWLSOLFDGD FRPR XQD UpSOLFD H[DFWD SRU innumerables generaciones va semillas. Esto SRVLELOLWDUtD HO XVR GHO FDUiFWHU SDUD SURSDJDU HVSHFLHV TXH DFWXDOPHQWH VH FORQDQ YHJHWDWLvamente o in vitro /D SHUVSHFWLYD GH UHSURGXFLU KtEULGRV VXSHULRUHV YtD VHPLOODV SRGUtD UHSUHVHQWDU XQD D\XGD LPSRUWDQWH SDUD ORV SURGXFWRUHV DJURSHFXDULRV GH ORV SDtVHV HQ GHVDUUROOR SHUPLWLpQGROHV VRVWHQHU DOWRV UHQGLPLHQWRV DxR WUDV DxR XVDQGR SDUWH GH OD FRVHFKD VLQ SpUGLGDV HQ OD SURGXFFLyQ GHELGDV D OD VHJUHgacin o endogamia. Entre otras ventajas, la H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV UHGXFLUtD DO PtQLPR HO DLVODPLHQWR ItVLFR UHTXHULGR SDUD SUHVHUYDU lneas genticas homocigotas. Asimismo facilitara el uso de transformantes considerando TXH XQD SODQWD WUDQVJpQLFD DSRPtFWLFD MDUtD inmediatamente el nuevo carcter y se converWLUtD HQ XQ FXOWLYDU OXHJR GH VX PXOWLSOLFDFLyQ (Q XQ SODQHWD FRQ XQD GHPDQGD FUHFLHQWH GH DOLPHQWRV TXH GHEHUi GXSOLFDU VX SURGXFFLyQ HQ ORV SUy[LPRV DxRV XWLOL]DQGR XQD VXSHUFLH GH VLHPEUD LJXDO R PHQRU D OD DFWXDO HVD RSFLyQ UHVXOWD GH FUXFLDO LPSRUWDQFLD 6H FDOFXOD TXH VRODPHQWH SDUD OD SURGXFFLyQ GH DUUR] KtEULGR \ FRQ XQD WDVD PRGHUDGD GH DFHSWDFLyQ SRU SDUWH GH ORV DJULFXOWRUHV HVWD WHFQRORJtD EULQGDUtD EHQHFLRV JOREDOHV SRU XQRV a 4 billones de dlares anuales. Las ventajas enumeradas y muchas otras no mencionadas DTXt KDFHQ TXH HVWH FDUiFWHU UHSUHVHQWH XQ EHQHFLR SRWHQFLDO HQRUPH SDUD OD DJULFXOWXUD \ TXH VH KD\DQ FRPSDUDGR ORV LQFUHPHQWRV SRWHQFLDOHV HQ OD SURGXFFLyQ D WUDYpV GHO XVR GH esta tecnologa con aquellos derivados de la UHYROXFLyQ YHUGH D SDUWLU GH ORV DxRV El control gentico de la apomixis /D DSRPL[LV HV XQ FDUiFWHU KHUHGDEOH SHUR VX FRQWURO JHQpWLFR QR IXH D~Q FRPSOHWDPHQte esclarecido. Tradicionalmente se consider TXH VXV GHWHUPLQDQWHV EiVLFRV SRGUtDQ KDEHUVH RULJLQDGR SRU PXWDFLyQ \ TXH OD PD\RUtD GH ORV RWURV JHQHV LQYROXFUDGRV HQ VX H[SUHVLyQ VRQ VLPLODUHV D ORV GH OD VH[XDOLGDG $ SHVDU GH VX DPSOLD GLVWULEXFLyQ HQ ODV DQJLRVSHUPDV HO carcter no es muy comn en los cultivos mayores o en sistemas modelos. Esta condicin
IRU]y D TXH ORV HVWXGLRV HQ HVWH FDPSR GHEDQ VHU UHDOL]DGRV HQ HVSHFLHV VLOYHVWUHV TXH VRQ SROLSORLGHV DOWDPHQWH KHWHURFLJRWDV \ FRQ XQD SREUH FDUDFWHUL]DFLyQ JHQpWLFD /D GLVHFFLyQ GH ODV EDVHV JHQpWLFDV GHO FDUiFWHU HV SRU OR WDQWR GLFXOWRVD \ FRPSOHMD /RV HVWXGLRV GH KHUHQFLD VyOR VRQ SRVLEOHV VL SXHGHQ FUX]DUVH SURJHQLWRUHV FRPSOHWDPHQWH VH[XDOHV \ DSRPtFWLFRV \ OD SURJHQLH )1 VHJUHJDQWH SXHGH VHU H[DPLQDGD SRU PpWRGRV FLWRHPEULROyJLFRV R SRU DQiOLVLV GH SURJHQLHV HQ EXVFD GH YDULDFLRQHV FRQ UHVSHFWR DO IHQRWLSR PDWHUQR (O DQiOLVLV GH SURJHQLHV XVDQGR PDUFDGRUHV PROHFXODUHV SXHGH VHU XVDGR FRPR XQ LQGLFDGRU GH OD SURSRUFLyQ GH SURJHQLHV DSRPtFWLFDV GH XQ determinado individuo. En las cruzas de este WLSR TXH SXHGHQ VHU LQWUD R LQWHUHVSHFtFDV VH XWLOL]D XQ SROLSORLGH VH[XDO QDWXUDO R JHQHUDGR DUWLFLDOPHQWH FRPR SODQWD PDGUH PLHQWUDV TXH XQ JHQRWLSR DSRPtFWLFR FRQWULEX\H FRPR GDGRU GH SROHQ (O PRGR GH FODVLFDFLyQ GH ODV SURJHQLHV HQ DSRPtFWLFDV \ VH[XDOHV IXH PRWLYR GH FRQWURversia durante varias dcadas entre los invesWLJDGRUHV GHGLFDGRV DO HVWXGLR GH OD DSRPL[LV 0LHQWUDV DOJXQRV SURSRQtDQ WHQHU HQ FXHQWD VX JUDGR GH H[SUHVLYLGDG FRQVLGHUiQGROR como un carcter cuantitativo, otros consideraban que era ms conveniente tratarlo como XQ FDUiFWHU FXDOLWDWLYR \ SURSRQtDQ FODVLFDU D XQD SODQWD FRPR DSRPtFWLFD VLHPSUH \ FXDQGR llevase al menos un saco embrionario no reGXFLGR (O SULPHU PRGR GH FODVLFDFLyQ UHVXOWDUtD DGHFXDGR VL OD GLIHUHQWH H[SUHVLYLGDG GH OD DSRPL[LV VH RULJLQDVH HQ OD QHFHVLGDG GH OD accin conjunta de varios genes mayores que GHWHUPLQDUDQ HO FDUiFWHU R HVWXYLHVH LQXLGD SRU OD SUHVHQFLD GH PRGLFDGRUHV PLHQWUDV TXH OD VHJXQGD DSUR[LPDFLyQ VHUtD PiV DSURSLDGD VL HO FDUiFWHU HVWXYLHVH FRQWURODGR SRU XQ JHQ VLPSOH FX\D H[SUHVLYLGDG GHSHQGLHVH GH IDFWRUHV HSLJHQpWLFRV DVRFLDGRV 6H VDEH TXH HO DPELHQWH SXHGH DIHFWDU HO JUDGR GH DSRPL[LV HQ DOJXQDV HVSHFLHV OR TXH VXJLHUH TXH HIHFWLYDPHQWH SXHGH KDEHU WDQWR JHQHV PRGLFDGRUHV FRPR IDFWRUHV HSLJHQpWLFRV MXJDQGR XQ URO HQ OD H[SUHVLYLGDG GHO FDUiFWHU 3RU RWUD SDUWH VH GHPRVWUy TXH HQ KtEULGRV GH Pennisetum SODQWDV SHUWHQHFLHQWHV D GLIHUHQWHV SURJHQLHV WRGDV HOODV SRUWDGRUDV GH OD PLVPD
UHJLyQ TXH FRQWUROD OD DSRPL[LV SUHVHQWDQ GLIHUHQWH H[SUHVLYLGDG OR TXH UHIXHU]D OD LGHD GH TXH GHEHQ H[LVWLU PRGLFDGRUHV R DOWHUDFLRQHV HSLJHQpWLFDV DIHFWDQGR DO FDUiFWHU (Q QLQJ~Q FDVR HO HIHFWR GH HVRV PRGLFDGRUHV R OD QDWXUDOH]D GHO SRVLEOH FRQWURO HSLJHQpWLFR KDQ VLGR estudiados en detalle. Como veremos, en los ~OWLPRV DxRV VH LPSXVR PD\RULWDULDPHQWH HO PRGHOR FXDOLWDWLYR GH FODVLFDFLyQ \D TXH FDVL WRGRV ORV HVWXGLRV GH PDSHR KDQ FRQVLGHUDGR XQD SODQWD FRPR DSRPtFWLFD VL VH REVHUYD HQ ella al menos un saco embrionario no reducido, LQGHSHQGLHQWHPHQWH GHO JUDGR GH H[SUHVLYLGDG del carcter. El hecho de que en casi todas las HVSHFLHV DSRPtFWLFDV ORV PDUFDGRUHV OLJDGRV D OD DSRPHLRVLV PDSHDQ HQ XQD ~QLFD UHJLyQ JHQyPLFD KDFH SHQVDU TXH DSOLFDU HO PRGHOR cualitativo es esencialmente correcto, aunque SHUPDQHFH SHQGLHQWH HO HVWXGLR GH FXiOHV VRQ ORV IDFWRUHV TXH DIHFWDQ OD H[SUHVLYLGDG GHO FDrcter. /D DSRPL[LV HVSRURWLFD VH KHUHGD HQ IRUPD VLPSOH FRPR XQ FDUiFWHU GRPLQDQWH (Q HO ~QLFR HVWXGLR GH PDSHR UHSRUWDGR KDVWD DKRUD en Citrus HO FDUiFWHU SUHVHQWy XQD VHJUHJDFLyQ VLPSOH FRQ XQD UHODFLyQ GH VHJUHJDFLyQ GH 6LQ HPEDUJR OD DSOLFDFLyQ GHO PDSHR GH 47/V UHVXOWy HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH ORFL PD\RUHV FRQ HIHFWRV SRVLWLYRV R QHJDWLYRV XQ SDWUyQ PiV FRPSOHMR TXH HO DQWLFLSDGR $FWXDOPHQWH se estn llevando a cabo estudios genticos y moleculares adicionales en Citrus y gneros UHODFLRQDGRV DVt FRPR WDPELpQ HQ RWUDV HVSHFLHV TXH VH UHSURGXFHQ SRU HPEULRQtD DGYHQticia. /D DSRVSRUtD SDUHFH HVWDU FRQWURODGD SRU XQ nico locus en donde un gen mayor dominanWH R XQ JUXSR GH JHQHV OLJDGRV \ FRDGDSWDGRV (que funcionan como una sola unidad gentica D FDXVD GH XQD IXHUWH VXSUHVLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ VRQ ORV UHVSRQVDEOHV GH OD H[SUHVLyQ del carcter. En la mayora de las gramneas IRUUDMHUDV HVWXGLDGDV HO DSR ORFXV DSDUHFH FRPR XQD UHJLyQ JHQyPLFD FRPSOHMD TXH FRQtiene numerosos genes que son transmitidos a OD SURJHQLH FRPR XQ EORTXH (V LPSRUWDQWH QRWDU TXH OD SDODEUD ORFXV HV XWLOL]DGD DTXt SDUD GHQRWDU XQD UHJLyQ GHO JHQRPD TXH SXHGH LQFOXLU XQR R YDULRV JHQHV (VWH ~QLFR ORFXV HQ DOJXQDV HVSHFLHV VHJUHJD HQ IRUPD 0HQGHOLD-
na y en otras, muestra una fuerte distorsin de la segregacin. El modelo del locus nico se DSOLFD D FDVL WRGDV ODV HVSHFLHV DSRVSyULFDV estudiadas (Pennisetum squamulatum, Pennisetum ciliare, Panicum maximum, Brachiaria sp., Paspalum notatum, Ranunculus sp y Hieracium sp 6XSRQH TXH OD FRQVWLWXFLyQ JHQpWLFD GH ODV SODQWDV VH[XDOHV VHUtD GHO WLSR QXOLSOH[R DDDD PLHQWUDV TXH ORV LQGLYLGXRV DSRPtFWLFRV VHUtDQ XQLSOH[RV $DDD VLHQGR $ HO DOHOR GRPLQDQWH GHWHUPLQDQWH GH OD DSRVSRUtD /RV FUX]DPLHQWRV GH LQGLYLGXRV GH HVWH WLSR JHQHUDUtDQ SURJHQLHV )1 que segregan en sexuales \ DSRPtFWLFRV FRQ UHODFLRQHV GH VHJUHJDFLyQ DSUR[LPDGDV DO DXQTXH HQ DOJXQRV FDVRV se observan fuertes desviaciones en esta relacin. Las distorsiones en la segregacin en P. notatum KDQ VLGR DWULEXLGDV D XQ HIHFWR SOHLRWUySLFR OHWDO GHO JHQHV GHWHUPLQDQWHV GH OD DSRPL[LV R D XQ OLJDPLHQWR SDUFLDO FRQ XQ JHQ letal. Por otro lado en Poa pratensis est claramente documentado que existe recombinacin HQWUH OD DSRVSRUtD \ OD SDUWHQRJpQHVLV OR FXDO LQGLFD XQ FRQWURO LQGHSHQGLHQWH SDUD FDGD XQR GH HVWRV FRPSRQHQWHV $GHPiV QR VH REVHUYD VXSUHVLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ HQ OD UHJLyQ (Q HVWD HVSHFLH OD SDUWHQRJpQHVLV SXHGH HYDOXDUVH IiFLOPHQWH HQ DXVHQFLD GH IHUWLOL]DFLyQ SRU HO desarrollo de embriones luego del tratamiento con auxina. Cuando este carcter se analiz en forma cualitativa se demostr que involucra D XQ ~QLFR JHQ 3RVWHULRUPHQWH VH SRVWXOy SDUD Poa XQ PRGHOR JHQpWLFR PiV FRPSOHMR TXH LQFOX\H JHQHV VLPSOHV QR OLJDGRV SDUD OD LQLFLDFLyQ GH OD DSRVSRUtD OD SUHYHQFLyQ GH OD DSRVSRUtD OD LQLFLDFLyQ GH OD SDUWHQRJpQHVLV OD SUHYHQFLyQ GH OD SDUWHQRJpQHVLV \ HO GHVDUUROOR GH OD PHJiVSRUD (VWH ~OWLPR PRGHOR HV VRVWHQLGR SRU OD REVHUYDFLyQ GH FODVHV GLVFUHWDV FRQ GLIHUHQWH H[SUHVLYLGDG GHO FDUiFWHU DSRPL[LV TXH SRGUtDQ VHU H[SOLFDGDV PHMRU FRQ XQ PRGHOR GH JHQHV (O PRGHOR GHO JHQ ~QLFR DSOLFDGR D QXPHURVDV HVSHFLHV DSRVSyULFDV GHMD VLQ VROXFLRnar varias cuestiones, adems de la ya menFLRQDGD UHVSHFWR D OD GLIHUHQWH H[SUHVLYLGDG 3RU HMHPSOR HQ HO FDVR GH Panicum maximum TXH HV XQD HVSHFLH DSRPtFWLFD IDFXOWDWLYD R VHD IRUPD DOJXQRV GH VXV GHVFHQGLHQWHV SRU VH[XDOLGDG VL ELHQ VH SRVWXOD TXH ODV SODQWDV
DSRPtFWLFDV VRQ XQLSOH[DV $DDD KDVWD DKRUD QR VH KDQ HQFRQWUDGR HQ OD QDWXUDOH]D SODQWDV FRPSOHWDPHQWH VH[XDOHV DDDD (VWD VLWXDFLyQ VH UHSLWH HQ RWUDV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV 7DPSRFR VH SXHGH H[SOLFDU HO KHFKR GH TXH VLHPSUH TXH VH XWLOL]y FRPR SROLQL]DGRU D XQD SODQWD DSRPtFWLFD pVWD UHVXOWy VHU XQ JHQRWLSR $DDD &yPR HV SRVLEOH TXH HO JHQRWLSR XQLSOH[R VHD HO ~QLFR H[LVWHQWH HQ ODV SREODFLRQHV DSRPtFWLFDV IDFXOWDWLYDV" (VWDV FXHVWLRQHV SODQWHDQ OD SRVLELOLGDG GH TXH OD KHUHQFLD GH OD DSRPL[LV QR SXHGD VHU H[SOLFDGD ~QLFDPHQWH HQ EDVH a la constitucin gentica, sino que tambin GHED WHQHUVH HQ FXHQWD HO HQWRUQR HSLJHQpWLco asociado y la estrecha relacin de ambas FRQGLFLRQHV FRQ OD SROLSORLGtD /D GHPRVWUDFLyQ UHFLHQWH GH TXH RFXUUHQ PRGLFDFLRQHV JHQpWLFDV \ HSLJHQpWLFDV HVSHFtFDV UHFXUUHQWHV \ UHSURGXFLEOHV GXUDQWH ORV HYHQWRV GH DOR \ DXWR SROLSORLGL]DFLyQ SODQWHD SRVLELOLGDGHV QRYHGRVDV UHVSHFWR DO RULJHQ GH OD UHJLyQ TXH FRQWLHQH D ORFXV DSR \ VX IXQFLRQDPLHQWR HQ UHODFLyQ FRQ OD SROLSORLGtD /D GLSORVSRUtD D GLIHUHQFLD GH OD DSRVSRUtD SDUHFH HVWDU FRQWURODGD SRU GRV R PiV JHQHV TXH VHJUHJDQ HQ IRUPD LQGHSHQGLHQWH UHVSRQVDEOHV GH OD DSRPHLRVLV OD SDUWHQRJpQHVLV \ OD IRUPDFLyQ DXWyQRPD GHO HQGRVSHUPR cuando esta ltima existe. El ligamiento entre HO GHVDUUROOR GHO VDFR HPEULRQDULR GLSORVSyULFR \ OD SDUWHQRJpQHVLV SXHGH VHU HOLPLQDGR HQ DO menos dos taxones de Asteraceae: Erigeron y Taraxacum (Q FUX]DV GH GLSORLGHV VH[XDOHV \ WULSORLGHV DSRPtFWLFRV GH Taraxacum muchos hbridos 3x y 4x forman semillas en ausencia GH SROLQL]DFLyQ PLHQWUDV TXH HO HQGRVSHUPR se desarrolla autnomamente, tal como se HVSHUDUtD HQ Taraxacum DSRPtFWLFRV 6LQ HPbargo, varios hbridos 3x no forman semillas si QR VH ORV SROLQL]D DXQTXH XQR GH HOORV SURGXMR HPEULRQHV QQ GHULYDGRV GH OD IHFXQGDFLyQ de sacos embrionarios no reducidos) cuando IXH SROLQL]DGR FRQ XQ GLSORLGH (VWH JHQRWLSR UHDOL]D DSRPHLRVLV DXVHQFLD GH UHGXFFLyQ GH OD JDPHWD SHUR HV LQFDSD] GH KDFHU SDUWHQRJpQHVLV /D LQGHSHQGHQFLD HQWUH OD GLSORVSRUtD \ OD SDUWHQRJpQHVLV IXH OXHJR FRQUPDGD HQ otras cruzas. El desarrollo autnomo del enGRVSHUPR WDPELpQ VHJUHJy HQ IRUPD VHSDUDGD GH OD SDUWHQRJpQHVLV &XULRVDPHQWH OD UHJLyQ
TXH GHWHUPLQD OD GLSORVSRUtD HQ Taraxacum QR SUHVHQWD UHGXFFLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ FRQVWLWX\pQGRVH MXQWR DO FDVR GH OD DSRVSyULca Poa pratensis HQ XQR GH ORV SRFRV HMHPSORV GH UHFRPELQDFLyQ HQ OD UHJLyQ JHQyPLFD TXH GHWHUPLQD OD IRUPDFLyQ DSRPHLyWLFD GH XQ VDFR HPEULRQDULR 6LPLODUPHQWH ODV SURJHQLHV RULJLQDGDV D SDUWLU GH FUX]DV HQWUH GLSORLGHV VH[XDOHV \ SROLSORLGHV DSRPtFWLFRV GH Erigeron annuus PRVWUDURQ TXH YDULDV SODQWDV GLSORVSyULFDV QR IRUPDEDQ HPEULRQHV VXJLULHQGR TXH VH KDEtD HOLPLQDGR HO FRPSRQHQWH GH OD SDUWHQRJpQHVLV 6H GHPRVWUy FODUDPHQWH TXH las dos caractersticas segregaban en forma LQGHSHQGLHQWH /D UHJLyQ TXH OOHYD HO ORFXV ',3 TXH GHWHUPLQD OD GLSORVSRUtD WDPELpQ SUHVHQta restriccin de la recombinacin (como en el caso de la regin APO en la mayora de las esSHFLHV DSRVSyULFDV HVWXGLDGDV SHUR QR DVt OD UHJLyQ UHVSRQVDEOH GH OD SDUWHQRJpQHVLV 2WUD HVSHFLH GLSORVSyULFD H[WHQVDPHQWH HVWXGLDGD es Tripsacum dactyloides, debido a que es un SDULHQWH OHMDQR GHO PDt] \ SUHVHQWD SRWHQFLDO SDUD OD WUDQVIHUHQFLD GHO FDUiFWHU D HVWD HVSHFLH SRU PHMRUDPLHQWR FRQYHQFLRQDO (Q HVWD HVSHFLH OD GLSORVSRUtD VH KHUHGD GH PDQHUD VLPSOH 9DULRV PDUFDGRUHV GHO FURPRVRPD de maz cosegregan estrictamente con el caUiFWHU $XQTXH OD UHJLyQ SUHVHQWD XQD IXHUWH VXSUHVLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ HQ ODV UD]DV DSRPtFWLFDV HQ ODV FUX]DV GH GLSORLGHV VH[XDles se detecta una recombinacin considerable entre los mismos marcadores. La localizacin GH OD DSRPL[LV HQ XQD WUDQVORFDFLyQ FURPRVRPDO HQ KtEULGRV GH PDt] Tripsacum tambin reforz la conclusin de que un nico cromosoma de Tripsacum WUDQVPLWH OD DSRPL[LV Transferencia del carcter apomixis a especies de inters agronmico $XQTXH GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GHO PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR OD DSRPL[LV SXHGH FRQVLGHrarse como un sistema que restringe la variaELOLGDG JHQpWLFD HVWD IRUPD GH UHSURGXFFLyQ FRQVWLWX\H XQD KHUUDPLHQWD ~QLFD SDUD GHVDUUROODU FXOWLYDUHV VXSHULRUHV \ SUHVHUYDU FRPELQDFLRQHV KtEULGDV LQGHQLGDPHQWH 3RU HOOR OD WUDQVIHUHQFLD GHO FDUiFWHU D ODV HVSHFLHV FXOWLYDGDV KD VLGR SHUVHJXLGD GHVGH KDFH WLHPSR %iVLFDPHQWH VH FRQVLGHUDQ WUHV JUXSRV
JHQHUDOHV GH SURFHGLPLHQWRV SDUD WUDQVIHULU OD DSRPL[LV D HVSHFLHV VH[XDOHV L KLEULGDFLyQ FOiVLFD HQWUH XQD SODQWD VH[XDO \ XQ SDULHQWH DSRPtFWLFR QDWXUDO LL LQLFLDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV SRU H[SHULPHQWRV GH EORTXHR GH JHQHV PXWDQWHV 7 HWLTXHWDGR WUDQVSRVLFLRQDO mutagnesis) y iii) transformacin de cultivares VH[XDOHV FRQ JHQHV TXH FRQWURODQ OD H[SUHVLyQ GHO FDUiFWHU /DV GRV SULPHUDV DSUR[LPDFLRQHV ya fueron intentadas, aunque hasta el momenWR ORV SUR\HFWRV QR KDQ VLGR GHO WRGR H[LWRVRV /D WHUFHUD RSFLyQ WRGDYtD FRQWLQ~D VLHQGR KLSRWpWLFD /RV SULPHURV H[SHULPHQWRV GLULJLGRV D LQWURGXFLU OD DSRPL[LV D WUDYpV GH FUX]DPLHQWRV IXHURQ UHDOL]DGRV KDFH XQRV DxRV SRU ' F. Petrov, quien realiz hibridizaciones entre PDt] \ UD]DV WHWUDSORLGHV GH Tripsacum dactiloydes XQD HVSHFLH GLSORVSyULFD WDPELpQ SHUWHQHFLHQWH D OD WULEX GH OD $QGURSRJyQHDV LJXDO TXH HO PDt] 3RVWHULRUPHQWH RWURV JUXSRV GH LQYHVWLJDFLyQ SURGXMHURQ KtEULGRV LQWHUHVSHFtcos de maz-Tripsacum TXH VH UHSURGXFHQ SRU DSRPL[LV 6LQ HPEDUJR FRPR ORV JHQRWLSRV obtenidos luego de una serie de retrocruzas FRQ PDt] VRQ FRPSOHWDPHQWH PDFKRHVWpULOHV HO SURJUHVR HQ OD UHFXSHUDFLyQ GHO JHQRPD GH HVWD HVSHFLH HVWi IXHUWHPHQWH DVRFLDGR FRQ OD FDSDFLGDG GH JHQHUDU KtEULGRV FRQ DOJ~Q JUDGR GH UHSURGXFFLyQ VH[XDO DSRPtFWLFRV IDFXOWDWLYRV /D LPSRVLELOLGDG GH JHQHUDU HVWH WLSR GH LQGLYLGXRV HV OD SULQFLSDO GLFXOWDG TXH HQIUHQWD HVWH VLVWHPD 8QD GLFXOWDG DGLFLRQDO es el fuerte requerimiento de una relacin 2:1 HQ HO Q~PHUR GH JHQRPDV KDSORLGHV PDWHUQRV \ SDWHUQRV TXH FRQWULEX\HQ D OD IRUPDFLyQ GHO HQGRVSHUPR HQ PDt] (VWRV SUREOHPDV KDQ GHPRUDGR HO SURJUHVR HQ OD LQWURGXFFLyQ GH OD DSRPL[LV HQ PDt] HQ ORV ~OWLPRV DxRV /D WUDQVIHUHQFLD GH OD DSRPL[LV DO PLMR SHUOD Pennisetum glaucum) desde P. squamulatum SRU XQ SURJUDPD GH PHMRUDPLHQWR LQLFLDGR DO QDO GH los 70 es considerado el ms avanzado de su WLSR (Q HVWH HVTXHPD ODV UHWURFUX]DV FRQ Pennisetum glaucum han avanzado hasta la generacin BC7, mediante la seleccin de grandes SURJHQLHV SDUD LGHQWLFDU LQGLYLGXRV DSRPtFWLFRV SDUFLDOPHQWH PDFKR IpUWLOHV (VWDV SODQWDV VRQ PRUIROyJLFDPHQWH PX\ SDUHFLGDV DO PLMR SHUOD DXQTXH SURGXFHQ XQ EDMR Q~PHUR GH
semillas viables. Este hecho estara vinculado D OD IRUPDFLyQ GHO HQGRVSHUPR \ HV XQ LQFRQveniente que an resta resolver. En resumen, OD IDFWLELOLGDG GH OD WUDQVIHUHQFLD HVWi D~Q SRU GHPRVWUDUVH /RV SULQFLSDOHV REVWiFXORV VRQ HTXLOLEUDU HO EDODQFH HQGRVSpUPLFR \ ORJUDU OD H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV D QLYHO GLSORLGH $TXt se debera lograr, seguramente a travs de un HVIXHU]R PXOWLGLVFLSOLQDULR LQWHUQDFLRQDO XQ FRQRFLPLHQWR SURIXQGR GH OD UHODFLyQ HQWUH OD H[SUHVLyQ GH OD DSRPL[LV \ OD SROLSORLGtD HVSHFLDOPHQWH GH OD DXWRSORLGtD (Q JUDPtQHDV GH OD subfamilia Panicoideas (Paspalum, Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis \ RWUDV HV SRVLEOH TXH HO VLVWHPD DSRPtFWLFR GLHUD GHO TXH existe en Pooideas (Poa, Elymus y otras). Son QHFHVDULRV FRQRFLPLHQWRV EiVLFRV PiV SURIXQGRV GH OD HPEULRORJtD GH HVSHFLHV VLOYHVWUHV FRQ VLVWHPDV DSRPtFWLFRV SDUD GHWHUPLQDU TXp JpQHUR R TXp HVSHFLH VRQ ORV PiV DGHFXDGRV SDUD REWHQHU ORV JHQHV TXH SRGUtDQ XWLOL]DUVH HQ IXWXUDV WUDQVIRUPDFLRQHV JHQpWLFDV TXH SHUPLWDQ XVDU OD DSRPL[LV HQ ORV FHUHDOHV /RV LQWHQWRV SDUD JHQHUDU PXWDQWHV DSRmcticas inactivando genes de la sexualidad SRU HWLTXHWDGR WUDQVSRVLFLRQDO R PXWDJpQHVLV no han tenido xito an en recrear el carcter SHUR SHUPLWLHURQ OD LGHQWLFDFLyQ GH YDULRV JHQHV LQYROXFUDGRV HQ HO FRQWURO GH HWDSDV SDUWLFXODUHV GH VX GHVDUUROOR FRPR OD SUROLIHUDFLyQ GHO HQGRVSHUPR HQ DXVHQFLD GH IHUWLOL]DFLyQ R OD JHQHUDFLyQ GH VDFRV QR UHGXFLGRV TXH SRU IHFXQGDFLyQ SURGXMHURQ KtEULGRV %,,, /D WUDQVformacin gentica de cultivares sexuales con genes que controlan el inicio del carcter es D~Q KLSRWpWLFD &DUDFWHUL]DFLyQ PROHFXODU GH OD UHJLyQ genmica que gobierna la apomixis En los ltimos aos la tecnologa de marFDGRUHV PROHFXODUHV \ ORV SURFHGLPLHQWRV GH biologa molecular han generado una cantidad considerable de conocimientos nuevos sobre ODV EDVHV PROHFXODUHV GH OD DSRPL[LV /RV JpQHURV GH JUDPtQHDV SDUD ORV FXDOHV VH GLVSRQH de ms datos acerca de la estructura molecular GH OD UHJLyQ JHQyPLFD DVRFLDGD D OD DSRPL[LV son hasta el momento Pennisetum y Paspalum. En Pennisetum ciliare y Pennisetum squamulatum OD UHJLyQ TXH GHWHUPLQD OD DSRPL[LV
es un sector no recombinante de tamao calFXODGR HQ XQRV 0SE 6H DLVODURQ FORQHV de BAC conteniendo marcadores moleculares TXH PDSHDQ HQ HVWD UHJLyQ $OJXQRV GH HVWRV FORQHV IXHURQ XWLOL]DGRV SDUD UHDOL]DU HVWXGLRV GH ),6+ KLEULGL]DFLyQ XRUHVFHQWH in situ; del ingls XRUHVFHQW LQ VLWX K\EULGL]DWLRQ) sobre FURPRVRPDV GH HVWDV HVSHFLHV (Q P. squamulatum ORV H[SHULPHQWRV GH ),6+ FRQUPDURQ TXH OD UHJLyQ DVRFLDGD D OD DSRVSRUtD $6*5 HV ItVLFDPHQWH PX\ JUDQGH PiV GH 0SE \ que est localizada cerca del telmero sobre HO EUD]R FRUWR GHO FURPRVRPD SRUWDGRU 7DPbin demostr que la ASGR es hemicigota y de naturaleza heterocromtica. Se encontr una VHxDO SURYHQLHQWH GH XQD UHSHWLFLyQ FHQWURPprica en el extremo distal de la ASGR, lo que VXJLHUH TXH HO FURPRVRPD SRUWDGRU VXIULy XQD inversin. En Pennisetum ciliaris el cromosoma SRUWDGRU HV 0SE PiV ODUJR TXH VXV SUHVXQtos homelogos, y la ASGR se localiza cerca del centrmero, en una regin hemicigota y KHWHURFURPiWLFD (Q DPEDV HVSHFLHV P. squamulatum y P. ciliaris) la ASGR contiene una reJLyQ GH DOUHGHGRU GH 0SE GH EDMR Q~PHUR GH FRSLDV /D UHJLyQ GH EDMD FRSLD HV DQTXHDGD D DPERV ODGRV SRU UHJLRQHV GH DOWR Q~PHUR GH FRSLDV R UHSHWLWLYDV (Q P. squamulatum OD VHxDO GH DOWD FRSLD VH ORFDOL]D ~QLFDPHQWH en la ASGR, mientras que en P. ciliare SXHGH VHU LGHQWLFDGD HQ WRGRV ORV GHPiV FURPRVRmas tambin. Se encontr que un retrotransSRVyQ OpieOLNH SXHGH PLPHWL]DU OD VHxDO GH DOWD FRSLD JHQHUDGD SRU ORV FORQHV GH %$& 8QD FRPSDUDFLyQ GHO RUGHQ GH ORV JHQHV HQ ORV %$&V FRUUHVSRQGLHQWHV D OD UHJLyQ GH EDMD FRSLD HQWUH ODV GRV HVSHFLHV GH Pennisetum demostr que aunque la regin est invertida, PDQWLHQH HO RUGHQ UHODWLYR HQ OD SRVLFLyQ GH genes en un fragmento relativamente grande del cromosoma (es macrosintnica) en ambas HVSHFLHV /D PDFURVLQWHQLD DSDUHQWHPHQWH QR se mantiene fuera de la ASGR. En una escala menor, segmentos con un orden de genes VLPLODU H[LVWHQ HQWUH ODV GRV HVSHFLHV DSRPtFWLFDV \ HVWRV VHJPHQWRV SXHGHQ VHU KDOODGRV P~OWLSOHV YHFHV GHQWUR GH OD $6*5 HQ DPEDV HVSHFLHV ,QLFLDOPHQWH VH LGHQWLFDURQ UHJLRnes sintnicas con el cromosoma 11 de arroz, SHUR OXHJR VH GHPRVWUy TXH GHQWUR GH OD UHJLyQ
H[LVWHQ P~OWLSOHV VHFWRUHV PiV SHTXHxRV TXH FRPSDUWHQ sintenia con distintos cromosomas GH DUUR] FURPRVRPDV \ 8Q VHFWRU TXH UHSUHVHQWD 0SE a GH la regin) fue secuenciado, y los genes incluiGRV VH FRQRFHQ (QWUH HOORV HVWiQ FRSLDV GH genes homlogos a baby-boom, que fueron HVWXGLDGRV GHWDOODGDPHQWH FRPR SRVLEOHV FDQGLGDWRV D FRQWURODU DOJXQD HWDSD GH OD DSRPL[LV HQ OD HVSHFLH Baby-boom KDEtD VLGR LGHQWLcado inicialmente en Brassica napus, inducido HQ FXOWLYRV GH PLFUyVSRUDV TXH UHDOL]DEDQ HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD /D VROD VREUHH[SUHVLyQ de baby-boom en Arabidopsis thaliana induce OD IRUPDFLyQ GH HPEULRQHV VRPiWLFRV HFWySLFRV HQ KRMDV \ HV VXFLHQWH SDUD SURYRFDU HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD HVSRQWiQHD 7DPELpQ VH GHWHUPLQy OD SUHVHQFLD GH UHWURWUDQVSRVRQHV Opie-2-like, CACTA y helitrones en la regin ASGR de Pennisetum. /D FDUDFWHUL]DFLyQ SRU PDSHR JHQpWLFR GHO ORFXV DSR HQ HVSHFLHV GH Paspalum determin una alta conservacin de la regin entre P. notatum, P. simplex y P. mallacophylum. En P. notatum se observa homologa (sintenia) con segmentos de los cromosomas 12 y 2 de arroz, mientras que en Paspalum simplex y Paspalum malacophyllum slo con el cromosoma 12 de arroz. Dado que tambin en Brachiaria brizantha YDULDV VRQGDV TXH PDSHDQ HQ HO FURmosoma 2 de arroz fueron asociadas al locus DSR HV SRVLEOH HQWUHYHU XQD FLHUWD FRQVHUYDFLyQ GHO PHFDQLVPR GH FRQWURO GH OD DSRVSRUtD SDUD DOJXQDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV 3RU RWUR ODGR D SDUWLU GH XQD JHQRWHFD HQ %$& GH P. simplex VH DLVOy XQ FORQ + TXH FRQWLHQH VHFXHQFLDV OLJDGDV D OD DSRVSRUtD en P. simplex y P. notatum ([SHULPHQWRV GH ),6+ FRQ HO FORQ + GHWHUPLQDURQ TXH HO ORFXV DSR VH HQFXHQWUD HQ UHJLRQHV QR SHricentromricas del genoma de P. simplex. La VHFXHQFLDFLyQ GH + UHYHOy UHJLRQHV que mostraron homologa con los genes EXS XQ UHFHSWRU GHO WLSR SURWHtQD TXLQDVD ULFR HQ leucinas) y PKD GRPLQLR GH SURWHtQD TXLQDVD (VWRV JHQHV UHVXOWDURQ VLPLODUHV D 6(5. UHFHSWRU WLSR SURWHLQD TXLQDVD GH OD HPEULRJpQHsis somtica) el cual fue asociado con la induccin de la formacin de embriones somticos en zanahoria y con la formacin de los sacos
HPEULRQDULRV DSRVSyULFRV HQ Poa. En P. notatum (como en Pennisetum squamulatum WDPELpQ VH SRVWXOy OD H[LVWHQFLD GH una inversin gentica en la regin del APO locus, en base a observaciones citogenticas y a HYLGHQFLDV SURYHQLHQWHV GHO PDSHR /RV GDWRV GHULYDGRV GH PDSHR JHQpWLFR LQGLFDQ TXH OD UHJLyQ DVRFLDGD D OD DSRPL[LV HQ P. notatum HV XQ VHFWRU H[WHQVR GH 0SE TXH SUHVHQWD XQD IXHUWH VXSUHVLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ \ DSDUHDPLHQWR SUHIHUHQFLDO GH FURPRVRPDV YHU )LJXUD ([SHULPHQWRV GH 06$3 SROLPRUVPR GH DPSOLFDFLyQ VHQVLEOH D PHWLODFLyQ GHO ingls 0HWK\ODWLRQ 6HQVLWLYH $PSOLFDWLRQ 3Rlymorphisms \ 5)/3 SROLPRUVPR GH ORQJLWXG de fragmentos de restriccin, del ingls Restriction Fragment Length Polymorphisms) con enzimas sensibles a metilacin y la secuenciaFLyQ GH FORQHV SURYHQLHQWHV GH OD $6*5 SHUmitieron determinar que se trata de una regin metilada extensivamente y que contiene abunGDQWHV WUDQVSRVRQHV \ UHWURWUDQVSRVRQHV (Q resumen, los estudios realizados en Paspalum indican que, en forma similar al caso de Pennisetum squamulatum, la ASGR es una regin H[WHQVD TXH SRGUtD KDEHU VXIULGR XQD LQYHUVLyQ \ TXH SUHVHQWD WRGDV ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH OD KHWHURFURPDWLQD VXSUHVLyQ GH OD UHFRPbinacin, metilacin extensiva, abundancia de HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV \ DSDUHDPLHQWR SUHferencial de cromosomas. Adems se detect que varios genes de esta regin estn silenFLDGRV HQ ODV UD]DV DSRPtFWLFDV UHVSHFWR D ODV sexuales (ver siguiente seccin). Expresin de genes durante el desarrollo apomctico Una serie de trabajos recientes enfocados HQ HVWXGLDU OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV \ VH[XDOHV KDQ LQIRUPDGR HO DLVODPLHQWR GH WUDQVFULSWRV GH $51P HVSHFtFRV GHO GHVDUUROOR DSRPtFWLFR (Q HO DxR VH SXEOLFy XQ WUDEDMR SLRQHUR HQ OD UHDOL]DFLyQ GH HVWRV SHUODGRV GHO WUDQVFULSWRPD DOOt ORV autores informaron que un gen (Pcs-2) se exSUHVD VyOR HQ RYDULRV VH[XDOHV PLHQWUDV RWURV dos (Pca-2 y Pca-3) lo hacen exclusivamente HQ RYDULRV DSRPtFWLFRV GH EXIIHOJUDVV Pennisetum ciliare (VWRV WUDQVFULSWRV QR SUHVHQtaron homologas con genes incluidos en los
Figura 4: /RFDOL]DFLyQ GH OD UHJLyQ TXH FRQWUROD OD DSRVSRUtD HQ Paspalum notatum por medio de marcadores moleculares. 3DQHO $ JUXSR GH OLJDPLHQWR 0D GHO PDSD JHQpWLFR GH Paspalum notatum, que FRQWLHQH D OD UHJLyQ DSR (O FXDGUR GH DEDMR PXHVWUD XQ JUXSR GH PDUFDGRUHV TXH HVWiQ OLJDGRV D OD DSRPL[LV 1yWHVH OD VXSUHVLyQ GH OD UHFRPELQDFLyQ HQ HO ORFXV (O JUXSR 0D HVWi OLJDGR HQ UHSXOVLyQ DO JUXSR 0E 3DQHO % JHO GH $)/3 REWHQLGR GXUDQWH OD FRQVWUXFFLyQ GH XQ PDSD JHQpWLFR GH Paspalum notatum.
bancos de datos. Ms adelante otros autores LQIRUPDURQ OD H[SUHVLyQ GH asg1 JHQ HVSHFtFR GH OD DSRPL[LV HQ SULPRUGLRV RUDOHV GH XQD DFFHVLyQ DSRPtFWLFD GH JXLQHDJUDVV Panicum maximum DVRFLDGD WHPSRUDOPHQWH FRQ OD DSDULFLyQ GH ODV FpOXODV LQLFLDOHV GH OD DSRVSRUtD /D VHFXHQFLD GH asg1 es similar a varios JHQHV HVSHFtFRV GH OD VHPLOOD R HO HPEULyQ GH GLIHUHQWHV HVSHFLHV YHJHWDOHV HQWUH HOORV rd22 XQ JHQ H[SUHVDGR HQ VHPLOODV H LQGXFLGR SRU sequa en A. thaliana), grp XQ JHQ TXH FRGLFD XQD SURWHtQD ULFD HQ JOLFLQD GH OD SDUHG FHOXlar de ovarios de Phaseolus vulgaris), usp (un JHQ TXH FRGLFD D XQD SURWHtQD GH VHPLOOD GH Vicia fava), plyg1 XQ JHQ TXH FRGLFD D XQ SUHFXUVRU GH OD FDGHQD EHWD GH SROLJDODFWXURQDVD de Lycopersicum esculentum) y adr6p (un gen UHJXODGR QHJDWLYDPHQWH SRU DX[LQD GH Glycine max). La homologa de secuencia con todos HVWRV JHQHV HV DOWDPHQWH VLJQLFDWLYD SRU OR TXH ORV DXWRUHV LQWHUSUHWDURQ TXH asg1 SRGUtD FXPSOLU XQD IXQFLyQ QXHYD GHQWUR GHO FRPSOHjo de formacin del embrin y la semilla, relaFLRQDGD FRQ OD DSDULFLyQ GH ODV LQLFLDOHV GH OD
DSRVSRUtD 7DPELpQ VH FRPSDUy OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HQ RUHV GH JHQRWLSRV VH[XDOHV \ DSRPtFWLFRV GH P. notatum \ VH LGHQWLFy DO JHQ arp1, que es homlogo a la cinesina katD de A. thaliana 6H LGHQWLFDURQ JHQHV GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO HQ RYDULRV GH SODQWDV DSRPtFWLFDV y sexuales de Brachiaria brizantha, entre ellos XQ JHQ KRPyORJR D XQD SURWHtQD TXLQDVD IDPLlia MAP quinasas, del ingls mitogen-activated protein). Recientemente una caracterizacin ms exWHQVD GHO WUDQVFULSWRPD IXH FRPSOHWDGD SDUD ODV HVSHFLHV DSRVSyULFDV Poa pratensis y Paspalum notatum /D PLVPD SHUPLWLy HO DLVODPLHQWR GH FHQWHQDUHV GH JHQHV GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO HQ RUHV GH JHQRWLSRV VH[XDOHV \ DSRVSyULFRV )LJXUD 9DULRV JHQHV FRPXQHV IXHURQ LGHQWLFDGRV HQ DPEDV HVSHFLHV \ PXFKRV GH ORV UHVWDQWHV SHUWHQHFHQ D ODV PLVPDV YtDV IXQFLRQDOHV /RV JHQHV LGHQWLFDGRV VH LQVFULEHQ GHQWUR GH XQDV SRFDV FODVHV RQWROyJLFDV WUDQVGXFFLyQ GH VHxDOHV SURWHyOLVLV FRQWURO GHO FLFOR FHOXODU FRQWURO GH OD WUDQVFULScin, estructura de la cromatina y actividad de
Figura 5: $QiOLVLV GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH JHQHV HQ LQRUHVFHQFLDV GH SODQWDV DSRPtFWLFDV \ sexuales. 3DQHO $ ,PDJHQ GH ORV yUJDQRV UHSURGXFWLYRV GH Paspalum notatum FDSWDGD SRU PLFURVFRStD HOHFWUyQLFD GH EDUULGR \ FRORUHDGD DUWLFLDOPHQWH (Q HO FHQWUR VH REVHUYD HO RYDULR URGHDGR SRU ODV DQWHUDV TXH KDQ OLEHUDGR DOJXQRV JUDQRV GH SROHQ JHQWLOH]D GH OD 'UD $QD 0DUtD *RQ]iOH] ,%21( &21,&(7 Panel B. Geles de display diferencial PRVWUDQGR OD H[SUHVLyQ GH WUDQVFULSWRV HQ ORV yUJDQRV UHSURGXFWLYRV GH XQD SODQWD DSRPtFWLFD 4 \ RWUD VH[XDO 4 GH Paspalum notatum /DV HFKDV LQGLFDQ ORV WUDQVFULSWRV TXH SUHVHQWDQ H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO 3DQHOHV & \ ' D SDUWLU GH ORV JHOHV VH DLVODURQ IUDJPHQWRV GH JHQHV TXH IXHURQ XWLOL]DGRV FRPR VRQGDV HQ H[SHULPHQWRV GH KLEULGL]DFLyQ in situ de tejidos UHSURGXFWLYRV GH Paspalum notatum (Q HO SDQHO & VH PXHVWUD OD KLEULGL]DFLyQ GHO WUDQVFULSWR 1 FRQ ORV yUJDQRV UHSURGXFWLYRV GH OD SODQWD VH[XDO 4 (Q HO SDQHO ' VH PXHVWUD OD KLEULGL]DFLyQ GHO PLVPR WUDQVFULSWR 1 FRQ ORV yUJDQRV UHSURGXFWLYRV GH OD SODQWD DSRPtFWLFD 4 (Q HO yYXOR VH REVHUYD OD FODUD H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GHO JHQ EODQFR JHQWLOH]D GHO 'U *XLOOHUPR 6HLMR ,%21( &21,&(7
WUDQVSRVRQHV 0XFKRV GH ORV JHQHV DLVODGRV VRQ LGpQWLFRV D RWURV FX\D H[SUHVLyQ HV DIHFWDGD HQ LQRUHVFHQFLDV SRU XQ FDPELR HQ HO QLYHO GH SORLGtD OR TXH HYLGHQFLD D QLYHO PROHFXODU HO DOWR JUDGR GH UHODFLyQ HQWUH OD DSRPL[LV \ OD SR-
OLSORLGL]DFLyQ $VLPLVPR ORV JHQHV DIHFWDGRV GXUDQWH ORV FDPELRV GH SORLGtD SHUWHQHFHQ FODramente a las mismas clases funcionales que ORV FRQWURODGRV GXUDQWH OD DSRPL[LV Entre los genes activados o silenciados du-
UDQWH HO GHVDUUROOR DSRVSyULFR VH HQFXHQWUDQ QXPHURVRV UHSUHVHQWDQWHV GH XQD FDVFDGD GH WUDQVGXFFLyQ GH VHxDOHV GH WLSR (5. TXLQDVD UHJXODGD SRU VHxDOHV H[WUDFHOXODUHV GHO LQJOpV extracellular receptor kinase 3RU HMHPSOR UHFHSWRUHV /55 UHJLRQHV ULFDV HQ UHSHWLFLRQHV GH OHXFLQDV 5DV SURWHtQDV GH XQLyQ D DFWLYDGRUHV GH 5DV SURWHtQDV DQFODGDV D *3, JOLFRVLOIRVIDWLGLO LQRVLWRO 0$3 TXLQDVDV IRVIROLSDVD C, fosfatidilinositol quinasas, serin-treonin fosIDWDVDV VHULQWUHRQLQ TXLQDVDV SURWHtQDV GH interaccin con PRIP y otros genes asociados. Asimismo numerosos genes relacionados con HO UHFDPELR GH SURWHtQDV SURWHtQDV ULERVRPDOHV VHULQ SURWHLQDVDV XELTXLWLQD IDFWRUHV GH HORQJDFLyQ 7DPELpQ VH GHWHFWy OD H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV HQWUH SODQWDV DSRPtFWLFDV \ VH[XDOHV SHUR UHVWDUtD FRPSUREDU VL pVWD VH PDQWLHQH HQ RWURV JHQRWLSRV \ VL UHDOPHQWH SRGUtD HVWDU FXPSOLHQGR XQ rol relacionado con el carcter. En el caso de P. notatum, se observa un fenmeno interesante. Muchos de los genes siOHQFLDGRV HQ ODV SODQWDV DSRPtFWLFDV UHVSHFWR a las sexuales cuentan con secuencias homORJDV HQ OD SRUFLyQ GLVWDO GHO FURPRVRPD GH arroz, una regin que fue asociada con el locus DSR HQ HVWD HVSHFLH 0iV D~Q FXDQGR DOJXQRV de estos genes silenciados fueron localizados HQ OD SURSLD HVSHFLH UHVXOWDURQ DVRFLDGRV DO ORFXV DSR (VWH JUXSR GH JHQHV FRPSUHQGH OD SURWHtQD /XQD3DUN % XQ KRPyORJR GH OD SURWHtQD checkpoint &+. XQD SURWHtQD DQFODGD D *3, XQD SURWHtQD VLPLODU D H[WHQVLQD XQD 0$3. SROLXELTXLWLQD XQ UHFHSWRU /55 XQD SURWHtQD KLSRWpWLFD \ XQ UHWURWUDQVSRVyQ La ubicacin de estos genes en cercanas del DSR ORFXV MXQWR FRQ VX H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV \ VH[XDOHV ORV FRQYLHUWHQ HQ FDQGLGDWRV LQWHUHVDQWHV SDUD HO FRQWURO GH OD DSRPL[LV /RV JHQHV LQFOXLGRV HQ OD UHJLyQ DSR SDUHFHQ HVWDU VLOHQFLDGRV HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV UHVSHFWR D ODV VH[XDOHV 6H KD SRVWXODGR que en P. notatum SRGUtD KDEHU RFXUULGR XQD inversin de un sector sintnico con los cromosomas 2 y 12 de arroz, seguida de una invaVLyQ GH KHWHURFURPDWLQD HQ OD UHJLyQ OD SUROLIHUDFLyQ GH UHWURWUDQVSRVRQHV \ OD PRGLFDFLyQ ORFDO GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD 3RGUtD HVWD PRGLFDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ VHU OD FDXVD GH OD
DSRPL[LV" &XiO R FXiOHV JHQHV GH OD UHJLyQ VHUtDQ UHVSRQVDEOHV GH GLVSDUDU HO FDUiFWHU" /D GLIHUHQWH H[SUHVLYLGDG GH OD DSRPL[LV TXH REVHUYDPRV HQ QXPHURVDV HVSHFLHV HV FRQVHFXHQFLD GLUHFWD GHO JUDGR GH PRGXODFLyQ HSLgentica que afecta a la regin? Aunque se ha avanzado mucho en la caracterizacin de las bases moleculares del carcter, estas y otras SUHJXQWDV SHUPDQHFHQ VLQ UHVSXHVWD 7DPELpQ VH UHDOL]DURQ HVWXGLRV GH H[SUHVLyQ GH WUDQVFULSWRV HQ LQRUHVFHQFLDV LQPDGXUDV HQ JHQRWLSRV DSRPtFWLFRV \ VH[XDOHV GH GLIHUHQWHV SORLGtDV GH OD HVSHFLH GLSORVSyULFD Eragrostis curvula. Los estudios realizados GHPRVWUDURQ TXH SDUD XQ JUXSR QXPHURVR GH JHQHV ORV SHUOHV GH H[SUHVLyQ GH XQ JHQRWLSR WHWUDSORLGH DSRPtFWLFR [ DSR \ XQ GLSORLGH sexual (2x sex) resultaron casi idnticos entre Vt \ D OD YH] GLIHUHQWHV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ XQ JHQRWLSR WHWUDSORLGH VH[XDO [ VH[ /D FDVL WRWDOLGDG GH ORV JHQHV LPSOLFDGRV VH KDOODQ VLOHQFLDGRV HQ ORV JHQRWLSRV [ VH[ \ [ DSR (VWRV UHVXOWDGRV VRQ LQHVSHUDGRV \D TXH HVWRV LQGLYLGXRV [ VH[ \ [ DSR SUHVHQWDQ GLIHUHQFLDV WDQWR HQ VX SORLGtD FRPR HQ VX PRGR GH UHSURGXFFLyQ 3DUD H[SOLFDU HVWRV UHVXOWDGRV ORV DXWRUHV IRUPXODURQ OD KLSyWHVLV GH TXH XQD IDOOD SDUFLDO HQ HO UHDFRPRGDPLHQWR GH OD H[SUHVLyQ GH DOJXQRV JHQHV GXUDQWH OD SROLSORLGL]DFLyQ HQ HVWD HVSHFLH FXOPLQDUtD HQ HO GLVSDUR PROHFXODU GH OD GLSORVSRUtD 2 VHD DQWH XQ FDPELR GH SORLGtD XQ JUXSR QXPHURVR GH JHQHV GHEHUtD DFWLYDU VX H[SUHVLyQ SDUD ORJUDU PDQWHQHU OD sexualidad. Una falla en esta activacin dara FRPR UHVXOWDGR XQ IHQRWLSR DSRPtFWLFR (VWH PRGHOR FRLQFLGH FRQ OD HYLGHQFLD H[SHULPHQWDO de Paspalum HQ HO KHFKR GH TXH OD DSRPL[LV SRGUtD HVWDU FDXVDGD SRU XQ VLOHQFLDPLHQWR GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD *HQpWLFDPHQWH OD DSRVSRUtD \ OD GLSORVSRUtD QR SDUHFHQ WHQHU HO PLVPR RULJHQ \D TXH ORV GLVSDUDGRUHV GH DPERV SURcesos han sido asociados a regiones sintnicas de arroz con diferente localizacin. Sin embarJR YDULRV GH ORV JHQHV H[SUHVDGRV GXUDQWH HO GHVDUUROOR GLSORVSyULFR VRQ ORV PLVPRV R WLHQHQ UHODFLyQ FRQ ORV GH OD DSRVSRUtD GH KHFKR ODV PLVPDV FODVHV IXQFLRQDOHV SDUHFHQ DIHFWDGDV SRU OR TXH SDUHFH KDEHU XQD UHODFLyQ PROHFXODU HYLGHQWH HQWUH DPERV WLSRV GH DSRPL[LV /D H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH JHQHV IXH HVWXGLDGD
WDPELpQ HQ HVSHFLHV GLSORVSyULFDV GH Boechera (Brasicaceae). En Boechera microphylla y B. lignifera DSRPtFWLFDV \ B. formosa (sexual) VH GHWHFWDURQ JHQHV GLIHUHQFLDOPHQWH H[SUHVDGRV XWLOL]DQGR PLFURDUUHJORV (QWUH ORV JHQHV LGHQWLFDGRV VH HQFXHQWUDQ DOJXQRV UHlacionados con la organizacin de la estructura GHO JHQRPD FRPR JHQHV GHO JUXSR SRO\FRPE 3F* \ IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ GH WLSR 0$'6 ER[ /RV DXWRUHV SRVWXODURQ TXH ORV JHQHV GHO JUXSR 3F* VREUHH[SUHVDGRV HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV SRGUtDQ HVWDU SURGXFLHQGR OD DOWHUDFLyQ HQ OD H[SUHVLyQ GH ORV JHQHV GH WLSR 0$'6 ER[ FRQFOX\HQGR HQ HO GHVDUUROOR GH DSRPL[LV aunque se ignora si ste es el factor causal del GLVSDUR GHO FDUiFWHU D QLYHO GH FRQWURO JHQpWLFR HQ HVWDV HVSHFLHV 2WURV HVWXGLRV GH PXFKD LPSRUWDQFLD SDUD la elucidacin de las bases moleculares de OD DSRPL[LV LQIRUPDURQ OD FDUDFWHUL]DFLyQ GH PXWDQWHV HQ ODV HVSHFLHV PRGHOR TXH VLQ VHU DSRPtFWLFDV SUHVHQWDURQ IHQRWLSRV VLPLODUHV D DOJXQDV HWDSDV SDUWLFXODUHV GH VX GHVDUUROOR (QWUH HOODV GHEHPRV FLWDU ODV PXWDQWHV SDUtenogenticas H, V V PHGHD y medicis de Arabidopsis thaliana OD PXWDQWH DSRPHLyWLca dyad de Arabidopsis thaliana; 3) una mutante LRR de arroz que da origen a clulas anloJDV D ODV LQLFLDOHV GH DSRVSRUtD \ OD PXWDQWH embriognica somtica SERK de zanahoria 6(5. HV XQ UHFHSWRU GH WLSR /55 3DUWLFXlarmente en el caso de la interesante mutante DSRPHLyWLFD dyad de A. thaliana, VH KD FRQUPDGR TXH OD LQDFWLYDFLyQ GH XQ JHQ UHVSRQVDble de la cohesin de las cromtides hermanas y organizacin del centrmero durante la meioVLV GH FpOXODV JHUPLQDOHV '<$'6:,7&+ HV FDSD] GH JHQHUDU XQ IHQyPHQR VLPLODU D OD DSRPHLRVLV HQ GLFKDV FpOXODV OOHYDQGR OXHJR GH OD IHUWLOL]DFLyQ SRU SROHQ \ D OD SURGXFFLyQ GH KtEULGRV %,,, /D EDMD WDVD GH SURGXFFLyQ GH VDFRV QR UHGXFLGRV \ OD DXVHQFLD GH SDUWHQRJpnesis en esta mutante es un indicador ms de que aunque la regin genmica que controla el carcter es nica, hay ms de un gen o quizs XQD FRQGLFLyQ HSLJHQpWLFD FRPSOHMD LQYROXFUDGDV HQ OD UHJXODFLyQ GH OD DSRPL[LV . Perspectivas $ SHVDU GH TXH D~Q HV QHFHVDULR UHVSRQGHU numerosas cuestiones sobre la accin de ge-
QHV OD IXQFLyQ \ OD UHJXODFLyQ GH OD DSRPL[LV VH YLVOXPEUD SDUD HO IXWXUR XQ HVFHQDULR SURmisorio. Nuestro entendimiento de las bases PROHFXODUHV GH OD DSRPL[LV VH KD LQFUHPHQtado notablemente a causa del desarrollo de WpFQLFDV SRGHURVDV GH ELRORJtD PROHFXODU \ DO FUHFLHQWH LQWHUpV HQ HO WHPD GHVSHUWDGR HQ ODV LQVWLWXFLRQHV FLHQWtFDV H LQYHVWLJDGRUHV 3RU RWUD SDUWH FRQ HO DGYHQLPLHQWR GHO DQiOLVLV JHQyPLFR D JUDQ HVFDOD VH GLVSRQH GH QXHYDV KHUUDPLHQWDV SDUD HO GHVFXEULPLHQWR GH JHQHV \ ORV DQiOLVLV GH H[SUHVLyQ (V GH HVSHUDU TXH HQ ORV SUy[LPRV DxRV HVWH DXPHQWR GHO FRQRcimiento de las bases genticas y moleculares GHO FDUiFWHU SHUPLWD FRQWURODU VX H[SUHVLyQ FRQ QHV GH PHMRUDPLHQWR 6RODPHQWH D WUDYpV GH XQD FRPSUHQVLyQ SURIXQGD GHO PHFDQLVPR ELROyJLFR UHVSRQVDEOH GH OD DSRPL[LV \ GH ODV LPSOLFDQFLDV HYROXWLYDV GHULYDGDV GH VX XWLOL]DFLyQ SRGUi FRQFUHWDUVH VX WUDQVIHUHQFLD H[LWRVD D ODV HVSHFLHV GH JUDQ FXOWLYR 3DUD HVWR VH UHTXHULUi XQ IXHUWH DSR\R QDQFLHUR D ORV HVWXGLRV EiVLFRV VREUH HO WHPD 3RU RWUD SDUWH GDGR TXH OD SUREOHPiWLFD GHO FDUiFWHU HV PX\ FRPSOHMD VHUi LQGLVSHQVDEOH IRUWDOHFHU OD FRRSHUDFLyQ LQWHUQDFLRQDO \D H[LVWHQWH SDUD PDQWHQHU XQ HVSDFLR GH GLVFXVLyQ \ GH LQWHUFDPELR de materiales e informacin. Lecturas recomendadas
Albertini E, Marconi G, Barcaccia G, Raggi L, Falcinelli M . 2004. Isolation of candidate genes IRU DSRPL[LV LQ Poa pratensis. Plant Mol Biol, $VNHU 6( DQG -HUOLQJ / $SRPL[LV LQ SODQWV CRC Press, London. %LFNQHOO 5 DQG .ROWXQRZ $ 8QGHUVWDQGLQJ $SRPL[LV 5HFHQW $GYDQFHV DQG 5HPDLQLQJ &RQXQGUXPV 7KH 3ODQW &HOO 66 Calderini O, Chang SB, De Jong H, Busti A, Paolocci ) $UFLRQL 6 GH 9ULHV 6 $EPD +HQNHQV 0+& .OHLQ /DQNKRUVW 50 'RQQLVRQ ,6 3XSLOOL ) Molecular cytogenetics and DNA sequence DQDO\VLV RI DQ DSRPL[LVOLQNHG %$& LQ 3DVSDOXP VLPSOH[ UHYHDO D QRQ SHULFHQWURPHUH ORFDWLRQ DQG SDUWLDO PLFURFROLQHDULW\ ZLWK ULFH 7KHRU $SSO Genet, 112, 1179-1191. Cervigni GDL, Paniego N, Pessino S, Selva JP, 'tD] 0 6SDQJHQEHUJ * DQG (FKHQLTXH 9 *HQH H[SUHVVLRQ LQ GLSORVSRURXV DQG VH[XDO (UDJURVWLV FXUYXOD JHQRW\SHV ZLWK GLIIHULQJ SORLG\
OHYHOV 3ODQW 0RO %LRO &UDQH &) &ODVVLFDWLRQ RI DSRPLFWLF PHFKDQLVPV ,Q )ORZHULQJ RI $SRPL[LV )URP 0HFKDQLVPV WR *HQHWLF (QJLQHHULQJ < 6DYLGDQ J.G. Carman, and T. Dresselhaus, eds (Mexico: &,00<7 ,5' (XURSHDQ &RPPLVVLRQ '* 9, SS 'R 9DOOH &% DQG 0LOHV -: %UHHGLQJ RI DSRPLFWLF VSHFLHV ,Q 6DYLGDQ< &DUPDQ -* DQG 'UHVVHOKDXV 7 HGV 7KH RZHULQJ RI DSRPL[LV IURP PHFKDQLVPV WR JHQHWLF HQJLQHHULQJ 0H[LFR ') &,00<7 ,5' (XURSHDQ &RPPLVVLRQ '* 9, )$,5 SS Grimanelli D, Leblanc O, Perotti E, Grossniklaus U 'HYHORSPHQWDO JHQHWLFV RI JDPHWRSK\WLF DSRPL[LV 7UHQGV LQ *HQHWLFV .ROWXQRZ $0 %LFNQHOO 5$ &KDXGKXU\ $0 $SRPL[LV PROHFXODU VWUDWHJLHV IRU WKH JHQHUDWLRQ of genetically identical seeds without fertilisation. 3ODQW 3K\VLRO /DVSLQD 19 9HJD 7 6HLMR -* *RQ]iOH] $0 Martelotto LG, Stein J, Podio M, Ortiz JPA, (FKHQLTXH 9& 4XDULQ &/ 3HVVLQR 6& *HQH H[SUHVVLRQ DQDO\VLV DW WKH RQVHW RI DSRVSRURXV DSRPL[LV LQ 3DVSDOXP QRWDWXP 3ODQW 0RO %LRO 1RJOHU *$ *DPHWRSK\WLF $SRPL[LV ,Q -RKUL %0 HG (PEU\RORJ\ RI $QJLRVSHUPV 6SULQJHU 9HUODJ %HUOLQ
2]LDV$NLQV 3 $SRPL[LV 'HYHORSPHQWDO Characteristics and Genetics. Critical Reviews in 3ODQW 6FLHQFH Pessino SC, Ortiz JPA, Hayward MD, Quarin CL . 7KH PROHFXODU JHQHWLFV RI JDPHWRSK\WLF DSRPL[LV +HUHGLWDV 3XSLOOL ) 0DUWtQH] (- %XVWL $ &DOGHULQL 2 4XDULQ &/ $UFLRQL 6 &RPSDUDWLYH PDSSLQJ UHYHDOV SDUWLDO FRQVHUYDWLRQ RI V\QWHQ\ DW WKH DSRPL[LV ORFXV LQ 3DVSDOXP VSS 0RO *HQ *HQRPLFV 5DYL 0 0DULPXWKX 03 6LGGLTL , *DPHWH IRUPDWLRQ ZLWKRXW PHLRVLV LQ $UDELGRSVLV 1DWXUH 6DYLGDQ < $SRPL[LV *HQHWLFV DQG %UHHGLQJ ,Q 3ODQW %UHHGLQJ 5HYLHZV YROXPH - -DQLFN (Ed.). John Wiley & Sons, Inc. London. 6PLWK - 1RWLFH RI D SODQW ZKLFK SURGXFHV VHHGV ZLWKRXW DQ\ DSSDUHQW DFWLRQ RI SROOHQ Transactions of the Linnaean Society of London PHHWLQJ RI -XQH Stein J, Pessino SC, Martnez EJ, Rodrguez MP, Siena L, Quarin CL, Ortiz JPA . 2007. A genetic PDS RI WHWUDSORLG 3DVSDOXP QRWDWXP )OXJJH (bahiagrass) based on single-dose molecular PDUNHUV 0ROHFXODU %UHHGLQJ 9LHOOH&DO]DGD -3 &UDQH &) 6WHOO\ '0 $SRPL[LV 7KH $VH[XDO 5HYROXWLRQ 6FLHQFH 1322-1323.
V. CAPTULO 4 Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales

Alejandro S. Escandn, Pablo A. Marinangeli y Mariana Prez de la Torre 1. Introduccin (Q OD VHJXQGD PLWDG GHO VLJOR ;; OD RULFXOWXra comenz a transformarse en una verdadera industria que deba abastecer a un mercado PX\ H[LJHQWH DOWDPHQWH FRPSHWLWLYR \ iYLGR GH QRYHGDGHV (Q HO GHVDUUROOR GH HVWH SURFHso la incidencia de la biotecnologa result de una relevancia insoslayable. &RPR WRGD LQGXVWULD OD DFWLYLGDG RUtFROD JLUD DOUHGHGRU GH XQ SURGXFWR \ GH ORV IDFWRUHV TXH OR DIHFWDQ (QWUH HOORV ORV UHIHULGRV D OD SURGXFFLyQ SURSLDPHQWH GLFKD YROXPHQ FDOLGDG KRPRJHQHLGDG VDQLGDG \ SOD]R GH HQWUHJD \ aquellos que hacen a su mejoramiento (en el FDVR GH OD RULFXOWXUD IDFWRUHV TXH PRGLFDQ OD DUTXLWHFWXUD GH ODV SODQWDV \ ODV RUHV FRORUHV IUDJDQFLDV WLHPSR GH SRVWFRVHFKD HWF 'H ODV KHUUDPLHQWDV ELRWHFQROyJLFDV GLVSRnibles, el cultivo de tejidos ha sido de las que PiV LPSDFWR WXYR HQ OD RULFXOWXUD DXQTXH HQ forma reciente, la genmica y la transgnesis han adquirido gran relevancia, sobre todo en cultivos como la rosa, el clavel y el crisantemo. (Q HVWH FDStWXOR FRPHQWDUHPRV ORV DYDQFHV SURGXFLGRV D SDUWLU GH HVWDV WHFQRORJtDV HQ ORV FXOWLYRV PHQFLRQDGRV \ HQ SODQWDV HQ PDFHWD 2. Cultivo de tejidos (Q ORV ~OWLPRV DxRV VH KD YHULFDGR XQ LQFUHPHQWR UHOHYDQWH HQ OD SURGXFFLyQ GH SODQWDV RUQDPHQWDOHV HVWH KHFKR SRVLEOHPHQWH KD\D sido una consecuencia del aumento registrado en su valor comercial durante los ltimos 20 DxRV +R\ HQ GtD DOUHGHGRU GH HVSHFLHV GLIHUHQWHV GH SODQWDV RUQDPHQWDOHV VRQ SURSDgadas a escala comercial a travs del cultivo GH WHMLGRV HQ ODERUDWRULRV SULYDGRV TXH SURveen a los mayores consumidores del mercado RUtFROD +RODQGD -DSyQ \ ((88 HQWUH RWURV El cultivo in vitro de tejidos resulta una heUUDPLHQWD FODYH SDUD OD SURSDJDFLyQ GH SODQ-
WDV D JUDQ HVFDOD GHELGR TXH SHUPLWH QR VROR OD SURGXFFLyQ PDVLYD VLQR OD FRQVHUYDFLyQ GH PDWHULDO VHOHFWR \ OD PXOWLSOLFDFLyQ GH FORQHV GH sanidad controlada. (Q OD DFWXDOLGDG VH XWLOL]DQ SULQFLSDOPHQWH WUHV HVWUDWHJLDV SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ in vitro: 1) organognesis, 2) embriognesis somtica, \ WHFQRORJtD GH FXOWLYR GH FpOXODV HQ FDSD QD 7/& thin cell layer SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ GH SODQWDV HQWUH RWUDV DSOLFDFLRQHV 2UJDQRJpQHVLV /D PLFURSURSDJDFLyQ SRU RUJDQRJpQHVLV HV XQD DOWHUQDWLYD GH JUDQ DSOLFDFLyQ SDUD OD SURGXFFLyQ PDVLYD GH SODQWDV HQ XQ FRUWR ODSVR 6H WUDWD GH XQD KHUUDPLHQWD PX\ XWLOL]DGD SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ WDQWR GH RUQDPHQWDOHV FRPR GH otros cultivos hortcolas, frutales, industriales y forestales. 8Q UHTXLVLWR LQGLVSHQVDEOH HV HO DMXVWH SUHFLVR de las condiciones de cultivo tanto fsicas como qumicas. Se deben establecer las condiciones ySWLPDV GH IRWRSHUtRGR LQWHQVLGDG GH OX] EDlance de nutrientes (orgnicos e inorgnicos), y reguladores del crecimiento (RC) adecuados. &DGD HVSHFLH \ FDGD FXOWLYDU HQ SDUWLFXODU SUHsentan requerimientos nutricionales y hormonaOHV VXPDPHQWH HVSHFtFRV $Vt SRU HMHPSOR HQ el cultivo de segmentos nodales de Bougainvillea en medio libre de RC se induce el desarrollo GH XQ FDOOR TXH SURJUHVD HQ OD PHGLGD TXH VH OR PDQWHQJD XQLGR DO H[SODQWR RULJLQDO LQKLELHQGR el desarrollo de la yema axilar. Mientras que el DJUHJDGR GH %$3 EHQFLODPLQRSXULQD SURmueve la formacin y el desarrollo de yemas. Otro caso interesante es el de algunas esSHFLHV GHO JpQHUR Begonia que requieren del agregado de carbn activado al medio de cultivo SDUD LQGXFLU HO GHVDUUROOR GH EURWHV 6H VDEH TXH el carbn activado adsorbe a los RC reducienGR VX GLVSRQLELOLGDG SDUD ORV WHMLGRV GH PRGR TXH VH KD SURSXHVWR TXH HO KtEULGR GH EHJRQLD HQ FXHVWLyQ SURGXFH XQD DOWD FRQFHQWUDFLyQ GH auxinas y citocininas, y que el agregado de carEyQ DFWLYDGR DGHFXD HO QLYHO GH 5& SHUPLWLHQGR un desarrollo mejorado y controlado. Siguiendo HQ OD PLVPD OtQHD GHO HMHPSOR RWUR UHTXHULPLHQWR HVSHFLDO SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ HQ PDVD GHO hbrido Begonia x elatior es la utilizacin de las citocininas cinetina y zeatina, que a diferencia
de BAP, no afectan las caractersticas bsicas GH OD SODQWD FRPR HO FRORU GH ODV RUHV XQ GHWDOOH QR PHQRU DO GLVHxDU XQD HVWUDWHJLD SDUD OD SURGXFFLyQ GH XQ FXOWLYR RUQDPHQWDO &RQ UHVSHFWR D OD LQXHQFLD GH OD OX] HO FXOtivo de Ficus benjamina SHUPLWLy HVWXGLDU HO efecto de la calidad de la luz sobre la induccin de yemas de novo. Se observ que al utilizar iSLFHV FRPR H[SODQWR OD WD]D GH \HPDV IRUPDdas de novo resultaba mayor bajo luz roja. En el mismo estudio se advirti que la calidad de luz QR DIHFWDED HO HQUDL]DPLHQWR GH HVWD HVSHFLH /RV UHTXHULPLHQWRV GH OD HWDSD GH HQUDL]DPLHQWR WDPELpQ VXHOHQ VHU PX\ HVSHFtFRV 3RU HMHPSOR HQ Ficus carica el agregado de 393 SROLYLQLO SLUUROLGRQD TXH DGVRUEH ORV SROLfenoles oxidantes facilita el enraizamiento. En JHUEHUD SRU HMHPSOR SDUD UHGXFLU HO HVWUpV SURYRFDGR SRU HO SDVDMH GHO FXOWLYR in vitro a invernculos, se trabaj con atmsfera enriquecida en CO2, y el uso de soluciones de alta FRQGXFWLYLGDG HOpFWULFD SURYRFDQGR HO FLHUUH GH HVWRPDV SDUD HYLWDU OD WUDQVSLUDFLyQ H[WUHma del material y su desecacin. En la Tabla se SUHVHQWDQ DOJXQRV GH ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV a travs de estas tcnicas y de las que se deVDUUROODUDQ HQ ORV SiUUDIRV VLJXLHQWHV (PEULRJpQHVLV VRPiWLFD /D HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD WLHQH XQ JUDQ SRWHQFLDO SDUD OD SURSDJDFLyQ FORQDO GH LQGLYLGXRV VHOHFWRV \ GHVGH HO SXQWR GH YLVWD FRPHUFLDO SDUD OD SURGXFFLyQ HQ ELRUUHDFWRUHV \ OD SURGXFFLyQ GH VHPLOOD DUWLFLDO 3HVH D HVWR SUHVHQWD OLPLWDFLRQHV LPSRUWDQWHV FRPR OD GHSHQGHQFLD GHO JHQRWLSR TXH DIHFWD OD SURGXFFLyQ GH HPEULRQHV VRPiWLFRV WDQWR FRPR HO SRGHU germinativo de los mismos. /D SXHVWD D SXQWR GH XQ VLVWHPD GH SURGXFFLyQ FRPHUFLDO D SDUWLU GH HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD UHTXLHUH GH XQD VHULH GH DMXVWHV QRV VREUH WRGR HQ OD HWDSD GH IRUPDFLyQ GH ORV HPEULRQHV R IDVH /RJUDU XQD UHVSXHVWD embriognica homognea, en la forma, calidad \ WLHPSR GH PDGXUDFLyQ GH ORV HPEULRQHV HV HVHQFLDO SDUD DOFDQ]DU OD SURGXFFLyQ LQGXVWULDO 9DULDV HVSHFLHV RUQDPHQWDOHV FRPR FULVDQtemo, ciclamen, rosa, begonia, violeta africana \ HVWUHOOD IHGHUDO KDQ VLGR SURSDJDGDV FRQ p[LWR SRU PHGLR GH HVWD HVWUDWHJLD YHU 7DEOD 3RU
RWUR ODGR ORV H[SHULPHQWRV UHDOL]DGRV FRQ URVD y ciclamen, han contribuido en gran medida a incrementar nuestro conocimiento sobre las EDVHV GH OD KHUHQFLD GH OD FDSDFLGDG GH HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD GH XQ JHQRWLSR GDGR 3Drecera ser que este rasgo estara controlado SRU PiV GH XQ JHQ FX\D QDWXUDOH]D UHFHVLYD R GRPLQDQWH VHUtD HVSHFLH GHSHQGLHQWH &pOXODV HQ FDSD QD /D WHFQRORJtD GH FpOXODV HQ FDSD QD 7&/ es una estrategia de cultivo de tejidos desarrollada en la dcada del 70. Consiste en utilizar FRPR H[SODQWR XQD QD FDSD GH FpOXODV HQWUH \ PP GH HVSHVRU HO FRUWH SXHGH ser longitudinal (lTCL) o transversal (tTCL). El corte longitudinal generalmente involucra cOXODV HSLGpUPLFDV VXEHSLGpUPLFDV FRUWLFDOHV FDPELDOHV R PHGXODUHV TXH SXHGHQ UHDOL]DUVH D SDUWLU GH WDOORV KRMDV SHGLFHORV EXOELOORV nervaduras, etc. Para los cortes transversales VH SDUWH GH WDOORV UDtFHV UL]RPDV SHG~QFXORV SpWDORV X RWURV yUJDQRV RUDOHV HWF En la actualidad algunos investigadores la KDQ UHGHVFXELHUWR FRPR XQD SRGHURVD KHUUDPLHQWD SDUD HO FXOWLYR GH WHMLGRV GH yUJDQRV \ SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD 6H WUDWD GH XQ VLVWHPD VLPSOH TXH VyOR UHTXLHUH XQD SHTXHxD FDQWLGDG GH FpOXODV FRPR H[SODQWR LQLFLDO \ XQD PtQLPD FDQWLGDG GH PHdio de cultivo. Puede ser utilizada como herraPLHQWD SDUD OD SURSDJDFLyQ FRPHUFLDO HQ DOJXQRV FDVRV VH REVHUYy TXH DXPHQWD OD HFLHQFLD UHVSHFWR GHO XVR GH H[SODQWRV FRQYHQFLRQDOHV H LQFOXVR DFRUWD GH PDQHUD VLJQLFDWLYD ORV WLHPSRV GH FXOWLYR $GHPiV GH UHJHQHUDU SODQWDV D WUDYpV GHO DMXVWH QR GH ODV FRQGLFLRQHV GH FXOWLYR H[LVWLUtD OD SRVLELOLGDG GH UHJHQHUDU \ FXOWLYDU yUJDnos aislados. (Q OD 7DEOD VH SUHVHQWDV DOJXQRV HMHPSORV de los resultados obtenidos a travs de TCL, de los cules describiremos algunos en detaOOH 3RU HMHPSOR D SDUWLU GH WUR]RV GH [ mm2 GH FDSDV HSLGpUPLFDV \ VXEHSLGpUPLFDV O7&/ GH ORV HQWUHQXGRV GH XQD UDPD RUDO GH Petunia hybrida VH UHJHQHUDURQ \HPDV \ RUHV GHQWUR GH ORV SULPHURV GtDV GH LQLFLDGR HO FXOWLYR (Q RWUR H[SHULPHQWR SDUWLHQGR GH OiPLQDV WUDQVYHUVDOHV GH SHFtRORV GH YLROHWD
Tabla 1. Micropropagacin de cultivos ornamentales aplicando diferentes estrategias de cultivo in vitro y las respuestas obtenidas. ya: yemas adventicias; mb: multibrotacin; pt SOiQWXODV r: races; dy GHVDUUROOR GH \HPDV SUHH[LVWHQWHV ce: callo embriognico; sce VXVSHQVLyQ FHOXODU HPEULJpQLFD ge: germinacin de embriones; dp GHVDUUROOR GH SOiQWXOD bu: bulbillo; pr SURWRFRUPRV 6yOR VH UHJHQHUDURQ SODQWDV FRPSOHWDV HQ DOJXQRV FXOWLYDUHV
africana (Saintpaulia ionantha VH UHFXSHUDURQ SODQWDV DO FDER GH PHVHV GH FXOWLYR /D WpFQLFD WDPELpQ VH XWLOL]y SDUD OD REWHQcin de embriones somticos de geranio (Pelargonium x hortorum GRQGH VH YHULFy TXH con el uso de segmentos transversales de hiSRFyWLOR VH ORJUDED XQD HFLHQFLD YHFHV PD\RU HQ OD SURGXFFLyQ GH HPEULRQHV UHVSHFWR GH ORV SURGXFLGRV FXDQGR VH XWLOL]DED HO KLSRFyWLOR HQWHUR FRPR H[SODQWR La orqudea es uno de los cultivos ornamenWDOHV PiV DSUHFLDGRV WDQWR SDUD RU GH FRUWH FRPR SDUD SODQWD HQ PDFHWD 6RQ HVSHFLHV
FX\RV SURGXFWRV QDOHV WLHQHQ XQD DOWD FRWL]DFLyQ HQ HO PHUFDGR $ SHVDU GH TXH PXFKDV HPSUHVDV SURSDJDQ in vitro GLIHUHQWHV HVSHcies de esta monocotilednea, son escasos ORV UHSRUWHV SXEOLFDGRV VREUH SURWRFRORV GH PXOWLSOLFDFLyQ D JUDQ HVFDOD &RQ HO PpWRGR GH PLFURSURSDJDFLyQ FRQYHQFLRQDO GH \HPDV DSLFDOHV HV SRVLEOH SURGXFLU FHUFD GH SODQWDV DQXDOHV 6LQ HPEDUJR VH KD UHSRUWDGR TXH HO XVR GH W7&/ GH \HPDV DSLFDOHV VH SRGUtD DOFDQ]DU XQD SURGXFFLyQ GH DOUHGHGRU GH SODQWLQHV SRU DxR En la Figura 1 se describen las alternativas de TCL segn los tratamiento in vitro a los que se someten GLVWLQWRV H[SODQWRV GH FULVDQtemo (Dendranthema grandiRUD). As, variando las conGLFLRQHV GH FXOWLYR SRGHPRV VHJXLU GLIHUHQWHV YtDV SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ HV pVWD H[LELOLdad la que lo convierte la tecQRORJtD HQ XQD SRGHURVD KHUUDPLHQWD SDUD HO HVWXGLR GH OD diferenciacin vegetal. Otro cultivo ornamental al TXH VH KD DSOLFDGR HVWD WHFQRloga es la gentiana (Gentiana VSS YDORUDGD WDQWR FRPR RU GH FRUWH \ SODQWD HQ PDFHWD *HQWLDQD SXHGH VHU SURSDJDGD SRU PHGLR GH VHFFLRQHV WUDQVYHUVDOHV GHO UHFHSWiFXOR RUDO TXH UHJHQHUD \HPDV SRU organognesis directa luego de 2 a 4 semanas de cultivo. Gladiolus VSS Heliconia VSS Iris VSS \ Helianthus VSS son otros de los gneros ornamentales que han sido exitoVDPHQWH SURSDJDGRV SRU HVWD tecnologa. $XWRPDWL]DFLyQ GH OD SURSDJDFLyQ LQ YLWUR (O SURFHVR GH HVFDODGR SDUD OD RSWLPL]DFLyQ GH OD SURGXFWLYLGDG GH XQ SURFHVR GH PLFURSURSDJDFLyQ LQGHSHQdientemente de la estrategia que se utilice, requiere de la
Figura 1. El diagrama indica el origen de las tTCLs y las diferentes FRQGLFLRQHV GH FXOWLYR DSOLFDGDV SDUD OD REWHQFLyQ GH SODQWLQHV GH crisantemo. (Gentileza de Jaime Teixeira da Silva, traducido)
LPSOHPHQWDFLyQ GH ORV FXOWLYRV HQ PHGLR OtTXLdo y el uso de biorreactores. En efecto, en un contexto comercial, esta tecnologa tiene una serie de ventajas sobre las tcnicas convencioQDOHV HQWUH HOODV OD SRVLELOLGDG GH DXWRPDWL]DU OD SURGXFFLyQ GLVPLQX\HQGR FRVWRV \ VLPSOLcando tareas). En trminos generales un biorreactor es un UHFLSLHQWH R VLVWHPD TXH PDQWLHQH XQ DPELHQWH biolgicamente DFWLYR \ GH FRQGLFLRQHV SURSLcias (pH, temperatura, concentracin de oxgeno QXWULHQWHV HWF SDUD HO HOHPHQWR TXH VH FXOWLYD (Q SODQWDV WUDGLFLRQDOPHQWH VH ORV KD XWLOL]DGR SDUD HO FXOWLYR GH UDtFHV \ HQ OD SURduccin de metabolitos secundarios. Como sisWHPD GH SURSDJDFLyQ QR VRQ PXFKDV ODV HVSHcies en los que se los ha utilizado exitosamenWH $OJXQRV GH HVWRV FDVRV VRQ KLSSHDVWUXP (Hippeastrum spp.), ciclamen (Cyclamen persicum), clavel (Dianthus caryophyllus), gladiolo (*ODGLROXV JUDQGLRUXP) y jacinto (Hyacinthus orientalis &RPHUFLDOPHQWH VH KDQ PXOWLSOLFDGR FRQ p[LWR KHOHFKRV HVSDWLOXP ORGHQGUR estrella federal y liliaceas. (Q HO DxR OD UPD IUDQFHVD IN VITRO PIC, SUHVHQWy XQ VLVWHPD GH LQPHUVLyQ WHPSRraria al que denomin RITA (del francs: Rcipient dInmersion Temporaire Automatique) YHU )LJXUDV \ (O VLVWHPD SHUPLWH VXPHUJLU ORV H[SODQWRV HQ HO PHGLR GH FXOWLYR HQ IRUPD VXFHVLYD \ SRU WLHPSR H LQWHUYDORV GHWHUPLQDGRV SDUD FDGD VLWXDFLyQ
Figura 3. (O SULQFLSLR GH IXQFLRQDPLHQWR GH ORV VLVWHPDV GH LQPHUVLyQ WHPSRUDULD VH EDVD HQ TXH SRU PHGLR GHO WUDEDMR GH XQ FRPSUHVRU TXH LQVXD DLUH HVWpULO DO UHFLSLHQWH LQIHULRU VH SURGXFH HO GHVSOD]DPLHQWR GHO PHGLR OtTXLGR TXH VH HQFXHQWUD GHSRVLWDGR HQ VX LQWHULRU DO UHFLSLHQWH VXSHULRU ODV HFKDV D]XOHV LQGLFDQ HO FLUFXLWR GHO DLUH LQVXDGR GRQGH se encuentra el material en cultivo que es cubierto WRWDOPHQWH SRU HO OtTXLGR ODV HFKDV URMDV GHVFULEHQ el recorrido del medio). Mientras la vlvula se manWLHQH DELHUWD VH LQVXD DLUH DO LQWHULRU GHO UHFLSLHQWH inferior y, en consecuencia, el medio se mantiene HQ FRQWDFWR FRQ ORV H[SODQWRV 8QD YH] FHUUDGD OD YiOYXOD SRU VLPSOH JUDYHGDG HO PHGLR YXHOYH DO UHFLSLHQWH LQIHULRU
Figura 2. Sistema original RITA, de origen francs GHVDUUROODGR SRU 9LWURSLF 6$
Figura 3. 9tDV PHWDEyOLFDV GH ODV DQWRFLDQLQDV
(VWH VLVWHPD GH LQPHUVLyQ WHPSRUDULD SUHsenta ciertas ventajas no slo sobre el sistema GH PXOWLSOLFDFLyQ WUDGLFLRQDO VLQR WDPELpQ VREUH ORV UHDFWRUHV GH LQPHUVLyQ FRPSOHWD (QWUH ellas se destacan: &RQ UHVSHFWR DO FXOWLYR HQ IDVH VyOLGD OD GLVminucin del costo de mano de obra debido a OD IDFLOLGDG GH PDQLSXODFLyQ GH ORV H[SODQWRV \ GHO FDPELR GH PHGLR OD HFRQRPtD GH HVSDFLR \ OD RSWLPL]DFLyQ GH OD QXWULFLyQ GH ORV H[SODQtos debido a que absorben los nutrientes del PHGLR D WUDYpV GH WRGD VX VXSHUFLH IDYRUHciendo el crecimiento en general. &RQ UHVSHFWR D ORV VLVWHPDV GH LQPHUVLyQ SHUPDQHQWH GHELGR D OD QDWXUDOH]D GHO VLVWHPD WHPSRUDULR VH IDYRUHFH OD UHQRYDFLyQ FRPSOHWD GHO DLUH GHQWUR GHO UHFLSLHQWH HYLWDQGR OD FRQFHQWUDFLyQ GH JDVHV SHUMXGLFLDOHV DO GHVDUUROOR GH ORV H[SODQWRV \ UHGXFLHQGR ORV SUREOHPDV GH DV[LD R YLWULFDFLyQ GH ORV WHMLGRV 3RU RWUR ODGR FDGD UHFLSLHQWH VH HQFXHQWUD SURWHJLGR SRU OWURV FRQWUD FRQWDPLQDFLyQ \ DGHPiV VH elimina el riesgo de contaminacin cruzada. 3HVH D HVWR SUHVHQWDQ FLHUWDV GHVYHQWDMDV es difcil controlar la sanidad dentro del reciSLHQWH UHTXLHUH GH HTXLSDPLHQWR HVSHFLDO \ QR VLUYH SDUD HO HVWDEOHFLPLHQWR GHO FXOWLYR VyOR SDUD ODV IDVHV GH PXOWLSOLFDFLyQ FUHFLPLHQWR \ enraizamiento). (QWUH ODV HVSHFLHV RUDOHV TXH VH KDQ PXOWLSOLFDGR SRU PHGLR GH HVWD WHFQRORJtD HQFRQWUDPRV OD SLxD RUQDPHQWDO Ananas lucidus), DXQTXH FRPHUFLDOPHQWH VyOR VH SXHGH PHQcionar al bananero ornamental (Musa basjoo FY
9DULHJDWD
\ YDULDV HVSHFLHV GH RUTXtGHDV (Orchydea VS (VWRV VLVWHPDV VRQ HVSHFLDOPHQWH LQWHUHVDQWHV SDUD OD SURSDJDFLyQ GH SODQWDV VLQ QHFHVLGDG GH OX] SXHV SHUPLWHQ XQ DXPHQWR GH OD HFLHQFLD SRU GLVPLQXFLyQ GH FRVWRV DO LQGHSHQGL]DUVH GH OD LOXPLQDFLyQ 3RU HMHPSOR HQ el caso de Lilium VSS VH GLVHxy XQ SURWRFROR GH PLFURSURSDJDFLyQ LQGHSHQGLHQWH GH OD OX] EDVDGR HQ FLFORV GH EXOELFDFLyQ GLUHFWD VHJXLda de una fase de crecimiento in vitro de los bulbillos. Como resultado se obtienen microEXOERV DSWRV SDUD HO FXOWLYR D FDPSR
3. Transformacin gentica 0RGLFDQGR FRORUHV En la edicin anterior de este texto se coment sobre el desarrollo de claveles azules y la H[WHQVLyQ GH OD YLGD SRVWFRVHFKD GH OD HPSUHVD Florigene R&D (Australia). Posteriormente, Florigene R&D se asoci con Suntory Research -DSyQ SDUD FRQFUHWDU OD REWHQFLyQ SRU LQJHQLera gentica de una rosa de color azul. /DV DQWRFLDQLQDV VRQ OD FODVH GH SLJPHQWRV PD\RULWDULRV HQ ODV RUHV VRQ PROpFXODV UHODWLYDPHQWH VLPSOHV VROXEOHV HQ DJXD TXH VH encuentran en grandes vacuolas de las clulas HSLGpUPLFDV GH ORV SpWDORV 8Q SXQWR FODYH GH OD UXWD GH ELRVtQWHVLV GH HVWRV FRPSXHVWRV HV HO LQWHUPHGLDULR '+. GLKLGURNDHPSIHURO /DV HQ]LPDV )/6 DYRQRO VLQWDVD )+ DYRQRLGH KLGUR[LODVD )+ DYRQRLGH K\GUR[LODVD \ ')5 GLKLGURDYRQRO UHGXFWDVD XWLOL]DQ HVWH VXVWUDWR VXJLULHQGR TXH HVWH SXQWR es crtico en la biosntesis de antocianinas y en OD GHWHUPLQDFLyQ GHO FRORU RUDO )LJXUD 3DUD OD REWHQFLyQ GH URVDV D]XOHV VH LQFRUSRUDURQ ORV JHQHV GH OD YtD GH OD GHOGLQD SLJPHQWR UHVSRQVDEOH GHO FRORU D]XO $GHPiV IXH QHFesario a travs de la tecnologa de ARN de interferencia bloquear la ruta de sntesis de cianidina, SDUD GLVPLQXLU OD FRQFHQWUDFLyQ GH HVWH SLJPHQWR y de esta forma evitar la contaminacin del color ERUGy HQ ORV SpWDORV /RV FXOWLYRV GH ODV QXHYDV YDULHGDGHV D]XOHV KDEUtDQ DOFDQ]DGR OD HWDSD GH HQVD\RV D FDPSR \ SRGUtDQ VHU ODQ]DGDV DO mercado en 2009. En otros gneros como Torenia, con el objetivo de incrementar la variabilidad en los colores, VH KDQ GHVDUUROODGR PDWHULDOHV WUDQVJpQLFRV SRU PHGLR GH OD WpFQLFD GH FRVXSUHVLyQ GH ORV JHQHV TXH FRGLFDQ OD ')5 GLKLGURDYRQRO UHGXFWDVD y la CHS (chalcona sintetasa). En lobelia (Lobelia erimus VH REWXYLHURQ SODQWDV FRQ RUHV D]XOHV LQFRUSRUDQGR HO JHQ GH OD )+ GH OLVLantus. En crisantemo, utilizando la tecnologa de ARN DQWLVHQWLGR VH KD ORJUDGR OD REWHQHU RUHV GH GLIHUHQWHV WRQDOLGDGHV 5HFLHQWHPHQWH XQ JUXSR GH RULJHQ MDSRQpV KD GDGR XQ SDVR LPSRUWDQWH HQ OD HOXFLGDFLyQ GH OD YtD PHWDEyOLFD SDUD OD REtencin de crisantemos de color blanco, al idenWLFDU OD HQ]LPD &P&&' GHO LQJOpV carotenoid cleavage dioxygenase FRPR OD UHVSRQVDEOH GH
la degradacin de los carotenoides que ocasioQD OD SpUGLGD GH OD FRORUDFLyQ amarilla. Incrementando fragancias 8QR GH ORV SDUiPHWURV GH JUDQ YDORU DJUHJDGR HQ HO PHUFDGR GH RUQDPHQWDOHV HV OD FDSDFLGDG GH ORV FXOWLYRV GH SURGXFLU SHUIXPH ODV IUDJDQFLDV VLUYHQ SDUD DWUDHU WDQWR D SROLQL]DGRUHV FRPR D SRWHQFLDOHV FOLHQWHV 6H FRQRFHQ FHUFD GH SURGXFWRV YROiWLOHV LQYROXFUDGRV FRQ HO DURPD GH ODV SODQWDV \ RUHV GHVGH HO SXQWR GH YLVWD TXtPLFR VRQ iFLGRV JUDVRV GHULYDGRV GHO EHQFHQR IHQLOSURSDQROHV \ WHUSHQRLGHV 6L ELHQ VH KDQ FORQDGR una interesante cantidad de genes involucrados en estas vas de sntesis, los avances en la bioqumica y la biologa molecular de estos FRPSXHVWRV VRQ D~Q PX\ OLPLWDGRV \ D OD IHFKD VRQ PX\ SRFRV ORV UHSRUWHV GH DYDQFHV HQ HVWD HVSHFLDOLGDG Por el momento se obtuvieron resultados SURPLVRULRV HQ SHWXQLD FRQHMLWR \ FODYHO (Q HO FDVR GH pVWH ~OWLPR VH UHSRUWy HO LQFUHPHQWR en la fragancia al regular negativamente la exSUHVLyQ GHO JHQ GH OD HQ]LPD )+ FRPR VH mencion antes, involucrada en la biosntesis GH DQWRFLDQLQDV 'H PRGR TXH ODV RUHV UHVXOWDURQ PiV SiOLGDV SRU XQD GLVPLQXFLyQ GH OD FRQFHQWUDFLyQ GH DQWRFLDQLQDV SHUR FRQ PD\RU fragancia debido a un incremento en la sntesis de metil benzoato. Resistencia a hongos, insectos y virus 'DGR TXH RWURV FDStWXORV SURIXQGL]DQ VREUH ODV HVWUDWHJLDV XWLOL]DGDV SDUD GHVDUUROODU UHVLVWHQFLD D SDWyJHQRV HQ SODQWDV QRV OLPLWDUHPRV HQ HVWH DSDUWDGR D FRPHQWDU DOJXQRV FDVRV LOXVWUDWLYRV HQ HO iUHD GH SODQWDV RUQDPHQWDOHV /RV PHFDQLVPRV GH GHIHQVD GH SODQWDV VRQ EDVWDQWH FRPSOHMRV SRU OR JHQHUDO HO DWDTXH GH XQ SDWyJHQR DFWLYD FDVFDGDV GH VHxDOHV TXH GHVHQFDGHQDQ P~OWLSOHV UHVSXHVWDV (Q ORV FXOWLYRV RUtFRODV OD PD\RUtD GH ODV HVWUDWHJLDV SDUD REWHQHU UHVLVWHQFLD D KRQJRV VH EDVDQ HQ la utilizacin de enzimas hidrolticas. Por ejemSOR HO KRQJR Fusarium HV UHVSRQVDEOH GH XQ GH ODV SpUGLGDV DQXDOHV SURGXFLGDV HQ HO FXOWLYR GH FODYHO 6H GHVDUUROODURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ XQ JHQ GH TXLWLQDVD aislado de Serratia marcecens. Ante el desafo
FRQ HO SDWyJHQR ODV SODQWDV WUDQVIRUPDQWHV SUHVHQWDURQ XQ UHWUDVR VLJQLFDWLYR HQ HO GHVDUUROOR GH VLQWRPDWRORJtD \ GH OD HWDSD DJXGD de la enfermedad. Otro caso es el ataque del hongo Botrytis, XQ SUREOHPD LPSRUWDQWH SDUD HO FXOWLYR GHO FULsantemo. Hasta el momento no se ha logrado GHWHFWDU UHVLVWHQFLD HQ HO JHUPRSODVPD GHO Jpnero Chrisantemum. Al da de hoy el control del SDWyJHQR VH UHDOL]D SRU PpWRGRV TXtPLFRV \ GH manejo del cultivo, sin embargo estas medidas VRQ VyOR SDOLDWLYDV 6H KDQ REWHQLGR SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH FULVDQWHPR SRUWDGRUDV GHO JHQ SDUD OD TXLWLQDVD GH DUUR] rcc2) que mostraron en lo ensayos de desafo una resistencia leve a Botrytis. Cuando se trata de obtener resistencia a insecto, la estrategia comn es la utilizacin de toxinas. As, en crisantemos se logr obtener resistencia a Helicoverpa armiguera utilizanGR OD WR[LQD PRGLFDGD GHO JHQ Bt, CryIAB; y resistencia a Spodoptera exigua, con CryIC. $GHPiV VH UHDOL]DURQ LPSRUWDQWHV SURJUHVRV HQ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV FRQ UHVLVWHQFLD D WULSV Frankiniella occidentalis, vector de toVSRYLUXV (Q HVWH FDVR VH REWXYLHURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH FULVDQWHPR TXH H[SUHVDQ XQ FRQMXQWR GH LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV /RV HQsayos con larvas F. occidentalis alimentadas FRQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV PRVWUDURQ XQ GH UHGXFFLyQ HQ OD YLDELOLGDG FRPSDUDGDV FRQ DTXHOODV ODUYDV DOLPHQWDGDV FRQ ODV SODQWDV control (no transgnicas). Los gneros virales Tospovirus y Potyvirus DIHFWDQ D FXOWLYRV RUtFRODV \ KRUWtFRODV \ VH HQFXHQWUDQ DPSOLDPHQWH GLVWULEXLGRV HQ WRGR HO PXQGR (QWUH ODV HVWUDWHJLDV SODQWHDGDV SDUD JHQHUDU UHVLVWHQFLD HQ SODQWDV VH OOHYy D FDER la transformacin de crisantemo con el gen de OD QXFOHRFiSVLGH YLUDO GH Tomato spotted wilt tospovirus (TSWT). Se utilizaron construccioQHV TXH SUHVHQWDEDQ OD VHFXHQFLD HQ VHQWLGR y antisentido, que lograron conferir resistencia D ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV DQWH HO GHVDItR YLUDO se mostraron asintomticas y con bajos niveles de acumulacin de viral). Con una estrategia VLPLODU VH ORJUDURQ SODQWDV UHVLVWHQWHV DO YLUXV GH OD FORURVLV GHO WRPDWH 7&69 DO YLUXV GHO DQLOODGR GH WRPDWH \ SLPLHQWR *569 \ HO GH OD QHFURVLV GHO WDOOR GHO FULVDQWHPR &619
Una estrategia alternativa se bas en la utilizacin del gen PACI, del hongo Schizosaccharommyces pombe TXH FRGLFD XQD ULbonucleasa que reconoce y degrada ARN de doble cadena. En este caso se observ que los QLYHOHV GH UHVLVWHQFLD DOFDQ]DGRV SRU ODV WUDQVIRUPDQWHV GHSHQGtDQ GHO JUDGR GH H[SUHVLyQ GHO WUDQVJpQ DSUR[LPDGDPHQWH HO GH HVWDV SODQWDV SUHVHQWDEDQ QLYHOHV DOWRV GH H[SUHsin que correlacionaban con la ausencia de desarrollo de los sntomas de infeccin. Prolongando la vida en postcosecha (O SHUtRGR GH YLGD SRVWFRVHFKD GH ODV RUHV GHSHQGH GHO JUDGR GH QXWULFLyQ OD FDUJD PLFURELDQD \ IXQGDPHQWDOPHQWH GH OD SURGXFFLyQ GH HWLOHQR KRUPRQD DVRFLDGD DO SURFHVR de senescencia). Existen sustancias como las VDOHV GH SODWD TXH UHWDUGDQ HO SURFHVR DFW~DQ EORTXHDQGR HO UHFHSWRU GH HWLOHQR (75 VLQ embargo son muy txicas y su uso debera dejarse de lado. La ingeniera gentica ofrece XQD VHULH GH DOWHUQDWLYDV SDUD ORJUDU UHWUDVDU HVWH SURFHVR 3RU HMHPSOR VH WUDQVIRUPDURQ FODYHOHV FRQ el gen etr1 EDMR UHJXODFLyQ GHO SURPRWRU 6 GHO YLUXV GHO PRVDLFR GHO FROLRU &D09 /DV SODQWDV WUDQVIRUPDQWHV PRVWUDURQ XQD YLGD SRVWFRVHFKD GH WLHPSR FRPSDUDEOH DO GH ODV SODQWDV FRQWURO QR WUDQVJpQLFDV WUDWDGDV qumicamente. En una estrategia mejorada, VH WUDQVIRUPDURQ SODQWDV GH Campanula carpatica (una ornamental de maceta) con una construccin del mismo gen (etr1 EDMR HO SURmotor FBP1 GH SHWXQLD HVSHFtFR GH RUHV /DV RUHV PRVWUDURQ XQD PDUFDGD GLVPLQXFLyQ GH VX VHQVLELOLGDG DO HWLOHQR \ IXHURQ FDSDFHV de mantenerse abiertas durante 14 das, cuDQGR HO SHUtRGR KDELWXDO HV GH GtDV 6H SXHGH REVHUYDU TXH OD XWLOL]DFLyQ GH SURPRWRUHV HVSHFtFRV GH yUJDQR JHQHUD HO PLVPR QLYHO GH SURWHFFLyQ IUHQWH D HWLOHQR \ SUHVHQWD YHQWDMDV VLJQLFDWLYDV IUHQWH D OD H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD QR PRGLFD OD VHQVLELOLGDG DO HWLOHQR HQ HO UHVWR GH OD SODQWD SRU OR TXH RWUDV DFFLRQHV GHO HWLOHQR FRPR OD DFWLYDFLyQ GH UHVSXHVWDV defensivas, no resultaran afectadas. Plantas con nuevas formas 'HVGH HO SXQWR GH YLVWD GH HVWpWLFR OD PRGLFDFLyQ GH OD DUTXLWHFWXUD GH OD SODQWDV HV XQR
GH ORV SDUiPHWURV PiV FRGLFLDGRV HQ HO PHMRUDPLHQWR GH SODQWDV RUQDPHQWDOHV WDQWR SDUD RUHV GH FRUWH FRPR SODQWDV GH PDFHWD /D PRGLFDFLyQ GH OD IRUPD GH ODV SODQWDV DGTXLere relevancia a la hora de obtener un cultivo homogneo en altura, o bien de incrementar la cantidad de brotes laterales. Por otro lado, una SODQWD FRQ IRUPD GLIHUHQWH VLJQLFD XQ JUDQ LPSDFWR HQ HO PHUFDGR $ SHVDU GH TXH VH FRQRFH XQ Q~PHUR LPSRUtante de genes involucrados en la determinaFLyQ GH OD DUTXLWHFWXUD GH ODV SODQWDV VyOR XQRV SRFRV KDQ VLGR XWLOL]DGRV HQ FXOWLYRV RUtFRODV (Q SHWXQLD VH VREUHH[SUHVy HO IDFWRU /,) (del ingls lateral shoot inducing factor) bajo HO SURPRWRU 6 GH &D09 6H REVHUYy TXH DO DOWHUDED HO PHWDEROLVPR GH ODV FLWRFLQLQDV SURYRFDQGR OD DSDULFLyQ GH IHQRWLSRV FRQ PD\RU FDQWLGDG GH UDPDV FRQ UDPLFDFLRQHV VHFXQGDULDV SRFR XVXDOHV HQ HVWD HVSHFLH /D PLVPD SODQWD SHWXQLD VH WUDQVIRUPy FRQ el gen ipt LVRSHQWHQLO WUDQVIHUDVD GH A. tumefaciens) EDMR HO FRQWURO GH XQ SURPRWRU GH Arabidopsis de la senescencia de las hojas. Las SODQWDV WUDQVIRUPDQWHV SUHVHQWDURQ PD\RU FDQWLGDG GH RUHV \ UHWUDVR GH OD VHQHVFHQFLD con una marcada disminucin de sensibilidad al etileno. Asimismo, se han obtenido resultados inteUHVDQWHV PRGLFDQGR ODV YtDV GH ELRVtQWHVLV R UHVSXHVWD D JLEHUHOLQDV (VWR VH GHEH D TXH SDUD VROXFLRQDU OD IDOWD GH XQLIRUPLGDG HQ OD PRUIRORJtD GH ODV SODQWDV GH FULVDQWHPR SODQWDV HQ PDFHWD VH DSOLFDQ SURGXFWRV FRPR SDFOREXWUD]RO SKRVSKRQ' $PR HWF 6H WUDWD GH LQKLELGRUHV GH JLEHUHOLQDV FRPSXHVWRV FRVtosos, difciles de manejar y, en algunos casos, de uso restringido. Dado que las giberelinas incrementan la divisin y elongacin celular, la inhibicin de esta va resultaba una alternativa YiOLGD 8Q HTXLSR GH LQYHVWLJDGRUHV WUDQVIRUPy crisantemo con el gen gai de A. thaliana bajo el SURPRWRU FRQVWLWXWLYR 6 2EWXYLHURQ XQ DPSOLR UDQJR GH IHQRWLSRV GH HQDQLVPR TXH DWULEX\HURQ QR VyOR DO GLIHUHQWH Q~PHUR GH FRSLDV insertadas, sino tambin al sitio de insercin en HO JHQRPD GH OD SODQWD $O PHGLU ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ GHO JHQ VH REVHUYy TXH FRUUHODFLRQDEDQ FRQ HO JUDGR GH LQWHQVLGDG GHO IHQRWLSR REVHUYDGR HVWR HV D PD\RU QLYHO GH H[SUHVLyQ
mayor grado de enanismo detectado (Figura 4). Usando esta estrategia lograron obtener XQD UHGXFFLyQ HQ OD DOWXUD FRPSDUDEOH D OD DOFDQ]DGD SRU OD XWLOL]DFLyQ GH ORV LQKLELGRUHV GH giberelinas, evitando los efectos colaterales TXH HVWRV SURGXFWRV SURYRFDQ 8QD LQWHUHVDQWH DOWHUQDWLYD SDUD LQFUHPHQWDU la variabilidad gentica es el uso de A. rhizogenes. Se trata de una bacteria del suelo que SRVHH XQ PHJDSOiVPLGR GHQRPLQDGR 5L )LJXUD GRQGH VH HQFXHQWUDQ ORV JHQHV rol A, rol B, rol C, y rol D, UHVSRQVDEOHV GH SURYRFDU DOWHUDFLRQHV IHQRWtSLFDV GHQRPLQDGDV UDtFHV HQ cabellera (hairy roots). En la infeccin, la bacWHULD WUDQVHUH D OD SODQWD HVWRV JHQHV TXH FRGLFDQ SURWHtQDV TXH LQWHUYLHQHQ HQ OD VtQWHVLV GH DX[LQDV \ RSLQDV $GHPiV GH DFUHFHQWDU HO desarrollo de las races en el sitio de infeccin, otros de los sntomas asociados son: enanisPR PD\RU FRPSDFLGDG PHQRU GRPLQDQFLD DSLFDO YDULDELOLGDG HQ KRMDV \ RUHV (VWDV DOWHraciones varan de evento a evento, y la intenVLGDG GH ORV VtQWRPDV HV HVSHFLH GHSHQGLHQWH Pese a esto constituyen una herramienta inteUHVDQWH SDUD SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR GH SODQWDV RUQDPHQWDOHV (Q HO DxR OD HPSUHVD 6DNDWD SUHVHQWy una variedad de conejito (A. majus) con caractersticas diferentes a las variedades comerciaOHV FRQRFLGDV KDVWD HVH HQWRQFHV /D SODQWD VH FDUDFWHUL]y SRU VHU VLJQLFDWLYDPHQWH PiV FRPSDFWD WHQHU HQWUHQXGRV FRUWRV XQD PDUFDGD GLVPLQXFLyQ GH OD GRPLQDQFLD DSLFDO PX\ UDPLFDGD KRMDV \ RUHV PiV SHTXHxDV \ JUDQ FDSDFLGDG GH HQUDL]DPLHQWR (VWD YDULHGDG VH REWXYR DSOLFDQGR OD WHFQRORJtD GH A. rhizogenes. Una estrategia similar se utiliz a SULQFLSLRV GH ORV FRQ Nierembergia scoparia GRQGH VH WUDEDMy FRQ ODV FHSDV KLSHUYLUXlentas de A. rhizogenes )LJXUD (Q OD PLVPD pSRFD VH SUHVHQWDURQ UHVXOWDGRV VLPLODUHV REtenidos con geranio (Pelargonium VS GRQGH ODV SODQWDV PRVWUDURQ IHQRWLSR HQDQR LQFUHmento en el nmero de entrenudos y de ramas laterales, mayor nmero de hojas, de color PiV RVFXUR PD\RU FDSDFLGDG GH HQUDL]DPLHQto y un incremento en la concentracin de aceiWHV HVHQFLDOHV SHUR XQD PDUFDGD LQKLELFLyQ HQ OD RUDFLyQ 8WLOL]DQGR OD PLVPD WHFQRORJtD se informaron resultados similares en lisiantus
Figura 4. Efecto del gen gai HQ SODQWDV GH FULVDQWHmo. A la izquierda el control sin transformar, el resto VRQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV H[SUHVDQGR GLIHUHQWHV QLveles del transgen que se correlacionaron con los sntomas de enanismo observado. Cortesa del Dr. 6HWHSKHQ ' -DFNVRQ
Figura 5. 3OiVPLGR 5L GHO WLSR DJURSLQD TXH VH FDUDFWHUL]D SRU SRVHHU HO $'17 GLYLGLGR HQ GRV 7O \ 7U (Q OD SRUFLyQ 7O VH HQFXHQWUDQ ODV VHFXHQFLDV TXH FRGLFDQ SDUD ORV JHQHV URO \ HQ 7U ORV RQFRJHQHV DX[ \ DX[ \ GH OD VtQWHVLV GH RSLQDV $PEDV SRUFLRQHV GH $'1 7 VRQ WUDQVIHULGDV HQ HO SURFHVR de transformacin.
((XVWRPD JUDQGLRUXP), rudbekia (Rudbeckia hirta), datura (Datura arborea y D. sanguinea), angelonia (Angelonia salicariifolia) y catarantus (Catharanthus roseus). Los genes rol tambin fueron utilizados en IRUPD LQGHSHQGLHQWH GHO VLVWHPD GH A. rhizogenes SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD GH SODWDV
Figura 6. A la izquierda los controles sin transformar de Nierembergia scoparia, a la derecha las SODQWDV WUDQVJpQLFDV H[SUHVDQGR OD VLQWRPDWRORJtD de la enfermedad de las races en cabellera. Gentileza del Dr. Masahiro Mii de la Universidad de ChiED -DSyQ
Utilizando el rol C EDMR HO FRQWURO GHO SURPRWRU 6 GH &D09 VH REWXYLHURQ SHWXQLDV FRQ PHQRU GRPLQDQFLD DSLFDO \ WDQWR OD SODQWD FRPR VXV KRMDV \ RUHV PRVWUDURQ XQ WDPDxR VLJQLFDWLYDPHQWH PiV UHGXFLGR TXH OD SODQWD FRQWURO (no transgnica). En crisantemo y clavel, con XQD FRQVWUXFFLyQ VLPLODU VH REWXYLHURQ SODQWDV GH IHQRWLSR HQDQR HQWUHQXGRV FRUWRV PX\ UDPLFDGDV KRMDV GH GLIHUHQWHV IRUPDV \ WRQRV GH YHUGH PD\RU FDQWLGDG GH RUHV SRU WDOOR DXQTXH PiV SHTXHxDV \ FRPSDFWDV En begonia (B. tuberhybrida VH XWLOL]y SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ XQD FRQVWUXFFLyQ TXH SRUWDba los tres genes rolA, rolB y rolC /DV SODQWDV transformantes resultaron enanas, con mayor cantidad de hojas arrugadas y de intenso color YHUGH SHUR FRQ SUREOHPDV HQ OD RUDFLyQ GHVGH UHWUDVRV D LQKLELFLyQ HQ FRPSDUDFLyQ FRQ HO JHQRWLSR VDOYDMH La estrategia de transformacin con tres geQHV WDPELpQ VH DSOLFy FRQ GLVWLQWRV JUDGRV GH xito, en lilium, limonium y rosa. 4. Genmica en ornamentales ([LVWHQ FDGD YH] PiV SUR\HFWRV GH LQYHVWLJDFLyQ DERFDGRV DO GHVDUUROOR GH SUR\HFWRV GH bioinformtica y genmica, que se estructuran FRPR FRQVRUFLRV PXQGLDOHV FRQ HO Q GH DXQDU esfuerzos y recursos: En ornamentales estn activos los consorcios de Rosceas GDR (Genome Database for Rosaceae) y Begonia; y el de Petunia hybrida y A. majus incluidas en la SGN (Sol Genomic Network).
/D FDUDFWHUL]DFLyQ GH JHQHV SRU PHGLR GH marcadores moleculares clsicos como las HWLTXHWDV GH VHFXHQFLDV H[SUHVDGDV (67 Expressed Sequence Tags R ORV SROLPRUVPRV de un slo nucletidos (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), conjuntamente con la estimaFLyQ GH OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV SDUD HVWDEOHFHU ORV PDUFDGRUHV TXH VH FRUUHVSRQGHQ FRQ UDVJRV IHQRWtSLFRV GH LQWHUpV < XQD YH] REWHQLGRV pVWRV XWLOL]DUORV SDUD la seleccin asistida, la construccin de maSDV JHQpWLFRV \ ORFXV GH FDUiFWHU FXDQWLWDWLYR (QTLs, Quantitative Trait Loci). (Q URVD SRU HMHPSOR VH KD FUHDGR XQ PDSD JHQpWLFR GH DOWD GHQVLGDG SDUD VHU XVDGR FRPR herramienta de anlisis de la variacin gentica \ OD GHWHFFLyQ JHQHV GH LQWHUpV /RV PDSDV GH ligamiento fueron construidos con marcadores moleculares (incluyendo AFLP, $PSOLHG )UDJment Length Polymorphism, ISSR, Inter-Simple Sequence Repeat; RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism; RAPD, Random AmpliHG 3RO\PRUSKLF '1$, entre otros) y marcadoUHV PRUIROyJLFRV (O UHVXOWDGR IXH XQ PDSD GH gran cobertura y con marcadores robustos, con OR FXDO VH DEULy XQD PX\ SURPLVRULD SHUVSHFWLYD SDUD OD FRQIHFFLyQ GH PDSDV GH 47/V \ SDUD HO PHMRUDPLHQWR DVLVWLGR SRU PDUFDGRUHV &RQ HO GHVDUUROOR GHO PDSD GH OLJDPLHQWR VH SXGLHURQ LGHQWLFDU IXQFLRQDOPHQWH GLYHUVDV UHJLRQHV GHO JHQRPD SRU HMHPSOR VH KD LGHQWLFDGR XQ JHQ TXH FRQWUROD HO WLSR GH RU GRV 47/V SDUD UHVLVWHQFLD D powdery mildew, otros GRV TXH FRQWURODQ HO WLHPSR GH RUDFLyQ \ RWURV DVRFLDGRV D HO WDPDxR GH OD RU HO Q~PHUR GH entrenudos, al grosor del tallo, la longitud de OD UDt] HO FRQWHQLGR GH FORUROD \ HO iUHD IROLDU entre otros caracteres. El avance de la genmica tambin ha hecho SRVLEOH JHQHUDU OLEUHUtDV GH $'1F GH SpWDORV GH URVD SDUD GHVDUUROODU (67V \ PLFURDUUHJORV TXH FRPELQDGRV FRQ ORV UHVXOWDGRV GH SURWHyPLFD KDQ SHUPLWLGR LGHQWLFDU YDULRV JHQHV \ HVWLPDU VXV SRVLEOHV IXQFLRQHV HQWUH HOORV DOJXQRV LQFOXLGRV HQ OD SURGXFFLyQ GH IUDJDQFLD $OJXQRV JUXSRV GH LQYHVWLJDFLyQ WUDEDMDQ DFWLYDPHQWH HQ HO HVWXGLR GHO GHVDUUROOR RUDO GH Lilium SDUD HOXFLGDU HO SURFHVR D QLYHO JHQpWLFR \ WUDQVFULSFLRQDO (VWXGLRV JHQyPLFRV FRPR pVWRV SXHGHQ VHU GH VXPD XWLOLGDG DO FRPEL-
D (WDSDV GHO HQVD\R GH WUDQVIRUPDFLyQ LQRFXODFLyQ 5DtFHV HPHUJHQWHV HQ XQD HWDSD WHPSUDQD GHO FXOWLYR &UHFLPLHQWR HQ SODFD \ PHGLR OtTXLGR D OD L]TXLHUGD VH REVHUYD HO JUDGR GH GHVDUUROOR GH XQ FRQWURO HQ PHGLR VyOLGR 3ULPHUDV HWDSDV GH OD RUJDQRJpQHVLV 3OiQWXODV in vitro (YHQWRV UHFXSHUDGRV OXHJR GH OD HWDSD GH DFOLPDWDFLyQ
E /DV HFKDV LQGLFDQ ORV HYHQWRV \ L]TXLHUGD \ GHUHFKD UHVSHFWLYDPHQWH \ VX FRPSDUDFLyQ UHVSHFWR GH OD SODQWD VLOYHVWUH 6H SXHGH DSUHFLDU GLIHUHQFLDV HQWUH RWUDV HQ HO WDPDxR GH ODV RUHV \ OD IRUPD y tamao de las hojas. Figura 7. 'HVDUUROOR GH ORV SURGXFWRV REWHQLGRV HQ ORV HQVD\RV GH WUDQVIRUPDFLyQ de Calibrachoa excellens con Agrobacterium rhizogenes.
narse con tcnicas de transformacin gentica TXH SHUPLWDQ LQWURGXFLU YDULDFLRQHV HQ HO SDWUyQ GH RUDFLyQ \ H[SORWDUORV FRPHUFLDOPHQWH El conocimiento de la diversidad gentica es GH JUDQ D\XGD SDUD XQ FRUUHFWR PDQHMR GHO JHUPRSODVPD SRU SDUWH GH ORV PHMRUDGRUHV &RQ HVWH Q VH FUHDURQ %(*2%,2 \ %(*202/ GRV EDQFRV GH JHUPRSODVPD ex situ e in situ de Begonia (O SUR\HFWR FXHQWD FRQ XQ SURJUDPD GH SUHVHUYDFLyQ GH OD ELRGLYHUVLGDG SRU PHGLR GH FULRSUHVHUYDFLyQ \ GH DOPDFHQDPLHQWR GH $'1 HQ FKLSV \ HQ OLEUHUtDV GH $'1F Distintos trabajos con marcadores moleculaUHV FOiVLFRV TXH KDQ SHUPLWLGR DQDOL]DU WDQWR
las relaciones genticas como la diversidad HQWUH GLVWLQWDV HVSHFLHV 3RU HMHPSOR HQ FDODtea (Calathea 0H\ HO XVR GH $)/3V SHUPLWLy GLIHUHQFLDU GLVWLQWDV HVSHFLHV JHQHUDQGR SHUles y clusters TXH SRGUiQ VHU XWLOL]DGRV SDUD OD FRPSDUDFLyQ FRQ RWUDV HVSHFLHV Por otro lado, estudios basados en RAPDs, ,665V \ PLFURVDWpOLWHV GH FORURSODVWR $'1FS KDQ SHUPLWLGR HVWXGLDU OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD GH GRV HVSHFLHV GH SUtPXOD Primula sikkimensis y P. farinosa. En el ltimo caso, el relevaPLHQWR GH SODQWDV GH GLVWLQWDV DOWLWXGHV SHUPLWLy HVWDEOHFHU OD GLIHUHQFLDFLyQ GH ODV SREODFLRQHV a travs del gradiente de altitudes. En came-
lia amarilla (Camellia nitidissima) se utilizaron 5$3'V \ $)/3V SDUD HVWXGLDU OD YDULDELOLGDG \ OD HVWUXFWXUD GH GLVWLQWDV SREODFLRQHV HVWRV GDWRV VRQ GH YLWDO LPSRUWDQFLD HQ OD FRQVHUYDFLyQ GH OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD GH HVWD HVSHFLH (Q OD YDULHGDG %OXH 3DUURW GH WXOLSiQ Tulipa VSS VH ORJUy HVWDEOHFHU XQD FRUUHODFLyQ HQWUH OD GHWHFFLyQ GH FDPELRV IHQRWtSLFRV UHOHYDQWHV HQ SODQWDV PLFURSURSDJDGDV \ OD PRGLFDFLyQ GH ORV SHUOHV PROHFXODUHV GH 5$3'V H ,665 En junquillo (Narcissus tazetta var. chinensis) VH XWLOL]DURQ 5$3'V \ $)/3V SDUD FDUDFWHUL]DU PXWDQWHV JHQHUDGDV SRU UDGLDFLyQ JDPPD /D DOWD IUHFXHQFLD GH PXWDQWHV GHWHFWDGDV SHUPLti determinar la efectividad del tratamiento. (Q YLROHWD GH ORV $OSHV (Cyclamen persicum) VH LQLFLy XQ SUR\HFWR GH (67V SDUD HQWHQGHU HO SURFHVR GH HPEULRJpQHVLV VRPiWLFD $SUR[Lmadamente un tercio de los genes involucraGRV HQ HVWH SURFHVR VH FXEULy FRQ ORV (67V analizados. En la coleccin generada de Ciclamen VH KDOOy XQD DOWD SURSRUFLyQ GH JHQHV KRPyORJRV FRQ ORV LQYROXFUDGRV HQ HO SURFHVR GH embriognesis somtica en el sistema modelo de Daucus carota (zanahoria). En Gerbera hybrida se logr obtener una coOHFFLyQ GH $'1F D SDUWLU GH WHMLGRV GLIHUHQWHV $ SDUWLU GH OD VHFXHQFLDFLyQ \ HO HQVDPEODGR FRQ las bases de datos existentes, se gener una base de ESTs que dio origen a un microarreJOR GHQRPLQDGR . F'1$ (VWH PLFURDUUHJOR SHUPLWLy OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV HVSHFtFRV GH RUHV YDULRV GH ORV FXDOHV WHQGUtDQ SRVLEOHV IXQFLRQHV HQ HO GHVDUUROOR yUJDQRRUDO /XHJR HO PLVPR PLFURDUUHJOR VH XWLOL]y SDUD DQDOL]DU ORV FDPELRV WUDQVFULSFLRQDOHV SURGXFLGRV GXUDQWH OD RUJDQRJpQHVLV HQ HVWDGLRV GLIHUHQWHV GHO GHVDUUROOR RUDO GH JHUEHUD 6H ORJUy LGHQWLFDU XQD VHULH GH JHQHV TXH SDUWLFLSDUtDQ HQ HO GHVDUUROOR \ OD DSHUWXUD GH ORV SpWDORV DEULHQGR un camino interesante al manejo de la regulaFLyQ GH OD RUDFLyQ En Petunia ODV OLEUHUtDV GH $'1F GH RUHV SHUPLWLHURQ GHVDUUROODU (67V \ PLFURDUUHJORV D SDUWLU GH ORV FXDOHV VH GHVFULELHURQ SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ ODV YtDV GHSHQGLHQWHV GHO FDOFLR \ HQ HO PHWDEROLVPR GH OD SDUHG FHOXODU \ JHQHV UHODFLRQDGRV D OD DSHUWXUD GH ODV RUHV la biosntesis de antocianinas y la degradacin GH SURWHtQDV
En conejito (A. majus) se aislaron secuenFLDV UHSHWLGDV HQ tandem de las regiones centromricas de los cromosomas. Por medio de OD WpFQLFD GH KLEULGDFLyQ XRUHVFHQWH in situ ),6+ VH HVWDEOHFLy XQ FDULRWLSR HVWiQGDU XWLOL]DQGR HVWDV VHFXHQFLDV UHSHWLWLYDV 3DUD LQWHJUDU ORV PDSDV JHQpWLFRV \ FURPRVyPLFRV se seleccionaron marcadores moleculares de FDGD JUXSR GH OLJDPLHQWR GH XQD FROHFFLyQ GH FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH Antirrhinum SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ GH SODQWDV /RV FORQHV VH KLEULGDURQ SRU ),6+ HQ ORV FURPRVRPDV GH FRQHMLWR HO UHVXOWDGR SHUPLWLy HVWDEOHFHU OD UHODFLyQ HQWUH ORV FURPRVRPDV \ ORV JUXSRV GH OLJDPLHQWR 6. Perspectivas Si bien se han obtenido resultados intereVDQWHV SRU HO PRPHQWR ODV WpFQLFDV GH LQJHQLHUtD JHQpWLFD KDQ WHQLGR SRFR LPSDFWR HQ HO mbito de los cultivos ornamentales. 7HQLHQGR HQ FXHQWD TXH OD IXHU]D LPSXOVRUD TXH PXHYH HVWD FODVH GH LQGXVWULD HV OD SHUPDQHQWH UHQRYDFLyQ \ OD DSDULFLyQ GH QRYHGDGHV ODV SHUVSHFWLYDV VRQ SURSLFLDV SDUD HO GHVDUrollo de nuevas variedades ornamentales utilizando tcnicas biotecnolgicas. En este marco HV LPSRUWDQWH GHVWDFDU TXH D OD KRUD GH VHOHFcionar los cultivos sobre lo cuales trabajar, deEHUtDQ FRQWHPSODUVH QR VyOR FXHVWLRQHV WpFQLcas sino tambin comerciales y legales. Por otro lado, los avances en las tcnicas biotecnolgicas y el desarrollo de nuevos y meMRUDGRV SURJUDPDV GH FRPSXWDFLyQ KDQ GDGR D OD JHQyPLFD HO LPSXOVR QHFHVDULR SDUD VHU XQD KHUUDPLHQWD IXQGDPHQWDO HQ ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR $ SHVDU GH TXH VH KDQ SURGXFLGR DYDQFHV HQ HO Q~PHUR GH HVSHFLHV HVWXGLDGDV \ OD FRPSUHQVLyQ GH VXV UHVSHFWLYRV genomas (cada da hay nueva informacin de PDSDV GH OLJDPLHQWR \ pVWRV D OD YH] PiV VDWXUDGRV D~Q KD\ PXFKR SRU KDFHU VREUH WRGR IUHQWH D ODV SHUVSHFWLYDV GHO FDPELR FOLPiWLFR \ ORV SUREOHPDV DVRFLDGRV D OD FRQWDPLQDFLyQ ambiental.
&DVDQRYD ( 7ULOODV 0, 0R\VVHW // DQG 9DLQVWHLQ $ ,QXHQFH RI URO JHQHV LQ RULFXOWXUH Biotech Advances, 23, 3-39. &KRL 36 .LP <' &KRL .0 &KXQJ +- &KRL D.W., and Liu J.R. 2004. Plant regeneration from hairy root cultures transformed by infection with Agrobacterium rhizogenes in Catharanthus roseus 3ODQW &HOO 5HS -da Silva Souza A. and GoesJunhans T. (Editores) ,QWURGXomR D 0LFURSURSDJDomR GH 3ODQWDV (0%5$3$ 0DQGLRFD H )UXWLFXOWXUD 7URSLFDO &UX] das Almas-BA. Brasil. -Dugo M. L., Satovic Z., Milln T., Cubero J. I., 5XELDOHV ' &DEUHUD $ DQG 7RUUHV $0 *HQHWLF PDSSLQJ RI 47/V FRQWUROOLQJ KRUWLFXOWXUDO WUDLWV LQ GLSORLG URVHV 7KHRU $SSO *HQHW -Escandn A. S., Ferrari P., Facciuto G., Soto S., Hagiwara J.C. and Acevedo A. 2003. Combinacin de tcnicas in vitro y ex vitro SDUD OD PLFURSURSDJDFLyQ GH 6DQWD 5LWD +tEU 8QD arbustiva de relevancia ornamental. Revista de ,QYHVWLJDFLyQ $JURSHFXDULD -Marinangeli P. 2003. Biotecnologa del Lilium. En: )ORULFXOWXUD HQ OD $UJHQWLQD 0DVFDULQL / ) 9LOHOOD y E. Wright Eds. Editorial Facultad de Agronoma 8%$ %XHQRV $LUHV 3iJV D 0LVKLED . 1LVKLKDUD 0 $EH < 1DNDWVXND 7 .DZDPXUD + .RGDPD . 7DNHVDZD 7 $EH - DQG <DPDPXUD 6 3URGXFWLRQ RI GZDUI SRWWHG JHQWLDQ XVLQJ ZLOGW\SH Agrobacterium rhizogenes. 3ODQW %LRWHFKQRORJ\ 1DNDJDZD + -LDQJ &K 6DNDNLEDUD + .RMLPD 0 +RQGD , $MLVDND + 1LVKLMLPD 7 .RVKLRND 0 +RPPD 7 /HZLV 0 DQG 7DNDWVXML + 2YHUH[SUHVVLRQ RI D SHWXQLD ]LQFQJHU JHQH DOWHU F\WRNLQLQ PHWDEROLVP DQG SODQW IRUPV 7KH 3ODQW -RXUQDO 1DNDWVXND 7 3LWDNVXWKHHSRQJ & <DPDPXUD 6 and Nishihara M. 2007. Induction of differential RZHU SLJPHQWDWLRQ SDWWHUQV E\ 51$L XVLQJ SURPRWHUV ZLWK GLVWLQFW WLVVXHVSHFLF DFWLYLW\ 3ODQW %LRWHFKQRO 5HS 3HONRQHQ 93 1LLWW\YXRSLR $ $ 0 3LUWWLOl $ /DLQH . DQG +RKWROD $ 3K\ORJHQHWLF Background of Orange Lily (Lilium bulbiferum s.l.) Cultivars from a Genetically Isolated Environment. 3ODQW %LRO 3HQJD < /LQE : :HLD + .UHEVF 6 DQG $URUD 5 3K\ORJHQHWLF DQDO\VLV DQG VHDVRQDO FROG DFFOLPDWLRQ DVVRFLDWHG H[SUHVVLRQ RI HDUO\ OLJKWLQGXFHG SURWHLQ JHQHV RI 5KRGRGHQGURQ FDWDZELHQVH 3K\VLRORJLD 3ODQWDUXP -Petty L.M. Harberd N.P. Carre I.A. Thomas B. -DFNVRQ 6 ([SUHVVLRQ RI WKH $UDELGRSVLV JDL JHQH XQGHU LWV RZQHU SURPRWHU FDXVHV D
UHGXFWLRQ LQ SODQW KHLJK LQ FKU\VDQWKHPXP E\ DWWHQXDWLRQ RI WKH JLEEHUHOOLQ UHVSRQVH 3ODQW 6FL -Pichersky E. and Dudareva N. .2007 Scent engineering: toward the goal of controlling how RZHUV VPHOO 7UHQGV LQ %LRWHFKQRORJ\ YRO 3RQFH -3 3URSDJDFLyQ PDVLYD GH SODQWDV SRVLELOLGDGHV \ SHUVSHFWLYDV In: Resumos do II (QFRQWUR %UDVLOHLUR GH %LRWHFQRORJLD 9HJHWDO 5('%,2 D QRYLHPEUH *UDPDGR S 5RXW *5 0RKDSDWUD $ \ 0RKDQ -DLQ 6 7LVVXH FXOWXUH RI RUQDPHQWDO SRW SODQW $ FULWLFDO UHYLHZ RQ SUHVHQW VFHQDULR DQG IXWXUH SURVSHFW %LRWHFK $GYDQFHV -Sriskandarajah S., Mibus H. y Serek M. .2007. Transgenic Campanula carpatica SODQWV ZLWK UHGXFHG HWK\OHQH VHQVLWLYLW\ 3ODQW &HOO 5HS 7DQDND < .DWVXPRWR < %UXJOLHUD ) \ 0DVRQ - *HQHWLF HQJLQHHULQJ LQ RULFXOWXUH 3&72& -Teixeira da Silva JA .2003 Thin layer Technology LQ RUQDPHQWDO SODQW PLFURSURSDJDWLRQD DQG ELRWHFKQRORJ\ $IULFDQ - %LRWHFK 9LVVHU 3% 'H 0DDJG 5$ \ -RQJVPD 0$ Chrysanthemum. En: Biotech. in Agriculture and )RUHVWU\ 9RO 7UDQVJHQLF &URSV 9, HG 3XD (& \ 'DYRH\05 &KDSWHU ,,, 6SULQJHU 9HUODJ %HUOLQ +HLGHOEHUJ 3DJV :DQJ < \ /L - *HQHV FRQWUROOLQJ SODQW DUFKLWHFWXUH &XUUHQW RSLQLRQ LQ %LRWHFK 129. :DQJ ) *H ; *RQJ ; +X & DQG +DR * 6WURQJ *HQHWLF 'LIIHUHQWLDWLRQ RI Primula sikkimensis LQ WKH (DVW +LPDOD\D+HQJGXDQ 0RXQWDLQV %LRFKHP *HQHW :DQJ < \ /L - *HQHV FRQWUROOLQJ SODQW DUFKLWHFWXUH &XUUHQW RSLQLRQ LQ %LRWHFK 129. <DQ = 9LVVHU 3 % +HQGULNV 7 3ULQV 7 : 6WDP P. y Dolstra O. .2007. QTL analysis of variation for YLJRXU LQ URVH (XSK\WLFD =LY 0 %LRUHDFWRU WHFKQRORJ\ IRU SODQW PLFURSURSDJDWLRQ +RUWLFXOWXUDO 5HYLHZV Sitios WEB sugeridos BEGOBIO: KWWSZZZEHJRELRF]SDJHVPRUHSURMHFWVFKWP ZZZDUDELGRSVLVRUJ www.bioinfo.wsu.edu/gdr/ KWWSZZZYLWURSLFIU KWWSZZZRULJHQHFRPUHVHDUFKUHVHDUFKSKS KWWSJVEMRXUQDOVFOLHQWMS)23%KWPO) KWWSZZZDFWDKRUWRUJERRNVBKWP KWWSZZZLVEYWHGXQHZV1RYSGI
V. CAPTULO 5 Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales

Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry (Q HO SUHVHQWH WH[WR VH DERUGDQ GRV JUDQGHV DVSHFWRV GH LQYHVWLJDFLyQ HQ ELRWHFQRORJtD IRUHVWDO XQR GH ORV FXDOHV LQYROXFUD OD H[SORUDFLyQ GH OD YDULDELOLGDG QDWXUDO \ VX DSURYHFKDPLHQWR SDUD GLVWLQWRV QHV LQFOX\HQGR DYDQFHV PXQGLDOHV \ SULQFLSDOHV SUR\HFWRV HQ HO FDPSR GH OD JHQyPLFD DSOLFDFLRQHV HQ $UJHQWLQD HQ la gentica ecolgica de los bosques y en el PHMRUDPLHQWR \ GRPHVWLFDFLyQ GH HVSHFLHV GH LQWHUpV (O RWUR DVSHFWR VH UHHUH D ORV RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV REMHWLYRV \ HMHPSORV GH LQYHVWLJDFLyQ HQ $PpULFD /DWLQD 1) Avances de las estrategias y herramientas genmicas en el mejoramiento molecular forestal Introduccin (O GHVDUUROOR ELRWHFQROyJLFR \ VXV DSOLFDFLRQHV DO VHFWRU IRUHVWDO VH HVWiQ H[SDQGLHQGR UiSLGDPHQWH Figura A). Las tcnicas de marFDGRUHV PROHFXODUHV SDUD OD ORFDOL]DFLyQ GH JHQHV VLPSOHV \ 47/V loci involucrados en caractersticas cuantitativas o Quantitative Trait ORFL KDQ SHUPLWLGR LGHQWLFDU LQWHUYDORV JHQyPLFRV UHODWLYDPHQWH DPSOLRV WtSLFDPHQWH LQvolucrando decenas de centiMorgans (cM), y SRU OR WDQWR GHFHQDV R FHQWHQDV GH JHQHV \ no los genes efectivamente involucrados en el control de la caracterstica. Estos marcadores VH DSOLFDQ GHQWUR GH WiFWLFDV GH VHOHFFLyQ IDPLOLDU \ VyOR XQD HVWUDWHJLD GH PDSHR GH SROLPRUVPRV GH VHFXHQFLD TXH HVWpQ VXFLHQWHPHQWH SUy[LPRV D XQD PXWDFLyQ IXQFLRQDO UHYHODUi asociaciones entre marcadores moleculares y FDUDFWHUHV GH LQWHUpV PiV SUHFLVDV 1HDOH \ 6DYRODLQHQ *RQ]DOH]0DUWLQH] et al. /D LQIRUPDFLyQ GH ORV PDSDV FRQMXQWDPHQWH FRQ OD JHQHUDGD SRU ORV GLYHUVRV SUR\HFWRV
Figura A: 3URSRUFLyQ GH ODV DFWLYLGDGHV HQ ELRWHFQRORJtD IRUHVWDO DJUXSDGDV HQ JUDQGHV FDWHJRUtDV VHJ~Q HO GRPLQLR S~EOLFR &KDL[ DQG 0RQWHXXLV $SHQGLFH )$2
genmicos que comenzaron en el ao 2000 con la secuenciacin de Arabidopsis thaliana, siguiendo en el ao 2004 con la de Populus trichocarpa KWWSJHQRPHMJLSVIRUJ3RSWU 3RSWUKRPH; Tuskan et al \ TXH FRQWLQ~D FRQ OD GH VHFXHQFLDFLyQ FRPSOHWD GHO JHnoma de Eucalyptus grandis HVSHUDGD SDUD HO ao 2010), SHUPLWLHURQ HO GHVDUUROOR GH QXHYDV HVWUDWHJLDV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV LQvolucrados en caractersticas de inters. ([LVWHQ YDULRV SUR\HFWRV JHQyPLFRV IRUHVWDOHV S~EOLFRV \ SULYDGRV &RQ OD LQIRUPDFLyQ JHQyPLFD GLVSRQLEOH VH KD XWLOL]DGR OD HVWUDWHJLD GHO DQiOLVLV GHO JHQ FDQGLGDWR FDQGLGDWH JHQH DSSURDFK SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV VXE\DFHQWHV HQ 47/V SRU HMHPSOR HQ SLQR SDUD JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD VtQWHVLV GH OLJQLQD \ HVWUXFWXUD GH OD SDUHG FHOXODU %URZQ et al 0HGLDQWH OD HVWUDWHJLD GH JHQpWLFD genmica (genetical genomics), que es una combinacin del anlisis de QTLs y anlisis del WUDQVFULSWRPD HQ ODV SREODFLRQHV VHJUHJDQWHV VH YLR TXH 47/V SDUD FUHFLPLHQWR FRORFDOL]DURQ FRQ H47/V H[SUHVVHG 47/V SDUD JHQHV relacionados a contenido de lignina, sugiriendo que crecimiento y lignina estaran controlados SRU ORV PLVPRV loci HQ HO SHGLJUt GH HXFDOLSWR HQVD\DGR .LUVW et al, 2004). En lamo, se estudiaron combinadamente QTLs, microarreglos y JHQHV FDQGLGDWRV SDUD LGHQWLFDU JHQHV LQYRlucrados en tolerancia a sequa (Street et al., 3RU ~OWLPR \ SDUD GHWHUPLQDU loci y alelos UHVSRQVDEOHV GH ODV GLIHUHQFLDV IHQRWtSLFDV VH
HPSOHD HO PDSHR GH DVRFLDFLyQ DVVRFLDWLRQ PDSSLQJ D SDUWLU GH OD E~VTXHGD GH YDULDQWHV de genes candidatos. En contraste con el maSHR GH 47/V ORV PDUFDGRUHV TXH PXHVWUDQ DVRFLDFLyQ FRQ XQ FDUiFWHU IHQRWtSLFR HVWiQ PX\ FHUFD R GLUHFWDPHQWH HQ HO JHQ TXH LQX\H en el carcter (Figura B). Esta tctica, toma ventaja de la gran variabilidad y bajo valor de desequilibrio de ligamiento que generalmente SUHVHQWDQ ODV SREODFLRQHV QDWXUDOHV \ SXHGH DSOLFDUVH FXDQGR H[LVWH JUDQ YDULDELOLGDG DOpOLFD 613V R VLQJOH QXFOHRWLGH SRO\PRUSKLVPV En el caso de Eucalyptus XQD SULPHUD DVRFLDFLyQ HQWUH SROLPRUVPR HQ JHQHV FDQGLGDWRV \ HO iQJXOR GH OD PLFUREULOOD IXH SXEOLFDGR SRU Thumma et al (Q FRQtIHUDV ORV HVWXGLRV GH DVRFLDFLyQ IXHURQ SLRQHURV \ VH UHDOL]DURQ HQ SLQR WDHGD *RQ]DOH]0DUWLQH] et al SLQR UDGLDWD SLQR 2UHJyQ DEHWR EODQFR y falso abeto (abeto rojo). Hasta aqu, se ha hablado del estudio de la YDULDELOLGDG GH ORV IHQRWLSRV QDWXUDOHV SDUD OD bsqueda de las variantes genticas que los FDXVDQ FX\R HVTXHPD JHQHUDO VLPSOLFDGR VH muestra en la Figura C. La otra alternativa es OD PRGLFDFLyQ GH XQ IHQRWLSR D WUDYpV GH ORV DQiOLVLV GH DQXODFLyQ R VXSUHVLyQ NQRFN RXW R VREUHH[SUHVLyQ GH XQ JHQ PHGLDQWH SODQWDV transgnicas. ,QGHSHQGLHQWHPHQWH GH ODV HVWUDWHJLDV XWLOL]DGDV XQD YH] LGHQWLFDGRV ORV IHQRWLSRV EHQHFLRVRV SXHGHQ VHJXLUVH GRV FDPLQRV LGHQWLFDU JHQRWLSRV TXH FRQWHQJDQ HVWRV DOHORV GH LQWHUpV H LQWURGXFLUORV HQ ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWRFRQVHUYDFLyQ \ PRGLFDU genticamente clones elite con estas variantes, TXH VL ELHQ HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV HV GLFXOWRVD HQ ORV FDVRV SRVLEOHV KDQ VLGR H[LWRVDV FRPR VH H[SOLFDUi SRVWHULRUPHQWH %RHUMDQ Situacin en Argentina /D ELRWHFQRORJtD HQ HVWXGLRV GH *HQpWLFD (FROyJLFD )RUHVWDO El bosque constituye el ecosistema terrestre GH PD\RU FRPSOHMLGDG GRQGH RFXUUHQ LQQLGDG de interacciones entre los elementos estructurales del sistema (los rboles) y los numerosos organismos que viven dentro de l. En las ltimas dcadas, el acelerado avance de la frontera agrcola y ganadera ha reducido sensible-
Figura B ,OXVWUDFLyQ VLPSOLFDGD GH XQ HQVD\R GH DVRFLDFLyQ JHQpWLFD SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH OD YDULDFLyQ DOpOLFD TXH LQX\H XQ FDUiFWHU IHQRWtSLFR DOWXUD HQ XQ HVFHQDULR GH EDMR R DOWR GHVHTXLOLbrio de ligamiento. A) El carcter de inters se mide HQ iUEROHV QR UHODFLRQDGRV WRPDGRV GH XQD SREODFLyQ &RPR HMHPSOR VH PLGLy OD DOWXUD GH FDGD iUERO D XQD HGDG GHQLGD % VH GHWHUPLQDQ 613 HQ FDGD JHQRWLSR JHQHUDOPHQWH WRPDQGR XQD PXHVWUD SHTXHxD \ OXHJR H[WHQGLHQGR DO WRWDO GH OD SREODFLyQ HVWXGLDGD SDUD ORV 613V VHOHFFLRQDGRV /RV 613V VH KDQ HOHJLGR SDUD GRV ORFL HQ XQ PLVPR FURPRVRPD EDMR HO HVFHQDULR GH EDMR GHVHTXLOLEULR GH OLJDPLHQWR 3DUD HO 613 VXSHULRU $ YV & ORV iUEROHV THX SRVHHQ 613 $ WLHQHQ XQD DOWXUD SURPHGLR GH PLHQWUDV THX ORV TXH WLHQHQ & VX DOWXUD SURPHGLR HV VyOR FRQVLVWHQWH FRQ XQD DVRFLDFLyQ VLJQLFDWLYD HQWUH HO JHQRWLSR 613 \ HO IHQRWLSR DOWXUD 3DUD HO VHJXQGR 613 * YV 7 ORV iUEROHV TXH SRVHHQ * WLHQHQ XQ SURPHGLR GH DOWXUD GH \ ORV iUEROHV TXH WLHQHQ 7 WDPELpQ WLHQHQ XQ SURPHGLR GH DOWXUD GH LQGLFDQGR TXH HVWH 613 QR WLHQH DVRFLDFLyQ FRQ HO IHQRWLSR DOWXUD (O EDMR GHVHTXLOLEULR GH OLJDPLHQWR UHVXWDUtD WLSLFDPHQWH HQ XQD SHTXHxD UHJLyQ FURPRVyPLFD SRFRV FLHQWRV GH EDVHV VHxDODGR SRU FDMDV FRORUHDGDV & ORV PLVPRV JHQRWLSRV GH 613 SHUR HQ HVFHQDULR de alto desequilibrio de ligamiento. En este caso, la regin cromosmica que rodea al SNP es grande, algunos cientos de kilobases, y es comn entre los individuos, tambin sealada como caja coloreada. (O UHVXOWDGR HV TXH XQ 613 FRQ VLJQLFDWLYD DVRFLDFLyQ D XQ FDUiFWHU HV SUREDEOH TXH HVWp PX\ FHUFD R GLUHFWDPHQWH VREUH HO JHQ \ HVWR SHUPLWH HO FRnocimiento de la funcin, regulacin etc., siendo los 613V SUHGLFWLYRV QR VyOR HQ HO SHGLJUH \ SXHGHQ XVDUVH HQ SREODFLRQHV QDWXUDOHV Tomado de Will genomics guide a greener forest ELRWHFK" $QGUHZ 7 *URRYHU &XUUHQW 2SLQLRQ LQ %LRWHFKQRORJ\
Figura C: (VTXHPD GH WUDEDMR VLPSOLFDGR SDUD GHWHFFLyQ \ DQiOLVLV GH (67V PHGLDQWH JHQpWLFD GLUHFWD $ SDUWLU GHO WHMLGR GRQGH VH H[SUHVD HO FDUiFWHU R GHO WHMLGR GHO iUERO VRPHWLGR D GLVWLQWRV HVWtPXORV (A) (ej, madera o tejidos sometidos a diversos factores de estrs), se extraen diferencialmente los ARNm que se WUDQVFULEHQ IUHQWH D HVD UHVSXHVWD /XHJR GH XQ SDVR GH VtQWHVLV GH F$'1 LQ YLWUR HVWRV IUDJPHQWRV R ESTs son clonados (B) HQ OLEUHUtDV GH H[SUHVLyQ \ VHFXHQFLDGRV C). (VWD LQIRUPDFLyQ VH FRPSDUD FRQ ODV VHFXHQFLDV GHSRVLWDGDV HQ ODV EDVHV GH GDWRV S~EOLFDV H[LVWHQWHV (D) y se observa el grado de similitud HQWUH HOODV $ SDUWLU GH DTXHOODV TXH SUHVHQWDQ DOWD LGHQWLGDG GH VHFXHQFLD FRQ ORV JHQHV SXEOLFDGRV DKRUD JHQHV FDQGLGDWRV VH GLVHxDQ PDUFDGRUHV HVSHFtFRV GH IUDJPHQWRV E), o bien se buscan variantes de 613V HQWUH ORV LQGLYLGXRV PXHVWUHDGRV (VWDV GLIHUHQFLDV GH VHFXHQFLDV SHUPLWLUiQ SRVLFLRQDU DO JHQ HQ HO FURPRVRPD \ GHWHFWDU VX FRORFDOL]DFLyQ FRQ 47/V HQ XQD SREODFLyQ VHJUHJDQWH GH FUX]DPLHQWRV FRQWUDVWDQWHV SDUD HO FDUiFWHU HQ FXHVWLyQ G). La otra estrategia, (H) HV XWLOL]DU SREODFLRQHV GH LQGLYLGXRV GH JUDQ YDULDELOLGDG IHQRWtSLFD \ JHQRWtSLFD HQ GRQGH HVWRV 613V WUDWDQ GH DVRFLDUVH FRQ ORV IHQRWLSRV, realizando PDSHR GH DVRFLDFLyQ YHU WDPELpQ Figura B 6H REVHUYDUiQ GLIHUHQFLDV VLJQLFDWLYDV GHO FDUiFWHU HQWUH ORV JUXSRV TXH SRVHHQ XQR X RWUR KDSORWLSR VL pVWH HVWi GLUHFWDPHQWH LQX\HQGR HO FDUiFWHU (Q HVWH HVTXHPD JHQHUDO HO FDPELR GH OD EDVH $ GHO JHQ GH SRU XQD & JHQHUD XQD PRGLFDFLyQ GHO DPLQRiFLGR HQ OD SURWHLQD TXH LQX\H GLUHFWDPHQWH HQ OD H[SUHVLyQ GHO FDUiFWHU \ SXHGH YLVXDOL]DUVH HQ ORV IHQRWLSRV GH ORV LQGLYLGXRV VHJUHJDQWHV GH OD SREODFLyQ GH PDSHR \ HQ OD SREODFLyQ GH DVRFLDFLyQ
PHQWH OD VXSHUFLH ERVFRVD D XQD WDVD DQXDO de deforestacin mundial de unos 13 millones GH KDV D OD FXDO QXHVWUR SDtV FRQWULEX\H FRQ XQ SURPHGLR GH KDV GH ERVTXH QDWLYR SRU DxR )$2 XUJH SRU OR WDQWR DFWXDU UiSLGDPHQWH HQ OD FRQVHUYDFLyQ GHO ELHQ FRP~Q JHQpWLFR IRUHVWDO \D TXH GH pO GHSHQGH OD conservacin de la diversidad gentica y el uso DGHFXDGR GH OD PLVPD HQ SURFHVRV SURGXFWLYRV GH LPSRUWDQFLD VRFLRHFRQyPLFD Numerosos son los marcadores que se utili]DQ HQ HVWXGLRV GH JHQpWLFD HFROyJLFD FRQ QHV GH FRQVHUYDFLyQ \ GRPHVWLFDFLyQ GH HVSHFLHV
IRUHVWDOHV /D PD\RUtD \D KDQ VLGR SUHVHQWDGRV \ GHVFULSWRV HQ HVWH YROXPHQ \ SXHGHQ VHU HQFRQWUDGRV HQ GLIHUHQWHV SXEOLFDFLRQHV HJ =LHJHQKDJHQ DQG )ODGXQJ 8QD GH ODV IRUPDV GH DJUXSDU D ORV GLIHUHQWHV WLSRV GH PDUFDGRUHV JHQpWLFRV XWLOL]DGRV en estudios de gentica ecolgica forestal es HQ IXQFLyQ GH VX XWLOLGDG SDUD UHHMDU HO YHUdadero nivel de variacin gentica a diferentes HVFDODV HVSDFLRWHPSRUDOHV (Q EDVH D HOOR SRGHPRV GHQLU WUHV JUXSRV de marcadores genticos que se han utilizado y se utilizan actualmente:
ORV TXH SHUPLWHQ PRQLWRUHDU SURFHVRV evolutivos de larga data y en grandes escalas HVSDFLDOHV ORV TXH SHUPLWHQ PRQLWRUHDU SURFHVRV HYROXWLYRV UHFLHQWHV \ SURFHVRV JHQpWLFRV GH LPSRUWDQFLD DFWXDO HQ HVFDOD GH SDLVDMH ORV TXH SHUPLWHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQRPDV \ HO PRQLWRUHR GHO LPSDFWR DFWXDO GH GLIHUHQWHV WLSRV GH GLVWXUELRV VREUH OD GLYHUVLGDG gentica en escala local /RV OtPLWHV HQWUH ORV JUXSRV QR VRQ H[FOX\HQWHV SRU OR TXH SRGHPRV FRQWDU HQ DOJXQRV FDVRV FRQ XQ PLVPR PDUFDGRU TXH VLUYD SDUD PiV GH XQ SURSyVLWR (QWUH ORV GHO SULPHU JUXSR VH GHVWDFDQ los marcadores genticos de ADN de RUJDQHODV GH PLWRFRQGULDV \ SDUWLFXODUPHQWH GH FORURSODVWRV /D RUJDQL]DFLyQ PROHFXODU GHO JHQRPD GH FORURSODVWR HV H[WUHPDGDPHQWH FRQVHUYDGD SRU OR TXH diferentes taxones vegetales mantienen un mismo arreglo lineal de sus genes. Su evolucin es lenta con una tasa mutacional del orden de 1-3 x 10-9 PRWLYR SRU HO FXDO PXWDFLRQHV RFXUULGDV HQ WLHPSRV geolgicos son mantenidas hasta la actualidad. Con el monitoreo de la distribuFLyQ HVSDFLDO GH VX YDULDFLyQ \ HQ JUDQdes escalas, como las de distribucin QDWXUDO GH XQD HVSHFLH SXHGHQ VHU XWLOL]DGDV MXQWR FRQ HVWXGLRV SDOLQROyJLFRV \ UHJLVWURV GH PLFURIyVLOHV SDUD D\XGDU D UHFRQVWUXLU OD KLVWRULD JODFLDULD \ SRVW glaciaria de los bosques. De esta forma VH XELFDQ VLWLRV GH SUREDEOHV UHIXJLRV JODFLDULRV \ UXWDV PLJUDWRULDV D SDUWLU GH ellos durante la retraccin de los hielos. /D FRUUHFWD LQWHUSUHWDFLyQ GH OD GLVWULEXFLyQ HVSDFLDO GH OtQHDV JHQHDOyJLFDV GDGDV SRU ODV VHFXHQFLDV JpQLFDV R VLWLRV GH UHVWULFFLyQ SHUPLWHQ UHDOL]DU HVWXGLRV ORJHRJUiFRV GHQWUR GH JpQHURV \ HVSHFLHV $YLVH /DV DQJLRVSHUPDV SRVHHQ KHUHQFLD PDWHUQD HQ HO $'1 GH FORURSODVWR SRU OR TXH HO PRQLWRUHR HVSDFLRWHPSRUDO GH VX YDULDFLyQ SHUPLWH GHQLU HO PRYLPLHQWR KLVWyULFR GH OD VHPLOOD \ SRU OR WDQWR HO XMR JpQLFR PDWHUQR 0HGLDQWH estudios realizados con marcadores de ADN
GH FORURSODVWR HQ 5DXOL Nothofagus nervosa) y FRQUPDGR OXHJR HQ 5REOH 3HOOLQ N. obliqua), HVSHFLH HPSDUHQWDGD VH SURSXVR XQD FODUD GLferenciacin entre el norte y el sur del rea de GLVWULEXFLyQ QDWXUDO GH HVWDV HVSHFLHV HQ EDVH D ORV KDSORWLSRV HQFRQWUDGRV 0DUFKHOOL *DOOR $]SLOLFXHWD et al.2009) y la existencia de varios refugios glaciarios sobre la vertiente oriental de los Andes e incluso en el ecotono FRQ OD HVWHSD SDWDJyQLFD /D GLIHUHQFLD GHO HIHFWR VREUH ORV ERVTXHV SDWDJyQLFRV GH GRV SDWURQHV GLIHUHQWHV GH GLVWULEXFLyQ H LQWHQVLGDG GH OD ~OWLPD JODFLDFLyQ VH SXVR GH PDQLHVWR tambin con estos marcadores en un estudio SUHOLPLQDU UHDOL]DGR FRQ Nothofagus antarctica 3DVWRULQR et al. (VWRV UHVXOWDGRV SHUPLWHQ FRPSUHQGHU PHMRU OD KLVWRULD HYROXWLYD TXH GLR RULJHQ D OD GLVWULEXFLyQ HVSDFLDO DFWXDO GH OD YDULDFLyQ JHQpWLFD HQ ODV HVSHFLHV DUEyreas de nuestros bosques. En el caso de una JLPQRVSHUPD HPEOHPiWLFD FRPR OD Araucaria araucana se determinaron los sitios de mayor GLYHUVLGDG \ VH YHULFy QXHYDPHQWH HO SDWUyQ general de diferenciacin norte-sur hallado en RWUDV HVSHFLHV PHGLDQWH OD GLVWULEXFLyQ GH ORV KDSORWLSRV DQDOL]DGRV 0DUFKHOOL HW DO 3DUD ORV REMHWLYRV GHO VHJXQGR JUXSR GH PDUFDGRUHV TXH FRPSUHQGH HVHQFLDOmente estudios de variacin gentica HQWUH \ GHQWUR GH SREODFLRQHV GLIHUHQciacin y diversidad genticas), se utiliza SULQFLSDOPHQWH OD LQIRUPDFLyQ GHO $'1 nuclear, sujeta a una mayor tasa de muWDFLyQ D KHUHQFLD ELSDUHQWDO \ D UHFRPELnacin de la informacin gentica. Estudios realizados con marcadores gniFRV LVRHQ]LPiWLFRV HQ &LSUpV GH OD &RUGLOOHUD (Austrocedrus chilensis) SHUPLWLHURQ HQFRQWUDU TXH ODV SREODFLRQHV RULHQWDOHV HVWHSDULDV GH HVWD HVSHFLH SDWDJyQLFD IXHUD GH ORV SDUTXHV nacionales, son las que contienen la mayor diversidad gentica (Pastorino y Gallo 2002). Informacin obtenida con marcadores SSRs $UDQD HW DO FRQUPy HO FDUiFWHU UHOLFWXDO \ GH DOWD GLYHUVLGDG JHQpWLFD HQ HVWH WLSR GH SREODFLRQHV $UDQD et al. 2010, HQ SUHQVD Con ambos marcadores se determin adems OD HVWUXFWXUDFLyQ HVSDFLDO GHO VLVWHPD GH DSDUHDPLHQWR HQ SREODFLRQHV GH HVWD HVSHFLH \ XQ SURFHVR GH GHULYD JHQpWLFD
/D HVWUXFWXUDFLyQ JHQpWLFD \ VXV SDWURQHV GH GLVWULEXFLyQ HVSDFLDO KDQ VLGR VXJHULGRV HQ HVWXGLRV GH UHJHQHUDFLyQ QDWXUDO SRVWLQFHQGLR D HVFDOD GH URGDO HQ XQD HVSHFLH GHO JHQpUR Nothofagus utilizando marcadores genticos LVRHQ]LPiWLFRV 3UHPROL \ .LW]EHUJHU En Roble Pelln (Nothofagus obliqua SXGR VHU GHWHFWDGR RWUR SURFHVR JHQpWLFR SRFDV YHFHV HYLGHQFLDGR HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV XQ efecto de cuello de botella HQ XQD SREODFLyQ HVWHSDULD \ DLVODGD D XQRV NP DO HVWH GH ODV SREODFLRQHV FRQWLQXDV GH OD HVSHFLH *Dllo et al $]SLOLFXHWD \ *DOOR $GHPiV PDUFDGRUHV JpQLFRV LVRHQ]LPiWLFRV SHUPLWLHURQ FRQUPDU OD KLEULGDFLyQ QDWXUDO HQWUH HVSHFLHV GHO JpQHUR Nothofagus SRU PHGLR GH DOHORV HVSHFtFRV GH HVSHFLH HQ GRV ORFL GH VHJUHJDFLyQ LQGHSHQGLHQWH R SRU GLIHUHQFLDFLyQ de frecuencias allicas en el gnero Prosopis 9HUJD Estos resultados contribuyeron HQ HO SULPHUR GH ORV FDVRV D IRUPXODU XQ PRGHOR GH GLQiPLFD GH KLEULGDFLyQ QDWXUDO \ SURSRQHU SDXWDV GH PDQHMR VLOYtFROD SDUD OD FRQVHUYDFLyQ GH DPEDV HVSHFLHV *DOOR /DV HWDSDV DYDQ]DGDV GHO SURFHVR GH KLEULGDFLyQ H LQWURJUHVLyQ UHWURFUX]DV SXGLHURQ VHU FRQUPDGDV FRQ PDUFDGRUHV PLFURVDWpOLWHV HQ XQ HVWXGLR FRPSDUDWLYR GH VX FDOLGDG GH PDGHUD Un estudio morfolgico detallado junto con informacin sobre variacin gentica isoenziPiWLFD SHUPLWLy GHWHFWDU OD KLEULGDFLyQ QDWXUDO LQWHUHVSHFtFD SRFR FRP~Q HQWUH XQD HVSHFLH decidua (Nothofagus antarctica) y una siemSUHYHUGH N. dombeyi) (Steconni et al. 2004). Un estudio que deriv en una medida concreta GH SURWHFFLyQ IXH UHDOL]DGR D WUDYpV GHO DQiOLVLV combinado con marcadores de ADN de cloroSODVWR H LVRHQ]LPiWLFRV &RQ HOORV IXH GHWHFWDdo el centro de mayor diversidad gentica de SREODFLRQHV DUJHQWLQDV GH Nothofagus nervosa 0DUFKHOOL *DOOR *DOOR HW DO (Figura D UHVXOWDQGR HQ XQD GHFLVLyQ SROtWLca sobre la conservacin y manejo de masas boscosas (O WHUFHU JUXSR GH PDUFDGRUHV HV XWLOL]DGR HQ HVWXGLRV GH SURFHVRV GH LPSRUWDQFLD HYROXWLYD \ GH JHQpWLFD HVSDFLDO D escala local, los cuales requieren esenFLDOPHQWH PDUFDGRUHV KLSHUYDULDEOHV co-dominantes o dominantes (nSSR o
665 QXFOHDUHV FS665 R 665 GH FORURSODVWRV 5$3', AFLP). Entre estos SURFHVRV JXUDQ HVWLPDFLRQHV GH XMR SROtQLFR DFWXDO HVWUXFWXUDFLyQ JHQpWLFD en diferentes estratos generacionales, LPSDFWR GHO XVR VLOYtFROD HQ OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD LPSDFWR GH OD IUDJPHQWDFLyQ GHO KDELWDW DQiOLVLV GH SDWHUQLGDG LGHQWLFDFLyQ GH UHJHQHUDFLyQ QDWXUDO YHJHWDtiva, entre otros. $SOLFDQGR 665V MXQWR FRQ PDUFDGRUHV Jpnicos isoenzimticos y PCR-RFLP en ADN de FORURSODVWR VH DQDOL]y HO XMR JpQLFR HQWUH GRV SREODFLRQHV GH Nothofagus nervosa, VHSDUDGDV SRU XQD FRODGD GH ODYD GH XQD HUXSFLyQ geolgicamente reciente del volcn Lann. Se FRPSUREy TXH QR H[LVWH FRQH[LyQ SRU XMR VH-
Figura D: (MHPSOR GHO SDWUyQ HOHFWURIRUpWLFR GH $'1 GH FORURSODVWR GH SREODFLRQHV DUJHQWLQDV GH Nothofagus nervosa (Raul), que conjuntamente FRQ LVRHQ]LPDV IXH XWLOL]DGR SDUD GHWHFWDU HO FHQWUR de mayor diversidad gentica al oeste de la cuenFD /DJR /DFDU VHxDODGR HQ HO PDSD SRU HO FtUFXOR OOHQR GHULYDQGR OXHJR HQ XQD PHGLGD SROtWLFD TXH SHUPLWLy PRGLFDU HO HVWDWXV GH SURWHFFLyQ GH HVH bosque.1: 0DSD FRQ KDSORWLSRV GH 0DUFKHOOL \ *DOOR 2: Migracin de fragmentos de restriccin GH $'1 GH FORURSDVWR HQ JHOHV GH DJDURVD GH 0DUchelli et.al. 3: Bosque Hua-Hum incluido en OD QXHYD iUHD SURWHJLGD
PLQDO SHUR TXH DPEDV SREODFLRQHV VH PDQWLHQHQ FRQHFWDGDV JHQpWLFDPHQWH SRU XMR GH SROHQ 0LOOHURQ et al. &RQ HO XVR GH PLFURVDWpOLWHV VH REWXYLHURQ UHVXOWDGRV SUHOLPLQDUHV VREUH HO XMR SROtQLFR HQ Araucaria araucana GHVWDFiQGRVH OD LPSRUWDQFLD GH ORV iUEROHV DLVODGRV FRPR SXHQWHV JHQpWLFRV HQWUH IUDJPHQWRV 3RU RWUR ODGR VH FRPSUREy TXH HO vecindario gentico de un bosque de Nothofagus WLHQH XQ UDGLR GH VROR P FRQ XQ Q~PHUR HIHFWLYR GH iUEROHV SROLQL]DGRUHV 0DUFKHOOL et al. OR FXDO \D KD VHUYLGR SDUD MDU SDXWDV DSOLFDEOHV GH FRVHFKD GH VHPLOOD \ GH PDnejo silvcola. Como se ve a travs de todos estos ejemSORV GH HVWXGLRV UHDOL]DGRV HQ $UJHQWLQD ODV tcnicas biotecnolgicas de gentica molecular UHDOL]DQ XQ FRQWXQGHQWH DSRUWH HQ HO PRQLWRUHR GH SURFHVRV HFROyJLFRV GH LPSRUWDQFLD HYROXWLYD (VWR SHUPLWH HQ WLHPSRV UHODWLYDPHQWH FRUWRV REWHQHU UHVXOWDGRV TXH SRVLELOLWDQ OD WRPD de decisiones relacionadas a la conservacin y al manejo de la diversidad gentica de nuestros bosques nativos. $SOLFDFLyQ GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV neutros en Poblaciones de mejora y SURGXFFLyQ GH HVSHFLHV IRUHVWDOHV GH rpido crecimiento La caracterizacin, evaluacin y manejo de OD YDULDELOLGDG JHQpWLFD HQ SREODFLRQHV GH PHMRUD \ SURGXFFLyQ LQWHJUDQ iUHDV GH DSOLFDFLyQ donde los marcadores de ADN neutros ofrecen mayor utilidad. 7DQWR HQ ORV SURJUDPDV GH PHMRUD JHQpWLFD FRPR HQ ORV SURJUDPDV GH SURSDJDFLyQ PDVLYD OD FRUUHFWD LGHQWLFDFLyQ GH FORQHV HOLWH DVt FRPR OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV SURJHQLWRUHV involucrados en cruzamientos controlados, FRQVWLWX\HQ IDFWRUHV FUtWLFRV HQ OD SURGXFFLyQ GH HVSHFLHV FRPHUFLDOHV \D TXH HUURUHV GH LGHQWLFDFLyQ JHQpWLFD SXHGHQ DIHFWDU VHYHUDPHQWH ORV QLYHOHV GH JDQDQFLD HVSHUDGRV HQ VLVWHPDV D JUDQ HVFDOD 'LFKRV DVSHFWRV DVt como la estimacin del nivel de contaminacin FRQ SROHQ SURFHGHQWH GH IXHQWHV H[WHUQDV HQ KXHUWRV VHPLOOHURV SXHGHQ VHU DVLVWLGRV PHGLDQWH QJHUSULQW R KXHOOD GDFWLODU GHO $'1 PHGLDQWH HO HPSOHR GH ORV 665V JUDFLDV D su naturaleza multiallica y herencia codomi-
nante. En el mbito local estos marcadores se XWLOL]DURQ FRPR GHVFULSWRUHV FRPSOHPHQWDULRV SDUD OD LQVFULSFLyQ HQ HO 5HJLVWUR 1DFLRQDO GH OD 3URSLHGDG GH &XOWLYDUHV GH ORV SULPHURV clones de Eucayptus grandis, mediante la utiOL]DFLyQ GH 665V GHVDUUROODGRV SRU (0%5$3$ %UDVLO 7RUDOHV HW DO /D FXDQWLFDFLyQ GH OD GLYHUVLGDG JHQpWLFD dentro del stand, es uno de los criterios claves TXH GHQHQ OD FDOLGDG GH OD VHPLOOD IRUHVWDO /D SURGXFFLyQ GH VHPLOOD JHQpWLFDPHQWH PHjorada, a travs de Huertos Semilleros, integra ODV DFWLYLGDGHV SULRUL]DGDV HQ ORV SURJUDPDV de mejoramiento del INTA, donde idealmente HO PDWHULDO GH SURSDJDFLyQ GHEH SUHVHQWDU DOWR valor gentico y mantener alta diversidad. (O KXHUWR VHPLOOHUR FRQVWLWX\H XQD SODQWDFLyQ GH FORQHV +6& R SURJHQLHV +63 VHOHFFLRnados intensivamente sobre la base de caracWHUtVWLFDV GH LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD HO FXDO ha sido sometido a los aclareos genticos neFHVDULRV SDUD FRQVHUYDU ~QLFDPHQWH DTXHOORV clones o individuos que han demostrado su suSHULRULGDG (VWR SXHGH RULJLQDU HO GHFUHFLPLHQWR GHO QLYHO GH YDULDELOLGDG JHQpWLFD SUHVHQWH HQ ODV VHPLOODV SURGXFLGDV HQ HO KXHUWR \ SRU H[WHQVLyQ HQ ODV SOiQWXODV XWLOL]DGDV HQ ODV H[SORWDFLRQHV FRPHUFLDOHV FRQ SRVLEOHV SpUGLGDV GH SURGXFWLYLGDG $ PRGR GH HMHPSOR VH FLWDQ ODV HVSHFLHV GHO JpQHUR Eucalyptus, las cuales VL ELHQ SUHVHQWDQ XQ VLVWHPD GH IHFXQGDFLyQ SUHGRPLQDQWHPHQWH DOyJDPR \ PHGLDGR SRU SROLQL]DFLyQ HQWRPyOD SXHGHQ HVWDU VXJHWDV D HIHFWRV GH GHSUHVLyQ SRU HQGRJDPLD (VWRV HIHFWRV VH PDQLHVWDQ HQ OD UHGXFFLyQ GH ORV QLYHOHV GH SURGXFFLyQ GH VHPLOODV UHGXFFLyQ de altura de fuste, rea basal y volumen, y deIRUPDFLyQ GH KRMDV \ WDOORV HQ DOJXQDV HVSHcies. En consecuencia, el diseo de los huertos debe considerar restricciones de distancias mQLPDV HQWUH LQGLYLGXRV HPSDUHQWDGRV (Q SODQWDFLRQHV FORQDOHV OD DVLVWHQFLD SRU PDUFDGRUHV PROHFXODUHV SHUPLWH HYLWDU OD LPSODQWDFLyQ GH clones genticamente relacionados en bloques contiguos, disminuyendo adems, el riesgo frenWH DO DWDTXH GH SODJDV \ SDWyJHQRV HQ WRGD OD SODQWDFLyQ (Q HO iPELWR ORFDO VH DSOLFDURQ $)/3 \ 665 HQ SREODFLRQHV GH PHMRUD GH Eucalyptus dunnii VHOHFFLRQDGDV SRU FDUDFWHUHV PRUIRPp-
tricos de inters, FRQ OD QDOLGDG GH GLVHxDU +6&V TXH PD[LPLFHQ HO SURJUHVR HQ OD PHMRUD JHQpWLFD \ PLQLPLFHQ ORV ULHVJRV GH GHSUHVLyQ SRU HQGRJDPLD 6X DSOLFDFLyQ SHUPLWy HO DQiOLVLV JHQyPLFR GH FORQHV VHOHFWRV SRU IRUPD GH IXVWH \ WDVD GH FUHFLPLHQWR \ OD LGHQWLFDFLyQ GH QXHYH SDUHV GH FORQHV PiV GLYHUJHQWHV PDQWHQLHQGR HO GHO Q~PHUR WRWDO GH DOHORV GHWHFWDGRV 0DUFXFFL 3ROWUL HW DO 2003). As mismo, estos marcadores han sido XWLOL]DGRVSDUD OD HVWLPDFLyQ GH OD DPSOLWXG GH la base gentica retenida en huertos semilleros GLVHxDGRV D SDUWLU GH SREODFLRQHV GH PHMRUDmiento, en E. grandis, E. globulus y E. dunnii 0DUFXFFL 3ROWUL HW DO $FWXDOPHQWH VH DSOLFDQ HQ Pinus taeda, con el objeto de estaEOHFHU ODV UHODFLRQHV GH SDUHQWHVFR HQWUH LQGLYLGXRV SHUWHQHFLHQWHV D +6&V LQVWDODGRV HQ OD SURYLQFLD GH 0LVLRQHV 9LOODOED$FRVWD HW DO \ HQ HO 12$ )RUQHV SXGLHQGR ser sujetos al raleo de individuos. /D LQFRUSRUDFLyQ GH WpFQLFDV PROHFXODUHV HQ ORV SURJUDPDV GH PHMRUD SURFXUD RSWLPL]DU OD HVWUXFWXUD GH ODV SREODFLRQHV GH PHMRUDSURduccin, incrementar la informacin necesaria SDUD GHFLGLU VREUH OD LQIXVLyQ GH QXHYRV PDteriales y mejorar las estrategias de seleccin. &RQ OD QDOLGDG GH HVWDEOHFHU XQD HVWUDWHJLD DOWHUQDWLYD GH VHOHFFLyQ SDUD HO GLVHxR GH XQ HSP local de E. dunnii, basado en el anlisis conjunto de un ndice de seleccin morfomtrico y criterios de diversidad gentica molecular, se realiz el estudio genmico de 37 familias GH PHGLR KHUPDQRV VHOHFWDV SRU IRUPD GH IXVWH '$3 \ GHQVLGDG GH OD PDGHUD SURYHQLHQWHV GH RUtJHQHV DXVWUDOLDQRV \ XQD SURFHGHQFLD local. La diversidad gentica y su distribucin as como las relaciones genticas entre los individuos, evidenciaron con claridad baja difeUHQFLDFLyQ JHQpWLFD HQWUH SURFHGHQFLDV \ DOWD GLIHUHQFLDFLyQ HQWUH IDPLOLDV GRQGH HO GH OD YDULDFLyQ WRWDO IXH H[SOLFDGD GHQWUR GH HOODV VXJLULHQGR SRU OR WDQWR TXH HO GLVHxR GHO +63 deba basarse en la seleccin individual y famiOLDU =HOHQHU et. al. /D GHWHUPLQDFLyQ GH ORV SRVLEOHV RUtJHQHV de las razas locales de E. globulus SURYHQLHQWHV GH $UJHQWLQD 3RUWXJDO (VSDxD \ &KLOH fue tambin abordada mediante el anlisis de SSRs y AFLPs. Los estudios de diversidad ge-
QpWLFD \ HVWUXFWXUD SREODFLRQDO GLDJQRVWLFDURQ una marcada asociacin entre las razas locales HQWUH Vt DVt FRPR XQD FODUD DQLGDG HQWUH pVtas y las razas australianas del Sur y Sudeste de Tasmania, sugiriendo que dichas regiones IXHURQ ODV SULPHUDV IXHQWHV SURYHHGRUDV GH VHPLOODV GH OD HVSHFLH $FXxD et.al. 2004). (YDOXDFLyQ GH YDULDELOLGDG IXQFLRQDO HQ programas de mejoramiento y GRPHVWLFDFLyQ /D H[SORUDFLyQ GH OD YDULDELOLGDG DOpOLFD GH genes candidatos mediante diversas tcnicas de deteccin de SNPs, constituye un desafo SDUD HO HVWXGLR GH OD GLYHUVLGDG IXQFLRQDO HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV (Q ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR \ GRmesticacin de Argentina se han comenzado D LQFRUSRUDU \ GHVDUUROODU QXHYDV HVWUDWHJLDV GLULJLGDV D RSWLPL]DU OD FDOLGDG GH PDGHUD FRQWHQLGR GH OLJQLQD \ GHQVLGDG HQ HVSHFLHV GHO gnero Eucalyptus, como as tambin a anaOL]DU FDUDFWHUtVWLFDV DGDSWDWLYDV HQ HVSHFLHV QDWLYDV (Q DPERV HVWXGLRV OD QDOLGDG HV GHWHFWDU YDULDQWHV DOpOLFDV UHVSRQVDEOHV GH OD H[SUHVLyQ GHO FDUiFWHU \ D FRQWLQXDFLyQ VH GHWDOODQ ORV GRV HMHPSORV (O FRQWHQLGR \ FRPSRVLFLyQ GH OLJQLQD HV GH JUDQ LPSRUWDQFLD HQ OD SURGXFFLyQ GH SXOSD SDUD OD LQGXVWULD GHO SDSHO IXQGDPHQWDOPHQWH SRU ODV FRQVHFXHQFLDV TXH VX HOLPLQDFLyQ WLHne en la conservacin del medio ambiente. Por RWUR ODGR HO EDMR FRQWHQLGR GH HVWH SROtPHUR HV XQD FDUDFWHUtVWLFD LPSRUWDQWH SDUD OD XWLOL]DFLyQ de los residuos forestales en la generacin de biocombustibles (bioetanol) ya que reduce los FRPSRQHQWHV LQKLELWRULRV \ HQULTXHFH OD FRQcentracin relativa de los hidratos de carbono IHUPHQWDEOHV (Q XQD SULPHUD HWDSD VH FDUDFWHUL]y XQ +XHUWR 6HPLOOHUR &ORQDO GH SULPHUD generacin (27 rboles) de E. grandis, tanto en la variabilidad de los genes candidatos involucrados en la via metablica como en el conWHQLGR \ FRPSRVLFLyQ GH OLJQLQD 7RUDOHV et al, . Se encontraron escasas diferencias feQRWtSLFDV HQWUH LQGLYLGXRV \ DOJXQDV YDULDQWHV allicas diferenciales. En cuanto a la bsqueda de QTLs asociados a densidad de madera, se WUDEDMy HQ SREODFLRQHV VHJUHJDQWHV ORFDOHV GH E. grandis (Garca et al, 2007) y en el desa-
UUROOR GH PDUFDGRUHV IXQFLRQDOHV GH WLSR (67 665 D SDUWLU GH VHFXHQFLDV SXEOLFDGDV GH E. globulus (Acua et al, 2007), informacin til HQ HO PDSHR JHQpWLFR \ HVWXGLRV GH YDULDELOLGDG funcional. /D VHJXQGD DSOLFDFLyQ GHO SURJUDPD VH UHHUH DO HVWXGLR GH YDULDELOLGDG D QLYHO GH QXcletidos de genes involucrados en tolerancia a estrs abitico tales como sequa y salinidad. Los genes seleccionados se estudiaron HQ ODV SREODFLRQHV GH Austrocedrus chilensis y Prosopis spp, en sus gradientes naturales de GLVWULEXFLyQ JHRJUiFD DEDUFDQGR ODV ]RQDV marginales, sometidas a estrs hdrico y saliQR $PEDV HVSHFLHV FRQVWLWX\HQ VLVWHPDV PRGHOR SDUD HVWH WLSR GH DQiOLVLV VLHQGR HVSHFLHV IRUHVWDOHV QDWLYDV GH LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD GH UHODWLYR UiSLGR FUHFLPLHQWR \ FRQ XQ DOWR SRWHQFLDO DGDSWDWLYR 7LHQHQ SRVLELOLGDGHV GH adecuarse a cambios climticos futuros, que OHV SHUPLWLUtDQ RFXSDU QLFKRV TXH QR VH VXSHUSRQHQ FRQ OD SURGXFFLyQ IRUHVWDO GH HVSHFLHV H[yWLFDV GH DOWR UHQGLPLHQWR SHUPLWLHQGR OD UHVWDXUDFLyQ GH HFRVLVWHPDV GHJUDGDGRV SRU OD H[SORWDFLyQ IRUHVWDO H[WUDFWLYD &RQVWLWX\HQ XQD DOWHUQDWLYD SURGXFWLYD \ HQ DOJXQRV FDVRV SXHGH VHU FRPELQDGD FRQ OD DFWLYLGDG DJUtFROD R JDQDGHUD $ SDUWLU GH (67V GH Pinus pinaster, P. taeda, 3URVRSLV MXOLRUD y genes de Arabidopsis y Criptomeria japnica, se disearon FHEDGRUHV VH DPSOLFDURQ \ DQDOL]DURQ IUDJPHQWRV FRQ DOWR SRUFHQWDMH GH VLPLOLWXG D ORV GHSRVLWDGRV HQ OD EDVH GH GDWRV (Q Austrocedrus chilensis VH DQDOL]DURQ SRUFLRQHV GH ORV JHQHV 3DO /3 \ $TXDSRULQD HQ JHQRWLSRV contrastantes sin detectar an asociacin. En Prosopis VH HYDOXDURQ JHQHV HQ JHQRWLSRV GH ODV HVSHFLHV 3URVRSLV H[XRVD, P.chilensis y P.alba FRQ FRPSRUWDPLHQWRV FRQWUDVWDQWHV IUHQWH DO HVWUpV KtGULFR (Q ORV JHQHV +$.3 (5' 3+' )LQJHU \ 5DE VH GHWHFWDURQ 613V GLIHUHQFLDOHV HQWUH HVSHFLHV TXH KDELWDQ las distintas regiones (Torales et al, 2009). Conclusiones y perspectivas La utilizacin de marcadores moleculares QHXWURV \ JHQpWLFRV SDUD PDQHMR DVLVWLGR GH SREODFLRQHV GH PHMRUD \ HQ JHQpWLFD HFROyJLFD SULQFLSDOPHQWH FRQ QHV GH FRQVHUYDFLyQ KDQ VLGR DSOLFDGRV HQ $UJHQWLQD /RV DYDQ-
ces logrados mundialmente a nivel genmico HQ HVSHFLHV PRGHOR SRGUiQ VHU XWLOL]DGRV FRQ PD\RU LQWHQVLGDG HQ RWUDV HVSHFLHV KDELHQGR iniciado el camino en alguna de ellas, con el Q GH H[SORWDU OD YDULDFLyQ JHQpWLFD GH SREODFLRQHV GH PHMRUD R QDWLYDV 1R REVWDQWH SDUD el descubrimiento de nuevos genes, ser tamELpQ QHFHVDULR JHQHUDU H LQFRUSRUDU HQ EDVHV GH GDWRV S~EOLFDV VHFXHQFLDV GH (67V ORJUDGDV D WUDYpV GH GLYHUVRV H[SHULPHQWRV \ HQVD\RV ELROyJLFRV HQ JpQHURV \ HVSHFLHV HQ ODV TXH OD GLVSRQLELOLGDG DFWXDO GH SUR\HFWRV GH VHFXHQFLDFLyQ QR HVWp SUHYLVWD R VHD GLItFLO SRU OD FRPSOHMLGDG GHO JHQRPD FRPR HO FDVR GH ODV FRQtIHUDV $ SDUWLU GH HVWDV EDVHV GH GDWRV \ GH ODV PHWRGRORJtDV GH DOWR GHVHPSHxR FRPR PpWRGRV GH SLURVHFXHQFLDFLyQ R PLFURDUUHJORV de oligonucletidos en cuentas (beadarrays), basadas en la extensin de iniciadores alelo HVSHFtFD FRPR WHFQRORJtD GH *ROGHQ *DWH )DQ HW DO VH SRGUiQ GHWHFWDU JUDQ FDQWLGDG GH 613V HQ IRUPD SDUDOHOD D XQ FRVWR UD]RQDEOH \ QDOPHQWH SRGUiQ XWLOL]DUVH HQ HVtudios de asociacin gentica. Por lo tanto, la JHQpWLFD GH DVRFLDFLyQ SURPHWH VHU OD HVWUDWHgia elegida en todos los gneros y en donde el objetivo es correlacionar la distribucin de ORV JHQRWLSRV GH ORV JHQHV FDQGLGDWRV FRPR VHFXHQFLDV GH $'1 \ ORV IHQRWLSRV UHOHYDQWHV WDO FRPR VH DSOLFD HQ KXPDQRV \ RWURV RUJDnismos de fecundacin cruzada). Por esta razn, seguirn siendo clave la seOHFFLyQ GH ORV JHQHV FDQGLGDWRV OD FDSDFLGDG GH FDUDFWHUL]DU DSURSLDGDPHQWH ORV IHQRWLSRV \ OD KDELOLGDG GH XWLOL]DUORV SDUD PDQLSXODU YtD mejoramiento molecular o transgnesis. Todas estas metodologas, adems de mejorar el conocimiento del control gentico de caUDFWHUtVWLFDV GH LQWHUpV DOHORV GH LPSRUWDQFLD econmica y ecolgica), reduciran los costos \ WLHPSRV GH PHMRUDPLHQWR \ D\XGDUiQ HQ OD conservacin. 0RGLFDFLyQ JHQpWLFD GH HVSHFLHV forestales Introduccin La transformacin gentica de rboles es todava un instrumento relativamente nuevo en el sector forestal y se realiza a menudo usando
sistemas de transformacin basados en Agrobacterium tumefaciens YHU &DSLWXOR ;; HQ DQJLRVSHUPDV \ SRU ERPEDUGHR FRQ PLFURSDUWtFXODV HQ JLPQRVSHUPDV YHU &DS ;; /RV p[LWRV HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV VRQ KDVWD HO PRPHQWR OLPLWDGRV GHELGR D ORV SUREOHPDV DVRFLDGRV D OD UHJHQHUDFLyQ GH ODV SODQWDV HVSHFLDOPHQWH VL VH FRQVLGHUD TXH PXFKDV HVSHFLHV VRQ D~Q consideradas recalcitrantes al cultivo in vitro y que OD WUDQVIRUPDFLyQ GH XQD QXHYD HVSHFLH GHSHQGH GH VX FDSDFLGDG GH UHJHQHUDFLyQ GH SODQWDV 8QD GH ODV DSOLFDFLRQHV GH OD WHFQRORJtD GH PRGLFDFLyQ JHQpWLFD TXH D PHQXGR VH SDVD SRU DOWR SHUR TXH HV WDO YH] OD PiV LPSRUWDQWH HV OD TXH VH UHHUH D OD LQYHVWLJDFLyQ GH OD ELRloga de los rboles, es decir, estudios sobre el funcionamiento de los genes y sobre los caracteres que stos controlan. Por otro lado, la utilizacin comercial de rEROHV WUDQVJpQLFRV VH OLPLWD D ODV SODQWDFLRQHV FRPHUFLDOHV SDUD OR FXDO HV HVHQFLDO GLVSRQHU GH PDUFRV UHJODPHQWDULRV SDUD HO HQVD\R VHguimiento y gestin de los rboles OGM, utiOL]DQGR PDWHULDOHV FRQ UHSURGXFFLyQ FRQWURODGD HVWpULOHV GH SURSDJDFLyQ YHJHWDWLYD R FRQ SURGXFFLyQ UHGXFLGD GH SROHQ /D PRGLFDFLyQ gentica a travs del ensayo clonal es la estraWHJLD PiV OyJLFD SDUD LQWHJUDUOD D ORV SURJUDmas tradicionales de mejoramiento de rboles. 3RU HVWD UD]yQ HV SUHIHULEOH XWLOL]DU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV TXH FXHQWDQ FRQ SURJUDPDV DYDQ]DGRV GH PHMRUDPLHQWR \ HQ ODV TXH SXHGD FRQVLGHUDUVH GH PRGR UHDOLVta la utilizacin de tcnicas de clonacin. 2EMHWLYRV GH OD WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD de rboles 8QR GH ORV REMHWLYRV PiV LPSRUWDQWHV FRQVtituye el estudio de la funcionalidad de los genes que se van descubriendo y que mediante HVWD KHUUDPLHQWD \D VHD SRU VREUHH[SUHVLyQ R VXSUHVLyQ HV SRVLEOH DWULEXLU /RV GRV REMHWLvos ms estudiados en la investigacin en ingeniera gentica forestal son el aumento en OD SURGXFFLyQ GH ELRPDVD \ ORV FDPELRV HQ OD HVWUXFWXUD GH OD PDGHUD FRQ XQ SDSHO IXQdamental en los estudios de los mecanismos reguladores de formacin de la misma. El aumento de la tasa de crecimiento, el incremento
del volumen del tronco, y el acortamiento de ORV WXUQRV GH FRUWD VRQ REMHWLYRV LPSRUWDQWHV GH PXFKRV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR GH iUEROHV DVt FRPR OD UHFWLWXG GHO IXVWH HO SHUtRGR GH UHSRVR \ ORV KiELWRV GH FUHFLPLHQWR UDPLFDFLyQ 3DUD HOOR VH KD PRGLFDGR OD H[SUHVLyQ GH XQD VHULH GH JHQHV TXH SDUWLFLSDQ HQ OD VtQWHVLV GH KRUPRQDV YHJHWDOHV 3RU HMHPSOR el gen ipt de Agrobacterium tumefasciens, que FRGLFD XQD HQ]LPD SDUD OD SURGXFFLyQ GH FLWRFLQLQDV OD VREUHH[SUHVLyQ GH ORV JHQHV rol de Agrobacterium rhizogenes TXH SURGXFHQ PRGLFDFLRQHV HQ OD DQDWRPtD \ FRPSRVLFLyQ TXtPLFD GH OD SDUHG FHOXODU HQ iUEROHV WUDQVJpQLFRV OD H[SUHVLyQ HQ GLUHFFLyQ VHQWLGR \ DQWLVHQWLGR de la enzima GA 20-oxidasa TXH SDUWLFLSD HQ OD VtQWHVLV GH JLEHUHOLQDV \ SRU HQGH HQ HO FUHFLmiento, el gen de la glutamina sintasa (GS) de SLQR TXH LQWHUYLHQH HQ HO PHWDEROLVPR GHO QLtrgeno y una xiloglucanasa de Aspergillus que SURPXHYH OD H[SDQVLyQ FHOXODU 5HVSHFWR D OD HVWUXFWXUD GH OD PDGHUD OD LQYHVWLJDFLyQ VH FRQFHQWUD HQ PRGLFDU HO FRQWHQLGR \ OD FRPSRVLFLyQ GH OLJQLQD 0XFKRV GH ORV genes involucrados en la sntesis de la lignina KDQ VLGR VREUHH[SUHVDGRV R LQKLELGRV HQ iUEROHV FRPR iODPR SLQR \ HXFDOLSWRV 8WLOL]DQGR OD HVWUDWHJLD GH DQWLVHQWLGR SDUD UHGXFLU OD H[SUHVLyQ GHO JHQ 4CL +X HW DO 6HGHURII HW DO R DXPHQWDQGR OD H[SUHVLyQ GH )+ VH REWXYR XQD UHGXFFLRQ GHO GHO FRQWHQLGR GH OLJQLQD \ XQ DXPHQWR GHO GH FHOXORVD en lamos. Otros objetivos han sido la introduccin de resistencia a insectos y hongos, tolerancia a herbicidas y las mejoras relacionadas con la FDSDFLGDG GH FUHFHU HQ VXHORV PDUJLQDOHV H[hibiendo resistencia o tolerancia a los estreses biticos y abiticos (como sequas, heladas, LQXQGDFLRQHV DOWD VDOLQLGDG HWF (O SULPHU rbol transgnico fue un lamo con resistenFLD D LQVHFWRV )LODWWL et al XWLOL]DQGR los genes Cry de Bacillus thuringiensis, que se HPSOHDQ SDUD FXOWLYRV DJUtFRODV ~WLOHV SDUD YDULDV SODJDV IRUHVWDOHV 6H KDQ LQWURGXFLGR HQ iODPRV SLQRV DEHWR QRJDO DOHUFH \ RWUDV HVSHFLHV IRUHVWDOHV /D UHVLVWHQFLD D KRQJRV IXH REWHQLGD HQ iODPRV TXH H[SUHVDQ JHQHV GH quitinasas como e Ac-AMP 1.2 y ESF 12 (Liang et al. 2002). La resistencia a herbicidas (glifo-
sato) se obtuvo en lamo, Picea y Pinus. En el caso de la resistencia o tolerancia a estrs abiotico, se han logrado transformar rboles tolerantes a salinidad (gen codA de la enzima colina oxidasa de Arthrobacter globiformis en Eucalyptus camaldulensis), tolerantes a suelos cidos y sequa (gen DREB1A de Arabidopsis thaliana en hbridos de Eucalyptus grandis x E. urophylla). /D PRGLFDFLyQ GH OD RUDFLyQ KD VLGR WDPELpQ EODQFR GH OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD $O FRQWUDULR GH ODV HVSHFLHV KHUEiFHDV \ DQXDOHV ORV rboles no han sido totalmente domesticados \ SRU FRQVLJXLHQWH WLHQHQ SDULHQWHV VLOYHVWUHV FRQ ORV TXH SXHGHQ VHU LQWHUIpUWLOHV DGHPiV VRQ HVSHFLHV ORQJHYDV SURGXFHQ FDQWLGDGHV FRSLRVDV GH SROHQ \ VHPLOODV TXH VH GLVHPLQDQ D PHQXGR SRU HO YLHQWR D GLVWDQFLDV FRQVLGHUDEOHV 3RU OR WDQWR SDUD OLEHUDU HQ IRUPD VHJXra rboles transgnicos, es necesario evitar el ULHVJR GH GLVSHUVLyQ GHO WUDQVJpQ HQ HO DPELHQWH 6H KD ORJUDGR OD HVWHULOLGDG UHSURGXFWLYD HQ forma gentica, utilizando el gen PTD, aislado de Populus tricocharpa, que genera ablacin FLWRWy[LFD GH HVWUXFWXUDV RUDOHV ~QLFDPHQWH 6KHSDUG (Q FXDQWR D OD XWLOL]DFLyQ GH SODQWDFLRQHV IRUHVWDOHV WRUUHPHGLDU VH KDQ HQVD\DGR GLIHUHQWHV HVWUDWHJLDV SDUD DXPHQWDU OD FDSDFLGDG de absorcin de las races. Se han transformado hbridos de Populus usando un gen de PDPtIHURV GHO FLWRFURPR 3, SDUD GHWR[LFDU WULFORURHWLOHQR 7&( \ RWURV FRPSXHVWRV KDORgenados, se han transformado callos embriognicos de Liriodendron tulipifera con un gen PRGLFDGR GH OD HQ]LPD EDFWHULDQD PHUF~ULFR reductasa (gen merA) (Che et al., 2003) y se KDQ PRGLFDGR KtEULGRV GH iODPR Populus alba x P. glandulosa VREUHH[SUHVDQGR XQ JHQ GH WRTXHODWLQDV SpSWLGRV TXH XQHQ PHWDOHV HQ KRQJRV \ SODQWDV SDUD OD HOLPLQDFLyQ GH cadmio. UEROHV WUDQVJpQLFRV HQ $PHULFD ODWLQD (Q DOJXQRV SDtVHV GH $PpULFD /DWLQD VH HVWiQ GHVDUUROODQGR SUR\HFWRV GH WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD GH iUEROHV SDUD VX FRPHUFLDOL]DFLyQ (Q &KLOH D WUDYpV GH XQ SUR\HFWR FRQMXQWR GHO VHFWRU SULYDGR HQ DFXHUGR FRQ OD 8QLYHUVLGDG VH HVWi WUDWDQGR GH REWHQHU SLQRV UHVLVWHQWHV
D OD PDULSRVD GHO EURWH ,QYHVWLJDGRUHV EUDVLOHxRV KDQ SDUWLFLSDGR HQ HO GHVDUUROOR GH iODPRV \ HXFDOLSWRV WUDQVJpQLFRV HQ FRQMXQWR FRQ )UDQFLD \ 86$ 3RU RWUR ODGR HQ HVH SDtV HPSUHVDV GHO VHFWRU SULYDGR GH OD LQGXVWULD GHO SDSHO HVWiQ GHVDUUROODQGR HXFDOLSWRV FRQ OD FDQWLGDG GH OLJQLQD PRGLFDGD (Q 0p[LFR VH HVWiQ ensayando nuevos genes involucrados en la PRGLFDFLyQ GH OD PDGHUD SDUD LQFUHPHQWDU el crecimiento en Pawlonia VS (Q $UJHQWLQD WDQWR HO ,17$ FRPR OD 81/3 KDQ LQLFLDGR SUR\HFWRV GH PRGLFDFLyQ JHQpWLFD GH FORQHV GH iODPRV SDUD PRGLFDU OD OLJQLQD SDUD WROHUDQcia a herbicidas y resistencia a insectos. Conclusiones /D PRGLFDFLyQ JHQpWLFD HQ HO VHFWRU IRUHVtal es mucho ms que una cuestin tcnica; se han de tener en cuenta los valores sociocultuUDOHV \ ORV P~OWLSOHV XVRV GH ORV ERVTXHV \ HV QHFHVDULD OD DFHSWDFLyQ GH OD RSLQLyQ S~EOLFD 6H QHFHVLWDQ SURWRFRORV DEOHV H[SHULPHQWDGRV \ FRQYHQLGRV SDUD HYDOXDU ORV ULHVJRV relacionados con los rboles forestales modiFDGRV JHQpWLFDPHQWH SHUR OD HYDOXDFLyQ GHO ULHVJR HQ FXOWLYRV GH WDQ ODUJD GXUDFLyQ SODQWHD DOJXQRV SUREOHPDV (Q FRQVHFXHQFLD HO GHVDUUROOR HQVD\R \ DSUREDFLyQ GH ORV iUEROHV IRUHVWDOHV PRGLFDGRV JHQpWLFDPHQWH SDUD XQD XWLOL]DFLyQ PiV JHQHUDOL]DGD SXHGH VXIULU XQ FRVWR HOHYDGR \ H[LJLU SOD]RV PX\ ODUJRV (Q FRQMXQWR OD PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD HQ HO VHFWRU IRUHVWDO VH UHDOL]D HQ DO PHQRV SDtVHV DXQTXH VHJ~Q OD )$2 HQ OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VH WUDWD GH H[SHULPHQWRV GH ODERUDWRULR FRQ WDQ VROR DOJXQDV SUXHEDV sobre el terreno y se limitan esencialmente a ODV HVSHFLHV Populus, Pinus, Liquidambar y Eucalyptus. El ltimo informe de China ante OD &RPLVLyQ ,QWHUQDFLRQDO GHO ODPR UHSRUWy HO HVWDEOHFLPLHQWR GH SODQWDFLRQHV GH iUEROHV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV KDELHQGR VLGR DXtorizada la comercializacin de Populus nigra y de 741 lneas hbridas transformadas con ORV JHQHV GH UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV (V LPSRUtante tener en cuenta que si se decide liberar FRPHUFLDOPHQWH iUEROHV IRUHVWDOHV PRGLFDGRV JHQpWLFDPHQWH HV FRQGLFLyQ HO HPSOHR GH PDWHULDOHV FRQ UHSURGXFFLyQ FRQWURODGD HVWpULOHV GH SURSDJDFLyQ YHJHWDWLYD R FRQ SURGXFFLyQ
UHGXFLGD GH SROHQ /D PDGHUD HV YLWDO SDUD OD HFRQRPtD PXQGLDO SHUR OD SUHVLyQ GHO GHVDrrollo humano y el crecimiento de la demanda estn contribuyendo a la degradacin de los ecosistemas forestales naturales, creando un dilema sobre el futuro de estos recursos. La PRGLFDFLyQ JHQpWLFD \ RWUDV ELRWHFQRORJtDV SXHGHQ WHQHU XQD IXQFLyQ GH LPSRUWDQFLD HQ ODV SODQWDFLRQHV IRUHVWDOHV Referencias
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1XFOHRWLGH 3RO\PRUSKLVPV DW &DQGLGDWH *HQHV IRU 'URXJKW6WUHVV 5HVSRQVH LQ Pinus taeda L. Genetics *RQ]DOH]0DUWQH] 6& :KHHOHU 1 & (UVR] ( Nelson C. D. and Neale D. B. 2007. Association Genetics in Pinus taeda /, :RRG 3URSHUW\ 7UDLWV. Genetics 0DUFKHOOL 3 DQG *DOOR /$ 0XOWLSOH LFHDJH refugia in a southern beech from southern South $PHULFD DV UHYHDOHG E\ FKORURSODVW '1$ PDUNHUV Conservation Genetics Marchelli P, Baier C, Mengel C, Ziegenhagen % *DOOR / %LRJHRJUDSKLF KLVWRU\ RI WKH WKUHDWHQHG VSHFLHV Araucaria araucana (Molina) . .RFK DQG LPSOLFDWLRQV IRU FRQVHUYDWLRQ D FDVH study with organelle DNA markers. Conservation Genetics, '2, V Marcucci Poltri S.N., Zelener N., Rodriguez Traverso - *HOLG 3 +RSS +( 6HOHFWLRQ RI D VHHG RUFKDUG RI (XFDO\SWXV GXQQLL EDVHG RQ JHQHWLF diversity criteria calculated using molecular markers. Tree Physiology Marcucci Poltri S.N., Acua C., Torales S., Zelener 1 3DWKDYHU 3 /ySH] * +DUUDQG / 0DUFy 0 +RSS ( (YDOXDFLyQ GH OD 9DULDELOLGDG *HQpWLFD ,',$ ;;, 5HYLVWD GH LQIRUPDFLyQ VREUH LQYHVWLJDFLyQ \ GHVDUUROOR DJURSHFXDULR $xR 9 1 SS 0LOOHURQ 0 *DOOR / 0DUFKHOOL 3 7KH HIIHFW RI YROFDQLVP RQ SRVWJODFLDO PLJUDWLRQ DQG VHHG GLVSHUVDO $ FDVH VWXG\ LQ VRXWKHUQ 6RXWK America. Tree Genetics and Genomes,4: Pastorino, M.J., Marchelli, P, Milleron, M, Soliani, C and Gallo, L.A. 2009. The effect of different JODFLDWLRQ SDWWHUQV RYHU WKH FXUUHQW JHQHWLF variation distribution of the southern beech Nothofagus antarctica (G.Forster) Oersted. Genetica Torales, S., Marcucci Poltri S.N., Harrand L., Marc 0 ,GHQWLFDFLyQ *HQpWLFD GH &ORQHV 8WLOL]DQGR 0LFURVDWpOLWHV ,',$ ;;, 5HYLVWD GH informacin sobre investigacin y desarrollo DJURSHFXDULR $xR 9 1 SS 7RUDOHV 63RPSRQLR ) 5RGUtJXH] 0 *DOOR / 9HUJD $ 0DUFKHOOL 3 3DVWRULQR 0 (ZHQV 0 Catalano S. y Marcucci Poltri S. 2009..Estudios SUHOLPLQDUHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD UHVSXHVWD D HVWUpV DELyWLFR HQ HVSHFLHV IRUHVWDOHV QDWLYDV 9,, 6LPSRVLR Nacional de Biotecnologa REDBIO-Argentina. /LEUR GH 5HV~PHQHV SDJ =HOHQHU 1 0DUFXFFL 3ROWUL 61 %DUWRORQL 1 /ySH] &5 $QG +RSS +( 6HOHFWLRQ VWUDWHJ\ IRU a seedling seed orchard design based on both, trait selection index and genomic analysis by
PROHFXODU PDUNHUV D FDVH VWXG\ IRU (XFDO\SWXV dunnii. Tree Physiology =LHJHQKDJHQ % $QG )ODGXQJ 0 '1$ 0DUNHUV IRU ,GHQWLFDWLRQ DQG (YDOXDWLRQ RI Genetic Resources in Forest Trees: Case Studies LQ $ELHV 3LFHD DQG 3RSXOXV ,Q 1DJDWD 7 /|U] + DQG :LGKROP - 0 HGV %LRWHFKQRORJ\ LQ $JULFXOWXUH DQG )RUHVWU\ /|U] + DQG :HQ]HO G. (eds) Molecular Marker Systems in Plant Breeding and Crop Improvement SS
V. CAPTULO 6 Tcnicas de Ingeniera Gentica para conferir resistencia a virus en plantas

0 GHO 9DV $- 'LVWpIDQR & 5RYHUH 9i]TXH] +( +RSS /DV HQIHUPHGDGHV GH ODV SODQWDV FDXVDQ OD SpUGLGD GH DSUR[LPDGDPHQWH HO GH OD SURGXFFLyQ DJUtFROD PXQGLDO (Q SDUWLFXODU ODV LQIHFFLRQHV YLUDOHV SURGXFHQ SHUMXLFLRV HFRQyPLFRV VLJQLFDWLYRV GH PDQHUD GLUHFWD D WUDYpV GH XQD GLVPLQXFLyQ GHO UHQGLPLHQWR SRU efecto de la enfermedad e indirecta, y a travs de un incremento en los costos debido a la utiOL]DFLyQ GH VHPLOOD OLEUH GH YLUXV SRU HMHPSOR HQ SODQWDV GH SURSDJDFLyQ FORQDO FRPR SDSD DMR \ EDWDWD 3RU RWUR ODGR OD H[SRUWDFLyQ GH FLHUWRV SURGXFWRV VH YH UHVWULQJLGD GHELGR D ODV OLPLWDFLRQHV LQWHUQDFLRQDOHV LPSXHVWDV D OD H[SRUWDFLyQ GH PDWHULDOHV IXHUD GH ODV WROHUDQFLDV WRVDQLWDULDV \ GH FDOLGDG SHUPLWLGDV Clsicamente las enfermedades virales en SODQWDV VH FRQWURODQ PHGLDQWH GLVWLQWDV HVWUDtegias como el mejoramiento gentico, el uso de semillas libres de virus, la rotacin de cultiYRV \ OD WpFQLFD GH SURWHFFLyQ FUX]DGD TXH VH describe brevemente ms adelante). 'HVGH FRQ ODV SULPHUDV REWHQFLRQHV GH SODQWDV GH WDEDFR \ SHWXQLD WUDQVJpQLFDV VH SXEOLFDURQ XQ JUDQ Q~PHUR GH WUDEDMRV GHtallando la transferencia de genes forneos a XQD FDQWLGDG FUHFLHQWH GH HVSHFLHV GH SODQWDV /D LQJHQLHUtD JHQpWLFD SHUPLWH LQFRUSRUDU HQ ODV SODQWDV QXHYRV FDUDFWHUHV GH LQWHUpV DJUtFROD HQ IRUPD KRUL]RQWDO HYLWDQGR DVt HO WUDVSDso de caracteres indeseables. De esta forma, la variedad transgnica adquiere un carcter QXHYR DO WLHPSR TXH PDQWLHQH LQWDFWRV HO IRQGR JHQpWLFR \ HO SRWHQFLDO SURGXFWLYR RULJLQDO OR TXH SHUPLWH HQFDUDU HO PHMRUDPLHQWR UiSLGR GH FXOWLYDUHV \D XWLOL]DGRV SRU HO DJULFXOWRU /RV WUDQVJHQHV LQWURGXFLGRV SXHGHQ SURYHQLU GH RWUDV YDULHGDGHV GH OD PLVPD HVSHFLH YHJHWDO GH SODQWDV GH RWUDV HVSHFLHV VH[XDOPHQWH LQFRPSDWLEOHV H LQFOXVR GH RUJDQLVPRV SHUWHnecientes a otros reinos incluyendo animales y microorganismos.
(Q VHQWLGR DPSOLR H[LVWHQ GRV IRUPDV GH PRGLFDU SODQWDV SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD GH manera de conferirles resistencia a virus: desHQFDGHQDU UHVLVWHQFLD PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH VHFXHQFLDV JHQyPLFDV GHULYDGDV GHO SURSLR YLUXV DO TXH VH GHVHD FRPEDWLU OODPDGD UHVLVWHQFLD GHULYDGD GHO SDWyJHQR R 3'5 R GHVHQFDGHQDU UHVLVWHQFLD PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV QRYLUDOHV TXH SRVHHQ DFWLYLGDG antiviral. Ambas estrategias se describirn a FRQWLQXDFLyQ 5HFLHQWHPHQWH VH KD SXEOLFDGR XQD LQWHUHVDQWH UHFRSLODFLyQ VREUH HO WHPD YHU 3ULQV HW DO HQ /HFWXUDV 5HFRPHQGDGDV Resistencia a virus conferida por secuencias virales /D SUHYHQFLyQ GHO GHVDUUROOR GH HQIHUPHGDGHV YLUDOHV XWLOL]DQGR JHQHV GHULYDGRV GHO SDWyJHQR IXH SURSXHVWD SRU SULPHUD YH] D FRPLHQ]RV GHO VLJOR ;; FXDQGR VH GHPRVWUy TXH ODV SODQWDV GH WDEDFR SRGtDQ VHU SURWHJLGDV IUHQWH D OD LQIHFFLyQ FRQ XQD FHSD VHYHUD GHO YLUXV GHO PRVDLFR GHO WDEDFR 709 Tobacco mosaic virus VL SUHYLDPHQWH VH ODV KDEtD LQRFXODGR FRQ XQD FHSD PHQRV YLUXOHQWD GHO PLVPR YLUXV (VWH WLSR GH HVWUDWHJLD FRP~QPHQWH GHQRPLQDGD SURWHFFLyQ FUX]DGD KD VLGR HPSOHDGD SDUD YDULRV FXOWLYRV GH LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD LQFOX\HQGR WRPDWH SDSD\D FtWULFRV HWF (Q GRV LQYHVWLJDGRUHV SURSXVLHURQ TXH OD H[SUHVLyQ GH FLHUWRV JHQHV GHO SDWyJHQR HQ XQ KRVSHGDQWH DOWHUDUtD HO EDODQFH QRUPDO GH ORV FRPSRQHQWHV YLUDOHV \ SUHGLMHURQ TXH HVWR FRQGXFLUtD DO LPSHGLPHQWR GH OD UHSOLFDFLyQ R GHO PRYLPLHQWR GHO YLUXV GHQWUR GH OD SODQWD PiV DOOi GH OD SULPHUD FpOXOD LQIHFWDGD Proteccin debida a la expresin de la protena de cpside viral (CP) /DV SULPHUDV SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD D YLUXV VH REWXYLHURQ HQ PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GHO JHQ TXH FRGLFD OD FiSVLGH GH 709 8WLOL]DQGR HVWD HVWUDWHJLD VH ORJUDURQ REWHQHU SODQWDV UHVLVWHQWHV D YLUXV SHUWHQHFLHQWHV D FDVL WRGRV ORV JpQHURV GH YLUXV GH SODQWDV SULQFLSDOPHQWH HQ WREDPR SRWH[ \ DOIDPRYLrus (Tabla 1). (Q JHQHUDO ODV SODQWDV SURWHJLGDV PXHVWUDQ XQ UHWDUGR WHPSRUDO GHO GHVDUUROOR GH VtQWRPDV una atenuacin en la sintomatologa caracte-
7DEOD (MHPSORV GH UHVLVWHQFLD D YLUXV PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD GH FiSVLGH &3 R QXFOHRFiSVLGH *HQ 1 YLUDO HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV
Gneros de virus transgn Tobamovirus Potexvirus Potyvirus CP CP CP
Virus TMV; ToMV; AIMV PVX; CyMV; WCIMV
Especies vegetales tabaco; tomate tabaco
Carlavirus Luteovirus Comovirus Nepovirus Tobravirus Ilavirus Geminivirus Tospovirus
CP CP CP CP CP CP CP Gen N
PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; maz MDMV; SMV; WMV II; ZYMV tabaco; papa PVS PLRV SLRSV ArMV TRV TSV TYLCV papa tabaco tabaco tabaco tabaco tomate
TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco
/RV DFUyQLPRV XWLOL]DGRV HQ RUGHQ DOIDEp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
rstica de cada virus, una menor cantidad de sitios de infeccin y un menor ttulo viral. Se demostr que hay una correlacin entre la reVLVWHQFLD \ HO QLYHO GH H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD GH OD FiSVLGH TXH OD SURWHFFLyQ DFW~D D QLYHO FHOXODU \ HV VXSHUDGD SRU DOWDV GRVLV GH LQyFXOR YLULRQHV (Q DOJXQRV FDVRV HV VXSHUDGD SRU LQRFXODFLyQ FRQ $51 YLUDO /D SURWHFFLyQ HV PiV HIHFWLYD SDUD HO YLUXV KRPyORJR DO TXH dio origen al transgn. Sin embargo, abarca WDPELpQ D YLUXV \ FHSDV UHODFLRQDGDV DXQTXH OD HFLHQFLD VH YD UHGXFLHQGR D PHGLGD TXH OD UHODFLyQ ORJHQpWLFD VH KDFH PiV OHMDQD \ GLVPLQX\H OD LGHQWLGDG HQWUH OD VHFXHQFLD H[SUHVDGD HQ OD SODQWD WUDQVJpQLFD \ OD VHFXHQFLD GHO YLUXV GHVDDQWH
/DV SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ HO JHQ GH FiSVLGH GHO YLUXV 709 UHVXOWDURQ UHVLVWHQWHV D OD LQRFXODFLyQ FRQ SDUWtFXODV YLUDOHV GH 709 SHUR OD UHVLVWHQFLD HUD VREUHSDVDGD si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se SRVWXOy HQWRQFHV TXH OD SURWHFFLyQ VH GHEtD D la inhibicin del desnudamiento viral en las cOXODV LQIHFWDGDV LQLFLDOPHQWH 9DULDV OtQHDV GH HYLGHQFLD DSR\DQ HVWD KLSyWHVLV 3RU HMHPSOR VL VH LQRFXODQ SURWRSODVWRV GHULYDGRV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ OD &3 GH 709 R SODQWDV QR WUDQVIRUPDGDV FRQ SVHXGRYLULRQHV GH 709 TXH FRQWLHQHQ $51P TXH FRGLFD SDUD OD SURWHtQD LQGLFDGRUD EHWDJOXFXURQLGDVD (GUS), se observa que hay una marcada disPLQXFLyQ GH OD DFWLYLGDG *86 HQ ORV SURWR-
SODVWRV GHULYDGRV GH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV SUREDEOHPHQWH GHELGD D OD IDOOD HQ HO GHVQXdamiento de los viriones. Ms adelante se dePRVWUy TXH ODV SURWHtQDV GH FiSVLGH PXWDJHnizadas de forma que carecen de la habilidad GH DXWRDJUHJDUVH QR VRQ FDSDFHV GH FRQIHULU SURWHFFLyQ IUHQWH D 709 \ TXH ODV SURWHtQDV PXWDGDV FDSDFHV GH LQWHUDFWXDU FRQ Vt PLVPDV FRQ DQLGDG PiV DOWD FRQIHUtDQ PD\RU SURWHFFLyQ TXH OD SURWHtQD GH FiSVLGH VDOYDMH (V GHcir se estableci una relacin directa entre el QLYHO GH DJUHJDFLyQ GH OD SURWHtQD GH FiSVLGH \ HO QLYHO GH SURWHFFLyQ IUHQWH D 709 3RVWHULRUmente se demostr que el estado de agregaFLyQ GH ODV SURWHtQDV GH FiSVLGH GH 709 HQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRUUHODFLRQD FRQ HO QLYHO de resistencia observado. Estos resultados suJLHUHQ TXH OD UHVLVWHQFLD SRU H[SUHVLyQ GH OD FiSVLGH YLUDO &3 HVWDUtD PHGLDGD SRU GHWHUPLQDGDV FRQJXUDFLRQHV GH OD HVWUXFWXUD FXDWHUQDULD GH OD FiSVLGH PDV TXH SRU OD H[SUHVLyQ GH OD VXEXQLGDG GH FiSVLGH HQ OD WUDQVJpQLFD per se. 6H SURSXVR TXH HO JUDGR GH UHJXODFLyQ GH OD UHSOLFDFLyQ YLUDO SRU ODV DJUHJDGRV GH OD FiSVLGH HQ OD SODQWD WUDQVJpQLFD GHWHUPLQD HO JUDGR GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU OD &3 6L ELHQ HVWRV WUDEDMRV DSR\DQ OD KLSyWHVLV GH TXH HQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV SDUD &3 KD\ XQD LQKLELFLyQ HQ XQD HWDSD WHPSUDQD GH OD LQIHFFLyQ QR VH SXHGH GHVFDUWDU TXH DGHPiV OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQD GH FiSVLGH LPSLGD R PRGLTXH HWDSDV PiV WDUGtDV GH OD LQIHFFLyQ 6L VH LQMHUWD XQD SRUFLyQ GH SODQWD WUDQVJpQLFD TXH PXHVWUD SURWHFFLyQ PHGLDGD SRU FiSVLGH HQWUH XQD EDVH \ XQ iSLFH QR WUDQVJpQLFRV \ VH LQRFXOD OD SODQWD LQMHUWDGD HQ OD EDVH QR WUDQVJpQLFD VH REVHUYD TXH HO YLUXV QR SXHGH PRYHUVH KDFLD HO iSLFH HV GHFLU TXH QR SXHGH DWUDYHVDU OD ]RQD WUDQVJpQLFD SURWHJLGD 6LQ HPEDUJR OD VXSUHVLyQ GHO PRYLPLHQWR YDVFXODU LQYROXFUD WDPELpQ HO HPSDTXHWDPLHQWR \ GHVQXGDPLHQWR YLUDO \ FDEH OD SRVLELOLGDG GH TXH OD VXSUHVLyQ del movimiento vascular sea una consecuencia secundaria de la inhibicin del desnudamienWR YLUDO HQ ODV SODQWDV H[SUHVDQGR SURWHtQD GH FiSVLGH 2WUR FDVR PX\ HVWXGLDGR HV HO GHO YLUXV 39; GH OD SDSD /DV SODQWDV WUDQVJpQLFDV SDUD OD FiSVLGH GH 39; UHVXOWDQ SURWHJLGDV DQWH OD LQRFXODFLyQ FRQ YLUXV R FRQ $51 YLUDO 6H SRV-
WXOD TXH OD SURWHtQD GH FiSVLGH VH XQH DO RULJHQ GH HQVDPEODGR ORFDOL]DGR HQ HO H[WUHPR GHO $51 YLUDO VXSULPLHQGR GH HVWD PDQHUD OD WUDGXFFLyQ GH OD UHSOLFDVD YLUDO FX\R JHQ HVWi localizado en el mismo extremo). Tambin es SRVLEOH TXH LQKLED HO PRYLPLHQWR GH 39; GH FpOXOD D FpOXOD \D TXH OD SURWHtQD GH FiSVLGH es un cofactor esencial de la traslocacin sistmica. &RPR VH GHVSUHQGH GH ORV GRV HMHPSORV GHVFULSWRV HO PHFDQLVPR GH SURWHFFLyQ PHGLDGR SRU OD SURWHtQD GH FiSVLGH QR HV ~QLFR \ HV SDUWLFXODU SDUD FDGD VLVWHPD YLUXVSODQWD Adems de obtenerse resistencia a virus PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV GH FiSVLde (CP) virales, se logr obtener resistencia a YLUXV PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH RWUDV SURWHtQDV YLUDOHV WDOHV FRPR OD UHSOLFDVD YLUDO 5(3 R GH OD SURWHtQD GH PRvimiento viral (MP).Ambas estrategias se describen a continuacin. Proteccin debida a la expresin de la replicasa viral (REP) o de la protena de movimiento viral (MP) /D UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU OD UHSOLFDVD YLUDO HV OD VHJXQGD DSOLFDFLyQ PiV DYDQ]DGD HQ HO XVR GH JHQHV GHULYDGRV GHO SDWyJHQR SDUD OD REWHQFLyQ GH SODQWDV UHVLVWHQWHV D YLUXV (VWD UHVLVWHQFLD IXH SULPHUR GHPRVWUDGD HQ SODQWDV GH WDEDFR TXH H[SUHVDEDQ HO JHQ GH OD UHSOLFDVD GH 709 JpQHUR WREDPRYLUXV \ OXHJR REVHUYDGD SDUD GLIHUHQWHV IDPLOLDV GH YLUXV TXH LQFOX\HQ ORV WREUDYLUXV SRWH[ SRW\ DOIDPR cucumo- y luteovirus entre otros. Los genes de UHSOLFDVD YLUDO FRQHUHQ UHVLVWHQFLD WDQWR D LQIHFFLRQHV SURGXFLGDV SRU HO $51 YLUDO R SRU HO virin y se ha demostrado que dan lugar a una resistencia muy efectiva y estable. Entre los HMHPSORV GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU UHSOLFDVD YLUDO VH HQFXHQWUD HO XVR GH JHQHV TXH SRVHHQ GHOHFLRQHV PRGLFDFLRQHV GH VHFXHQFLD JHQHV WUXQFDGRV \ JHQHV FRPSOHWRV VLQ PRGLFDU ([LVWHQ HMHPSORV HQ ORV FXDOHV OD H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD GH UHSOLFDVD HV IXQGDPHQWDO HQ HO IHQRWLSR UHVLVWHQWH \ HMHPSORV HQ ORV FXDOHV OD UHVLVWHQFLD SRGUtD VHU PHGLDGD SRU HO $51 GH OD UHSOLFDVD YLUDO SRU OR TXH VH KD VXJHULGR TXH no hay un nico mecanismo involucrado en OD UHVLVWHQFLD LQGXFLGD SRU UHSOLFDVD /RV PH-
FDQLVPRV GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 VH GHVFULEHQ PiV DGHODQWH HQ pVWH FDStWXOR 3RU ~OWLPR OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV GH PRYLPLHQWR GLVIXQFLRQDOHV R PXWDQWHV IXH UHSRUWDGD FRPR FDSD] GH FRQIHULU XQD UHVLVWHQFLD PiV DPSOLD FRPSDUDGD FRQ OD UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU &3 R 5(3 3RU HO FRQWUDULR OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV 03 VLQ PRGLFDU SRU OR JHQHUDO DXPHQWDQ OD LQIHFFLyQ YLUDO (O PHFDQLVPR SRVWXODGR HQ HVWH FDVR LPSOLFD OD H[LVWHQFLD GH GRPLQLRV IXQFLRQDOHV FRPSDUWLGRV SRU 03V GH GLIHUHQWHV YLUXV (VWRV GRPLQLRV SRGUtDQ FRPSHWLU SRU IDFWRUHV FHOXODUHV FRPXQHV UHTXHULGRV SDUD HO PRYLPLHQWR \ HQ FRQVHFXHQFLD LPSHGLU HO SURJUHVR GH OD LQIHFFLyQ GH HVWRV YLUXV Mecanismo de proteccin debida al desencadenamiento de resistencia mediada por ARN (Q VH GHPRVWUy SRU SULPHUD YH] TXH VH SRGtD REWHQHU UHVLVWHQFLD D YLUXV PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH XQ $51P GH FiSVLGH YLUDO QR WUDGXFLEOH HV GHFLU QR HUD QHFHVDULD OD H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD FRGLFDGD SRU HO WUDQVJpQ $ SDUWLU GH HQWRQFHV VH SXEOLFDURQ QXPHURVRV WUDEDMRV SURIXQGL]DQGR OD FDUDFWHUL]DFLyQ GH HVWH WLSR GH UHVLVWHQFLD D YLUXV OODPDGD HQ VHQWLGR DPSOLR UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 /DV SODQWDV TXH PXHVWUDQ HVWH WLSR GH UHVLVWHQFLD SUHVHQWDQ XQ IHQRWLSR GH LQPXQLGDG TXH VH FDUDFWHUL]D SRUTXH QR KD\ UHSOLFDFLyQ YLUDO GHtectable, no hay diseminacin viral dentro de la SODQWD \ QR KD\ VtQWRPDV GHELGRV D OD HQIHUPHGDG R XQ IHQRWLSR GH UHFXSHUDFLyQ TXH VH FDUDFWHUL]D pVWH ~OWLPR SRU XQD LQIHFFLyQ LQLFLDO FRQ SURGXFFLyQ GH VtQWRPDV VHJXLGD SRU XQ FUHFLPLHQWR SRVWHULRU UHVLVWHQWH D OD LQIHFFLyQ \ asintomtico. En cualquiera de los dos casos, \ D GLIHUHQFLD GH OR TXH RFXUUH HQ OD SURWHFFLyQ PHGLDGD SRU OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV GH FiSVLGHV YLUDOHV ODV SODQWDV VRQ VRODPHQWH UHVLVWHQWHV D OD LQIHFFLyQ SURGXFLGD SRU YLUXV HVtrechamente relacionados con el virus que dio RULJHQ DO WUDQVJpQ (O DQiOLVLV GH HVWDV SODQtas a nivel molecular demostr que en general FRQWLHQHQ FRSLDV P~OWLSOHV GHO WUDQVJpQ \ TXH VL ELHQ SUHVHQWDQ XQ DOWR QLYHO GH WUDQVFULSFLyQ en el ncleo, los niveles estables del ARNm GHO WUDQVJpQ HQ HO FLWRSODVPD VRQ PX\ EDMRV Usualmente se observa adems metilacin de OD UHJLyQ FRGLFDQWH GHO WUDQVJpQ
(Q HO DxR VH FRUUHODFLRQy SRU SULPHUD YH] OD UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 FRQ HO IHQyPHQR GH FRVXSUHVLyQ \ VH SURSXVR TXH HO $51 YLUDO R HO HQGyJHQR HQ OD FRVXSUHVLyQ HUD GHJUDGDGR HQ IRUPD LQGXFLEOH \ HVSHFtFD SRU XQ PHFDQLVPR GHVHQFDGHQDGR SRU OD H[SUHVLyQ GHO $51 GHO WUDQVJpQ (VWH SURFHVR TXH VH OODPy VLOHQFLDPLHQWR SRVW WUDQVFULSFLRQDO GH JHQHV 37*6 VH GHVFULELy SRU SULPHUD YH] HQ SODQWDV SHUR VH KD HQFRQWUDGR WDPELpQ HQ KRQJRV GRQGH VH GHQRPLQD quelling) y animales como nematodos, moscas o mamferos (donde se denomina interferencia mediaGD SRU $51 %UHYHPHQWH HO 37*6 SXHGH VHU GHVHQFDGHQDGR HFLHQWHPHQWH SRU WUDQVJHQHV QXFOHDUHV TXH GDQ OXJDU D WUDQVFULSWRV FRQ HVtructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o TXH H[SUHVDQ DOWRV QLYHOHV R QLYHOHV DEHUUDQWHV GH WUDQVFULSWRV (Q SODQWDV WDPELpQ SXHGH VHU GHVHQFDGHQDGR SRU OD UHSOLFDFLyQ GH YLUXV TXH JHQHUDOPHQWH SURGXFH LQWHUPHGLDULRV UHSOLFDWLYRV GH $51GF SRU OR TXH VH FRQFOX\y TXH HVWD HVWUDWHJLD GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 SURgrama un mecanismo de resistencia antiviral SUHH[LVWHQWH 8QD YH] GHVHQFDGHQDGR HO SURceso, los intermediarios que contienen ARNdc VRQ UHFRQRFLGRV SRU XQD QXFOHDVD HVSHFtFD GH $51GF TXH ORV SURFHVD HQ IUDJPHQWRV GH $51V SHTXHxRV OODPDGRV SHTXHxRV LQWHUIHUHQWHV VPDOO LQWHUIHULQJ VL$51 GH DPEDV SRODULGDGHV \ GH \ QW GH ORQJLWXG $ VX YH] VH SRVWXOD TXH ORV VL$51 DFW~DQ FRPR JXtDV SDUD GLULJLU OD PDTXLQDULD GH GHJUDGDFLyQ de ARN contra todo aqul ARN con homologa D OD VHFXHQFLD GHVHQFDGHQDQWH 8Q DVSHFWR a destacar es que el silenciamiento mediado SRU $51 HV GHVHQFDGHQDGR ORFDOPHQWH \ OXHJR WUDQVPLWLGR D WRGD OD SODQWD YtD XQD VHxDO de silenciamiento mvil. Si bien se desconoce SRU HO PRPHQWR OD QDWXUDOH]D GH OD VHxDO VH SRVWXOD TXH pVWD FRQWLHQH XQ FRPSRQHQWH GH iFLGR QXFOHLFR TXH H[SOLFDUtD OD HVSHFLFLGDG de secuencia del mecanismo de degradacin y XQ FRPSRQHQWH SURWHLFR Utilizando los conocimientos que se fueron DFXPXODQGR VREUH HO PHFDQLVPR GH OD SURWHFFLyQ PHGLDGD SRU $51 VH KDQ GLVHxDGR \ XWLlizado construcciones genticas que contienen VHFXHQFLDV UHSHWLGDV LQYHUWLGDV ,5 GH WUDQVJHQHV YLUDOHV /D WUDQVFULSFLyQ GD OXJDU D ODU-
JRV $51GF TXH VRQ PX\ HFLHQWHV SUHFXUVRres de siARNs. De esta manera se ha logrado DXPHQWDU HO SRUFHQWDMH GH SODQWDV VLOHQFLDGDV \ SRU OR WDQWR OD HIHFWLYLGDG GH OD HVWUDWHJLD GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 0LHQWUDV TXH las estrategias clsicas que utilizan construcFLRQHV FRQ WUDQVJHQHV VLPSOHV HQ RULHQWDFLyQ VHQWLGR R DQWLVHQWLGR GDQ OXJDU D XQ DO GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV UHVLVWHQWHV XWLOL]DQGR construcciones de transgenes IR se obtienen PiV GHO GH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV UHVLVWHQWHV 8WLOL]DQGR ,5V IXH SRVLEOH GHVHQFDGHQDU UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU $51 HQ GLIHUHQWHV IDPLOLDV GH YLUXV 6H KD GHPRVWUDGR SUHYLDmente que este mecanismo de resistencia no HV HIHFWLYR DQWH YLUXV FX\D VHFXHQFLD GLHUD HQ PiV GH XQ UHVSHFWR GH OD VHFXHQFLD GHO transgn. Con el objetivo de obtener una resisWHQFLD PiV DPSOLD VH IXVLRQDURQ IUDJPHQWRV GH SE GH VHFXHQFLDV YLUDOHV SHUWHQHFLHQWHV D FXDWUR WRVSRYLUXV HQ XQD VLPSOH FRQVWUXFcin IR quimrica obteniendo con esta estrateJLD XQD DOWD IUHFXHQFLD GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD P~OWLSOH Dado que el PTGS es un mecanismo de GHIHQVD DQWLYLUDO HQ SODQWDV UHVXOWD HVSHUDble que se haya seleccionado en los virus de SODQWDV OD FDSDFLGDG GH FRQWUDUUHVWDU D HVWH PHFDQLVPR &RQJUXHQWHPHQWH FRQ HVWD HVSHFXODFLyQ VH HQFRQWUy TXH YDULRV YLUXV GH SODQWDV FRGLFDQ SURWHtQDV VXSUHVRUDV GHO 37*6 /XHJR GH XQD E~VTXHGD H[KDXVWLYD GH VXSUHsores de silenciamiento en una gran cantidad GH YLUXV GH SODQWDV VH FRQFOX\y TXH SUiFWLFDPHQWH WRGRV ORV YLUXV OOHYDQ VXSUHVRUHV GH VLOHQFLDPLHQWR TXH ORV JHQHV TXH ORV FRGLFDQ tienen secuencias y origen evolutivo diverso, y TXH ORV GLVWLQWRV VXSUHVRUHV DFW~DQ LQKLELHQGR el silenciamiento a distintos niveles. Algunos FRPR OD SURWHtQD +&3UR FRGLFDGD SRU ORV SRW\YLUXV SUHYLHQHQ OD DFXPXODFLyQ GH ORV VL$51 SHUR QR HOLPLQDQ OD VHxDO PyYLO TXH SURSDJD HO VLOHQFLDPLHQWR 2WURV VXSUHVRUHV FRPR OD SURWHtQD S GHO YLUXV 39; LQWHUHUHQ FRQ OD VHxDO GH SURSDJDFLyQ VLVWpPLFD \ QDOPHQWH RWURV FRPR HO FRGLFDGR SRU HO YLUXV GHO DFKDSDUUDPLHQWR GHO WRPDWH 7%69 VXSULPHQ HO VLlenciamiento slo en las nervaduras. Incluso se KDQ HQFRQWUDGR HQ YLUXV DQLPDOHV VXSUHVRUHV GH VLOHQFLDPLHQWR TXH VRQ IXQFLRQDOHV HQ SODQ-
tas. Es interesante destacar que varios de los VXSUHVRUHV GH VLOHQFLDPLHQWR YLUDOHV GHVFULSWRV KDEtDQ VLGR SUHYLDPHQWH FDUDFWHUL]DGRV FRPR SURWHtQDV UHVSRQVDEOHV GH OD VLQWRPDWRloga, del movimiento viral y/o del fenmeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o ms virus. /D SRVLELOLGDG GH OD VXSUHVLyQ GHO VLOHQFLDPLHQWR SRU SDUWH GH XQ YLUXV TXH FRH[LVWD FRQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV SURWHJLGDV SRU HO PHcanismo de silenciamiento gnico debe ser tomada en cuenta ya que la infeccin de una SODQWD VLOHQFLDGD FRQ XQ YLUXV KHWHUyORJR TXH OOHYD XQ VXSUHVRU GH VLOHQFLDPLHQWR SXHGH GDU lugar a la reversin del silenciamiento tornnGROD VXVFHSWLEOH D OD LQIHFFLyQ YLUDO 5HVXOWD LPSRUWDQWH HQWRQFHV HVWXGLDU TXp YLUXV FRLQIHFWDQ XQ PLVPR KRVSHGDGRU HQ FRQGLFLRQHV QDWXUDOHV \ HQ OR SRVLEOH XWLOL]DU SODQWDV WUDQVJpQLFDV con resistencia a ambos virus. En forma anORJD D OD HVWUDWHJLD GHVFULSWD DQWHULRUPHQWH HV SRVLEOH GLVHxDU FRQVWUXFFLRQHV LQFRUSRUDQGR GLVWLQWDV VHFXHQFLDV YLUDOHV SHTXHxDV \ FRQVHUYDGDV FRUUHVSRQGLHQWHV D ORV GLVWLQWRV YLUXV contra los que se quiere obtener resistencia. Recientemente, ha surgido una variante alWHUQDWLYD SDUD OD REWHQFLyQ GH UHVLVWHQFLD D YLUXV PHGLDGD SRU $51 HO XVR GH PLFUR$51V (miARNs). Los miARNs son ARNs endgenos SHTXHxRV TXH UHJXODQ OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HQ SODQWDV \ DQLPDOHV (Q SODQWDV HVWRV PL$51V GH QXFOpRWLGRV VH SURFHVDQ D SDUWLU GH UHJLRQHV GH stem loops GH WUDQVFULSWRV SULPDULRV ODUJRV TXH OXHJR VH DFRSODQ D FRPSOHMRV GH VLOHQFLDPLHQWR GRQGH HQ JHQHUDO GLULJHQ OD GHJUDGDFLyQ HVSHFtFD GH $51V PHQVDMHURV FRPSOHPHQWDULRV D XQD GH ODV FDGHQDV GHO PL$51 6H KD GHPRVWUDGR TXH VH SXHGHQ realizar cambios en la secuencia de 21 nt del miARN sin alterar la biognesis o la maduraFLyQ GHO SUHPL$51 (VWR FRQGXMR D OD LGHD GH redisear miARNs de manera que tengan como EODQFR JHQHV LPSUHVFLQGLEOHV SDUD OD UHSOLFDcin del virus que se desea controlar. De esta PDQHUD VH KDQ REWHQLGR SODQWDV WUDQVJpQLFDV UHVLVWHQWHV D YLUXV SRU H[SUHVLyQ GH PL$51V DUWLFLDOHV DPL$51V HQ SODQWDV 8Q JUXSR GH LQYHVWLJDGRUHV PRGLFy XQ PL$51 GH $UDELGRSVLV HO PL5 GH PDQHUD GH GLULJLUOR KDFLD ORV VXSUHVRUHV GH VLOHQFLDPLHQWR YLUDOHV 3
del Turnip yellow mosaic virus y HC-Pro del Turnip mosaic virus \ GHPRVWUDURQ TXH SODQWDV GH $UDELGRSVLV TXH H[SUHVDQ HVWRV DPL$51V VRQ UHVSHFWLYDPHQWH UHVLVWHQWHV D HVWRV YLUXV 'H PDQHUD VLPLODU RWUR JUXSR GH WUDEDMR dise un amiARN basado en el miR171 de taEDFR GLULJLGR DO VXSUHVRU GH VLOHQFLDPLHQWR E GHO &09 \ REVHUYy XQD FRUUHODFLyQ HQWUH ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ GHO PL$51 DUWLFLDO \ HO nivel de resistencia al virus obtenido. AsimisPR ORV DXWRUHV FRPSDUDURQ HVWD HVWUDWHJLD FRQ OD HVWUDWHJLD FOiVLFD GH H[SUHVLyQ GH XQ KDLUSLQ GH GF$51 GLULJLGD D HVWD PLVPD VHFXHQcia y demostraron que la estrategia basada en HO PL$51 DUWLFLDO IXH PiV HIHFWLYD WDQWR HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRPR HQ HQVD\RV GH H[SUHVLyQ WUDQVLHQWH /DV YHQWDMDV GH XVDU DPL$51V FRQ UHVSHFWR a usar las construcciones de dcARN que desencadenen silenciamiento son 1) el mecanismo GH UHVLVWHQFLD PHGLDGR SRU PL51$ HQ JHQHUDO QR HV VHQVLEOH D OD WHPSHUDWXUD KD\ H[FHSFLRnes). Se ha demostrado en cambio, que el siOHQFLDPLHQWR PHGLDGR SRU GF$51 HV LQKLELGR D WHPSHUDWXUDV PHQRUHV D & HQ Nicotiana benthamiana. 2) en el caso de los amiARNs ODV VHFXHQFLDV YLUDOHV TXH VH H[SUHVDQ HQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV VRQ GH PHQRU WDPDxR TXH en las estrategias clsicas de silenciamiento. Esto es relevante dado que en las estrategias GH UHVLVWHQFLD PHGLDGD SRU GF$51 VH JHQHUD XQD SREODFLyQ GH VL$51V FRQ XQD JUDQ FDQWLGDG GH EODQFRV SRWHQFLDOHV HQGyJHQRV (Q cambio, en el caso de los amiRNAs los blancos SRWHQFLDOHV VRQ PHQRUHV \ SXHGHQ VHU HOHJLdos a priori FRQ SUHFLVLyQ 6LQ HPEDUJR HVWD ~OWLPD FDUDFWHUtVWLFD SXHGH DO PLVPR WLHPSR VHU XQD GHVYHQWDMD \D TXH VH HVSHUDUtD XQD durabilidad menor ya que un cambio en unos SRFRV QXFOHyWLGRV GHO YLUXV GHVDDQWH SRGUtD VREUHSDVDU OD UHVLVWHQFLD GHVHQFDGHQDGD SRU un amiARN. 8Q DVSHFWR LQWHUHVDQWH D UHFDOFDU HV TXH debido a que el mecanismo de silenciamiento LPSOLFD XQD PX\ EDMD DFXPXODFLyQ GHO $51 GHrivado del transgn y una nula acumulacin de SURWHtQDV HVWH WLSR GH HVWUDWHJLD UHVXOWD DWUDFWLYD GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GH OD HYDOXDFLyQ GH riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos 2*0V HQ FRQWUDSRVLFLyQ GH OD VREUHH[SUH-
VLyQ GH JHQHV TXH LQWHUHUDQ FRQ HO FLFOR GH PXOWLSOLFDFLyQ YLUDO FRPR HV HO FDVR GH OD FiSVLGH X RWUDV SURWHtQDV YLUDOHV (VWR VH GHEH D que la baja acumulacin de ARN transgnico PLQLPL]D ODV SRVLELOLGDGHV GH XQD SRWHQFLDO recombinacin homloga con ARN de origen viral infectante. Por otro lado, la ausencia de OD SURWHtQD FRGLFDGD SRU HO WUDQVJpQ PLQLPL]D drsticamente el anlisis de riesgo alimentario GHO 2*0 \ HYLWD HO ULHVJR GH WUDQVFDSVLGDFLyQ de otros virus en el caso en que el transgn FRGLTXH SDUD OD SURWHtQD GH FiSVLGH YLUDO IXQcional. Resistencia a virus conferida por genes no virales $GHPiV GH OD UHVLVWHQFLD GHULYDGD GHO SDWyJHQR 3'5 HQ ORV ~OWLPRV DxRV VH KDQ H[SORUDGR HVWUDWHJLDV DOWHUQDWLYDV SDUD OR REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD D HQIHUPHGDGHV YLUDOHV (QWUH HOODV ODV PiV SURPLVRULDV VRQ OD H[SUHVLyQ GH DQWLFXHUSRV DQWLYLUDOHV HQ SODQWDV R SODQWLERGLHV \ OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV TXH LQWHUHUHQ FRQ OD WUDQVPLVLyQ GHO YLUXV SRU LQVHFWRV YHFWRUHV $PEDV HVWUDWHJLDV VH GLVFXWLUiQ SRU VHSDUDGR PiV DGHODQWH 2WUDV DOWHUQDWLYDV LQYROXFUDQ OD H[SUHVLyQ GH JHQHV GH UHVLVWHQFLD FRQWUD YLUXV HQ HVSHFLHV diferentes de las cuales fueron aislados origiQDOPHQWH 3RU HMHPSOR OD LQFRUSRUDFLyQ GHO JHQ 1 GH WDEDFR HQ SODQWDV GH WRPDWH FRQHUH resistencia al Tabacco mosaic virus 709 \ OD LQFRUSRUDFLyQ GHO JHQ Sw5 GH WRPDWH HQ SODQWDV GH WDEDFR FRQHUH UHVLVWHQFLD D WRVSRYLUXV 2WUR HQIRTXH SURPLVRULR HV JHQHUDU UHVLVWHQcia mediante el silenciamiento de genes de la SODQWD HVHQFLDOHV SDUD HO FLFOR GH YLGD YLUDO (Q XQD UHFLHQWH SXEOLFDFLyQ HO VLOHQFLDPLHQWR SRU $51 LQWHUIHUHQWH GH ORV JHQHV NtTOM1 y NtTOM3 HVHQFLDOHV SDUD OD PXOWLSOLFDFLyQ GH los tobamovirus) en Nicotiana tabaccum dio FRPR UHVXOWDGR OD LQKLELFLyQ GH OD PXOWLSOLFDFLyQ del Tomato mosaic virus y otros tobamovirus, SHUR QR DIHFWy HO FUHFLPLHQWR GH ODV SODQWDV Otras estrategias incluyen el uso de la enzima ROLJRDGHQLODVD VLQWHWDVD GH PDPtIHURV HQ SODQWDV \ GH LQKLELGRUHV QDWXUDOHV \ HVSHFtFRV GH OD UHSOLFDFLyQ YLUDO FRPR OD H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD LQDFWLYDGRUD GH ULERVRPDV 3$3 de Phytolacca americana pokeweed en in-
JOpV /D H[SUHVLyQ GH 3$3 HQ SODQWDV GH SDSD \ WDEDFR WUDQVJpQLFDV ODV SURWHJH IUHQWH D XQD variedad de virus, ya sea que stos fueran inoFXODGRV PHFiQLFDPHQWH R SRU iGRV YHFWRUHV En los ltimos aos se encontraron o redisexDURQ YDULRV WLSRV PHQRV Wy[LFRV \ IRUPDV QR Wy[LFDV GH HVWDV SURWHtQDV ODV TXH H[SUHVDGDV HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQHUHQ UHVLVWHQFLD D YLUXV VLQ SURGXFLU HO HIHFWR GH OD LQDFWLYDFLyQ de los ribosomas. Por otro lado, se estudi la DFWLYLGDG DQWLYLUDO GH OD SURWHtQD ,5,3 SURWHtQD RIP obtenida de bulbos de iris), una ARN-N-gliFRVLGDVD HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WDEDFR REVHUYiQGRVH XQD UHGXFFLyQ VLJQLFDWLYD GH ODV OHVLRQHV SURGXFLGDV SRU HO YLUXV 709 FRQ UHVSHFWR D ODV SODQWDV FRQWURO Expresin de anticuerpos en plantas transgnicas $ SHVDU GH TXH ODV SODQWDV QR VLQWHWL]DQ DQWLFXHUSRV OD H[SUHVLyQ GH DQWLFXHUSRV HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV HV XQD HVWUDWHJLD SURPHWHGRUD SDUD REWHQHU UHVLVWHQFLD D YLUXV /D FRQVHUYDFLyQ GH OD HVWUXFWXUD \ DQLGDG GH ORV PLVPRV KDFLD XQD GHWHUPLQDGD SURWHtQD YLUDO VHUtD VXFLHQWH SDUD LQWHUUXPSLU IXQFLRQHV HVHQFLDOHV H LPSHGLU HQ FRQVHFXHQFLD OD UHSOLFDFLyQ YLUDO Para que la estrategia sea efectiva es indisSHQVDEOH ORJUDU DOWRV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ GH ORV DQWLFXHUSRV HQ HO FRPSDUWLPLHQWR FHOXODU GRQGH RFXUUH OD UHSOLFDFLyQ YLUDO (Q ORV ~OWLPRV DxRV VH KDQ GHVDUUROODGR SURWRFRORV VHQFLOORV SDUD OD VHOHFFLyQ GH EXHQRV DQWLFXHUSRV TXH LQFOX\HQ OD VHOHFFLyQ GH DQWLFXHUSRV PRQRFORnales usando las tecnologas de hibridoma y genotecas utilizando la tcnica de exhibicin GH HSLWRSHV HQ EDFWHULyIDJRV R phage display. En este sentido la obtencin de bibliotecas de DQWLFXHUSRV GH FDGHQD ~QLFD VF)Y VLQWpWLFRV KDQ LPSXOVDGR OD DSOLFDFLyQ GH HVWD HVWUDWHJLD (Q VH GHPRVWUy SRU SULPHUD YH] TXH OD H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH XQ DQWLFXHUSR GH FDGHQD ~QLFD VF)Y GLULJLGR FRQWUD OD SURWHtQD GH FiSVLGH GHO Artichoke mottled crinkle virus FDXVDED XQD UHGXFFLyQ HQ OD VXVFHSWLELOLGDG DO YLUXV TXH VH SRQtD GH PDQLHVWR SRU XQD EDMD en la incidencia de la infeccin y un retraso en OD DSDULFLyQ GH ORV VtQWRPDV (Q VH H[SUHVy XQ DQWLFXHUSR PRQRFORQDO GH FDGHQD ~QLFD VF)Y FRQWUD OD SURWHtQD GH FiSVLGH GHO Beet
necrotic yellow vein virus en Nicotiana benthamiana \ HQ HO VH PRVWUy TXH OD H[SUHVLyQ GH OD FDGHQD )Y FRQWUD OD SURWHtQD GH FiSVLGH GHO YLUXV 709 HQ OD PHPEUDQD SODVPiWLFD GH SODQWDV GH WDEDFR WUDQVJpQLFDV FRQIHUtD UHVLVtencia al virus. Otra variante de la misma estrategia consisWH HQ HO XVR GH VF)YV GLULJLGRV FRQWUD SURWHtQDV TXH QR IRUPDQ SDUWH GH OD FiSVLGH YLUDO \ MXHJDQ XQ URO LPSRUWDQWH HQ OD UHSOLFDFLyQ FRPR OD UHSOLFDVD YLUDO 8VDQGR VF)YV REWHQLGRV FRQWUD OD 51$ SROLPHUDVD GHSHQGLHQWH GH $51 5G5S GHO Tomato bushy stunt virus 7%69 VH REWXYLHURQ SODQWDV GH N. benthamiana con altos niveles de resistencia no solo contra el 7%69 VLQR WDPELpQ FRQWUD RWURV PLHPEURV GH la familia Tombusviridae como el Red clover necrotic mosaic virus, el Cucumber necrotic virus y el Turnip crincle virus. Recientemente VH GHPRVWUy TXH DOWRV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ HQ SODQWDV GH SDSD GH XQ VF)Y GLULJLGR FRQWUD OD SURWHDVD 1,D GH 39< GDED SURWHFFLyQ FRPSOHWD FRQWUD 39< 3RU OR WDQWR OD H[SUHVLyQ GH DQWLFXHUSRV GLULJLGRV FRQWUD SURWHtQDV YLUDOHV HVHQFLDOHV KD demostrado ser una alternativa interesante SDUD REWHQHU UHVLVWHQFLD D YLUXV ([SUHVLyQ GH SURWHtQDV TXH LQWHUHUHQ con la transmisin viral por parte de insectos vectores en plantas transgnicas La toxina BT de Bacillus thuringiensis ha VLGR PX\ HIHFWLYD SDUD HO FRQWURO GH LQVHFWRV FROHySWHURV \ OHSLGySWHURV SHUR KDVWD HO PRPHQWR QR KD VLGR HIHFWLYD SDUD FRQWURODU D ORV LQVHFWRV TXH VH DOLPHQWDQ GHO RHPD TXH SHUWHQHFHQ DO JUXSR GH ORV KHPtSWHURV (VWH JUXSR GH LQVHFWRV HQWUH ORV TXH VH HQFXHQWUDQ ORV VDOWDPRQWHV leafhoppers) y las chichaUULWDV planthoppers), causan grandes daos de manera directa durante su alimentacin y SULQFLSDOPHQWH SRUTXH VRQ WUDQVPLVRUHV GH YLUXV 6H KD GHPRVWUDGR TXH OD H[SUHVLyQ GH OHFWLQDV HQ SODQWDV FRQHUH UHVLVWHQFLD D HVWH WLSR GH LQVHFWRV (Q SDUWLFXODU OD H[SUHVLyQ GH OD OHFWLQD *1$ HQ RHPD GH DUUR] HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV OHV FRQHUH UHVLVWHQFLD D OD FKLcharrita Nilaparvata lugens que transmite entre otros a los virus Rice black streaked dwarf vi-
rus, Rice tungrovirus y Rice ragged stunt virus. Una estrategia similar se utiliz exitosamente SDUD FRQWURODU RWUR WLSR GH LQVHFWRV FRPR ORV iGRV OD H[SUHVLyQ GH FLHUWDV OHFWLQDV GH DMR HQ HO RHPD GH Arabidopsis GLVPLQX\H OD FDSDFLGDG UHSURGXFWLYD GHO iGR Myzus nicotianae. 8QD HVWUDWHJLD DOWHUQDWLYD SDUD REWHQHU SODQtas resistentes a virus de manera indirecta se EDVD HQ OD XWLOL]DFLyQ GH SURWHtQDV LQVHFWLFLGDV GHO WLSR GH OD 3$' (VWD SURWHtQD VH H[SUHVD naturalmente en altos niveles durante la infeccin de Arabidopsis SRU HO iGR Myzus persicae y modula un mecanismo endgeno de defenVD /D H[SUHVLyQ GH HVWD SURWHtQD HQ HO RHPD GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FDXVD OD GLVPLQXFLyQ GHO WLHPSR GH DOLPHQWDFLyQ \ HQ HO WDPDxR GH ODV SREODFLRQHV GHO iGR 8QD WHUFHUD HVWUDWHJLD VH EDVD HQ OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV GH LQVHFWRV HQ HO RHPD GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV 3RU HMHPSOR VH KD GHmostrado que el Tomato yellow leaf curl virus 7</&9 HYLWD VX GHVWUXFFLyQ GHQWUR GH OD KHmolinfa de la mosca blanca que lo transmite PHGLDQWH XQD LQWHUDFFLyQ HVWUHFKD FRQ OD SUR-
tena del insecto GroEL. Se ha demostrado que SODQWDV GH WRPDWH TXH H[SUHVDQ OD SURWHtQD *UR(/ HQ HO RHPD VRQ UHVLVWHQWHV DO YLUXV 6H HVSHUD TXH HVWD HVWUDWHJLD FREUH PD\RU LPSRUWDQFLD D PHGLGD TXH VH YD\DQ LGHQWLFDQGR ODV IXQFLRQHV GH ODV GLVWLQWDV SURWHtQDV GH LQVHFWRV en su relacin con la transmisin de virus. Plantas transgnicas con resistencia a virus cultivadas comercialmente, o en HWDSDV DYDQ]DGDV GH H[SHULPHQWDFLyQ En los ltimos aos se ha autorizado el cultivo comercial y consumo de una variedad de SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD D YLUXV EDVDGD HQ DOJXQR GH ORV PHFDQLVPRV GHVFULStos (Tabla 2). ([LVWH RWUR JUXSR PX\ LPSRUWDQWH GH SODQtas transgnicas con resistencia a virus que VH HQFXHQWUDQ HQ HWDSDV DYDQ]DGDV GH H[SHULPHQWDFLyQ R GH SUXHEDV SLORWR D FDPSR (V LQWHUHVDQWH FRQVWDWDU TXH ORV SDtVHV HQ YtDV GH GHVDUUROOR KDQ DGRSWDGR HVWD WHFQRORJtD \ WUDEDMDQ DFWLYDPHQWH HQ OD REWHQFLyQ GH SODQtas de cultivos de inters local con resistencia a virus (Tabla 3).
Tabla 2: 3ODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD D YLUXV DXWRUL]DGDV SDUD VX FRPHUFLDOL]DFLyQ IXHQWH $*%LRV KWWSZZZDJELRVFRPGEDVHSKS
Cultivo Ciruela Papaya Papa
Evento C5 55-L63-1 RBTM21-129 21-350 22-082
Virus PPV PRSV PLRV
Transgn Cpside Cpside Replicasa
Pases EEUU Canad y EEUU Australia, Canad Japn, Corea, Filipinas, Mxico , y EEUU
Australia, Canad Japn, Corea, Filipinas, Mxico y EEUU Canad y EEUU Canad y EEUU
RBMT15-1001 SEMT15-02 SEMT15-15 Zapallo ZW20 CZW-3
PVY
Cpside
WMV, ZYMV CMV, WM ZYMV V,
Cpside Cpside
Los acrnimos utilizados fueron: CMV: Cucumber mosaic cucumoviru s; PRSV: Papaya ringspot potyvirus ; PLRV: Potato leafroll luteovirus ; PPV: Plum pox virus ; PVY: Potato virus Y; WMV-2: Watermelon mosaic virus 2; ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.
Tabla 3: 3ODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD D YLUXV HQ HWDSDV DYDQ]DGDV GH H[SHULPHQWDFLyQ HQ ODERUDWRULR H SUXHEDV SLORWR D FDPSR F R FRPHUFLDOL]DFLyQ FR HQ SDtVHV HQ YtDV GH GHVDUUROOR IXHQWH )$2 %LR'HF ZZZIDRRUJELRWHFKLQYHQWRU\BDGPLQGHSGHIDXOWDVS
Cultivo Aj Aj pimiento Algodn Virus CMV y TMV CVbMV PVY CMV y TMV CLCV CYDV Vigna mungo virus Tungro virus RRSV RDV RTV BGMV BTV SPFMV SCMV y Yellow virus SCMV ABMV AMV FBNYV Ctricos Trist eza virus CPsV CVpD Garbanzo Maz Man Meln Nuez mocada Papa CABMV VMYMV MSV MRCV PStV IPCV CMV ZYMV Stri pped virus PVY PLRV PVY, PLRV PVX, PVY PMV PRSV RV RSV PRV Pepino Pimienta Pimienta picante Pimienta dulce Poroto Repollo Ta baco ZYMV CMV -CGMMV CMV CVBMV , pepLCV CMV y TMV CMV Virus R BGMV TuMV TSWV y PVY PVY TMV BYDV YMV WYDRV Tomate Geminivirus y Tospovirus Gemi nivirus CMV TYLCV ToLCV Uva Zapallo Zuchini GLRaV, GFLV, GVA, GVB PMV, PAMV y SMV2 ZYMN PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV Pas China (c) Tailandia (e) Indonesia (e) Korea (e) Pakistn (e) China (e) India (e) Malasia (e) Tailandia (e) China (c) China (c), Malasia e Indonesia (e) Brazil (c) Filipinas (c) y Egipto (e) Kenia (c), India y Filipinas (e) Brasil (c) Egipto (c) Taila ndia (e) Ucrania (e) Egipto (e) India y Cuba (e) Argentina (e) Indonesia (e) Zimbaw e (c) India (e) Sudfrica (e) Argentina (e) Indonesia (e) India (e) Mxico y China (c) Egipto (c) China (c) Argentina , Tunez y Vietnam (e) y China (c) Argentina (c) , Vietnam, Filipinas y Cuba (e) Brasil y Egipto(c) , Chile , India y Colombia (e) Per, Sudfrica e Indonesia (e) y Mxico (c) Bangladesh e Indonesia (e) Malasia, Vietman, India, Indonesia y Malasia (e) China, Brasil y Mxico (c) Filipinas (e) Cuba (c) Tailandia (e) Egipto (c) india (e) Malasia (e) Tailandia (e) Repblica de Corea (c) China (c) China (co) Brasil (c) China (c) Brasil (c) India (e), Republica de Corea (e) Indonesia y Rep. de Corea (e), China y Mxico (c) China (e) China (e) China (e) Brasil (c) Cuba (e) Indonesia (e), Mxico (c) y China (co) Tailandia, China y Egipto (e) India e Indonesia (e) Tunez (e) Mxico (c) Egipto (c) Mxico (c)
Arroz
Arveja Banana Batata Caa de azcar Chaucha
Papaya
Trigo
-Abel, P. P., Nelson, R. S., De, B., Hoffmann, N., 5RJHUV 6 * )UDOH\ 5 7 %HDFK\ 5 1 'HOD\ RI GLVHDVH GHYHORSPHQW LQ WUDQVJHQLF SODQWV WKDW H[SUHVV WKH WREDFFR PRVDLF YLUXV FRDW SURWHLQ JHQH 6FLHQFH -Akad, F., Eybishtz, A., Edelbaum, D., Gorovits, R., Dar-Issa, O., Iraki, N. & Czosnek, H. (2007). 0DNLQJ D IULHQG IURP D IRH H[SUHVVLQJ D *UR(/ JHQH IURP WKH ZKLWH\ %HPLVLD WDEDFL LQ WKH SKORHP RI WRPDWR SODQWV FRQIHUV UHVLVWDQFH WR WRPDWR \HOORZ OHDI FXUO YLUXV $UFK 9LURO 1323-1339. %DXOFRPEH ' & 0HFKDQLVPV RI 3DWKRJHQ 'HULYHG 5HVLVWDQFH WR 9LUXVHV LQ 7UDQVJHQLF 3ODQWV 7KH 3ODQW FHOO %RRQURG . *DOHW]ND ' 1DJ\ 3 ' &RQUDG 8 .UF]DO * 6LQJOHFKDLQ DQWLERGLHV DJDLQVW D SODQW YLUDO 51$GHSHQGHQW 51$ SRO\PHUDVH confer virus resistance. Nature biotechnology 22, %XFKHU ( /RKXLV ' YDQ 3RSSHO 3 0 *HHUWV 'LPLWULDGRX & *ROGEDFK 5 3ULQV 0 0XOWLSOH YLUXV UHVLVWDQFH DW D KLJK IUHTXHQF\ using a single transgene construct. The Journal RI JHQHUDO YLURORJ\ &DQWR 7 3DOXNDLWLV 3 5HSOLFDVH mediated resistance to cucumber mosaic virus GRHV QRW LQKLELW ORFDOL]DWLRQ DQGRU WUDIFNLQJ RI WKH YLUDO PRYHPHQW SURWHLQ 0RO 3ODQW 0LFUREH Interactions 12, 743-747. 'LQJ 6 : 9RLQQHW 2 $QWLYLUDO LPPXQLW\ GLUHFWHG E\ VPDOO 51$V &HOO -Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B., Sanders, P. R., Flick, J. S., Adams, S. P., Bittner, M. L., %UDQG / $ )LQN & / )U\ - 6 *DOOXSSL * R., Goldberg, S. B., Hoffmann, N. L. & Woo, S. & ([SUHVVLRQ RI EDFWHULDO JHQHV LQ SODQW FHOOV 3URF 1DWO $FDG 6FL 8 6 $ -Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P. & Zaitlin, M. (1990). Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant WR WKH YLUXV 3URF 1DWO $FDG 6FL 8 6 $ -Lindbo, J. A. & Dougherty, W. G. (1992). 8QWUDQVODWDEOH WUDQVFULSWV RI WKH WREDFFR HWFK YLUXV FRDW SURWHLQ JHQH VHTXHQFH FDQ LQWHUIHUH ZLWK WREDFFR HWFK YLUXV UHSOLFDWLRQ LQ WUDQVJHQLF SODQWV DQG SURWRSODVWV 9LURORJ\ -Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W. M. & Dougherty, W. G. (1993). Induction of a Highly 6SHFLF $QWLYLUDO 6WDWH LQ 7UDQVJHQLF 3ODQWV ,PSOLFDWLRQV IRU 5HJXODWLRQ RI *HQH ([SUHVVLRQ DQG 9LUXV 5HVLVWDQFH 7KH 3ODQW FHOO
1LX 4 : /LQ 6 6 5H\HV - / &KHQ . & :X + : <HK 6 ' &KXD 1 + ([SUHVVLRQ RI DUWLFLDO PLFUR51$V LQ WUDQVJHQLF $UDELGRSVLV WKDOLDQD FRQIHUV YLUXV UHVLVWDQFH 1DWXUH ELRWHFKQRORJ\ -Palauqui, J. C., Elmayan, T., Pollien, J. M. & 9DXFKHUHW + 6\VWHPLF DFTXLUHG VLOHQFLQJ WUDQVJHQHVSHFLF SRVWWUDQVFULSWLRQDO silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions. The EMBO journal 3HJDGDUDMX 9 /RXLV - 6LQJK 9 5HHVH - & Bautor, J., Feys, B. J., Cook, G., Parker, J. E. & Shah, J. (2007). Phloem-based resistance to JUHHQ SHDFK DSKLG LV FRQWUROOHG E\ $UDELGRSVLV 3+<72$/(;,1 '(),&,(17 ZLWKRXW LWV VLJQDOLQJ SDUWQHU (1+$1&(' ',6($6( 686&(37,%,/,7< 3ODQW - -Prins, M., Laimer, M., Noris, E., Schubert, J., :DVVHQHJJHU 0 7HSIHU 0 6WUDWHJLHV IRU DQWLYLUDO UHVLVWDQFH LQ WUDQVJHQLF SODQWV 0ROHFXODU 3ODQW 3DWKRORJ\ 5DR . 9 5DWKRUH . 6 +RGJHV 7 . )X ; Stoger, E., Sudhakar, D., Williams, S., Christou, 3 %KDUDWKL 0 %RZQ ' 3 3RZHOO . 6 6SHQFH - *DWHKRXVH $ 0 *DWHKRXVH - $ ([SUHVVLRQ RI VQRZGURS OHFWLQ *1$ LQ WUDQVJHQLF ULFH SODQWV FRQIHUV UHVLVWDQFH WR ULFH EURZQ SODQWKRSSHU 3ODQW - 6DQIRUG - & -RKQVWRQ 6 $ 7KH FRQFHSW RI SDUDVLWHGHULYHG UHVLVWDQFH GHULYLQJ UHVLVWDQFH JHQHV IURP WKH SDUDVLWH
V RZQ JHQRPH - 7KHRU %LRO -Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., De 0DUWLQLV ' &DWWDQHR $ *DOHI 3 7UDQVJHQLF SODQWV H[SUHVVLQJ D IXQFWLRQDO VLQJOH FKDLQ )Y DQWLERG\ DUH VSHFLFDOO\ SURWHFWHG IURP YLUXV DWWDFN 1DWXUH 9RLQQHW 2 3LQWR < 0 %DXOFRPEH ' & 6XSSUHVVLRQ RI JHQH VLOHQFLQJ D JHQHUDO VWUDWHJ\ XVHG E\ GLYHUVH '1$ DQG 51$ YLUXVHV RI SODQWV 3URF 1DWO $FDG 6FL 8 6 $ -Waterhouse, P. M., Graham, M. W. & Wang, M. % 9LUXV UHVLVWDQFH DQG JHQH VLOHQFLQJ LQ SODQWV FDQ EH LQGXFHG E\ VLPXOWDQHRXV H[SUHVVLRQ RI VHQVH DQG DQWLVHQVH 51$ 3URF 1DWO $FDG 6FL 8 6 $
V. CAPTULO 7 Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas

$GULiQ 9RMQRY 0 0HUFHGHV 5LYHUR 'LHJR =DSSDFRVWD Introduccin $ SHVDU GH TXH ODV SODQWDV VRQ HQ JHQHUDO UHVLVWHQWHV D ODV LQIHFFLRQHV SURGXFLGDV SRU OD PD\RUtD GH ORV SDWyJHQRV EDFWHULDV KRQJRV \ YLUXV FDGD XQD GH HOODV SRVHH FLHUWR JUDGR GH VXVFHSWLELOLGDG D DOJXQR GH pVWRV WRSDWyJHQRV (O FRQRFLPLHQWR GH OD LQWHUDFFLyQ SDWyJHQRKRVSHGDGRU ODV KHUUDPLHQWDV XWLOL]DGDV SRU XQRV SDUD DWDFDU \ ORV PHFDQLVPRV GH GHIHQVD SDUD HYLWDU ODV FRQVHFXHQFLDV GH HVWH DWDTXH SRU ORV RWURV VRQ WHPD GH HVWXGLR GH GLYHUVRV JUXSRV GH LQYHVWLJDFLyQ DOUHGHGRU GHO PXQGR Conocer los factores de virulencia utilizados SRU ODV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV \ VX PHFDQLVPR GH DFFLyQ HV LPSRUWDQWH SDUD HO GHVDUUROOR GH SODQWDV UHVLVWHQWHV D HQIHUPHGDGHV 3RU RWUR ODGR SURIXQGL]DU ORV FRQRFLPLHQWRV VREUH ORV PHFDQLVPRV GH GHIHQVD YHJHWDO SHUPLWH SODnear estrategias en el diseo de cultivos mejor DGDSWDGRV DO PHGLR \D VHD LQFUHPHQWDQGR OD resistencia innata o a travs de la introduccin de genes de resistencia heterlogos. (VWH FDStWXOR HV XQD EUHYH UHVHxD VREUH ODV SULQFLSDOHV EDFWHULDV UHVSRQVDEOHV GH HQIHUPHGDG HQ SODQWDV VXV KHUUDPLHQWDV R IDFWRUHV GH virulencia, su regulacin, y otras estrategias imSRUWDQWHV TXH XWLOL]DQ GXUDQWH HO SURFHVR LQIHFtivo. Las distintas estrategias biotecnolgicas SDUD OD SURGXFFLyQ GH SODQWDV UHVLVWHQWHV \D sea aquellas que ya se encuentran en el camSR FRPR RWUDV HQ GHVDUUROOR R GH SRWHQFLDO XWLOL]DFLyQ WDPELpQ VRQ SUHVHQWDGDV HQ HO FDStWXOR Tipos de interaccin planta-bacteria /DV SODQWDV FRPR WRGRV ORV RUJDQLVPRV YLvientes, interactan con el medio ambiente y en l con otros organismos, entre ellos se encuentran las bacterias. Ambos organismos, EDFWHULDV \ SODQWDV LQWHUFDPELDQ VHxDOHV HVWDEOHFLHQGR XQD HVSHFLH GH GLiORJR /DV FpOXlas vegetales emiten secreciones conteniendo
DPLQRiFLGRV D]~FDUHV \ RWURV FRPSXHVWRV TXtPLFRV TXH SXHGHQ VHU UHFRQRFLGRV FRPR VHxDOHV SRU ORV PLFURRUJDQLVPRV GHO VXHOR H LQGXFHQ HQ HOORV XQD UHVSXHVWD UHFtSURFD /D UHVSXHVWD EDFWHULDQD SXHGH VHU PX\ GLVWLQWD WHQLHQGR HQ FXHQWD HO WLSR GH LQWHUDFFLyQ TXH HVWDEOHFH FRQ ODV SODQWDV $Vt ODV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV SXHGHQ HVWDEOHFHU LQWHUDFFLRQHV FRPSDWLEOHV R LQFRPSDWLEOHV (Q XQD UHODFLyQ FRPSDWLEOH HO SDWyJHQR LQIHFWD \ HQIHUPD D OD SODQWD HVWR RFXUUH VyOR VL ODV FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV VRQ IDYRUDEOHV VL ODV GHIHQVDV SUHIRUPDGDV GH OD SODQWD VRQ LQDGHFXDGDV VL OD SODQWD IDOOD HQ GHWHFWDU DO SDWyJHQR H LQFOXVR VL ODV UHVSXHVWDV GH GHIHQVD DFWLYDGDV VRQ LQHFLHQWHV (Q XQD LQWHUDFFLyQ LQFRPSDWLEOH ODV SODQWDV UHVLVWHQ DO DWDTXH GHO SDWyJHQR (VWD UHVLVWHQFLD SXHGH VHU LQHVSHFtFD D WUDYpV GH OD GHQRPLQDGD UHVLVWHQFLD QR KRVSHGDGRUD EDVDO R LQQDWD HQ OD FXDO HO SDWyJHQR QR HQFXHQWUD FRQGLFLRQHV IDYRUDEOHV SDUD LQIHFWDU R ELHQ SRUTXH OD SODQWD SUHVHQWD EDUUHUDV HVWUXFWXUDOHV DGHFXDGDV R VLQWHWL]D FRPSXHVWRV Wy[LFRV TXH LPSLGHQ OD SUROLIHUDFLyQ \ FRORQL]DFLyQ GH OD EDFWHULD /D UHODFLyQ LQFRPSDWLEOH \ SRU OR WDQWR OD UHVLVWHQFLD SXHGH VHU GHELGD WDPELpQ D XQ UHFRQRFLPLHQWR HVSHFtFR (Q HVWH FDVR H[LVWH XQD EDVH JHQpWLFD GHQLGD 6H WUDWD GH OD SUHVHQFLD GH JHQHV GH UHVLVWHQFLD GRPLQDQWHV HQ HO KRVSHGDGRU TXH OH SHUPLWHQ UHFRQRFHU JHQHV GH DYLUXOHQFLD GHO SDWyJHQR (Q ORV DxRV GHO VLJOR SDVDGR +DUROG + )ORU SURSXVR HO PRGHOR gen a gen (ver Figura 1). Dicho modelo establece que la resistencia se SURGXFH FXDQGR OD SODQWD H[SUHVD XQ JHQ GH resistencia dominante (R, SURWHtQD 5 \ HO SDtgeno un gen de avirulencia dominante comSOHPHQWDULR Avr, SURWHtQD $YU (VWD UHVSXHVta defensiva est frecuentemente asociada a XQD 5HVSXHVWD +LSHUVHQVLEOH +5 GHO LQJOpV Hypersensitive Response), que se caracteriza SRU XQD QHFURVLV UiSLGD \ ORFDOL]DGD HQ UHVSXHVWD DO DWDTXH GHO SDWyJHQR (V GHFLU IUHQWH D OD LQYDVLyQ GH WHMLGRV YHJHWDOHV SRU XQ PLFURRUJDQLVPR IRUiQHR OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD LQGXFLEOH PiV WHPSUDQD HV OD PXHUWH FHOXODU FRQWURODGD (VWD UHDFFLyQ +5 RFXUUH DSUR[LPDGDPHQWH KRUDV GHVSXpV GH TXH OD SODQWD SHUFLEH XQ SDWyJHQR SRWHQFLDO 6H WUDWD GH XQ fenmeno conocido desde hace varios dece-
Figura 1. Modelo gen por gen. /D JXUD PXHVWUD las combinaciones de genes involucradas en distintas interacciones de resistencia/enfermedad entre XQ SDWyJHQR \ VX KRVSHGDGRU (Q ORV DxRV GHO VLJOR SDVDGR +DUROG + )ORU SURSXVR HVWH PRGHOR TXH HVWDEOHFH TXH OD UHVLVWHQFLD VH SURGXFH FXDQGR OD SODQWD H[SUHVD XQ JHQ GH UHVLVWHQFLD GRPLQDQWH (R \ HO SDWyJHQR XQ JHQ GH DYLUXOHQFLD GRPLQDQWH FRPSOHPHQWDULR Avr (VWH PRGHOR H[SOLFD ORV FDVRV GH FRPSDWLELOLGDG GH LQFRPSDWLELOLGDG SODQWD SDWyJHQR
QLRV TXH FRPSDUWH FDUDFWHUtVWLFDV JHQHUDOHV FRQ OD DSRSWRVLV R PXHUWH FHOXODU SURJUDPDGD (O REMHWLYR QDO HV DLVODU DO LQYDVRU HQ OD ]RQD GRQGH VH KD GHWHFWDGR OD SHQHWUDFLyQ GHO PLFURRUJDQLVPR SDWRJpQLFR /XHJR GH XQD +5 OD SODQWD DGTXLHUH UHVLVWHQFLD HQ WHMLGRV GLVWDOHV DO VLWLR SULPDULR GH LQIHFFLyQ (VWD UHVLVWHQFLD TXH SURWHJH D WRGD OD SODQWD HV FRQRFLGD FRPR 5HVLVWHQFLD 6LVWpPLca Adquirida (SAR; Systemic Acquired Resistance). 3ULQFLSDOHV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV /DV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV FDSDFHV GH LQfectar y desarrollar enfermedades en un gran Q~PHUR GH HVSHFLHV YHJHWDOHV GH LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD SHUWHQHFHQ D XQ UHGXFLGR JUXSR de gneros. Los gneros de bacterias GramQHJDWLYDV PiV HVWXGLDGRV GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GH VX ELRORJtD LPSDFWR WRSDWROyJLFR \
DVSHFWRV JHQpWLFRPROHFXODUHV VRQ Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas. (VWRV RUJDQLVPRV SXHGHQ VHU FXOWLYDGRV HQ HO ODERUDWRULR \ SXHGHQ LQRFXODUVH IiFLOPHQWH HQ SODQWDV SDUD UHDOL]DU HVWXGLRV GH WRSDWRgenicidad. Por otro lado, las bacterias GramSRVLWLYDV FRPR Clavibacter, Curtobacterium y Rhodococcus, son ms difciles de manejar en condiciones controladas. Erwinia chrysanthemi, E. carotovora, E. amylovora \ RWUDV HVSHFLHV VRQ ODV FDXVDQWHV GH SXGULFLRQHV EODQGDV GHELGR D VX FDSDFLGDG SDUD SURGXFLU JUDQGHV FDQWLGDGHV GH HQ]LPDV SHFWROtWLFDV FDSDFHV GH PDFHUDU WHMLGR SDUHQTXLPDWRVR GH XQ DPSOLR UDQJR GH HVSHFLHV Pseudomonas syringae VH FODVLFD HQ DOUHGHGRU GH SDWRYDULHGDGHV \ SXHGH LQIHFWDU XQ DPSOLR UDQJR GH HVSHFLHV (QWUH HOODV P. syringae SY phaseolicola infecta el frjol cauVDQGR OD HQIHUPHGDG FRQRFLGD FRPR WL]yQ GH halo;y, P. syringae SY tomato SURGXFH OD PDQcha negra del tomate. Ralstonia (formalmente Pseudomonas) solanacearum es una bacteria de suelo que coloQL]D HO RHPD GH XQD DPSOLD JDPD GH SODQWDV KXpVSHG FDXVDQGR HQWUH RWUDV OD SRGUHGXPEUH SDUGD GH OD SDSD El gnero Xanthomonas HVWD FRQVWLWXtGR SRU HVSHFLHV TXH DWDFDQ D PiV GH YHJHWDOHV (Q SDUWLFXODU Xanthomonas axonopodis SY citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis GH ORV FtWULFRV HQIHUPHGDG TXH SRU ORV GDxRV TXH SURGXFH KD DGTXLULGR XQD LPSRUWDQWH VRFLRHFRQyPLFD WUDVFHQGHQWH HQ ORV SDtVHV SURGXFWRUHV GH FtWULFRV 3RU RWUD SDUWH Xanthomonas campestris SY campestris HV HO SDWyJHQR FDXVDQWH GH OD SXGULFLyQ QHJUD HQ FUXFtIHUDV entre ellas Arabidopsis, y constituye un modelo GH LQWHUDFFLyQ SODQWDSDWyJHQR PX\ HVWXGLDGR 2WURV JpQHURV GH EDFWHULDV WRSDWyJHQDV son Agrobacterium, Rhodococcus, Spiroplasma, Xylella y Streptomyces. Xylella fastidiosa, es la causante de la clorosis variegada de los FtWULFRV \ IXH OD SULPHUD EDFWHULD WRSDWyJHQD cuyo genoma fue secuenciado totalmente. Las bacterias del gnero Streptomyces son SURFDULRQWHV ODPHQWRVRV *UDPSRVLWLYRV TXH SURGXFHQ HVSRUDV FRPR SULQFLSDO PHFDQLVPR GH GLVSHUVLyQ 6yOR XQDV SRFDV HVSHFLHV HQWUH
ODV GHVFULSWDV VRQ SDWyJHQDV GH SODQWDV /DV HVSHFLHV GH Streptomyces WRSDWyJHQDV causan enfermedades a nivel de rganos y HVWUXFWXUDV VXEWHUUiQHDV GH GLYHUVDV HVSHFLHV YHJHWDOHV 3RU HMHPSOR Streptomyces scabies FDXVD OD VDUQD GH OD SDSD HVFDUDV D QLYHO GH los tubrculos). /D DGHFXDGD LGHQWLFDFLyQ GH ODV HVSHFLHV VXEHVSHFLHV \ SDWRYDULHGDGHV GH EDFWHULDV HV fundamental, y de gran inters en el marco de HVWXGLRV HSLGHPLROyJLFRV \ GH LPSDFWR DPbiental o ecolgico. En la actualidad, existen herramientas genticas y moleculares que se VXPDQ D OD WUDGLFLRQDO FDUDFWHUL]DFLyQ IHQRWtSLca de las diferentes bacterias. Entre ellas, se encuentran la secuenciacin de ADN, la hibridacin ADN-ADN, el anlisis de isoenzimas y los marcadores moleculares. Factores de virulencia bacterianos /DV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV KDQ GHVDUUROODGR XQD VHULH GH FRPSXHVWRV TXH FRQWULEX\HQ D ORV QHV GH LQYDGLU \ FRORQL]DU ORV UHVSHFWLYRV KRVSHGDGRUHV (VWRV FRPSXHVWRV R IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD GHWHUPLQDQ OD SDWRJHQLFLGDG \ HO JUDGR GH YLUXOHQFLD GHO SDWyJHQR 'HSHQGLHQGR GH OD LQWHUDFFLyQ SODQWDEDFWHULD ODV EDFWHULDV SURGXFHQ IDFWRUHV DOJXQRV GH ORV FXDOHV VRQ FRPXQHV \ RWURV HVSHFtFRV SDUD FDGD LQWHUDFFLyQ SDWyJHQRKRVSHGDGRU 0XFKRV GH HVWRV IDFWRUHV VRQ SURWHtQDV TXH LQ\HFWDQ GLUHFWDPHQWH HQ OD FpOXOD KRVSHGDGRUD SURWHtQDV HIHFWRUDV D WUDYpV GHO VLVWHPD GH VHFUHFLyQ WLSR ,,, 667,,, XQ VLVWHPD FRP~Q HQWUH ODV EDFWHULDV SDWyJHQDV WDQWR GH SODQtas como animales, y que se induce cuando la EDFWHULD WRPD FRQWDFWR FRQ HO KRVSHGDGRU /DPHQWDEOHPHQWH SDUD HO DJHQWH SDWyJHQR HVWDV SURWHtQDV VRQ PROpFXODV LGHDOHV SDUD VHU UHFRQRFLGDV SRU HO VLVWHPD GH GHIHQVD GH OD SODQWD (modelo gen a gen D WUDYpV GH ODV SURWHtQDV GH UHVLVWHQFLD SURWHtQD 5 OD SODQWD SXHGH UHFRQRFHU OD SUHVHQFLD GH GHWHUPLQDGD SURWHtQD HIHFWRUD SURWHtQD $YU GHVHQFDGHQDQGR OD UHVSXHVWD KLSHUVHQVLEOH +5 Algunos de los factores de virulencia han VLGR FDUDFWHUL]DGRV UHFLHQWHPHQWH FRPR VXSUHVRUHV GH OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD YHJHWDO \ OH SHUPLWHQ D OD EDFWHULD SURPRYHU VX FUHFLPLHQWR \ GLIXVLyQ GHQWUR GHO WHMLGR YHJHWDO 9DULRV GH
HVWRV LQFOX\HQ SURWHtQDV HIHFWRUDV VHFUHWDGDV SRU HO 667,,, SHUR WDPELpQ H[RSROLVDFiULGRV \ WRWR[LQDV KDQ VLGR UHVHxDGDV HQ OD OLWHUDWXUD (QWUH ORV HIHFWRUHV GHVFULSWRV HO $YU3WR% HV XQR GH ORV PHMRUHV FDUDFWHUL]DGRV /D SURWHtna R Pto es una serina/treonina quinasa de toPDWH TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD D Pseudomonas syringae TXH H[SUHVHQ OD SURWHtQD $YU3WR 3WR y AvrPto interactan fsicamente, y esta inteUDFFLyQ HV QHFHVDULD SDUD OD DFWLYDFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD 6H KD GHPRVWUDGR TXH OD GHSRVLFLyQ de calosa constituye un mecanismo defensivo HQ SODQWDV (Q DXVHQFLD GH 3WR $YU3WR DFW~D VXSULPLHQGR GLFKR PHFDQLVPR SHUPLWLpQGROH D OD EDFWHULD XQD VXVWDQFLDO PXOWLSOLFDFLyQ HQ HO WHMLGR YHJHWDO 3RU RWUR ODGR $YU3WR% VXSULPH OD PXHUWH FHOXODU SURJUDPDGD LQLFLDGD SRU 3WR SHUR WDPELpQ DTXHOOD LQLFLDGD SRU RWUDV SURWHtQDV 5 DOWHUDQGR OD UHVSXHVWD LQPXQH YHJHWDO 2WUR HMHPSOR VLPLODU D ORV PHQFLRQDGRV DQWHULRUPHQWH HVWD GDGR SRU +RS0 /D SURWHtQD +RS0 HV XQ HIHFWRU SURGXFLGR SRU Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora y Pantoea stewartii VXEVS stewartii \ TXH WDPELpQ PRGLFD OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD 2WURV HIHFWRUHV SURGXFLGRV SRU Pseudomonas syringae SY phaseolicola 9LU3SK$ $YU3SK& \ $YU3SK) SUHYLHQHQ OD GHWHFFLyQ GHO SDWyJHQR SRU SDUWH GHO KRVSHGDGRU PHGLDQWH distintos mecanismos, entre ellos: inhibicin de OD H[SUHVLyQ GHO JHQ avr, bloqueo de la secreFLyQ GH OD SURWHtQD $YU LQWHUIHUHQFLD HQWUH HO $YU \ OD SURWHtQD 5 R VXSUHVLyQ HQ HO FDPLQR GH VHxDOL]DFLyQ GH OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD UtR abajo al reconocimiento del Avr. /DV FHSDV YLUXOHQWDV GH Pseudomonas syringae SURGXFHQ GLYHUVDV WR[LQDV FRPR FRURQDtina, faseolotoxina, tagetitoxina, tabtoxina, siringomicina, siringotoxina, etc. La toxina coroQDWLQD SURPXHYH OD YLUXOHQFLD GH P. syringae actuando como un anlogo del jasmonato y SRVHH OD FDSDFLGDG GH LQGXFLU VXVFHSWLELOLGDG en Arabidopsis thaliana. Diversas enzimas extracelulares son imSRUWDQWHV IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD \D TXH HQ VX DXVHQFLD OD YLUXOHQFLD GHO SDWyJHQR GLVPLnuye considerablemente. La secrecin de un DPSOLR UDQJR GH HQ]LPDV FDSDFHV GH GHJUDGDU FRPSRQHQWHV GH OD SDUHG FHOXODU GH SODQWDV YDVFXODUHV \ RWURV FRPSRQHQWHV FHOXODUHV
WLHQHQ XQ SDSHO LPSRUWDQWH HQ HQIHUPHGDGHV EDFWHULDQDV FRPR ODV SRGUHGXPEUHV EODQGDV y tambin en bacterias que causan necrosis o PDUFKLWDPLHQWR YDVFXODU (QWUH pVWDV SRGHPRV PHQFLRQDU HQ]LPDV SHFWROtWLFDV FHOXODVDV SURWHDVDV JOLFDQDVDV SROLJDODFWXURQDVDV \ HVWHUDVDV /D SRVHVLyQ GH GLFKDV HQ]LPDV JDUDQWL]D XQD SXHUWD GH HQWUDGD D OD SODQWD R XQD YH] DGHQWUR OD SURYLVLyQ GH QXWULHQWHV SDUD VX PXOWLSOLFDFLyQ /DV EDFWHULDV SURGXFHQ XQD HQRUPH YDULHGDG GH SROLVDFiULGRV FRQVWLWXLGRV SRU GLYHUVRV D]~FDUHV /RV H[RSROLVDFiULGRV (36 SXHGHQ estar asociados a la membrana externa forPDQGR FDSVXODV R VHU OLEHUDGRV HQ HO PHGLR extracelular. Estos EPS han sido involucrados HQ SDWRJHQLFLGDG FRQMXQWDPHQWH FRQ RWURV (glucanos cclicos) y como ocurre tambin con las enzimas antes mencionadas estn sometiGRV D XQD FRPSOHMD UHG GH UHJXODFLyQ /RV (36 TXH KDQ VLGR LPSOLFDGRV HQ OD LQWHUDFFLyQ FRQ HO KRVSHGDGRU IDFLOLWDUtDQ OD GLVHPLQDFLyQ GHO SDWyJHQR PHGLDQWH PHFDQLVPRV que en algunos casos ya se han dilucidado. El [DQWDQR TXH HV HO SROLVDFiULGR PiV LPSRUWDQWH SURGXFLGR SRU WRGDV ODV ;DQWKRPRQDV DFW~D VXSULPLHQGR OD GHIHQVD ORFDO VLHQGR HVWD DFWLYLGDG GHSHQGLHQWH GH HVWUXFWXUD GHO PLVPR (O [DQWDQR VXSULPH HO HQJURVDPLHQWR GH OD SDUHG FHOXODU GH OD FpOXOD YHJHWDO LQGXFLGR SRU HO DWDTXH GHO SDWyJHQR GHSRVLFLyQ GH FDORVD PHGLDQWH HO VHFXHVWUR GH LRQHV FDOFLR H LQWHUriendo con el camino de sealizacin que lleva a la activacin de la calosa sintetasa. En el caso de Agrobacterium XQ SDWyJHQR TXH GHVDUUROOD WXPRUHV HQ OD SODQWD KRVSHGDGRUD ODV KRUPRQDV YHJHWDOHV VRQ LPSRUWDQWHV factores de virulencia que el microorganismo SURGXFH DX[LQDV \ FLWRTXLQLQDV /D DX[LQD SULQFLSDO SURGXFLGD HV HO iFLGR LQGRODFpWLFR TXH PRGXOD HO WLHPSR GH LQFXEDFLyQ GH OD HQIHUPHGDG /DV FLWRTXLQLQDV TXH VH SURGXFHQ VRQ YDrias (derivados de la zeatina) y determinan el tamao del tumor. 2UJDQL]DFLyQ HQ FRPXQLGDGHV ELROP una estrategia bacteriana durante la interaccin con la planta hospedadora Las bacterias no viven aisladas sino que forman una comunidad estructurada, coordinada
y funcional que se denomina comnmente bioSHOtFXOD R ELROP 6H KD SRGLGR REVHUYDU XQD UHODFLyQ GLUHFWD HQ OD FDSDFLGDG GH SURGXFLU ELROPV \ OD YLUXOHQFLD GH HVWDV EDFWHULDV /RV ELROPV VRQ HVWUXFWXUDV LPSRUWDQWHV HQ HO GHVDUUROOR EDFWHULDQR \ SRGUtDQ VHU XQ EODQFR PX\ DSURSLDGR SDUD FRQWUDUUHVWDU ODV HQIHUPHGDGHV SURGXFLGDV SRU pVWDV HQ ORV UHVSHFWLYRV KRVSHGDGRUHV (QWUH ODV YHQWDMDV TXH OH SURSRUFLRQD D OD EDFWHULD SRVHHU OD FDSDFLGDG GH GHVDUUROODU XQ ELROP SRGHPRV PHQFLRQDU SURWHFFLyQ GHO PHGLR DPELHQWH PD\RU GLVSRQLELOLGDG GH QXWULHQWHV FRRSHUDFLyQ HQWUH HVSHFLHV PLFURFRQVRUFLR VLQWURVPR \ DGTXLVLFLyQ GH QXHvas caractersticas genticas /D IRUPDFLyQ GH ELROPV UHTXLHUH GH OD FDSDFLGDG GH ODV EDFWHULDV GH XQLUVH D GLVWLQWDV VXSHUFLHV HQ SDUWLFXODU HO WHMLGR YHJHWDO 3DUD lograr esta asociacin, las bacterias utilizan diversas molculas, entre ellas los EPS y las SURWHtQDV GH VXSHUFLH VLHQGR ODV IXQFLRQHV GH PRWLOLGDG LPSRUWDQWHV SDUD HO GHVDUUROOR GH HVWDV HVWUXFWXUDV WULGLPHQVLRQDOHV /D H[SUHsin de los genes involucrados en la sntesis de estas molculas de adhesin, as como otros factores de virulencia, estn regulados SRU PHFDQLVPRV GHSHQGLHQWHV GH OD GHQVLGDG celular. Regulacin de factores de virulencia y ELROP HQ EDFWHULDV WRSDWyJHQDV /D IRUPDFLyQ GH ELRSHOtFXODV EDFWHULDQDV HV XQ SURFHVR PX\ UHJXODGR &DGD HVSHFLH UHVSRQGH D VXV SURSLDV VHxDOHV DPELHQWDOHV D travs de un conjunto de mecanismos moleFXODUHV $ SHVDU GH HVWD JUDQ GLYHUVLGDG KD\ un sistema conservado de regulacin que resSRQGH D YDULRV HVWtPXORV TXH VRQ LPSRUWDQWHV SDUD OD DVRFLDFLyQ HQWUH EDFWHULDV \ SODQWDV (O sistema de regulacin de la formacin de bioOP DO LJXDO TXH DOJXQRV IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD HQ SDUWLFXODU ODV HQ]LPDV H[WUDFHOXODUHV \ ORV (36 VRQ GHSHQGLHQWHV GHO Q~PHUR GH EDFWHULDV SUHVHQWHV R GHO PHFDQLVPR FRP~QPHQWH denominado qurum sensing. El fenmeno de quorum sensing fue reconoFLGR HQ OD GHFDGD GH ORV HQ HVWXGLRV UHDOLzados con la bacteria 9LEULR VFKHUL. Esta bacWHULD PDULQD ELROXPLQLVFHQWH SURGXFH OX] VyOR
cuando hay una gran cantidad de bacterias SUHVHQWHV 6H REVHUYy TXH OD OXPLQLVFHQFLD VH SURGXFtD SRU DFXPXODFLyQ GH XQ DFWLYDGRU R PROHFXOD DXWRLQGXFWRUD (VWD PROpFXOD HV SURGXFLGD SRU OD EDFWHULD \ DFWLYD OD OXPLQLVFHQcia cuando alcanza una determinada concenWUDFLyQ FUtWLFD /DV EDFWHULDV VRQ FDSDFHV GH FHQVDU VX GHQVLGDG GH SREODFLyQ D WUDYpV GH la deteccin de esta molcula autoinductora. Al mecanismo del censado de la densidad celular se lo llam quorum sensing y la molcula acWLYDGRUD SURGXFLGD SRU 9 VFKHUL fue aislada HQ HO DxR VLHQGR LGHQWLFDGD FRPR XQD N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lactona. (O TXRUXP VHQVLQJ HV XQ SURFHVR UHODWLYDPHQWH VLPSOH /DV DFLOKRPRVHULQ ODFWRQDV +6/ VRQ VLQWHWL]DGDV D XQ QLYHO EDVDO SRU las acil-HSL sintasas (generalemente homloJDV D ODV SURWHtQDV WLSR /X[, GH 9 VKHUL). Las PROpFXODV GH DFLO+6/V VLQWHWL]DGDV VRQ UiSLGDPHQWH OLEHUDGDV SRU ODV FpOXODV EDFWHULDQDV SRU GLIXVLyQ (O LQFUHPHQWR HQ HO WDPDxR GH OD SREODFLyQ EDFWHULDQD HOHYD OD FRQFHQWUDFLyQ GH las acil-HSLs. A niveles elevados de concentracin, las acil-HSLs interactan con un factor GH WUDQVFULSFLyQ KRPyORJR D OD SURWHtQD /X[5 de 9 VKHUL TXH PRGXOD OD H[SUHVLyQ GH ORV JHQHV UHJXODGRV SRU TXRUXP VHQVLQJ Como se muestra en la Figura 2, en la regulacin de factores de virulencia a travs de
TXRUXP VHQVLQJ ODV SURWHtQDV , \ 5 MXHJDQ XQ rol central. La clula bacteriana (en gris) conWLHQH XQD SURWHtQD , TXH HV UHVSRQVDEOH GH OD sntesis de molculas difusibles (en verde) de acil homoserin lactonas (A-HSLs), que actan como sealizadoras. A una alta concentracin celular, las molculas sealizadoras interacW~DQ FRQ OD SURWHtQD 5 /D LQWHUDFFLyQ FRQ OD misma induce un cambio conformacional que DXPHQWD VX DQLGDG SRU GHWHUPLQDGDV VHFXHQFLDV GH $'1 VHFXHQFLDV OX[ SUHVHQWHV HQ ODV UHJLRQHV SURPRWRUDV GH ORV JHQHV UHJXODGRV SRU DFLO KRPRVHULQ ODFWRQDV Uno de los sistemas de qurum sensing mejor estudiados es el de Ralstonia solanacearum. (VWD EDFWHULD SURGXFH HO H[RSROLVDFDULGR , (EPS I) y otros factores de virulencia que estn regulados a travs de una red sensorial. Para ORJUDU OD H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH VXV JHQHV R. solanacearum XWLOL]D HVWD FRPSOHMD UHG GH cascadas regulatorias que censan los cambios DPELHQWDOHV \ JDWLOODQ FDPELRV HQ OD H[SUHVLyQ JpQLFD /RV FRPSRQHQWHV GH OD UHG VRQ HQ VX PD\RUtD UHJXODGRUHV GHO WLSR GH GRV FRPSRQHQWHV VHQVRUUHJXODGRU (VWRV VLVWHPDV SUHVHQWDQ XQ GRPLQLR VHQVRU HQ HO H[WUHPR 1WHUPLQDO TXH SXHGH XQLU VHxDOHV HVSHFtFDV del medio extracelular y un dominio quinasa FLWRSODVPiWLFR TXH GLVSDUD OD IRVIRULODFLyQ GHO FRPSRQHQWH UHJXODGRU /D IRVIRULODFLyQ DFWL-
Figura 2. Qurum sensing. 0RGHOR VLPSOLFDGR GH OD WUDQVGXFFLyQ GH VHxDOHV HQ TXyUXP VHQVLQJ 46 /RV PLFURRUJDQLVPRV FHQVDQ VXV SREODFLRQHV D WUDYpV GH XQ VRVWLFDGR PHFDQLVPR GH FRPXQLFDFLyQ FHOXODU &XDQGR OD GHQVLGDG FHOXODU DOFDQ]D XQ GHWHUPLQDGR XPEUDO VH GLVSDUD OD H[SUHVLyQ GH GHWHUPLQDGRV JHQHV (VWH WLSR GH UHJXODFLyQ TXH FRQWUROD GLYHUVDV IXQFLRQHV ELROyJLFDV HQWUH HOODV ODV GH YLUXOHQFLD HV conocido como autoinduccin o quorum sensing. Las moleculas seallizadoras esenciales de este sistema son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL).
YD HO GRPLQLR GH XQLyQ D $'1 SUHVHQWH HQ OD UHJLyQ &WHUPLQDO GH HVWD SURWHtQD FRQYLUWLpQGROD HQ XQ DFWLYDGRU WUDQVFULSFLRQDO GH ORV JHnes blancos. En R. solanacearum la densidad celular es censada mediante el ster metlico GHO iFLGR KLGUR[L SDOPtWLFR 2+3$0( 8Q QLYHO HOHYDGR GH 2+3$0( LQGXFH OD SURGXFcin de EPS I y de algunas exoenzimas. Estos IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD SURPXHYHQ HO DWDTXH GH la bacteria. En Xanthomonas camprestris SY campestris (Xcc XQ SDWyJHQR TXH DIHFWD FUXFtIHUDV OD SURGXFFLyQ GH ODV HQ]LPDV H[WUDFHOXODUHV \ GH (36 HVWi UHJXODGD SRU HO JUXSR GH JHQHV rpf UHJXODFLyQ GH ORV IDFWRUHV GH SDWRJHQLFLGDG FRPSXHVWR SRU JHQHV rpfA-I). Los genes rpfB y rpfF HVWiQ LPSOLFDGRV HQ OD UHJXODFLyQ PHGLDGD SRU SHTXHxDV PROpFXODV GLIXVLEOHV denominadas DSF (del ingls diffusible signal factor), las cuales actuaran como comunicadoras intercelulares. *HQyPLFD \ EDFWHULDV WRSDWyJHQDV 3DUD ODV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV OD HUD JHQyPLFD FRPHQ]y RFLDOPHQWH FRQ OD SXEOLFDFLyQ de la secuencia del genoma de Xylella fastidiosa, el agente causal de la clorosis variegada de ORV FtWULFRV 8WLOL]DQGR SURJUDPDV GH SUHGLFFLyQ de secuencias se han encontrado en el genoPD GH HVWD EDFWHULD GH PiV GH PLOORQHV GH SDUHV GH EDVHV XQRV JHQHV $GHPiV GH X. fastidiosa, ya se han secuenciado los genoPDV GH FHSDV UHSUHVHQWDWLYDV GH OD PD\RUtD GH ORV JUXSRV WD[RQyPLFRV TXH FRQWLHQHQ EDFWHULDV WRSDWyJHQDV GH LPSRUWDQFLD (QWUH HOORV YDULDV HVSHFLHV GHO JpQHUR GH Xanthomonas y Pseudomonas Para conocer el estado actual de la secuenciacin de genomas en bacterias WRSDWyJHQDV VH SXHGH FRQVXOWDU OD EDVH GH datos GOLD (ver Lecturas Recomendadas) donde se encuentra una lista actualizada de ORV SUR\HFWRV GH VHFXHQFLDFLyQ La planta y su sistema defensivo /RV PHFDQLVPRV PROHFXODUHV LPSOLFDGRV HQ HO GHVHQFDGHQDPLHQWR GH XQD UHVSXHVWD GHIHQVLYD HQ SODQWDV LQYROXFUDQ HO UHFRQRFLPLHQWR SRU SDUWH GH pVWDV GH VHxDOHV GHULYDGDV GHO SDWyJHQR (VWDV VHxDOHV R PROpFXODV SUHVHQWHV HQ HO SDWyJHQR SXHGHQ VHU UHFRQRFLGDV SRU
OD SODQWD GH PDQHUD LQHVSHFtFD GLULJLHQGR XQD UHVSXHVWD JHQHUDO R ELHQ SXHGHQ VHU GHWHFWDGDV HVSHFtFDPHQWH SRU HO SURGXFWR GH ORV genes de resistencia (R /DV SULPHUDV VRQ PROpFXODV SUHVHQWHV HQ OD VXSHUFLHV GH OD PD\RUtD GH ODV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV FRPR HO OLSRSROLVDFiULGR /36 HQ OD PHPEUDQD H[WHUQD GH ODV EDFWHULDV *UDPQHJDWLYDV R OD DJHOLQD FRPSRQHQWH HVWUXFWXUDO GHO DJHOR (O FRQMXQWR GH HVWDV PROpFXODV VH FRQRFH FRPR SDWURQHV PROHFXODUHV DVRFLDGRV D SDWyJHQRV 3$03V (O UHFRQRFLPLHQWR HVSHFtFR FRPR VH PHQFLRn en secciones anteriores, involucra la inteUDFFLyQ GHO SURGXFWR GH XQ JHQ GH Avr GHO SDWyJHQR \ HO SURGXFWR GH XQ JHQ GH R GH OD SODQWD En cualquiera de los casos (reconocimiento esSHFtFR R LQHVSHFtFR OD UHVSXHVWD GH OD SODQWD HVWi FRQVWLWXLGD SRU XQD VHULH GH HYHQWRV (Q SULPHU OXJDU D WUDYpV GH OD PHPEUDQD SODVPiWLFD VH SURGXFH XQ UiSLGR LQWHUFDPELR GH LRQHV con el medio extracelular. De esta forma, se incrementa la concentracin intracelular de H y Ca, mientras disminuye la de Cl- \ .. Este LQWHUFDPELR GH LRQHV HV XQ SUHUUHTXLVLWR SDUD OD DFWLYDFLyQ GH ODV SURWHtQ TXLQDVDV DFWLYDGDV SRU PLWyJHQRV 0$3. mitogen-activating protein kinase \ GH OD JHQHUDFLyQ GH HVSHFLHV GH oxgeno reactivas (ROS; reactive oxygen species) a travs de una NAD(P)H oxidasa asociaGD D PHPEUDQD 8QD YH] DFWLYDGDV ODV 0$3. algunas son traslocadas al ncleo y otras son UiSLGDPHQWH IRVIRULODGDV \ GHVIRVIRULODGDV )LQDOPHQWH VH SURGXFH OD LQGXFFLyQ WUDQVFULSFLRnal de un considerable nmero de genes en la FpOXOD YHJHWDO HQWUH HOORV ORV GH ODV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV D OD SDWRJHQLFLGDG 35 pathogenicity related proteins) y los genes involucrados HQ OD ELRVtQWHVLV GH WRDOH[LQDV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV OLSRItOLFRV GH EDMR SHVR PROHFXODU y con actividad antimicrobiana). Estrategias biotecnolgicas para la obtencin de plantas resistentes a EDFWHULDV WRSDWyJHQDV - Interferencia con los factores de virulencia 8QR GH ORV FDPLQRV HPSOHDGRV SDUD QHXWUDOL]DU SDWyJHQRV EDFWHULDQRV HV OD DOWHUDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ GH VXV IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD FRQtrolados a travs del mecanismo de qurum sensing (estrategia de qurum quenching, QQ,
Figura 3). Consiste en interferir en la comunicacin entre bacterias a nivel de la generacin GH OD VHxDO SRU HMHPSOR OD LQKLELFLyQ GH OD VtQtesis, la transferencia de estas molculas seal R GH VXV SUHFXUVRUHV 2WURV QLYHOHV GH LQWHUIHUHQFLD VRQ HO WUDQVSRUWH \ OD UHFHSFLyQ GH OD VHal. Estrategias alternativas se relacionan con la degradacin de las acil-HSL o con la utilizaFLyQ GH PROpFXODV TXH ODV LPLWDQ SURYHQLHQWHV GH PLFURRUJDQLVPRV R SODQWDV $OJXQRV GH HVWRV FRPSXHVWRV KDQ VLGR UHFLHQWHPHQWH FDUDFWHUL]DGRV SRU HMHPSOR ODV IXUDQRQDV TXH VRQ PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV SURGXFLGRV SRU HO DOJD roja Delinea pulcra \ TXH SUHVHQWDQ XQD DOWD homologa estructural con las HSLs. 3RU RWUD SDUWH VH KDQ LGHQWLFDGR GLVWLQWDV HVSHFLHV GHO JpQHUR Bacillus como fuente imSRUWDQWH GH JHQHV TXH FRGLFDQ HQ]LPDV FDSDFHV GH GHJUDGDU IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD R PROpFXODV TXH DFW~DQ HQ VX UHJXODFLyQ SRU HMHPSOR HQ]LPDV FDSDFHV GH GHJUDGDU SROtPHURV
EDFWHULDQRV $Vt DOJXQDV FHSDV GH B. subtilis SURGXFHQ HQ]LPDV TXH GHJUDGDQ HO [DQWDQR SROLVDFiULGR SURGXFLGR SRU WRGDV ODV EDFWHULDV del gnero Xanthomonas. $GHPiV VH KDQ LGHQWLFDGR RWUDV HVSHFLHV del gnero Bacillus TXH SURGXFHQ DFLOKRPRVHrina lactonasas (acil-HSLasa). Estas enzimas inactivan las HSLs mediante la hidrlisis de su HQODFH ODFWRQD 'LYHUVDV FHSDV GH Bacillus, mediante el gen aiiA, sintetizan acil-HSLasa. (VWH JHQ VH H[SUHVy HQ SODQWDV GH Nicotiana tabacum y Solanum tuberosum y se evalu su efecto en ensayos de infeccin con Erwinia carotovora $ SDUWLU GH LQRFXODFLRQHV GH KRMDV GH WDEDFR \ WXEpUFXORV GH SDSD FRQ HVWD EDFWHULD se observ TXH OD H[SUHVLyQ GH OD HQ]LPD LQWHUIHUtD FRQ OD SDWRJHQLFLGDG LQFUHPHQWDQGR OD resistencia vegetal a la infeccin. Otra estrategia, enfocada a la alteracin GH OD H[SUHVLyQ GH ORV IDFWRUHV GH YLUXOHQFLD consisti en la introduccin del gen expI de E.
Figura 3. Quorum quenching. 'LIHUHQWHV HVWUDWHJLDV SXHGHQ XWLOL]DUVH SDUD LQWHUIHULU OD FRPXQLFDFLyQ HQWUH FpOXODV EDFWHULDQDV ([LVWHQ GLIHUHQWHV PHFDQLVPRV TXH DIHFWDQ OD UHJXODFLyQ SRU DFLO+6/ ([LVWHQ PHFDQLVPRV ELRTXtPLFRV TXH LQWHUHUHQ HQ OD FRPXQLFDFLyQ HQWUH EDFWHULDV D QLYHO GH OD JHQHUDFLyQ GH OD VHxDO SRU HMHPSOR OD LQKLELFLyQ GH OD VtQWHVLV R GH OD WUDQVIHUHQFLD GH HVWDV PROpFXODV VHxDO R GH VXV SUHFXUVRUHV ([LVWHQ DGHPiV SRVLEOHV LQWHUIHUHQFLDV HQ HO WUDQVSRUWH \ HQ OD UHFHSFLyQ GH OD VHxDO 2WUDV estrategias de interferencia a la comunicacin entre clulas bacterianas se relacionan con la degradacin GH ODV DFLO+6/ $OJXQRV PLFURRUJDQLVPRV VRQ FDSDFHV GH VLQWHWL]DU FRPSXHVWRV TXH LPLWDQ D ODV DFLO+6/ FRQ HO REMHWR GH LQWHUIHULU OD FRPXQLFDFLyQ HQWUH RWUDV HVSHFLHV \ FRPSHWLU FRQ HOODV SRU QLFKRV HFROyJLFRV
carotovora (VWH JHQ TXH FRGLFD OD HQ]LPD UHVSRQVDEOH GH OD VtQWHVLV GH R[RDFLOKRPRVHULQD ODFWRQD 2+/V VH LQWURGXMR HQ SODQWDV de Nicotiana tabacum /D SUHVHQFLD GH 2+/V HQ OD SODQWD DO LQLFLR GHO FXUVR GH OD LQIHFFLyQ EDFWHULDQD LQGXMR OD H[SUHVLyQ WHPSUDQD GH JHQHV GH YLUXOHQFLD GHO SDWyJHQR (VWD H[SUHVLyQ WHPSUDQD GHVHQFDGHQR XQD UHVSXHVWD UiSLGD GH GHIHQVD TXH OH SHUPLWLy FRQWUDUUHVWDU OD LQfeccin. - Introduccin de genes de resistencia Uno de los casos mas exitosos en el control de enfermedades bacterianas es el del tizn EDFWHULDQR GHO DUUR] FDXVDGR SRU Xanthomonas oryzae SY oryzae (Q HVWH SDWRVLVWHPD HO HVWXGLR GH OD LQWHUDFFLyQ SDWyJHQRKRVSHGDGRU SHUPLWLy GHVDUUROODU XQD HVWUDWHJLD SDUD FRPELQDU JHQHV HVSHFtFRV GH PDQHUD GH REWHQHU una resistencia duradera. El Xa21 HV HO SULPHU gen de resistencia de arroz caracterizado. La SURWHtQD FRGLFDGD SRU HVWH JHQ SRVHH XQ GRPLQLR GH VHULQDWUHRQLQD TXLQDVD \ HV FDSD] de autofosforilarse en varios sitios en el curso GH XQD LQWHUDFFLyQ LQFRPSDWLEOH ;D FRQHUH resistencia a la mayora de las razas de Xanthomonas oryzae SY oryzae (Xoo). Otro de los genes de resistencia, aislados de arroz y que FRQHUH UHVLVWHQFLD D Xanthomonas oryzae SY oryzae, es el gen Xa26. Si bien ambos genes FRGLFDQ SURWHtQDV PX\ VLPLODUHV HO Xa26 conHUH UHVLVWHQFLD WDQWR HQ SODQWDV MyYHQHV FRPR adultas; mientras que Xa21 slo tiene efecto HQ SODQWDV DGXOWDV OR TXH VXJLHUH TXH HVWDUtD UHJXODGR SRU JHQHV LQYROXFUDGRV GXUDQWH HO GHVDUUROOR GH OD SODQWD (VWD WiFWLFD GH PDQLSXODFLyQ \ H[SUHVLyQ GH JHQHV 5 HV OD PiV XWLOL]DGD tanto en mejoramiento clsico como con transgnicos. El descubrimiento de genes R en diferentes cultivos como cebada, maz y tomate se ha acelerado notablemente debido al desarrollo GH ODV WpFQLFDV GH PDSHR DLVODPLHQWR \ VHcuenciacin. Son interesantes las similitudes KDOODGDV HQ OD HVWUXFWXUD GH ODV SURWHtQDV 5 HQ HVSHFLHV GH SODQWDV PRQR \ GLFRWLOHGyQHDV lo que evidencia que los sistemas defensivos han sido conservados durante la evolucin \ GLYHUVLFDFLyQ GH ODV SODQWDV /RV JHQHV R PiV FRPXQHV FRGLFDQ SURWHtQDV LQWUDFHOX-
lares con dominios de unin de nucletidos y VHFXHQFLDV UHSHWLGDV ULFDV HQ OHXFLQDV 1% LRR; nucleotide-binding/leucine-rich repeat) y con un dominio N-terminal variable, donde se observan motivos TIR (Toll-like receptor) o CC (coiled coil). 8Q HMHPSOR GH H[SUHVLyQ KHWHUyORJD GH XQ gen R es la introduccin del gen Bs2 GH SLPLHQWR HQ SODQWDV GH WRPDWH 'LFKR JHQ FRQHUH UHVLVWHQFLD D FHSDV GH Xanthomonas campestris SY vesicatoria (Xcv) que contienen el gen de avirulencia avrBS2. Dado que diverVDV SDWRYDULHGDGHV GH X. campestris SRVHHQ el gen avrBS2, se estima que el gen Bs2 de SLPLHQWR SRGUtD FRQIHULU UHVLVWHQFLD HVWDEOH D FDPSR D RWUDV HVSHFLHV GH SODQWDV 6H REWXYLHURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WRPDWH TXH H[SUHVDEDQ HO JHQ GH UHVLVWHQFLD BS2. Para deWHUPLQDU HO HIHFWR GH OD H[SUHVLyQ GHO JHQ, se PLGLy HO FUHFLPLHQWR GH FHSDV LVRJpQLFDV GH X. campestris SY vesicatoria conteniendo o no el gen de avirulencia avrBS2. 6H LQRFXODURQ SODQtas de tomate transgnicas y no transgnicas FRQ DPEDV FHSDV 6yOR VH REVHUYy UHVLVWHQFLD HQ DTXHOOD SODQWD WUDQVJpQLFD BS2 inoculada FRQ ODV EDFWHULDV TXH SRUWDEDQ HO JHQ avrBS2. - Expresin de genes antimicrobianos de diverso origen Pptidos antimicrobianos: (QWUH ORV FRPSXHVWRV DQWLEDFWHULDQRV PiV GLIXQGLGRV \ GH PD\RU HVSHFWUR GH DFFLyQ VH HQFXHQWUDQ ORV SpSWLGRV DQWLPLFURELDQRV /D DPSOLD GLVWULEXFLyQ GH HVWH WLSR GH PROpFXODV en los reinos animal y vegetal sugiere que han FXPSOLGR XQ URO IXQGDPHQWDO HQ OD HYROXFLyQ GH HVWRV RUJDQLVPRV PXOWLFHOXODUHV FRPSOHMRV /D PD\RUtD GH ORV SpSWLGRV DQWLPLFURELDQRV SUHVHQWDQ XQD HVWUXFWXUD DQWLSiWLFD HQ IRUPD de D-hlice, en la que diferentes aminocidos FDWLyQLFRV H KLGURIyELFRV VH RUJDQL]DQ HVSDcialmente en sectores discretos de la molcuOD /RV SpSWLGRV OLQHDOHV FRPR OD FHFURSLQD \ OD PDJDLQLQD VyOR DGRSWDQ HVWD FRQIRUPDFLyQ una vez que se insertan en la membrana. /RV SpSWLGRV DQWLPLFURELDQRV DFW~DQ IUHQWH D ORV PLFURRUJDQLVPRV HQ IRUPD HVSHFtFD /D EDVH GH HVWD HVSHFLFLGDG HVWi GHWHUPLQDGD SRU OD QDWXUDOH]D GLIHUHQFLDO GH OD PHPEUDQD
de las clulas bacterianas y las clulas animales o vegetales. En las bacterias, la membrana se organiza de forma tal que la gran mayora GH IRVIROtSLGRV FRQ FDUJD QHJDWLYD SHUPDQHFH H[SXHVWD DO PHGLR H[WHUQR (Q HO FDVR GH ODV FpOXODV GH PDPtIHURV \ GH SODQWDV OD PHPEUDQD SUHVHQWD VyOR OtSLGRV VLQ FDUJD QHWD KDFLD HO H[WHULRU PLHQWUDV TXH RV OtSLGRV FRQ FDUJD QHJDWLYD VH GLVSRQHQ KDFLD HO LQWHULRU GH OD FpOXOD HV GHFLU KDFLD HO FLWRSODVPD 3RU HVWD UD]yQ ORV SpSWLGRV FRQ FDUJD SRVLWLYD VH XQHQ HOHFWURVWiWLFDPHQWH FRQ ORV OtSLGRV GH FDUJD QHJDWLYD SUHVHQWHV HQ OD FDUD H[WHUQD GH OD PHPEUDQD EDFWHULDQD SHUR QR LQWHUDFW~DQ FRQ ORV OtSLGRV TXH FRQVWLWX\HQ ODV PHPEUDQDV GH ODV FpOXODV VXSHULRUHV (O PRGHOR 6KDL0DWVX]DNL +XDQJ )LJXUD JUDFD HO PHFDQLVPR GH DFFLyQ GH ORV SpSWLGRV DQWLPLFURELDQRV 6H KDQ H[SUHVDGR HQ SODQWDV GLIHUHQWHV WLSRV GH SpSWLGRV DQWLPLFURELDQRV (QWUH HOORV OD VDUFRWR[LQD TXH HV XQ SpSWLGR DLVODGR RULJLQDOPHQWH D SDUWLU GH OD KHPROLQID GH ODUYDV GH
Sarcophaga peregrina SRU XQ JUXSR GH FLHQWtFRV GH OD 8QLYHUVLGDG GH 7RNLR -DSyQ (VWH SpSWLGR SRVHH DPLQRiFLGRV \ SHUWHQHFH DO JUXSR GH ODV FHFURSLQDV FRQ DFWLYLGDG OtWLFD \ antibacteriana contra muchas bacterias GramSRVLWLYDV \ QHJDWLYDV (Q HVWXGLRV in vitro, la VDUFRWR[LQD KD UHVXOWDGR DOWDPHQWH HFLHQWH HQ la inhibicin del crecimiento de algunas bacteULDV WRSDWyJHQDV WDOHV FRPR Xanthomonas axonopodis SY citri. 6H KD FRPSUREDGR TXH OD H[SUHVLyQ GH VDUFRWR[LQD HQ SODQWDV GH WDEDFR EDMR HO FRQWURO GH XQ SURPRWRU FRQVWLWXWLYR DXPHQWD OD UHVLVWHQFLD GH HVWDV SODQWDV D GRV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV Pseudomonas syringae SY tabaci y Erwinia carotovora VXEVS carotovora. Expresin de enzimas lticas del tipo lisozimas: Estas enzimas catalizan la hidrlisis de la PXUHtQD XQ FRQVWLWX\HQWH GH OD SDUHG FHOXODU bacteriana. Las lisozimas se localizan en las
)LJXUD 0RGHOR GH 6KDL0DWVX]DNL+XDQJ 6H UHSUHVHQWD XQ SpSWLGR FRQ VX HVWUXFWXUD HQ D-hlice. A: UHFRQRFLPLHQWR GH OD PHPEUDQD EDFWHULDQD SRU SDUWH GH ORV SpSWLGRV % LQVHUFLyQ GHO SpSWLGR D OD PHPEUDQD PHGLDGD SRU OD DWUDFFLyQ HOHFWURVWiWLFD GH FDUJDV DGHOJD]DPLHQWR GH OD FDSD H[WHUQD GH OD PHPEUDQD VH JHQHUDQ WHQVLRQHV HQ OD ELFDSD HFKDV & IRUPDFLyQ GH SRURV HQ OD PHPEUDQD ' WUDQVSRUWH GH SpSWLGRV \ OtSLGRV D OD FDSD LQWHUQD GH OD PHPEUDQD ( DFFLyQ GH ORV SpSWLGRV VREUH EODQFRV LQWUDFHOXODUHV HQ DOJXQRV FDVRV ) FRODSVR GH OD PHPEUDQD EDFWHULDQD \ UXSWXUD GH OD FpOXOD /RV OtSLGRV UHSUHVHQWDGRV HQ DPDULOOR SRVHHQ FDUJD QHJDWLYD /RV OtSLGRV UHSUHVHQWDGRV HQ QHJUR QR SRVHHQ FDUJD QHWD
YDFXRODV GH QXPHURVDV HVSHFLHV YHJHWDOHV SRU OR TXH HQWUDQ HQ FRQWDFWR FRQ ODV EDFWHULDV WRSDWyJHQDV XQD YH] TXH pVWDV KDQ SURGXFLGR OD OLVLV R UXSWXUD GH OD FpOXOD YHJHWDO 3RFDV lisozimas vegetales han sido caracterizadas y FORQDGDV SRU OR TXH VH KDQ EXVFDGR OLVR]LPDV GH RWURV RUtJHQHV SDUD VHU H[SUHVDGDV HQ SODQtas transgnicas, como las del bacterifago T4 (los bacterifagos son virus que infectan a las bacterias) y la del huevo de gallina. El gen de la lisozima del bacterifago T4, uno de los miembros ms activos de esta familia de enzimas EDFWHULROtWLFDV KD VLGR H[SUHVDGR HQ SODQWDV de Solanum tuberosum /DV SODQWDV WUDQVJpQLcas obtenidas fueron infectadas con la bacteria WRSDWyJHQD Erwinia carotovora VXVS atroseptica bajo condiciones de laboratorio e invernFXOR 8VDQGR XQD DOWD SUHVLyQ GH LQIHFFLyQ VH REVHUYy XQD UHGXFFLyQ VLJQLFDWLYD HQ OD PDceracin de los tejidos infectados. Tambin se FRPSUREy TXH OD FDSDFLGDG GH EURWDFLyQ GH ORV WXEpUFXORV WUDQVJpQLFRV GHVDDGRV FRQ HO SDtgeno result sumamente disminuda. Expresin de tioninas: /DV WLRQLQDV VRQ SROLSpSWLGRV ULFRV HQ FLVWHtQDV SUHVHQWHV HQ HO HQGRVSHUPD \ HQ ODV KRMDV GH ORV FHUHDOHV FX\D DFFLyQ QR HVSHFtFD VH EDVD HQ OD SHUPHDELOL]DFLyQ GH ODV PHPEUDnas celulares. &RPR HMHPSOR ODV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV GH WLRQLQDV GH FHEDGD \ WULJR VH WUDQVIRUPDURQ HQ SODQWDV GH WDEDFR 6H VHOHFFLRQDURQ ODV OtQHDV WUDQVIRUPDGDV \ VH ODV GHVDy HQ HQVD\RV GH LQRFXODFLyQ FRQ EDFWHULDV WRSDWyJHnas (Pseudomonas syringae SY tabaci \ P. syringae SY syringae) 6H FRPSUREy TXH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ HO JHQ GH OD WLRQLQD SUHVHQWDEDQ PHQRU SURSRUFLyQ GH OHVLRQHV QHFUyWLFDV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ ODV SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV 6tQWHVLV GH WRDOH[LQDV Entre las estrategias tendientes a increPHQWDU HO VLVWHPD GHIHQVLYR GH ODV SODQWDV VH LQFOX\H OD VtQWHVLV GH WROH[LQDV OR TXH JHQHUDOPHQWH LQYROXFUD OD PRGLFDFLyQ GH YtDV ELRVLQWpWLFDV FRPSOHMDV /DV WRDOH[LQDV VRQ FRPSXHVWRV TXtPLFRV VLQWHWL]DGRV SRU OD SODQWD HQ UHVSXHVWD D XQD LQYDVLyQ PLFURELDQD /D
SULPHUD WRDOH[LQD DLVODGD \ FDUDFWHUL]DGD IXH OD SLVDQWLQD VH DLVOy HQ D SDUWLU GH ODV YDLnas de Pisum sativum 6H WUDWDED GH XQ LVRDYRQRLGH SWHURFDUSDQR /D QDWXUDOH]D TXtPLFD GH ODV WRDOH[LQDV FXEUH SUiFWLFDPHQWH WRGR HO HVSHFWUR TXtPLFR GH ORV SURGXFWRV QDWXUDOHV Recientemente se ha logrado la sntesis consWLWXWLYD GH JOXFyVLGRV GHO LVRDYRQRLGH GDLG]HtQD XQ PLHPEUR GH ODV WRDOH[LQDV GHO WLSR SWHURFDUSDQR HQ FpOXODV GH PDL] D WUDYpV GH OD LQWURGXFFLyQ GH OD HQ]LPD LVRDYRQD VLQWDVD de Glycine max. Lecturas recomendadas:
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V. CAPTULO 8 Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngico en la agricultura
Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Salazar; 1DGLD &KDOIRXQ *DEULHO 9HOOLFFH &DUORV *UHOOHW 3DXOD )LOLSSRQH Alicia Mamani; Marta Ontivero; y Atilio Pedro Castagnaro INTRODUCCIN /D UHODFLyQ HQWUH ODV SODQWDV \ ORV KRQJRV VH remonta a hace alrededor de 400 millones de aos, ya que hay evidencias de que el estableFLPLHQWR GH ODV SULPHUDV SODQWDV VREUH OD VXSHUFLH GH OD WLHUUD IXH IDFLOLWDGR SRU OD LQWHUDFcin con hongos simbiticos. Esta asociacin PHMRUy OD FDSDFLGDG GH OD SODQWD SDUD OD DGTXLVLFLyQ GH QXWULHQWHV \ OH SHUPLWLy VX DGDSWDFLyQ a los cambios del medioambiente. A lo largo de OD HYROXFLyQ OD KDELOLGDG GH ORV KRQJRV SDUD LQIHFWDU D ODV SODQWDV VXUJLy HQ IRUPD UHSHWLGD H LQGHSHQGLHQWH OR TXH GHWHUPLQy HO GHVDUUROOR de una diversidad de estrategias en los hongos WRSDWyJHQRV SDUD HYDGLU ODV GHIHQVDV YHJHWDOHV \ FRPSOHWDU VX FLFOR GH YLGD HQ ODV SODQWDV Durante el desarrollo de la enfermedad se alteUDQ HQ OD SODQWD SURFHVRV UHODFLRQDGRV D OD IRtosntesis, a la absorcin de agua y minerales GHO VXHOR \ VX WUDQVSRUWH DO UHVWR GH OD SODQWD DO FUHFLPLHQWR \ GHVDUUROOR WRGR OR FXDO UHSHUFXWH negativamente en la agricultura. El desarrollo de estrategias biotecnolgicas SDUD HO PDQHMR VRVWHQLEOH WDQWR HQ OR SURGXFWLYR FRPR SDUD OD VDOXG KXPDQD \ DPELHQWDO FRQVLVWH HQ FRPSOHPHQWDU HO PHMRUDPLHQWR JHntico convencional de cultivos vegetales con HO FRQRFLPLHQWR JHQHUDGR SRU OD LQYHVWLJDFLyQ GH ODV LQWHUDFFLRQHV HQWUH KRQJRV \ SODQWDV HQ SDUWLFXODU GH ORV IDFWRUHV UHODFLRQDGRV D OD SDWRJHQLFLGDG HQ KRQJRV \ GH ORV PHFDQLVPRV GH GHIHQVD HQ SODQWDV /D DSOLFDFLyQ GH herramientas desarrolladas recientemente en HO FDPSR GH OD %LRORJtD 0ROHFXODU FRPR ODV WpFQLFDV TXH SHUPLWHQ VHFXHQFLDU JHQRPDV
FRPSOHWRV SRU HMHPSOR OD SLURVHFXHQFLDFLyQ OD SRVLELOLGDG GH HYDOXDU ORV FDPELRV HQ OD H[SUHVLyQ JpQLFD D JUDQ HVFDOD \ HO GHVDUUROOR GH OD ELRLQIRUPiWLFD KD WHQLGR XQ JUDQ LPSDFWR HQ la generacin de estos conocimientos. Otras IXHQWHV TXH DSRUWDQ WDPELpQ DO GHVDUUROOR GH la biotecnologa asociada al mejoramiento gentico vegetal son los marcadores moleculares de inters agronmico que se tratan en otros FDStWXORV GH HVWH OLEUR (Q HVWH FDStWXOR QXHVWUR REMHWLYR HV GDU XQD EUHYH LQWURGXFFLyQ GH ORV SULQFLSDOHV KRQJRV FDXVDQWHV GH HQIHUPHGDGHV GH SODQWDV FXOWLYDGDV GHVFULELU ORV PHFDQLVPRV SRU ORV FXDOHV ORV SDWyJHQRV I~QJLFRV SXHGHQ DFFHGHU D los tejidos vegetales y una vez establecidos en HOORV ODV WiFWLFDV TXH XVDQ SDUD VX QXWULFLyQ Adems se analizan brevemente las reacciones GH GHIHQVD TXH SXHGHQ GHVDUUROODU ODV SODQWDV IUHQWH D HVWH DWDTXH \ QDOPHQWH FRPHQWDU HO DSURYHFKDPLHQWR GH HVWH FRQRFLPLHQWR SDUD generar algunas estrategias biotecnolgicas TXH SHUPLWDQ PHMRUDU OD DJURQRPtD GH ORV FXOWLYRV UHVSHFWR GHO FRQWURO VXVWHQWDEOH R PHMRU GLFKR GHO PDQHMR HFLHQWH \ HFRVLVWpPLFR VH UHHUH D XQ VLVWHPD TXH LQYROXFUD D OD HFRORJtD HQ XQ VHQWLGR DPSOLR GH HQIHUPHGDGHV SURYRFDGDV SRU KRQJRV WRSDWyJHQRV PRINCIPALES HONGOS CAUSANTES DE ENFERMEDADES DE INTERS AGRONMICO 'H ODV LQQXPHUDEOHV HVSHFLHV I~QJLFDV FRQRFLGDV VyOR XQ SHTXHxR Q~PHUR VRQ FDSDFHV GH SURGXFLU HQIHUPHGDGHV HQ SODQWDV (Q OD actualidad, Magnaporthe oryzae es consideraGR HO KRQJR TXH PiV GDxR SURGXFH D OD DJULFXOWXUD PXQGLDO SRUTXH DIHFWD DO DUUR] TXH HV HO FXOWLYR YHJHWDO PiV LPSRUWDQWH GHO SODQHWD (VWH WRSDWyJHQR I~QJLFR FRQMXQWDPHQWH FRQ Ustilago maydis, causante del carbn de la esSLJD GHO PDt] IXHURQ VHOHFFLRQDGRV SRU FRQVRUFLRV LQWHUQDFLRQDOHV SDUD OD VHFXHQFLDFLyQ \ HO HVWXGLR HQ SURIXQGLGDG GH VX JHQRPD FRQ OR que se han conseguido grandes avances en el conocimiento de sus mecanismos de infeccin. /DV GLIHUHQWHV HVSHFLHV GH Colletotrichum TXH SURGXFHQ HQIHUPHGDGHV HQ YDULRV FXOWLYRV de inters con una incidencia severa en la ecoQRPtD OH VLJXHQ HQ LPSRUWDQFLD /RV KRQJRV GH HVWH JpQHUR SURYRFDQ DQWUDFQRVLV HQ FHUHD-
les, legumbres y frutas. Aunque los hongos de HVWDV HVSHFLHV DWDFDQ GLIHUHQWHV WHMLGRV GH OD SODQWD GXUDQWH VX GHVDUUROOR HQ PXFKRV FDVRV HO GDxR VH SURGXFH GHVSXpV GH OD FRVHFKD GHO fruto o del tejido u rgano de consumo, al igual que sucede con hongos del gnero Penicillium. 2WURV SDWyJHQRV I~QJLFRV LPSRUWDQWHV SHUtenecen al gnero Botrytis, causantes de la SRGUHGXPEUH JULV ORV FXDOHV WLHQHQ XQ DPSOLR UDQJR GH KRVSHGHURV DO LJXDO TXH ORV GH ORV gneros Alternaria y Septoria. Estos hongos FDXVDQ GDxRV HQ GLIHUHQWHV FXOWLYRV SRU OD SURGXFFLyQ GH WR[LQDV TXH QDOPHQWH PDWDQ D OD SODQWD \ SXHGHQ DIHFWDU WDPELpQ D ORV FRQVXmidores. Lograr un manejo sostenible de las enfermedades conocidas con el nombre comn de UR\D FX\R DJHQWH HWLROyJLFR SXHGHQ VHU GLVWLQWDV HVSHFLHV GH KRQJRV WRSDWyJHQRV HV FODYH WDPELpQ SDUD PHMRUDU OD DJULFXOWXUD PXQGLDO 3DUD SURIXQGL]DU HQ HO FRQRFLPLHQWR GH ORV KRQJRV WRSDWyJHQRV VH UHFRPLHQGD FRQVXOWDU OD H[WHQVD ELEOLRJUDItD TXH HVWi GLVSRQLEOH HQ Agrios (2004), ya que esta breve enumeracin VyOR SHUVLJXH XQ REMHWLYR LQWURGXFWRULR GH OR TXH VH WUDWDUi D FRQWLQXDFLyQ HQ HVWH FDStWXOR PROCESO DE INFECCION DE PLANTAS POR HONGOS PATOGENOS 3DUD SURGXFLU OD HQIHUPHGDG ORV KRQJRV deben acceder al interior de los tejidos vegeWDOHV SHQHWUDQGR HQ KRMDV WDOORV \ UDtFHV GLUHFWDPHQWH R D WUDYpV GH KHULGDV R DSHUWXUDV QDWXUDOHV FRPR HVWRPDV /DV SDUWHV DpUHDV GH ODV SODQWDV HVWiQ FXELHUWDV SRU XQD FDSD FRQWLQXD IRUPDGD SRU XQ PDWHULDO GH QDWXUDOH]D OLStGLFD GHQRPLQDGD FXWtFXOD /D HVWUXFWXUD \ OD FRPSRVLFLyQ GH HVWD FXELHUWD YDUtDQ VHJ~Q OD SODQWD yUJDQR R HVWDGLR GHO FUHFLPLHQWR SHUR EiVLFDPHQWH HVWi IRUPDGD SRU XQD PDWUL] GH FXWLQD \ FHUDV /RV KRQJRV WRSDWyJHQRV VRQ ORV ~QLFRV TXH SXHGHQ DFFHGHU D ORV QXWULHQWHV YHJHWDOHV D WUDYpV GH OD FXWtFXOD SRU DFFLyQ GH enzimas denominadas cutinasas, que degradan la cutina. (V LPSRUWDQWH WHQHU HQ FXHQWD TXH GH DFXHUGR DO WLSR GH QXWULHQWHV TXH QHFHVLWDQ SDUD FRPSOHWDU VX GHVDUUROOR ORV KRQJRV SDWyJHQRV VH SXHGHQ FODVLFDUVH HQ ELRWURIRV \ QHFURWURfos \ HO KHFKR TXH SHUWHQH]FDQ D XQ WLSR X RWUR determina las caractersticas de sus mecanismos de infeccin. Los biotrofos son aquellos
TXH VH QXWUHQ GH ORV WHMLGRV YLYRV GHO KRVSHdero, mientras que los necrotrofos lo hacen a SDUWLU GH WHMLGRV PXHUWRV 2WURV GHQRPLQDGRV KHPLELRWURIRV VH FRPSRUWDQ FRPR ELRWURIRV \ necrotrofos segn el estadio de su ciclo vital considerado. /DV SDUHGHV GH ODV FpOXODV YHJHWDOHV IRUPDGDV SULQFLSDOPHQWH SRU SROLVDFiULGRV FRPSOHMRV FRPR FHOXORVD KHPLFHOXORVD SHFWLQDV FRPSXHVWRV IHQyOLFRV UHVLVWHQWHV a hidrlisis FRPR OLJQLQD \ HQ PHQRU JUDGR SRU SURWHtQDV GHVHPSHxDQ XQ LPSRUWDQWH URO HQ OD GHIHQVD FRQWUD SDWyJHQRV (VWD EDUUHUD SXHGH VHU VXSHUDGD SRU DOJXQRV KRQJRV JUDFLDV D TXH VHFUHWDQ HQ]LPDV FDSDFHV GH KLGUROL]DU VXV FRPSRQHQWHV SHUPLWLpQGROHV DFFHGHU D ORV WHMLGRV \ HVSDFLRV LQWUDFHOXODUHV 6LQ HPEDUJR DOJXQRV HYHQWRV SUHYLRV D OD SHQHWUDFLyQ KDQ GHPRVWUDGR VHU GH JUDQ LPSRUWDQFLD HQ HO SURceso infectivo, entre los que se encuentra: la DGKHVLyQ GH ORV FRQLGLRV D OD VXSHUFLH GH OD SODQWD HO UHFRQRFLPLHQWR GHO KRVSHGHUR \ OD OLEHUDFLyQ GH ODV VHxDOHV DSURSLDGDV TXH SHUPLWDQ ORV SURFHVRV GH PRUIRJpQHVLV UHODFLRQDGRV al desarrollo del hongo, como se muestra en la Figura 1. (Q JHQHUDO HO SURFHVR GH LQIHFFLyQ GH SODQWDV SRU SDUWH GH KRQJRV WRSDWyJHQRV LQFOX\H XQD VHULH GH HWDSDV FRPXQHV D GLIHUHQWHV HVSHFLHV TXH SXHGHQ UHVXPLUVH HQ ORV VLJXLHQWHV SDVRV DOJXQRV GH ORV FXDOHV SXHGHQ YHUVH HQ HO HVTXHPD PRVWUDGR HQ OD )LJXUD SDUD KRQgos biotrofos (Fig. 1A) y hemibiotrofos en su HWDSD ELRWUyFD )LJ % 1- Unin de las estructuras infectivas fngiFDV D OD VXSHUFLH GH OD SODQWD 2- Germinacin de conidios y formacin de HVWUXFWXUDV GH LQIHFFLyQ HQ ODV SDUWHV DpUHDV GHO KRVSHGHUR 3HQHWUDFLyQ DO KRVSHGHUR 4- Colonizacin de los tejidos vegetales. 1- Unin de las estructuras infectivas I~QJLFDV D OD VXSHUFLH GH OD SODQWD /D DGKHVLyQ GH ORV FRQLGLRV D OD VXSHUFLH GHO KRVSHGHUR HV HO SULPHU SDVR GHO SURFHVR GH LQIHFFLyQ \ HV LQGLVSHQVDEOH SDUD OOHYDU D FDER ODV HWDSDV SRVWHULRUHV GHO GHVDUUROOR /D QDWXUDOH]D TXtPLFD GHO PDWHULDO XVDGR SRU ODV GLVWLQWDV HVSHFLHV I~QJLFDV SDUD OD XQLyQ HV YDULDEOH como lo son tambin las condiciones del medio
Figura 1 (VTXHPD VLPSOLFDGR GH ODV HVWUXFWXUDV LQIHFWLYDV WtSLFDV GH XQ KRQJR SDWyJHQR ELRWUyFR REOLJDGR $ KHPLELRWUyFR HQ OD IDVH ELRWUyFD % \ DOJXQDV GH ODV YtDV GH VHxDOL]DFLyQ DFWLYDGDV 'HVSXpV GH OD DGKHVLyQ GHO FRQLGLR D OD VXSHUFLH GHO WHMLGR YHJHWDO HVWH HPLWH XQ WXER JHUPLQDWLYR 7* TXH FUHFH KDVWD HQFRQWUDU XQD ]RQD GH OD VXSHUFLH GH OD KRMD X RWUR WHMLGR GRQGH VH MD \ GHVDUUROOD HO DSUHVRULR $ SDUWLU GH DOOt VH SURGXFH OD SHQHWUDFLyQ GH OD SDSLOD LQIHFWLYD TXH WHUPLQD HQ RWUD HVWUXFWXUD GHVWLQDGD D OD nutricin del hongo, el haustorio. Nomenclatura: MC, membrana celular; MH, membrana haustorial; MeEH, membrana extrahaustorial; MaEH, matriz extrahaustorial; Avr, factor de avirulencia; Gen R, gen de resisWHQFLD LH WLSR 7,51%6/55 &&1%6/55 355 SDWWHUQ UHFRJQLWLRQ HIIHFWRU R (7, HIIHFWRUWULJJHUHG LPPXQLW\ 0$3. 0DS TXLQDVDV )7 IDFWRUHV WUDQVFULSFLRQDOHV
ambiente que inducen la adhesin. En el caso del hongo causante del tizn del arroz Magnaporthe oryzae, la humedad del ambiente o el roFtR HV QHFHVDULD SDUD OD KLGUDWDFLyQ GHO PXFtOD-
go que se encuentra en el extremo de la conidia TXH VH XQLUi D OD VXSHUFLH GH VX KRVSHGHUR HQ tanto que Blumeria graminis I VS hordei que SURGXFH OD HQIHUPHGDG OODPDGD RtGLR HQ FH-
reales, no requiere un medio hidratado en esta IDVH LQLFLDO SRUTXH ODV HVSRUDV OLEHUDQ FXWLQDVDV TXH PRGLFDQ OD VXSHUFLH GHO KRVSHGHUR \ GH la conidia, tornndolas ms hidrofbicas, favoreciendo la unin entre ambas y el desarrollo SRVWHULRU GHO WXER JHUPLQDWLYR 2- Germinacin de los conidios y formacin de estructuras de infeccin en las partes areas del hospedero. Los estmulos que determinan la germinacin de los conidios son diversos, entre ellos OD HVWLPXODFLyQ SRU FRQWDFWR FRQGLFLRQHV GHO PHGLRDPELHQWH WHPSHUDWXUD \ KXPHGDG \ OD GLVSRQLELOLGDG GH QXWULHQWHV 'XUDQWH HVWH SURFHVR VH SURGXFH PRYLOL]DFLyQ GH FRPSXHVWRV GH UHVHUYD SRODUL]DFLyQ \ ELRVtQWHVLV GH PHPEUDQDV \ SDUHG FHOXODU KDVWD TXH QDOPHQWH HPHUJH HO WXER JHUPLQDWLYR KLID HVSHFLDOL]DGD TXH DYDQ]D SRU XQD FRUWD GLVWDQFLD YHU )LJ$ \ % (O WXER JHUPLQDWLYR FHQVD OD VXSHUFLH GHO KRVSHGHUR \ VL VH SHUFLEHQ ODV VHxDOHV ItVLFDV \ TXtPLFDV DSURSLDGDV VH LQGXFHQ XQD VHULH GH HYHQWRV TXH QDOPHQWH OOHYDUiQ D OD IRUPDFLyQ GHO DSUHVRULR )LJ $ \ % 'H HVWH UHFRQRFLPLHQWR SDUWLFLSDQ GLYHUVDV SURWHtQDV I~QJLFDV FRPR ODV LQWHJULQDV SURWHtQDV WUDQVmembrana que conectan eventos del medio externo con el citoesqueleto, o las hidrofobinas, que intervienen en el desarrollo de estructuras areas y en las interacciones de las hifas FRQ VXSHUFLHV KLGURIyELFDV 3- Penetracin en el hospedero. Para acceder a los nutrientes intracelulares GHO KRVSHGHUR ORV PLFURRUJDQLVPRV SDWyJHQRV GHEHQ OOHJDU DO DSRSODVWR 3DUD FRQVHJXLUOR SXHGHQ SHQHWUDU GLUHFWDPHQWH D WUDYpV GH DSHUWXUDV SUHH[LVWHQWHV FRPR KHULGDV R HVWRPDV R XVDU XQD HVWUDWHJLD VLFRTXtPLFD FRPELQDGD HMHUFLHQGR SUHVLyQ VREUH ODV HVWUXFWXUDV vegetales y secretando enzimas hidrolticas GXUDQWH SHUPLWH HO DQFODMH GH OD KLID LQIHFWLYD \ SRVLELOLWD D VX YH] HO FUHFLPLHQWR \ MDFLyQ GH otro rgano llamado haustorio (ver Fig. 1A). &RORQL]DFLyQ GHO WHMLGR GHO KRVSHGHUR 'HVSXpV GH OD SHQHWUDFLyQ ORV KRQJRV VH GLVHPLQDQ D SDUWLU GHO VLWLR GH LQIHFFLyQ (Q HO caso de hongos biotrofos o hemibiotrofos en OD SULPHUD IDVH GH OD LQIHFFLyQ VH HVWDEOHFH
XQ iUHD HVSHFLDOL]DGD HQ LQWHUFDPELR GH QXtrientes en la zona de contacto con la memEUDQD HQ OD FXDO VH KD GHWHFWDGR OD SUHVHQFLD GH WUDQVSRUWDGRUHV GH KH[RVDV DPLQRiFLGRV \ RWUDV PROpFXODV (VWH WLSR GH LQWHUDFFLyQ HV SRVLEOH GHELGR D TXH FRPR KD VLGR GHPRVWUDdo en Colletotrichum \ RWUDV HVSHFLHV HQ ODV iUHDV GH FRQWDFWR ORV SDWyJHQRV HQPDVFDUDQ ORV FRPSRQHQWHV HVSHFtFRV GH VX SDUHG FHOXODU FRPR TXLWLQD PRGLFiQGRORV TXtPLFDPHQWH \ DVt HYLWDQ VHU UHFRQRFLGRV SRU ORV VLVWHmas de defensa celulares. En el caso de los biotrofos obligados como Blumeria graminis IVS hordei, SDWyJHQR GH OD FHEDGD FXDQGR OD KLID GH LQIHFFLyQ VH SRQH HQ FRQWDFWR FRQ OD PHPEUDQD SODVPiWLFD GH OD FpOXOD GHO KRVSHGHUR VH LQLFLD OD IRUPDFLyQ del haustorio, que es una estructura de nutricin del hongo que se desarrolla en el interior GH XQD FpOXOD HSLGHUPDO SRU LQYDJLQDFLyQ GH OD PHPEUDQD SODVPiWLFD (O KDXVWRULR WLHQH XQD HVWUXFWXUD FRPSOHMD HQ OD TXH DOJXQRV GH ORV FRPSRQHQWHV VH IRUPDQ D SDUWLU GH OD PHPEUDQD FHOXODU GH OD SODQWD OODPDGD PHPEUDQD extrahaustorial (MeEH, Fig. 1A) y otros son SURGXFLGRV SRU HO KRQJR FRPR ORV FRPSRQHQtes de la membrana haustorial (MH, Fig. 1A), matrz extrahaustorial (MaEH, Fig. 1A), etc. A travs de este conjunto de estructuras, el hongo absorbe agua, minerales y otros nutrientes (Catanzariti et al., 2007). En el caso de los hongos hemibiotrofos, esta estructura haustorial no llega a desarrollarse WDQWR DXQTXH FXPSOH FRQ ODV PLVPDV IXQFLRQHV QXWULFLRQDOHV SDUD HO KRQJR )LJ % (Q OD segunda fase de desarrollo en los tejidos del KRVSHGHUR ORV PLFURRUJDQLVPRV KHPLELRWURIRV PRGLFDQ VX PHWDEROLVPR GDQGR OXJDU DO FUHFLPLHQWR GH XQ QXHYR WLSR GH KLID XQD KLID QHFURWUyFD VHFXQGDULD GH PHQRU GLiPHWUR TXH SXHGH DWUDYHVDU OD PHPEUDQD SODVPiWLFD UDPLFDUVH GHQWUR GH OD FpOXOD \ GHVWUXLU SRVWHULRUPHQWH DO KRVSHGHUR Patgenos necrotrofos como Botrytis cinerea GHVSXpV GH GHJUDGDU SRU PHGLR GH HQ]LPDV ODV SDUHGHV FHOXODUHV GHO KRVSHGHUR SURGXFHQ XQD DPSOLD YDULHGDG GH FRPSXHVWRV WRWy[LFRV TXH DIHFWDQ LPSRUWDQWHV SURFHVRV celulares, los que conducen a la degradacin GH FRPSRQHQWHV HVWUXFWXUDOHV \ IXQFLRQDOHV GH
OD FpOXOD GHO KRVSHGHUR ORV TXH OXHJR VRQ XVDGRV SRU HO KRQJR SDUD VX SURSLD QXWULFLyQ RESPUESTAS DE DEFENSA DE LA PLANTA. (Q OD QDWXUDOH]D ODV SODQWDV HVWiQ H[SXHVWDV DO DWDTXH GH RUJDQLVPRV SDWyJHQRV GLYHUsos como virus, bacterias, hongos, insectos y herbvoros, entre otros. Para hacer frente a ellos han desarrollado varios mecanismos de GHIHQVD TXH VH GHVHQFDGHQDQ HVSHFtFDPHQte luego del reconocimiento del atacante, y que GHEHQ VHU UHJXODGRV SDUD PLQLPL]DU ORV HIHFWRV QHJDWLYRV GH HVWD UHVSXHVWD VREUH RWURV SURFHsos de la clula, como el crecimiento. Como se dijo, a medida que invaden los teMLGRV GHO KRVSHGHUR ODV HVWUXFWXUDV LQIHFWLYDV GHO KRQJR VH SRQHQ HQ FRQWDFWR FRQ OD SDUHG celular de las clulas vegetales y secretan una serie de enzimas conocidas como HQ]LPDV GH degradacin de la pared celular que incluyen, como se mencion anteriormente, celulasas, SROLJDODFWXURQDVDV [LODQDVDV \ SURWHLQDVDV )LJ % /RV IUDJPHQWRV GH SDUHG FHOXODU GHULYDGRV GH HVWDV DFWLYLGDGHV HQ]LPiWLFDV SXHGHQ DFWXDU WDPELpQ FRPR HOLFLWRUHV GH OD UHVSXHVta de defensa vegetal, aunque en otros casos OD VXSULPHQ (Q ORV VLWLRV GRQGH VH SURGXFH OD GHJUDGDFLyQ GH OD SDUHG FHOXODU HO KRQJR DFFHGH DO DSRSODVWR \ VX SUHVHQFLD HV SHUFLELGD SRU XQD VHULH GH UHFHSWRUHV TXH VH HQFXHQWUDQ HQ OD PHPEUDQD SODVPiWLFD GHQRPLQDGRV UHFHSWRUHV GH UHFRQRFLPLHQWR GH SDWURQHV R 553V FDSDFHV GH UHFRQRFHU HStWRSHV FRQVHUYDGRV GHQWUR GH PROpFXODV TXH VRQ LPSUHVFLQGLEOHV SDUD OD VXSHUYLYHQFLD GHO SDWyJHQR ODV FXDOHV HQ FRQMXQWR UHFLEHQ HO QRPEUH GH 0$03V SRU ODV VLJODV HQ LQJOpV GH 0LFURELDO $VVRFLDWHG 0ROHFXODU 3DWWHUQV *OD]HEURRN (QWUH estas molculas se encuentra la quitina, consWLWX\HQWH HVSHFtFR GH OD SDUHG FHOXODU GH ORV KRQJRV TXH HV UHFRQRFLGD SRU UHFHSWRUHV 553 TXH SRVHHQ XQ GRPLQLR GHQRPLQDGR /\V0 /D XQLyQ GHO OLJDQGR D HVWRV UHFHSWRUHV GHVHQFDdena una serie de eventos subcelulares que LQGXFHQ QDOPHQWH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV UHODFLRQDGRV D OD GHIHQVD GH OD SODQWD &RPR VHxDO GH OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD GHVHQFDGHQDGD HQ HO KRVSHGHUR LQPHGLDWDPHQWH GHEDMR GHO VLWLR GH IRUPDFLyQ GHO DSUHVRULR VH
REVHUYD XQ UHRUGHQDPLHQWR GH ORV FRPSRQHQWHV GHO FLWRSODVPD \ PLJUDFLyQ GHO Q~FOHR HQ ORV TXH SDUWLFLSDQ FRPSRQHQWHV GHO FLWRHVTXHleto como la DFWLQD )LJ % (O HVSDFLR HQWUH SDUHG FHOXODU \ PHPEUDQD SODVPiWLFD HQ HO VLWLR GH SHQHWUDFLyQ FRPLHQ]D D HQJURVDUVH SRU HO GHSyVLWR GH FDORVD FRPSXHVWRV IHQyOLFRV OLJQLQD FHOXORVD SHFWLQD SURWHtQDV FRPR ODV JOLFRSURWHtQDV ULFDV HQ KLGUR[LSUROLQD \ SHUR[LGDVDV IRUPDGR OD SDSLOD TXH URGHD D OD KLID GH LQIHFFLyQ /D VtQWHVLV GHSRVLFLyQ \ HQVDPEOH GH WRGRV HVWRV PDWHULDOHV HVWi DFRPSDxDGD SRU OD OLEHUDFLyQ GH HVSHFLHV UHDFWLYDV GH R[tgeno (ERO) entre las cuales se encuentra el SHUy[LGR GH KLGUyJHQR /DV (52 GHVHPSHxDran al menos tres funciones en la defensa de OD SODQWD L FUHDQ HO DPELHQWH DSURSLDGR TXH SURPXHYH HO SURFHVR GH OLJQLFDFLyQ \ OD IRUPDFLyQ GH SXHQWHV FUX]DGRV HQWUH UHVLGXRV GH DPLQRiFLGRV GH ODV SURWHtQDV GH OD SDUHG FHOXlar (lo que las torna ms resistentes al ataque GH HQ]LPDV I~QJLFDV LL SRVHHQ WDPELpQ XQD DFFLyQ Wy[LFD GLUHFWD VREUH HO SDWyJHQR IUHQDQdo su crecimiento, y (iii) sirven como molculas VHxDOHV SDUD LQGXFLU OD H[SUHVLyQ GH DOJXQRV genes relacionados a la defensa. A lo largo de la evolucin y como modo de suSHUDU ODV UHVSXHVWDV LQGXFLGDV HQ OD SODQWD ORV KRQJRV WRSDWyJHQRV KDQ HYROXFLRQDGR KDFLD OD SURGXFFLyQ GH XQD VHULH GH PROpFXODV GHQRPLQDGDV HIHFWRUHV I~QJLFRV ODV FXDOHV SXHGHQ actuar a distintos niveles. La naturaleza qumiFD GH HVWRV HIHFWRUHV HV GLYHUVD OR TXH KD GLFXOWDGR VX LGHQWLFDFLyQ /DV SODQWDV UHVLVWHQWHV H[SUHVDQ SURWHtQDV SURGXFWRV GH JHQHV GH resistencia o R )LJ $ FDSDFHV GH GHWHFWDU OD SUHVHQFLD GH HIHFWRUHV IDFWRUHV GH DYLUXOHQcia) y desencadenar eventos relacionados a la transduccin de seales e.g. cascada de MAP TXLQDVDV )LJ % TXH QDOPHQWH DFWLYDQ XQD GHIHQVD HIHFWLYD HQ HVWRV KRVSHGHURV Como consecuencia de esta interaccin, en la clula en contacto con el agente invasor y HQ DTXHOODV TXH OD URGHDQ SXHGH GHVHQFDGHQDUVH OD UHVSXHVWD GH KLSHUVHQVLELOLGDG R +5 TXH FRQVLVWH HQ XQ FRPSOHMR SHUR RUJDQL]DGR mecanismo de suicidio llamado tambin muerWH FHOXODU SURJUDPDGD 3&' DFRPSDxDGR GH OD LQGXFFLyQ GH UHVSXHVWDV GHIHQVLYDV ORFDOHV (LAR: resistenca local adquirida) y sistmicas (SAR: resistencia sistmica adquirida), siendo
estas ltimas efectivas en sitios distantes del GH LQIHFFLyQ /D UHVSXHVWD GH KLSHUVHQVLELOLdad es considerada como uno de los factores PiV LPSRUWDQWHV TXH IUHQD HO GHVDUUROOR GH ORV SDWyJHQRV ELRWURIRV R HQ OD HWDSD ELRWUyFD GH ORV KHPLELRWURIRV LPSLGLHQGR VX DFFHVR D ORV QXWULHQWHV \ FRQQiQGROR DO VLWLR LQLFLDO GH OD LQIHFFLyQ 6LQ HPEDUJR HQ HO FDVR GH SDWyJHQRV QHFURWURIRV FDSDFHV GH SURGXFLU WR[LQDV que inducen la muerte celular, tiene un efecto RSXHVWR \D TXH IDFLOLWD OD FRORQL]DFLyQ GH ODV SODQWDV 'HVSXpV GHO UHFRQRFLPLHQWR GHO SDWyJHQR se activan dos vas de transduccin de seales SULQFLSDOHV XQD GHSHQGLHQWH GH iFLGR VDOLFtOLFR \ OD RWUD TXH GHSHQGH GH HWLOHQR \ iFLGR MDVPyQLFR (Q PXFKRV SXQWRV HVWDV YtDV VH LQWHUFRnectan y modulan, fenmeno conocido como FURVVWDON 'DQJO \ -RQHV *OD]HQEURRN HW DO (Q JHQHUDO \ D PRGR PX\ VLPSOLcado hasta tanto se diluciden los mecanismos involucrados en la llamada resistencia horizonWDO R SROLJpQLFD VH SXHGH DFHSWDU TXH OD UHsistencia a organismos biotrofos se establece a travs de la va de transduccin de seales GHSHQGLHQWH GH iFLGR VDOLFtOLFR HQ WDQWR TXH OD UHVLVWHQFLD D QHFURWURIRV GHSHQGH GH OD YtD GH etileno/cido jasmnico. GENOMICA DE HONGOS PATOGENOS /D VHFXHQFLDFLyQ GH ORV JHQRPDV FRPSOHWRV GH PXFKDV HVSHFLHV I~QJLFDV SHUPLWLy DOJXQRV DYDQFHV HQ HO FRQRFLPLHQWR GH ORV SURFHVRV biolgicos relacionados a los mecanismos de SUROLIHUDFLyQ GH ORV KRQJRV WRSDWyJHQRV HQ ORV WHMLGRV GHO KRVSHGHUR H LQX\y HQ HO GLVHxR GH ODV HVWUDWHJLDV GH LQYHVWLJDFLyQ SDUD WUDWDU GH UHVSRQGHU VREUH DVSHFWRV GH HVWH SURFHVR que an se desconocen. (Q OD DFWXDOLGDG VH KD FRPSOHWDGR OD VHFXHQFLDFLyQ GHO JHQRPD FRPSOHWR GH DOJXQRV KRQJRV FDXVDQWHV GH LPSRUWDQWHV GDxRV HQ cultivos como Magnaporthe oryzae (Dean et DO FDXVDQWH GHO WL]yQ GHO DUUR] Ustilago maydis, y Fusarium, entre otros; el estado de ORV SUR\HFWRV GH VHFXHQFLDFLyQ GH RWURV JHQRPDV I~QJLFRV SXHGH VHU FRQVXOWDGR HQ www. ncbi.nlm.nih.gov. Sin embargo, el anlisis de la gran cantidad GH GDWRV JHQHUDGRV SXHGH WUDQVIRUPDUVH HQ un factor limitante, que requiere la creacin de
mejores herramientas bioinformticas, la conIRUPDFLyQ GH JUXSRV GH LQYHVWLJDFLyQ LQWHUGLVFLSOLQDULRV SDUD GLOXFLGDU OD IXQFLyQ GH ORV QXHYRV JHQHV \ FRPR GHVDItR HQ HO IXWXUR SDUD LQWHJUDU ORV FRQRFLPLHQWRV \ DSOLFDUORV HQ OD DJULFXOWXUD D JUDQ HVFDOD ;X HW DO ESTRATEGIAS BIOTECNOLGICAS 'HVSXpV GH KDEHU SUHVHQWDGR ORV DVSHFWRV PiV VREUHVDOLHQWHV GH ORV SURFHVRV GH LQWHUDFFLyQ HQWUH SODQWDV \ SDWyJHQRV I~QJLFRV HQ HVWD VHFFLyQ VH SUHWHQGH GDU DOJXQDV LGHDV \ HMHPSORV GH LQYHVWLJDFLyQ TXH WLHQGD D LPSOHPHQWDU HVWUDWHJLDV DJUtFRODV SDUD XQ PDQHMR VXVWHQWDEOH \ HFLHQWH GHO HVWUpV ELyWLFR HQ JHQHUDO \ I~QJLFR HQ SDUWLFXODU PLQLPL]DQGR HO LPSDFWR VREUH HO PHGLR DPELHQWH \ OD VDOXG WDQWR GH FRQVXPLGRUHV FRPR GH RSHUDGRUHV GH WRGD la cadena agroindustrial. Se aborda la bsqueda y utilizacin de biocontroladores (bioinducWRUHV \ ELRSHVWLFLGDV SURSLDPHQWH GLFKRV GH origen vegetal y microbiano, la caracterizacin GH JHQHV TXH SXGLHUDQ HVWDU LQYROXFUDGRV HQ OD defensa vegetal y la transferencia de los misPRV SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD 1 - Inductores de la Respuesta de Defensa de Origen Microbiano y Vegetal 8QR GH ORV SURFHVRV QDWXUDOHV TXH VH LQWHQWD DSURYHFKDU SDUD HO GHVDUUROOR GH HVWUDWHJLDV GH FRQWURO GH HQIHUPHGDGHV HV OD FDSDFLGDG TXH WLHQHQ ODV SODQWDV GH GHIHQGHUVH GHO DWDTXH GH SDWyJHQRV &RPR VH KD YLVWR VH VDEH TXH ODV SODQWDV UHDFFLRQDQ DQWH XQ HVWUpV ELyWLFR XWLOL]DQGR GLYHUVRV PHFDQLVPRV TXH VH PDQLHVWDQ FXDQGR VH SRQHQ HQ FRQWDFWR FRQ XQ SDWygeno o con sustancias qumicas derivadas de pVWRV (VWD LQWHUDFFLyQ SXHGH FRQGXFLU D TXH OD SODQWD QR FRQWUDLJD OD HQIHUPHGDG R OR KDJD HQ IRUPD PX\ GpELO VL SHUFLEH D WLHPSR ODV VHxDOHV GHO SDWyJHQR LQGXFWRUHV R HOLFLWRUHV \ ORJUD LQGXFLU XQD UHVSXHVWD GH GHIHQVD SHUR VH enfermar si no logra detectarlas o si lo hace muy tardamente (Dangl y Jones, 2001). En el SULPHU FDVR VH GLFH TXH OD LQWHUDFFLyQ HV GHO WLSR LQFRPSDWLEOH \ HO SDWyJHQR HV DYLUXOHQWR \ HQ HO VHJXQGR VH WUDWD GH XQD LQWHUDFFLyQ FRPSDWLEOH \ HO SDWyJHQR HV YLUXOHQWR Un hecho interesante que es la base de una GH ODV HVWUDWHJLDV GH SURWHFFLyQ SRVLEOHV HV
TXH DOJXQRV SDWyJHQRV SXHGHQ FRPSRUWDUVH FRPR DYLUXOHQWRV FRQ DOJXQRV JHQRWLSRV GH SODQWDV \ FRPR YLUXOHQWRV FRQ RWURV JHQRWLSRV 'LFKR HQ RWUDV SDODEUDV HVWR VLJQLFD TXH SRU DOJXQD UD]yQ HVH SDWyJHQR SXHGH GHVHQFDGHQDU XQD UHVSXHVWD GH GHIHQVD HQ DTXHOORV JHQRWLSRV GH SODQWD GRQGH HVWDEOHFH XQD LQWHUDFFLyQ GHO WLSR LQFRPSDWLEOH /D )LJXUD PXHVWUD D PRGR GH HMHPSOR FRPR DLVODGRV GH KRQJRV SDWyJHQRV GHO JHQHUR Colletotrichum SXHGHQ SUHVHQWDU GLYHUVRV QGLFHV GH 6HYHULGDG ,6 GH OD HQIHUPHGDG DQWUDFQRVLV HQ frutilla, OR TXH SRQH HQ HYLGHQFLD OD H[LVWHQFLD GH SDWRWLSRV WLSRV R JHQRWLSRV SDWRJpQLFRV Hay cultivares de frutilla que se muestran muy UHVLVWHQWHV SDUD DOJXQRV SDWRWLSRV ,6 PLHQWUDV TXH VRQ PX\ VXVFHSWLEOHV SDUD RWURV DLVODGRV GHO SDWyJHQR ,6 YHU FRPR HMHPSOR DO FXOWLYDU 3iMDUR TXH SUHVHQWD JUDQ resistencia al aislado SS71 mientras que es alWDPHQWH VXVFHSWLEOH DO DLVODGR 0 (VWH UHVXOWDGR VXJLHUH TXH FXDQGR ODV SODQWDV VRQ H[SXHVWDV D XQ SDWyJHQR TXH VH FRPSRUWD FRPR DYLUXOHQWR HV GHFLU TXH HVWDEOHFH
XQD LQWHUDFFLyQ GHO WLSR LQFRPSDWLEOH QR VH HQIHUPDQ R OR KDFHQ HQ PHQRU JUDGR SRUTXH que estos aislados inducen una serie de reacFLRQHV VLROyJLFDV TXH FRQGXFHQ DO GHVDUUROOR GH XQD UHVSXHVWD GH GHIHQVD (VWXGLRV SRVWHULRUHV FRQUPDURQ HVWD KLSyWHVLV GHPRVWUDQGR que el efecto observado se debe efectivamenWH D OD LQGXFFLyQ GH XQD YHUGDGHUD UHVSXHVWD GH GHIHQVD GH OD SODQWD 6DOD]DU HW DO (VWH IHQyPHQR QRV SHUPLWH LPDJLQDU TXH VHUtD SRVLEOH XWLOL]DU HVWH WLSR GH LQWHUDFFLRQHV HQWUH SODQWDV \ PLFURRUJDQLVPRV SDUD GHVDUUROODU estrategias alternativas a las convencionales, SDUD FRQWURODU OD LQFLGHQFLD GH HQIHUPHGDGHV fngicas. Sin embargo, si bien lo antedicho es FLHUWR SDUD LQWHQWDU XQD DSOLFDFLyQ GLUHFWD WLHQHQ TXH VHU VXSHUDGR DOJXQRV LQFRQYHQLHQWHV que se discuten a continuacin. /D GHELOLGDG GH HVWD DSUR[LPDFLyQ UDGLFD HQ TXH HQ ORV FDPSRV GRQGH VH UHDOL]D HO FXOWLYR muchas veces los agricultores no utilizan una nica lnea gentica del cultivo (cultivar o vaULHGDG QL HO FXOWLYDU HVSHFtFR SDUD HO FXDO HO ELRFRQWURODGRU SDWyJHQR DYLUXOHQWR HV HIHFWL-
IS frente a Colletotrichum
4
LFC1-05 F7
3
LFC3-05 TPS1-05
2
SS71 L9
1
M11 MP3
0 1 2 3 4 5
Cultivares de frutilla
Figura 2 6XVFHSWLELOLGDG GH FLQFR FXOWLYDUHV GH IUXWLOOD D RFKR DLVODGRV GLIHUHQWHV GH Colletotrichum VS /D VXVFHSWLELOLGDG HV HYDOXDGD SRU HO ,QGLFH GH 6HYHULGDG ,6 XWLOL]DQGR XQD HVFDOD GH D VLHQGR PX\ UHVLVWHQWH \ PX\ VXVFHSWLEOH
vo. Esta condicin hace que la utilizacin de HVH IDFWRU ELyWLFR SDUD LQGXFLU OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD DXQTXH VHD DYLUXOHQWR \ HIHFWLYR SDUD XQD YDULHGDG HQ SDUWLFXODU SXHGH VHU FDSD] GH SURGXFLU HQIHUPHGDG HQ RWUR FXOWLYDU SURYRcando efectos no deseados en el cultivo. 3DUD VROXFLRQDU HVWH LQFRQYHQLHQWH VH SURSXVR OD XWLOL]DFLyQ GH SDWyJHQRV PXHUWRV R LQDFWLYDGRV TXH FRQVHUYHQ OD FDSDFLGDG GH LQGXFLU OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD HQ HO YHJHWDO R H[WUDFWRV SURYHQLHQWHV GH HVWRV PLFURRUJDQLVPRV LQDFWLYDGRV GH RWURV QR SDWyJHQRV TXH FRQWHQJDQ HOLFLWRUHV GH OD GHIHQVD PDQWHQJDQ HO SRGHU LQGXFWRU R OD XWLOL]DFLyQ GLUHFWD GH FRPSXHVWRV YHJHWDOHV FDSDFHV GH LQWHUPHGLDU R GH DFtuar como inductores naturales de la defensa LQQDWD GH ODV SODQWDV Como se muestra en la Figura 3, se investig OD FDSDFLGDG GH H[WUDFWRV HVWpULOHV GH XQ SDWyJHQR GH IUXWLOOD SDUD LQGXFLU XQD UHVSXHVWD GH
GHIHQVD HQ SODQWDV VXVFHSWLEOHV GH IUXWLOOD 6H SXGR SUREDU TXH OD IUDFFLyQ SDUWLFXODGD (& y soluble (sobrenadante, SN) de extractos de conidios obtenidos del aislado avirulento (M23) del hongo Colletotrichum fragariae, mostraURQ FDSDFLGDG GH LQGXFLU OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD HQ SODQWDV VDQDV GH IUXWLOOD FXDQGR VRQ DSOLFDGRV HQ IRUPD SUHYLD D OD LQIHFFLyQ FRQ XQ SDWyJHQR YLUXOHQWR GH C. acutatum, y que OD SURWHFFLyQ DGTXLULGD SRGUtD SHUGXUDU HQ HO WLHPSR YHU )LJ (& (& 61 \ 61 Los 5HVXOWDGRV PRVWUDURQ TXH SODQWDV WUDWDGDV GH HVWH PRGR QR PDQLHVWDQ VtQWRPDV GH OD HQIHUPHGDG D~Q KDVWD GtDV SRVWHULRU D OD LQIHFFLyQ YHU )LJ (& \ 61 '65 1) y que ese efecto, del mismo modo que el SURGXFLGR SRU HO KRQJR DFWLYR VH GHEtD D OD LQGXFFLyQ GH XQD UHVSXHVWD GH GHIHQVD GH OD SODQWD &KDOIRXQ HW DO 'HVGH HO SXQWR GH YLVWD WHFQROyJLFR VH SR-
5 4
Figura 3
3 2 1 0 EC 3 EC SN 2 SN C1 C2 Ctr. Prot. Cruz. Ctr.(+) C.acut.
9 dpi 30 dpi 50 dpi
Tratamientos
Figura 3 (YROXFLyQ GH OD HQIHUPHGDG HYDOXDGD FRPR ,6 tQGLFH GH VHYHULGDG D ORV \ GSL GtDV SRVWHULRUHV D OD LQIHFFLyQ FRQ XQ DLVODGR YLUXOHQWR GH C. acutatum GH SODQWDV GH IUXWLOOD GHO FXOWLYDU 3iMDUR SUHWUDWDGDV FRQ (& H[WUDFWR HVWpULO GH FRQLGLRV GHO DLVODGR DYLUXOHQWR 0 GH Colletotrichum VS 61 VRbrenadante estril de un cultivo del aislado avirulento M23 de Colletotrichum VS & FRQLGLRV DFWLYRV GHO aislado avirulento M23 de Colletotrichum VS & DJXD GHVWLODGD HVWpULO /D VXVFHSWLELOLGDG HV HYDOXDGD SRU HO ,QGLFH GH 6HYHULGDG ,6 XWLOL]DQGR XQD HVFDOD GH D VLHQGR PX\ UHVLVWHQWH \ PX\ VXVFHSWLEOH
GUtD HVSHUDU TXH OD XWLOL]DFLyQ GH HVWRV H[WUDFWRV I~QJLFRV VROXFLRQH HO SUREOHPD PHQFLRQDdo arriba referido a la inconveniencia de usar SDWyJHQRV YLYRV SDUD HO GHVDUUROOR GH ELRFRQtroladores. Sin embargo, esta nueva estrateJLD WDPELpQ SXHGH FRQOOHYDU DVSHFWRV QR WDQ ventajosos que deben tenerse en cuenta antes de intentar su utilizacin directa como agente GH ELRFRQWURO /RV LQFRQYHQLHQWHV SUHYLVLEOHV VH UHHUHQ DO JUDGR GH HVSHFLFLGDG TXH SXHden tener estos inductores con el cultivar utili]DGR HV GHFLU GHO HVSHFWUR YDULHWDO GH DFFLyQ /R LGHDO VHUtD TXH SRU XQD VLPSOH FXHVWLyQ GH amortizaciones y costos, el efecto inductor fuera efectivo en muchas variedades de frutilla y an mejor, en otros cultivos vegetales. Dicho de RWUD PDQHUD TXH HVWRV H[WUDFWRV SXHGHQ VHUYLU SDUD SURWHJHU RWUDV YDULHGDGHV X RWUDV HVSHFLHV DJUtFRODV GH VXV SDWyJHQRV PiV DJUHVLvos. En este sentido, es recomendable realizar HQVD\RV FRQ RWURV FXOWLYDUHV \ HVSHFLHV YHJHWDOHV SDUD FRPSUREDU HO JUDGR GH HVSHFLFLGDG TXH SXHGD PDQLIHVWDU HVWH WLSR GH HOLFLWRUHV \D TXH VL VH DQDOL]D HO RULJHQ GH HVH LQGXFWRU VH SRGUtD SHQVDU TXH VH WUDWD GH XQD SURWHtQD GHO WLSR $YU SURWHtQDV GHO SDWyJHQR TXH LQWHUDFFLRQDQ HVSHFtFDPHQWH FRQ SURGXFWRV GH JHQHV de resistencia R \ SRU OR WDQWR WHQHU HIHFWR ~QLFDPHQWH VL VRQ UHFRQRFLGDV SRU ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU XQ JHQ R HVSHFtFR GH OD SODQWD 'DWWD \ 0XWKXNULVKQDQ (VWD ~Otima aseveracin se sustenta en la teora del UHFRQRFLPLHQWR JHQDJHQ SURSXHVWD SRU GH )ORU \D HQ SRU OR TXH GHEHUtDPRV HVSHUDU XQD UHVSXHVWD PX\ HVSHFtFD HV GHFLU UHVWULQJLGD D XQD HVSHFLH H LQFOXVLYH XQ FXOWLYDU determinado de la misma. En caso de ser cierWD HVWD KLSyWHVLV GHEHUtDPRV HVSHUDU XQ UDQJR GH DFFLyQ PX\ UHGXFLGR GH HVWRV H[WUDFWRV SRU OR TXH OD DSOLFDFLyQ GH HVWD HVWUDWHJLD TXHGDUtD UHGXFLGD D XQ Q~PHUR SHTXHxR GH JHQRWLSRV GH XQD HVSHFLH YHJHWDO (Q HVWRV FDVRV KDEUtD TXH SHQVDU HQ RWUD DSUR[LPDFLyQ WHFQROyJLFD TXH SHUPLWD XQ XVR PiV DPSOLR GH ORV HOLFLWRUHV GH GHIHQVD (Q ese sentido, se estn investigando otros comSXHVWRV GH RULJHQ QDWXUDO FRQ UHVXOWDGRV LQWHresantes, algunos de los cuales son extractos LQDFWLYRV R SURWHtQDV SXULFDGDV GH PLFURRUJDQLVPRV FRPR HO KDUSLQ TXH HV XQD HV
XQD SURWHtQD GHULYDGD GH OD EDFWHULD Erwinia amylovora con actividad elicitora de la defenVD R PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV QR SURWHLFRV GH SODQWDV )LOLSSRQH HW DO 6H GHEHUtD HVSHUDU TXH HO PHFDQLVPR GH LQGXFFLyQ GH OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD XWLOL]DGR SRU HVWRV SURGXFWRV R FRPSXHVWRV VHD PHQRV UHVWULQJLGR DO estar ms conservado en el reino vegetal, lo TXH SHUPLWLUtD SUHYHU XQ UDQJR GH DFFLyQ H[tendido no slo a otras variedades comerciales GH IUXWLOOD VLQR D RWUDV HVSHFLHV FXOWLYDGDV 5HVXOWDGRV SUHOLPLQDUHV REWHQLGRV QRV SHUPLWHQ DEULJDU HVSHUDQ]DV HQ HVWD GLUHFFLyQ Todos estos resultados, nos hacen entrever XQ IXWXUR PX\ SURPLVRULR HQ ODV LQYHVWLJDFLRQHV RULHQWDGDV D OD H[WUDFFLyQ SXULFDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH PROpFXODV FRQ FDSDFLGDG GH LQGXFLU OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD GH ODV SODQtas, ya sean de origen vegetal o microbiano, SDUD OD IRUPXODFLyQ GH ELRLQGXFWRUHV GH DPSOLR HVSHFWUR FDSDFHV GH WHQHU DFWLYLGDG VREUH GLferentes variedades de distintos cultivos. 8WLOL]DFLyQ GH *HQHV 3RWHQFLDOPHQWH Involucrados en la Respuesta Defensiva 2WUD HVWUDWHJLD SRVLEOH FRQVLVWH HQ XWLOL]DU genes involucrados en la defensa vegetal, TXH SXGLHUDQ FRQIHULU UHVLVWHQFLD WRWDO R DO PHQRV XQ LQFUHPHQWR SDUFLDO GH OD UHVLVWHQFLD HQ SODQWDV GH LQWHUpV (VWR GHEHUtD ORJUDUVH SRU H[SUHVLyQ KRPyORJD e.g. cuando el gen que VH LQWURGXFH SRU YtD QR VH[XDO SURYLHQH GH OD PLVPD HVSHFLH R KHWHUyORJD e.g. cuando el JHQ SURYLHQH GH XQD HVSHFLH GLVWLQWD D OD TXH se est transformando), utilizando herramientas de ingeniera gentica. En estos casos, SDUD LQFUHPHQWDU ODV H[SHFWDWLYDV GH p[LWR GH esta estrategia, se suelen elegir variedades de DOWR SRWHQFLDO SURGXFWLYR SHUR VXVFHSWLEOHV D ODV SULQFLSDOHV HQIHUPHGDGHV /D SUHJXQWD TXH VXUJH HV TXp WLSR GH JHQHV FRQYHQGUtD FRQVLGHUDU \ HVD SUHJXQWD QR WLHQH XQD UHVSXHVWD WULYLDO \ HV PX\ GHSHQGLHQWH GH OD HVSHFLH GH LQWHUpV \ OD LQIRUPDFLyQ GLVSRQLEOH VREUH ORV JHQHV TXH PXHVWUHQ DOJ~Q YDORU SRWHQFLDO A grandes rasgos y hasta tanto se diluciden los mecanismos involucrados en la resistencia SROLJpQLFD X KRUL]RQWDO R VH GLVSRQJD GH PpWRGRV SDUD FORQDU DLVODU H LQWURGXFLU JUDQGHV SRUFLRQHV FURPRVyPLFD SRU XQD YtD QR VH[XDO
A
CMv35s
Construccin utilizada: pHCHI
ch5B
tnos
Pnos
nptII
toct
Lneas transgnicas obtenida: ChiA y ChiB
C1
pBI
ChiA
ChiB
C2
Actividad quitinasa en lneas transgnicas
30 kDa
IS
NT pBI 39A 39B 35 ChiA ChiB ChiC
kDa
30 14
Figura 4 $XPHQWR GH OD UHVLVWHQFLD LQGXFLGD SRU OD H[SUHVLyQ KHWHUyORJD GH XQ JHQ GH TXLWLQDVD ch5B) SURYHQLHQWH GH Phaseolus vulgaris $ S+&+, FRQVWUXFWR XWLOL]DGR SDUD OD H[SUHVLyQ GHO JHQ GH TXLWLQDVD HQ SODQWDV GH IUXWLOOD FXOWLYDU 3iMDUR &0YV SURPRWRU FRQVWLWXWLYR SURYHQLHQWH GHO YLUXV GH PRVDLFR GHO FROLRU WQRV WHUPLQDGRU SURYHQLHQWH GHO JHQ GH QRSDOLQR VLQWDVD nos GHO SOiVPLFR 7L GH Agrobacterium tumefanciens 3QRV SURPRWRU SURYHQLHQWH GHO JHQ GH OD QRSDOLQR VLQWDVD GHO SOiVPLFR 7L GH A. tumefanciens WRFW WHUPLQDGRU SURYHQLHQWH GHO JHQ GH RFWRSLQD VLQWDVD oct GHO SOiVPLFR 7L GH A. tumefanciens; nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa que otorga resistencia a neomicina a los tejidos transformados GH SODQWDV % 5HVXOWDGRV GH HQVD\RV GH VXVFHSWLELOLGDG DO KRQJR SDWyJHQR Botrytis cinerea de hojas de SODQWDV GH IUXWLOOD FY 3iMDUR & FRQWURO GH SODQWD QR WUDQVIRUPDGD \ QR LQRFXODGD S%, FRQWURO GH SODQWD WUDQVIRUPDGD FRQ HO YHFWRU GH H[SUHVLyQ VLQ HO LQVHUWR GH OD TXLWLQDVD \ QR LQRFXODGR &KL$ \ &KL% KRMDV GH GRV OtQHDV SODQWDV WUDQVIRUPDGDV REWHQLGDV HQ IRUPD LQGHSHQGLHQWH H LQRFXODGDV FRQ HO SDWyJHQR & FRQWURO GH SODQWD QR WUDQVIRUPDGD H LQRFXODGD FRQ HO SDWyJHQR /D LQRFXODFLyQ VH UHDOL]y FRQ O GH XQD VXVSHQFLyQ GH FRQLGLRVPO /DV KRMDV IXHURQ FRORFDGDV EDMR FRQGLFLRQHV FRQWURODGDV GH WHPSHUDWXUD OX] \ KXPHGDG HYDOXiQGRVH HO GHVDUUROOR GH OD HQIHUPHGDG D ORV GSL & (YDOXDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ D LQGLFH GH VXVFHSWLELOLGDG E \ DFWLYLGDG GH OD TXLWLQDVD HQ KRMDV GH IUXWLOOD F QR WUDQVIRUPDGD 17 WUDQVIRUPDGD FRQ HO YHFWRU VLQ LQVHUWR S%, GH OLQHDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ &KL$ \ &KL% \ TXH QR H[SUHVDQ $ % &KL& HO JHQ GH OD TXLWLQDVD ch5B /L]R SURWHtQD XWLOL]DGD FRPR PDUFDGRU GH SHVR PROHFXODU FRUUHVSRQGLHQWH D /\VR]LPD JXUD H[WUDtGD GH 9HOOLFFH et al Y
VH SXHGH GHFLU TXH ORV JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD GHIHQVD YHJHWDO \ SRU WDQWR XWLOL]DEOHV SXHGHQ VHU GH GRV WLSRV i) aquellos asociados a OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD \ ii) los denominados JHQHV GH UHVLVWHQFLD GH WLSR R ORV TXH SXHGHQ VHU D VX YH] GH YDULRV WLSRV GLIHUHQWHV 3DUD TXH HVWD HVWUDWHJLD SXHGD WHQHU DOJXQD SRVLbilidad de xito, es necesario adems que se FXPSODQ DOJXQDV FRQGLFLRQHV 6L VH WUDWD GH XQ JHQ DVRFLDGR D OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD HO SURducto de ese gen debe tener una actividad coQRFLGD TXH SHUPLWD SUHYHU XQD DFFLyQ GHOHWpUHD VREUH HO SDWyJHQR SRU HMHPSOR DQWLELyWLFD \ FRQVHFXHQWHPHQWH GH SURWHFFLyQ D OD SODQWD (Datta and Muthukrishnan, 1999). En cambio, si VH WUDWD GH XQ JHQ GH UHVLVWHQFLD WLSR R no hace IDOWD FRQRFHU VX DFWLYLGDG HVSHFtFD SHUR VL GHEH WHQHU OD FDSDFLGDG GH UHFRQRFHU DO SDWyJHQR HQ IRUPD GLUHFWD R LQGLUHFWD SRU PHGLR GHO SURGXFWR GH XQ JHQ avr del mismo (Axtell and Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2002, 2003). (QWUH ORV JHQHV PiV SURPLVRULRV VH SXHGHQ PHQFLRQDU DTXHOORV TXH FRGLFD SDUD DOJXQD SURWHtQD UHODFLRQDGD FRQ OD GHIHQVD YHJHWDO como ser: quitinasas, glucanases, entre las que tienen actividad enzimtica hidrolticas de FRPSRQHQWHV GH OD SDUHG FHOXODU GH KRQJRV 3HUR WDPELpQ SXHGHQ VHU GH JHQHV TXH FRGLFDQ SDUD HQ]LPDV TXH QR HVWiQ UHODFLRQDGDV GLUHFWDPHQWH FRQ DFWLYLGDGHV KLGUROtWLFDV SHUR estn sin embargo relacionadas a la regulaFLyQ GHO PHWDEROLVPR GH HVSHFLHV UHDFWLYDV GHO oxgeno (i.e. glutation S tranferasas o GSTs, VXSHUy[LGR GLVPXWDVDV R 62'V SHUR[LGDVDV HWF DO WUDQVSRUWH GH OtSLGRV LH OLSRR[LJHQDVDV /73V HWF R VLPSOHPHQWH TXH QR WHQJDQ DFWLYLGDG FRQRFLGD SHUR FX\D SDUWLFLSDFLyQ HQ OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD KD\D VLGR SUREDGD LH SURWHtQDV GH WUDQVSRUWH GH FDOFLR UHFHSWRres de etileno, MAMPs, etc.). Particularmente interesante son aquellos genes que an cuanGR VXV SURGXFWRV QR SRVHHQ XQD DFWLYLGDG DQWLELyWLFD GLUHFWD FRGLFDQ SDUD SURWHtQDV TXH SDUWLFLSDQ HQ OD VHxDOL]DFLyQ GH OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD \D VHD SRU TXH UHJXODQ HWDSDV GH la cascada de sealizacin (i.e. NPR1, GSTs), R OD H[SUHVLyQ GH JHQHV DVRFLDGRV D OD GHIHQsa (i.e. genes R 7DQJ HW DO .LP HW DO 7RQHOOR HW DO 0DUWLQH] =DPRUD HW DO
En los ltimos aos se ha incrementado el inWHUpV SRU OD E~VTXHGD GH JHQHV GH UHVLVWHQFLD QR VyOR SRU OD SRVLELOLGDG GH XWLOL]DFLyQ SDUD OD REWHQFLyQ GH YDULHGDGHV UHVLVWHQWHV VLQR SDUD dilucidar mecanismos de control y regulacin GH OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD \ GH IDFWRUHV TXH GHWHUPLQHQ OD VXVFHSWLELOLGDG R UHVLVWHQFLD GH OD SODQWD KDFLD XQ SDWyJHQR (VWH SODQWHR SHUPLWH YLVXDOL]DU DO PHQRV WUHV HVWUDWHJLDV SRVLEOHV QR H[FOX\HQWHV TXH SXHGHQ FRQWULEXLU VLJQLFDWLYDPHQWH DO PHMRUDPLHQWR WRSDWROyJLFR GH FXOWLYDUHV 3RU XQ ODGR VH SRGUtD LQWHQWDU SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD aumentar la frecuencia de alelos (variantes gQLFDV GH JHQHV WLSR R que contribuyan a incrementar la resistencia a enfermedades. Por otra SDUWH VH SRGUtD EORTXHDU R DQXODU OD H[SUHVLyQ GH JHQHV GH OD SODQWD TXH SHUPLWHQ HO SURJUHVR GH OD HQIHUPHGDG R LQWHQWDU VREUHH[SUHVDU HQ YDULHGDGHV VXVFHSWLEOHV JHQHV FX\D DFWLYLGDG QRV SHUPLWD LQFUHPHQWDU OD UHVLVWHQFLD 'H HVWR se trata la siguiente seccin. 3 Transferencia de Genes Involucrados en la Respuesta Defensiva por Ingeniera Gentica La estrategia consiste en utilizar recursos JHQpWLFRV GLVSRQLEOHV FRQ DOWR SRWHQFLDO GH UHQGLPLHQWR H LQFRUSRUDU SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD XQRV SRFRV JHQHV DXVHQWHV HQ ORV JHQRWLSRV GH SDUWLGD YDULHGDGHV R FXOWLYDUHV TXH OH FRQHUDQ XQ LQFUHPHQWR GH UHVLVWHQFLD D HQIHUmedades fngicas. La literatura en ese sentiGR HV WDQ H[WHQVD TXH SDUD OR TXH VH SUHWHQGH HQ HVWH FDStWXOR VHUtD LPSRVLEOH UHVXPLUOD 6LQ HPEDUJR TXLVLpUDPRV UHVDOWDU GRV DVSHFWRV \ GHWHQHUQRV VyOR HQ XQR GH HOORV HO SULPHUR VH UHHUH DO LPSDFWR VRFLRFXOWXUDO TXH SXHGH LPSOLFDU OD LQWURGXFFLyQ GH 2*0V RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV SRU LQJHQLHUtD JHntica) en el mercado y el otro, a la factibilidad GH ORJUDU ORV PLVPRV REMHWLYRV SRU RWUD PHWRGRORJtD &RQ UHVSHFWR DO SULPHU DVSHFWR PHQFLRQDGR VyOR GLUHPRV TXH GHVGH HO SXQWR GH YLVWD FLHQWtFR KD\ TXH WHQHU HQ FXHQWD SRU XQ ODGR TXH HO QXHYR JHQRWLSR SRUWDGRU GH ORV JHQHV LQWURGXFLGRV PDQWHQJD R PHMRUH VXV SURSLHGDdes en relacin a la salud de consumidores y RSHUDULRV \ SRU RWUD SDUWH TXH ORV QXHYRV JHQHV QR SXHGDQ WUDQVIHULUVH VLQ FRQWURO D RWUDV
HVSHFLHV YHJHWDOHV HPSDUHQWDGDV 5HVSHFWR GH OD SRVLELOLGDG GH DOFDQ]DU HO PLVPR REMHWLYR FRQ RWUD DSUR[LPDFLyQ WHFQROyJLFD FRPR SRU HMHPSOR OD PHMRUD JHQpWLFD FRQYHQFLRQDO R FOisica, en este caso habra que evaluar el costo UHDO HV GHFLU SRU HMHPSOR FRQWUDSRQHU HO WLHPSR QHFHVDULR SDUD LQWURGXFLU OD FDUDFWHUtVWLFD SRU OD YtD FRQYHQFLRQDO FRQ HO UHTXHULGR SDUD lograr la desregulacin y la autorizacin de uso del cultivar transgnico. Tambin habra que FRQRFHU SUHYLDPHQWH VL OD FDUDFWHUtVWLFD JHQpWLFD D WUDQVIHULU HVWi R QR HQ XQ JHUPRSODVPD TXH SXHGD FUX]DUVH \ GDU GHVFHQGHQFLD IpUWLO FRQ OD HVSHFLH FXOWLYDGD R YDULHGDG TXH VH GHsea mejorar. &RPR HMHPSOR YDPRV D PHQFLRQDU OD LQWHUDFFLyQ HQWUH IUXWLOOD \ GRV SDWyJHQRV I~QJLFRV Colletotrichum acutatum y Botrytis cinerea. El SULPHUR FDXVDQWH GH OD HQIHUPHGDG OODPDGD DQWUDFQRVLV \ HO VHJXQGR GH OD SRGUHGXPEUH R PRKR JULV &RPR SXHGH YHUVH HQ OD )LJ HVWXGLRV WRSDWROyJLFRV UHDOL]DGRV GH OD LQWHUDFFLyQ HQWUH JHQRWLSRV GH Colletotrichum con distintos cultivares de frutilla (Fragaria x ananassa), PXHVWUDQ TXH XQ DLVODGR SDUWLFXODU GH KRQJR SXHGH DWDFDU FRQ GLVWLQWRV JUDGRV GH VHYHULdad a diferentes cultivares de frutilla y tambin, TXH XQ FXOWLYDU GH IUXWLOOD SXHGH VHU DIHFWDGR GH PDQHUD GLIHUHQWH SRU GLVWLQWRV DLVODGRV GH KRQJRV SDWyJHQRV (VWH UHVXOWDGR FODUDPHQWH muestra que no slo hay variabilidad gentica HQ ORV KRQJRV SDWyJHQRV SDUD HO FDUiFWHU GH SDWRJHQLFLGDG?YLUXOHQFLD VLQR TXH HQ OD IUXWLOOD KD\ WDPELpQ YDULDELOLGDG JHQpWLFD SDUD HO carcter de resistencia. Este dato es de gran LPSRUWDQFLD SDUD DQDOL]DU GLVWLQWDV HVWUDWHJLDV DOWHUQDWLYDV SDUD RWRUJDU D FXOWLYDUHV GH IUXWLlla resistencia a la antracnosis o al moho gris. (VWR VLJQLFD TXH KDEUi TXH DQDOL]DU ELHQ FXiO metodologa, si la clsica o la de transgnesis, FRQYLHQH XWLOL]DU SDUD WUDQVIHULU OD FDUDFWHUtVWLFD GHVGH HO PDWHULDO JHQpWLFR SRFR GRPHVWLFDGR a otro ms domesticado. Concretamente todos ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR GHO PXQGR LQWHQWDQ FRQWHVWDU HVWD SUHJXQWD 6LQ HPEDUJR SXHGH RFXUULU TXH XQ FXOWLYR determinado no muestre variabilidad gentica SDUD HO FDUiFWHU GH UHVLVWHQFLD KDFLD XQ SDWyJHQR SRU OR TXH QR VHUtD SRVLEOH PHMRUDU HO FXOWLYR SRU XQD DSUR[LPDFLyQ FRQYHQFLRQDO HJ
cruzamientos y seleccin) y la obtencin de un 2*0 TXH H[SUHVH XQ JHQ KHWHUyORJR TXH FRQHUD UHVLVWHQFLD SRGUtD VHU XQ DOWHUQDWLYD PX\ adecuada. Este el caso de la interaccin entre frutilla y Botrytis: no se encontr ninguna variedad de frutilla con resistencia hacia Botrytis, SRU OR TXH VH GHFLGLy LQFRUSRUDU OD UHVLVWHQFLD SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD (Q OD )LJXUD VH PXHVWUDQ UHVXOWDGRV REWHQLGRV SDUD XQD YDULHGDG GH IUXWLOOD 3iMDUR VXVFHSWLEOH D OD HQIHUmedad de moho gris. La estrategia consisti en OD H[SUHVLyQ GH XQ JHQ KHWHUyORJR ch5B) que FRGLFD SDUD XQD SURWHtQD &K% GHO WLSR 35 DVRFLDGD D OD UHVSXHVWD GH GHIHQVD HQ SRURWR o Phaseolus vulgaris. En la Figura 4A se muesWUD OD FRQVWUXFFLyQ XWLOL]DGD SDUD WUDQVIRUPDU HO cultivar Pjaro de frutilla, con la cual se obtuYLHURQ GRV OtQHDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ la quitinasa en forma correcta y activa: ChiA y ChiB. Tambin (Figura 4B) se muestran los resultados de un ensayo de infeccin con Botrytis HQ KRMD GHVSUHQGLGD HQ HO TXH VH SXHGH DSUHFLDU HO JUDGR GH SURWHFFLyQ FRQIHULGD SRU OD H[SUHVLyQ GHO WUDQVJHQ R JHQ LQWURGXFLGR SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ SODQWDV WUDQVIRUPDGDV &KL$ \ &KL% HQ FRPSDUDFLyQ FRQ FRQWUROHV QR transformados (C1, C2) o transformados con el SOiVPLGR VLQ HO LQVHUWR GHO JHQ ch5B S%, 9HOOLFFH HW DO 4LQ HW DO (VWD HQIHUmedad es de gran incidencia en casi todos los agro-ecosistemas donde se cultiva frutilla en el mundo. El gen ch5B XWLOL]DGR FRGLFD SDUD XQD SURWHtQD FRQ DFWLYLGDG TXLWLQDVD FX\D DFWLYLGDG DQWLI~QJLFD \D KDEtD VLGR SUHYLDPHQWH SUREDGD %HQKDPRX HW DO (VWRV UHVXOWDGRV SHUPLWHQ FRPSUREDU TXH OD H[SUHVLyQ GH HVH JHQ GH TXLWLQDVD HV FDSD] GH GLVPLQXLU OD VXVFHSWLbilidad (IS) de este cultivar hacia Botrytis (Fig. 4Ca y 4Cb) y que ese carcter estaba asociado a la actividad de esta quitinasa (Fig. 4Cc). 2WUD HVWUDWHJLD LQWHUHVDQWH SDUD HO PDQHMR de Botrytis HQ IUXWLOOD HV DTXHOOD UHSRUWDGD SRU +DQKLQHYD 6X SURSXHVWD FRQVLVWLy HQ XWLOL]DU ODV SURSLHGDGHV DQWLI~QJLFDV GH ODV LVRDYRQDV VREUHH[SUHVDQGR XQR GH ORV JHQHV UHVSRQVDEOHV GH VX VtQWHVLV OD estilbeno sintasa HQ JHQRWLSRV VHQVLEOHV GH IUXWLOOD $Vt SXGR GHPRVWUDU TXH HVWD DSUR[LPDFLyQ WUDQVJpQLFD WDPELpQ SHUPLWH REWHQHU FXOWLYDUHV GH IUXWLOOD con tolerancia al moho gris incrementada.
Estos resultados muestran claramente que OD YtD GH OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD SRU WUDQVJpQHVLV HV XQD HVWUDWHJLD SRVLEOH \ SXHGH FRQWULbuir efectivamente al manejo de enfermedades SURGXFLGDV SRU SDWyJHQRV I~QJLFRV GLVPLQX\HQGR ORV ULHVJRV GH HIHFWRV QRFLYRV SDUD HO medio ambiente y la salud humana, que tienen los fungicidas de origen sinttico. 4 Conclusiones (Q HVWH FDStWXOR VH PRVWUy FRPR HO FRQRFLmiento bsico de los mecanismos de defensa \ ORV IDFWRUHV LQYROXFUDGRV HQ OD UHVSXHVWD GHIHQVLYD R HQ OD UHVLVWHQFLD SHUPLWH GLVHxDU desde la biotecnologa, mtodos racionales, VXVWHQWDEOHV H LQWHJUDGRV SDUD DIURQWDU HO GHVDItR TXH VLJQLFD HO FRQWURO GH HQIHUPHGDGHV fngicas en la agricultura, dentro de un marco GH SURWHFFLyQ GH OD VDOXG KXPDQD \ GHO PHGLR DPELHQWH 6LQ HPEDUJR QR SRGHPRV GHMDU GH PHQFLRQDU TXH KD\ D~Q XQ ODUJR FDPLQR SRU UHFRUUHU WDQWR SDUD HVWDEOHFHU SURWRFRORV YDOLGDGRV D FDPSR FRPR SDUD ORJUDU TXH OD GHVUHJXODFLyQ GH WUDQVJpQLFRV QR DIHFWH HO SURJUHVR HVSHUDGR \ OD GLVSRQLELOLGDG GH HVWD KHUUDPLHQWD HQ ORV SDtVHV PHQRV GHVDUUROODGRV (VWRV resultados tambin estimulan a continuar con el desarrollo de nuevas lneas de investigacin TXH FRQ XQD EDVH IXHUWHPHQWH FLHQWtFD SXHdan brindar sustentabilidad social, econmica y ambiental a la agricultura, que es la base anFHVWUDO \ PRGHUQD GH OD SURGXFFLyQ GH DOLPHQWRV \ SRU HQGH GHO GHVDUUROOR GH OD KXPDQLGDG Reconocimientos: Los trabajos mencionaGRV HQ HVWH FDStWXOR IXHURQ QDQFLDGRV SDUcialmente con fondos de Agencia Nacional de 3URPRFLyQ &LHQWtFD \ 7HFQROyJLFD )21&\7 3,&72 8QLYHUVLGDG 1DFLRQDO GH 7XFXPiQ &,817 ' \ &21,&(7 3,3 NCh y CG son becarios del CONICET, y JCDR y APC son investigadores del CONICET. 5 Bibliografa
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0DFNH\ ' %HONKDGLU< $ORQVR -0 (FNHU -5 DQG 'DQJO -/ $UDELGRSVLV 5,1 LV D WDUJHW RI WKH W\SH ,,, YLUXOHQFH HIIHFWRU $YU5SW DQG modulates PRP2-mediated resistance. Cell, 112, Martnez Zamora, M.G., Castagnaro, A.P. and 'tD] 5LFFL -& *HQHWLF GLYHUVLW\ RI 3WR like serine/threonine kinase disease resistance genes in cultivated and wild strawberries. J.Mol. Evol 2LQ < 7H[HLUD GD 6LOYD - =KDQJ / =KDQJ 6K (2007) Transgenic strawberry: State of the art IRU LPSURYHG WUDLWV GRL- %LRWHFKQRORJ\ Advances 2007.12.004. Salazar, S.M.; Castagnaro, A.P.; Arias, M.E.; Chalfoun, N.; Tonello, U. and Daz Ricci, J.C. ,QGXFWLRQ RI D GHIHQVH UHVSRQVH LQ strawberry mediated by an avirulent strain of Colletotrichum. (XURSHDQ -RXUQDO RI 3ODQW Pathology, 117, 109-122. 7DQJ ; ;LH 0 .LP <- =KRX - .OHVVLJ ') 0DUWLQ *% 2YHUH[SUHVVLRQ RI 3WR DFWLYDWHV GHIHQFH UHVSRQVHV DQG FRQIHUV EURDG UHVLVWDQFH 7KH 3ODQW &HOO
Tonello U, Maman MA, Salazar SM, Grellet C, Tortora ML, Castagnaro AP and Daz Ricci JC Antioxidant activity and SA accumulation associated to the GHIHQVH UHVSRQVH LQ VWUDZEHUU\ 5HXQLyQ $QXDO GH 6$,% 1RYLHPEUH 5RVDULR 6DQWD )H $UJHQWLQD $EVWUDFW 3/3 S 9HOOLFFH * 'LD] 5LFFL -& +HUQDQGH] *DUFLD / DQG &DVWDJQDUR $ (QKDQFHG UHVLVWDQFH to Botrytis cinerea mediated by the transgenic H[SUHVVLRQ RI WKH FKLWLQDVH JHQH FK% LQ VWUDZEHUU\ 7UDQVJHQLF 5HVHDUFK ;X - 3HQJ < 'LFNPDQ 0% 6KDURQ $ 7KH Dawn of Fungal Pathogen genomics. Ann Rev 3K\WRSDWKRO
V . CAPTULO 9 8WLOL]DFLyQ GH FXOWLYRV GH WHMLGRV para la obtencin y conservacin de plantas libres de enfermedades.
Vilma C. Conci. Cultivo de meristema El cultivo de meristema ha sido utilizado con p[LWR SDUD GLVWLQWRV REMHWLYRV HQWUH HOORV OD UiSLGD FORQDFLyQ GH PDWHULDO GHVHDEOH PLFURSURSDJDFLyQ OD FRQVHUYDFLyQ GH JHUPRSODVPD D EDMDV WHPSHUDWXUD FULRSUHVHUYDFLyQ \ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH SDWyJHQRV VLVWpPLcos, entre ellos los virus. Esta tcnica consiste en aislar el meristema H[SODQWR \ VHPEUDUOR HQ XQ PHGLR GH FXOWLYR DGHFXDGR TXH SRVLELOLWH HO GHVDUUROOR GH XQD SODQWD FRPSOHWD (O WpUPLQR FXOWLYR GH PHULVWHPD SRU OR JHQHUDO QR HV FRUUHFWDPHQWH HPSOHDGR \D TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VH VLHPEUD HO GRPR PHULVWHPiWLFR DFRPSDxDGR SRU XQR R GRV SULPRUGLRV IROLDUHV (O GRPR HV una estructura generalmente menor a 0,1 mm muy difcil de extraer en forma aislada, y de la FXDO UHVXOWD FRQ IUHFXHQFLD FRPSOLFDGR REWHQHU XQD SODQWD FRPSOHWD 3DUD HOOR HV QHFHVDULR un medio de cultivo con concentraciones de hormonas y sales equilibradas y condiciones DPELHQWDOHV HVWULFWDV SRU FRQVLJXLHQWH HVWR ha llevado a que los resultados en ese sentido VHDQ PX\ SREUHV 3RU HVWD UD]yQ HQ OD PD\Rra de los casos, se utiliza el domo meristemWLFR DFRPSDxDGR GH y SULPRUGLRV IROLDUHV Quizs lo aconsejable sera utilizar el trmino FXOWLYR GH \HPD EURWH R WDOOR $ SHVDU GH ello, utilizaremos la denominacin cultivo de PHULVWHPD SRU VHU HVWD OD WHUPLQRORJtD PiV GLfundida, aunque no estrictamente correcta. (Q JHQHUDO VH FRQVLGHUD TXH ODV SODQWDV SURYHQLHQWHV GHO FXOWLYR GH PHULVWHPD VRQ LGpQWLFDV X KRPyORJDV D OD SODQWD PDGUH GH GRQGH VH H[WUDMR HO H[SODQWR 3RU HO FRQWUDULR ODV SODQWDV GHULYDGDV GH RWURV WHMLGRV FRPR FDOORV QXFHOD SULPRUGLRV RUDOHV R SURWRSODVWRV XVXDOPHQWH SUHVHQWDQ GLVWLQWRV JUDGRV GH YD-
ULDELOLGDG (VWR ~OWLPR QR HV GHVHDEOH SDUD OD SURGXFFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV GRQGH HO REMHWLYR TXH VH SHUVLJXH HV PHMRUDU OD VDQLGDG GH OD SODQWD VLQ PRGLFDU VXV FXDOLGDGHV DJURQyPLFDV (V LPSRUWDQWH DFODUDU TXH KDQ VLGR UHSRUWDGDV FLHUWDV PXWDFLRQHV HQ SODQWDV SURYHQLHQWHV GH FXOWLYR GH PHULVWHPD SHUR FRQ PXFKD PHQRV IUHFXHQFLD \ PHQRV LPSRUWDQWHV que las detectadas con otros sistemas de obWHQFLyQ GH SODQWDV in vitro. Eliminacin de virus /RV YLUXV GH SODQWDV VRQ UHVSRQVDEOHV GH LPSRUWDQWHV SpUGLGDV HQ ORV UHQGLPLHQWRV OOHJDQGR HQ DOJXQRV FDVRV D VHU OLPLWDQWHV SDUD el cultivo. La mayora de ellos no se transmiten SRU VHPLOOD SRU OR WDQWR ODV HVSHFLHV TXH VH PXOWLSOLFDQ SRU HVWD YtD WLHQHQ OD SRVLELOLGDG GH OLEHUDUVH GH HVWRV SDWyJHQRV HQ IRUPD QDWXUDO 3RU RWUD SDUWH ODV HVSHFLHV TXH VH SURSDgan exclusivamente en forma agmica no tienen esta ventaja. Cuando son infectadas sisWpPLFDPHQWH SRU YLUXV HVWRV VRQ WUDQVPLWLGRV GHVGH OD SODQWD PDGUH D OD GHVFHQGHQFLD FRQ DOWD HFLHQFLD (VWD VLWXDFLyQ SHUPLWH TXH OD LQfeccin contine de generacin en generacin y se disemine a diferentes regiones a travs del FRPHUFLR GH HVWRV SURSiJXORV EXOERV WXEpUFXORV HVTXHMHV HWF (MHPSOR GH HOOR VRQ DMR IUXWLOOD IUXWDOHV GH FDUR]R R SHSLWD \XFD SDSD EDWDWD \ QXPHURVDV HVSHFLHV RUQDPHQWDOHV (Q HVWRV FDVRV OD REWHQFLyQ \ PXOWLSOLFDFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV SRU PHGLRV DUWLFLDOHV MXHJD XQ SDSHO LPSRUWDQWH SDUD PHMRUDU OD SURduccin y calidad. 8QD ODUJD OLVWD GH HVSHFLHV KDQ VLGR OLEHUDGDV GH YLUXV D WUDYpV GH OD UHJHQHUDFLyQ GH SODQWDV in vitro. El sistema ms frecuentemente utilizado y con mayores xitos, es el cultivo de meULVWHPD VXSOHPHQWDGR HQ DOJXQRV FDVRV SRU WUDWDPLHQWRV GH WHUPRWHUDSLD R TXLPLRWHUDSLD Distribucin de los virus en las plantas /RV YLUXV HQ ODV SODQWDV QR HVWiQ XQLIRUPHmente distribuidos. En las infecciones sistmiFDV DOJXQRV HVWiQ OLPLWDGRV DO RHPD R D SRFDV FpOXODV SDUHQTXLPiWLFDV DG\DFHQWHV RWURV involucran a todas, o casi todas las clulas de OD SODQWD $OJXQRV YLUXV GHMDQ VHFWRUHV VLQ LQIHFWDU \ VyOR XQRV SRFRV LQYDGHQ ORV QXHYRV tejidos meristemticos.
/RV PHULVWHPDV VXHOHQ WHQHU SRFRV R QLQJ~Q YLUXV /DV UD]RQHV SDUD HOOR QR HVWiQ HVFODUHFLGDV FRPSOHWDPHQWH SHUR VH PHQFLRQDQ FRPR SRVLEOHV ODV VLJXLHQWHV 6LVWHPD YDVFXODU SRFR GLIHUHQFLDGR /RV YLUXV VRQ UiSLGDPHQWH WUDQVSRUWDGRV D OR ODUJR GH WRGD OD SODQWD SRU HO RHPD \ DVt VH GLVtribuyen sistmicamente. Los meristemas no WLHQHQ WHMLGR YDVFXODU IRUPDGR SRU OR WDQWR HO avance es solamente a travs del movimiento FpOXOD D FpOXOD 6H FRPSUREy TXH HO Tobacco mosaic virus 709 \ HO Potato virus X 39; DYDQ]DQ D FPK SRU HO WHMLGR YDVFXODU \ D PK FpOXOD D FpOXOD 3RU HVWD UD]yQ VH VXSRQH TXH ODV FpOXODV PHULVWHPiWLFDV QR HVWiQ FRPSOHWDPHQWH LQYDGLGDV SRU YLUXV FXDQGR estn en activo crecimiento. 2.- Alta actividad metablica. PresumiblePHQWH HV PiV GLItFLO SDUD XQ YLUXV LQYDGLU Fplulas con alta actividad metablica, como las clulas meristemticas donde est ocurriendo activa mitosis. 3.-Altas concentraciones de auxinas. Se ha observado que altas concentraciones de 2,4-D HQ HO PHGLR GH FXOWLYR LQKLEH OD PXOWLSOLFDFLyQ GH ORV YLUXV 3RU OR WDQWR VH SXHGH VXSRQHU TXH las altas concentraciones de auxinas endgeQDV H[LVWHQWHV HQ ORV iSLFHV PHULVWHPiWLFRV SXHGHQ SURGXFLU XQ HIHFWR VLPLODU $OJXQRV H[SHULPHQWRV VRVWLHQHQ OD KLSyWHVLV GH TXH OD KDELOLGDG GH ORV PHULVWHPDV SDUD HVFDSDU GH ODV LQIHFFLRQHV YLUDOHV VH debe a un mecanismo de silenciamiento gentico viral ocurrido en clulas meristemticas, cuyo objetivo es la degradacin del ARN viral. El silenciamiento gnico es un mecanismo de UHJXODFLyQ PHGLDQWH HO FXDO OD FpOXOD LPSLGH OD H[SUHVLyQ GH XQ JHQ (O VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR SRVWUDQVFULSFLRQDO LPSOLFD OD GHJUDGDFLyQ GH XQ $51 PHQVDMHUR LPSLGLHQGR VX WUDGXFFLyQ \ GH HVWD IRUPD HYLWDQGR OD VtQWHVLV GH OD SURWHtQD FRUUHVSRQGLHQWH (VWH SURFHVR FRPLHQ]D HQ OD FpOXOD D SDUWLU GH $51 GH GREOH FDGHQD $51GF HO FXDO HV SURFHVDGR SRU XQD $51DVD WLSR ,,, GHQRPLQDGD 'LFHU R 'LFHUOLNH HQ SODQWDV (O SURFHVDPLHQWR JHQHUD IUDJPHQWRV GH QXFOHyWLGRV GHQRPLQDGRV SHTXHxRV ARNs de interferencia (siARN). El siARN se XQH DO FRPSOHMR GH HQ]LPDV TXH GHJUDGDUiQ HO iFLGR QXFOHLFR 5,6& FRPSOHMR GH VLOHQFLD-
PLHQWR LQGXFLGR SRU $51 HVWH FRPSOHMR VHSDra la doble hebra del siARN y une slo una de ellas. La hebra de siARN actuar como gua en OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV $51V PHQVDMHURV EODQFR GH GHJUDGDFLyQ D WUDYpV GHO DSDUHDPLHQWR GH VHFXHQFLDV FRPSOHPHQWDULDV (Q DOJXQRV RUJDQLVPRV FRPR SODQWDV H LQVHFWRV HVWH SURFHVR VLUYH FRPR GHIHQVD IUHQWH D YLUXV \D TXH OD PD\RUtD GH HOORV SURGXFHQ ARN de doble cadena en algn momento del ciclo infectivo. El mecanismo de silenciamiento SXHGH LQKLELU OD DFXPXODFLyQ GH YLUXV HQ XQD FpOXOD H LPSHGLU TXH VH GLIXQGD GDGR TXH H[LVWH XQ SURFHVR GH GLVHPLQDFLyQ VLVWpPLFD GHO VLOHQciamiento. Es decir, que la induccin del silenciamiento en la zona de infeccin genera una seal mvil que inicia el silenciamiento en zonas GLVWDQWHV GHO RUJDQLVPR (VWD VHxDO SRGUtD PRYHUVH D WUDYpV GHO RHPD R GH XQD FpOXOD D RWUD SRU SODVPRGHVPRV Existe adems un mecanismo basado en un SULQFLSLR VLPLODU TXH UHJXOD OD H[SUHVLyQ GH JHnes endngenos. $OJXQRV WUDEDMRV SURSRQHQ XQ PRGHOR GH GHIHQVD HQ HO FXDO FLHUWDV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV en el silenciamiento suministran una seal que JDWLOOD XQD LQPHGLDWD UHVSXHVWD GH VLOHQFLDPLHQto contra el virus en las zonas de crecimiento y en las nuevas hojas emergentes. De este modo HO PHFDQLVPR GH VHxDO GH VLOHQFLDPLHQWR SRGUtD H[SOLFDU DO PHQRV HQ SDUWH SRUTXH DOJXQRV YLUXV QR LQYDGHQ ORV PHULVWHPDV GH SODQWDV LQfectadas. Factores que pueden afectar la produccin de plantas libres de patgenos sistmicos 9DULRV IDFWRUHV SXHGHQ DIHFWDU HO GHVDUUROOR in vitro GH XQD SODQWD D SDUWLU GH XQ PHULVWHPD HO PHGLR GH FXOWLYR HPSOHDGR HO HVWDGR VLROyJLFR GHO H[SODQWR OD FRQFHQWUDFLyQ GH KRUPRnas endgenas, las contaminaciones internas R H[WHUQDV SURGXFLGDV GXUDQWH HO GHVDUUROOR GHO FXOWLYR HO WDPDxR \ ORFDOL]DFLyQ GHO H[SODQWR etc. Mencionaremos aqu algunas consideracioQHV KDFLHQGR HVSHFLDO UHIHUHQFLD D DTXHOODV TXH DIHFWDQ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV /RFDOL]DFLyQ GHO H[SODQWR FrecuentemenWH VH XWLOL]DQ PHULVWHPDV DSLFDOHV \ D[LODUHV
FRQ EXHQRV UHVXOWDGRV SDUD OD SURGXFFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV 6LQ HPEDUJR HV DFRQVHjable el uso de yemas terminales ya que tienen XQ PD\RU FUHFLPLHQWR SRWHQFLDO TXH ODV \HPDV laterales. En general los meristemas ms jvenes se desarrollan mejor que los viejos y SURGXFHQ PiV SODQWDV OLEUHV GH YLUXV TXH ODV \HPDV ODWHUDOHV SUREDEOHPHQWH SRUTXH WLHQHQ un crecimiento ms activo que las axilares. Sin HPEDUJR WDPELpQ HV SRVLEOH OD REWHQFLyQ GH SODQWDV VDQDV D SDUWLU GH \HPDV D[LODUHV Estacin o momento de la extraccin: los meristemas en activo crecimiento son los PiV UHFRPHQGDGRV SRU VX DOWR SRWHQFLDO GH GHVDUUROOR (VWR WDPELpQ IDYRUHFH ODV SRVLELOLGDGHV GH REWHQHU SODQWDV OLEUHV GH YLUXV 3DUD HVSHFLHV YHJHWDOHV FRQ SHUtRGRV GH GRUPDQFLD GHQLGRV ORV PHMRUHV UHVXOWDGRV VH REWLHQHQ FXDQGR ORV PHULVWHPDV HVWiQ GHVSLHUWRV \ FRmienzan a brotar. En el caso de ser necesario inducir la brotacin, los tratamientos ms usaGRV FRQVLVWHQ HQ VRPHWHUOR D SHUtRGRV GH IUtR YDULDEOH VHJ~Q OD HVSHFLH \R HO XVR GH iFLGR giberlico. 7DPDxR GHO H[SODQWR XWLOL]DGR. El meristema necesita una serie de requerimientos nutriFLRQDOHV SDUD FXPSOLU VXV IXQFLRQHV GH DXWRSHUSHWXDFLyQ \ GH JHQHUDU FpOXODV SDUD IRUPDU WHMLGRV GHQLGRV 3RU OR WDQWR DO VHU UHWLUDGR GH OD SODQWD GHEH VHU VHPEUDGR HQ XQ PHGLR GH FXOWLYR DSURSLDGR DVt UiSLGDPHQWH GHVDUUROOD XQD SODQWD FRPSOHWD &XDQWR PiV SHTXHxR sea el meristema ms difcil ser encontrar HO PHGLR GH FXOWLYR DGHFXDGR TXH SHUPLWD XQ buen desarrollo. Se ha observado que sembrar slo el domo meristemtico, en general, no da buenos resultados. En la mayora de los casos VyOR SURGXFH FDOOR TXH OXHJR SXHGH UHJHQHUDU SODQWDV &RPR VH PHQFLRQy DQWHULRUPHQWH OD GLIHUHQFLDFLyQ D SDUWLU GH FDOOR LPSOLFD XQ LQFUHPHQWR HQ OD SRVLELOLGDG GH PXWDFLRQHV \ variabilidad no deseada cuando se intenta obWHQHU SODQWDV JHQpWLFDPHQWH LJXDOHV D OD SODQWD GRQDQWH GHO H[SODQWR 3RU HVWD UD]yQ JHQHUDOPHQWH VH FXOWLYD HO GRPR FRQ XQR R GRV SULPRUGLRV IROLDUHV D SDUWLU GHO FXDO VH REWLHQH FRQ IUHFXHQFLD XQD SODQWD FRPSOHWD (O WDPDxR GHO H[SODQWR DVt FRPR HO Q~PHUR GH SULPRUGLRV TXH GHED SRVHHU GHSHQGHUi HQ FDGD FDVR GHO REMHWLYR TXH VH SHUVLJD OD
HVSHFLH YHJHWDO TXH VH WUDWH \ HO R ORV YLUXV involucrados. En trminos generales, cuanto PiV JUDQGH UHVXOWH HO H[SODQWR PD\RU VHUi OD SRVLELOLGDG GH UHJHQHUDU SODQWDV SHUR PHQRU OD SRVLELOLGDG GH REWHQHU SODQWDV OLEUHV GH YLUXV 6L SRU HO FRQWUDULR VH SDUWH GH SODQWDV \D saneadas, o lo que se desea es slo la multiSOLFDFLyQ GHO PDWHULDO in vitro VH SRGUiQ XVDU yemas o brotes de mayor tamao y asegurar DVt HO GHVDUUROOR GH XQD SODQWD VLQ PD\RUHV UHquerimientos nutricionales. Existe un gradiente de incremento de concentracin de virus desde el domo meristemWLFR KDFLD ORV VXFHVLYRV SULPRUGLRV TXH FRLQFLGH FRQ OD GLIHUHQFLDFLyQ (VWR VLJQLFD TXH OD SUREDELOLGDG GH REWHQHU SODQWDV OLEUHV GH YLUXV HV LQYHUVDPHQWH SURSRUFLRQDO DO WDPDxR GHO H[SODQWR XWLOL]DGR ([SODQWRV HQWUH \ PP VRQ ORV TXH PiV IUHFXHQWHPHQWH SURGXFHQ SODQWDV OLEUHV GH YLUXV 6LQ HPEDUJR WDPELpQ VH KDQ UHSRUWDGR EXHQRV UHVXOWDGRV FRQ HO HPSOHR GH PHULVWHPDV PiV JUDQGHV (O WDPDxR UHFRPHQGDGR HV YDULDEOH \ GHSHQGH GHO KRVSHGDQWH GH ORV WUDWDPLHQWRV SUHYLRV WHUPRWHUDSLD TXLPLRWHUDSLD HWF \ HO R ORV YLUXV LQYROXFUDGRV (Q DOJXQRV FDVRV QR VyOR HV LPSRUWDQWH FRQVLGHUDU OD HVSHFLH GH KRVSHGDQWH VLQR tambin el cultivar, ya que se han detectado notables diferencias entre ellos. 3RU RWUD SDUWH HV SUREDEOH TXH HO WDPDxR GHO PHULVWHPD SRU VL VROR QR VHD HO TXH GHWHUPLQD HO p[LWR HQ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLrus. Se han detectado numerosos virus en meULVWHPDV DSLFDOHV GH PP HQ GLIHUHQWHV HVSHFLHV FODYHO Nicotiana rustica, N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, SRURWR WDEDFR WRPDWH SHWXQLD SDSD 6LQ HPEDUJR VH KD ORJUDGR OD REWHQFLyQ GH SODQWDV VDQDV FRQ H[SODQWRV GH HVRV WDPDxRV R PD\RUHV SRU OR TXH VH SRGUtD VXSRQHU TXH OD HOLPLQDFLyQ GH YLUXV RFXUUH WDPELpQ GXUDQWH HO SURFHVR GH FXOtivo in vitro R SRU DOJXQD RWUD UD]yQ QR DFODUDGD todava. Desarrollo del cultivo (O SULPHU SDVR HV OD H[WUDFFLyQ GHO PHULVWHPD R H[SODQWR 3DUD HOOR VH FRUWD XQD SRUFLyQ GH WHMLGR GH DSUR[LPDGDPHQWH FP TXH LQcluye el meristema y se desinfecta. Frecuentemente se realiza mediante una inmersin en
DOFRKRO VHJXLGR GH KLSRFORULWR GH VRGLR R FDOcio. Luego este trozo es llevado a una cmara GH XMR ODPLQDU \ FRQ OD D\XGD GH LQVWUXPHQWDO HVWpULO \ XQD OXSD HVWHUHRVFySLFD VH SURFHGH D OD HVFLVLyQ GHO H[SODQWR 8QD YH] H[WUDtGR VH coloca en un medio de cultivo adecuado y es PDQWHQLGR EDMR FRQGLFLRQHV DSURSLDGDV GH OX] WHPSHUDWXUD \ KXPHGDG SDUD HO GHVDUUROOR Fase I. Etapa de iniciacin. El objetivo de HVWD HWDSD HV HO GHVDUUROOR GHO H[SODQWR HQ IRUPD DVpSWLFD (Q JHQHUDO RFXUUH SULPHUR XQ DXPHQWR GHO WDPDxR \ OXHJR HO WHMLGR SXHGH LU tornndose lentamente verde. Posteriormente LUiQ GHVDUUROOiQGRVH EURWHV R SODQWDV FRPSOHWDV \ D SDUWLU GH HVWDV VH SXHGHQ REWHQHU \Hmas axilares. Fase II. Etapa de multiplicacin. En esta HWDSD HO REMHWLYR HV OD PXOWLSOLFDFLyQ DFWLYD GHO H[SODQWR SDUD OD SURGXFFLyQ GH QXPHURVDV SODQWDV D SDUWLU GH XQD FRQVWLWX\HQGR DVt XQ FORQ SURYHQLHQWH GH XQ VROR PHULVWHPD DO TXH VH FRQRFH FRPR PHULFORQ /D PXOWLSOLFDFLyQ R PLFURSURSDJDFLyQ SXHGH HIHFWXDUVH SRU SUROLferacin de brotes axilares, brotes adventicios, formacin de embriones somticos, etc., traWDQGR VLHPSUH GH HYLWDU OD IRUPDFLyQ GH FDOOR FRPR SDVR SUHYLR D OD GLIHUHQFLDFLyQ /D HWDSD GH PXOWLSOLFDFLyQ SXHGH LQYROXFUDU YDULRV UHSLques del material a medio de cultivo fresco. Se KD YLVWR FRQ IUHFXHQFLD TXH OD WDVD GH PXOWLSOLFDFLyQ YDUtD FRQ HO WLHPSR GH SHUPDQHQFLD GHO H[SODQWR HQ HO PHGLR GH FXOWLYR (V IUHFXHQWH TXH GHVSXpV GH y PiV VXEFXOWLYRV DXPHQWH HO Q~PHUR GH \HPDV TXH VH SURGXFHQ D SDUWLU GH XQ H[SODQWR 1R HV DFRQVHMDEOH PDQWHQHU HO PDWHULDO LQGHQLGDPHQWH HQ HVWD HWDSD \D TXH se ha observado un aumento de la variabilidad FXDQGR ODV SODQWDV VRQ PDQWHQLGDV SRU ODUJRV SHUtRGRV HQ HVWDV FRQGLFLRQHV (Q JHQHUDO VH considera que 10-12 subcultivos es lo mximo que debera mantenerse el material en esta HWDSD Fase III. Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra. Frecuentemente las SODQWDV GHVDUUROODGDV in vitro QR SRVHHQ UDtFHV o si las tienen muchas veces no son funcionales; y en general, tiene malas conexiones vasFXODUHV FRQ HO WDOOR $ QLYHO IROLDU SXHGH HVWDU DOWHUDGD OD SURGXFFLyQ GH FORUROD /RV HVWRPDV suelen no funciona o hacerlo muy lentamente,
\ OD FDSD GH FHUD HSLFXWLFXODU HV PX\ UHGXFLGD La formacin de races adventicias es relaWLYDPHQWH IiFLO GH FRQVHJXLU HQ SODQWDV KHUEiFHDV \ GLItFLO HQ OHxRVDV ([LVWH XQD HWDSD de induccin de races, de iniciacin del crecimiento y de elongacin de las mismas. En esta fase del crecimiento se suele incrementar la LQWHQVLGDG GH OX] SDUD IDYRUHFHU OD UXVWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV SHUR KD\ TXH FXLGDU TXH pVWD QR DIHFWH D ODV UDtFHV 6H SXHGH PHMRUDU HVWR cubriendo con aluminio la base de los tubos o XVDQGR GH FDUEyQ DFWLYDGR HQ HO PHGLR GH FXOWLYR SDUD SURSRUFLRQDU VRPEUD D ODV UDtces. (Q ODV SODQWDV TXH VH SURSDJDQ SRU EXOERV WXEpUFXORV UL]RPDV HWF VH SXHGH LQGXFLU OD formacin de los mismos in vitro SDUD PHMRUDU OD HFLHQFLD HQ HO WUDQVSODQWH \D TXH pVWRV SXHGHQ VHU FRVHFKDGRV GHO WXER GH HQVD\R \ sembrados directamente en tierra sin mayores GLFXOWDGHV Transplante (Q HO PRPHQWR GHO WUDQVSODQWH HV LPSRUWDQWH QR GDxDU ODV UDtFHV (V QHFHVDULR ODYDUODV FXLGDGRVDPHQWH SDUD UHWLUDU ORV restos de agar, debido a que los medio de culWLYR RIUHFHQ XQ EXHQ VXVWUDWR SDUD HO GHVDUUROOR GH KRQJRV \ EDFWHULDV TXH SXHGHQ DIHFWDU HO GHVDUUROOR GH OD SODQWD HQ HO VXHOR (O PD\RU SUREOHPD HQ HVWD HWDSD HV OD GHVhidratacin debido a algunas caractersticas GH ODV SODQWDV FXOWLYDGDV in vitro: reducida cera HSLFXWLFXODU OHQWLWXG GH PRYLPLHQWR HVWRPiWLFR DEXQGDQWHV HVSDFLRV LQWHUFHOXODUHV GLFXOWDdes en las conexiones del tallo y la raz. Por lo FXDO FRQYLHQH WUDQVIHULU ODV SODQWDV D PDFHWDV \ PDQWHQHUODV FRQ DOWD KXPHGDG UHODWLYD SRU ORV SULPHURV GtDV 7DPELpQ VH KDQ REVHUYDGR EXHQRV UHVXOWDGRV FRQ HO XVR GH URFtR DUWLFLDO R QHEOLQD 2WUD SUiFWLFD IUHFXHQWH HV FXEULU ODV SODQWDV FRQ SROLHWLOHQR R UHFLSLHQWHV GH YLGULR WUDQVSDUHQWH D PRGR GH FiPDUD K~PHGD \ GHVFXEULUODV SURJUHVLYDPHQWH KDVWD GHVWDSDUODV FRPSOHWDPHQWH DO FDER GH y VHPDQDV Multiplicacin del material ex vitro /DV SODQWDV OLEUHV GH SDWyJHQRV GHEHQ VHU PXOWLSOLFDGDV EDMR FRQGLFLRQHV FRQWURODGDV SDUD HYLWDU VX UHFRQWDPLQDFLyQ 8QD YH] UXVWLFDGDV \ DGDSWDGDV QXHYDPHQWH D ODV FRQGLciones ex vitro SXHGHQ VHU PXOWLSOLFDGDV EDMR
MDXODV DQWLYHFWRUHV WRGR HO WLHPSR TXH VH FRQVLGHUH QHFHVDULR (Q HVWD HWDSD HV LPSRUWDQWH HYLWDU TXH ODV SODQWDV VH UHLQIHFWHQ (V UHFRPHQGDEOH OD HVWHULOL]DFLyQ GHO VXHOR SDUD evitar la contaminacin con nematodes y hongos que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de PDOOD PX\ QD SDUD HYLWDU OD HQWUDGD ORV YHFtores. Por la misma razn, es recomendable XQD GREOH SXHUWD GH DFFHVR 3HULyGLFDPHQWH OD PDOOD GHEH VHU FRQWURODGD SDUD GHWHFWDU URWXUDV (V UHFRPHQGDEOH DSOLFDU LQVHFWLFLGDV \ PDQWHQHU OLEUH GH PDOH]DV TXH SXHGDQ DFWXDU como reservorio de vectores tanto dentro como fuera de la jaula. Si bien el material introducido D ODV MDXODV GHEH VHU SUHYLDPHQWH FRQWURODGR UHVSHFWR D VX VDQLGDG HV FRQYHQLHQWH HQ HVWD HWDSD UHSHWLU ORV DQiOLVLV SDUD GHWHFWDU UiSLGDmente si se evidencia una infeccin y eliminarOD DQWHV GH TXH VH SURSDJXH (Q HVWDV FRQGLFLRQHV HV SRVLEOH PDQWHQHU SODQWDV PDGUHV SRU PXFKR WLHPSR FRPR XQ VWRFN GH PDWHULDO OLEUH GH YLUXV D SDUWLU GHO FXDO UHDOL]DU VXFHVLYDV PXOWLSOLFDFLRQHV /D HWDSD GH PXOWLSOLFDFLyQ PDVLYD R D JUDQ HVFDOD VH UHDOL]D D FDPSR HQ iUHDV DLVODGDV GH IRFRV GH FRQWDPLQDFLyQ (VWD HWDSD VH H[WLHQGH WRGR HO WLHPSR QHFHVDULR KDVWD REWHQHU HO Q~PHUR UHTXHULGR GH LQGLYLGXRV FRPR SDUD UHDOL]DU XQD SURGXFFLyQ FRPHUFLDO 6L HO iUHD SURWHJLGD HVWi OR VXFLHQWHPHQWH DOHMDGD GH SODQWDV LQIHFWDGDV \ VH HYLWD HO DFFHVR GH ORV YHFWRUHV HV SRVLEOH PDQWHQHU HVWDV SODQWDV SRU PXFKRV FLFORV GH FXOWLYR 6RQ IXQGDPHQWDOHV HQ HVWD HWDSD ORV DQiOLVLV SHULyGLFRV TXH SHUPLWDQ OOHYDU XQ UHJLVWUR GHO HVWDGR VDQLWDULR del material. $OWHUQDWLYDV SDUD PHMRUDU OD HFLHQFLD HQ la produccin de plantas libres de virus Termoterapia. Es la tcnica ms antigua XWLOL]DGD SDUD OD OLEHUDFLyQ GH SDWyJHQRV HQ SODQWDV 3HUR VyOR FRQ HO HPSOHR GH DOWDV WHPSHUDWXUDV GLItFLOPHQWH VH FRQVLJDQ SODQWDV OLEUHV GH YLUXV 0DQWHQHU ODV SODQWDV HQIHUPDV SRU SHUtRGRV SURORQJDGRV D DOWDV WHPSHUDWXUDV GLVPLQX\H OD FRQFHQWUDFLyQ GH YLUXV HQ OD SODQWD SHUR DO OOHYDUODV QXHYDPHQWH D FRQGLFLRQHV QRUPDOHV HQ SRFR WLHPSR UHFXSHUDQ HO QLYHO original.
8QD SUiFWLFD PX\ XVDGD HV OD FRPELQDFLyQ GH OD WHUPRWHUDSLD \ HO FXOWLYR GH PHULVWHPDV (VWR LPSOLFD PDQWHQHU ODV SODQWDV HQ WHUPRWHUDSLD SRU XQ SHUtRGR YDULDEOH GH WLHPSR \ WHPSHUDWXUD HQWUH \ qC desde una a varias semanas), luego se realiza la extraccin del meristema, se siembra en el medio de cultivo y VH FRQWLQXD FRQ ORV SDVRV FRQYHQFLRQDOHV SDUD su desarrollo. (VWD SUiFWLFD QR HV HIHFWLYD SDUD WRGRV ORV YLUXV SRU LJXDO GHSHQGH GHO YLUXV \ GHO KRVSHdante. Se ha visto que un mismo virus en disWLQWDV HVSHFLHV VH LQDFWLYD HQ IRUPD GLIHUHQWH *HQHUDOPHQWH HVWD SUiFWLFD KD UHVXOWDGR PiV HIHFWLYD HQ YLUXV GH SDUWtFXODV DODUJDGDV \ PHQRV HFLHQWH SDUD YLUXV SROLpGULFRV 3RGUtD VXSRQHUVH TXH FXDQWR PiV ODUJR HV el tratamiento con calor sera ms efectivo, sin HPEDUJR QR UHVXOWD VLHPSUH DVt (Q FULVDQWHPR \ DMR SRU HMHPSOR VH KD REVHUYDGR TXH WUDWDPLHQWRV GH GtDV SXHGHQ VHU HIHFWLYRV SDUD OD OLEHUDFLyQ GH DOJXQRV YLUXV HQ FDPELR WUDWDPLHQWRV PDV SURORQJDGRV QR VLHPSUH SURGXFHQ PD\RU SRUFHQWDMH GH SODQWDV VDQDV $GHPiV GLFXOWDQ OD LPSODQWDFLyQ GHO WHMLGR DFRQdiciones in vitro, traducindose en un nmero PHQRU GH SODQWDV REWHQLGDV En algunos casos la combinacin de bajas WHPSHUDWXUDV qC) seguido del cultivo de meULVWHPD IXH XWLOL]DGD FRQ p[LWR SDUD OD OLPSLH]D GH YLUXV (VWD SUiFWLFD VH DSOLFy VREUHWRGR HQ el caso de viroides, que se desarrollan bien con DOWDV WHPSHUDWXUDV Quimioterapia. El uso de antivirales sera la VROXFLyQ GHQLWLYD SDUD HVWDV HQIHUPHGDGHV sin embargo hasta ahora no se ha encontrado XQ FRPSXHVWR DVt $OJXQDV VXVWDQFLDV TXtPLFDV ocasionan una disminucin en la concentracin GH YLUXV \ DWHQ~DQ R VXSULPHQ ORV VtQWRPDV TXH SURGXFH OD LQIHFFLyQ SHUR VXVSHQGLGR HO WUDWDPLHQWR VH UHFXSHUD OD FRQFHQWUDFLyQ YLUDO Se han evaluado diferentes sustancias, la ms utilizada es la Ribavirina (1-b-D-ribofuranosyl-1, WULD]ROHFDUER[DPLGH 9LUD]ROH HV HO QRPEUH FRPHUFLDO 6LQ HPEDUJR XQ SUREOHPD LPSRUWDQWH FRQ HVWH FRPSXHVWR HV VX WRWR[LFLGDG TXH GHSHQGH GH OD GRVLV HPSOHDGD \ GH OD HVSHFLH WUDWDGD (O p[LWR GHO SURFHVR HQ PXFKRV casos requiere de varios meses de tratamiento \ OD WRWR[LFLGDG SXHGH FRQVWLWXLU XQD GLFXOWDG
8Q PRGR DGHFXDGR GH HPSOHR GH ORV DQWLYLrales es la combinacin con el cultivo de meULVWHPD (Q DOJXQRV FDVRV KDQ VLGR DSOLFDGRV directamente a los meristemas in vitro, colocando el antiviral en el medio de cultivo. Las SODQWDV VRQ PDQWHQLGDV EDMR OD DFFLyQ GHO DQWLYLUDO SRU ODUJRV SHUtRGRV TXH LQFOX\HQ YDULRV subcultivos. 7DPELpQ VH KDQ REWHQLGR SODQWDV OLEUHV GH YLUXV D SDUWLU GH FDOORV D ORV TXH SUHYLDPHQWH VH DSOLFy 5LEDYLULQD DXQTXH OD SUiFWLFD QR KD VLGR HFLHQWH HQ WRGRV ORV FDVRV (OHFWURWHUDSLD (O PpWRGR FRQVLVWH HQ DSOLFDU FRUULHQWH HOpFWULFD D \HPDV SRU XQ SHUtRGR YDULDEOH GH WLHPSR SDUD REWHQHU SODQWDV OLEUHV GH SDWyJHQRV 6H VXSRQH TXH OD DSOLFDFLyQ GH HOHFWULFLGDG SURGXFH OD GHJUDGDFLyQ GH ODV SDUWtFXODV \ SpUGLGD GH LQIHFWLYLGDG (VWD WpFQLFD KD VLGR LPSOHPHQWDGD SDUD OLEHUDU GH PRVDLFR al almendro cv Caetanuccia. En este caso, broWHV GH PP VH VRPHWLHURQ D 9 SRU WLHPSRV YDULDEOHV \ OXHJR VH LQMHUWDURQ VREUH SLHV VDQRV REWHQLGRV SRU VHPLOOD &RQ PLQXWRV de tratamiento los resultados fueron buenos, y FRQ PLQXWRV VH REWXYR FRPSOHWD LQDFWLYDFLyQ YLUDO (O PpWRGR WDPELpQ KD VLGR HPSOHDGR SDUD HOLPLQDU EDFWHULDV GH FDxD GH D]~FDU Potato leaf roll virus GH SDSD Dasheen mosaic virus de araceas y Banana streak virus de baQDQD HQWUH RWUDV /D HFLHQFLD GH OD WpFQLFD SXHGH GHSHQGHU GHO FXOWLYDU HO SDWyJHQR \ HO JHQRWLSR Cultivo de domo proveniente del disco basal (del ingls, stem-disc dome culture (O SURFHGLPLHQWR FRQVLVWH HQ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV D SDUWLU GHO FXOWLYR GH HVWUXFWXUDV FRQ IRUPD GH GRPR GLIHUHQFLDGDV D SDUWLU GHO cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se ha informado la diferenciacin de 20-30 brotes D SDUWLU GHO FXOWLYR GHO GLVFR EDVDO GH GLHQWHV de ajo en 1 mes de cultivo. Originalmente, el mtodo se llam cultivo del disco basal (stemdisc culture 8QD PRGLFDFLyQ SRVWHULRU GH esta tcnica que consiste en la extraccin de las estructuras con forma de domo y su cultivo HQ PHGLR DGHFXDGR SHUPLWH REWHQHU SODQWDV libres de virus. 0LFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV in vitro SDUD REWHQFLyQ GH SODQWDV GH QDUDQMR OLEUHV GH virus. La tcnica consiste en extraer el meriste-
ma de la variedad a injertar, y luego sembrarlo VREUH OD VXSHUFLH GHFDSLWDGD GHO HSLFyWLOR GH XQD SOiQWXOD SURYHQLHQWH GH VHPLOOD FUHFLGD in vitro 6H WUDEDMD FRQ SOiQWXODV FUHFLGDV in vitro, GH DSUR[LPDGDPHQWH VHPDQDV GH HGDG 6H ODV H[WUDH GHO WXER \ VH FRUWD HO HSLFyWLOR \ HO iSLFH GH OD UDt] GHMDQGR XQ WUR]R GH FP Los cotiledones y yemas axilares tambin se HOLPLQDQ (Q OD EDVH GHO WDOOR FRUWDGR VH SUDFWLca una incisin en forma de "T" invertida, donde se coloca el meristema (domo con 1, o 2 SULPRUGLRV IROLDUHV SURYHQLHQWH GH OD SODQWD GH FDPSR TXH VH GHVHD LQMHUWDU /DV SODQWDV microinjertadas se colocan en medio de cultivo DGHFXDGR SDUD VX GHVDUUROOR \ FXDQGR WLHQHQ KRMLWDV VH LQMHUWDQ HQ SODQWDV QRUPDOHV GH vivero. Anlisis de las plantas obtenidas Como hemos visto existen varias alternatiYDV SDUD REWHQHU SODQWDV OLEUHV GH YLUXV D SDUWLU del cultivo de meristemas, y si bien contamos con lineamientos o consideraciones generales SDUD DXPHQWDU ODV SRVLELOLGDGHV GH p[LWR QR KD\ SURFHVR TXH RIUH]FD WRWDO VHJXULGDG /D HWDSD GHFLVLYD HQ HVWH VLVWHPD HV HO DQiOLVLV GH ODV SODQWDV REWHQLGDV FXDQGR FRPSUREDPRV VL UHDOPHQWH VH DOFDQ]y HO REMHWLYR (PSOHDQGR HO PLVPR SURWRFROR HQ HO PLVPR PRPHQWR FRQ HO PLVPR PDWHULDO HV SRVLEOH REWHQHU SODQWDV VDQDV \ SODQWDV TXH D~Q SHUPDQHFHQ LQIHFWDGDV Por lo tanto, la nica forma de diferenciarlas VHUi PHGLDQWH SUXHEDV R WHVWV TXH HVWDEOH]FDQ VX HVWDGR VDQLWDULR (O p[LWR GH XQ SURJUDPD GH SURGXFFLyQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV QR GHSHQGH GH OD REWHQFLyQ GH XQ DOWR SRUFHQWDMH GH SODQWDV VDQDV HQ DO SULPHUD HWDSD VLQR GH DO PHQRV XQDV SRFDV SODQWDV PDGUHV UHDOPHQWH OLEUHV GH SDWyJHQRV TXH OXHJR SRGUHPRV PXOWLSOLFDU SRU GLIHUHQWHV VLVWHPDV (V UHFRPHQGDEOH DQDOL]DU ODV SODQWDV PDGUHV PiV GH XQD YH] SDUD DVHJXUDU VX VDQLGDG HV SUHIHULEOH TXH VHD HQ HWDSDV GLIHUHQWHV D OR ODUJR GHO SURFHVR \ HQ OR SRVLEOH SRU WpFQLFDV GLVWLQWDV 3DUD UHDOL]DU XQ DQiOLVLV FRQDEOH KD\ TXH WHQHU HQ FXHQWD YDULRV IDFWRUHV TXH VRQ HVSHFtFRV SDUD FDGD FRPELQDFLyQ SODQWDSDWyJHQR /D HOHFFLyQ GH OD WpFQLFD GH DQiOLVLV GHSHQGHUi GHO SDWyJHQR \ GH ODV SRVLELOLGDGHV SDUD UHDOL]DUOD (V LPSRUWDQWH HO HPSOHR GH VLVWHPDV
GH DOWD VHQVLELOLGDG TXH QRV SHUPLWDQ GHWHFWDU los virus an en bajas cantidades. Sin embargo QR H[LVWH XQD SUXHED TXH VHD LQIDOLEOH VLHPSUH KD\ XQ OtPLWH GH FRQFHQWUDFLyQ GHO SDWyJHQR SRU GHEDMR GHO FXDO QR SXHGH VHU GHWHFWDGR 3DUD evitar errores en este sentido es recomendable tener en cuenta algunas consideraciones. Como ya se ha mencionado, la concentracin GH YLUXV QR HV LJXDO HQ WRGDV ODV SDUWHV GH XQD SODQWD SRU OR WDQWR HV UHFRPHQGDEOH HVWDEOHFHU HQ TXH WLSR GH WHMLGRV X yUJDQRV VH FRQFHQWUD HO SDWyJHQR \ UHDOL]DU OD SUXHED D SDUWLU GH HOORV 'HO PLVPR PRGR VH KD FRPSUREDGR TXH H[LVWHQ XFWXDFLRQHV HQ OD FRQFHQWUDFLyQ YLUDO D OR ODUJR GHO FLFOR GH FXOWLYR SRU OR WDQWR HV FRQYHQLHQWH UHDOL]DU ODV SUXHEDV HQ YDULDV RFDVLRQHV R ELHQ VL VH FRQRFH HQ DTXHO SXQWR en que virus alcanza su mayor ttulo. Esto es VREUHWRGR LPSRUWDQWH FXDQGR VH SUXHED HO PDWHULDO WUDQVIHULGR D FDPSR &XDQWR PiV WHPSUDQR GHVFDUWHPRV ODV SODQWDV FRQWDPLQDGDV PiV VHJXUR VHUi HO VLVWHPD 8QD SODQWD LQIHFWDGD VLHPSUH HV XQ IRFR GH FRQWDPLQDFLyQ \ SRU PiV FXLGDGRV TXH VH WHQJDQ VLHPSUH VH FRUUHQ ULHVJRV &XDQGR ODV SODQWDV HVWiQ in vitro, en general, la concenWUDFLyQ GH YLUXV HV PX\ EDMD SUREDEOHPHQWH debido a las condiciones de cultivo, la concentracin de hormonas en el medio, u otros factoUHV QR PX\ FODURV 6LQ HPEDUJR ODV SODQWDV QR GHEHQ GHMDU GH DQDOL]DUVH HQ HVWD HWDSD )UHFXHQWHPHQWH VH PHQFLRQD HO HPSOHR GH la tcnica inmunoenzimtica de doble sndZLFK GH DQWLFXHUSRV '$6(/,6$ (VWD WpFQLFD WLHQH YDULDV YHQWDMDV SHUPLWH HO DQiOLVLV VLPXOWiQHR GH PXFKDV PXHVWUDV FHOGDV SRU SODFD YDULDV SODFDV SRU HQVD\R HV UHODWLYDmente fcil y de bajo costo. Sin embargo, no es OR VXFLHQWHPHQWH VHQVLEOH FRPR SRU HMHPSOR SDUD GHWHFWDU YLUXV HQ PXHVWUDV GH SODQWDV in vitro (Q HVWRV FDVRV PXFKDV GH ODV SODQWDV in vitro que dan resultados negativos medianWH '$6(/,6$ UHVXOWDQ SRVLWLYDV FXDQGR VH SUXHEDQ SRU RWUD WpFQLFD PiV VHQVLEOH $OJXnas variantes como ELISA en membrana de nitrocelulosa, o dot blot ODV SURWHtQDV VH DSOLFDQ GLUHFWDPHQWH HQ ODV PHPEUDQDV VLQ SDVDU SRU ORV SURFHVRV GH HOHFWURIRUHVLV \ WUDQVIHUHQFLD el revelado es similar al de un western blot), WDPELpQ KDQ VLGR HPSOHDGDV FRQ UHVXOWDGRV
satisfactorios, sin embargo cuando se las utili]D VRODV IDOODQ HQ OD GHWHFFLyQ GH PXFKDV SODQtas infectadas (falsos negativos). Mejores resultados se han obtenido con el HPSOHR GH WpFQLFDV TXH FRPELQDQ OD VHURORJtD FRQ OD PLFURVFRStD HOHFWUyQLFD FRPR VRQ OD LQPXQRHOHFWURPLFURVFRStD FRQ R VLQ GHFRUDFLyQ (ISEM ISEM-D). Estas tcnicas son altamenWH VHQVLEOHV \ SHUPLWHQ OD REVHUYDFLyQ GLUHFWD GHO YLUXV SRU OR FXDO QR KD\ IDOVRV SRVLWLYRV \ QR VH UHTXLHUH XQ DQWLVXHUR GH DOWD FDOLGDG SDUD VX desarrollo. El inconveniente es que no son de uso masivo debido a que es engorroso analizar JUDQ FDQWLGDG GH PXHVWUDV \ D TXH HO HTXLSDPLHQWR TXH VH UHTXLHUH PLFURVFRSLR HOHFWUyQLco) es altamente costoso. Las tcnicas basadas en la deteccin de los cidos nucleicos han mostrado un gran desarrollo y evolucin en la ltima dcada, y son utilizadas con frecuencia debido a su alta VHQVLELOLGDG \ HVSHFLFLGDG (O XVR GH VRQGDV moleculares ha dado buenos resultados. La UHDFFLyQ HQ FDGHQD GH OD SROLPHUDVD 3&5 \ sus variantes son las tcnicas de mayor sensiELOLGDG TXH VH FXHQWD KDVWD HO SUHVHQWH (QWUH HOODV VH PHQFLRQDQ 3&5 DQLGDGR WUDQVFULSWDVD UHYHUVD 573&5 LQPXQR FDSWXUD ,& 57 3&5 HQWUH RWUDV (VWR SRVLELOLWD GHWHFWDU ORV YLrus, an en bajsimas concentraciones. Si bien HVWDV SUXHEDV VRQ DOWDPHQWH VHQVLEOHV D~Q QR son de uso masivo. 3DUD REWHQHU UHVXOWDGRV FRQDEOHV HV UHFRPHQGDEOH OD FRPELQDFLyQ GH YDULDV SUXHEDV HV GHFLU DSURYHFKDU OD SUDFWLFLGDG GHO (/,6$ \ la sensibilidad de las tcnicas moleculares, de ,6(0 X RWUDV (Q HVWH FDVR ODV SODQWDV TXH UHVXOWDQ QHJDWLYDV D (/,6$ SXHGHQ VHU OXHJR DQDOL]DGDV SRU XQD WpFQLFD PiV VHQVLEOH \ GLVPLQXLU DVt HO Q~PHUR GH SUXHEDV FRPSOLFDGDV o costosas. Como se mencion anteriormente, la conFHQWUDFLyQ GH YLUXV HQ ODV SODQWDV in vitro en JHQHUDO HV EDMD SRU OR WDQWR VH FRUUH HO JUDYH ULHVJR GH FRQVLGHUDU FRPR VDQDV SODQWDV TXH en realidad estn infectadas. Por esta razn se KDFH FDVL REOLJDWRULR UHSHWLU ORV DQiOLVLV HQ ODV SODQWDV ex vitro (V QHFHVDULR GHMDU SDVDU FLHUWR WLHPSR DQWHV GH KDFHU HO DQiOLVLV SDUD TXH HO YLUXV VL HVWi SUHVHQWH WHQJD OD SRVLELOLGDG de incrementar su concentracin y resulte ms
IiFLO GHWHFWDUOR (Q HVWD HWDSD HV IUHFXHQWH OD utilizacin de ELISA en cualquiera de sus variantes, con buenos resultados. En algunos casos el sistema que resulta PiV HFLHQWH SDUD DQDOL]DU ODV SODQWDV REWHQLGDV HV HO HPSOHR GH SODQWDV LQGLFDGRUDV (O injerto es la forma ms segura de transmitir un YLUXV \ HVWR HV OR TXH VH HPSOHD FRPR VLVWHPD de diagnstico. Se realiza un injerto desde la SODQWD TXH VH GHVHD SUREDU D SODQWDV VXVFHStibles (indicadoras) y que desarrollan sntomas HYLGHQWHV GH OD SUHVHQFLD GHO SDWyJHQR (O LQFRQYHQLHQWH HQ HVWH WLSR GH DQiOLVLV HV TXH KD\ TXH HVSHUDU TXH OD SODQWD REWHQLGD in vitro VHD WUDQVIHULGD D VXHOR \ TXH GHVDUUROOH OR VXFLHQWH FRPR SDUD H[WUDHU XQD SRUFLyQ GH WHMLGR KRMD \HPD EURWH HWF VHJ~Q HO WLSR GH LQMHUWR $GHPiV QHFHVLWDPRV XQ RSHUDGRU FRQ KDELOLGDG SDUD UHDOL]DU HO LQMHUWR FRQ p[LWR \ OXHJR PDQWHQHU ODV SODQWDV LQMHUWDGDV HQ FRQGLFLRQHV DGHFXDGDV KDVWD TXH DSDUH]FDQ ORV VtQWRPDV (Q DOJXQRV FDVRV HVWH WLHPSR SXHGH VHU PX\ SURORQJDGR $ SHVDU GH ORV LQFRQYHQLHQWHV TXH VH PHQFLRQDQ SDUD DOJXQDV HVSHFLHV HVWH VLgue siendo el mtodo ms seguro. Por ejemSOR HQ IUXWLOOD XQD HVSHFLH DIHFWDGD SRU PiV de 20 enfermedades diferentes de las que en muchos casos ni siquiera se ha caracterizado HO DJHQWH FDXVDO OD WUDQVPLVLyQ D SODQWDV LQGLFDGRUDV UHVXOWD OD SUXHED PiV HIHFWLYD (Q HVWH FDVR VH LQMHUWD HO IROtROR PHGLR GH OD SODQWD TXH VH GHVHD SUREDU D SODQWDV LQGLFDGRUDV HQ ODV FXDOHV ORV SDWyJHQRV YDQ D GDU VtQWRPDV notables. Algunos virus se van a manifestar GHVSXpV GH y VHPDQDV GH UHDOL]DGR HO LQjerto, en otros casos la bibliografa menciona TXH ORV VtQWRPDV DSDUHFHQ UHFLpQ GHVSXpV GH PHVHV y LQFOXVR DxR &RQ IUHFXHQFLD QR HV SRVLEOH LGHQWLFDU TXH YLUXV HV HO TXH HVWi SUHVHQWH SHUR HV SRVLEOH GHWHUPLQDU VL OD SODQWD est infectada. (Q YLG SDUWH GH ORV YLUXV VRQ DQDOL]DGRV PHGLDQWH (/,6$ VLQ HPEDUJR SDUD RWURV VH XWLOL]D HO LQMHUWR D SODQWDV LQGLFDGRUDV $OJXQRV GH ORV YLUXV SXHGHQ VHU GHWHFWDGRV HQ SRFDV VHPDQDV SHUR SDUD VtQGURPHV FRPR HO GHO WDOOR estriado o agujereado (stem pitting/grooving) SRU HMHPSOR HV QHFHVDULR HVSHUDU HQWUH y 12 meses.
Consideraciones respecto a los anlisis de virus (Q JHQHUDO FXDQGR VH KDEOD GH ODV SODQWDV OLEHUDGDV GH YLUXV VH HPSOHDQ WpUPLQRV FRPR SODQWDV OLEUHV GH YLUXV SODQWD VDQD VDQHDGD VLQ TXH VH GHQD TXH YLUXV IXHURQ HOLPLQDGRV QL TXH SUXHEDV VH HPSOHDURQ SDUD FRPSUREDU VX HOLPLQDFLyQ (O FRQFHSWR GH SODQWDV libres de virus debera estar acotado a los viUXV DQDOL]DGRV (Q HO FDVR GH SODQWDV TXH VRQ DIHFWDGDV SRU XQ FRQMXQWR GH YLUXV GLIHUHQWHV VHUtD QHFHVDULR UHDOL]DU XQ DQiOLVLV LQGHSHQGLHQWH SDUD FDGD XQR GH HOORV \ VHxDODU HO R ORV YLUXV GH ORV FXDOHV KD VLGR OLEHUDGD R SUREDGD 3RU RWUD SDUWH GHEH GHQLUVH OD WpFQLFD GH DQiOLVLV HPSOHDGD \D TXH QR WRGDV WLHQHQ OD misma sensibilidad. Todas las tcnicas tienen XQ OtPLWH GH VHQVLELOLGDG SRU GHEDMR GHO FXDO QR VRQ FDSDFHV GH GHWHFWDU OD SUHVHQFLD GHO SDWyJHQR 3RU FRQVLJXLHQWH GHSHQGLHQGR GH OD VHQVLELOLGDG GH OD WpFQLFD TXH VH XVH HO SRUFHQWDMH GH SODQWDV VXSXHVWDPHQWH OLEUHV GH YLUXV SXHGH YDULDU /R FRUUHFWR VHUtD HQWRQFHV KDEODU GH SODQWDV QHJDWLYDV D ORV YLUXV SUREDdos y mencionar las tcnica usada. Ejemplos de sistemas de produccin de plantas libres de patgenos sistmicos Produccin de plantas de ajo libres de virus. &RQFL 9& &DIUXQH ( 3HURWWR & \ 4XHYHGR 9 ,17$,)),9( &yUGRED Argentina. (QWUH ORV SDWyJHQRV TXH DIHFWDQ DO FXOWLYR GH DMR ORV YLUXV VRQ ORV UHVSRQVDEOHV GH ODV PD\RUHV SpUGLGDV HQ ORV UHQGLPLHQWRV RFDVLRQDQGR HQWUH XQ \ GH GLVPLQXFLyQ HQ HO SHVR GH ORV EXOERV /DV LQIHFFLRQHV FDXVDGDV SRU numerosos virus, si bien no causan la muerte GH OD SODQWD SURGXFHQ HQIHUPHGDGHV FUyQLFDV 'HELGR D TXH HO DMR VH SURSDJD H[FOXVLYDPHQWH GH IRUPD DJiPLFD ODV SODQWDV LQIHFWDGDV SRU diferentes combinaciones de estos virus los transmiten a las sucesivas generaciones y a ODV GLVWLQWDV UHJLRQHV GH SURGXFFLyQ /D XWLOL]DFLyQ GH PDWHULDOHV OLEUH GH YLUXV REWHQLGR SRU FXOWLYR GH PHULVWHPDV HV SRU HO PRPHQWR OD nica forma de control utilizada.
En trabajos realizados en Argentina se ensa\DURQ WUDWDPLHQWRV GH WHUPRWHUDSLD FRQ DJXD \ FRQ DLUH FDOLHQWH SUHYLRV D OD H[WUDFFLyQ GH los meristemas. Los mejores resultados se obWXYLHURQ FRQ DLUH FDOLHQWH FRQ XQ GH SODQWDV OLEUHV GH YLUXV (Q DOJXQRV FXOWLYDUHV QR VH FRQVLJXLHURQ SODQWDV OLEUHV GH YLUXV VLQ HO HPSOHR GH WHUPRWHUDSLD PLHQWUDV TXH DOJXQRV JHQRWLSRV IXHURQ OLEHUDGRV VyOR FRQ HO HPSOHR GHO FXOWLYR GH PHULVWHPD (Q OD )LJXUD VH GHVFULEH HO SURFHGLPLHQWR XWLOL]DGR SDUD OD REWHQFLyQ GH ODV SODQWDV GH DMR libres de virus. Se inici con la extraccin del meristema incluyendo el disco basal. Se desLQIHFWy \ VH H[WUDMR HO H[SODQWR FRQVWLWXLGR HQ HVWH FDVR SRU HO GRPR PiV XQ SULPRUGLR IROLDU 6H VHPEUy HQ PHGLR GH LQLFLDFLyQ SDUD GHVDUUROODU XQD SODQWD FRPSOHWD )LJ $ /DV SODQtas obtenidas se analizaron mediante ISEM-D, FRQ DQWLVXHURV HVSHFtFRV SDUD ORV YLUXV GH LQWHUpV /DV SODQWDV TXH UHVXOWDURQ QHJDWLYDV D WRGDV ODV SUXHEDV VH WUDQVULHURQ D PHGLR GH PLFURSURSDJDFLyQ )LJ % /XHJR GH YDULRV ciclos in vitro PXFKDV SODQWDV EXOELFDQ HVSRQtneamente y otras deben ser inducidas (Fig. 1C). Los minibulbillos obtenidos in vitro se cosecharon y se sembraron en suelo estril. Las SODQWDV TXH QR IRUPDURQ EXOERV VH WUDQVULHURQ a maceta y se mantuvieron en cmara hmeda SRU XQ SHUtRGR GH WLHPSR YDULDEOH OXHJR VH ODV DGDSWy GH PDQHUD SDXODWLQD D ODV FRQGLFLRQHV QDWXUDOHV GH KXPHGDG \ WHPSHUDWXUD )LJ ' ( /DV SODQWDV ex vitro VH SUREDURQ PHGLDQWH '$6(/,6$ SDUD FRQVWDWDU VX HVWDGR VDQLWDULR y se mantuvieron bajo jaulas anti-vectores. Los bulbos cosechados se conservan en lugar fresFR \ VHFR KDVWD OD pSRFD GH VLHPEUD /DV VXFHVLYDV PXOWLSOLFDFLRQHV VH UHDOL]DURQ HQ MDXODV GRQGH VH FRQWLQXy DQDOL]DQGR ODV SODQWDV PHGLDQWH SUXHEDV GH '$6(/,6$ )LJ )* /RV EXOERV SURGXFLGRV VH HQWUHJDURQ D VHPLOOHURV TXH UHDOL]DQ OD PXOWLSOLFDFLyQ HQ iUHDV DLVODGDV de otros cultivos de Alliaceae, hasta obtener el Q~PHUR GH EXOERVHPLOOD VXFLHQWH FRPR SDUD LQLFLDU XQD SURGXFFLyQ FRPHUFLDO /D LPSOHPHQWDFLyQ GH SURJUDPDV WHQGLHQWHV D OD SURGXFFLyQ GH SODQWDV GH DMR OLEUH GH YLUXV \ HO FRQWURO GH HQIHUPHGDGHV HV LPSRUWDQWH \D TXH HQ $UJHQWLQD ULJHQ QRUPDWLYDV SDUD OD VFDOL]DFLyQ GH VHPLOOD GH DMR (VWDV QRUPDV
establecen una serie de categoras de semilla (Bsica, subcategora Preinicial, Inicial y Fundacin; Registrada, subcategora A y B; y &HUWLFDGD FDGD XQD GH ODV FXDOHV FRQWHPSOD XQ YDORU Pi[LPR WROHUDGR SDUD OD SUHVHQFLD GHO virus Onion yellow dwarf virus, UHVSRQVDEOH HQ QXHVWUD UHJLyQ GH ODV PD\RUHV SpUGLGDV HQ ORV rendimientos. Sin embargo, dado el avance de ORV FRQRFLPLHQWRV UHVSHFWR DO GDxR TXH SURGXcen otros virus, seguramente algunos otros sern considerados en el futuro. Plantas ctricas libres de enfermedades. Costa N., Plata M.I. y Anderson C. INTA EEA. Entre Ros, Argentina. /DV HQIHUPHGDGHV SURGXFLGDV SRU YLUXV YLURLGHV \ RWURV RUJDQLVPRV VLPLODUHV SURGXFHQ LPSRUWDQWHV SpUGLGDV HFRQyPLFDV HQ ORV FtWULFRV GH WRGR HO PXQGR $OJXQDV SURYRFDQ OD PXHUWH GH ODV SODQWDV \ RWUDV GLVPLQX\HQ OD SURGXFFLyQ \ OD FDOLGDG GH OD IUXWD FDXVDQGR SpUGLGD GH YLJRU \ GH ORQJHYLGDG GH OD SODQWD /DV SULQFLSDOHV HQIHUPHGDGHV FDXVDGDV SRU HVWH WLSR GH PLFURRUJDQLVPRV VRQ SVRURVLV tristeza, exocortis y cachexia. Estas enfermeGDGHV VH KDQ H[WHQGLGR GHELGR D OD SURSDgacin vegetativa de material infectado. Es normal encontrar varias virosis en una misma SODQWD \ HQ PXFKRV SDtVHV FRPR $UJHQWLQD FDVL OD WRWDOLGDG GH ODV SODQWDV DGXOWDV HVWiQ DIHFWDGDV SRU DOJXQD YLURVLV /D SVRURVLV \ RWUDV HQIHUPHGDGHV VH WUDQVmiten mediante el injerto de yemas. Una vez KHFKR HO LQMHUWR OD SODQWD SXHGH SHUPDQHFHU con la enfermedad latente durante muchos DxRV /DV \HPDV TXH VH H[WUDLJDQ GH XQD SODQWD FRQ HQIHUPHGDG ODWHQWH RULJLQDUiQ SODQWDV enfermas. /RV SDtVHV FRQ FLWULFXOWXUD GH DYDQ]DGD KDQ EDVDGR VX p[LWR HQ HO HPSOHR GH 3URJUDPDV GH &HUWLFDFLyQ XWLOL]DGR SODQWDV OLEUHV GH HQIHUmedades. /D WHUPRWHUDSLD \ OD REWHQFLyQ GH SODQWDV QXFOHDUHV KDQ VLGR WpFQLFDV PX\ XWLOL]DGDV SDUD HVWH REMHWLYR $FWXDOPHQWH HQ JUDQ SDUWH GH ORV SDtVHV FLWUtFRODV TXH WLHQHQ SURJUDPDV GH HOLminacin de virus y viroides, se utiliza la tcniFD GH PLFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV in vitro. La combinacin de las tcnicas de termoteUDSLD \ GH PLFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV in
Figura 1 3URGXFFLyQ GH SODQWDV GH DMR OLEUHV GH YLUXV $ SODQWD HQ PHGLR GH LQLFLDFLyQ % PLFURSURSDgacin. C: bulbillos obtenidos in vitro PLFUREXOELOORV ' SODQWD WUDQVIHULGD D WLHUUD \ PDQWHQLGD HQ FiPDUD K~PHGD ( SODQWD DGDSWDGD D ODV FRQGLFLRQHV ex vitro ) SODQWDV HQ VXHOR EDMR MDXOD DQWLiGRV * PXOWLSOLFDFLyQ D JUDQ HVFDOD EDMR MDXOD DQWLiGRV + EXOERV GH DMR OLEUH GH YLUXV DUULED H LQIHFWDGRV DEDMR
vitro ORJUD REWHQHU XQ DOWR SRUFHQWDMH GH SODQtas ctricas libres de virus. (Q OD )LJXUD VH GHVFULEH HO SURFHGLPLHQWR SDUD OD REWHQFLyQ GH SODQWDV FtWULFDV OLEUHV GH YLUXV (Q SULPHU OXJDU VH VHOHFFLRQD XQD SODQta candidata en base a las introducciones de YDULHGDGHV FtWULFDV GH FRSD \ SRUWDLQMHUWR TXH VH UHDOL]DQ D ORV %DQFRV GH *HUPRSODVPD GH selecciones locales y de variedades obtenidas HQ ORV SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR 8QD YH]
VHOHFFLRQDGD OD SODQWD VH OD VRPHWH D WHUPRWHUDSLD \ FXOWLYR GH WHMLGR HPSOHDGR OD WpFQLFD GH PLFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV in vitro. (VWD WpFQLFD FRPSUHQGH ODV VLJXLHQWHV HWDSDV SUHSDUDFLyQ GHO SRUWDLQMHUWR SUHSDUDFLyQ GHO iSLFH LQMHUWR FXOWLYR GH SODQWDV LQMHUWDGDV H LQMHUWR VREUH XQ SODQWtQ YLJRURVR /DV SODQWDV REWHQLGDV SRU PLFURLQMHUWR QR SUHVHQWDQ FDUDFWHUHV MXYHQLOHV \ HQ ODV SODQWDV REWHQLGDV QR VH KDQ REVHUYDGR DQRUPDOLGDGHV FRQ UHVSHFWR D OD SODQWD PDGUH )LJ
Figura 2 2EWHQFLyQ GH SODQWDV FtWULFDV OLEUHV GH HQIHUPHGDGHV $ SODQWD REWHQLGD SRU PLFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV in vitro % LQMHUWR VREUH XQ SODQWtQ YLJRURVR & PHPEUDQD GH LQPXQRLQPSUHVLyQ(/,6$ FRQ KXHOODV GH WDOORV GH SODQWDV LQIHFWDGDV FRQ WULVWH]D ' PRWHDGR FDXVDGR SRU SVRURVLV ( HSLQDVWLD FDXVDGD SRU H[RFRUWLV ) DFDQDODGXUDV FDXVDGDV SRU FDFKH[LD[LORSRURVLV * LQYHUQiFXOR FRQ SODQWDV madres libres de enfermedades.
(O p[LWR GH OD WpFQLFD GHSHQGH HQ JUDQ PHGLGD GHO WDPDxR GHO WHMLGR H[WUDtGR \ GHO SDWyJHno a eliminar. En el caso de exocortis, tristeza \ FDFKH[LD HO SRUFHQWDMH GH SODQWDV OLEUHV HV VXSHULRU DO ( YLUXV GH OD SVRURVLV GH ORV ctricos es bastante ms difcil de eliminar. 8QD YH] REWHQLGD OD SODQWD GH PLFURLQMHUWR \ FXDQGR WLHQH WDPDxR VXFLHQWH VH UHDOL]DQ ODV SUXHEDV GH GLDJQyVWLFR SDUD FRPSUREDU TXH HVWpQ OLEUHV GH SDWyJHQRV /DV WpFQLFDV GH GLDJQyVWLFRV SDUD FDGD HQIHUPHGDG SXHGHQ VHU YDULDV SHUR HQ FDVR VH H[LVWLU RUJDQLVPR nacionales o internacionales de referencia, es FRQYHQLHQWH HPSOHDU DTXHOODV UHFRQRFLGDV R UHFRPHQGDGDV SRU HOORV 3RU HMHPSOR HQ HVWH FDVR SRGUtD WUDWDUVH GH 352&,7586 SUR\HFWR ,17$ SDUD OD REWHQFLyQ SURGXFFLyQ PDQWHQLPLHQWR \ GLVWULEXFLyQ GH SRUWDLQMHUWRV \ FXOWLYDUHV GH HVSHFLHV FtWULFDV FRQ LGHQWLGDG YDULHWDO y estado sanitario controlado), o el Programa 1DFLRQDO GH &HUWLFDFLyQ GH &tWULFRV (Q HVWH FDVR H[LVWH XQD QRUPDWLYD HVSHFtFD SDUD HO funcionamiento de los laboratorios de diagnsWLFR GH HQIHUPHGDG HQ FtWULFRV DSUREDGR SRU ,1$6( \ 6(1$6$ DPERV GHSHQGLHQWHV GH OD SAGPyA (Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin). Produccin de Prunus libres de virus. 'RFDPSR '0 ,17$,)),9( Crdoba, Argentina. 0RQLWRUHRV UHDOL]DGRV HQ HVSHFLHV IUXWDOHV del gnero Prunus GHO iUHD IUXWtFROD WHPSODGD Argentina evidenciaron el deterioro sanitario de SODQWDFLRQHV HQ SURGXFFLyQ \ GH SURSDJDFLyQ 8QD GH FDGD FXDWUR SODQWDV DQDOL]DGDV VH HQFRQWUy LQIHFWDGD SRU XQR R PiV YLUXV 9DULRV factores facilitaron esta situacin: carencia de FRQWUROHV VDQLWDULRV LQHFDFLD GH ORV PpWRGRV HPSOHDGRV HQ ORV DQiOLVLV GLVSHUVLyQ SRU YHFtores, diseminacin de materiales infectados SRU OD FRPHUFLDOL]DFLyQ 8Q 6LVWHPD GH &HUWLFDFLyQ 6DQLWDULD GH 3ODQWDV 3HUHQQHV VH IXQGDPHQWD HQ SURGXFLU HO Q~PHUR GH SODQWDV UHTXHULGDV SRU HO PHUFDGR D SDUWLU GH XQD Planta Inicial. Bsicamente requiere:1) Obtener la Planta Inicial de cultivares \R SRUWDLQMHUWRV VHOHFFLRQDGD SRU VXV FDUDFWHUHV DJURQyPLFRV SXUH]D YDULHWDO \ VX HVWDGR sanitario. Constituye el material fundacional del FXDO GHULYDUi WRGR HO PDWHULDO FHUWLFDGR 8Q
Monte Fundacin. Plantas de reserva y donanWH GH PDWHULDOHV GH SURSDJDFLyQ JHQHUDOPHQWH FRQVWLWXLGR SRU WUHV SODQWDV GH FDGD FXOWLYDU R SRUWDLQMHUWR REWHQLGDV SRU SURSDJDFLyQ DJiPLca de la Planta Inicial.; 3) Un monte de Plantas de Base FRQ DO PHQRV GLH] SODQWDV SRU FXOWLYDU \R SRUWDLQMHUWR GHULYDGDV SURSDJDFLyQ DJiPLca del Monte Fundacin. Son las Plantas MaGUHV GH 3URSDJDFLyQ VRPHWLGDV D ULJXURVRV controles sanitarios y varietales, anuales; 4) Produccin de 3ODQWDV &HUWLFDGDV SDUD YLYHURV H[SHQGHGRUHV GHULYDGDV SURSDJDFLyQ DJimica de Plantas de Base. Obtencin de la Planta Inicial. 1) SelecFLRQDU SODQWDV SRU VX SXUH]D YDULHWDO \ FRQGLciones agronmicas candidata a Planta Inicial. 2) Determinar su estado sanitarios mediante WUDQVPLVLyQ D SODQWDV LQGLFDGRUDV SUXHEDV VHUROyJLFDV PROHFXODUHV \R PLFURVFRSLD HOHFWUyQLFD 6L QLQJXQD GH ODV SODQWDV UHVXOWD OLEUH GH SDWyJHQRV VLVWpPLFRV DSOLFDU WHUPRWHUDSLD seguida de cultivo de meristemas. Los controOHV VDQLWDULRV GH ODV SODQWDV UHJHQHUDGDV SHUmitirn seleccionar la Planta inicial. Termoterapia y cultivo de meristemas. 1) Enraizar en suelo estril estacas GH ODV SODQWDV VHOHFFLRQDGDV \R GH SRUWDLQMHUWRV GH 6DQLGDG &HUWLFDGD SDUD LQMHUWDU \HPDV GH ODV FDQGLdatas a Planta Inicial &RORFDU ODV SODQWDV enraizadas y con brotes (en actividad) en cPDUDV GRQGH UHFLEDQ WHUDSLD FRQ DLUH caliente. 7HPSHUDWXUD YDUtD FRQ OD UHODFLyQ cultivarSDWyJHQR (Q JHQHUDO VH XVD & )RWRSHUtRGR K GH OX] WXERV XRUHVFHQWHV GH OX] EODQFD .OX[ 5LHJR GLiULR +XPHGDG UHODWLYD \ 7LHPSR YDUtD FRQ OD UHODFLyQ SODQWDSDWyJHQR 2VFLOD HQWUH \ VHPDQDV 5HWLUDU ODV SODQWDV GH OD WHUPRWHUDSLD $ FRQWLQXDFLyQ H[WUDHU ORV PHULVWHPDV GH las yemas desarrolladas durante el tratamiento y sembrar en medio de cultivo in vitro. Micropropagacin. 1) Sembrar meristemas GH PP FRQ XQR R GRV SULPRUGLRV IROLDUHV H LGHQWLFDU HO PDWHULDO 5HSLFDU H LGHQWLFDU LQGLYLGXDOPHQWH FDGD \HPD GHO \HPDULR RULJLQDGR &DGD XQD RULJLQDUi XQ FORQ 5HSLcar las yemas manteniendo la individualizacin GHO FORQ 1R VXSHUDU GLH] FLFORV GH PLFURSURSDJDFLyQ Control Sanitario. Antes de la terFHUD PXOWLSOLFDFLyQ WRPDU DO PHQRV SODQWDV GH FDGD FORQ \ DQDOL]DU OD SUHVHQFLD GH ORV SD-
tgenos que se estableci eliminar. Mantener HVWDV SODQWDV DO PHQRV XQD VHPDQD IXHUD GH OD FiPDUD GH FXOWLYR EDMR OX] WHPSHUDWXUD \ KXPHGDG DGHFXDGD SDUD TXH ORV SDWyJHQRV VL ORV KXELHUD LQFUHPHQWHQ VX SREODFLyQ SDUD facilitar su deteccin. El control sanitario deEHUi LQFOXLU WUDQVPLVLyQ D SODQWDV LQGLFDGRUDV SUXHEDV VHUROyJLFDV PLFURVFRStD HOHFWUyQLFD \ tcnicas moleculares. Eliminar los clones que QR VXSHUHQ HO FRQWURO Aclimatacin. 'HVFDO]DU ODV SODQWDV UHgeneradas lavando cuidadosamente sus races bajo chorro de agua hasta retirar la totalidad GHO DJDU 3ODQWDU HQ WHUULQDV SOiVWLFDV desinIHFWDGDV FRQ 1D2&O DO HQ XQD PH]FOD GH WXUED PDQWLOOR \ SHUOLWD HVWpULO Colocar ODV WHUULQDV HQ FiPDUDV GHO GH KXPHGDG UHODWLYD OX] FRQWLQXD WXERV XRUHVFHQWHV GH OX] EODQFD .OX[ 7HPSHUDWXUD HQWUH & $ ORV GtDV WUDQVSODQWDU D FHVWLOORV 0DQWHQHUORV EDMR W~QHOHV GH SROLHWLOHQR HQ LQYHUQDGHUR 5HWLUDU HO SOiVWLFR OHQWDPHQWH XQD SDUWH FDGD GtDV KDVWD VX UHWLUR GHQLWLYR Control Sanitario. Como se describi anteriormente. Lecturas recomendadas
$\DEH 0 DQG 6XPL 6 $ QRYHO DQG HIFLHQW WLVVXH FXOWXUH PHWKRGVWHPGLVF GRPH FXOWXUH IRU SURGXFLQJ YLUXVIUHH JDUOLF Allium sativum L.). 3ODQW &HOO 5HS Canteros B. 2001. Cancrosis de los Citrus en el /LWRUDO $UJHQWLQR ,',$ ;;, $xR &KDQJ 77 7KH FDVH IRU ODUJH FROOHFWLRQV In Brown A.H.D., Frankel O.H., Marshall D.R. DQG :LOOLDPV -7 HGV 7KH XVH RI SODQWJHQHWLF resources. Cambridge University Press, Reino 8QLGR SS &RQFL 9& 9LUXV \ )LWRSODVPDV GH DMR ,Q %XUED -/ HG WHPDV VREUH SURGXFFLyQ GH ajo. EEA-INTA La Consulta, Mendoza, Argentina. 9RO SS &RQFL 9& \ 1RPH 6) 9LUXV IUHH JDUOLF Allium sativum / SODQWV REWDLQHG E\ WKHUPRWKHUDS\ DQG PHULVWHP WLS FXOWXUH - 3K\WRSDWKRORJ\ 192. 'RFDPSR '0 +DHOWHUPDQ 50 \ *XHUUD *' 'LVWULEXFLyQ GHO 31569 3'9 \ 3/9 HQ 3UXQRLGHDV GH UHDV )UXWtFRODV GH OD 5HS~EOLFD $UJHQWLQD 5,$ )UDFFLROL * DQG 0DUDQL ) 9LUXV HOLPLQDWLRQ E\ PHULVWHP WLS FXOWXUH DQG WLS PLFURJUDIWLQJ ,Q +DGLGL $ .KHWDUSDO 5. DQG .RJDQH]DZD +
(eds). Plant virus deasease control. The American 3K\WKRSDWKRORJ\ 6RFLHW\ 6W 3DXO 0LQQHVRWD 86$ SS *HOOD )DxDQDV 5 2EWHQFLyQ GH SODQWD FHUWLFDGD 6HUYLFLR GH ,QYHVWLJDFLyQ $JUDULD 'LSXWDFLyQ *HQHUDO GH $UDJyQ (VSDxD SS Hernandez R. et al (OHFWURWKHUDSK\ Technique eliminates viral and bacterial infection IURP SODQW VKRRWWLS FXOWXUHV ,1,9,7 6DQWR Domingo, Cuba. +X &< DQG :DQJ 3- 0HULVWHP VKRRW WLS DQG EXG FXOWXUHV ,Q (YDQV '$ 6KDUS :5 $PPLUDWR 39 DQG <DPDGD < HGV +DQGERRN RI SODQW FHOO FXOWXUH 7HFKQLTXHV IRU SURSDJDWLRQ DQG EUHHGLQJ 9RO &ROOLHU 0DFPLOODQ 3XEOLVKHUV /RQGRQ SS .DUWKD .. 0HULVWHP FXOWXUH DQG FU\RSUHVHUYDWLRQPHWKRGV DQG DSSOLFDWLRQV ,Q 7KRUSH $7 HG 3ODQW WLVVXH FXOWXUH PHWKRGV DQG DSSOLFDWLRQV LQ DJULFXOWXUH 'HSDUWPHQW RI Biology, University of Calgary, Calgary, Alberta, &DQDGD SS .DUWKD .. (OLPLQDWLRQ RI YLUXV ,Q 9DVLO ,. (ed). Cell culture and somatic cell genetics of SODQWV $FDGHPLF 3UHVV ,QF SS 1DYDUUR / 0LFURLQMHUWR GH iSLFHV FDXOLQDUHV LQ YLWUR SDUD OD REWHQFLyQ GH SODQWDV GH DJULRV OLEUHV GH YLUXV %RO 6HUY 3ODJDV Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., Ritchie D.F., Uriu . DQG 8\HPRWR - . &RPSHQGLXP RI VWRQH IUXLW GLVHDVHV $36 SUHVV 7KH $PHULFDQ 3K\WRSDWKRORJLFDO 6RFLHW\ SS 3DODFLR%LHOVD$ )RLVVDF ; DQG 'XUDQ9LOD 1 ,QGH[LQJ RI &LWUXV YLURLGV E\ LPSULQW K\EULGLVDWLRQ (XURSHDQ -RXUQDO RI 3ODQW 3DWKRORJ\ 903. 4XDFTXDUHOOL $ *DOOLWHOOL ' 6DYLQR 9 DQG 3LD]]ROOD 3 7KH XVH RI HOHFWULF FXUUHQW IRU REWDLQLQJ PRVDLFIUHH DOPRQGV $FWD 3K\WRSDWKRORJLFD $FDGHPLDH 6FLHQWLDUXP +XQJDULFDH 5DYQLNDU 0 3ODSHU , 8FPDQ 5 DQG =HO - (VWDEOLVKPHQW RI DQ HIFLHQW PHWKRG IRU YLUXV elimimation in meristem cultures and regeneration RI KLJK TXDOLW\ SODQWV 3URF RI ,3%$ 5RJOD 'HFHPEHU 6FKZDFK ) 9DLVWLM )( -RQHV / DQG %DXOFRPEH '& $Q 51$'HSHQGHQW 51$ SRO\PHUDVH SUHYHQWV PHULVWHP LQYDVLRQ E\ 3RWDWR YLUXV ; DQG LV UHTXLUHG IRU WKH DFWLYLW\ EXW QRW WKH SURGXFWLRQ of a systemic silencing signal. Plant Physiology, Walkey D.G.A., Webb M.J.W., Bolland C.J. and 0LOOHU $ 3URGXFWLRQ RI YLUXVIUHH JDUOLF (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum / E\ PHULVWHPWLS FXOWXUH -RXUQDO RI +RUWLFXOWXUDO 6FLHQFH
V. CAPTULO 10 Obtencin de plantas resistentes a insectos

Dalia Lewi; Clara Rubinstein Breve introduccin sobre manejo de plagas en agricultura y sistemas de control Aplicaciones de la biotecnologa en el control de insectos plaga /D SUHRFXSDFLyQ S~EOLFD SRU ORV ULHVJRV LQKHUHQWHV DO XVR GH SHVWLFLGDV SDUD HO FRQWURO de insectos estimul la bsqueda y el desaUUROOR GH DOWHUQDWLYDV PHQRV ULHVJRVDV SDUD HO ambiente. La adicin de genes mediante la inJHQLHUtD JHQpWLFD SDUD GHVDUUROODU YDULHGDGHV vegetales con resistencia a insectos es una heUUDPLHQWD PX\ ~WLO SDUD FRPSOHPHQWDU HO PHMRramiento gentico vegetal. Mediante diversos PpWRGRV \D VH KDQ WUDQVIHULGR D YDULDV HVSHFLHV YHJHWDOHV QXPHURVRV JHQHV SURYHQLHQWHV GH XQ DPSOLR UDQJR GH SODQWDV \ EDFWHULDV TXH FRQHUHQ UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV HQIHUPHGDGHV \ WROHUDQFLD D KHUELFLGDV (Q OD H[SHULHQFLD VXmada hasta el momento, los genes transferiGRV VRQ KHUHGDGRV QRUPDOPHQWH D ODV SURJHQLHV VLQ HIHFWRV DGYHUVRV HQ ODV SODQWDV TXH ORV FRQWLHQHQ \ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV KDQ PDQWHQLGR ORV QLYHOHV GH UHVLVWHQFLD D FDPSR En todos los casos, la transgnesis debe estar LQWHJUDGD D XQ VLVWHPD GH PDQHMR GH SODJDV ecolgicamente sustentable. En el ao 2007, de las 114 millones de hectreas que se cultivaron globalmente con 29*0V 2UJDQLVPRV 9HJHWDOHV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV XQ WHUFLR PLOORQHV IXHURQ GH HYHQWRV FRQ UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV <D VH han obtenido transformaciones estables en XQDV HVSHFLHV YHJHWDOHV HQWUH ODV FXDOHV se incluyen maz, trigo, soja, tomate, algodn, SDSD \ DUUR] 7DPELpQ VH KDQ REWHQLGR HYHQWRV que combinan la resistencia a insectos con la resistencia a herbicidas en maz y algodn. Tanto las tcnicas de transformacin gentica vegetal como las de ingeniera gentica ya
son rutina en muchos laboratorios de desarrollo tecnolgico e investigacin. No obstante, alJXQRV DVSHFWRV FRPR HO DLVODPLHQWR GH JHQHV FDQGLGDWRV \ VX HIHFWLYD H[SUHVLyQ HQ SODQWDV an son estudiados y ajustados. /DV HVWUDWHJLDV H[SORUDGDV HQ OD E~VTXHGD GH JHQHV TXH SXHGHQ JHQHUDU UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV HQ YHJHWDOHV VRQ GLYHUVDV (O HVSHFWUR GH JHQHV FDQGLGDWRV D DSRUWDU UHVLVWHQFLD D GLVWLQWDV SODJDV SDUD OD DJULFXOWXUD SXHGH SURvenir de diversas fuentes, tanto vegetales como bacterianas. Tambin se est investigando la SRVLELOLGDG GH FRQIHULU UHVLVWHQFLD PHGLDQWH HO uso de tcnicas que involucran interferencia de $51 51$L /RV JHQHV TXH SURGXFHQ HQGRtoxinas, como los Bt, derivados de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis, son los ms H[SORUDGRV \ ORV ~QLFRV TXH KDVWD HO PRPHQWR WLHQHQ DSOLFDFLyQ FRPHUFLDO Dada la numerosa cantidad de genes releYDGRV H LGHQWLFDGRV FRPR SRVLEOHV IXHQWHV GH UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV VH SRGUtDQ DJUXSDU segn el origen de las secuencias candidatas en: i) genes de origen bacteriano (Bt); ii) genes GH RULJHQ YHJHWDO LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV quitinasas, avidina, lectina); iii) secuencias de insectos (estrategia de RNAi) i) Bacillus thuringiensis (Bt) El microorganismo Bacillus thuringiensis, comnmente conocido como Bt, es una bacteria DHUyELFD JUDP SRVLWLYD TXH VH HQFXHQWUD QDturalmente en el suelo y ha sido utilizada como insecticida biolgico desde hace ms de medio VLJOR 'HVFXELHUWD HQ -DSyQ HQ HVWD EDFWHULD SURGXFH SURWHtQDV GH LQFOXVLyQ HQ IRUPD GH FULVWDOHV OODPDGDV HQGRWR[LQDV R SURWHtQDV &U\ GXUDQWH OD HVSRUXODFLyQ (VWRV FULVWDOHV VRQ HVSHFtFDPHQWH Wy[LFRV SDUD LQVHFWRV HVSHFLDOPHQWH ORV OHSLGySWHURV /XHJR GH OD ingestin de los cristales, las toxinas actan a nivel del intestino de la larva. Los cristales son GLVXHOWRV SRU ORV MXJRV DOFDOLQRV GHO LQWHVWLQR TXH FRQYLHUWHQ D ODV SURWR[LQDV HQ IUDJPHQtos txicos -toxinas- que daan las clulas del HSLWHOLR LQWHVWLQDO GH ODV ODUYDV (Q PDPtIHURV VXSHULRUHV QR H[LVWHQ VLWLRV GH UHFRQRFLPLHQWR GH HVWDV WR[LQDV UD]yQ SRU OD FXDO QR UHVXOWDQ Wy[LFDV SDUD KXPDQRV /DV SUHSDUDFLRQHV GH FULVWDOHV VRQ XVDGDV FRPR LQVHFWLFLGD GHVGH KDFH PiV GH DxRV
HQ QXPHURVRV FXOWLYRV HVSHFLDOPHQWH HQ KXHUtas orgnicas. Los cristales individuales suelen ser una mezcla de toxinas, cada una de las FXDOHV SRVHH HVSHFLFLGDG VREUH XQ WLSR GH LQVHFWRV 5HVSHFWR D VX XWLOL]DFLyQ HQ ELRWHFQRORJtD XQD GH ODV YHQWDMDV TXH SRVHHQ ODV WR[LQDV derivadas de Bt en el contexto de los eventos WUDQVJpQLFRV HV OD HVSHFLFLGDG FRQ OD TXH DFtan. Por tratarse de eventos que contienen un JHQ FRGLFDQWH SDUD XQ WLSR GH WR[LQD VH REVHUYD TXH OD DFWLYLGDG LQVHFWLFLGD HV HVSHFtFD KDFLD ORV LQVHFWRV SODJD TXH VH TXLHUH FRQWURODU HQ FXOWLYRV TXH H[SUHVDQ HVWDV SURWHtQDV Esto constituye una ventaja sobre otros sistemas de control, ya que los insectos que no son SODJD DVt FRPR ORV LQVHFWRV EHQpFRV QR VRQ DIHFWDGRV $GHPiV HVWD HVSHFLFLGDG SHUPLWH LPSOHPHQWDU VLVWHPDV GH PDQHMR LQWHJUDGR GH SODJDV SDUD FRPEDWLU RWURV LQVHFWRV TXH QR VRQ FRQWURODGRV SRU HVWDV WR[LQDV Hasta el momento existen alrededor de 400 JHQHV DLVODGRV TXH FRGLFDQ SDUD WR[LQDV GLIHUHQWHV SDUD PD\RU GHWDOOH KWWSZZZOLIHVFL VXVVH[DFXNKRPH1HLOB&ULFNPRUH%W). IniFLDOPHQWH VH ODV FODVLFy VHJ~Q OD HVSHFLFLdad biolgica (cryI SDUD /HSLGySWHURV cry II SDUD /HSLGySWHURV \ 'tSWHURV cry III SDUD &ROHySWHURV \ cry IV SDUD 'tSWHURV (Q FDPELR la nomenclatura actual se basa en la identidad DPLQRDFtGLFD GH OD SURWHtQD 7DPELpQ VH RSWy SRU FDPELDU ORV Q~PHURV URPDQRV SRU DUiELJRV 3RU HMHPSOR OD &U\,,,$ DFWXDOPHQWH VH GHQRmina Cry3A). /RV SULPHURV LQWHQWRV SDUD H[SUHVDU ODV WR[LQDV %W HQ SODQWDV IXHURQ DOJR LQIUXFWXRVRV debido al origen bacteriano de los genes, esSHFLDOPHQWH SRU HO DOWR FRQWHQLGR HQ QXFOHyWLGRV $7 DGHQLQD \ WLPLQD TXH SURGXFH EDMRV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ 3DUD VROXFLRQDU HVWRV LQconvenientes se han mejorado las secuencias HOLPLQDQGR DOJXQRV VLWLRV GH SROLDGHQLODFLyQ PHMRUDQGR OD FRGLFDFLyQ SDUD ORV FRGRQHV H incrementando el contenido de GC. Estos camELRV PHMRUDURQ OD H[SUHVLyQ KDVWD DOFDQ]DU HO GHO WRWDO GH SURWHtQD VROXEOH HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV /D SULPHUD HVSHFLH YHJHWDO WUDQVIRUPDGD FRQ HVWRV JHQHV IXH HO WDEDFR HQ $FWXDOPHQWH \D VH KDQ SRGLGR H[SUHVDU ORV JH-
QHV GH SURWHtQDV Cry mediante transgnesis HQ QXPHURVDV HVSHFLHV YHJHWDOHV IRUHVWDOHV iODPR HXFDOLSWR DOHUFH FHUHDOHV PDt] WULgo), leguminosas (garbanzo, soja, man), horWtFRODV SDSD WRPDWH UHSROOR EUyFROL EDWDWD y frutales (manzano, frutilla). Todos los cultivos FRPHUFLDOHV DSUREDGRV FRQ UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV SRVHHQ JHQHV GHULYDGRV GH %W WDEOD Manejo del cultivo Bt: refugios 3DUD TXH HO XVR \ OD DSOLFDFLyQ H[LWRVD GH OD WHFQRORJtD GH UHVLVWHQFLD PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV GHULYDGRV GH %W SXHGD SHUSHWXDUVH HQ HO WLHPSR VH GHEH FRQVLGHUDU HO XVR GH UHIXJLRV /D SRVLELOLGDG SRWHQFLDO GH GHVDUUROOR GH UHVLVWHQFLD D ODV SODQWDV LQVHFWLFLGDV HV FRQVLGHUDGR XQR GH ORV WHPDV SULQFLSDOHV GH SUHRFXSDFLyQ VREUH HVWD WHFQRORJtD GHELGR D TXH \D KDQ DSDUHFLGR FDVRV GH UHVLVWHQFLD D SURGXFWRV SDUD HVSROYRUHDU GHULYDGRV GH %W 3RU HVWD UD]yQ HO GHVDUUROOR GH SODQHV GH PDnejo de la resistencia de insectos es de suma LPSRUWDQFLD 'H ODV HVWUDWHJLDV FRQVLGHUDGDV OD PiV HIHFWLYD HV OD DOWD H[SUHVLyQ GH ODV SURWHtQDV HQWRPRWy[LFDV HQ ODV SODQWDV MXQWR D OD VLHPEUD GH UHIXJLRV GH SODQWDV QR %W 3RU RWUR ODGR OD VHJXQGD JHQHUDFLyQ GH SODQWDV GH DOJRGyQ %W FRPELQD GRV WLSRV GH SURWHtQDV LQVHFWLFLGDV SDUD XQ PLVPR LQVHFWR EODQFR (VWH DSLODPLHQWR GH JHQHV %W HQ FRPELQDFLyQ FRQ una buena estrategia de manejo de refugios, FRQIHULUi OD Pi[LPD FDSDFLGDG GH SURWHFFLyQ D la tecnologa Bt contra la resistencia de insectos. ii) Genes de origen vegetal Inhibidores de proteasas HO GHVDUUROOR SRtencial de resistencia a las toxinas derivadas GH JHQHV %W HQ OHSLGySWHURV KD GLVSDUDGR GLYHUVDV LQYHVWLJDFLRQHV SDUD JHQHUDU QXHYDV HVWUDWHJLDV GH FRQWURO GH LQVHFWRV TXH SXHGDQ D VX YH] SUHVHUYDU HVWD ELRWHFQRORJtD DPLJDEOH SDUD HO DPELHQWH /RV LQKLELGRUHV GH SURWHDVDV ,3 VRQ FDQGLGDWRV SRVLEOHV SDUD PHMRUDU OD WR[LFLGDG GH %W FRQWUD OHSLGySWHURV DJUHJDQGR OD SRVLELOLGDG GH FRQWURO GH FROHySWHURV GtSWHros y otros insectos. /RV ,3 VRQ SDUWH GHO VLVWHPD GH GHIHQVD GH OD SODQWD FRQWUD HO DWDTXH GH ORV LQVHFWRV \ VH SXHGHQ HQFRQWUDU HQ KRMDV IUXWRV WXEpUFXORV R VHPLOODV 3DUD SRGHU GLJHULU VXV DOLPHQWRV
Tabla 1. &XOWLYRV UHVLVWHQWHV D LQVHFWRV DSUREDGRV SRU SDtV )XHQWH www.isaaa.org; www.agbios.com
Cultivo con genes de reistencia a insectos algodn algodn maz algodn algodn papa maz batata algodn alamos maz algodn algodn arroz algodn maz algodn maz algodn maz algodn maz tomate papa maz maz Ao de la primera liberacin a campo 2003 2005 2008 2008 2003 1995 1996 1995 1997 2005 2002 (precomercial) 2002 2001 2004 1997 1996 1997 2002 1997 1997 1995 1995 1998 1995 1997 2003
Pas Australia Brasil Burkina Faso Canada
China Honduras India Indonesia Irn Japn Mejico Filipinas Sudfrica
EE UU Unin Europea (Espaa, Francia, Alemania, Rep. Checa, Polonia, Portugal, Eslovaquia y Rumania) Uruguay
PXFKRV LQVHFWRV SURGXFHQ SURWHLQDVDV FRPR OD WULSVLQD R HQ]LPDV VHPHMDQWHV D OD TXLPRWULSVLQD /DV SURWHtQDV DQWLPHWDEyOLFDV FRPR ODV ,3 LQWHUHUHQ HQ HO SURFHVR GLJHVWLYR GH ORV LQVHFWRV VXVFHSWLEOHV \ GH HVWD PDQHUD DIHFtan su crecimiento y desarrollo. Tomando este FRQFHSWR VH KDQ WUDQVIRUPDGR SODQWDV FRQ VHFXHQFLDV GH JHQHV ,3 TXH HVFROWDGRV SRU SURPRWRUHV DGHFXDGRV SXHGHQ H[SUHVDU DOWRV QLYHOHV GH HVWDV SURWHtQDV /RV ,3 VH HQFXHQtran comnmente en los alimentos derivados de vegetales y son fcilmente inactivados con OD FRFFLyQ 7HQLHQGR HQ FXHQWD HVWD SUHFDXFLyQ OD H[SUHVLyQ GH JHQHV TXH FRGLFDQ SDUD ,3 HQ SODQWDV VH SXHGH FRQVLGHUDU FRPR XQD estrategia segura. (O SULPHU HMHPSOR H[LWRVR GH UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV H[SUHVDQGR ,3V IXH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV LQKLELGRUHV GH WULSVLQD GH FDXSt CpTi) HQ $ SDUWLU GH HVH PRPHQWR VH KDQ LQWURducido numerosos genes IP en diferentes es-
SHFLHV 6H KD REVHUYDGR TXH QR VLHPSUH HVWRV genes actan como antimetabolitos efectivos, sino que hay un gradiente de efectividad frente a diferentes insectos y que, adems, muchas veces no son tan efectivos como los genes Bt. (Q EDVH D HVWDV REVHUYDFLRQHV VH GHEH RSWLmizar la interaccin entre el IP introducida y la SURWHDVD EODQFR GHO LQVHFWR SDUD LQFUHPHQWDU OD DFFLyQ GHO JHQ H[SUHVDGR HQ OD SODQWD WUDQVgnica. 2WUD HVWUDWHJLD SDUD PHMRUDU ORV QLYHOHV GH FRQWURO SXHGH VHU XWLOL]DU PiV GH XQ JHQ ,3 SDUD LQWHUIHULU HQ GLIHUHQWHV SURWHDVDV GHO LQsecto. En este sentido, la combinacin exitosa de diferentes secuencias de IPs formando PXOWLGRPLQLRV SDUD HO FRQWURO GH WULSV Thysanoptera: Thripidae) abre un abanico de nuevas SRVLELOLGDGHV 7DPELpQ VH KD SURSXHVWR HO XVR GH ,3V HQ combinacin con los genes Bt, debido a que ODV HQWRPRWR[LQDV %W DFWLYDGDV SXHGHQ HVWDU
VXMHWDV D SURWHyOLVLV R GHJUDGDFLyQ SRU ODV SURteinasas, derivando en fragmentos no txicos. Estos casos de resistencia o estados menos VHQVLEOHV SRGUtDQ HYLWDUVH VL VH FRPELQDQ HVWRV JHQHV FRQ ORV LQKLELGRUHV GH WULSVLQD R TXLPRWULSVLQD GHO LQVHFWR /D FRPELQDFLyQ GH genes de endotoxinas con genes derivados de SODQWDV FRPR ORV ,3 RIUHFH QXHYDV RSRUWXQLGDGHV \ HVWUDWHJLDV SDUD HO FRQWURO GH LQVHFWRV 2WURV HMHPSORV GH DSOLFDFLyQ GH ,3 VRQ OD H[SUHVLyQ GHO JHQ GH HVSRUDPLQD LQKLELGRU GH WULSVLQD GH EDWDWD HQ B. oleracea, la sobreexSUHVLyQ GH KLGUR[LSUROLQD HQ WDEDFR SDUD FRQWURO GH OHSLGySWHURV R OD LQWURGXFFLyQ GH LQKLELGRUHV GH WULSVLQD GH JDUEDQ]R HQ DOJRGyQ SDUD FRQWURO GHO FROHySWHUR SLFXGR GHO DOJRGRQHUR Anthonomus grandis. Genes inhibidores de alfa amilasa: as como los IP, los inhibidores de -amilasa VRQ SURGXFLGRV SRU ODV SODQWDV FRPR XQ mecanismo natural de defensa contra insectos. La toxicidad de los inhibidores de DPLODVD VH SURGXFH PHGLDQWH OD LQterferencia en la digestin de los carbohidratos. Recientemente se ha aislado el gen inhibidor de DPLODVD GH FDXSt \ se ha demostrado el efecto txico sobre JRUJRMRV GH SDSD\D Lectinas VRQ SURWHtQDV FRQ XQLyQ HVSHFtFD D FDUERKLGUDWRV (O URO SULQFLSDO TXH se les atribuye es el fenmeno de reconocimiento biolgico que involucra clulas \ SURWHtQDV 3DUD VHU FODVLFDGDV FRPR OHFWLQDV ODV SURWHtQDV GH XQLyQ D FDUERKLGUDWRV GHEHQ SRVHHU SRU OR PHQRV GRV sitios de unin. Esta caracterstica les SHUPLWH DJOXWLQDU R SUHFLSLWDU HVWUXFWXUDV que contienen residuos de azcares. Se ha determinado que algunas lectinas veJHWDOHV SRVHHQ XQ PD\RU R PHQRU HIHFWR entomotxico o actividad insecticida. La toxicidad sera consecuencia de la inteUDFFLyQ FRQ ODV JOLFRSURWHtQDV LQWHVWLQDles. Las diferencias en el nivel de toxiFLGDG VH SXHGHQ GHEHU D TXH HYROXWLYDPHQWH ODV SODQWDV GHVDUUROODURQ SURSLHGDGHV ELRTXtPLFDV \ VLFRTXtPLFDV GLIHUHQWHV FRPR OD HVSHFLFLGDG HQ OD XQLyQ D FDUERKLGUDWRV (O HVSHFWUR GH SODJDV TXH VH SXHGHQ FRQWURODU FRQ HVWRV JHQHV
VH DPSOtD QRWDEOHPHQWH 1XPHURVRV WUDbajos informan que ya se han introducido genes de lectinas (como la GNA, de Galanthus nivalis L. aglutinina) en cultivos SDUD HO FRQWURO GH LQVHFWRV OHSLGySWHURV GtSWHURV FROHySWHURV \ KRPySWHURV 8Q PHFDQLVPR GH DFFLyQ SURSXHVWR FRQ OD *1$ HV TXH DO VHU VXFFLRQDGR SRU ORV LQVHFWRV VH XQH DO HSLWHOLR GHO LQWHVWLQR \ SDVD D OD KHPROLQID DFWXDQGR FRPR HQWRPRWy[LFR ([SUHVDQGR ODV *1$ VH KDQ SRGLGR REWHQHU SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH SDSD\D UHVLVWHQWHV D iFDURV ([SUHVDQdo lectinas de cebolla (llamadas ASAL) VH KDQ FRQWURODGR iGRV HQ SODQWDV GH mostaza. Como en otros casos de genes SURYHQLHQWHV GH SODQWDV ODV OHFWLQDV SXHden combinarse con otros genes, como SRU HMHPSOR FRQ GLVWLQWRV WLSRV GH %WV SDUD FRPEDWLU SODJDV GH OHSLGySWHURV \ GH KRPySWHURV D OD YH] 3RU HMHPSOR OD OHFWLQD 37$ GH OD SODQWD PHGLFLQDO FKLQD Pinellia ternata) ha mostrado efectos soEUH iGRV HQ FRPELQDFLyQ FRQ JHQHV %W en trigo. Algunas lectinas tienen limitaciones en su DSOLFDFLyQ HQ DOLPHQWDFLyQ GH PDPtIHURV VXSHriores debido a su toxicidad, como en el caso de las contenidas en el germen de trigo, que SRVHHQ IXHUWHV SURSLHGDGHV LQVHFWLFLGDV 2WUDV lectinas como la GNA se consideran no txicas SDUD HVWH JUXSR GHELGR D VX EDMD FDSDFLGDG GH unin en el intestino. Quitinasas: son enzimas digestivas que URPSHQ ODV XQLRQHV JOXFRVtGLFDV GH OD TXLWLQD VXVWDQFLD TXH FRPSRQH ODV SDredes celulares de hongos, el exoesqueleto de algunos gusanos, y cutculas de LQVHFWRV QHPDWRGHV \ DUWUySRGRV 6H encuentran en organismos que deben GLJHULU VX SURSLD TXLWLQD R OD GH RWURV LQGLviduos como hongos o animales. Pueden IXQFLRQDU FRPR Wy[LFDV SDUD LQVHFWRV VL VRQ FDSDFHV GH GHJUDGDU OD FDSD GH TXLWLQD GH ODV PHPEUDQDV TXH SURWHJHQ HO HSLWHOLR LQWHVWLQDO (Q SODQWDV VXSHULRUHV OD H[SUHVLyQ JpQLFD GH ODV TXLWLQDVDV VH DFWLYD SRU OD LQYDVLyQ GH SDWyJHQRV SRU OR TXH VH FUHH TXH FXPSOHQ XQ URO LPSRUWDQWH GH GHIHQVD <D VH KD FRPSUREDGR
la accin inhibitoria sobre el crecimiento GH KRQJRV SHUR OD DSOLFDFLyQ HQ HO FRQtrol de insectos an no est fehacientePHQWH GHVFULSWD Avidina: HV XQD JOLFRSURUWHtQD TXH VH encuentra en la clara del huevo de gaOOLQD \ WLHQH OD SURSLHGDG GH VHFXHVWUDU OD YLWDPLQD ELRWLQD $O VHU LQJHULGD SRU HO insecto en una concentracin mayor a SSP OD DYLGLQD SXHGH RFDVLRQDU XQD GHFLHQFLD OHWDO GH HVWD YLWDPLQD \ HYLWDU el desarrollo de insectos durante el almacenamiento de granos. Por lo tanto, la DYLGLQD H[SUHVDGD HQ ORV JUDQRV SXHGH VHU HIHFWLYD FRPR ELRSHVWLFLGD SDUD XQ DPSOLR HVSHFWUR GH HVSHFLHV GH LQVHFtos. Los datos sobre la efectividad y esSHFLFLGDG GH DFFLyQ GH ODV DYLGLQDV QR HVWiQ WDQ FRPSOHWRV FRPR HQ HO FDVR GH ODV HQWRPRWR[LQDV %WV SHUR VH FRQVLGHUD TXH SRGUtDQ XVDUVH FRPR DOWHUQDWLYD R FRPSOHPHQWR GH HVWD WHFQRORJtD 6H KD H[SUHVDGR HQ PDt] SDUD SURGXFLU ELRPROpFXODV SHUR SRGUtD XWLOL]DUVH HQ XQ IXWXUR WDPELpQ SDUD ELRFRQWURO Polifenol oxidasas: las enzimas llamadas SROLIHQRO R[LGDVDV 332V FDWDOL]DQ OD R[LGDFLyQ GH FRPSXHVWRV IHQyOLFRV D TXLnonas. Frecuentemente su induccin se DVRFLD FRQ OD UHVSXHVWD GH ODV SODQWDV D VHxDOHV R GDxRV SURGXFLGRV SRU SDWyJHnos o insectos. Por estas observaciones VH VXJLHUH TXH WHQGUtDQ OD FDSDFLGDG GH conferir resistencia tanto a enfermedaGHV SURYRFDGDV SRU EDFWHULDV FRPR SRU LQVHFWRV &RPR HMHPSORV GH DSOLFDFLyQ VH KDQ SXEOLFDGR WUDEDMRV GH UHVLVWHQFLD D OHSLGySWHURV HQ iODPR \ HQ WRPDWH /D PDQLSXODFLyQ GH OD DFWLYLGDG GH 332V SDUD JHQHUDU UHVLVWHQFLD WDPELpQ SRGUtD VHU XQ FRPSRQHQWH GHO PDQHMR LQWHJUDGR GH SODJDV Combinacin de genes: muchos de los JHQHV FDQGLGDWRV SDUD UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV SODJD TXH SXHGHQ VHU XVDGRV HQ WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD VRQ PX\ HVSHFtFRV R D YHFHV PHGLDQDPHQWH HIHFWLYRV 3DUD FXEULU PiV SRVLELOLGDGHV GH FRQWURO \ HYLWDU ODV SRVLEOHV DSDULFLRQHV GH UHVLVWHQFLD HV UHFRPHQGDEOH SODQ-
WHDU VLVWHPDV GH DSLODPLHQWR GH GLVWLQWRV JHQHV HQ OD PLVPD SODQWD $VLPLVPR VHra ms efectivo combinar sistemas de JHQHV TXH SDUWLFLSHQ HQ VLVWHPDV PHtablicos diferentes. Para efectuar una sinergia efectiva entre la biotecnologa y el mejoramiento gentico, las distintas HVWUDWHJLDV SODQWHDGDV GH H[SUHVLyQ GH JHQHV HQ SODQWDV D VX YH] GHEHQ VHU incluidas dentro del sistema de manejo LQWHJUDGR GH SODJDV iii) Estrategias de ARN de interferencia (ARNi) /RV RUJDQLVPRV HXFDULyWLFRV SRVHHQ XQD maquinaria comn se silenciamiento gnico de VHFXHQFLDV HVSHFtFDV TXH HV GLVSDUDGR SRU OD SUHVHQFLD GH $51V GH GREOH FDGHQD GV51$ (VWH SURFHVR VH FRQRFH FRPR LQWHUIHUHQFLD GHO 51$ 51$L HQ DQLPDOHV \ VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR SRVW WUDQVFULSFLRQDO HQ SODQWDV 37*6 El silenciamiento de algunos genes esenFLDOHV HQ LQVHFWRV PHGLDGR SRU ORV GV51$ SXHGH LQGXFLU HO FHVH GH OD LQJHVWLyQ \ HYHQtualmente la muerte. La utilizacin de la estraWHJLD HO $51 GH LQWHUIHUHQFLD SDUD FRQWURO GH LQVHFWRV UHTXLHUH GH XQD OOHJDGD HFLHQWH DO VLWLR GH DFFLyQ WDQWR YtD LQJHVWLyQ R SRU DSOLFDFLyQ WySLFD GH ODV PROpFXODV GH GV51$ /RV JHQHV FDQGLGDWRV EODQFR LGHDOHV SDUD VLOHQFLDU GH HVWD PDQHUD SRGUtDQ VHU ORV TXH FRGLFDQ SDUD SURWHtQDV FRQ IXQFLRQHV HVHQFLDOHV SDUD HO LQVHFWR 6H KD HVWXGLDGR OD WUDQVFULSFLyQ GH DOJXQDV VHFXHQFLDV GH JHQHV SURYHQLHQWHV GH LQVHFWRV OHSLGySWHURV HQ SODQWDV GH PDt] WUDQVJpQLFDV FRPR SRU HMHPSOR XQD SRUFLyQ del gen de la ATPasa de Diabrotica virgifera virgifera EDMR SURPRWRUHV FRQVWLWXWLYRV YHULFiQGRVH XQD PHUPD HQ HO GDxR D QLYHO GH ODV UDtFHV $VLPLVPR VH KD HVWXGLDGR OD SRVLbilidad de control combinando mediante el uso de ARN de interferencia, de ms de un gen en termitas 5HWLFXOLWHUPHV DYLSHV. (VWH HQIRTXH DOWHUQDWLYR DO FRQWURO GH SODJDV SXHGH VHU HIHFWLYR WDPELpQ HQ FRPELQDFLyQ FRQ JHQHV %W WDQWR SDUD FRQWURO GH OHSLGySWHURV FRPR GH FROHySWHURV VHJ~Q OD VHFXHQFLD TXH VH LQWURGX]FD HQ OD SODQWD 3RU HMHPSOR SDUD HO FRQWURO GHO OHSLGySWHUR Helicoverpa armigera) del algodn, del cual se han encon-
trado algunos individuos resistentes en China D ORV JHQHV %W VH GHPRVWUy TXH OD H[SUHVLyQ de la secuencia de la enzima que degrada el JRVVLSRO HQ OD RUXJD TXH OH SHUPLWH WROHUDU OD SUHVHQFLD GH HVD VXVWDQFLD HV HIHFWLYD SDUD HO FRQWURO GH OD SODJD (VWD QXHYD HVWUDWHJLD SDUD HO FRQWURO GH LQVHFWRV SODJD HQ SODQWDV SDUHFH VHU PX\ SURmetedora, ya que las secuencias gnicas de ORV LQVHFWRV SDUD XVDU FRPR EODQFR SXHGHQ VHU PX\ HVSHFtFDV \ UHODWLYDPHQWH IiFLOHV GH REtener. &XOWLYRV %W FRPHUFLDOL]DGRV EHQHFLRV GH OD tecnologa Control biolgico /RV HQHPLJRV QDWXUDOHV FRPR ORV SUHGDGRUHV \ SDUDVLWRLGHV FXPSOHQ XQD IXQFLyQ HFROyJLFD \ HFRQyPLFD LPSRUWDQWH HQ FXDQWR DO PDQWHQLPLHQWR GH OD SREODFLyQ GH LQVHFWRV KHUEtYRURV SRU GHEDMR GH ORV XPEUDOHV GH GDxR econmico. De esta manera contribuyen a los sistemas sustentables de manejo integrado de SODJDV 0,3 Tambin se conocen algunos factores que DIHFWDQ D ORV LQVHFWRV SODJD TXH LQWHUDFW~DQ con los enemigos naturales y, consecuentemente, con la funcin de control que stos DSRUWDQ 'H PDQHUD VLPLODU OD UHVLVWHQFLD GHULYDGD GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ SODQWDV SRGUtD WHQHU LPSDFWR VREUH HO FRQWURO ELROyJLFR SHUR VH KD FRPSUREDGR TXH ORV FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV GLVSRQLEOHV D OD IHFKD TXH H[SUHVDQ SURWHtQDV &U\ GHULYDGDV GH Bacillus thuringiensis, no tienen efectos sobre los enemigos QDWXUDOHV GHELGR D VX UHVWULQJLGR HVSHFWUR GH actividad. Sin embargo, el hecho que los insecWRV SODJD VRQ HFLHQWHPHQWH FRQWURODGRV SRU los cultivos Bt tiene inevitables consecuencias VREUH ORV HQHPLJRV QDWXUDOHV TXH VH HVSHFLDOL]DQ HQ HVDV HVSHFLHV WDQWR FRPR KRVSHGDQWHV FRPR SUHGDGRUHV 3HUR SRU RWUD SDUWH VH ha demostrado una disminucin en el uso de insecticidas en los cultivos Bt, lo que ha beQHFLDGR VLJQLFDWLYDPHQWH D ORV RUJDQLVPRV de control biolgico. Como consecuencia, esta WHFQRORJtD SXHGH FRQWULEXLU D OD FRQVHUYDFLyQ de los enemigos naturales, deviniendo en una KHUUDPLHQWD PX\ ~WLO SDUD HO PDQHMR LQWHJUDGR GH SODJDV
Reduccin de micotoxinas 8QR GH ORV EHQHFLRV LQGLUHFWRV GH ORV FXOWLvos Bt es la reduccin del nivel de contaminaFLyQ SRU PLFRWR[LQDV HQ PDt] /DV PLFRWR[LQDV son metabolitos secundarios de los hongos que colonizan los cultivos. Se consideran contaminantes inevitables en los alimentos y an las PHMRUHV WHFQRORJtDV QR SXHGHQ HOLPLQDU FRPSOHWDPHQWH VX SUHVHQFLD (O GDxR SRU LQVHFWRV HV XQR GH ORV IDFWRUHV TXH SUHGLVSRQHQ D OD FRQWDPLQDFLyQ SRU PLFRWR[LQDV HQ PDt] GHELGR D TXH DEUHQ OD SXHUWD GH HQWUDGD D ORV KRQJRV D travs de los canales que realizan en los tallos. Por esta razn, cualquier mtodo que reduce el dao de orugas, tambin reduce el riesgo de FRQWDPLQDFLyQ SRU KRQJRV \ VH KD REVHUYDGR que los maces Bt muestran una reduccin sigQLFDWLYD GHO QLYHO GH ODV PLFRWR[LQDV PiV FRmunes. En Argentina, en los aos favorables a OD DFXPXODFLyQ GH IXPRQLVLQDV SRU SUHVHQFLD de Fusarium verticillioides y F. proliferatum), las concentraciones de esta micotoxina son en un PHQRUHV HQ ORV KtEULGRV %W TXH HQ ODV UHVSHFWLYDV LVROtQHDV GH PDt] 5HGXFFLyQ GH SODJXLFLGDV 'XUDQWH HO DxR ORV FXOWLYRV *0 KDQ UHGXFLGR OD DSOLFDFLyQ GH SHVWLFLGDV HQ PLOORQHV GH NJ HTXLYDOHQWH D XQ GHO YROXPHQ GH SHVWLFLGDV DQXDO DSOLFDGR HQ OD 8QLyQ (XURSHD GLVPLQX\HQGR DVt HO LPSDFWR GHO XVR GH SHVWLFLGDV VREUH HO DPELHQWH HQ XQ Segn una investigacin de la IUPAC (Unin inWHUQDFLRQDO GH 4XtPLFD 3XUD \ $SOLFDGD HQWUH ORV DxRV \ OD DGRSFLyQ GH FXOWLYRV resistentes a insectos redujo el uso de insecWLFLGDV HVSHFLDOPHQWH HQ HO DOJRGyQ %W HQ (Vtados Unidos, as como tambin en Australia, India, China y Sudfrica. El algodn Bt se ha LQFRUSRUDGR D ODV SUiFWLFDV GH PDQHMR LQWHJUDGR GH SODJDV SDUD HYLWDU TXH ORV LQVHFWLFLGDV DIHFWHQ ORV LQVHFWRV EHQpFRV $GHPiV OD UHduccin del uso de insecticidas debido al uso GH DOJRGyQ \ PDt] %W EHQHFLDQ GLUHFWDPHQWH D ORV SURGXFWRUHV DXPHQWDQGR HO PDUJHQ EUXWR Aumento del rendimiento 7RGRV ORV UHSRUWHV DFHUFD GH ORV EHQHFLRV GH OD DGRSFLyQ GH FXOWLYRV %W PHQFLRQDQ FRPR XQ SXQWR GH JUDQ UHOHYDQFLD HO DXPHQWR GH ORV
ULQGHV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ ODV WHFQRORJtDV FRQYHQFLRQDOHV (Q SDtVHV FRPR $UJHQWLQD &KLQD 0pMLFR ,QGLD \ 6XGiIULFD VH YHULFDQ LQFUHPHQWRV GH UHQGLPLHQWR HQWUH \ PLHQWUDV TXH ORV FRVWRV SRU HO PHQRU XVR GH GLVPLQX\HQ HQWUH D Menor uso de agua $O GLVPLQXLU HO Q~PHUR GH SXOYHUL]DFLRQHV con insecticidas, la tecnologa Bt contribuye al uso racional del agua. %HQHFLRV H LPSDFWRV GH OD WHFQRORJtD VHJ~Q HO SDtV DGRSWDQWH /RV EHQHFLRV GH HVWDV WHFQRORJtDV SXHGHQ observarse en diferentes contextos y desde diYHUVRV DVSHFWRV &DGD SDtV DGRSWDQWH GH ORV eventos transgnicos con resistencia a insecWRV KD WUDQVLWDGR SRU H[SHULHQFLDV H[LWRVDV SRU razones tanto econmicas, ecolgicas y/o sociales. /D DGRSFLyQ GH OD WHFQRORJtD PXFKDV YHFHV VH PLGH HQ WpUPLQRV GH EHQHFLR HFRQyPLFR Pero se ha determinado que hay factores insWLWXFLRQDOHV TXH LQX\HQ LQGLUHFWDPHQWH HQ HO nivel y la distribucin de las ganancias, como OD FDSDFLGDG GH LQYHVWLJDFLyQ HQ LQVWLWXWRV QDFLRQDOHV ODV SROtWLFDV HQ GHUHFKR GH SURSLHGDG LQWHOHFWXDO OD FDSDFLGDG GH UHJXODFLyQ HQ VHguridad ambiental y alimenticia, y la existencia GH PHUFDGRV SHUPHDEOHV D HVWDV WHFQRORJtDV Estados Unidos (O SULPHU SDtV DGRSWDQWH GH DOJRGyQ \ PDt] %W IXH (VWDGRV 8QLGRV (O EHQHFLR SRU HO XVR de estos dos eventos fue de $19 millones en \ GH PLOORQHV HQ (Q HO SULPHU ciclo de cultivo de algodn Bt se redujeron en XQ ODV DSOLFDFLRQHV GH LQVHFWLFLGDV \ KXER XQ LQFUHPHQWR GH HQ HO UHQGLPLHQWR $FWXDOPHQWH HO GH ORV FXOWLYRV 2*0 WLHQHQ OXJDU HQ (( 88 RFXSDQGR PiV GH PLOORQHV GH hectreas. India ,QGLD HV HO SDtV TXH VLHPEUD OD PD\RU VXSHUFLH GH DOJRGyQ \ GRQGH PLOORQHV GH SHUVRQDV HVWiQ UHODFLRQDGDV FRQ HVWH FXOWLYR (Q HO XQRV DJULFXOWRUHV FXOWLYDURQ
KHFWiUHDV GH DOJRGyQ %W &LQFR DxRV GHVSXpV HQ HO iUHD GH DOJRGyQ %W OOHJy D PLOORQHV GH KHFWiUHDV FXOWLYDGDV SRU PLOORQHV GH SHTXHxRV SURGXFWRUHV \ GH HVFDsos recursos. Cabe destacar que ms de 9 de FDGD SURGXFWRUHV TXH VHPEUDURQ DOJRGyQ %W HQ WDPELpQ OR KLFLHURQ HQ \ HQ 2007. El algodn Bt ha aumentado los rendiPLHQWRV KDVWD HQ XQ KD UHGXFLGR HO XVR GH LQVHFWLFLGDV D OD PLWDG FRQ ODV FRUUHVSRQGLHQWHV FRQVHFXHQFLDV SDUD HO DPELHQWH \ OD salud, y ha incrementado los ingresos de los SURGXFWRUHV HQ 86 R PiV SRU KHFWiUHD $ nivel nacional, el incremento en los ingresos de ORV SURGXFWRUHV GHULYDGRV GHO XVR GHO DOJRGyQ %W IXH HVWLPDGR SDUD HQWUH 86 PLOORQHV \ 86 PLO PLOORQHV $GHPiV OD SURGXFFLyQ GHO DOJRGyQ VH GXSOLFy H ,QGLD TXH WHQtD uno de los rendimientos ms bajos en el cultivo GH DOJRGyQ SDVy D VHU XQ H[SRUWDGRU HQ OXJDU GH XQ LPSRUWDGRU GH DOJRGyQ Cabe mencionar que en India hay nuevos SURGXFWRV GH OD ELRWHFQRORJtD HQ GHVDUUROOR FRPR OD EHUHQMHQD %W XQ LPSRUWDQWH FXOWLYR DOLPHQWLFLR \ FRPHUFLDO TXH SXHGH EHQHFLDU D XQRV PLOORQHV GH SURGXFWRUHV SHTXHxRV \ GH bajos recursos. La berenjena Bt se encuentra HQ HVWDGR DYDQ]DGR GH HQVD\RV D FDPSR \ VH HVSHUD VX DSUREDFLyQ HQ XQ IXWXUR FHUFDQR China La historia del algodn en China est bien GRFXPHQWDGD \ HV XQ LPSRUWDQWH FDVR GH HVWXGLR VREUH OD DGRSFLyQ GH FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV SRU SDUWH GH SURGXFWRUHV SHTXHxRV \ GH bajos recursos. Aunque India inici la siembra GH DOJRGyQ %W HQ VHLV DxRV GHVSXpV TXH &KLQD \D HQ ,QGLD KDEtD SODQWDGR PLllones de hectreas de algodn Bt ms que China, y 2,4 millones de hectreas ms que China HQ 6LQ HPEDUJR FRPR ODV SODQWDFLRQHV GH DOJRGyQ VRQ PXFKR PiV SHTXHxDV HQ &KLQD WLHQHQ HQ SURPHGLR KHFWiUHDV TXH HQ ,QGLD KHFWiUHDV HO Q~PHUR GH SHTXHxRV SURGXFWRUHV TXH FXOWLYDURQ DOJRGyQ %W HQ &KLQD en 2007 (7,1 millones) fue casi el doble que en ,QGLD PLOORQHV OR TXH HTXLYDOH DO GH ODV PLOORQHV GH KHFWiUHDV GHO DOJRGyQ FXOWLvadas en China. Segn los estudios realizados SRU HO &HQWUR SDUD OD 3ROtWLFD $JUtFROD &KLQD
&&$3 HO DOJRGyQ %W HQ &KLQD HQ SURPHGLR DXPHQWD HO UHQGLPLHQWR HQ XQ UHGXFH HO XVR GH LQVHFWLFLGDV HQ XQ FRQ FRQVHFXHQFLDV SRVLWLYDV WDQWR SDUD HO DPELHQWH FRPR SDUD OD VDOXG GH ORV SURGXFWRUHV \ JHQHUD XQ LQFUHPHQWR HQ ORV LQJUHVRV GH 86 SRU KHFWirea. Adems, China ya ha sembrado casi un cuarto de milln de lamos Bt. En un estudio realizado entre 2002 y 2007, se ha encontrado TXH DGHPiV GH FRQWURODU HO SULQFLSDO OHSLGySWHro en el algodn (Helicoverpa armigera), reduce OD SUHVHQFLD GH HVWD SODJD HQ RWURV FXOWLYRV QR 2*0 GLVPLQX\HQGR OD QHFHVLGDG GH SXOYHUL]DU con insecticidas. Entre los desarrollos actuales se encuentra el arroz transgnico resistente a SODJDV ODUYDV GH OHSLGySWHURV TXH XQD YH] que se cultive comercialmente, aumentara el UHQGLPLHQWR XQ \ UHGXFLUtD HO XVR GH LQVHFWLFLGDV HQ FDVL XQ Irn (Q HO DxR ,UiQ DSUREy OD VLHPEUD FRmercial de arroz resistente a insectos. Fue el SULPHU SDtV HQ DSUREDU DUUR] *0 SDUD FXOWLYR y consumo. El evento contiene el gen Cry1Ab, LQWURGXFLGR HQ OD YDULHGDG SRSXODU DURPiWLFD OODPDGD Tarom molaii FRQULpQGROH UHVLVWHQFLD D OD RUXJD GHO WDOOR SODJD TXH DIHFWD HO GH OD FRVHFKD FDGD DxR 'XUDQWH Irn sembr unas 4000 hectreas de arroz Bt. Se observ que esta variedad rinde 200 kg PiV TXH VX FRQWUDSDUWH QR 2*0 $FWXDOPHQWH WRGDYtD QR VH SURGXFH DUUR] *0 HQ IRUPD comercial. )LOLSLQDV 8Q HMHPSOR PX\ LQWHUHVDQWH GH FXOWLYRV *0 HV HO GH OD EHUHQMHQD HQ )LOLSLQDV (VWH FXOWLYR GH JUDQ LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD 8 6 PLOORQHV HV DWDFDGR SRU PXFKDV SODJDV GH LQVHFWRV HQWUH HOORV HO PiV GHVWUXFWLYR HV HO OHSLGyStero L. orbonalis, Guenee. Para combatir esta SODJD DOJXQRV SURGXFWRUHV SXOYHUL]DQ LQVHFWLFLGDV KDVWD GRV R WUHV YHFHV SRU VHPDQD 6H HVWiQ GHVDUUROODQGR HYHQWRV FRQ LQFRUSRUDFLyQ GH JHQHV %W \ SURQRVWLFDQ TXH VX DGRSFLyQ VLJQLFDUi XQ DXPHQWR HQ HO UHQGLPLHQWR UHduccin de costos y de las labores, y un increPHQWR GHO EHQHFLR GH 8 6 KD FRPSDUDGR con las variedades de cultivo actual.
8QLyQ (XURSHD (O PDt] %W VH VHPEUy SRU SULPHUD YH] HQ (VSDxD HQ HO (QWUH \ PHGLDQWH XQ FRQYHQLR HQWUH SURGXFWRUHV \ FRPSDxtDV VHPLOOHUDV VH VHPEUDURQ SHTXHxDV VXSHUFLHV GHO WRWDO GHO PDt] OOHJDQGR D KDV HQ (Q )UDQFLD VH VHPEUDURQ SHTXHxDV VXSHUFLHV DVt FRPR HQ 3RUWXJDO \ $OHPDQLD HQWUH \ +DVWD HO DxR KXER SHqueos incrementos en el rea sembrada, y en HO DxR VH VHPEUDURQ DSUR[LPDGDPHQWH KDV GH PDt] %W HQ VLHWH (VWDGRV 0LHPEURV GH OD 8( (O SULPHU LPSDFWR GH OD DGRScin del maz Bt se tradujo en mayores rindes R PiV GHELGR DO FRQWURO GH ORV OHSLGySWHURV SODJD PiV LPSRUWDQWHV GH HVDV ]RQDV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ ORV PDtFHV FRQYHQFLRQDOHV /DV JDQDQFLDV JHQHUDGDV SRU HO XVR GH ORV PDtFHV %W IXHURQ HQWUH \ KD PiV TXH en los cultivos convencionales. En algunas regiones adems, se mejor la calidad de grano PHGLDQWH XQD UHGXFFLyQ VLJQLFDWLYD GHO QLYHO de micotoxinas. Argentina (Q HO DxR VH KDQ DSUREDGR SRU SULmera vez en Argentina los eventos de maz \ DOJRGyQ FRQ UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV SDUD VX SURGXFFLyQ \ FRPHUFLDOL]DFLyQ $ SDUWLU GH DOOt VH DSUREDURQ RWURV HYHQWRV %W HQ PDt] /D VXSHUFLH VHPEUDGD IXH LQFUHPHQWiQGRVH GHVGH PLO \ PLO KDV KDVWD PLOORQHV \ PLO KDV HQ OD FDPSDxD SDUD PDt] \ DOJRGyQ UHVSHFWLYDPHQWH (Q HO LQFUHPHQWR DQXDO FRPSDUDGR FRQ IXH GH PLOORQHV GH hectreas, equivalentes a una tasa anual de FUHFLPLHQWR GHO (Q HO FDVR GH PDt] \D VH KDQ DSUREDGR SDUD VX FXOWLYR HQ OD FDPSDxD HYHQWRV DSLODGRV GH WROHUDQFLD D KHUbicidas con resistencia a insectos. La tasa de DGRSFLyQ GH HVWRV HYHQWRV SDUD OD SURGXFFLyQ VH SXHGH REVHUYDU HQ OD JXUD (Q OD WDEOD VH GHWDOODQ ORV HYHQWRV DSUREDGRV HQ OD $UJHQWLQD KDVWD DJRVWR GH Maz Bt HO EHQHFLR GH OD DGRSFLyQ GH OD WHFQRORJtD %W FRQVLVWH HQ OD SUHYHQFLyQ GH ODV SpUGLGDV GH UHQGLPLHQWR FDXVDGDV SRU HO DWDTXH GH Diatraea Saccharalis (barrenador del tallo) en su estado larval. 6H HVWLPD TXH ODV SpUGLGDV HQ OD UHJLyQ
Figura 1. 6XSHUFLH FRQ FXOWLYRV %W HQ $UJHQWLQD )XHQWH $UJHQELR
SDPSHDQD SRU HVWD SODJD DOFDQ]DQ ORV 170 millones de dlares y que adems, OD DGRSFLyQ GH KtEULGRV %W LQFUHPHQWy HQ XQ HO UHQGLPLHQWR GHO FXOWLYR HV GHFLU TXH HYLWy SpUGLGDGV GH SURGXFFLyQ GH esa magnitud). Algodn Bt: HO DOJRGyQ %W SURYHH UHVLVWHQFLD DO FRPSOHMR SULQFLSDO GH SHVWHV (Helicoverpa gelotopoeon y H. Zea comnmente asociadas con Heliotis virescens) y tambin al gusano de la hoja (Alabama argillacea), la lagarta rosada (Pectinophora gossipiella) y otros leSLGySWHURV Spodoptera VSS 3HUR QR SURYHH UHVLVWHQFLD FRQWUD LQVHFWRV FROHySWHURV R VXFFLRQDGRUHV FKLQFKHV \ KRPySWHURV 6H KD GHWHUPLQDGR TXH OD reduccin en la cantidad de insecticidas SXOYHUL]DGRV GXUDQWH HO SHUtRGR GH FXOWLYR %W RVFLOD HQWUH \ /D PD\Rra de las reducciones son en insecticidas muy txicos (de clases I y II), como RUJDQRIRVIRUDGRV FDUEDPDWRV \ SLUHWURLGHV VLQWpWLFRV TXH FDXVDQ SUREOHPDV GH UHVLGXRV \ VRQ Wy[LFRV SDUD ORV LQVHFWRV EHQpFRV 6H KD HVWLPDGR HO LPSDFWR GH OD DGRSFLyQ GH DOJRGyQ %W FRPR HO HTXLYDOHQWH D XQ GH DXPHQWR QHWD GH SURGXFFLyQ SRU KHFWiUHD (O DXPHQWR GH SURGXFFLyQ FRUUHVSRQGH D OD UHGXFFLyQ
GH ODV SpUGLGDV FDXVDGDV SRU DWDTXHV GH OHSLGySWHURV Lecturas recomendadas

Baum J A, Bogaert T, Clinton W, Heck G R, Feldmann P, Ilagan O, Johnson S, Plaetinck G, 0XQ\LNZD 7 3OHDX 0 9DXJKQ 7 5REHUWV - &RQWURO RI FROHRSWHUDQ LQVHFW SHVWV WKURXJK 51$ LQWHUIHUHQFH 1DWXUH %LRWHFKQRORJ\ %URRNHV * 7KH EHQHWV RI DGRSWLQJ JHQHWLFDOO\ PRGLHG LQVHFW UHVLVWDQW %W PDL]H LQ WKH (XURSHDQ 8QLRQ (8 UVW UHVXOWV IURP 3* (FRQRPLFV /WG ZZZSJHFRQRPLFV co.uk. Christeller J T, Malone L A, Todd J H, Marshall R 0 %XUJHVV ( 3 - 3KLOLS % $ 'LVWULEXWLRQ DQG UHVLGXDO DFWLYLW\ RI WZR LQVHFWLFLGDO SURWHLQV DYLGLQDQG DSURWLQLQ H[SUHVVHG LQ WUDQVJHQLF WREDFFR SODQWV LQ WKH ERGLHV DQG IUDVV RI Spodoptera litura larvae following feeding. -RXUQDO RI ,QVHFW 3K\VLRORJ\ Farias L R, Costa F T, Souza L A, Pelegrini P B, Grossi-de-S MF, Neto S M, Bloch C Jr, Laumann R A, Noronha E F, Franco O L. 2007. Isolation RI D QRYHO &DULFD SDSD\D DP\ODVH LQKLELWRU with deleterious activity toward Callosobruchus maculates. Pesticide Biochemistry and 3K\VLRORJ\ ,QWHJUDWLRQ RI ,QVHFW5HVLVWDQW *HQHWLFDOO\ 0RGLHG &URSV ZLWKLQ ,30 3URJUDPV 6HULHV 3URJUHVV LQ %LRORJLFDO &RQWURO 9RO (G 5RPHLV -|UJ
Tabla 2. (YHQWRV FRQ UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV DSUREDGRV HQ $UJHQWLQD KDVWD MXQLR GH
Nombre del Evento de Transformacin
Solicitante
Fecha aprobacin
Gen
Otros pases con Resolucin el mismo evento aprobado Australia, Brasil, Canad, China, UE, India, Japn, Corea, Mjico, Filipinas, Sudfrica, EEUU
MON 531
Monsanto Argentina
16/07/1998
cry1Ac de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 (B.t.k)
SAGPyA N428
MON 810
Monsanto Argentina
16/07/1998
Australia, Brasil, Canad, China, UE, India, Japn, cry1Ab de Bacillus SAGPyA N Corea, Mjico, thuringiensis subsp. Filipinas, 429 kurstaki HD-1. Sudfrica, Suiza, Taiwn, Uruguay, EEUU Australia, Brasil, Canad, China, cry1A(b) de Bacillus UE, Japn, Corea, thuringiensis subsp. SAGPyA N Mjico, Filipinas, kurstaki cepa HD-1; 392 Rusia, Sudfrica, pat Suiza, Taiwn, Reino Unido, Uruguay, EEUU Australia Canad China UE Japn Corea Mjico Filipinas Sudfrica Suiza Taiwn EEUU
Bt 11
Novartis Agrosem
27/07/2001
TC 1507
Dow AgroSciences y Pioneer Argentina
15/03/2005
cry1F de Bacillus thuringiensis var. SAGPyA N aizawai ; gen pat de 143 Streptomyces viridochromogenes
NK603 x 810
Monsanto
28/08/2007
Hbrido derivado del UE, Japn, cruzamiento entre SAGPyA N Corea, Mjico, las lneas parentales 78 Filipina, Sudfrica NK603 y MON810
1507 x NK603
Dow AgroSciences y Pioneer Argentina
28/05/2008
Evento apilado derivado del cruzamiento de las lneas 1507 y NK603 SAGPyA N 434 con tolerancia a herbicida y resistencia a lepidpteros.
UE, Japn, Corea, Mjico, Filipinas
6KHOWRQ $QWKRQ\ 0 .HQQHG\ *HRUJH ;9,,, S 6SULQJHU 1HWKHUODQGV 0DR < % &DL : - :DQJ - : +RQJ * - 7DR ; < :DQJ / - +XDQJ < 3 &KHQ ; < 6LOHQFLQJ D FRWWRQ EROOZRUP 3 PRQRR[\JHQDVH JHQH E\ SODQWPHGLDWHG 51$L LPSDLUV ODUYDO WROHUDQFH RI JRVV\SRO 1DWXUH %LRWHFKQRORJ\ 1313. 0D\HU $ 0 3RO\SKHQRO R[LGDVHV LQ SODQWV DQG IXQJL *RLQJ SODFHV" $ UHYLHZ 3K\WRFKHPLVWU\ 0F&DIIHUW\ + 0RRUH 3 + =KX < - 3DSD\D transformed with the Galanthus nivalis GNA gene SURGXFHV D ELRORJLFDOO\ DFWLYH OHFWLQ ZLWK VSLGHU PLWH FRQWURO DFWLYLW\ 3ODQW 6FLHQFH 5DOSK 6 * $QDO\VLV RI KLJKTXDOLW\ VHTXHQFHQLVKHG SRSODU IXOOOHQJWK F'1$ clones and their utility for the discovery of genes UHVSRQGLQJ WR LQVHFW IHHGLQJ %0& *HQRPLFV
5DQH\ 7 (FRQRPLF LPSDFW RI WUDQVJHQLF FURSV LQ GHYHORSLQJ FRXQWULHV &XUUHQW 2SLQLRQ LQ %LRWHFKQRORJ\ 7ULJR ( - \ &DS ( - 'LH] $xRV GH &XOWLYRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV HQ OD $JULFXOWXUD Argentina. www.argnebio.org. :DQJ - DQG &RQVWDEHO & 3 3RO\SKHQRO R[LGDVH RYHUH[SUHVVLRQ LQ WUDQVJHQLF 3RSXOXV enhances resistance to herbivory by forest tent FDWHUSLOODU Malacosoma disstria). Planta 220, :X ) )LHOG (YLGHQFH %W &RUQ DQG 0\FRWR[LQ 5HGXFWLRQ ,6% 1HZV 5HSRUWHU www.isb.vt.edu. :X 0 6XSSUHVVLRQ RI &RWWRQ %ROOZRUP LQ 0XOWLSOH &URSV LQ &KLQD LQ $UHDV ZLWK %W 7R[LQ &RQWDLQLQJ &RWWRQ 6FLHQFH 9RO
V. CAPTULO 11 Aplicaciones biotecnolgicas al PDQHMR GH PDOH]DV (YHQWRV GH resistencia a herbicidas en cultivos.

Germn Ferrari Julio E. Delucchi Marcadores moleculares (V PX\ LPSRUWDQWH GHVWDFDU TXH OD LQFXPEHQFLD GH OD ELRWHFQRORJtD DSOLFDGD DO PDQHMR de malezas no se limitan solamente a la obtenFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ UHVLVWHQFLD herbicidas. As, el uso de marcadores molecuODUHV WLHQH JUDQ LPSRUWDQFLD SDUD OD FRUUHFWD LGHQWLFDFLyQ WD[RQyPLFD GH PDOH]DV \ SDUD el conocimiento de las relaciones genticas HQWUH SREODFLRQHV HO HVWXGLR GHO PRGR GH UHSURGXFFLyQ \ GHO XMR GH JHQHV FRQ ODV SODQWDV cultivadas. Los recientes avances en la caracterizacin funcional de los genomas vegetales HVWiQ HQFRQWUDQGR FUHFLHQWH DSOLFDFLyQ HQ HVWH FDPSR /D JHQyPLFD IXQFLRQDO SHUPLWH LGHQWLcar genes cuyas formas mutantes son letales, FRQVWLWX\HQGR pVWRV EODQFRV LGHDOHV SDUD VX LQKLELFLyQ SRU XQ KHUELFLGD 3RU RWUD SDUWH OD XWLOL]DFLyQ GH PLFUR DUUHJORV SHUPLWH HVWXGLDU D QLYHO JHQyPLFR ORV HIHFWRV GH KHUELFLGDV FDQGLGDWR VREUH OD H[SUHVLyQ JpQLFD (VWRV GDWRV GHEHQ VHU OXHJR FRQUPDGRV HQ HVWXGLRV SURtemicos. /DV DSOLFDFLRQHV GH ORV PDUFDGRUHV PROHFXODUHV VRQ PX\ GLYHUVDV \ HV GH HVSHUDU TXH se les encuentren nuevos usos. Por ahora se estn utilizando en la diferenciacin de indiviGXRV GLVFULPLQDFLyQ HQWUH FORQHV DQiOLVLV ORJHQpWLFRV \ WD[RQyPLFRV PDSHR GH JHQRPDV FXDQWLFDFLyQ GH YDULDELOLGDG JpQLFD LQWUD H LQWHU HVSHFtFD PHMRUDV JHQpWLFDV GHWHFFLyQ GH LQIHFFLRQHV R SURSHQVLyQ D VXIULUODV ORFDOL]DFLyQ GH UHVLVWHQFLD D HQIHUPHGDGHV \ GLVSHUVLyQ GH HVSHFLHV HQWUH RWUDV 8Q HMHPSOR GH DSOLFDFLyQ GHO XVR GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HQ PDOH]DV HV OD HSLGHPLRORJtD PROHFXODU GH VRUJR GH $OHSR Sorghum halepensis UHVLVWHQWH D JOLIRVDWR /RV SULPHURV casos se manifestaron en el noroeste argenti-
QR \ DO DxR KD\ UHSRUWDGRV FDVRV HQ HO norte de Buenos Aires, Crdoba y el noreste DUJHQWLQR FRPSURPHWLHQGR HO FXOWLYR GH VRMD \ maz, cuya estrategia de manejo de malezas, est basada en el uso de glifosato. Existe un SUR\HFWR TXH SODQWHD HO XVR GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV \ VHFXHQFLDFLyQ QXFOHRWtGLFD SDUD FDUDFWHUL]DU OD GLQiPLFD GH OD GLVSHUVLyQ \ FDracterizacin molecular del mecanismo de resistencia de dicha maleza. Instrumentos genmicos y de la protemica /D SURWHyPLFD HV HO HVWXGLR GH OD HVWUXFWXUD \ IXQFLyQ GH ODV SURWHtQDV LQFOXLGD VX IRUPD de actuar e interactuar dentro de las clulas. A SDUWLU GHO FRQRFLPLHQWR SURIXQGR GHO PHWDEROLVPR FHOXODU HQ ODV PDOH]DV HV SRVLEOH OD LGHQWLFDFLyQ GH EODQFRV WDQWR SDUD VLWLR GH DFFLyQ GH ORV KHUELFLGDV FRPR SDUD IXHQWH GH UHVLVWHQFLD DSOLFDEOHV D FXOWLYRV 3RU PHGLR GH HVWD WHFQRloga fue detectada en el maz la enzima Glutatin S-transferaza (GST) (Frear y Swanson, TXH WLHQH OD FDSDFLGDG GH GHWR[LFDU SRU PHGLR GH FRQMXJDFLyQ D KHUELFLGDV HOHFWURflicos como la atrazina, acetoclor y metolaclor. Posteriormente ocurri el descubrimiento y aislamiento del gen psbA SURYHQLHQWH GH ORV FORURSODVWRV GH YDULDV HVSHFLHV GH PDOH]DV TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD FRQVSLFXD D KHUELFLGDV con accin sobre el fotosistema II como la atra]LQD $ SDUWLU GH HVWH GHVFXEULPLHQWR SXGLHURQ REWHQHUVH SODQWDV GH WDEDFR FRQ HO JHQ psbA PXWDGR SDUD RWRUJDUOH UHVLVWHQFLD D DWUD]LQD SRU VHOHFFLyQ IRWRPL[RWUyFD VLVWHPD GH FXOtivo de in-vitro). Cultivo de tejidos, seleccin in vitro y mutagnesis para el desarrollo de cultivos con resistencia a herbicidas. Las tcnicas de mutagnesis y seleccin in YLWUR R D FDPSR KDQ SHUPLWLGR HO DLVODPLHQWR de individuos con resistencia a herbicidas, que en muchos casos, han alcanzado el nivel de utilizacin comercial. La obtencin de cultivos &OHDUHOG (maz, girasol, colza, trigo, arroz, HQWUH RWURV UHVLVWHQWHV D GLIHUHQWHV SULQFLSLRV activos de la familia de las imidazolinonas o la soja STS, resistente a sufonilureas, ambos JUXSRV LQKLELGRUHV GH OD HQ]LPD DFHWRODFWDWR
sintetasa (de ahora en ms en este texto, aceWRKLGUR[LiFLGR VLQWHWDVD R $+$6 VRQ HMHPSOR de ello. Estos cultivos fueron obtenidos a traYpV GH OD LQGXFFLyQ GH PXWDFLRQHV \ SRVWHULRU VHOHFFLyQ SRU OD DFFLyQ GH ORV PHQFLRQDGRV herbicidas, de los individuos resistentes. Cultivos resistentes a herbicidas obtenidos por ingeniera gentica /D LQJHQLHUtD JHQpWLFD SHUPLWH OD LQWURGXFFLyQ GH YDULDELOLGDG JHQpWLFD ~WLO SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH ORV FXOWLYRV SRU PpWRGRV QR VH[XDles. La resistencia a herbicidas fue una de las SULPHUDV DSOLFDFLRQHV GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD GH SODQWDV GLFKRV PHFDQLVPRV GH UHVLVWHQFLD \D VH FRQRFtDQ D SDUWLU GH HVWXGLRV FRQ DLVlamientos bacterianos resistentes, seleccin in vitro de clulas vegetales y de resistencia D FDPSR HQ FXOWLYRV \ PDOH]DV 3RU OR WDQWR UHVXOWDED FODUR TXH HO IHQRWLSR GH UHVLVWHQFLD SRGtD REWHQHUVH D SDUWLU GH OD LQWURGXFFLyQ GH genes individuales. $ SDUWLU GHO FRQRFLPLHQWR GH ODV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV TXH SXGLHUDQ FRQIHULU UHVLVWHQFLD D FLHUWRV KHUELFLGDV HQ SODQWDV \ GLVSRQHU GH ODV KHUUDPLHQWDV SDUD VX FRUUHFWD H[SUHVLyQ fue factible la obtencin de cultivos resistentes. 6XPDGR D HVWR XQ JUXSR GH HPSUHVDV FRQ PDUFDGR LQWHUpV SRU GLYHUVLFDUVH KDFLD HO QHJRFLR GH VHPLOODV SDUD GHVDUUROODU FXOWLYRV UHsistentes a sus molculas herbicidas, hicieron SRVLEOH OD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV con resistencia exclusiva a dichos herbicidas o bien, combinada con resistencia a insectos. 6HJ~Q XQ LQIRUPH GHO ,6$$$ 6HUYLFLR SDUD OD $GTXLVLFLyQ GH $SOLFDFLRQHV $JURELRWHFQRlgicas), en 2007, 114.3 millones de hectreas HQ WRGR HO PXQGR XQ PiV TXH HQ fueron sembradas con cultivos genticamente PRGLFDGRV *0 (O GH HVWDV KHFWiUHDV FRUUHVSRQGLHURQ D VRMD HO D PDt] HO D DOJRGyQ \ HO UHVWDQWH D FDQROD (VWDV VXSHUFLHV VLJQLFDURQ HO \ de las reas totales de cada uno de esos cultiYRV UHVSHFWLYDPHQWH (Q $UJHQWLQD HQ OD FDPSDxD SUiFWLFDPHQWH HO GH OD VXSHUFLH GH VRMD IXH VHPEUDGD FRQ VRMD WROHUDQte al herbicida glifosato, mientras que el maz \ HO DOJRGyQ WUDQVJpQLFRV RFXSDURQ HO \ HO GHO iUHD GHVWLQDGD D HVRV FXOWLYRV
UHVSHFWLYDPHQWH /D VXSHUFLH WRWDO GH FXOWLYRV *0 HQ $UJHQWLQD DVFHQGLy D PLOORQHV GH KHFWiUHDV HQ OD FDPSDxD XQ PiV TXH HQ OD FDPSDxD DQWHULRU (O SURFHVR GH LQVHUFLyQ GH JHQHV LPSOLFD OD obtencin de organismos genticamente moGLFDGRV HQ HVWH FDVR SDUWLFXODU GH FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV (O SULPHU FXOWLYR WUDQVJpQLFR REWHQLGR SRU HVWH PpWRGR IXH OD GHQRPLQDGD VRMD 55 VRMD 5RXQGXS 5HDG\) resistente a la DFFLyQ KHUELFLGD GHO JOLIRVDWR SRU PHGLR GH OD WUDQVIHUHQFLD GH XQ JHQ GHVGH XQD HVSHFLH GH Agrobacterium al genoma de la soja. Dicho gen tambin fue introducido en el maz, generando HO KtEULGR GH PDt] 55 PDt] 5RXQGXS 5HDG\). 3RU RWUD SDUWH WDPELpQ VH REWXYR HO PDt] /Lberty Link, resistente a glufosinato de amonio, herbicida no selectivo conocido comercialmente como Liberty. En este ltimo caso, el gen LQFRUSRUDGR FRGLFD SDUD XQD HQ]LPD IRVQRWULFLQ1DFHWLO WUDQVIHUDVD UHVSRQVDEOH GH convertir al glufosinato en un metabolito inocuo SDUD HO FXOWLYR Objetivos buscados en el desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas 5HVROYHU XQ SUREOHPD GH PDOH]DV SDUD HO TXH QR KD\D KHUELFLGDV GLVSRQLEOHV 5HHPSOD]DU ODV FRPELQDFLRQHV GH KHUELFLGDV DFWXDOPHQWH HQ XVR SRU QXHYRV herbicidas. 5HHPSOD]DU XQ KHUELFLGD GH DOWDV GRVLV SRU XQR GH EDMDV GRVLV 5HHPSOD]DU D XQ KHUELFLGD SUHHPHUJHQWH SRU XQR SRVWHPHUJHQWH 5HHPSOD]DU KHUELFLGDV FRQ SURSLHGDGHV ecolgicas y/o toxicolgicas inferiores. Estos objetivos dan un marco de referencia SDUD HQFDUDU HO GHVDUUROOR GH FXOWLYRV FRQ UHVLVtencia a un herbicida, teniendo en cuenta que, HO GHVDUUROOR GH FXOWLYRV WROHUDQWHV GHEH SULRULzar la utilizacin de herbicidas con los menores HIHFWRV QRFLYRV SDUD HO PHGLR DPELHQWH (V LPSRUWDQWH FRPSUHQGHU TXH H[LVWHQ GLIHUHQWHV SUREOHPDV GH PDOH]DV HQ FXOWLYRV SDUWLFXODUHV no resueltos an y que se trata de una situacin dinmica donde las malezas evolucionan SHUPDQHQWHPHQWH FRPR UHVSXHVWD D ODV SUiFWLFDV GH FRQWURO HPSOHDGDV SRU ORV DJULFXOWRUHV
Estrategias para obtener cultivos resistentes a herbicidas mediante ingeniera gentica ,QFUHPHQWDU OD H[SUHVLyQ GH OD SURWHtQD blanco del herbicida. Alterar el sitio de accin del herbicida. ,QWURGXFLU JHQHV TXH SHUPLWDQ OD GHWR[Lcacin del herbicida. Cabe mencionar que, de las estrategias PHQFLRQDGDV VyOR ODV GRV ~OWLPDV KDQ SURGXFLGR DSOLFDFLRQHV FRPHUFLDOHV (Q OD WDEOD LQIHULRU VRQ HQXPHUDGRV ORV SULQFLSDOHV HYHQWRV GH UHVLVWHQFLD D KHUELFLGDV DSOLFDGRV HQ FXOWLYRV \ su modo de accin. Resistencia a Glifosato En el ao 1974 se introdujo al mercado el KHUELFLGD 5RXQGXS cuyo ingrediente activo es el cido glifosato (n-fosfonometil glicina). Este HV XQ KHUELFLGD SRV HPHUJHQWH GH DPSOLR HVSHFWUR QR VHOHFWLYR \ VHJXUR GHVGH HO SXQWR
GH YLVWD DPELHQWDO EDMD WR[LFLGDG SDUD RUJDnismos no blanco, bajo movimiento en el agua VXEWHUUiQHD \ SHUVLVWHQFLD OLPLWDGD (O JOLIRVDWR LQKLEH HQ SODQWDV EDFWHULDV DOJDV KRQJRV \ SDUiVLWRV DSLFRPSOHMRV OD HQROSLUXYLO VKLNLPDWRIRVIDWR VLQWHWDVD (3636 HQ]LPD FODYH SDUD OD VtQWHVLV GH aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina \ WULSWRIDQR /D (3636 HV FRGLFDGD HQ SODQWDV SRU XQ JHQ QXFOHDU FX\R SURGXFWR DFWLYR VH ORFDOL]D HQ ORV SOiVWLGRV (Q ODV SODQWDV HVWD ruta biosinttica (ruta del shikimato) tiene lugar HQ HO FORURSODVWR (O JOLIRVDWR DFW~D FRPR XQ LQKLELGRU FRPSHWLWLYR RFXSDQGR HO OXJDU GHO 3(3 IRVIRHQROSLUXYDWR HQ HO FRPSOHMR HQ]LPiWLFR La unin de este herbicida a la enzima nativa EORTXHD VX DFWLYLGDG H LPSLGH HO WUDQVSRUWH GHO FRPSOHMR (3636VKLNLPDWR IRVIDWR DO FORURSODVWR /D HQ]LPD SURGXFLGD SRU HO JHQ PXWDGR HSVSV WLHQH XQD PHQRU DQLGDG SRU HO JOLIRVDWR \ HV FDWDOtWLFDPHQWH DFWLYD HQ SUHVHQFLD del herbicida (Figura 1).
Figura 1 (VTXHPD GH OD LQKLELFLyQ SRU HO iFLGR QIRVIRQRPHWLO JOLFLQD JOLIRVDWR VREUH OD HQ]LPD (3636 VXVFHSWLEOH \ OD LQFRPSDWLELOLGDG GHO VLWLR GH DFFLyQ DO PLVPR KHUELFLGD HQ OD HQ]LPD (3636 PXWDQWH Fuente: Mentaberry, A. 2007
GD $ SDUWLU GH HVWRV GHVFXEULPLHQWRV VH DLVOy HO JHQ TXH FRGLFD XQD (3636 UHVLVWHQWH D JOLIRVDWR SURYHQLHQWH GH OD FHSD CP4 de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (cp4 epsps). $VLPLVPR VH GHPRVWUy HQ YDULDV HVSHFLHV YHJHWDOHV ]DQDKRULD SHWXQLD WDEDFR DOIDOID \ soja) que la seleccin gradual con glifosato en FXOWLYRV FHOXODUHV SHUPLWH REWHQHU OtQHDV FHOXODUHV FRQ UHVLVWHQFLD DO KHUELFLGD PHGLDGD SRU XQ SURFHVR GH DPSOLFDFLyQ JpQLFD Gen gox TXH FRGLFD OD HQ]LPD JOLIRVDWR oxidoreductasa (VWD HV OD HQ]LPD UHVSRQVDEOH GHO SURFHVR GH GHJUDGDFLyQ GHO JOLIRVDWR SRU OD UXWD GHO iFLdo aminometilfosfnico (AMPA). Se observ TXH HO JOLIRVDWR HV UiSLGDPHQWH GHJUDGDGR SRU bacterias del suelo, el catabolismo de este herELFLGD SXHGH SURGXFLUVH SRU OD UXWD GH OD &3 liasa (observada en Pseudomonas sp R SRU OD GHO $03$ D SDUWLU Achromobacter sp. El gen gox FRGLFDGRU GH OD HQ]LPD JOLIRVDWR R[LGRUHGXFWDVD HV REWHQLGR D SDUWLU GH OD FHSD LBAA de Achromobacter sp \ SXHGH VHU LQFRUSRUDGR DO JHQRPD YHJHWDO SDUD VLQWHWL]DU GLFKD HQ]LPD \ DVt FRQIHULU UHVLVWHQFLD SRU GHJUDGDFLyQ GHO SULQFLSLR DFWLYR La utilizacin del gen cp4 epsps SDUD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV WROHUDQWHV D JOLIRVDWR KD UHVXOWDGR PiV HFLHQWH TXH OD GHO JHQ gox. Se han observado en varios casos que la H[SUHVLyQ GH HVWH ~OWLPR HQ SUHVHQFLD GHO KHUbicida, est asociada a sntomas que sugieren WRWR[LFLGDG GH ORV SURGXFWRV GH GHJUDGDFLyQ 'HVDUUROOR GH SURGXFWRV FRPHUFLDOHV UHVLVtentes a glifosato Soja SURPRWRU [6 VHFXHQFLD FRGLcante cp4 epsps Canola 3URPRWRU )09 )LJZRUW PRVDLF YLUXV VHFXHQFLD FRGLFDQWH cp4 epsps \ SURPRWRU )09 VHFXHQFLD FRGLFDQWH JR[ Algodn SURPRWRU )09 VHFXHQFLD FRGLFDQWH cp4 epsps (versin sinttica con RSWLPL]DFLyQ GH XVR GH FRGRQHV 0Dt] SURPRWRU GH DFWLQD GH DUUR] VHFXHQFLD FRGLFDQWH cp4 epsps \ SURPRWRU [6 VHFXHQFLD FRGLFDQWH cp4 epsps (2001).
Figura 2. Estructura de la EPSP sintetasa de E. coli. Los residuos del sitio activo estn marcados en azul. La regin en rojo es una regin altamente conservada. La conversin de la Gly 96 a Ala transforma a la enzima en resistente a glifosato. Mentaberry, A. 2007
'HVDUUROOR GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV resistentes a glifosato EPSPS resistente a glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens (cp4 epsps). (O JHQ TXH FRGLFD OD (3636 VH FORQy LQLcialmente en bacterias y se demostr que el LQFUHPHQWR GH VX H[SUHVLyQ ORJUDGR PHGLDQWH OD ORFDOL]DFLyQ GHO PLVPR HQ XQ SOiVPLGR PXOWLFRSLD FRQHUH UHVLVWHQFLD DO KHUELFLGD 6H REWXYLHURQ DVt SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH SHWXQLD TXH H[SUHVDEDQ XQ $'1F FRGLFDQWH SDUD OD SUHSURWHtQD FRPSOHWD (3636 GH HVD PLVPD HVSHFLH EDMR FRQWURO GHO SURPRWRU 35S GHO YLUXV GHO PRVDLFR GHO FROLRU (VWDV SODQtas resultaron altemente tolerantes al herbiciGD 2WUD HVWUDWHJLD H[SORUDGD IXH OD E~VTXHGD de formas variantes de la EPSPS que tuvieran VLPXOWiQHDPHQWH EDMD DQLGDG SRU HO JOLIRVDWR y buena actividad cataltica. Se demostr que ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ XQD EPSPS heterloga con estas caractersticas, WHQtDQ PX\ EXHQD UHVSXHVWD IUHQWH DO KHUELFL-
Resistencia a glufosinato de amonio El glufosinato de amonio es un herbicida GH FRQWDFWR GH DPSOLR HVSHFWUR TXH VH XWLOL]D SDUD FRQWURODU PDOH]DV HQ SRVWHPHUJHQFLD FRPR GHIROLDQWH SDUD DFHOHUDU HO VHFDGR GH JUDQRV SUHYLR D OD FRVHFKD R SDUD HO FRQWURO total de la vegetacin en suelos no cultivados. )XH GHVDUUROODGR SRU +RHFKVW HQ ORV DxRV \ HV FRPHUFLDOL]DGR HQ PiV GH SDtVHV EDMR distintos nombres comerciales, Basta, Rely, Finale y Challenge (O /JOXIRVLQDWR /IRVQRWULFLQD HV XQ LQKLELGRU FRPSHWLWLYR UHYHUVLEOH GHO OXJDU GHO /JOXWDPDWR HQ HO FRPSOHMR HQ]Lmtico de la glutamino sintetasa, que desemSHxD XQ SDSHO FUXFLDO HQ OD YLD GH DVLPLODFLyQ SULPDULD \ VHFXQGDULD GHO DPRQLR HQ ODV SODQWDV /D DVLPLODFLyQ SULPDULD FRPSUHQGH HO DPRQLR RULJLQDGR D SDUWLU GHO QLWUDWR DEVRUELGR GHO VXHOR SRU ODV UDtFHV \ OD VHFXQGDULD FRPSUHQGH la reasimilacin del amonio libre que se forma HQ OD SODQWD FRPR FRQVHFXHQFLD GH OD GHDPLQDFLyQ GH DPLQRiFLGRV \ OD IRWRUHVSLUDFLyQ (Q ODV SODQWDV WUDWDGDV FRQ JOXIRVLQDWR OD LQKLELFLyQ GH OD UHDFFLyQ TXH SURGXFH JOXWDPLQD D SDUWLU GHO JOXWDPDWR FRQGXFH D XQD UiSLGD DFXmulacin de amonio, la fotosntesis y la snteVLV GH SURWHtQDV GHFUHFHQ (O FRQMXQWR GH HVWRV SURFHVRV SURGXFHQ OD PXHUWH GH OD SODQWD XQRV SRFRV GtDV OXHJR GHO WUDWDPLHQWR Obtencin de plantas transgnicas resistentes a glufosinato (O ELDODIRV XQ SURGXFWR GH IHUPHQWDFLyQ GH Streptomyces hygroscopicus, se comerciaOL]D HQ -DSyQ GHVGH EDMR HO QRPEUH GH Herbiace (VWH HV XQ SUR KHUELFLGD QDWXUDO que consiste en L-glufosinato y dos residuos L-alanina. En las clulas vegetales, el bialafos VH FRQYLHUWH HQ /JOXIRVLQDWR SRU DFFLyQ GH HQGRSHSWLGDVDV $ SDUWLU GH OD FHSD Tu494 de Streptomyces hygroscopicus, se clonaron los genes bar y pat, DPERV FRGLFDQ SDUD OD VtQWHVLV GH OD HQ]LPD IRVQRWULFLQDFHWLO WUDQVIHUDVD SURWHtQD 3$7 que convierte al L-glufosinato en una forma DFHWLODGD VLQ DFWLYLGDG KHUELFLGD \ TXH SHUPLWH a estas bacterias defenderse de la accin txiFD GHO JOXIRVLQDWR TXH HOODV PLVPDV SURGXFHQ /DV SULPHUDV SODQWDV FRQ QLYHOHV GH UHVLVWHQ-
FLD D KHUELFLGDV VXFLHQWH SDUD VX XVR DJUtFROD VH REWXYLHURQ H[SUHVDQGR FRQVWLWXWLYDPHQWH HO gen bar WDEDFR WRPDWH \ SDSD $FWXDOPHQWH ambos genes se encuentran en varios cultivares transgnicos que tienen status comercial as, Aventis comercializa en Canad, la canola Liberty Link GHVGH \ HQ HO DxR VH DSUREy HQ ((88 OD VRMD \ HO PDt] /LEHUW\ /LQN. Herbicidas que inhiben la acetohidroxicido sintetasa La acetohidroxicido sintetasa (AHAS), ms FRQRFLGD SRU VX DQWLJXD GHQRPLQDFLyQ GH DFHtolactato sintetasa (ALS), es una enzima clave HQ OD ELRVtQWHVLV GH ORV DPLQRiFLGRV UDPLFDdos leucina, valina e isoleucina (Fig. 3). Los herbicidas inhibidores de la AHAS se KDQ GLIXQGLGR GHELGR D TXH SUHVHQWDQ YDULDV ventajas: 6H XWLOL]DQ HQ GRVLV PX\ EDMDV TXH SXHden llegar a 2 g. ia/ha. 6RQ GH DPSOLR HVSHFWUR Poseen actividad residual en el suelo. 3HUPLWHQ XQD DPSOLD YHQWDQD GH DSOLFDFLyQ \ EXHQ PDUJHQ GH VHJXULGDG SDUD HO cultivo. 3UHVHQWDQ EDMD WR[LFLGDG SDUD PDPtIHros. /D $+$6 HV XQ EODQFR PX\ SDUWLFXODU \D TXH HV LQKLELGD SRU KHUELFLGDV TXH SHUWHQHFHQ D YDULRV JUXSRV TXtPLFRV HQWUH HOORV ODV sulfonilureas y las imidazolinonas. Ambos son UHODWLYDPHQWH UHFLHQWHV \ HO SULPHUR GH HOORV IXH FRPHUFLDOL]DGR HQ FORUVXOIXURQ XQD sulfonilurea). Las sulfonilureas actan como LQKLELGRU FRPSHWLWLYR GHO SLUXYDWR VREUH HO VLWLR cataltico de la enzima y las imidazolinonas acWXDQ FRPR LQKLELGRU QR FRPSHWLWLYR FRQ UHVSHFWR DO SLUXYDWR )LJ /D H[SUHVLyQ GH $+$6 HV QHFHVDULD VLHPSUH TXH KD\D VtQWHVLV GH SURWHtQDV SRU HOOR HVWD HQ]LPD VH H[SUHVD D OR ODUJR GHO FLFOR GH YLGD GH OD SODQWD FDWDOL]DQGR HO SULPHU SDVR GH ODV GRV UDPDV GH OD ELRVtQWHVLV GH DPLQRiFLGRV UDPLFDGRV SURFHVR TXH HQ ODV SODQWDV VH ORFDOL]D HQ ORV FORURSODVWRV Los inhibidores de la AHAS se unen a dominios GH OD PLVPD TXH QR FRUUHVSRQGHQ DO VLWLR FDWDOtWLFR HVWR SURYRFD TXH ODV PXWDFLRQHV SXQtuales que afectan la unin de un herbicida a
Figura 3. 5HSUHVHQWDFLyQ GH OD HQ]LPD $+$6 GH Arabidopsis thaliana mostrando sus 4 sub-unidades idnticas. Fuente: Dr. Ronald G. Duggleby
Figura 4. 6XEXQLGDG GH $+$6 PRVWUDQGR VXV WUHV VHFWRUHV MXQWR FRQ OD 7LDPLQD SLUR IRVIDWR 733 HQ color rojo y los cofactores Mg \ DYLQ GLQXFOHRWLGR )$' (Q DPDULOOR SXHGH YHUVH HO VLWLR GH DFFLyQ RFXSDGR SRU HO KHUELFLGD LPD]DTXLQ )XHQWH 'U 5RQDOG * 'XJJOHE\
OD $+$6 QR PRGLTXHQ VX DFWLYLGDG FDWDOtWLFD Como consecuencia, se han descrito en malezas, varias sustituciones de aminocidos que
convierten a la AHAS sensible en una forma de OD HQ]LPD UHVLVWHQWH D SRU OR PHQRV XQ KHUELFLGD VLQ SHUGHU VX IXQFLRQDOLGDG
6XUJLPLHQWR GH PDOH]DV UHVLVWHQWHV D ODV AHAS El extenso y reiterado uso de los inhibidores GH OD $+$6 KL]R TXH D SHVDU GH VX UHFLHQWH GLfusin, la resistencia a los mismos haya evoluFLRQDGR UiSLGDPHQWH HQ ODV PDOH]DV $Vt KD\ DFWXDOPHQWH PiV HVSHFLHV R ELRWLSRV GH PDOH]DV UHVLVWHQWHV D HVWH JUXSR GH KHUELFLGDV TXH a cualquier otro. En la mayora de los casos la resistencia que surge en las malezas se debe a alteraciones en el sitio blanco del herbicida FRPR RULJHQ GH XQD PXWDFLyQ SXQWXDO ([LVWHQ XQD JUDQ FDQWLGDG GH PXWDFLRQHV UHVSRQVDEOHV de la resistencia a los inhibidores de la AHAS, SRU HMHPSOR ODV PXWDFLRQHV HQ ORV JHQHV TXH FRGLFDQ GLFKD HQ]LPD UHVXOWDQGR HQ DOJ~Q cambio de cualquiera de los cinco aminocidos TXH OD IRUPDQ 3RU HMHPSOR XQ FDPELR HQ Pro 197 SURYHH DOWD UHVLVWHQFLD D ODV VXOIRQLO XUHDV SHUR QR D ODV LPLGD]ROLQRQDV PLHQWUDV TXH OD sustitucin de Ala122 resulta en resistencia solamente a IMI. Una mutacin en Trp591 SURYHH resistencia a las dos familias de herbicidas y HV PX\ SRVLEOH TXH RFXUUDQ PXWDFLRQHV P~OWLSOHV TXH JHQHUHQ UHVLVWHQFLD P~OWLSOH DO FRQjunto de inhibidores de la AHAS. Los diferentes
SDWURQHV GH UHVLVWHQFLD D ORV LQKLELGRUHV GH ODV AHAS sugieren que los sitios de unin de cada IDPLOLD QR VHDQ LGpQWLFRV )LJ (O JUDQ Q~PHUR GH ELRWLSRV UHVLVWHQWHV VH GHEH HQ SDUWH a que existen muchos aminocidos que al ser sustituidos transforman a la AHAS en resistenWH /D UHVLVWHQFLD D ODV $+$6 SXHGH GLYLGLUVH en 3 categoras: %LRWLSRV UHVLVWHQWHV D WRGRV ORV LQKLELdores de las AHAS: sulfonil-ureas (SU), LPLGD]ROLQRQDV ,0, WULD]RORS\ULPLGLQDV 73 \ S\ULPLGLQ\OWKLREHQ]RDWRV 37% %LRWLSRV UHVLVWHQWHV D ,0, \ 37% VRODmente. %LRWLSRV UHVLVWHQWHV D 68 \ 73 VRODPHQte. Obtencin de cultivos resistentes a inhibidores de la AHAS $ PHGLDGRV GH OD GpFDGD GHO VH REWXYLHURQ LPSRUWDQWHV DYDQFHV HQ HO GHVDUUROOR GH lneas de arroz tolerante o resistente a herbiciGDV ,0, SULQFLSDOPHQWH SRU XQD VHOHFFLyQ PDVLva en cultivos de tejidos. En 2001 y 2002 las variedades resistentes a IMI fueron introducidas en el sur de EEUU bajo el nombre comercial de
Figura 5. $ &ORULPXURQHWLO SRVLFLRQDGR HQ HO VLWLR DFWLYR GH OD $+$6 GH Arabidopsis. La molcula es LQFOLQDGD HQ WRUQR DO JUXSR VXOIRQLO ORV DQLOORV DURPiWLFRV REVWUX\HQ HO FDQDO GH DFFHVR DO VLWLR DFWLYR GH OD enzima mientras que el resto de la molcula se mete en ste. B) Imazaquin bloqueando el acceso al sitio DFWLYR GH OD $+$6 VX SRVLFLyQ HV PXFKR PiV VXSHUFLDO HQ FRPSDUDFLyQ DO FORULPXUyQ )XHQWH 'U 5RQDOG Duggleby
&OHDUHOG (VWDV YDULHGDGHV QR IXHURQ PRGLFDGDV SRU OD LQVHUFLyQ GH JHQHV H[WUDxRV VLQR que son mutantes seleccionados y desarrollados con variedades siguiendo el mtodo clsico GH WRPHMRUDPLHQWR /D WHFQRORJtD &OHDUHOG, SURYHQLHQWH GH XQD PXWDFLyQ QDWXUDO HQ SODQWDV de girasol silvestre (Helianthus annuus), ha sido LQFRUSRUDGD HQ HO FXOWLYR FRPHUFLDO GH JLUDVRO (O WULJR GH SULPDYHUD UHVLVWHQWH D ODV LPLGD]ROLnonas fue liberado comercialmente en Canad en 2004 (IR Trait). En remolacha azucarera fue desarrollada la resistencia a IMI y sulfonilureas SRU VHOHFFLyQ GH FpOXODV VRPiWLFDV Sir-13 y 93R30B. Las sojas STS (sulfonylurea-tolerant VR\EHDQV IXHURQ REWHQLGDV HQ SRU PpWRGRV GH VHOHFFLyQ WUDGLFLRQDO \ SRVHHQ HO JHQ Als1 TXH RWRUJD UHVLVWHQFLD QDWXUDO D HVWH WLSR de herbicida. Mediante tratamientos mutagnicos de miFURVSRUDV \ SRVWHULRU FXOWLYR \ VHOHFFLyQ LQ YLWUR VH KDQ REWHQLGR SODQWDV UHVLVWHQWHV D LPLGD]ROLnonas (colza), de esta misma manera, se obtuYLHURQ SODQWDV UHVLVWHQWHV D LPLGD]ROLQRQDV SRU PXWDJpQHVLV TXtPLFD GH VHPLOODV \ SRVWHULRU VHOHFFLyQ D FDPSR HQ DUUR] WULJR \ PDt] 5HVSHFWR GH OD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV IXHURQ REWHQLGDV SODQWDV GH DOJRGyQ UHVLVWHQWHV GHELGR D OD H[SUHVLyQ GH XQD $+$6 GH WDEDFR PXWDJHQL]DGD LQ YLWUR \ OLQR FRQ OD H[SUHVLyQ de una AHAS de Arabidopsis VSS 5HVLVWHQFLD D ODV WULD]LQDV /D DSDULFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD D ODV WULD]LQDV HQ DOJXQDV HVSHFLHV GH PDOH]DV DSRUWy XQD EXHQD RSRUWXQLGDG SDUD GHVDUUROODU FXOWLYRV UHVLVWHQWHV SRU WpFQLFDV GH VHOHFFLyQ FOiVLFD /D IXHQWH GH JHQHV XWLOL]DGD SRU ORV FULDGRUHV HVWDED QRUPDOPHQWH OLPLWDGD SRU ODV EDUUHUDV UHSURGXFWLYDV TXH H[LVWHQ HQWUH ODV HVSHFLHV SHUR OD DSDULFLyQ GH XQ ELRWLSR GH Brassica campestris UHVLVWHQWH SHUPLWLy HO GHVDUUROOR GH OD FDQROD UHVLVWHQWH D ODV WULD]LQDV (O FLWRSODVPD GH B. Campestris resistente fue transferida a Brassica napus var. Olefera SRU UHWURFUX]DV FRPELQDda con seleccin citogentica. As OAC Triton IXH OD SULPHUD FDQROD UHVLVWHQWH D WULD]LQDV TXH DSDUHFLy FRPHUFLDOPHQWH HQ &DQDGi 'HQWUR GH HVWH JUXSR OD DWUD]LQD HV XQR GH los herbicidas ms usados en el mundo, estos herbicidas son inhibidores fotosintticos. Su
mecanismo de accin consiste en unirse a la SURWHtQD D1, ubicada en la membrana tilacoiGH GHO FORURSODVWR LPSLGLHQGR DVt VX XQLyQ D OD SODVWRTXLQRQD \ EORTXHDQGR HO WUDQVSRUWH GH electrones hacia el Fotosistema I. La atrazina VH XVD HQ FXOWLYRV FRPR PDt] \ VRUJR TXH SUHVHQWDQ UHVLVWHQFLD D OD PLVPD SRU WHQHU FDSDFLGDG PHWDEyOLFD GH GHWR[LFDUOR SRU PHGLR GH OD JOXWDWLRQVWUDQVIHUDVD TXH MD XQ WULSpSWLGR GH JOXWDWLRQ D FRPSXHVWRV KLGURIyELFRV FRPR OD atrazina. Este mecanismo, esta involucrado en el metabolismo de las triazinas y las cloracetanilidas. Una vez que el glutatin es unido al KHUELFLGD HVWH VH WUDQVIRUPD HQ XQ FRPSXHVWR no txico y es removido hacia la vacuola. Este HV XQR GH ORV PHFDQLVPRV HQ]LPiWLFRV GH SURWHFFLyQ IUHQWH D FRPSXHVWRV [HQRELyWLFRV XQD de las estrategias de la resistencia a herbicidas. Selectividad por alteraciones en el sitio blanco del herbicida En el contexto de reiterado uso de triazinas HQ PRQRFXOWLYR GH PDt] VH KDQ LGHQWLFDGR ELRWLSRV GH PDOH]DV FRQ UHVLVWHQFLD D ODV PLVmas. Esta resistencia se basa en la alteracin GHO VLWLR EODQFR GH HVWRV KHUELFLGDV /D SURWHtna D1 HVWi FRGLFDGD SRU HO JHQ psb A, que HVWi XELFDGR HQ HO JHQRPD GHO FORURSODVWR (Q YDULDV HVSHFLHV YHJHWDOHV VH KD UHSRUWDGR como base molecular de la resistencia a triaziQDV XQD PXWDFLyQ GH SXQWXDO HQ HO FRGyQ 264 GHO PHQFLRQDGR JHQ TXH SURGXFH XQD VXVtitucin de serina SRU glicina )LJXUD HQ OD IRUPD UHVLVWHQWH 8Q UHHPSOD]R GH isoleucina SRU Val219 en Poa annua HV OD UHVSRQVDEOH GH OD UHVLVWHQFLD GH HVWH ELRWLSR DO GLXURQ \ PHWULbuzin. En Portulaca oleacea una sustitucin de Ser264 a treonina SURYHH UHVLVWHQFLD D OLQXURQ La resistencia de los inhibidores del fotosistema II basada en cambios del sitio de accin HV GH KHUHQFLD PDWHUQD SRU VHU RULJHQ GH XQD PXWDFLyQ GHO $'1 GHO FORURSODVWR (VWH WLSR GH KHUHQFLD HV GH EDMR SRWHQFLDO GH H[SDQVLyQ \D TXH QR VH GLVHPLQDQ SRU PHGLR GHO SROHQ /D SURWHtQD 32 kDa SURWHtQD GH XQLyQ D Qb o D1 IXH LGHQWLFDGD FRPR VLWLR GH XQLyQ GH ODV triazinas en Amaranthus hybridus (VWD SURWHtna integra el ncleo del centro de reaccin del Fotosistema II. En lneas resistentes de Amaranthus, se vio que las triazinas no se unan a
Figura 6. )UDJPHQWR GH OD SURWHtQD ' TXH HV SXQWR GH XQLyQ GH OD SODVWRTXLQRQD \ VLWLR GH DFFLyQ GH OD s triazinas, mostrando la sustitucin de serina GH OD IRUPD VXVFHSWLEOH SRU glicina en la forma resistente a DWUD]LQD HQ HO FRGyQ )XHQWH 0DOORU\6PLWK
OD SURWHtQD \ VH HQFRQWUy XQD PXWDFLyQ SXQWXDO de Ser a Gly HQ OD SRVLFLyQ 6H REVHUYDURQ mutaciones similares de la Ser D Gly en la SURWHtQD GH N'D GH Chlamydomonas reinhardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum. /D E~VTXHGD GH UHVLVWHQFLD SRU LQJHQLHUtD gentica se ha orientado a la introduccin de SURWHtQDV GH N'D PXWDGDV HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV \ D OD GHWR[LFDFLyQ GH DWUD]LQDV PHGLDQWH OD LQWURGXFFLyQ GH XQ JHQ TXH FRGLFD glutation-S-transferasa (GTS). El segundo enfoque ha dado mejores resultados. 5HVLVWHQFLD D KLGUR[LEHQ]RQLWULORV Los hidroxibenzonitrilos son tambin inhibiGRUHV GHO IRWRVLVWHPD ,, HQ HVSHFLHV GLFRWLOHGyQHDV 3RU HVWD UD]yQ FXDQGR VH DSOLFDQ VREUH dicotiledneas resistentes a los mismos, se suele incluir un herbicida de accin graminiciGD GH PRGR GH DPSOLDU HO HVSHFWUR GH FRQWURO GH PDOH]DV 6H REWXYLHURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH DOJRGyQ FRO]D \ WDEDFR TXH H[SUHVDQ XQD VHFXHQFLD FRGLFDQWH SDUD XQD QLWULODVD
obtenida de Klebsiella pneumoniae sub. sp. ozanae (VWDV SODQWDV VRQ UHVLVWHQWHV D FDPSR a los herbicidas ioxynil y bromoxynil y han sido OLEHUDGDV FRPHUFLDOPHQWH HQ DOJXQRV SDtVHV Al ser el glifosato menos costoso y de mayor HVSHFWUR GH FRQWURO TXH ORV KLGUR[LEHQ]RQLWULlos, en 2004 fue el ltimo ao de comercializaFLyQ GH DOJRGyQ %;1 \ FRO]D %;1 Resistencia a Dicamba Es un herbicida auxnico que se utiliza como SUH \ SRVW HPHUJHQWH HQ HO FRQWURO GH PDOH]DV ODWLIROLDGDV DQXDOHV \ SHUHQQHV 5HFLHQWHPHQte se logr aislar el gen de la dicamba monooxigenasa (DMO) de Pseudomona maltophilia OD FXDO FRQHUH WROHUDQFLD D GLFDPED (VWD enzima est involucrada en la conversin del GLFDPED HQ XQ FRPSXHVWR QR Wy[LFR FRPR HO iFLGR GLFORURVDOLFtOLFR /D LQVHUFLyQ GH HVWH JHQ SURYHH D ODV SODQWDV ODWLIROLDGDV UHVLVWHQcia al herbicida. Actualmente se encuentra en GHVDUUROOR \ SURFHVR GH LQVFULSFLyQ HQ 86$ OD VRMD \ HO DOJRGyQ UHVLVWHQWHV D GLFDPED SRU OD insercin de este gen.
Otras resistencias metablicas Genes de bacterias 6H REWXYLHURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH YDULDV HVSHFLHV UHVLVWHQWHV DO iFLGR GLFORUR fenxiactico (2,4-D; regulador de crecimiento GH WLSR DX[tQLFR SRU H[SUHVLyQ GH XQD PRQRR[LJHQDVD FRQ JUDQ HVSHFLFLGDG GH VXVWUDto, obtenida de Alcaligenes eutrophus (gen JMP134 tfdA XQD EDFWHULD GH VXHOR FDSD] GH utilizar el 2,4-D como sustrato fuente de carERQR $ SDUWLU GH HVWD EDFWHULD WDPELpQ VH ORJUDURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ XQD VHFXHQFLD FRGLFDQWH SDUD XQD GHKDORJHQDVD TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD DO KHUELFLGD GDODSRQ LQKLELGRU GH OD VtQWHVLV GH OtSLGRV DVL FRPR XQD VHFXHQFLD FRGLFDQWH SDUD XQD FDUEDPDWR hidroxilasa, obtenida tambien de Alcaligenes sp TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD DO KHUELFLGD PHWRODFORU SHUWHQHFLHQWH DO JUXSR GH ODV FORURDFHWDPLGDV TXH LQKLEHQ OD VtQWHVLV GH OtSLGRV Genes eucariticos )XHURQ REWHQLGDV SODQWDV GH WDEDFR TXH H[SUHVDQ XQD JOXWDWLRQ 6WUDQVIHUDVD GH PDt] UHVLVWHQWHV D FORURDFHWDPLGDV SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH SDSD FRQ H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV SDUD FLWRFURPR3 PRQRR[LJHQDVDV KXPDQDV 6H H[SUHVy HQ SDSD EDMR FRQWURO GH XQ SURPRWRU LQGXFLEOH SRU EHQ]RWLDGLD]RO XQD VHFXHQFLD TXH FRGLFD OD FLWRFURPR3 PRQRR[LJHQDVD GH UDWD VROD R IXVLRQDGD FRQ XQD GH OHYDGXUD /DV SODQWDV IXHURQ UHVLVWHQWHV D KHUELFLGDV GHO JUXSR GH ODV IHQLOXUHDV 6H REWXYLHURQ SODQWDV GH WDEDFR \ Arabidopsis FRQ H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH XQD FLWRFURPR3 PRQRR[LJHQDVD GH WRSLQDPbur (Helianthus tuberosus). Estas resultaron resistentes a fenilureas. &RPHQWDULRV QDOHV El descubrimiento de nuevos herbicidas no es una tarea sencilla ni econmica. Para tener DOJXQD RSRUWXQLGDG GH VHU FRPHUFLDOL]DGR XQ herbicida, debern tener buena actividad bioOyJLFD FRQWUD XQ DPSOLR HVSHFWUR GH PDOH]DV VHU QR Wy[LFR SDUD FXOWLYRV PDPtIHURV H LQYHUWHEUDGRV WHQHU SRFD UHVLGXDOLGDG HQ HO VXHOR \ XQ FRVWR GH SURGXFFLyQ IDYRUDEOH (Q HVWH FRQtexto, el desarrollo de cultivos con resistencia
a los herbicidas no selectivos ya existentes, es XQD RSFLyQ LQWHUHVDQWH SDUD VHU H[SORUDGD SRU OD LQGXVWULD DJURTXtPLFD UHVSHFWR DO GHVDUUROOR de nuevos herbicidas. Debe remarcarse que HVWR LPSOLFD XQ FDPELR GH SDUDGLJPDV WHFQROyJLFRV DQWHV VH GHVDUUROODEDQ KHUELFLGDV SDUD VX XVR HQ FXOWLYRV SDUWLFXODUHV DKRUD VH PRGLFDQ JHQpWLFDPHQWH ORV FXOWLYRV SDUD IDYRUHFHU HO XVR GH KHUELFLGDV SDUWLFXODUHV /D FDSDFLGDG GH ORV FLHQWtFRV SDUD GHVDUUROODU QXHYRV HYHQWRV WUDQVJpQLFRV ~WLOHV HQ FXOWLYRV \ OD H[SHFWDtiva de utilizacin de los mismos es actualmente muy alta. Sin embargo, surgen cuestiones TXH SRGUtDQ DIHFWDU HO IXWXUR GHVDUUROOR GH HVWH WLSR GH WHFQRORJtD &yPR DIHFWDUi OD RSLQLyQ S~EOLFD \ ORV DFWXDOHV VLVWHPDV UHJXODWRULRV D los nuevos eventos transgnicos? Habr suFLHQWHV PHUFDGRV JOREDOHV TXH MXVWLTXHQ OD LQYHUVLyQ TXH LPSOLFD VX GHVDUUROOR" $FHSWDUiQ ORV FRQVXPLGRUHV OD SUROLIHUDFLyQ GH QXHYRV RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0 HQ (XURSD" /D GHPDQGD GH ORV SURGXFWRUHV SRU ORV 2*0 SXHGH VHU PX\ DOWD SHUR JOREDOPHQWH HO FRPSUDGRU GHEH WDPELpQ QHJRFLDU UHVSHFWR GH OD VLWXDFLyQ GH ORV JRELHUQRV \ OD VRFLHGDG SDUD GHWHUPLQDU OD YLDELOLGDG GH ORV QXHYRV HYHQWRV WUDQVJpQLFRV /D H[SDQVLyQ IXWXUD HQ HVWD iUHD GHSHQGHUi GH FyPR VH UHVSRQGD D HVWDV FXHVWLRQHV Bibliografa de consulta
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V, CAPITULO 12 Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos

)ORUHQFLD GHO 9LVR $QGUHD ) 3XHEOD Nstor Carrillo y Raquel L. Chan Factores abiticos que causan estrs en plantas. Efectos sobre los cultivos de inters agronmico Los cambios desfavorables en el ambiente, SURYRFDGRV SRU IDFWRUHV FOLPiWLFRV \ HGiFRV JHQHUDQ HVWUpV GH WLSR DELyWLFR HQ ODV SODQWDV DIHFWDQGR VHYHUDPHQWH VX SURGXFWLYLGDG /RV HVWUHVHV DELyWLFRV FRQVWLWX\HQ OD SULQFLSDO FDXVD GH SpUGLGDV HQ ORV FXOWLYRV (VWDV SpUGLGDV GH SURGXFWLYLGDG VXSHUDQ D YHFHV VHJ~Q FiOFXORV HVWLPDWLYRV HO /DV HVWUDWHJLDV GH PHMRUDmiento clsico indicaron que los caracteres de tolerancia a estreses ambientales son caracteres cuantitativos y difciles de seleccionar. Existen numerosos factores abiticos naturaOHV FDXVDQWHV GH HVWUHVHV SDUD ODV SODQWDV /DV DFWLYLGDGHV DQWURSRJpQLFDV KDQ DJUDYDGR HVWD SUREOHPiWLFD &RPR UHVXOWDGR JOREDO HO GH los suelos cultivados es salino y las reas sometiGDV D GpFLW KtGULFR VH H[SDQGHQ FRQWLQXDPHQWH (Q HVWH FDStWXOR QRV HQIRFDUHPRV HQ OD GHVFULSFLyQ GH ORV HVWUHVHV DELyWLFRV TXH PiV DIHFWDQ HO FUHFLPLHQWR GHVDUUROOR \ SURGXFWLYLGDG GH los cultivos; as como en las estrategias que se KDQ LPSOHPHQWDGR FRQ HO REMHWLYR GH REWHQHU ODV YDULHGDGHV GH HVSHFLHV DJURQyPLFDPHQWH LPSRUWDQWHV PHMRU DGDSWDGDV D VLWXDFLRQHV GH HVtrs. (O GpFLW KtGULFR /D GLVSRQLELOLGDG GH DJXD HV HO IDFWRU PiV LPSRUWDQWH TXH DIHFWD ORV FXOWLYRV /D VHTXtD FDXVD GHVKLGUDWDFLyQ FHOXODU SRU UHPRFLyQ GH DJXD KDFLD ORV HVSDFLRV H[WUDFHOXODUHV UHVXOWDQGR en la reduccin del volumen vacuolar y citoslico, en la reduccin del crecimiento vegetativo SRU GLVPLQXFLyQ GH OD WDVD IRWRVLQWpWLFD \ HQ OD SURGXFFLyQ GH HVSHFLHV UHDFWLYDV GH R[tJHQR (EROS) que afectan negativamente las estructuras celulares y el metabolismo.
/D SULPHUD UHVSXHVWD REVHUYDGD HQ SODQWDV sometidas a un estrs hdrico severo es el cierre GH ORV HVWRPDV SDUD SUHYHQLU OD SpUGLGD GH DJXD SRU WUDQVSLUDFLyQ OR TXH SURYRFD XQD GLVPLQXcin de la tasa fotosinttica y de la actividad ULEXORVD ELVIRVIDWR FDUER[LODVDR[LJHQDVD (RubisCO). La disminucin en el CO2 intraceOXODU SURYRFD XQ DXPHQWR HQ HO WUDQVSRUWH GH HOHFWURQHV FRQ XQD FRQFRPLWDQWH SURGXFFLyQ GH (526 LQFOX\HQGR DQLyQ VXSHUy[LGR SHUy[LGR de hidrgeno (H2O2) y oxgeno singlete. /RV FDPELRV ELRTXtPLFRV \ VLROyJLFRV DVRFLDGRV D OD DGDSWDFLyQ DO HVWUpV KtGULFR LQFOX\HQ YDULDFLRQHV HQ OD XLGH] \ HQ OD FRPSRVLFLyQ GH las membranas, acumulacin de osmolitos, y FDPELRV HQ ODV LQWHUDFFLRQHV SURWHtQDSURWHtQD \ SURWHtQDVOtSLGRV Salinidad Las altas concentraciones salinas en los VXHORV DIHFWDQ D ODV SODQWDV HQ DO PHQRV GRV IRUPDV (Q SULPHU OXJDU GLFXOWDQ D ODV UDtFHV la extraccin de agua del suelo y en segundo OXJDU UHVXOWDQ Wy[LFDV SDUD WRGD OD HVWUXFWXUD YHJHWDO /DV GLIHUHQWHV HVSHFLHV YDUtDQ HQ VX WROHUDQFLD DO HVWUpV VDOLQR ([LVWHQ HVSHFLHV sensibles como el arroz, el maz y la soja, mientras que otras como la alfalfa o la cebada SUHVHQWDQ XQD PD\RU WROHUDQFLD /RV HIHFWRV FDXVDGRV SRU HO HVWUpV VDOLQR VRQ HVHQFLDOPHQWH OD GLVUXSFLyQ GHO HTXLOLEULR RVPyWLFR H LyQLFR SRU H[FHVR GH VRGLR 1D), \ OD SURGXFFLyQ GH (526 1LYHOHV Wy[LFRV GH Na afectan la actividad de diversas enzimas y causan la desorganizacin de las membranas, la reduccin del crecimiento, y la inhibicin de OD H[SDQVLyQ \ OD GLYLVLyQ FHOXODU La reduccin del crecimiento como conseFXHQFLD GHO HVWUpV VDOLQR SUHVHQWD GRV IDVHV /D SULPHUD IDVH RVPyWLFD HV XQD UHVSXHVWD UiSLGD TXH FDXVD XQD SURQXQFLDGD GHWHQFLyQ GHO FUHFLPLHQWR GH OD SODQWD \ HO FLHUUH GH ORV estomas. La segunda (fase inica) se caracteUL]D SRU XQD QHFURVLV GH ODV KRMDV FDXVDGD SRU la acumulacin de Na (Q DOJXQDV HVSHFLHV ODV UDtFHV GH ODV SODQWDV H[KLEHQ OD FDSDFLGDG de excluir al Na. En otras, existe una toleranFLD HVSHFtFD GH WHMLGR DO 1D y al anin cloruro (Cl- TXH LQYROXFUD OD FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ GH estos iones intracelularmente, as como tam-
ELpQ OD H[FUHFLyQ GH VDOHV SRU PHGLR GH JOiQGXODV HVSHFLDOL]DGDV Las temperaturas extremas (O HVWUpV SRU WHPSHUDWXUD TXH H[SHULPHQWDQ ODV SODQWDV SXHGH FODVLFDUVH HQ WUHV WLSRV EDMDV WHPSHUDWXUDV VREUH FHUR GHO LQJOpV chilling WHPSHUDWXUDV GH FRQJHODPLHQWR GHO LQgls freezing \ DOWDV WHPSHUDWXUDV $OWDV WHPSHUDWXUDV En la actualidad, el calentamiento global acenta los efectos adversos de las altas temSHUDWXUDV VREUH ORV FXOWLYRV LQFUHPHQWDQGR ODV SpUGLGDV GH SURGXFWLYLGDG HQ WDVDV GH KDVWD HO SRU FDGD JUDGR &HOVLXV GH DXPHQWR GH OD WHPSHUDWXUD DPELHQWH GXUDQWH OD HVWDFLyQ GH crecimiento vegetativo. (O HVWUpV SRU DOWDV WHPSHUDWXUDV HVWi GHWHUPLQDGR WDQWR SRU HO DXPHQWR GH OD WHPSHUDWXUD DPELHQWDO SRU VREUH OD ySWLPD LQKHUHQWH D FDGD HVSHFLH FRPR SRU OD UDGLDFLyQ VRODU /DV KRMDV VRQ ORV yUJDQRV TXH PiV VXIUHQ HVWH WLSR GH estrs. /DV DOWDV WHPSHUDWXUDV DO LJXDO TXH ODV EDMDV DIHFWDQ OD XLGH] \ OD SHUPHDELOLGDG GH ODV PHPEUDQDV FHOXODUHV \ FRQGXFHQ D OD DSHUWXUD HVWRPiWLFD SDUD UHIULJHUDU OD KRMD %DMDV WHPSHUDWXUDV El fro es un factor relevante que causa seULDV FRQVHFXHQFLDV HQ OD SURGXFWLYLGDG GH ODV HVSHFLHV YHJHWDOHV /DV HVSHFLHV DGDSWDGDV D FOLPDV WHPSODGRIUtRV FRPR ORV FHUHDOHV GH LQYLHUQR WROHUDQ EDMDV WHPSHUDWXUDV VREUH FHUR & \ D~Q WHPSHUDWXUDV GH FRQJHODPLHQWR VL VRQ H[SXHVWDV D XQ SURFHVR FRQRFLGR FRPR DFOLPDWDFLyQ (Q FRQWUDVWH ODV HVSHFLHV GH FOLPDV WURSLFDOHV \ VXEWURSLFDOHV FRPR HO maz, el arroz o el tomate, son sensibles a las EDMDV WHPSHUDWXUDV \ HQ VX PD\RUtD FDUHFHQ de mecanismos de aclimatacin. /D FRQVHFXHQFLD PiV LPSRUWDQWH GHO FRQJHlamiento es el dao a las membranas celulares. eVWDV VRQ DIHFWDGDV SRU OD GLVPLQXFLyQ GH OD XLGH] \ OD GHVKLGUDWDFLyQ TXH VXIUHQ GXUDQWH HO FRQJHODPLHQWR /D XLGH] GH ODV PHPEUDQDV GHSHQGH GH OD WHPSHUDWXUD \ GH OD SURSRUFLyQ GH iFLGRV JUDVRV LQVDWXUDGRV SUHVHQWHV
9tDV GH VHxDOL]DFLyQ GH ODV UHVSXHVWDV Regulacin de la expresin gnica. /DV SODQWDV KDQ DGTXLULGR GXUDQWH VX HYROXFLyQ OD FDSDFLGDG GH PRGLFDU HYHQWRV HVSHFtFRV GHO GHVDUUROOR FRPR UHVSXHVWD D ORV FDPbios en las condiciones ambientales, y de este PRGR RSWLPL]DU OD XWLOL]DFLyQ GH ORV QXWULHQWHV GLVSRQLEOHV (VWD SODVWLFLGDG UHSUHVHQWD XQD YHQWDMD VLJQLFDWLYD \D TXH HO SURJUDPD GH H[SUHVLyQ GH JHQHV TXH JRELHUQD HO GHVDUUROOR SXHGH YDULDU GH DFXHUGR D ODV FRQGLFLRQHV externas. /DV SODQWDV SHUFLEHQ ODV VHxDOHV GHO PHGLR ambiente y las transmiten a la maquinaria celuODU 'H HVWD IRUPD DFWLYDQ SURFHVRV XWLOL]DQGR PHFDQLVPRV FRPSOHMRV TXH OHV SHUPLWHQ DFOLPDWDUVH /D UHVSXHVWD FRQVLVWH HQ JHQHUDO HQ FDPELRV HQ HO WLSR FDQWLGDG R DFWLYLGDG GH GHWHUPLQDGDV SURWHtQDV GH OD SODQWD JHQHUDQGR FRPSRQHQWHV ~WLOHV SDUD ODV QXHYDV FRQGLFLRQHV \ HOLPLQDQGR ORV VXSHUXRV (VWR LPSOLFD OD DFWLYDFLyQ R LQDFWLYDFLyQ GH ORV JHQHV D SDUWLU GH ORV FXDOHV HVWDV SURWHtQDV VRQ VLQWHWL]DGDV /RV SURFHVRV GH DFWLYDFLyQ H LQDFWLYDFLyQ VXHOHQ HVWDU JREHUQDGRV SRU XQ ODGR SRU IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ \ SRU RWUR SRU OD SUHVHQFLD GH HOHPHQWRV SUHVHQWHV HQ ODV UHJLRQHV SURPRWRras de los genes regulados. Adems de este niYHO GH UHJXODFLyQ GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD WUDQVFULSFLRQDO H[LVWHQ RWURV SXQWRV GH UHJXODFLyQ TXH LQFOX\HQ ODV YtDV GH SURFHVDPLHQWR GH ORV $51 PHQVDMHURV HO WUDQVSRUWH GH ORV PLVPRV XQD YH] PDGXURV VX WUDGXFLELOLGDG \ SRU ~OWLPR HO SURFHVDPLHQWR \ WUDQVSRUWH GH ODV SURWHtnas sintetizadas. Recientemente se han desFULSWR PHFDQLVPRV GH VLOHQFLDPLHQWR GH JHQHV PHGLDGRV SRU PLFUR$51V FRPR XQ SXQWR LPSRUWDQWH GH UHJXODFLyQ GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD SDUD XQD UHYLVLyQ YHU 6XQNDU \ FRO Obtencin de plantas transgnicas con tolerancia mejorada a distintos tipos de estrs de origen abitico Como se ha comentando, los mecanismos GH DGDSWDFLyQ D FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV DGYHUVDV VRQ FRQWURODGRV SRU UHGHV PROHFXODUHV LQYROXFUDGDV HQ OD SHUFHSFLyQ GHO HVWUpV OD transduccin de las seales, y la regulacin de OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HIHFWRUHV (VWDV FDVFDGDV DFWLYDQ PHFDQLVPRV SURWHFWRUHV SDUD UHV-
WDEOHFHU OD KRPHRVWDVLV \ SURWHJHU \ UHSDUDU biomolculas y membranas daadas (Figura (Q FRQVHFXHQFLD OD PDQLSXODFLyQ GH JHQHV que ayuden a mantener las funciones de cluODV \ FRPSRQHQWHV SRGUtD HQ SULQFLSLR LQFUHPHQWDU OD WROHUDQFLD D HVWUpV /D PD\RU SDUWH GH ODV HVWUDWHJLDV HPSOHDGDV SDUD PHMRUDU HO UHQGLPLHQWR GH SODQWDV EDMR FRQGLFLRQHV DGYHUVDV se han basado en el fortalecimiento de estos sistemas endgenos (Figura 1). En los ltimos
aos se realizaron numerosos estudios detallados sobre el desarrollo de tolerancia a estrs abitico, muchos de ellos basados en la deterPLQDFLyQ GH SHUOHV GH WUDQVFULSWRV \ DPSOLWXG JHQyPLFD TXH SURSRUFLRQDURQ HO FRQRFLPLHQWR LQGLVSHQVDEOH SDUD HO GHVDUUROOR UDFLRQDO GH WRlerancia a estrs. Diferentes fuentes de estrs (sequa, helaGDV VDOLQLGDG GLVSDUDQ XQD UHVSXHVWD HQ FLHUWR PRGR ~QLFD TXH SRVHH D OD YH] HOHPHQWRV
FRPXQHV H LGLRVLQFUiVLFRV UHVSHFWR D RWUDV UHVSXHVWDV \ D YtDV PHWDEyOLFDV \ PRUIRJHQpWLFDV GHO RUJDQLVPR ([LVWH XQD VLJQLFDWLYD VXSHUSRVLFLyQ \ HQWUHFUX]DPLHQWR GHO LQJOpV crosstalk HQWUH WDOHV UHGHV GH GHFLVLRQHV TXH SXHGH resultar sinrgica o antagnica. Aunque esta REVHUYDFLyQ DEUH SRVLELOLGDGHV GH REWHQHU WRlerancia cruzada a diferentes fuentes de estrs mediante una nica intervencin transgnica, tambin limita el nmero de intervenciones tiOHV \ D PHQXGR UHTXLHUH XQD UHJXODFLyQ VRVWLFDGD GHO WUDQVJpQ SDUD SUHYHQLU LPSDFWRV LQGHseables en el crecimiento y desarrollo vegetal. Las estrategias de ingeniera gentica emSOHDGDV SDUD LQFUHPHQWDU OD VXSHUYLYHQFLD EDMR condiciones de estrs han intentado fortalecer OD H[SUHVLyQ GH FXDWUR JUDQGHV JUXSRV GH JHnes: i) genes involucrados en la transmisin de seales; ii UHJXODGRUHV WUDQVFULSFLRQDOHV iii) JHQHV TXH FRGLFDQ SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ OD WROHUDQFLD FRPR SURWHtQDV GHO shock trmico (HSP) y enzimas antioxidantes; y iv) genes que FRGLFDQ HQ]LPDV LQYROXFUDGDV HQ OD VtQWHVLV GH PHWDEROLWRV SURWHFWRUHV 'LVFXWLUHPRV EUHvemente cada una de las estrategias. En las Tablas 1 a 3 se describen algunos casos. Genes involucrados en la cascada de VHxDOHV 9DULRV JHQHV LQGXFLEOHV SRU HVWUpV FX\RV SURGXFWRV LQWHUYLHQHQ HQ OD WUDQVPLVLyQ GH VHxDOHV GH OD UHVSXHVWD KDQ VLGR LGHQWLFDGRV \ caracterizados exhaustivamente, incluyendo IRVIROLSDVDV \ TXLQDVDV GH SURWHtQDV SHUWHQHcientes a las familias MAP (del ingls mitogenactivated protein), y SOS (del ingls salt-overlysensitive 3XHVWR TXH RSHUDQ HQ XQ QLYHO DOWR GH OD FDVFDGD GH GHFLVLRQHV GH OD UHVSXHVWD FRQVWLWX\HQ SRU GHQLFLyQ H[FHOHQWHV SXQWRV GH LQWHUYHQFLyQ SDUD REWHQHU WROHUDQFLD JHQHUDOL]DGD 9DULRV GH HVWRV JHQHV KDQ VLGR LQWURGXFLGRV HQ SODQWDV UHVXOWDQGR HQ OtQHDV FRQ IHQRWLSRV WROHUDQWHV D GLYHUVDV IXHQWHV GH HVWUpV $ WtWXOR GH HMHPSOR OD H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD de la MAP quinasa quinasa quinasa 1 de tabaco en maz, activa una cascada de seales R[LGDWLYDV TXH FRQHUH WROHUDQFLD DXPHQWDGD a heladas, calor y salinidad en las transformanWHV SURWHJLHQGR OD IRWRVtQWHVLV \ RWURV PHWDERlismos bajo condiciones adversas.
Sin embargo, esta estrategia no est exenta GH SUREOHPDV \D TXH OD H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GH HVWH WLSR GH JHQHV VXHOH DIHFWDU UXWDV QR vinculadas al estrs y, muy a menudo, se asocia con retardos de crecimiento y alteraciones en el metabolismo basal. Tales inconvenientes SRGUtDQ HYLWDUVH PHGLDQWH HO XVR GH SURPRWRUHV LQGXFLEOHV SRU HVWUpV HQ OXJDU GH FRQVWLWXWLYRV OD VLWXDFLyQ UHHMD OD GLFXOWDG GH PDQLSXlar reguladores clave sin contar con reglas geQHUDOHV SDUD LGHQWLFDU SXQWRV GH LQWHUYHQFLyQ adecuados. Los factores de transcripcin /RV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ )7V MXHJDQ XQ URO FHQWUDO HQ OD HODERUDFLyQ GH OD UHVSXHVWD DPELHQWDO \ HO SURJUDPD PRUIRJHQpWLFR GH OD SODQWD 6H WUDWD GH SURWHtQDV TXH DFW~DQ HQ trans FDSDFHV GH UHFRQRFHU EODQFRV GH VHFXHQFLDV HVSHFtFDV GH $'1 HOHPHQWRV cis) ORFDOL]DGDV HQ ODV UHJLRQHV SURPRWRUDV GH GHWHUPLQDGRV JHQHV /D UHJXODFLyQ GH OD H[SUHsin gnica est gobernada en gran medida SRU OD LQWHUDFFLyQ GH ORV )7V FRQ HVWD FODVH GH elementos cis LQGXFLHQGR R UHSULPLHQGR GLVWLQtas vas de transduccin de seales a travs de un efecto domin. (Q SODQWDV VH KDQ LGHQWLFDGR \ FDUDFWHUL]DGR QXPHURVRV JHQHV TXH FRGLFDQ )7V 'H hecho, en Arabidopsis thaliana y Oryza sativa, FX\RV JHQRPDV IXHURQ FRPSOHWDPHQWH VHFXHQFLDGRV VH LGHQWLFDURQ XQRV JHQHV TXH FRGLFDUtDQ )7V (VWD LGHQWLFDFLyQ VH UHDOL]y HQ EDVH D OD SUHVHQFLD GH GRPLQLRV R PRtivos conservados, y caracterizados funcionalmente en FTs de otros reinos. Sin embargo, en SODQWDV QR PiV GH XQ GH HVWDV VHFXHQcias han sido aisladas y estudiadas fehacientemente, asignndoles la funcin de FT a las SURWHtQDV FRGLFDGDV $GHPiV VH GHEH WHQHU HQ FXHQWD TXH OD VLPLOLWXG HQWUH SURWHtQDV GH RUJDQLVPRV TXH SHUWHQHFHQ D GLVWLQWRV UHLQRV QR QHFHVDULDPHQWH LPSOLFD TXH VH HQFXHQWUHQ involucradas en la regulacin de los mismos eventos. /RV )7V YHJHWDOHV VH FODVLFDQ HQ IDPLOLDV \ subfamilias de acuerdo al grado de conservacin de la secuencia de aminocidos, al tamaxR \ D OD FRPSRVLFLyQ HVWUXFWXUDO GH ORV JHQHV FRGLFDQWHV
Algunos FTs fueron caracterizados funcionalmente y, en casi todos los casos, se observ que intervienen en varias vas se sealizacin. $Vt SRU HMHPSOR ODV SURWHtQDV GH ODV IDPLOLDV 0<% 0<& E=LS \ +'=LS SDUWLFLSDQ HQ ODV UHVSXHVWDV D GLVWLQWRV WLSRV GH HVWUpV DELyWLFR PLHQWUDV TXH ODV SURWHtQDV GH OD IDPLOLD :5.< VH UHODFLRQDQ WDQWR FRQ OD UHVSXHVWD DO DWDTXH SRU RUJDQLVPRV SDWyJHQRV FRPR D OD UHVSXHVta frente a estrs abitico. En las estrategias donde los FTs vegetales KDQ VLGR VREUHH[SUHVDGRV H[SUHVDGRV GH PDQHUD HFWySLFD R VLOHQFLDGRV VH REVHUYy TXH ODV SODQWDV WUDQVIRUPDQWHV SUHVHQWDEDQ UHVSXHVWDV DOWHUDGDV D ODV FRQGLFLRQHV PHGLRDPELHQWDOHV WDQWR SRU OD DFFLyQ GH IDFWRUHV ELyWLcos como abiticos (ver Tabla 2). En algunos FDVRV OD GXSOLFDFLyQ R WULSOLFDFLyQ GH JHQHV TXH
FRGLFDEDQ SURWHtQDV GH WLSR :5.< SURYRFy OD IDOWD GH UHVSXHVWD HQ PXWDQWHV VLOHQFLDGDV (Q RWURV VH REWXYLHURQ SODQWDV FRQ UHVSXHVWDV PHMRUDGDV D GLVWLQWRV WLSRV GH HVWUpV DO PLVPR WLHPSR FRUURERUDQGR OD KLSyWHVLV GH TXH ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ DFW~DQ VLPXOWiQHDmente en diferentes vas de sealizacin. 'HQWUR GH ORV )7V HVSHFtFDPHQWH YLQFXODGRV D UHVSXHVWDV DPELHQWDOHV H[LVWH XQ JUXSR de genes bien caracterizados cuya accin se ubica en el inicio de la cascada de sealizacin HQ UHVSXHVWD D HVWUpV DELyWLFR (VWH JUXSR VH HQFXHQWUD UHSUHVHQWDGR SRU Rd29A de A. thaliana (Q ORV SURPRWRUHV GH ORV JHQHV GH HVWH JUXSR VH LGHQWLFDURQ ODV VHFXHQFLDV GHQRPLnadas ABRE (del ingls ABA-responsive element, HOHPHQWR GH UHVSXHVWD D $%$ \ '5( CRT (dehydration-responsive element/C-re-
Tabla 2. 2EWHQFLyQ GH SODQWDV WROHUDQWHV D GpFLW KtGULFR XWLOL]DQGR IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ GH RULJHQ YHJHWDO $GDSWDGD GH 8PH]DZD \ FRO
Clasificacin Nombre del gen Planta transformada Planta de la cual proviene el gen Sistema de expresin Experimentos realizados Parmetros medidos Ao
Familia AP2/ERF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF AP2/ERF DREB1/CBF DREB1/CBF DREB1/CBF AP2/ERF DREB2
DREB1A/CBF3 DREB1A/CBF3 DREB1B/CBF1 CBF4 ZmDREB1A DREB1C/CBF2 SHN1/WIN1 DREB1A/CBF3 DREB1A/CBF3 DREB1A/CBF3 WXP1 DREB2A (forma active con delecin interna)
Arabidopsis Arabidopsis Tomat e Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Trigo Tabaco Arroz Alfalfa Arabidopsis
Arabidopsis Ara bidopsis Arabidopsis Arabidopsis Maz Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis M. truncatula Arabidopsis
CaMV35SP Arabidopsis RD29AP CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP Knock out CaMV35SP Arabidopsis RD29AP Arabidopsis RD29AP MazUbi -1P CaMV35SP CaMV35SP, Arabidopsis RD29AP
Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Disecacin Disecacin Retencin de agua Retencin de agua Retenci n de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua
Supervivencia Supervivencia Crecimiento y desarrollo Supervivencia Electrolitos Supervivencia Desarrollo Supervivencia Superviven cia y fototsntesis Supervivencia Supervivencia Supervivencia
1998 1999 2002 2002 2004 2004 2004 2004 2004 2005 2005 2005
Protenas con dominio bsico asociado a cierre de leucinas (bZIP) bZIP bZIP bZIP bZIP
bZIP)
ABF3, AREB2/ABF4 AREB1/ABF2 ABF3 AREB1/ABF2 (forma active con una delecin interna) AREB1/ABF2 (forma active fosforilada)
Arabidopsis Arabidopsis Arroz Arabidopsis
Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis
CaMV35SP CaMV35SP Maz Ubi -1P CaMV35SP
Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua, deshidratacin deshidratacin
Crecimiento y supervivencia Supervivencia Fotosntesis y supervivencia Supervivencia
2002 2004 2005 2005
Arabidopsis
Arabidopsis
CaMV35SP
2005 Supervivencia
MYB/MYC MYB, MYC MYB R2R3 -MYB Protenas con dedos de zinc Cys2His2-type Cys2His2-type Cys2His2-type HD- Zip (homeodominio asociado a cierre de leucinas) Otros NAC
AtMYC2, AtMYB2 CpMYB10 AtMYB60
Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis
Arabidopsis C. plantagineum Arabidopsis
CaMV35SP CaMV35SP ARN de interferencia
Tratamiento con manitol Retencin de agua Retencin de agua
Electrolyte leakage Supervivencia, crecimiento y retencin de agua
2002 2004 2005
ZPT2-3 CAZFP1 STZ HAHB4
Petunia Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis y maz
Petunia Pimie nto Arabidopsis girasol
CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP y promotor HAHB4
Deshidratac in Retencin de agua Retencin de agua Deshidratacin, ataque con insectos, retencin de agua
Supervivencia Supervivencia, contenido de clorofila Supervivencia, conductancia Supervivencia, rea foliar, turgencia, desarrollo
2003 2004 2004
ANAC019/055/ 072
Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retencin de agua Supervivencia
2004
peat, HOHPHQWR GH UHVSXHVWD D GHVKLGUDWDFLyQ Los FTs de la familia EREBE/AP2 unen las seFXHQFLDV GH WLSR '5(&57 \ ORV GH OD IDPLOLD E=,3 ORV HOHPHQWRV $%5( /D H[SUHVLyQ GH los genes de la familia EREBE/AP2 se induce D EDMDV WHPSHUDWXUDV PLHQWUDV TXH ORV GH WLSR DREB OR KDFHQ SRU HVWUpV RVPyWLFR /RV )7V GH WLSR E=LS $5(% \ $5(% VRQ UHJXODGRV SRVLWLYDPHQWH SRU iFLGR DEVFtFLFR $%$ /D VREUHH[SUHVLyQ GH HVWH WLSR GH JHQHV SURGXMR SODQWDV FRQ WROHUDQFLD DXPHQWDGD D IDFWRres abiticos. En los casos de de DREB1 y 2 en A. thaliana ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV UHVXOWDURQ WROHUDQWHV D GpFLW KtGULFR 3RU RWUD SDUWH OD H[SUHVLyQ KHWHUyORJD GH DREB1B/CBF1 de A. thaliana en tomate, adems de conferir una elevada tolerancia a sequa, tambin lo hizo frente D HVWUpV R[LGDWLYR \ DO JHQHUDGR SRU IUtR $SDrentemente el mecanismo de tolerancia ocurre YtD HO FLHUUH HVWRPiWLFR UiSLGR HO LQFUHPHQWR HQ OD FRQFHQWUDFLyQ GH SUROLQD \ HO DXPHQWR GH OD DFWLYLGDG FDWDODVD TXH SURYRFD OD UHGXFFLyQ en la acumulacin de H2O2. Es interesante destacar que la transformacin cruzada con genes homlogos de arroz dio como resultado el misPR HIHFWR SURWHFWRU 8Q )7 TXH DFW~D SRU XQ PHFDQLVPR GLIHUHQWH HV :;3 SHUWHQHFLHQWH D OD IDPLOLD $3 GH Medicago truncatula &XDQGR VH H[SUHVy GH PDQHUD HFWySLFD HQ DOIDOID ODV SODQWDV WUDQVIRUPDGDV SUHVHQWDURQ WROHUDQFLD D GpFLW KtGULFR YtD OD VREUHSURGXFFLyQ GH FHUD HQ ODV KRMDV \ HYLWDQGR GH HVWD IRUPD OD HYDSRUDFLyQ SRU WUDQVSLUDFLyQ 2WUR HMHPSOR GH JHQHV TXH LQWHUYLHQHQ HQ distintas vas es el del FT HAHB4 de girasol. /D H[SUHVLyQ GH HVWH JHQ HV UHJXODGD SRVLWLYDPHQWH SRU HVWUpV KtGULFR VDOLQR \ OD SUHVHQFLD de las hormonas ABA, etileno y cido jasmQLFR /D H[SUHVLyQ HFWySLFD GH HVWH JHQ EDMR HO FRQWURO GH XQ SURPRWRU FRQVWLWXWLYR IXHUWH HQ SODQWDV GH Arabidopsis, gener lneas notoriamente ms tolerantes a condiciones de sequa \R VDOLQLGDG 6LQ HPEDUJR \ WDO FRPR VH UHULy HQ HMHPSORV DQWHULRUHV OD H[SUHVLyQ FRQVWLWXWLYD GHO JHQ SURYRFy FDPELRV PRUIROyJLFRV \ retraso en el desarrollo, eventos indeseables GHVGH HO SXQWR GH YLVWD DJURQyPLFR /D FRPSOHMLGDG GH OD DFFLyQ GH ORV )7V VH YH UHHMDGD WDPELpQ HQ HO KHFKR GH TXH OD H[SUHVLyQ HF-
WySLFD GH HAHB4 HQ SODQWDV GH Arabidopsis y PDt] FRQHUH WROHUDQFLD DO DWDTXH GH LQVHFWRV e incluso al dao mecnico; aunque tambin UHVXOWD HQ KLSHUVHQVLELOLGDG DO DWDTXH GH EDFWHULDV SDWyJHQDV DO PHQRV HQ Arabidopsis. 1XHYDPHQWH OD XWLOL]DFLyQ GH SURPRWRUHV LQGXFLEOHV HQ UHHPSOD]R GH ORV FRQVWLWXWLYRV SUHsenta una alternativa viable. Cuando se modiFDQ ORV IDFWRUHV DGHFXDGRV OD PRUIRORJtD \ HO SURFHVR GH GHVDUUROOR VH WRUQDQ LQGLVWLQJXLEOHV GH ODV SODQWDV FRQWUROHV VLQ WUDQVIRUPDU DOFDQzando buenos niveles de tolerancia. 3URWHtQDV TXH FRQHUHQ WROHUDQFLD D estrs Muchas situaciones adversas como la seTXtD HO FDORU H[WUHPR \ OD VDOLQLGDG SXHGHQ causar desnaturalizacin e inactivacin de ELRPROpFXODV /DV +63 ODV SURWHtQDV /($ OODPDGDV DVt SRU VX DEXQGDQFLD HQ OD HPEULRJpnesis tarda, del ingls late-embryogenesisabundant \ ODV FKDSHURQDV PROHFXODUHV VRQ FDSDFHV GH VXPLQLVWUDU SURWHFFLyQ FRQWUD HVWRV HIHFWRV IDYRUHFLHQGR HO DGHFXDGR SOHJDPLHQWR \ HQVDPEODGR GH HQ]LPDV \ RWUDV SURWHtQDV Los resultados de algunos ensayos sealan XQD FRUUHODFLyQ SRVLWLYD HQWUH ORV QLYHOHV GH YDULDV FKDSHURQDV \ OD WROHUDQFLD D HVWUpV 6H REVHUYy WDPELpQ TXH OD H[SUHVLyQ GH HVWRV JHQHV HV LQGXFLGD GXUDQWH HSLVRGLRV GH DGYHUVLGDG ambiental, y varios de ellos han sido utilizados SDUD GLVHxDU \ JHQHUDU SODQWDV WUDQVJpQLFDV WROHUDQWHV YHU 7DEOD 3RU HMHPSOR OD LQWURduccin de HSP101 de Arabidopsis en arroz condujo a un aumento de la termotolerancia, PLHQWUDV TXH OD VREUHH[SUHVLyQ GH SURWHtQDV LEA result en mayor resistencia a la sequa. 3RU RWUR ODGR OD SURGXFFLyQ DXPHQWDGD EROS tambin resulta frecuente frente a muchas situaciones de estrs. Las EROS cumSOHQ XQ GREOH URO SDUWLFLSDQ HQ OD WUDQVGXFFLyQ GH VHxDOHV SHUR DO PLVPR WLHPSR FRQWULEX\HQ DO GDxR SRU R[LGDFLyQ GH PHPEUDQDV \ ELRPROpFXODV HO FXDO HV UHVSRQVDEOH GH JUDQ SDUWH GHO GHWHULRUR TXH VXIUH OD SODQWD 3RU OR WDQWR OD PDQLSXODFLyQ GH HQ]LPDV DQWLR[LGDQWHV FRPR SHUR[LGDVDV \ GLVPXWDVDV RIUHFH RWUD RSRUWXQLGDG SDUD SUHYHQLU ORV GDxRV R[LGDWLYRV RFDVLRQDGRV SRU HO GHVDItR DPELHQWDO 3RU GHVJUDFLD OD DSOLFDFLyQ GH HVWD HVWUDWHJLD HVWi OHMRV GH
Tabla 1. 2EWHQFLyQ GH SODQWDV WROHUDQWHV D GpFLW KtGULFR XVDQGR FRPR KHUUDPLHQWDV JHQHV TXH FRGLFDQ SURWHtQDV SURWHFWRUDV DGDSWDGD GH 8PH]DZD \ FRO
Clasificacin Nombre del gen Planta transformada Organismo del cual se obtuvo el gen Sistema de expresin Experimentos realizados Parmetros medidos Ao
Metabolismo de osmoprotectores Fructan o s Trehalos a myo -Inositol Prolina Trehalos a Fructan o s Glicina -betana
SacB TPS1 IMT1 P5CS OtsA, OtsB SacB COX
Tabaco Tabaco Tabaco Arroz Tabaco Remolacha Arabidopsis/ Tabaco Arabidopsis Rice Arroz Trigo Arroz Arabidopsis Petunia Tomat e Arabidopsis
B. subtilis b S. cerevisiae b Iceplant Mothbean E. coli b B. subtilis b A. pascens b
canola/
CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP AIPC-ABAinducible CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP
510% PEG (tierra ) Disecacin Retencin de agua Retencin de agua Regado limitado Regado limitado Regado limitado
Desarrollo Supervivencia Fotosntesis Crecimiento del tallo Peso seco de hojas (productividad) Producci n de biomasa Crecimiento del tallo Supervivencia Fotosnte sis, crecimiento del tallo Fotosnte sis, crecimiento del tallo Crecimiento del tallo, biomasa Crecimiento del tallo Crecimiento del tallo Supervivencia Crecimiento del tallo Fotosntesis y crecimiento del tallo Desarrollo
1995 1996 1997 1998 1998 1999 2000
Galactinol Trehalosa Trehalosa Manitol Poliaminas Poliaminas Prolina Trehalosa Glicina -betana Protenas de proteccin LEA (del ingls late embryogenesis abundant ) LEA Chaperone Heat shock protein LEA LEA Protenas capt adoras de especies reactivas de oxgeno (EROS) Detoxific aci n Lpido per xido NAD+ ruptura Others desconocido transporte de iones biosntesis de ABA estomas catabolismo de ABA
AtGolS2 TPSP (OtsA+OtsB) TPSP (OtsA+OtsB) mtlD ADC SPDS P5CS TPS1 GSMT+DMT
Arabidopsis E. coli b E. coli b E. coli b D. stramonium b C. ficifolia Arabidopsis , arroz S. cerevisiae b A. halophytica b
CaMV35SP ABA-inducible/ rbcS P Ubi -1P de maz Maz Ubi -1P Maz Ubi -1P CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP
Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Regado limitado 20% PEG (soil) Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Regado lim itado Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua
2002 2002 2003 2003 2004 2004 2005 2005 2005
HVA1 HVA1 BiP AyHsp17.6A HVA1 LEA
Arroz Cebada Trigo Tabaco Arabidopsis Arroz Col china Canola Cebada Soja Arabidopsis Ceba da
Arroz Act -1P Maz Ubi -1P CaMV35SP CaMV35SP Arroz Act -1P CaMV35SP
1996 2000 2001 2001
Desarrollo y biomasa Crecimiento del tallo y fotos ntesis Supervivencia , Crecimiento y potencial de agua Crecimient o del tallo y retencin de agua
Retencin de agua ensayos a campo
2004 2005
MnSOD MsALR PARP
Alfalfa Tabaco Canola N. plumbaginifolia Alfalfa
CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP(RNAi) Agrobacterium pg5 CaMV35SP CaMV35SP Agrobacterium MAS Knockout
Retencin de agua Retencin de agua Callo s 1996 Fotosntesi s, conductancia , productividad 2000 2005 1997 2001 2001 2002 2005 ,
CDT1 AVP1 AtNCED3 Chl-NADP-ME CYP707A3
C. plantagenium Arabidopsis Arabidopsis Tabaco Arabidopsis C. plantagenium Arabidopsis Arabidopsis Maz Arabidopsis
Retencin de agua Retencin de agua Cultivo en hidropona y tierra
Fotosintesis Desarrollo Supervivencia de los callos Desarrollo Crecimiento del tallo Conductancia estomtica desarrollo Supervivencia y transpiracin
Retencin de agua
ser sencilla, ya que diferentes miembros de la UHG DQWLR[LGDQWH HQ SODQWDV UHVSRQGHQ GH PDnera diferente a distintos tratamientos hostiles. Se han obtenido en consecuencia niveles vaULDEOHV GH WROHUDQFLD PHGLDQWH OD H[SUHVLyQ GH HQ]LPDV DQWLR[LGDQWHV 3RU HMHPSOR OD VREUHH[SUHVLyQ GH VXSHUy[LGR GLVPXWDVDV IXH FDSD] GH LQFUHPHQWDU OD VXSHUYLYHQFLD \ WROHUDQFLD D HVWUpV HQ DUYHMD \ WDEDFR SHUR QR HQ DOIDOID Sntesis de metabolitos protectores 6H KD LGHQWLFDGR XQD DPSOLD JDPD GH PHWDEROLWRV FDSDFHV GH PLWLJDU ORV HIHFWRV GHletreos del estrs osmtico y del estrs oxiGDWLYR TXH DFRPSDxDQ D PXFKDV VLWXDFLRQHV
ambientales hostiles (Figura 1). Se trata de DPLQR iFLGRV FRPR SUROLQD DPLQDV JOLFLQD EHWDtQD SROLDPLQDV D]~FDUHV \ D]~FDUHV DOcoholes (trehalosa, manitol), y antioxidantes (glutatin, ascorbato, tocoferoles). Otros soluWRV FRPSDWLEOHV VRQ ORV IUXFWDQRV SROtPHURV de fructosa, cuyo incremento est relacionado DO SURFHVR GH DFOLPDWDFLyQ D ODV EDMDV WHPSHUDWXUDV HQ HVSHFLHV WROHUDQWHV GH JUDPtQHDV $Vt SRU HMHPSOR SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH DUUR] \ WDEDFR TXH SURGXFHQ IUXFWDQRV PRVWUDURQ XQ incremento en la tolerancia a las bajas temSHUDWXUDV 1R REVWDQWH OD PRGXODFLyQ GH XQD nica reaccin enzimtica, an cuando se trate GH OD HWDSD OLPLWDQWH HVWi JHQHUDOPHQWH UHJX-
ODGD SRU OD WHQGHQFLD GH OD FpOXOD D UHVWLWXLU OD KRPHRVWDVLV PHWDEyOLFD OLPLWDQGR HO SRWHQFLDO de este enfoque. /RV LQWHQWRV GH VREUHH[SUHVDU WUHKDORVD \ PDQLWRO HQ DUUR] \ PDt] UHVSHFWLYDPHQWH FRQdujeron a aumentos moderados en los niveles GH HVWRV FRPSXHVWRV FXDQGR VH PDQLSXOy XQD ~QLFD HQ]LPD /D PRGLFDFLyQ GH YDULDV HWDSDV GHQWUR GH XQD PLVPD YtD SXHGH D\XGDU DO FRQWURO GH ORV XMRV PHWDEyOLFRV GH XQD PDQHUD PiV SUHGHFLEOH 3RU HMHPSOR OD LQJHQLHUtD GH YDULDV UHDFFLRQHV HQ ODV FRUUHVSRQGLHQWHV UXWDV SHUPLWLy REWHQHU DOWRV QLYHOHV GH JOLFLQD EHWDtQD \ GH WUHKDORVD HQ SODQWDV /D GHWHUPLQDFLyQ GH SHUOHV PHWDEyOLFRV JOREDOHV HQ SODQWDV VH KD FRQYHUWLGR HQ XQD KHUUDPLHQWD LPSUHVFLQGLEOH SDUD FRPSUHQGHU FDPELRV LQGXFLGRV SRU HVWUpV HQ PHWDEROLWRV SURWHFWRUHV Estrategias sustitutivas Un elemento comn a muchas situaciones de HVWUpV TXH KD VXUJLGR GH ORV DQiOLVLV GH DPSOLtud genmica en Arabidopsis es la declinacin XQLYHUVDO GH OD SURWHtQD GH KLHUURD]XIUH IHUUHdoxina (Fd), resultado que adems se ha conUPDGR SRU HQVD\RV ELRTXtPLFRV )G MXHJD XQ rol central en la distribucin de electrones desGH OD FDGHQD GH WUDQVSRUWH HOHFWUyQLFR D QXPHURVDV YtDV FORURSOiVWLFDV LQFOX\HQGR OD MDFLyQ de CO2, la asimilacin de nitrgeno y azufre, el metabolismo de aminocidos y la desaturacin GH iFLGRV JUDVRV $GHPiV SDUWLFLSD HQ YDULRV SURFHVRV UHJXODWRULRV YtD WLRUUHGR[LQD GLVLSDWLYRV \ PRUIRJHQpWLFRV VtQWHVLV GH WRFURPRV \ de cido jasmnico). La regulacin negativa de OD H[SUHVLyQ PHGLDQWH XQ $51 DQWLVHQWLGR KD SHUPLWLGR REVHUYDU ORV HIHFWRV QHJDWLYRV GH OD FDtGD GH )G ODV SODQWDV SUHVHQWDURQ IHQRWLSRV clorticos y enanos, indicando que su disminuFLyQ SXHGH VHU H[WUHPDGDPHQWH GDxLQD SDUD un organismo sometido a estrs. Por lo tanto, )G FRQVWLWX\H XQ H[FHOHQWH FDQGLGDWR SDUD LQtervenciones transgnicas. 'HVDIRUWXQDGDPHQWH OD SRVLELOLGDG GH LQFUHmentar el contenido de Fd mediante ingeniera JHQpWLFD HVWi OLPLWDGD SRU OD IXHUWH UHJXODFLyQ SRVWUDQVFULSFLRQDO GH OD H[SUHVLyQ TXH GHSHQde de secuencias ubicadas dentro de la regin FRGRJpQLFD OR TXH KDFH YLUWXDOPHQWH LPSRVLble la mutagnesis. Una alternativa atractiva
SURYLHQH GH HVWXGLRV UHDOL]DGRV HQ PLFURRUJDnismos fotosintticos, cianobacterias y algas. (VWRV RUJDQLVPRV DO LJXDO TXH ODV SODQWDV HVWiQ VRPHWLGRV D HVWUpV DPELHQWDO HVSHFLDOmente en los ocanos donde las condiciones suelen ser extremas, y sufren disminuciones GHO PLVPR WLSR HQ ORV QLYHOHV GH )G En tales condiciones, algas y cianobacterias UHVSRQGHQ DO GHVDItR DPELHQWDO PHGLDQWH HVWUDWHJLDV VXVWLWXWLYDV 6H WUDWD GHO UHHPSOD]R GH ODV SURWHtQDV OiELOHV DO HVWUpV SRU RWUDV UHVLVWHQWHV PHGLDQWH OD LQGXFFLyQ GH OD H[SUHVLyQ GH ORV JHQHV TXH ODV FRGLFDQ (O UHHPSOD]R PiV FRQVSLFXR HV SUHFLVDPHQWH HO GH )G SRU DYRGR[LQD )OG XQD DYRSURWHtQD VROXEOH TXH FRQWLHQH PRQRQXFOHyWLGR GH DYLQD \ FX\DV SURSLHGDGHV FRPR WUDQVSRUWDGRUD GH HOHFWURQHV VRQ SUiFWLFDPHQWH LGpQWLFDV D ODV de Fd. Sin embargo, a diferencia de Fd que se HQFXHQWUD DPSOLDPHQWH GLVWULEXLGD HQ SODQWDV DQLPDOHV \ EDFWHULDV )OG KD GHVDSDUHFLGR GHO JHQRPD GH ORV HXFDULRWHV VXSHULRUHV LQFOX\HQGR SODQWDV \ VXV FRQVLGHUDEOHV YHQWDMDV DGDSWDWLYDV VH SHUGLHURQ LUUHYHUVLEOHPHQWH PXFKR DQWHV GH OD FRORQL]DFLyQ GH OD WLHUUD UPH (V LQWHUHVDQWH KDFHU QRWDU TXH D SHVDU GH ORV HRQHV GH GLYHUJHQFLD HYROXWLYD HQWUH SODQWDV \ FLDQREDFWHULDV OD SURWHtQD )OG DLVODGD GH HVWDV ~OWLPDV HV FDSD] GH LQWHUDFWXDU SURGXFWLvamente con las enzimas homlogas, sugirienGR TXH SRGUtDQ DFWXDU FRUULJLHQGR ODV FRQVHcuencias negativas de la disminucin de Fd en SODQWDV HVWUHVDGDV Efectivamente, lneas transgnicas de tabaco que acumulan una Fld de cianobacteriana HQ FORURSODVWRV GHVDUUROODURQ WROHUDQFLD DXmentada a diversas fuentes de estrs abitico (incluyendo sequa, radiaciones, heladas, altas WHPSHUDWXUDV \ DOWD OX] DVt FRPR WDPELpQ D los efectos txicos del herbicida de contacto SDUDTXDW \ D QLWURGHULYDGRV /D WROHUDQFLD GHVDUUROODGD IXH GHSHQGLHQWH GH OD GRVLV \ GH OD FDSDFLGDG GH OD )OG WUDQVJpQLFD GH LQWHUDFWXDU FRQ ORV VLVWHPDV HQGyJHQRV GH WUDQVSRUWH HOHFWUyQLFR UHHPSOD]DQGR D )G D PHGLGD TXH esta declina como consecuencia del estrs. 5HVXOWDGRV SUHOLPLQDUHV LQGLFDQ TXH ORV PLVPRV QLYHOHV GH WROHUDQFLD SXHGHQ REWHQHUVH en cultivos de inters agronmico como maz, FHEDGD FRO]D WRPDWH \ SDSD 7DEOD
7DEOD 2EWHQFLyQ GH SODQWDV WROHUDQWHV D GpFLW KtGULFR XVDQGR FRPR KHUUDPLHQWDV JHQHV LQYROXFUDGRV HQ ODV YtDV GH VHxDOL]DFLyQ DGDSWDGD GH 8PH]DZD \ FRO
Clasificacin Nombre del gen Planta transformada Planta de la cual fue aislado el gen Sistema de expresin Experimentos realizados Parmetros medidos Ao
Proteinasquinasas CDPK GSK3/Shaggy MAPKKK SnRK2 Otros Medidor de calcio 14-3-3 Proteina CC-NBS-LRR Farnesyltransferasa
OsCDPK7 AtGSK1 NPK1 SRK2C
Arroz Arabidopsis Maz Arabidopsis
Arroz Arabidopsis Tabaco Arabidopsis
CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP
Retencin de agua Retencin de agua Estrs hdrico Retencin de agua
Crecimiento del tallo, expresin gnica, marchitez, Supervivencia Nmero de hojas, tamao de fruto Supervivencia, expression gnica
2000 2001 2004 2004
CBL1 GF14l ADR1 ERA1
Arabidopsis Algodn Arabidopsis Arabidopsis, canola
Arabidopsis Algodn Arabidopsis Arabidopsis
Agrobacterium MAS CaMV35SP CaMV35SP CaMV35SP/ RD29AP (antisentido)
Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua Retencin de agua, ensayos a campot
Supervivencia, expression gnica Senescencia, contenido de clorofila, fotosntesis Supervivencia, expression gnica Supervivencia, prdida de agua, productividad de semilla, contenido de aceite
2003 2004 2004 2005
Del laboratorio al campo (Q OD REWHQFLyQ GH WROHUDQFLD D FDPSR HO SURQyVWLFR VH FRPSOLFD D~Q PiV GDGR TXH ODV SODQWDV HQ VX DPELHQWH QDWXUDO HVWiQ VRPHWLGDV a varias adversidades en forma simultnea, en lugar de una sola condicin (tal como se estudia HQ HO ODERUDWRULR (VWR SXHGH DJUDYDU HO GDxR TXH VXIUH SRU HO RUJDQLVPR \ DO PLVPR WLHPSR GHVHQFDGHQDU UXWDV SURWHFWRUDV GLIHUHQWHV H LQFOXVR RSXHVWDV 3RU HMHPSOR OD VHTXtD HV QRUPDOPHQWH DFRPSDxDGD SRU FLHUUH HVWRPiWLFR SDUD SUHYHQLU OD SpUGLGD GH DJXD PLHQWUDV TXH ODV DOWDV WHPSHUDWXUDV FRQGXFHQ D DSHUWXUDV GH ORV HVWRPDV SDUD EDMDU OD WHPSHUDWXUD IROLDU PHGLDQWH HYDSRUDFLyQ 6LQ HPEDUJR FDORU \ GHFLHQFLD GH DJXD QRUPDOPHQWH YDQ MXQWDV HQ HO FDPSR $OJXQRV LQYHVWLJDGRUHV KDQ VXJHrido que el desarrollo de tolerancia contra una FRPELQDFLyQ GH HVWUHVHV SRGUtD UHTXHULU XQD UHVSXHVWD ~QLFD TXH QR SXHGH SUHYHUVH SRU OD mera adicin de genes inducidos durante cada HSLVRGLR LQGLYLGXDO GH HVWUpV (O FRQRFLPLHQWR H[LVWHQWH VREUH HVWH WLSR GH WROHUDQFLD HV YLUWXDOPHQWH QXOR OR FXDO SRGUtD H[SOLFDU HQ SDUWH SRU TXp DOJXQDV SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ WROHrancia aumentada desarrolladas en el laboratorio, no muestran mejoras en el rendimiento FXDQGR VRQ HQVD\DGDV D FDPSR Perspectivas En consecuencia, uno de los mayores desaItRV HV HO GHVDUUROODU SODQWDV WUDQVJpQLFDV FRQ
WROHUDQFLD DXPHQWDGD D GLVWLQWRV WLSRV GH HVtrs, sobre todo a aquellos que se dan en forma simultnea en determinadas regiones. Lograr HVWR LPSOLFD FRQRFHU ODV FRPSOHMDV UHODFLRQHV entre distintas vas de transduccin de seales TXH SDUWLFLSDQ HQ FDGD XQD GH ODV UHVSXHVWDV Cul sera la estrategia entonces? Obtener XQ PDSD GH WRGRV ORV JHQHV HVHQFLDOHV SDUD el desarrollo de tolerancia a una combinacin GH HVWUHVHV DELyWLFRV SXHGH VHU DGHPiV GH FRVWRVR XQ WUDEDMR IDUDyQLFR 3RU RWUD SDUWH OD UHVLVWHQFLD D P~OWLSOHV HVWUHVHV SDUHFLHUD HVWDU OLJDGD JHQpWLFDPHQWH D OD SHQDOLGDG GH UHWDUdos en el desarrollo as como a disminuciones en los rendimientos. Sin embargo, desde el SXQWR GH YLVWD RSXHVWR XQD UHGXFFLyQ GHO UHQGLPLHQWR RFDVLRQDGD SRU OD HVWUDWHJLD XWLOL]DGD es mucho ms alentadora que el rendimiento FHUR FDXVDGR SRU OD FRPELQDFLyQ OHWDO GH YDULRV WLSRV GH HVWUpV 8QD HVWUDWHJLD SRVLEOH VHUtD OD GH DQDOL]DU OD H[SUHVLyQ JpQLFD HQ SODQWDV TXH DO VHU VRPHtidas a una combinacin de estreses severos, VREUHYLYDQ R ORV WROHUHQ PHMRU TXH VXV SDUHV (VWH WLSR GH UHVLVWHQFLD VXJLHUH OD SUHVHQFLD GH mutaciones detectables en los anlisis de exSUHVLyQ 7DPELpQ HV IXQGDPHQWDO OD H[SHULHQFLD GH PHMRUDGRUHV \ SURGXFWRUHV 6RQ HOORV TXLHQHV VDEHQ TXp WLSR GH HVWUpV R FRPELQDFLyQ de ellos, afecta ms a cada cultivo y en cada UHJLyQ /DV FRPELQDFLRQHV SXHGHQ VHU PX\ GL-
IHUHQWHV \ SRU FRQVLJXLHQWH ORV HVWXGLRV \ VROXciones buscadas. Lecturas Recomendadas

%DUWHOV ' DQG 6XQNDU 5 'URXJKW DQG VDOW WROHUDQFH LQ SODQWV &ULW 5HY 3ODQW 6FL &KLQQXVDP\ 9 =KX - DQG =KX -. &ROG VWUHVV UHJXODWLRQ RI JHQH H[SUHVVLRQ LQ SODQWV Trends Plant Sci -Dezar CA., Gago GM., Gonzlez DH. and Chan 5/ Hahb-4 D VXQRZHU KRPHRER[ OHXFLQH ]LSSHU JHQH FRQIHUV GURXJKW WROHUDQFH WR Arabidopsis thaliana SODQWV 7UDQVJHQLF 5HV 429-440. -Gutterson N. and Zhang JZ. 2004. Genomics DSSOLFDWLRQ WR ELRWHFK WUDLWV D UHYROXWLRQ LQ SURJUHVV" &XUU 2SLQ 3ODQW %LRO 0DKDMDQ 6 DQG 7XWHMD 1 &ROG VDOLQLW\ DQG drought stresses: An overview. Arch Biochem %LRSK\V -Manavella PA., Arce AL., Dezar CA., Bitton F., 5HQRX -3 &UHVSL 0 DQG &KDQ 5/ &URVV talk between ethylene and drought signaling SDWKZD\V LV PHGLDWHG E\ WKH VXQRZHU +DKE WUDQVFULSWLRQ IDFWRU 3ODQW -., 0LWWOHU 5 $ELRWLF VWUHVV WKH HOG HQYLURQPHQW and stress combination. Trends Plant Sci., 19. 0LWWOHU 5 9DQGHUDXZHUD 6 *ROOHU\ 0 DQG YDQ Breusegem F. 2004. Reactive oxygen gene QHWZRUN RI SODQWV 7UHQGV 3ODQW 6FL. 0XQQV 5 DQG 7HVWHU 0 0HFKDQLVPV RI VDOLQLW\ WROHUDQFH $QQX 5HY 3ODQW %LRO 5LHFKPDQQ -/ 7UDQVFULSWLRQDO UHJXODWLRQ D JHQRPLF RYHUYLHZ 7KH $UDELGRSVLV ERRN (G American Society of Plant Biologists. 5L]KVN\ / /LDQJ + 6KXPDQ - 6KXODHY 9 Davletova S. and Mittler R. 2004. When defense SDWKZD\V FROOLGH 7KH UHVSRQVH RI Arabidopsis to a combination of drought and heat stress. Plant 3K\VLRO 6KLQR]DNL . <DPDJXFKL6KLQR]DNL . DQG 6HNL 0 5HJXODWRU\ QHWZRUNV RI JHQH H[SUHVVLRQ LQ WKH GURXJKW DQG FROG VWUHVV UHVSRQVHV &XUU 2SLQ 3ODQW %LRO 6XQNDU 5 &KLQQXVDP\ 9 =KX - DQG =KX -. 6PDOO 51$V DV ELJ SOD\HUV LQ SODQW DELRWLF VWUHVV UHVSRQVHV DQG QXWULHQW GHSULYDWLRQ 7UHQGV Plant Sci, 12, 301-309. 7RJQHWWL 9% 3DODWQLN -) )LOODW 0) 0HO]HU 0 +DMLUH]DHL 05 9DOOH (0 DQG &DUULOOR 1 Functional replacement of ferredoxin by a F\DQREDFWHULDO DYRGR[LQ LQ WREDFFR FRQIHUV
broad-range stress tolerance. 3ODQW &HOO -Thomashow ME. 1999. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory PHFKDQLVPV $QQX 5HY 3ODQW %LRO 8PH]DZD 7 )XMLWD 0 )XMLWD < <DPDJXFKL 6KLQR]DNL . DQG 6KLQR]DNL . Engineering GURXJKW WROHUDQFH LQ SODQWV GLVFRYHULQJ DQG WDLORULQJ JHQHV WR XQORFN WKH IXWXUH &XUU 2S Biotechnol.,. 17, 113-122. 9LM 6 DQG 7\DJL $. (QJLQHHULQJ WUHQGV in the functional genomics of the abiotic stress UHVSRQVH LQ FURS SODQWV 3ODQW %LRWHFKQRO - 9LQRFXU % DQG $OWPDQ $ 5HFHQW DGYDQFHV LQ HQJLQHHULQJ SODQW WROHUDQFH WR DELRWLF VWUHVV DFKLHYHPHQWV DQG OLPLWDWLRQV &XUU 2SLQ Biotechnol.,. =KDQJ -= &UHHOPDQ 5$ DQG =KX -. )URP ODERUDWRU\ WR HOG 8VLQJ LQIRUPDWLRQ IURP Arabidopsis to engineer salt, cold and drought WROHUDQFH LQ FURSV 3ODQW 3K\VLRO -Zimmermann P., Hirsch-Hoffmann M., Hennig L. DQG *UXLVVHP : *(1(9(67,*$725 Arabidopsis microarray database and analysis WRROER[ 3ODQW 3K\VLRO
V. CAPTULO 13 Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas

Alicia Zelada, Mara Binaghi Metabolitos primarios y secundarios. /RV PHWDEROLWRV SUHVHQWHV HQ ODV SODQWDV SXHGHQ VHU GLYLGLGRV HQ GRV JUXSRV IXQGDPHQWDOHV ORV PHWDEROLWRV SULPDULRV \ ORV PHWDERlitos secundarios. Se denomina metabolismo SULPDULR GH ODV SODQWDV D ORV SURFHVRV TXtPLcos que intervienen en forma directa en la suSHUYLYHQFLD FUHFLPLHQWR \ UHSURGXFFLyQ GH ODV SODQWDV 3RU HMHPSOR VRQ SURFHVRV TXtPLFRV SHUWHQHFLHQWHV DO PHWDEROLVPR SULPDULR OD IRWRVtQWHVLV OD UHVSLUDFLyQ OD VtQWHVLV GH SURWHtnas, la diferenciacin de tejidos, y en general la IRUPDFLyQ GH FDUERKLGUDWRV OtSLGRV \ SURWHtQDV TXH LQWHUYLHQHQ HQ HVWRV SURFHVRV R VRQ SDUWH HVWUXFWXUDO GH ODV SODQWDV (Q FRQVHFXHQFLD los aminocidos destinados a la formacin de SURWHtQDV ORV FDUERKLGUDWRV \ ORV iFLGRV JUDVRV TXH LQWHUYLHQHQ HQ HVWRV SURFHVRV VRQ GHQRPLQDGRV PHWDEROLWRV SULPDULRV (Q FRQWUDSRVLFLyQ D HVWH FRQFHSWR SRGHPRV GHQLU ORV metabolitos secundarios como todos aquellos FRPSXHVWRV TXH QR VRQ HVHQFLDOHV per se SDUD ODV IXQFLRQHV YLWDOHV GH ODV SODQWDV SHUR TXH MXHJDQ XQ URO LPSRUWDQWH SDUD VX VXSHUYLYHQFLD HQ ORV HFRVLVWHPDV /D SULQFLSDO IXQFLyQ GH ORV metabolitos secundarios es actuar como meGLDGRUHV HQ ODV LQWHUDFFLRQHV HQWUH ODV SODQWDV y su medio ambiente. Muchos de estos comSXHVWRV FXPSOHQ IXQFLRQHV GH GHIHQVD FRQWUD SUHGDGRUHV \ SDWyJHQRV DFW~DQ FRPR DJHQWHV DOHORSiWLFRV FRPSXHVWRV TXH VRQ OLEHUDGRV SDUD HMHUFHU HIHFWRV VREUH RWUDV SODQWDV R VLUYHQ SDUD DWUDHU D ORV SROLQL]DGRUHV R D ORV GLVSHUVRUHV GH ODV VHPLOODV 6H FDUDFWHUL]DQ SRU VHU HVSHFLHHVSHFtFRV HV GHFLU TXH VX SURGXFFLyQ HVWi OLPLWDGD D XQD HVSHFLH R D XQ JUXSR GH HVSHFLHV GHQWUR GH XQ JUXSR ORJHQpWLFR \ VXHOHQ SURGXFLUVH HQ HVWUXFWXUDV HVSHFLDOL]DGDV \ GH IRUPD WHMLGR HVSHFtFD /RV PHWDEROLWRV SULPDULRV \ VHFXQGDULRV QR VH GLIHUHQFLDQ SRU VX HVWUXFWXUD TXtPLFD R VX RULJHQ ELRVLQWpWLFR VLQR VyOR SRU GLIHUHQFLDV
IXQFLRQDOHV 'H HVWD PDQHUD SRGHPRV HQFRQtrar metabolitos secundarios con estructuras TXtPLFDV VLPLODUHV D PHWDEROLWRV SULPDULRV SHUR TXH FXPSOHQ IXQFLRQHV PX\ GLIHUHQWHV 6HJ~Q VXV FDUDFWHUtVWLFDV ELRVLQWpWLFDV SRGHPRV FODVLFDU D ORV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV HQ WUHV JUXSRV SULQFLSDOHV )LJXUD WHUSHQRV FRPSXHVWRV OLStGLFRV GHULYDGRV GHO LVRSHQWHQLO GLIRVIDWR ,33 IHQLOSURSDQRLGHV FRPSXHVWRV IHQyOLFRV derivados de la va del shikimato o del malonato. DOFDORLGHV FRPSXHVWRV QLWURJHQDGRV GHrivados de aminocidos. /D LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD GH ORV PHWDEROLtos secundarios se ha acrecentado en los ltimos aos, y ello ha estimulado el inters en HO HVWXGLR GH VX PHWDEROLVPR \ HQ SDUWLFXODU HQ OD PRGLFDFLyQ GH FLHUWDV UXWDV ELRVLQWpWLcas mediante tcnicas de ingeniera gentica. 3RU RWUD SDUWH XQ PD\RU FRQRFLPLHQWR GH ODV SURSLHGDGHV ELROyJLFDV GH PXFKRV PHWDEROLWRV secundarios ha llevado a la revalorizacin de HVWRV FRPSXHVWRV FRPR IXHQWH GH QXHYDV GURJDV \ FRPSXHVWRV GH XWLOLGDG SDUD ODV LQGXVtrias farmacutica (antibiticos, anticancergeQRV DJURSHFXDULD LQVHFWLFLGDV KHUELFLGDV DOLPHQWLFLD SLJPHQWRV VDERUL]DQWHV FRQVHUvantes) y cosmtica (esencias colorantes), entre otras. Ingeniera gentica del metabolismo secundario en plantas. /D LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD VH SXHGH GHQLU como el redireccionamiento de una o ms reacciones enzimticas en una va biosinttica SDUD SURGXFLU QXHYRV FRPSXHVWRV DXPHQWDU OD SURGXFFLyQ GH FRPSXHVWRV SUHH[LVWHQWHV R GLVPLQXLU OD SURGXFFLyQ GH FRPSXHVWRV QR GHVHDGRV 6H WUDWD GH XQ FDPSR GH DSOLFDFLyQ UHODWLYDPHQWH QXHYR TXH HV PX\ GHSHQGLHQWH GHO FRQRFLPLHQWR ELRTXtPLFR \ VLROyJLFR 'HELGR al uso de trazadores radioactivos, ya hacia VH GLVSRQtD GH QRFLRQHV JHQHUDOHV DGHFXDGDV VREUH OD UHODFLyQ SURGXFWRVXVWUDWR HQ PXFKDV YtDV PHWDEyOLFDV (O GHVDUUROOR UiSLGR GH HVWH FDPSR RFXUULy D SDUWLU GH OD GLVSRQLbilidad de herramientas de biologa molecular, FRPR HO FORQDGR GH JHQHV HO XVR GH SURPRWRres y las tcnicas de transformacin, las cuales
Figura 1. Vas generales del metabolismo secundario de las plantas. 6H SUHVHQWDQ ODV WUHV SULQFLSDOHV YtDV ELRVLQWpWLFDV GH ORV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV WHUSHQRV FRPSXHVWRV IHQyOLFRV R IHQLOSURSDQRLGHV \ SURGXFWRV QLWURJHQDGRV R DOFDORLGHV SHUPLWLHURQ H[SORUDU ORV PHFDQLVPRV PROHFXODUHV TXH UHJXODQ OD SURGXFFLyQ GH PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV 'H HVWD IRUPD D SDUWLU GH OD GpFDGD GH ORV VH ORJUy XQ SURJUHVR VLJQLFDWLYR en la diseccin de muchas vas biosintticas y HQ OD VREUHH[SUHVLyQ GH JHQHV KHWHUyORJRV OR TXH SHUPLWLy ORV SULPHURV DYDQFHV 'HVGH HQtonces se han logrado numerosos resultados exitosos y un nmero an mayor de resultados QR HVSHUDGRV (O FRQRFLPLHQWR JDQDGR KD FRQducido a concebir el funcionamiento del metabolismo como el de una gran red de reacciones TXtPLFDV LQWHUUHODFLRQDGDV HQ TXH OD PRGLFDFLyQ GH XQ VyOR FRPSRQHQWH SXHGH SURGXFLU XQ LPSDFWR FRQVLGHUDEOH HQ HO PHWDEROLVPR de todo el organismo. An as, el metabolisPR VHFXQGDULR HV XQ EODQFR SDUWLFXODUPHQWH DWUDFWLYR SDUD PHMRUDU HO UHQGLPLHQWR GH XQ SURGXFWR GHWHUPLQDGR VLQ TXH HOOR DIHFWH PDUFDGDPHQWH SURFHVRV HVHQFLDOHV SDUD OD SODQWD 6LQ HPEDUJR SDUD ORJUDU HVWR GH XQD PDQHUD relativamente controlada, no basta con conoFHU ORV FRPSRQHQWHV HQ]LPDV \ PHWDEROLWRV TXH SDUWLFLSDQ GH XQD GHWHUPLQDGD YtD PHWDblica. Tambin se debe conocer la regulacin GH HVWD YtD SDVRV OLPLWDQWHV PHFDQLVPRV GH retroalimentacin) y su relacin con otras vas ELRVLQWpWLFDV YtDV FRPSHWLWLYDV 7DPELpQ HV LPSRUWDQWH FRQRFHU OD FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ FHOXODU GH OD UXWD HQ HVWXGLR \ OD SDUWLFLSDFLyQ GH WHMLGRV R GH yUJDQRV HVSHFLDOL]DGRV HQ OD SURGXFFLyQ GH GHWHUPLQDGRV PHWDEROLWRV Manipulacin gentica del metabolismo secundario por sobreexpresin o LQKLELFLyQ GH OD SURGXFFLyQ GH HQ]LPDV /D PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD GHO PHWDEROLVPR secundario tiene como objetivo el aumento o
GLVPLQXFLyQ GH OD SURGXFFLyQ GH XQ FRPSXHVWR TXH VH HQFXHQWUD QRUPDOPHQWH SUHVHQWH HQ XQD SODQWD R ELHQ OD SURGXFFLyQ GH XQ QXHYR FRPSXHVWR TXH QR HV QDWXUDOPHQWH SURGXFLGR SRU OD PLVPD 3DUD DXPHQWDU OD SURGXFFLyQ GH XQ FRPSXHVWR HV QHFHVDULR DXPHQWDU VX ELRVtQWHVLV R disminuir su catabolismo. El aumento de la bioVtQWHVLV SXHGH UHDOL]DUVH SRU VREUHSURGXFFLyQ GH ODV HQ]LPDV LPSOLFDGDV HQ OD YtD ELRVLQWpWLFD R ELHQ SRU LQKLELFLyQ GH XQD YtD FRPSHWLWLYD TXH aumenta indirectamente la sntesis del comSXHVWR SRU UHGLUHFFLRQDPLHQWR GH PHWDEROLWRV /D GLVPLQXFLyQ GHO FDWDEROLVPR VH ORJUD SRU GLVPLQXFLyQ GH OD SURGXFFLyQ GH HQ]LPDV TXH XWLOL]DQ HO FRPSXHVWR GHVHDGR SDUD OD REWHQFLyQ GH RWURV FRPSXHVWRV 3DUD GLVPLQXLU OD SURGXFFLyQ GH XQ FRPSXHVto no deseado se debe aumentar su catabolisPR R GLVPLQXLU VX ELRVtQWHVLV (VWR VH SXHGH ORJUDU SRU VREUHSURGXFFLyQ GH HQ]LPDV GH OD YtD FDWDEyOLFD R SRU LQKLELFLyQ GH OD SURGXFFLyQ de enzimas de la va biosinttica. El conocimiento de los genes involucrados HQ XQD YtD PHWDEyOLFD SHUPLWH DXPHQWDU ODV DFWLYLGDGHV GH GLFKDV HQ]LPDV SRU VREUHH[SUHVLyQ GH VXV UHVSHFWLYRV JHQHV D SDUWLU GH SURPRWRUHV LQGXFLEOHV R FRQVWLWXWLYRV 3RU RWUD SDUte, la utilizacin de tcnicas de ARN antisentido y, ms recientemente, de ARN de interferencia $51L QRV SHUPLWH GLVPLQXLU HVSHFtFDPHQWH OD H[SUHVLyQ GH GHWHUPLQDGDV HQ]LPDV D WUDYpV GHO VLOHQFLDPLHQWR SRVWUDQVFULSFLRQDO GH ORV JHQHV TXH ODV FRGLFDQ Uso de los factores de transcripcin en la manipulacin del metabolismo secundario. 6H DFHSWD DFWXDOPHQWH TXH HO FRQWURO GHO XMR metablico a travs de una va biosinttica se HQFXHQWUD HQ PiV GH XQ SDVR GH HVWD YtD (VWRV SXQWRV GH FRQWURO SDVRV OLPLWDQWHV SXHGHQ VHU PRGLFDGRV SRU FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV metablicas o del desarrollo y son, en ltima LQVWDQFLD UHVSRQVDEOHV GH OD SURGXFWLYLGDG GH OD SODQWD /D GLVWULEXFLyQ GHO FRQWURO UHJXODWRULR KDFH TXH OD PRGLFDFLyQ GHO PHWDEROLVPR SRU VREUHH[SUHVLyQ R LQKLELFLyQ GH XQRV SRFRV JHnes estructurales sea difcil de alcanzar. $ SHVDU GH ORV HVIXHU]RV UHDOL]DGRV SDUD LGHQWLFDU ORV SDVRV OLPLWDQWHV GH GLIHUHQWHV
YtDV PHWDEyOLFDV OD VREUHH[SUHVLyQ GH JHQHV HVWUXFWXUDOHV VyOR KD SHUPLWLGR REWHQHU DXPHQWRV GHO XMR PHWDEyOLFR GH PRGHUDGRV D PX\ SHTXHxRV &RQRFHU ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULScin que regulan una determinada va metabOLFD QRV SHUPLWH LQGXFLU OD H[SUHVLyQ GH WRGD OD YtD PHWDEyOLFD HQ VX FRQMXQWR SRU VREUHH[SUHVLyQ GHO R ORV JHQHV TXH FRGLFDQ GLFKRV IDFWRUHV (VWD HVWUDWHJLD KD SHUPLWLGR REWHQHU DXPHQWRV GHO XMR PHWDEyOLFR VLJQLFDWLYDPHQWH PD\RUHV TXH ORV REWHQLGRV SRU VREUHH[SUHVLyQ o inhibicin de genes estructurales. Este efecWR VH GHEH D TXH ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ DO FRQWURODU HQ IRUPD VLPXOWiQHD OD H[SUHVLyQ GH OD PD\RUtD GH ORV JHQHV FRPSUHQGLGRV HQ XQD YtD GHWHUPLQDGD SHUPLWHQ HOXGLU ODV UHVWULFFLRQHV JHQHUDGDV SRU OD H[LVWHQFLD GH SDVRV OLPLWDQWHV $GHPiV OD PRGXODFLyQ GHO XMR PHWDEyOLFR XWLOL]DQGR IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ QR UHTXLHUH GH OD LGHQWLFDFLyQ DLVODPLHQWR \ caracterizacin molecular de los genes que FRPSRQHQ OD YtD HQ FXHVWLyQ 6LQ HPEDUJR OD PRGLFDFLyQ GHO PHWDEROLVPR D WUDYpV GH OD H[SUHVLyQ GH IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ QR HV XQD SDQDFHD SDUD UHVROYHU WRGRV ORV SUREOHPDV GH OD LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD GH SODQWDV &RPR HV REYLR ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ QR SXHGHQ LQGXFLU YtDV PHWDEyOLFDV TXH QR HVWiQ SUHVHQWHV HQ OD SODQWD SRU OR TXH HQ HVWRV FDVRV HV necesario introducir todos los genes necesaULRV SDUD UHFUHDU ODV PLVPDV HQ ODV SODQWDV GH inters. Por esta razn, la ingeniera gentica de genes estructurales continuar an siendo QHFHVDULD SDUD UHVROYHU PXFKRV SUREOHPDV GH la ingeniera metablica. (QWUH ORV SULPHURV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ GHVFULSWRV HQ SODQWDV VH HQFXHQWUDQ ORV factores R y C1, involucrados en el control de la biosntesis de antocianinas de la aleurona de maz. La induccin de la va de la sntesis de antocianinas en clulas indiferenciadas de PDt] SXGR LQGXFLUVH SRU VREUHH[SUHVLyQ GH HVWRV GRV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ $VLPLVPR OD VREUHH[SUHVLyQ GH HVWRV IDFWRUHV HQ DUUR] SURdujo la activacin de la va de sntesis de las antocianinas, lo que se tradujo en un aumento GH OD UHVLVWHQFLD GHO DUUR] D OD LQIHFFLyQ SRU XQ SDWyJHQR I~QJLFR (VWH HMHPSOR PXHVWUD TXH OD DFXPXODFLyQ GH XQ SURGXFWR QDWXUDO SXHGH PRGLFDUVH SRU OD VREUHH[SUHVLyQ GH zWHUSHQRV
0RQRWHUSHQRV ORV DFHLWHV HVHQFLDOHV FRQWLHQHQ PRQRWHUSHQRV YROiWLOHV TXH VRQ DOPDFHQDGRV HQ ORV SHORV JODQGXODUHV GH OD HSLGHUPLV (VWRV DFHLWHV HVHQFLDOHV VH REWLHQHQ GH RUHV GH IUXWRV GH KLHUEDV \ HVSHFLDV \ VRQ XVDGRV HQ SHUIXPHV \ VDERUL]DQWHV $OJXQDV GH ODV SODQWDV PiV XWLOL]DGDV SDUD OD REWHQFLyQ GH HVWH WLSR GH FRPSXHVWRV VRQ OD PHQWD PHQWRO \ HO OLPyQ OLPRQHQR $OJXQDV SODQWDV HPLWHQ WHUSHQRV YROiWLOHV GHVSXpV TXH ORV LQVHFWRV se han alimentado de ellas. Estos atraen a los HQHPLJRV QDWXUDOHV GHO LQVHFWR SUHGDGRU \ DFtan como un mecanismo de defensa contra el mismo. 6HVTXLWHUSHQRV ORV DFHLWHV HVHQFLDOHV GH KLHUEDV \ HVSHFLDV WDPELpQ FRQWLHQHQ VHVTXLWHUSHQRV $OJXQRV VHVTXLWHUSHQRV DFW~DQ HQ ORV PHFDQLVPRV GH GHIHQVD GH OD SODQWD SURGXFLHQGR WRODH[LQDV FRPR OD URVLQD \ RWUDV VXVWDQFLDV UHSHOHQWHV GH KHUEtYRURV 'LWHUSHQRV /DV UHVLQDV FRQWLHQHQ GLWHUSHQRV &XDQGR ORV FDQDOHV TXH WUDQVSRUWDQ OD resina son daados, la descarga de la resina sirve como una barrera qumica y fsica a la alimentacin de los insectos. Por otro lado, ORV GLWHUSHQRV VH SROLPHUL]DQ FXDQGR OD UHVLQD HV H[SXHVWD DO DLUH \ FRQWULEX\H D VHOODU las heridas. Ciertos escarabajos de la corte]D KDQ DGTXLULGR OD FDSDFLGDG GH PHWDEROL]DU ORV PRQRWHUSHQRV FRQWHQLGRV HQ OD UHVLQD GH ODV FRQtIHUDV FRQYLUWLpQGRVH HQ GHSUHGDGRUHV HVSHFLDOL]DGRV $OJXQRV GLWHUSHQRV VRQ PX\ LPSRUWDQWHV HQ DSOLFDFLRQHV PHGLFLQDOHV \D TXH SRVHHQ SURSLHGDGHV DQWLLQDPDWRULDV DQWLPLFURELDQDV \ DQWLHVSDVPyGLFDV 8QD GH ODV GURJDV PiV SRWHQWHV FRQWUD FLHUWRV WLSRV GH FiQFHU HV XQ GLWHUSHQR HO SDFOLWD[HO 7D[RO obtenido originalmente de la corteza del tejo GHO 3DFtFR Taxus brevifolia). 7ULWHUSHQRV (O DOJRGRQFLOOR GH 6LULD Asclepias syriaca FRQWLHQH WULWHUSHQRV TXH VH DFXPXODQ HQ ODV ODUYDV GH ODV PDULSRVDV 0RQDUFD XQ OHSLGySWHUR TXH VH DOLPHQWD GH HVWD SODQWD (Q ORV DGXOWRV ORV WULWHUSHQRV VRQ DOPDFHQDGRV HQ ODV DODV GH OD PDULSRVD \ HOOR ODV YXHOYH Wy[LFDV SDUD VXV GHSUHGDGRUHV ORV SiMDURV (O WULWHUSHQR GLJLWDOLV REWHQLGR GH OD GHGDOHUD R GLgital (Digitalis purpurea), fortalece y enlentece el msculo cardaco. Fue desarrollado como GURJD KDFLD HO QDO GHO VLJOR ;9,,, EDViQGRVH
en un remedio casero (t hecho con hojas de OD SODQWD JXDQWH GH ]RUUR S~USXUD \ VH XVDED SDUD WUDWDU OD DQJLQD GH SHFKR 7HWUDWHUSHQRV (QWUH ORV WHWUDWHUSHQRV VH HQFXHQWUDQ ORV FDURWHQRLGHV FRPSXHVWRV TXH VRQ GH JUDQ LPSRUWDQFLD FRPR VXSOHPHQWRV dietarios. Los carotenoides son sintetizados de novo D SDUWLU GH JHUDQLOJHUDQLO GLIRVIDWR SRU WRGRV ORV RUJDQLVPRV IRWRVLQWpWLFRV 3DUWLFLSDQ HQ OD FDSWDFLyQ GH OD OX] \ HQ OD SURWHFFLyQ SRU el exceso de luz blanca. Muchas bacterias no fotosintticas (Erwinia herbicola, Thermus aquaticus, Deinococcus radiodurans) y hongos (Neurospora crassa, Phycomyces blakesleeanus) sintetizan tambin carotenoides. En ODV SODQWDV ORV FDURWHQRLGHV VH DFXPXODQ HQ FORURSODVWRV \ HQ FURPRSODVWRV 6H SXHGH HQFRQWUDU XQ DPSOLR UDQJR GH FDURWHQRLGHV HQ ORV FURPRSODVWRV SRU HMHPSOR OLFRSHQR HQ IUXWR GH WRPDWH FDURWHQR HQ UDtFHV GH ]DQDKRULD OXWHtQD \ ]HD[DQWLQD HQ HQGRVSHUPD GH PDt] La investigacin, el desarrollo y el uso de SURGXFWRV QDWXUDOHV FRPR DJHQWHV WHUDSpXWLFRV \ QXWULFLRQDOHV HVSHFLDOPHQWH DTXHOORV GHULYDGRV GH SODQWDV KD FUHFLGR PXFKR D OR largo de estos aos. Uno de los desarrollos FRQ PD\RU p[LWR \ SXEOLFLGDG IXH OD REWHQFLyQ del arroz transgnico rico en E-carotenos. La vitamina A es un nutriente esencial cuya carenFLD HQ KXPDQRV SXHGH DIHFWDU VHYHUDPHQWH OD YLVLyQ OD UHSURGXFFLyQ \ OD IXQFLyQ LQPXQH 6H estima que en el mundo existen 124 millones GH QLxRV GHFLHQWHV HQ YLWDPLQD $ \ TXH XQD SURYLVLyQ DGHFXDGD SRGUtD HYLWDU GH D PLllones de muertes anuales. El arroz es uno de ORV SULQFLSDOHV DOLPHQWRV SDUD PLOORQHV GH SHUVRQDV /D SDUWH FRPHVWLEOH GHO DUUR] FRQVLVWH EiVLFDPHQWH HQ HO HQGRVSHUPD FRPSXHVWR SRU JUiQXORV GH DOPLGyQ \ FXHUSRV SURWHLFRV SHUR FDUHFH GH ORV QXWULHQWHV HVHQFLDOHV SDUD HO PDQWHQLPLHQWR GH OD VDOXG FRPR HV OD SUR vitamina A (E-caroteno). El hecho que el arroz VHD OD SULQFLSDO IXHQWH GH DOLPHQWRV GH PXFKDV SREODFLRQHV FRQWULEX\H DO SUREOHPD GH OD GHciencia en vitamina A, convirtindose en un seULR SUREOHPD GH VDOXG S~EOLFD (O DUUR] SURGXFH JHUDQLOJHUDQLO GLIRVIDWR SUHFXUVRU GH ORV FDURWHQRV SHUR FDUHFH GH ODV HQ]LPDV FRUUHVSRQGLHQWHV D HVWD UXWD ELRVLQWpWLFD 3DUD FRPSOHWDU la va de sntesis del E-caroteno es necesario
LQWURGXFLU SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ]LPDV OD WRHQR VLQWHWDVD OD WRHQR GHVDWXUDVD OD FDURWHQR GHVDWXUDVD \ OD OLFRSHQR FLFODVD $OWHUQDWLYDPHQWH SDUD VLPSOLFDU HO WUDEDMR GH WUDQVIRUPDFLyQ HO Q~PHUR GH HQ]LPDV SXHGH VHU UHGXFLGR XWLOL]DQGR XQD WRHQR GHVDWXUDVD EDFWHULDQD TXH HV FDSD] GH UHHPSOD]DU D ODV dos desaturasas vegetales (Figura 2). La introduccin de la va de sntesis de E-caroteno HQ DUUR] VH HIHFWXy SRU WUDQVIRUPDFLyQ FRQ Agrobacterium tumefaciens SRUWDQGR YHFWRUHV que contenan los siguientes genes: a) gen de WRHQR VLQWHWDVD psy) de Narcissus pseudonarcissus EDMR HO FRQWURO GHO SURPRWRU JOXWHOLQD HVSHFtFR GH HQGRVSHUPD *W E JHQ GH OD WRHQR GHVDWXUDVD crtl) de Erwinia uredovora FRQWHQLHQGR OD VHFXHQFLD SDUD HO SpSWLGR GH trnsito de la subunidad menor de la Rubisco GH DUYHMD EDMR HO FRQWURO GHO SURPRWRU 6 GHO &DXOLRZHU PRVDLF YLUXV &D09 F JHQ GH OD OLFRSHQR FLFODVD lcy) de Narcissus pseudonarcissus FRQWHQLHQGR OD VHFXHQFLD SDUD XQ SpStido GH WUiQVLWR TXH SHUPLWH OD LPSRUWDFLyQ D SOiVWLGRV EDMR HO FRQWURO GHO SURPRWRU 6 GH
&D09 /RV JUDQRV GH DUUR] REWHQLGRV D SDUWLU GH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV HUDQ GH FRORU DPDULOOR GHELGR D OD SURGXFFLyQ GH E-caroteno, HVWD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLFD IXH OD TXH LQVSLUy el nombre de esta lneas transgnicas como "Arroz dorado" o en ingls "Golden rice".
Ingeniera metablica de la sntesis GH DYRQRLGHV /RV DYRQRLGHV SHUWHQHFHQ D XQD GH ODV SULQFLSDOHV FODVHV GH PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV 6H FDUDFWHUL]DQ SRU VHU FRPSXHVWRV SROLIHQyOLFRV GH HVWUXFWXUD DURPiWLFD SUHVHQWHV HQ WRdos los tejidos vegetales. Son una familia muy GLYHUVD GH FRPSXHVWRV TXH VH FDUDFWHUL]DQ SRU VHU VLQWHWL]DGRV D SDUWLU GH XQD PROpFXOD de fenilalanina y 3 de malonil-CoA (Figura 3). (VWD HVWUXFWXUD SXHGH VXIULU PRGLFDFLRQHV \ DGLFLRQHV GH JUXSRV IXQFLRQDOHV JOLFRVLODFLRnes, metilaciones o acetilaciones) generando XQD JUDQ GLYHUVLGDG GH DYRQRLGHV +DVWD HO SUHVHQWH KDQ VLGR LGHQWLFDGRV PiV GH DYRQRLGHV GLIHUHQWHV (VWRV VH FODVLFDQ VHJ~Q VX HVWUXFWXUD EDVH HQ JUXSRV FKDOFRQDV DYRQRQDV DYRQROHV GLKLGURDYRQRLGHV \ DQWRFLDQLQDV Esta clase de metabolitos secundarios se encuentran SUHVHQWHV HQ FDVL WRGDV ODV IDPLOLDV GH SODQWDV SULQFLSDOPHQWH HQ OD HSLGHUPLV GH KRMDV WDOORV UDtFHV RUHV VHPLllas y frutos. Por su condicin GH SROLIHQROHV ORV DYRQRLGHV DFW~DQ FRPR DQWLR[LGDQWHV SURWHJLHQGR D ODV SODQWDV FRQWUD OD UDGLDFLyQ 89 FRPR SRU HMHPSOR ORV DYRQROHV NHPIHURO \ TXHUFHWLQD 3RU RWUR ODGR SUHsentan un rol fundamental en OD GHIHQVD GH OD SODQWD IUHQWH D GHSUHGDGRUHV WRDOH[LQDV \ sobre el desarrollo y crecimienWR GH RWUD SODQWD YHFLQD IUHQWH D HVWUHVHV DPELHQWDOHV DOHORSDta). Tambin, se encuentran inFigura 2. Manipulacin del metabolismo de los terpenoides YROXFUDGRV HQ ORV SURFHVRV GH HQ SODQWDV GH DUUR] $UUR] GRUDGR 6H SUHVHQWD OD YtD GH VtQRUDFLyQ SROLQL]DFLyQ D WUDYpV tesis del geranil-geranil difosfato en arroz y la obtencin de cadel color u olor que le dan las URWHQRV SRU VREUHH[SUHVLyQ HQ DUUR] GH ODV HQ]LPDV KHWHUyORJDV DQWRFLDQLQDV D ODV RUHV \ HQ WRHQR VLQWHWDVD WRHQR GHVDWXUDVD \ OLFRSHQR VLQWHWDVD
)LJXUD 9tDV GH VtQWHVLV GH ORV DYRQRLGHV /RV DYRQRLGHV VH FODVLFDQ VHJ~Q VX HVWUXFWXUD FHQWUDO DJOLFRQD HQ JUXSRV FKDOFRQDV DYRQRQDV DYRQRLGHV GLKLGURDYRQRLGHV \ DQWRFLDQLQDV
OD VLPELRVLV YHJHWDO SRU LQGXFFLyQ GH OD QRGXODFLyQ GH EDFWHULDV MDGRUDV GHO QLWUyJHQR (VWH WLSR GH SROLIHQROHV VRQ LPSRUWDQWHV HFRQyPLFDPHQWH SRUTXH FRQWULEX\HQ DO VDERU DURma y color de los alimentos y bebidas. Adems en los ltimos aos han adquirido una gran imSRUWDQFLD HQ OD VDOXG KXPDQD GHELGR D HVWXGLRV TXH VXJLHUHQ TXH HVWRV FRPSXHVWRV SUHVHQWDQ XQ HIHFWR SURWHFWRU IUHQWH D FLHUWDV HQIHUPHGDGHV \ SXHGHQ DFWXDU FRPR DQWLDOHUJpQLFRV 'HELGR D ODV SURSLHGDGHV EHQpFDV SDUD OD VDOXG KXPDQD \ D VX LPSRUWDQFLD HFRQyPLFD ODV YtDV ELRVLQWpWLFDV GH ORV DYRQRLGHV KDQ VLGR H[WHQVDPHQWH HVWXGLDGDV (VWR KD SHUPLWLGR HO GHVDUUROOR GH OD LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD DSOLFDGD al mejoramiento nutricional de ciertos cultivos FRPR WDPELpQ D OD SURGXFFLyQ GH RUHV GH FRUWH 8QD GH ODV SULPHUDV DSOLFDFLRQHV GH OD LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD IXH OD PDQLSXODFLyQ GH OD YtD GH VtQWHVLV GH DYRQRLGHV \ DQWRFLDQLQDV SDUD FDPELDU HO FRORU GH ODV RUHV (VWR VH GHELy SULQFLSDOPHQWH D TXH HUD XQD GH ODV YtDV ms conocidas y los resultados eran fcilmente observables. Es inusual encontrar la gama FRPSOHWD GH FRORUHV GHQWUR GH ODV HVSHFLHV R-
rales convencionales. En Petunia hybrida, una GH ODV SODQWDV HQ TXH OD YtD GH VtQWHVLV GH DQtocianinas ha sido ms extensamente estudiaGD VH SURGXFHQ GHULYDGRV GH GHOQLGLQDV \ GH FLDQLGLQDV SHUR QR GHULYDGRV GH SHODUJRQLGLQD (VWR VH GHEH D OD HVSHFLFLGDG GH OD HQ]LPD GLKLGURDYRQRO UHGXFWDVD GH SHWXQLD OD FXDO QR SXHGH UHGXFLU DO SUHFXUVRU GH SHODUJRQLGLQD el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo, hace casi dos dcadas se obtuvo una variedad GH SHWXQLDV DQDUDQMDGDV TXH UHSUHVHQWD HO SULPHU SURGXFWR H[LWRVR GH PRGLFDFLyQ GHO FRORU GH ODV RUHV SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD (VWR VH ORJUy WUDQVIRUPDQGR XQD YDULHGDG GH SHWXQLD EODQFD FRQ HO JHQ GH OD GLKLGURDYRQRO UHductasa (dfr GH PDt] /D YDULHGDG GH SHWXQLD blanca (mutante RLo1) acumula dihidrokemferol debido a que los genes f3h DYRQRLGH hidroxilasa) y f35 DYRQRLGH KLGUR[LODVD VH KDOODQ DIHFWDGRV SRU PXWDFLRQHV HQ FRQVHFXHQFLD SURGXFH RUHV TXH QR PXHVWUDQ SLJmentacin. La transformacin de esta variedad FRQ HO JHQ GH PDt] FRQGXMR D OD SURGXFFLyQ \ DFXPXODFLyQ GH SHODUJRQLGLQD REWHQLpQGRVH RUHV GH SHWXQLD FRORU DQDUDQMDGR )LJXUD
4). Muchos de estos transformantes sufrieron LQHVWDELOLGDG HSLJHQpWLFD H[SUHVLyQ LQHVWDEOH GHELGR D OD PHWLODFLyQ GHO SURPRWRU QR SXGLpQGRVH REWHQHU FXOWLYDUHV XQLIRUPHPHQWH FRORUHDGRV OR FXDO LPSLGLy VX FRPHUFLDOLzacin. Sin embargo, los investigadores de la HPSUHVD 1RYDUWLV ORJUDURQ REWHQHU SHWXQLDV DQDUDQMDGDV XQLIRUPHPHQWH FRORUHDGDV SRU LQtrogresin del gen dfr HQ SODQWDV GH SHWXQLD 2WUR HMHPSOR H[LWRVR HV HO GHVDUUROOR GH FODYHOHV YLROHWDV SRU OD HPSUHVD DXVWUDOLDQD )ORULJHne. En los aos 90 los investigadores de esta FRPSDxtD WHQtDQ FRPR SUR\HFWR OD REWHQFLyQ
Figura 4. Manipulacin del metabolismo de las antocianinas en Petunia hybrida. /D H[SUHVLyQ del gen dfr GH PDt] HQ XQD OtQHD GH SHWXQLD TXH acumula dihidrokemferol debido a dos mutaciones en los genes f3h y f35 LQGXFH OD VtQWHVLV GHO SLJPHQWR SHODUJRQLGLQD SHODUJRQLGLQDJOXFyVLGR GH FRORU ODGULOOR /DV SHWXQLDV EODQFDV QR VLQWHWL]DQ
GH URVDV D]XOHV &RQ HVWH Q FORQDURQ \ VREUHH[SUHVDURQ HQ URVDV GRV HQ]LPDV GH SHWXQLD HQFDUJDGDV GH VLQWHWL]DU HO SLJPHQWR D]XO GHOQLGLQD VLQ HPEDUJR ORV UHVXOWDGRV TXH REWXYLHURQ QR IXHURQ ORV HVSHUDGRV $ SHVDU GH REWHQHU OtQHDV WUDQVJpQLFDV HVWDEOHV SDUD GLFKDV HQ]LPDV ODV URVDV QR SUHVHQWDEDQ FRORUDFLyQ D]XO GHELGR D OD LQXHQFLD GHO S+ YDFXRODU HQ OD FRORUDFLyQ GH ORV SLJPHQWRV &XDQGR DSOLFDURQ OD PLVPD HVWUDWHJLD SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ GH claveles los resultados fueron sustancialmente diferentes, lograron desarrollar exitosamente seis lneas de claveles transgnicos que van desde el color lila hasta el violeta. Los claveOHV PRGLFDGRV JHQpWLFDPHQWH VH HQFXHQWUDQ DFWXDOPHQWH GLVSRQLEOHV HQ PXFKDV SDUWHV GHO mundo. Estos claveles transgnicos han sido sometidos a un riguroso escrutinio regulatorio \ HQ SULQFLSLR QR SUHVHQWDQ PD\RUHV ULHVJRV SDUD HO DPELHQWH TXH ORV REWHQLGRV SRU PpWRdos convencionales debido a que la mayora de estos claveles son infrtiles y a que la disSHUVLyQ GH VHPLOODV VH YH OLPLWDGD \D TXH ODV RUHV VRQ UHPRYLGDV GH OD SODQWD FXDQGR HVWiQ an cerradas. Una cantidad creciente de evidencias sugieUH TXH ORV DYRQRLGHV VRQ SRWHQWHV DQWLR[LGDQtes y que un aumento en su consumo diario SRGUtD UHGXFLU HO ULHVJR GH HQIHUPHGDGHV FDUGLRYDVFXODUHV \ SUHYHQLU FLHUWRV WLSRV GH FiQcer. Por esta razn, existe gran inters en la REWHQFLyQ GH FXOWLYRV FRPHVWLEOHV TXH SURGX]FDQ DOWRV QLYHOHV GH DYRQRLGHV 8QR GH ORV SULQFLSDOHV FDQGLGDWRV SDUD GHVDUUROODU HVWH WLSR GH WHFQRORJtD HV HO WRPDWH (O WRPDWH SURGXFH HQ VX SLHO SHTXHxDV FDQWLGDGHV GH DYRQRLGHV OR FXDO QRV FRQUPD OD H[LVWHQFLD GH OD YtD GH VtQWHVLV GH DYRQRLGHV HQ HVWD SODQWD \ OD SRWHQFLDOLGDG GH DXPHQWDU VXV QLYHOHV GH SURGXFFLyQ $ SDUWLU GH OD PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD GH OD H[SUHVLyQ GH IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ se logr obtener lneas de tomate transgnicos FDSDFHV GH SURGXFLU QLYHOHV FLQFR YHFHV PD\RUHV GH DYRQROHV TXH OD YDULHGDG VDOYDMH /RV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ TXH UHJXODQ OD VtQWHVLV GH DYRQROHV HQ GLYHUVDV SODQWDV IRUPDQ SDUWH GH GRV IDPLOLDV SULQFLSDOHV OD IDPLOLD & WLSR 0<% \ OD IDPLOLD 5 WLSR 0<& /RV DXWRUHV VREUHH[SUHVDURQ HQ WRPDWH ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ & \ / GH PDt] < HQ IRUPD
VLPXOWiQHD WUDQVIRUPDURQ SODQWDV GH WRPDWHV FRQ SDUHV GH FRQVWUXFFLRQHV GLIHUHQWHV D JHQ C1 EDMR OD UHJXODFLyQ GHO SURPRWRU FRQVWLWXWLYR 6 GH &D09 \ HO JHQ L1 bajo la regulacin del SURPRWRU HVSHFtFR GH IUXWR ( 35SC1/E8L1); b) genes C1 y L1 EDMR OD UHJXODFLyQ GHO SURPRWRU HVSHFtFR GH IUXWR ( E8C1/E8L1). Dado que los factores C1 y L1 actan en forma coordinada se asumi que ambas estrategias, la VREUHH[SUHVLyQ LQGLYLGXDO \ FRPELQDGD GH ORV IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ FRQGXFLUtDQ DO LQFUHPHQWR HVSHFtFR GH DYRQROHV HQ HO IUXWR /D FDQWLGDG \ WLSR GH DYRQROHV IXH GHWHUPLQDGD SRU +3/& FURPDWRJUDItD OtTXLGD GH DOWR UHQdimiento, del ingls High Performance Liquid Chromatography) D SDUWLU GH SXOSD GH WRPDWHV controles y transgnicos. En este trabajo se GHPXHVWUD TXH VyOR KXER SURGXFFLyQ GH DYRQROHV HQ ODV SODQWDV TXH H[SUHVDEDQ ORV GRV IDFWRUHV OR TXH FRPSUXHED TXH DPERV VRQ UHTXHULGRV SDUD DFWLYDU FRPSOHWDPHQWH HVWD YtD Adems, se observ un aumento de la actividad antioxidante de los tomates transgnicos 6&(/ GHELGR D OD DFXPXODFLyQ GH ORV DYRQROHV NHPIHURO \ QDULQJHQLQD Ingeniera metablica de la sntesis de alcaloides /RV DOFDORLGHV VRQ HO JUXSR GH PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV PiV UHSUHVHQWDWLYR QXPHURso y diverso en la naturaleza. Debido a esto VRQ PX\ GLItFLOHV GH GHQLU HQ IRUPD JHQHUDO \ SUHFLVD 6LQ HPEDUJR HO FDUiFWHU FRP~Q TXH SUHVHQWDQ HV TXH HQ VX HVWUXFWXUD SRVHHQ XQ anillo heterocclico con uno o ms tomos de QLWUyJHQR 6RQ VLQWHWL]DGRV D SDUWLU GH DPLQRicidos o de sus derivados inmediatos y se clasiFDQ VHJ~Q VX HVTXHOHWR FDUERQDGR +DVWD HO PRPHQWR VH KD HVWLPDGR TXH ODV SODQWDV VRQ FDSDFHV GH SURGXFLU HVSHFLHV GH DOFDloides diferentes. /D LPSRUWDQFLD GH ORV DOFDORLGHV GHQWUR GH ODV SODQWDV UDGLFD HQ TXH FRQVWLWX\HQ XQ UHVHUYRULR GH QLWUyJHQR SDUD OD PLVPD 3RU RWUR ODGR DO LJXDO TXH DOJXQRV DYRQRLGHV DFW~DQ FRPR VXVWDQFLDV DOHORSiWLFDV HQ OD GHIHQVD IUHQWH D RWUDV HVSHFLHV YHJHWDOHV FRPR DVt WDPELpQ IUHQWH DO DWDTXH GH FLHUWRV SDWyJHQRV R GHSUHGDGRUHV 7DPELpQ DFW~DQ SURWHJLHQGR D ODV SODQWDV GHO HIHFWR GH ODV UDGLDFLRQHV XOWUDYLRletas.
/RV DOFDORLGHV SURGXFLGRV SRU ODV SODQWDV FRQVWLWX\HQ XQR GH ORV JUXSRV GH SURGXFWRV QDWXUDOHV TXH SURYHH PD\RU FDQWLGDG GH FRPSXHVWRV IDUPDFROyJLFDPHQWH DFWLYRV (Q OD DFWXDOLGDG GLYHUVRV WLSRV GH DOFDORLGHV VRQ XWLlizados tanto en la medicina tradicional como HQ OD KRPHRSDWtD *HQHUDOPHQWH DFW~DQ VREUH el sistema nervioso central a nivel del sistema QHUYLRVR SDUDVLPSiWLFR \ VLPSiWLFR (Q PHGLFLQD VRQ XWLOL]DGRV SDUD HO WUDWDPLHQWR GH HQIHUPHGDGHV PHQWDOHV FRPR DVt WDPELpQ SDUD calmar el dolor, ya que muchos de estos metaEROLWRV VRQ FRPSXHVWRV SVLFRDFWLYRV PRUQD (Papaver somniferum DWURSLQD Atropa belladonna), colchicina, entre otros. Existen otros WLSRV GH DOFDORLGHV TXH VRQ WDPELpQ IDUPDFDOyJLFDPHQWH LPSRUWDQWHV GHELGR D VX XVR HQ HO tratamiento de tumores. Se trata de la vinblastiQD YLQFULVWLQD \ OD FDPSWRWHFLQD 2WUR DOFDORLGH de extrema relevancia en medicina es la quinina (&LQFKRQD RIFLQDOLV GURJD SULQFLSDO HQ HO tratamiento de la malaria. /D LQJHQLHUtD JHQpWLFD DSOLFDGD D OD PDQLSXODFLyQ GH OD ELRVtQWHVLV GH HVWRV FRPSXHVWRV ha generado varios xitos durante los ltimos aos. Uno de los casos ms interesantes es el GHVDUUROOR GH SODQWDV GH FDIp WUDQVJpQLFDV Coffea canephora) con bajo contenido de cafena. Existe una creciente demanda de caf libre de cafena debido a los efectos adversos que HVWH FRPSXHVWR SURGXFH HQ SHUVRQDV VHQVLbles. El caf descafeinado que consumimos en OD DFWXDOLGDG VH REWLHQH PHGLDQWH XQ SURFHVR industrial costoso y que da como resultado un caf con menos sabor. La biosntesis de cafeQD HQ SODQWDV GH FDIp LQYROXFUD WUHV HQ]LPDV &D;07 &D0;07 DPEDV WHREURPLQD VLQWHWDVDV \ &D';07 FDIHtQD VLQWHWDVD TXH DJUHJDQ JUXSRV PHWLORV D OD [DQWRVLQD HQ IRUPD VXFHVLYD SDUD SURGXFLU FDIHtQD /D REWHQFLyQ GH SODQWDV GH FDIp FRQ PHQRU FRQWHQLGR GH FDIHtQD IXH ORJUDGD SRU LQKLELFLyQ GH OD H[SUHVLyQ GH OD HQ]LPD &D0;07 /D H[SUHVLyQ GH OD HQ]LPD IXH LQKLELGD SRU VREUHH[SUHVLyQ GH ARNs de interferencia (ARNi) dirigidos contra OD UHJLyQ QR FRGLFDQWH GHO JHQ CaMXMT1. Las bacterias de A. tumefaciens conteniendo los vectores con las construcciones de ARNi, IXHURQ XVDGDV SDUD WUDQVIRUPDU SODQWDV GH Coffea canephora. En las lneas transformadas se
DQDOL]DURQ ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ GH ODV WUHV HQ]LPDV SRU 573&5 WUDQVFULSFLyQ UHYHUVD UHDFFLyQ HQ FDGHQD GH OD SROLPHUDVD (O UHVXOWDGR LQGLFy QR VyOR OD VXSUHVLyQ GH &D0;07 sino tambin de las otras dos enzimas. Esto se debi a la elevada homologa entre las secuenFLDV FRGLFDQWHV GH ODV HQ]LPDV /D UHGXFFLyQ HQ ORV QLYHOHV GH $51P GH &D;07 &D0;07 \ &D';07 VXJHUtD XQD GLVPLQXFLyQ en la actividad de las enzimas. Esto fue conUPDGR GLUHFWDPHQWH PLGLHQGR ODV FDQWLGDGHV GH VXV SURGXFWRV WHREURPLQD \ FDIHtQD SRU HPLC. Las hojas jvenes de las lneas transIRUPDGDV SUHVHQWDURQ XQD UHGXFFLyQ GHO HQ HO FRQWHQLGR GH WHREURPLQD \ XQ HQ HO FRQWHQLGR GH FDIHtQD /RV DXWRUHV WDPELpQ KDQ ORJUDGR SODQWDV GHVFDIHLQDGDV GH Coffea arabica, HVSHFLH GH OD TXH VH SURGXFH HO GHO FDIp FRPHUFLDOL]DGR PXQGLDOPHQWH utilizando la misma tcnica. 2WUR HMHPSOR GH LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD HQ DOFDORLGHV HV OD REWHQFLyQ GH SODQWDV WUDQVJpQLcas de Papaver somniferum con altos niveles GH PRUQD FRGHtQD \ WHEDtQD (VWRV FRPSXHVWRV VRQ PX\ LPSRUWDQWHV HQ OD LQGXVWULD IDUPDFpXWLFD GHELGR D VXV SURSLHGDGHV DQDOJpVLFDV /D HFLHQFLD GH H[WUDFFLyQ D SDUWLU GH IUXWRV \ WDOORV VHFRV GH HVWH WLSR GH DOFDORLGHV GHSHQGH GH VX QLYHO GH DFXPXODFLyQ HQ OD SODQWD (V SRU eso que el aumento de los niveles de estas susWDQFLDV WUDHUtD FRPR FRQVHFXHQFLD XQ EHQHcio econmico debido al menor uso de tierras, la disminucin costos de extraccin, almaceQDPLHQWR \ WUDQVSRUWH 8QD GH ODV HVWUDWHJLDV XWLOL]DGDV SDUD DXPHQWDU OD FRQFHQWUDFLyQ GH HVWRV DOFDORLGHV IXH OD GH VREUHH[SUHVDU HO JHQ TXH FRGLFD OD HQ]LPD VDOXWDULGLQRO O-acetiltransferasa (SalAT), involucrada en la va de VtQWHVLV GH OD PRUQD \ VXV GHULYDGRV /D VREUHH[SUHVLyQ GH HVWD HQ]LPD HQ OD PD\RUtD GH las lneas transgnicas result en un aumento HQ ODV FRQFHQWUDFLRQHV GH PRUQD FRGHtQD \ tebana en los frutos. La lnea transgnica con PD\RU FRQWHQLGR GH HVWRV FRPSXHVWRV DXPHQWy HQ XQ VX FRQWHQLGR WRWDO GH HVWH WLSR GH alcaloides. Perspectivas de la manipulacin gentica del metabolismo secundario. (Q ORV ~OWLPRV DxRV VH KDQ VREUHH[SUHVDGR QXPHURVRV JHQHV \D VHD HQ VXV SODQWDV GH
RULJHQ R HQ RWUDV HVSHFLHV (Q DOJXQRV FDVRV OD VREUHH[SUHVLyQ UHVXOWy HQ XQ DXPHQWR GH OD DFXPXODFLyQ GH ORV FRPSXHVWRV GHVHDGRV 6LQ embargo, en otros result slo en el aumenWR GH OD HQ]LPD FRGLFDGD SRU HO SURSLR JHQ R SHRU D~Q HQ OD SURGXFFLyQ GH FRPSXHVWRV QR deseados. Estos resultados evidencian la comSOHMLGDG GH ODV UHGHV PHWDEyOLFDV \ OD OLPLWDGD FDSDFLGDG H[LVWHQWH SDUD SUHGHFLU ODV FRQVHFXHQFLDV GH VREUHH[SUHVDU GHWHUPLQDGRV JHQHV HVWUXFWXUDOHV (VWD VLWXDFLyQ SUHYDOHFHUi D~Q SRU FLHUWR WLHPSR HQ WDQWR \ HQ FXDQWR no se cuente con mayor informacin sobre la FRPSRVLFLyQ GH ODV YtDV PHWDEyOLFDV TXH VH GHVHDQ PRGLFDU (Q HVWH VHQWLGR OD XWLOL]DFLyQ GH IDFWRUHV GH WUDQVFULSFLyQ SDUD DFWLYDU YtDV PHWDEyOLFDV FRPSOHWDV SDUHFH VHU DFWXDOPHQWH XQD HVWUDWHJLD SURPHWHGRUD (Q ORV SUy[LPRV DxRV HO SULQFLSDO GHVDItR VHUi REWHQHU PD\RU informacin acerca de la regulacin metablica a todos los niveles: gentico, enzimtico, de la FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ GHO WUDQVSRUWH \ GH OD acumulacin. Dado que los metabolitos secunGDULRV VRQ HVSHFLHHVSHFtFRV OD LQIRUPDFLyQ gentica obtenida de Arabidopsis thaliana ser GH XWLOLGDG OLPLWDGD SRU OR TXH OD VHFXHQFLDFLyQ GH RWUDV HVSHFLHV GH LQWHUpV VHUi GH JUDQ YDORU HQ HVWH FDPSR $ VX YH] VHUi QHFHVDULR integrar los datos obtenidos de los estudios geQyPLFRV FRQ ORV GH ORV HVWXGLRV SURWHyPLFRV \ PHWDEROyPLFRV OR TXH SHUPLWLUi JHQHUDU XQ SDQRUDPD PiV FRPSOHWR GHO FRQMXQWR GH ODV interacciones regulatorias. Cuando el objetivo GH OD PRGLFDFLyQ GHO PHWDEROLVPR VHFXQGDULR sea mejorar la calidad nutricional de un cultivo comestible, ser necesario considerar el riesgo GH TXH OD PRGLFDFLyQ UHDOL]DGD FRQGX]FD D OD SURGXFFLyQ GH FRPSXHVWRV Wy[LFRV QR GHVHDGRV 3DUD SRGHU GLVPLQXLU HVWH ULHVJR VH UHTXLHUH FRQRFHU FRQ OD PD\RU SUHFLVLyQ SRVLEOH HO SHUO GH ORV PHWDEROLWRV TXH SURGXFH OD SODQta, lo que es corrientemente conocido como VX PHWDERORPD 6LQ HPEDUJR QR H[LVWHQ HQ OD DFWXDOLGDG PpWRGRV TXH QRV SHUPLWDQ REWHQHU HVWH SHUO HQ IRUPD FRPSOHWD (Q PXFKRV FDVRV ORV PpWRGRV FURPDWRJUiFRV FRPR OD cromatografa gaseosa y la cromatografa lTXLGD GH DOWD UHVROXFLyQ VHSDUDQ SREUHPHQWH FRPSRQHQWHV FRQ SURSLHGDGHV ItVLFDV PX\ GLVWLQWDV /D HVSHFWURPHWUtD +105 GHO LQJOpV
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy HVSHFWURVFRStD GH UHVRQDQFLD PDJQpWLca nuclear de 1H), que detecta todos los comSXHVWRV SUHVHQWHV FRQ OD PLVPD VHQVLELOLGDG QR SXHGH UHJLVWUDU FRPSXHVWRV PLQRULWDULRV 'H HVWD PDQHUD SDUD HO DQiOLVLV GHO PHWDERloma se debern utilizar simultneamente diferentes mtodos y, a su vez, mejorar las tcnicas actuales. $ SHVDU GHO OLPLWDGR FRQRFLPLHQWR DFWXDO GH las vas metablicas, se han obtenido ya resultados muy interesantes, lo que demuestra el JUDQ SRWHQFLDO GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ OD PRGLFDFLyQ GHO PHWDEROLVPR VHFXQGDULR (VWD FDSDFLGDG VH WUDGXFLUi HQ HO IXWXUR HQ QXPHURVDV DSOLFDFLRQHV HQ FDPSRV WDOHV FRPR molecular farming SURGXFFLyQ GH PROpFXODV GH LQWHUpV HQ RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLcados), fortalecimiento nutricional y resistencia D SDWyJHQRV
Lectura recomendada
*DQWHN 3 0HPHOLQN - 7UDQVFULSWLRQ IDFWRUV WRROV WR HQJLQHHU WKH SURGXFWLRQ RI SKDUPDFRORJLFDOO\ DFWLYH SODQW PHWDEROLWHV Trends Pharmacology Science -Petersen. 2007. Current status of metabolic SK\WRFKHPLVWU\ Phytochemistry, 9HUSRRUWH 5 DQG 0HPHOLQ. - (QJLQHHULQJ VHFRQGDU\ PHWDEROLWH SURGXFWLRQ LQ SODQWV &XUUHQW 2SLQLRQ LQ %LRWHFKQRORJ\
V. CAPTULO 14 Mejoras de calidad en alimentos

Clara Rubinstein y Gabriela Levitus (QWUH ODV DSOLFDFLRQHV ELRWHFQROyJLFDV GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH variedades alimentarias se encuentran ejemSORV YDULDGRV TXH LQFOX\HQ OD ELRIRUWLFDFLyQ GH cultivos con mayores cantidades de nutrientes HVSHFtFRV HO GHVDUUROOR GH YDULHGDGHV FRQ SHUOHV FRPSRVLFLRQDOHV PiV VDOXGDEOHV R VHguros, y el desarrollo de alimentos funcionales, FRQ GHWHUPLQDGD DFWLYLGDG EHQpFD VREUH OD salud. Asimismo, existen numerosos desarrollos TXH DSXQWDQ D PHMRUDU FDUDFWHUtVWLFDV RUJDQROpSWLFDV X RWUDV TXH UHVXOWHQ LPSRUWDQWHV GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GH OD WHFQRORJtD GH DOLPHQWRV R VX FRPHUFLDOL]DFLyQ (Q HVWH FDStWXOR VH UHYLVDUiQ EUHYHPHQWH DOJXQDV GH HVWDV DSOLFDciones, as como los criterios utilizados en la HYDOXDFLyQ GH OD LQRFXLGDG \ DSWLWXG QXWULFLRQDO SDUD HVWH WLSR GH PHMRUDV Si bien el foco de este trabajo es el mejoUDPLHQWR YHJHWDO HV LPSRUWDQWH QRWDU TXH ORV desarrollos biotecnolgicos abarcan a otros RUJDQLVPRV LJXDOPHQWH LPSRUWDQWHV GHVGH HO SXQWR GH YLVWD DOLPHQWDULR \D VHD FRPR PDWHULDV SULPDV R SRUTXH VRQ IXHQWH GH DG\XYDQWHV VXSOHPHQWRV DGLWLYRV R SUHVHUYDQWHV (Q efecto, numerosos microorganismos, as como HVSHFLHV DQLPDOHV SXHGHQ VHU PHMRUDGRV XWLlizando herramientas biotecnolgicas. Estas SXHGHQ LQFOXLU D OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD DXQTXH HV GH SUiFWLFD FRP~Q PHMRUDU ORV PLFURRUJDQLVPRV XWLOL]DGRV HQ ORV SURFHVRV IHUPHQWDWLYRV PHGLDQWH JHQpWLFD FOiVLFD HQ SDUWLFXODU SRU PRWLYRV HFRQyPLFRV GDGRV ORV FRVWRV GH DSUREDFLyQ UHJXODWRULD GH XQ RUJDQLVPR WUDQVJpQLFR \ WDPELpQ SRU XQ WHPD GH DFHSWDFLyQ HQ FLHUWRV PHUFDGRV 8Q HMHPSOR GH OD DSOLcacin de tecnologa recombinante en este FDPSR HV OD PHMRUD REWHQLGD HQ FHSDV EDFWHULDQDV XWLOL]DGDV HQ OD SURGXFFLyQ GH OiFWHRV IHUPHQWDGRV \RJXU TXHVRV HWF (VWDV FHSDV VRQ VHQVLEOHV D OD LQIHFFLyQ SRU IDJRV YLUXV GH EDFWHULDV FDXVDQGR SpUGLGDV HFRQyPLFDV
iPSRUWDQWHV HQ OD LQGXVWULD DOLPHQWDULD +R\ HV SRVLEOH FRQWDU FRQ FHSDV UHFRPELQDQWHV UHVLVtentes a la infeccin viral. En cuanto al mejoramiento animal, el uso de PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HV DFWXDOPHQWH SRVLble como herramienta gracias a los avances en la genmica animal. El uso de tecnologas reFRPELQDQWHV SDUD HVWH Q SXHGH HMHPSOLFDUVH HQ HO GHVDUUROOR GHO VDOPyQ $TXD$GYDQWDJH GH OD HPSUHVD $TXD %RXQW\ )DUPV TXH WLHQH OD FDSDFLGDG GH FUHFHU KDVWD HO WDPDxR SDUD OD FRPHUFLDOL]DFLyQ HQWUH \ NJ HQ XQ DxR \ PHGLR PLHQWUDV TXH ODV SUiFWLFDV GH FUtD FRQYHQFLRQDOHV UHTXLHUHQ GRV D WUHV DxRV SDUD ORJUDU HO PLVPR Q (VWRV QXHYRV VDOPRQHV SRGUtDQ WDPELpQ FRQWULEXLU D XQD SUiFWLFD GH acuicultura ms sustentable, colaborando con OD UHGXFFLyQ GH OD VREUHSHVFD GH HMHPSODUHV VDOYDMHV \ EDMDQGR ORV FRVWRV SDUD ORV FRQVXmidores. /RV HVSHFLDOLVWDV HQ JHQpWLFD DQLPDO WDPELpQ HVWiQ XVDQGR ELRWHFQRORJtD SDUD REWHQHU FDUQHV PiV VDOXGDEOHV FRPR SRU HMHPSOR FDUQHV YDFXQDV \ SRUFLQDV FRQ PHMRUHV SHUOHV de cidos grasos. Finalmente, las tcnicas de clonacin y otras, como la bio-nanotecnologa, tambin DSRUWDUiQ VROXFLRQHV D ORV PHMRUDGRUHV \ D ORV tecnlogos alimentarios en el corto y mediano SOD]R (Q FXDQWR D ODV DSOLFDFLRQHV GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD SDUD HO PHMRUDPLHQWR GH HVSHFLHV vegetales alimentarias, son muy diversos los SUR\HFWRV TXH VH HVWiQ GHVDUUROODQGR /D ELRWHFQRORJtD SXHGH D\XGDU D DXPHQWDU HO YDORU nutritivo y la seguridad de muchos cultivos, en SDUWLFXODU DTXHOORV TXH VRQ OD EDVH GH OD GLHWD HQ PXFKRV SDtVHV HQ GHVDUUROOR %LRIRUWLFDFLyQ /DV GHFLHQFLDV QXWULFLRQDOHV GH ODV GLHWDV afectan seriamente el desarrollo fsico y mental FRQ JUDYHV FRQVHFXHQFLDV SDUD HO UHQGLPLHQWR HGXFDWLYR ODERUDO \ SRU OR WDQWR OLPLWDQGR R UHGXFLHQGR ODV RSRUWXQLGDGHV SDUD DTXHOORV TXH ODV VXIUHQ \ VXV SRWHQFLDOHV FRQWULEXFLRQHV D OD VRFLHGDG /D 2UJDQL]DFLyQ 0XQGLDO SDUD OD 6DOXG 206 KD UHFRQRFLGR TXH HVWDV GHFLHQcias tienen graves efectos sobre la salud y la calidad de vida de al menos dos mil millones GH SHUVRQDV
Una nutricin inadecuada tambin contribuye a una mortalidad infantil aumentada a causa de enfermedades infecciosas, algunas de las FXDOHV QR VHUtDQ IDWDOHV SDUD QLxRV ELHQ DOLmentados. /DV GHFLHQFLDV HQ PLFURQXWULHQWHV FRPR hierro, vitamina A, yodo, zinc y cido flico, DIHFWDQ HVSHFLDOPHQWH D QLxRV \ PXMHUHV HQ HGDG UHSURGXFWLYD UHVXOWDQGR HQ XQD PRUELOLGDG \ PRUWDOLGDG LPSRUWDQWHV (Q HVWH VHQWLGR HV REYLR TXH OD UHVROXFLyQ GH HVWRV SUREOHPDV HQ HO ODUJR SOD]R \ D JUDQ HVFDOD VH DOFDQ]DUi ~QLFDPHQWH FXDQGR VHD SRVLEOH DFFHGHU D XQD dieta variada, balanceada y abundante. Algunos nutrientes clave suelen aadirse directamente a los alimentos en el momento GH OD HODERUDFLyQ DXQTXH HV SRVLEOH WDPELpQ enriquecerlos indirectamente, es decir, a travs del mejoramiento vegetal. Esto es lo que se deQRPLQD ELRIRUWLFDFLyQ WpUPLQR GHQLGR SRU HO &2'(; HQ FRPR OD DGLFLyQ LQGLUHFWD GH nutrientes esenciales u otras sustancias a los DOLPHQWRV FRQ HO Q GH ORJUDU XQD PHMRUD GH OD nutricin o de la salud. Es interesante resaltar que la reunin de &RQVHQVR GH &RSHQKDJHQ GH HQ OD TXH se reunieron economistas de todo el mundo SDUD SRQGHUDU ORV GHVDItRV JOREDOHV \ HVWDEOHFHU VROXFLRQHV SULRULWDULDV FRQFOX\y TXH OD ELRIRUWLFDFLyQ HV XQD GH ODV SRVLELOLGDGHV PiV DSOLFDEOHV D OD VROXFLyQ GH ODV GHFLHQFLDV QXWULFLRQDOHV UHVSHFWR GH RWUDV HVWUDWHJLDV FRQVLGHUDQGR TXH FRQ PLOORQHV GH GyODUHV HV SRVLEOH FXEULU /D VXSOHPHQWDFLyQ FRQ YLWDPLQD $ SDUD XQ DxR SDUD PLOORQHV GH FKLFRV HQ HGDG SUHHVFRODU HQ %DQJODGHVK ,QGLD \ Pakistn. /D IRUWLFDFLyQ FRQ KLHUUR SDUD XQ DxR SDUD PLOORQHV GH SHUVRQDV DSUR[LPDGDPHQWH XQ GH OD SREODFLyQ GH Bangladesh, India, y Pakistn. El desarrollo y difusin de variedades PHMRUDGDV ELRIRUWLFDFLyQ SRU PpWRGRV convencionales o utilizando marcadores moleculares) de arroz y trigo ricas en hieUUR \ ]LQF SDUD HO 6XGHVWH $VLiWLFR TXH HVWDUtDQ GLVSRQLEOHV DxR WUDV DxR D WUDvs de la semilla.
La transformacin gentica mediante tecnologas de ADN recombinante es uno de los insWUXPHQWRV TXH SXHGHQ XVDUVH SDUD ELRIRUWLFDU ODV PDWHULDV SULPDV DOLPHQWLFLDV \D TXH SHUPLWH DO DQLPDO R D OD SODQWD SURGXFLU HO QXWULHQWH DGLFLRQDO FRPR SRU HMHPSOR EHWD FDURWHQR HQ HO DUUR] 2WUR HMHPSOR GH HVWDV LQLFLDWLYDV HV HO GHVDUUROOR OOHYDGR DGHODQWH SRU FLHQWtFRV GH OD Universidad de Nehru en la India, que utilizaron XQ JHQ LGHQWLFDGR HQ HO DPDUDQWR VXGDPHULFDQR SDUD DXPHQWDU HO FRQWHQLGR GH SURWHtQDV GH OD SDSD HQ XQ \ WDPELpQ HO QLYHO GH DPLQRiFLGRV HVHQFLDOHV QRUPDOPHQWH QR SUHsentes en las variedades convencionales. El caso del arroz dorado: &HUFD GHO GH OD SREODFLyQ PXQGLDO EDVD su dieta en cereales. El arroz es el cereal ms LPSRUWDQWH SDUD OD QXWULFLyQ KXPDQD \ SURYHH HO GH OD LQJHVWD GH HQHUJtD GH OD SREODcin asitica. El maz est en tercer lugar desSXpV GHO WULJR FRPR XQR GH ORV WUHV FXOWLYRV PiV LPSRUWDQWHV 6L ELHQ HO JUDQR GH PDt] HV XVDGR IXQGDPHQWDOPHQWH SDUD DOLPHQWDFLyQ DQLPDO HQ ORV SDtVHV GHVDUUROODGRV HV OD EDVH GLHWDULD HQ PXFKRV SDtVHV GH $PpULFD /DWLQD \ IULFD 2WURV FXOWLYRV FRPR OD EDWDWD R SDSD GXOFH VRQ FXOWLYRV VHFXQGDULRV WDPELpQ LPSRUWDQWHV SDUD SDtVHV GH (XURSD GHO (VWH \ IULFD \ HQ SDUWLFXODU SDUD ORV DJULFXOWRUHV GH VXEVLVWHQFLD /D PD\RU SDUWH GH ORV FXOWLYRV \ SRU lo tanto los alimentos derivados de ellos, son GHFLHQWHV HQ XQR R PiV QXWULHQWHV HVHQFLDOHV DTXHOORV TXH GHEHQ VHU LQFRUSRUDGRV D WUDYpV de la dieta). Por esto, la dieta de mucha genWH TXH GHSHQGH GH HVWRV FXOWLYRV HQ SDtVHV HQ GHVDUUROOR UHVXOWD GHFLHQWH \ HV SRFR GLYHUVD OR TXH DXPHQWD ORV ULHVJRV GH GHFLHQFLDV QXtricionales. El arroz dorado (Golden Rice), denominado DVt SRU VX FRORU iPEDU HV XQ HMHPSOR GH HVWH WLSR GH PRGLFDFLRQHV \ IXH GHVDUUROODGR SDUD H[SUHVDU SURYLWDPLQD $ EHWDFDURWHQR HQ DOtas cantidades, con la idea de contribuir a aliYLDU ODV GHFLHQFLDV HQ YLWDPLQD $ HQ SDtVHV GHO sudeste asitico y otros. Actualmente, est en desarrollo el llamado *ROGHQ 5LFH OD VHJXQGD JHQHUDFLyQ GH HVWH DUUR] TXH H[SUHVD PD\RUHV FDQWLGDGHV GH EHWDFDURWHQR UHVSHFWR GH OD SULPHUD YHU-
VLyQ XQDV YHFHV PiV \ TXH SHUPLWLUtD TXH FRQ GH WD]D JUDPRV VH SURYHDQ de la ingesta diaria recomendada de vitamina $ SDUD QLxRV HQ HGDG SUHHVFRODU 3DUD ORJUDU HVWD PRGLFDFLyQ VH LQVHUWDURQ dos genes: el gen psy GH OD WRHQR VLQWHWDVD de maz y el gen crtl FRGLFDQWH SDUD OD FDURWHno desaturasa de la bacteria Erwinia uredovora (Figura 1).
a retinol. Esta bio-conversin es variable, de DFXHUGR D IDFWRUHV TXH GHSHQGHQ GHO WLSR GH FDURWHQRLGH OD PDWUL] HQ OD FXDO HV LQFRUSRUDdo, el estado nutricional del consumidor, etc. /D ELRGLVSRQLELOLGDG GHO EHWDFDURWHQR H[SUHVDGR HQ HO *ROGHQ 5LFH VH KD HYDOXDGR \ VH HVWLPD TXH JUDPRV GH DUUR] FUXGR SRGUtDQ SURYHHU HO GH OD LQJHVWD UHFRPHQGDGD HQ ORV ((88 SDUD ODFWDQWHV GH D DxRV GH HGDG /D SRUFLyQ GH DUUR] FRQYHQFLRQDO SURPHGLR SDUD XQ QLxR GH HVD HGDG HQ 7DLODQGLD SRU HMHPSOR HV GH JUDPRV La evaluacin de inocuidad de este evento sigue las recomendaciones del Codex Alimentarius, utiliza al arroz convencional como comSDUDGRU \ H[DPLQD ULHVJRV \ EHQHFLRV SRWHQciales. Las evidencias hasta el momento recoSLODGDV SDUD HVWH HYHQWR LQGLFDQ TXH /D FRPSRVLFLyQ JOREDO GHO *ROGHQ Rice 2, de acuerdo con las recomendaciones de la OECD (Organizacin SDUD OD &RRSHUDFLyQ \ HO 'HVDUUROOR Econmico), no se ha alterado, exFHSWR HQ OD YtD PHWDEyOLFD PRGLFDGD VHJ~Q OR HVSHUDGR (O DQiOLVLV ELRLQIRUPiWLFR GH OD toenodesaturasa de Erwinia no muestra relacin con alrgenos, toxinas o anti-nutrientes. /D WRHQR VLQWHWDVD GH Zea mays es comnmente consumida, es decir, tiene historia de uso seguro en alimentacin. (O EHWD FDURWHQR HVWi ELRGLVSRQLEOH
Figura 1. ,QVHUWR SUHVHQWH HQ HO *ROGHQ 5LFH
6H XWLOL]y OD WUDQVIRUPDFLyQ PHGLDGD SRU Agrobacterium tumefaciens SDUD LQWURGXFLU OD construccin en arroz (Oryza sativa). El sistema de seleccin utilizado fue el mtodo de la fosfomanosa isomerasa de E. coli (PMI), un sistema alternativo al uso de genes de resistenFLD D DQWLELyWLFRV (VWH VLVWHPD SHUPLWH D ORV WHjidos vegetales en cultivo utilizar manosa como IXHQWH SULQFLSDO GH FDUERQR QR GLVSRQLEOH SDUD ODV SODQWDV SRUTXH FDUHFHQ GH OD HQ]LPD 30, /D WRHQR VLQWHWDVD FDWDOL]D HO SDVR OLPLWDQWH GH OD ELRVtQWHVLV GH FDURWHQRLGHV HQ SODQWDV UHVXOWDQGR OD GHO PDt] OD PiV HFLHQWH GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GH OD DFXPXODFLyQ GH FDURtenoides totales y beta-caroteno en arroz. De hecho, el Golden Rice 1 contiene cerca de J GH FDURWHQRLGHV WRWDOHVJUDPR GH SHVR seco de grano, mientras que el Golden Rice 2 FRQWLHQH KDVWD JJUDPR GH SHVR VHFR GH JUDQR GH ORV FXDOHV JJ HV FDURWHQR 1LQJ~Q FXOWLYDU GH DUUR] SURGXFH FDURWHQRLGHV HQ HO HQGRVSHUPD VL ELHQ SXHGHQ SURGXFLU HO SUHFXUVRU JHUDQLOJHQDULO GLIRVIDWR /D WRHQR VLQWHWDVD FRQYLHUWH HVWH FRPSXHVWR D WRHQR HO SUHFXUVRU LQPHGLDWR GHO EHWDFDURWHQR HQ SODQWDV 3DUD SRGHU VHU XWLOL]DGD FRPR YLWDPLQD $ HO beta-caroteno debe ser absorbido y convertido
Figura 2: &RPSDUDFLyQ HQWUH HO DUUR] FRQYHQFLRQDO (izq), Golden Rice 1 (centro) y Golden Rice (der). 7RPDGR GH 3DLQH HW DO
Alimentos ms saludables o seguros 0RGLFDFLyQ HQ OD FRPSRVLFLyQ GH ORV aceites <D H[LVWHQ HQ HO PHUFDGR GLIHUHQWHV YDULHGDGHV GH ROHDJLQRVDV TXH SURGXFHQ DFHLWHV FRQ SHUOHV GH iFLGRV JUDVRV PiV VDOXGDEOHV DOJXQDV GH HOODV WUDQVJpQLFDV /DV PRGLFDFLRQHV LQWURGXFLGDV DSXQWDQ D REWHQHU PHQRU FDQWLGDG de cidos grasos saturados (los menos saludaEOHV \ HQULTXHFHU OD FRPSRVLFLyQ GH ORV DFHLWHV HQ iFLGRV JUDVRV PRQR R SROLLQVDWXUDGRV PiV GHVHDEOHV GHVGH HVWH SXQWR GH YLVWD (VWDV PRGLFDFLRQHV LQWURGXFHQ SDVRV PHWDEyOLFRV DXVHQWHV R ELHQ VLOHQFLDQ SDUWHV GH XQD va metablica, logrando derivar la sntesis a ORV SURGXFWRV GHVHDGRV 3RU HMHPSOR VH KD ORJUDGR OD FRQYHUVLyQ de cido linoleico en cidos omega 3 similaUHV D ORV HQFRQWUDGRV HQ DFHLWHV GH SHVFDGR DVRFLDGRV FRQ EHQHFLRV SDUD OD VDOXG FDUGLRYDVFXODU 'HO PLVPR PRGR HV SRVLEOH HYLWDU R eliminar la hidrogenacin industrial de los aceiWHV TXH JHQHUD ODV LQGHVHDEOHV JUDVDV WUDQV de conocidos efectos negativos sobre la salud. (O SURFHVR GH KLGURJHQDFLyQ HV QHFHVDULR SDUD HVWDELOL]DU ORV DFHLWHV R SDUD FRQVHJXLU JUDVDV VyOLGDV SDUD GLIHUHQWHV DSOLFDFLRQHV DOLPHQWDrias. Reducir el nivel de cido linolnico o bien aumentar la cantidad de cidos grasos como el esterico, son dos de las estrategias de mejoUDPLHQWR XWLOL]DGDV SRU ORV LQYHVWLJDGRUHV TXH estn desarrollando estas semillas. Eliminacin de alrgenos y toxinas (Q FXDQWR DO SRWHQFLDO DOHUJpQLFR GH FLHUWRV DOLPHQWRV OD ELRWHFQRORJtD WDPELpQ SXHGH FRQtribuir a mejorar la seguridad de las materias SULPDV (O GH ODV DOHUJLDV DOLPHQWDULDV SXHGH VHU DWULEXLGD D XQ JUXSR GH RFKR DOLPHQtos, entre los que se encuentran el man, la leFKH OD VRMD HO SHVFDGR HO KXHYR HWF 1R VyOR VH KDQ KHFKR JUDQGHV SURJUHVRV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH XQD VHULH GH SURWHtQDV DOHUJpQLFDV UHVSRQVDEOHV GH HVWDV LQWROHUDQFLDV VLQR TXH tambin se ha tenido xito en bloquear o eliPLQDU JHQHV FRGLFDQWHV SDUD DOpUJHQRV (Q efecto, las tcnicas de silenciamiento mediado
SRU $51 GH LQWHUIHUHQFLD KDQ VLGR DSOLFDGDV D OD UHGXFFLyQ GH DOpUJHQRV HQ GLIHUHQWHV HVSHFLHV FRPR OD SURWHtQD 3 GH VRMD HO DOpUJHQR GH DUUR] GH NGD R ODV SURWHtQDV /\F H Lyc e 3 de tomate. Asimismo, existen desarrollos que se enfocan en la eliminacin de toxinas naturalmenWH SUHVHQWHV HQ DOJXQRV FXOWLYRV DOLPHQWDULRV FRPR ORV JOLFRDOFDORLGHV GH OD SDSD R ORV FRPSXHVWRV FLDQRJpQLFRV GH OD PDQGLRFD El caso del man Utilizando la tecnologa de ARN de interfeUHQFLD HV SRVLEOH VLOHQFLDU D ORV DOpUJHQRV PiV SRWHQWHV GHO PDQt 8Q WUDEDMR UHFLHQWH PRVWUy TXH HV SRVLEOH VXSULPLU OD H[SUHVLyQ GH $UD K \ $UD K HQ IRUPD HVSHFtFD XWLOL]DQGR HVWD tecnologa. 6H KDQ LGHQWLFDGR RQFH SURWHtQDV DOHUJpnicas en el man (denominadas Arah 1- 11). (QWUH pVWDV $UD K \ $UD K VH KDQ UHFRQRFLGR FRPR ORV DOpUJHQRV PiV SRWHQWHV (QWUH XQ \ XQ GH ORV SDFLHQWHV DOpUJLFRV DO PDQt SUHVHQWDQ DQWLFXHUSRV ,J( HVSHFtFRV DQWL$UDK \ \ HO UHFRQRFLPLHQWR GH HVWRV DOpUJHQRV SHUVLVWH SRU PiV GH XQ DxR OXHJR GHO desafo alimentario en nios. Los genes codiFDQWHV SDUD HVWRV SROLSpSWLGRV IXHURQ VLOHQFLDGRV HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV \ ODV SUXHEDV GH XQLyQ D LQPXQRJOREXOLQD ( FRQUPDURQ XQD reduccin en el binding D HVWDV SURWHtQDV VHJ~Q OR HVSHUDGR VXJLULHQGR TXH HVWDV WpFQLFDV FRQVWLWX\HQ XQD HVWUDWHJLD SURPLVRULD SDUD GHVDUUROODU PDQt \ RWURV FXOWLYRV KLSRDOHUJpQLFRV 0RGLFDFLRQHV IXQFLRQDOHV Adems de agregar nuevos nutrientes, es SRVLEOH WDPELpQ DXPHQWDU ORV EHQHFLRV SDUD OD salud de los denominados alimentos funcionales. Estos son alimentos que contienen niveles VLJQLFDWLYRV GH FRPSRQHQWHV ELROyJLFDPHQWH DFWLYRV TXH FRQHUHQ EHQHFLRV TXH YDQ PiV all de cubrir las necesidades bsicas de caloras, aminocidos o cidos grasos esenciaOHV YLWDPLQDV R PLQHUDOHV $OJXQRV HMHPSORV de alimentos considerados funcionales, son la FHEROOD \ HO DMR GHELGR D FRPSRQHQWHV TXH DXPHQWDQ OD UHVSXHVWD LQPXQH R UHGXFHQ HO FROHVWHURO R ELHQ ORV JOXFRVLQRODWRV SUHVHQWHV HQ ODV FROHV TXH HVWLPXODQ HQ]LPDV FRQ SURSLHdades anti-cancergenas. Del mismo modo, los antioxidantes encontrados en alimentos como
el t verde, el vino, el chocolate, etc., son tamELpQ FRQVLGHUDGRV FRPSRQHQWHV IXQFLRQDOHV El caso del tomate Investigadores de la Universidad de Purdue \ GHO 'HSDUWDPHQWR GH $JULFXOWXUD GH ORV ((88 lograron tomates que contienen una cantidad WUHV YHFHV PD\RU GHO DQWLR[LGDQWH OLFRSHQR TXH las variedades convencionales. El consumo de OLFRSHQR VH KD DVRFLDGR FRQ XQ PHQRU ULHVJR GH FiQFHU GH SUyVWDWD \ PDPD \ FRQ PHQRUHV QLYHOHV HQ VDQJUH GH FROHVWHURO PDOR Tambin en tomate, se est trabajando en el aumento de antocianinas, del mismo modo DVRFLDGDV D QXPHURVRV HIHFWRV EHQpFRV SDUD la salud. Dos genes (Del y Ros1) originarios GHO JHQRPD GH XQD SODQWD RUQDPHQWDO FRQHjito, Antirrhinum majus) fueron introducidos en SODQWDV GH WRPDWH FRQYHQFLRQDO (VWRV JHQHV LQGXFHQ OD H[SUHVLyQ GH HQ]LPDV FODYH HQ OD VtQWHVLV \ HO WUDQVSRUWH GH DQWRFLDQLQDV D ODV vacuolas de las clulas del tejido que conforma OD SXOSD GHO WRPDWH (O UHVXOWDGR QDO HV XQ DXmento de tres veces en el contenido de estas DQWRFLDQLQDV TXH VH UHHMD HQ HO FRORU YLROHWD R S~USXUD GH HVWRV WRPDWHV )LJXUD (V LPSRUtante aclarar que no hay variedades de tomate WUDQVJpQLFR GLVSRQLEOHV HQ HO PHUFDGR D~Q QL estas ni otras), y que estos desarrollos se enFXHQWUDQ HQ IDVH H[SHULPHQWDO De manera similar, se est trabajando en OD 86'$ SDUD DXPHQWDU HO FRQWHQLGR GH iFLGR HOiJLFR HQ IUXWLOODV XQ FRPSXHVWR SURWHFWRU contra el cncer. 2WUDV PRGLFDFLRQHV
Las tcnicas biotecnolgicas se estn utiOL]DQGR DPSOLDPHQWH SDUD REWHQHU PHMRUHV caractersticas en alimentos e ingredientes, \D VHD SDUD IDFLOLWDU ORV SURFHVRV LQGXVWULDOHV R KDFHUORV PiV DWUDFWLYRV SDUD ORV FRQVXPLdores. Prolongar la vida til de frutas y vegetales, crear variedades sin semillas, extender OD GLVSRQLELOLGDG JHRJUiFD GH IUXWDV GH HVWDFLyQ PHMRUDU HO VDERU \ OD WH[WXUD GH SURGXFWRV FRPR WRPDWHV SLPLHQWRV R SHUDV \ FUHDU variedades de t y caf libres de cafena, son WRGDV PHMRUDV SRVLEOHV PHGLDQWH OD DSOLFDFLyQ de estrategias biotecnolgicas, algunas de las cuales incluyen a la ingeniera gentica como herramienta. 3RU HMHPSOR XQD HVWUDWHJLD XWLOL]DGD SDUD PHMRUDU OD FDOLGDG GH ODV SDSDV HV PRGLFDU OD UHODFLyQ DOPLGyQDJXD /DV SDSDV FRQ XQ PDyor contenido de almidn son ms saludables SRUTXH DEVRUEHQ PHQRV DFHLWH DO IUHtUODV \ UHTXLHUHQ PHQRV HQHUJtD SDUD VX SURFHVDPLHQWR 2WUR HMHPSOR HV HO XVR GH WRPDWHV REWHQLdos mediante variacin somaclonal que contieQHQ XQ PHQRV DJXD \ SXHGHQ SURFHVDUVH GH PDQHUD PiV HFLHQWH SDUD SURGXFLU VRSDV SDVWD GH WRPDWH R NHWFKXS (Q FXDQWR D OD SURORQJDFLyQ GH OD YLGD ~WLO SRVWFRVHFKD VH KDQ GHVDUUROODGR WRPDWHV \ frambuesas de maduracin retardada, utilizando tcnicas de control de etileno) La siguiente tabla muestra los numerosos cultivos y mejoras que se encuentran en etaSDV GH H[SHULPHQWDFLyQ \R GH GHVDUUROOR Lecturas y sitios recomendados
ArgenBio www.argenbio.org Batista J et al, 2007. Evaluacin de inocuidad alimentaria de organismos genticamente PRGLFDGRV &ULWHULRV \ UHFXUVRV SDUD VX LPSOHPHQWDFLyQ 818%LRODF51%LR,/6, GLVSRQLEOH HQ www.ilsi.org.ar. Biotecnologa) %RXLV + 7KH SRWHQWLDO RI JHQHWLFDOO\ PRGLHG IRRG FURSV WR LPSURYH KXPDQ QXWULWLRQ LQ GHYHORSLQJ FRXQWULHV - 'HY 6WXG Butelli E et al., Enrichment of tomato fruit with healthSURPRWLQJ DQWKRF\DQLQV E\ H[SUHVVLRQ RI VHOHFW WUDQVFULSWLRQ IDFWRUV 1DW %LRWHFKQRO &KX < )DXVWLQHOOL 35 DPRV 0/ +DMGXFK 0 Stevenson S, Thelen JJ, Maleki SJ, Cheng H y Ozias-Akins P. Reduction of IgE Binding
Figura 3: Tomates violeta con alto contenido de DQWRFLDQLQDV \ WRPDWHV URMRV VLQ PRGLFDU )RWR GHO Centro John Innes Centre
DQG QRQSURPRWLRQ RI $VSHUJLOOXV )ODYXV IXQJDO JURZWK E\ VLPXOWDQHRXVO\ VLOHQFLQJ $UDK DQG $UDK LQ SHDQXW -RXUQDO RI $JULFXOWXUDO DQG )RRG &KHP Codex Alimentarius KWWSZZZFRGH[DOLPHQWDULXV QHWZHELQGH[BHVMVS &RSHQKDJHQ &RQVHQVXV www. FRSHQKDJHQFRQVHQVXVFRP &XUUHQW 2SLQLRQ LQ %LRWHFKQRORJ\ Golden Rice www.goldenrice.org *UDQW 5 :KHUHV WKH 6XSHU )RRG" 7KH Scientist, 9ROXPH ,VVXH 3DJH Harvest Plus ZZZKDUYHVWSOXVRUJ ILSI www.ilsi.org y www.ilsi.org.ar ILSI, IFBIC: Nutritional and Safety Assessments of )RRGV DQG )HHGV 1XWULWLRQDOO\ ,PSURYHG WKURXJK Biotechnology: Case Studies. J. Food Science DQG &RPS 5HY )RRG 6FL )RRG 6DI Informe de la OMS: Modern Food Biotechnology, Human Health and Development: An EvidenceBased Study, 2005. www.who.int/foodsafety . .LQQH\ $- 0HWDEROLF HQJLQHHULQJ LQ SODQWV IRU human health and nutrition, Morris J. et al., 1XWULWLRQDO LPSDFW RI HOHYDWHG FDOFLXP WUDQVSRUW DFWLYLW\ LQ FDUURWV 31$6 3DLQH -$ HW DO ,PSURYLQJ WKH QXWULWLRQDO YDOXH RI
*ROGHQ 5LFH WKURXJK LQFUHDVHG SURYLWDPLQ $ FRQWHQW 1DW %LRWHFK 7DQJ * HW DO *ROGHQ 5LFH LV DQ HIIHFWLYH VRXUFH of vitamin A, $P - &OLQ 1XWU The Guide to Biotechnology 2008, Biotechnology Industry Organization (BIO), Editors Roxanna Guilford-Blake, Debbie Strickland. www.bio.org Unnevehr L, Pray C, Paarlberg R. 2007. $GGUHVVLQJ PLFURQXWULHQW GHFLHQFLHV DOWHUQDWLYH interventions and technologies. AgBioForum 8UVLQ 9 0RGLFDWLRQ RI 3ODQW /LSLGV IRU +XPDQ +HDOWK 'HYHORSPHQW RI )XQFWLRQDO /DQG%DVHG 2PHJD )DWW\ $FLGV 6\PSRVLXP ,PSURYLQJ Human Nutrition through Genomics, Proteomics and Biotechnologies. Journal of Nutrition. 133: 4271-4274. <H ; HW DO (QJLQHHULQJ WKH SURYLWDPLQ $ EHWD FDURWHQH ELRV\QWKHWLF SDWKZD\ LQWR FDURWHQRLG IUHH ULFH HQGRVSHUP 6FLHQFH
V. CAPTULO 15 Fitorremediacin
0DUtD (XJHQLD 6HJUHWLQ 3DXOD %H\ \ Alejandro Mentaberry $PEDV DXWRUDV FRQWULEX\HURQ SRU LJXDO Introduccin La autotrofa es una de las caractersticas PiV LPSRUWDQWH GH ODV SODQWDV GDGR TXH OHV SHUPLWH XWLOL]DU OD HQHUJtD VRODU \ HO &22 como IXHQWHV GH HQHUJtD \ FDUERQR UHVSHFWLYDPHQWH &RPR FRQVHFXHQFLD ODV PLVPDV GHSHQGHQ GH VXV UDtFHV SDUD LQFRUSRUDU DJXD GHO PHGLR TXH ODV URGHD \ FRQ HOOD FRPSXHVWRV PLQHUDles, nitrgeno y otros nutrientes. Junto con sWRV ODV SODQWDV DEVRUEHQ FRPSXHVWRV Wy[LFRV GH RULJHQ YDULDGR SRU OR TXH D OR ODUJR GH OD evolucin, han generado mecanismos de deWR[LFDFLyQ TXH OHV SHUPLWHQ VREUHYLYLU HQ DPELHQWHV DGYHUVRV (VWRV PHFDQLVPRV SXGLHURQ KDEHUVH RULJLQDGR D SDUWLU GH VLVWHPDV QDWXUDles de defensa contra aleloqumicos liberados SRU RUJDQLVPRV FRPSHWLGRUHV LQFOX\HQGR PLFURRUJDQLVPRV LQVHFWRV \ RWUDV SODQWDV /D WRUUHPHGLDFLyQ FRQVLVWH HQ OD XWLOL]DFLyQ GH ODV SODQWDV \ GH ORV PLFURRUJDQLVPRV DVRFLDGRV D ODV PLVPDV FRQ QHV GH GHVFRQtaminacin del medio ambiente. En este conWH[WR ODV SODQWDV SXHGHQ FRQVLGHUDUVH FRPR sistemas naturales de extraccin y tratamiento de contaminantes. A diferencia de los mtodos de tratamiento tradicionales, la energa requeULGD SDUD VX IXQFLRQDPLHQWR SURYLHQH GHO VRO HO costo de mantenimiento es reducido y los efectos indeseados son mnimos. Muchas actividades humanas, como la miQHUtD OD DJULFXOWXUD OD LQGXVWULD \ ODV RSHUDFLRQHV PLOLWDUHV KDQ SURYRFDGR OD FRQWDPLQDFLyQ GH JUDQGHV VXSHUFLHV LQFOX\HQGR VLWLRV FRQ DOWRV QLYHOHV GH FRQFHQWUDFLyQ GH FRPSXHVWRV Wy[LFRV SRU HMHPSOR OXHJR GH XQ GHUUDPH DFcidental) o con niveles escasamente detectaEOHV /XHJR GH ODUJRV SHUtRGRV GH H[SRVLFLyQ HVWRV ~OWLPRV SXHGHQ VHU SHUMXGLFLDOHV SDUD OD salud humana y de otros organismos debido a HIHFWRV DFXPXODWLYRV /RV SURFHGLPLHQWRV DFWXDOPHQWH XWLOL]DGRV SDUD HO WUDWDU VLWLRV FRQWD-
minados son muy caros y, como consecuencia GH HOOR PXFKRV WHUUHQRV SULYDGRV VH DEDQGRnan en lugar de remediarse. Solamente en EsWDGRV 8QLGRV VH JDVWDQ HQWUH \ PLOORQHV GH GyODUHV DQXDOHV SDUD HO WUDWDPLHQWR de zonas contaminadas, valores que, a escala PXQGLDO DOFDQ]DQ VXPDV GH \ millones de dlares. /RV PpWRGRV DFWXDOPHQWH XWLOL]DGRV SDUD OD UHPHGLDFLyQ DPELHQWDO VH SXHGHQ FODVLFDU HQ VLFRTXtPLFRV \ ELROyJLFRV /RV PpWRGRV VLFRTXtPLFRV LQFOX\HQ OD H[FDYDFLyQ WUDQVSRUWH y lavado de suelos, la extraccin, bombeo y tratamiento de aguas contaminadas y el trataPLHQWR GH DJXDV FRQWDPLQDGDV PHGLDQWH SUHFLSLWDFLyQ LQWHUFDPELR LyQLFR yVPRVLV UHYHUVD \ PLFUROWUDFLyQ 7RGRV HVWRV SURFHGLPLHQWRV VRQ DOWDPHQWH FRVWRVRV H LPSUDFWLFDEOHV VL VH WUDWD GH JUDQGHV VXSHUFLHV GH WLHUUD R YRO~PHnes de agua. Los mtodos biolgicos ms utilizados se basan agregar o estimular el crecimiento de bacterias que degraden o transformen el contaminante a tratar. Para que este enfoque resulte exitoso, se deben considerar factores WDOHV FRPR OD FDSDFLGDG GH VXSHUYLYHQFLD GH los microorganismos, la accesibilidad o bioGLVSRQLELOLGDG GHO FRPSXHVWR FRQWDPLQDQWH \ OD SUHVHQFLD GH LQGXFWRUHV GH ODV UHVSHFWLYDV DFWLYLGDGHV HQ]LPiWLFDV 0XFKRV FRPSXHVWRV orgnicos son recalcitrantes a la degradacin \ QR SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV FRPR IXHQWH GH FDUERQR SRU ORV PLFURRUJDQLVPRV LQYROXFUDGRV Adems, los contaminantes son generalmenWH PHWDEROL]DGRV SRU HQ]LPDV TXH XWLOL]DQ RWUR VXVWUDWR QDWXUDO SRU OR TXH OD SUHVHQFLD GH pVWH SXHGH VHU QHFHVDULD SDUD LQGXFLU OD H[SUHVLyQ GH ORV JHQHV FRUUHVSRQGLHQWHV 3RU RWUD SDUWH HO p[LWR GH XQ SURFHVR GH ELRUUHPHGLDFLyQ GHSHQGH GH OD SUHVHQFLD GH IXHQWHV GH FDUERQR \ HQHUJtD VXFLHQWHV HQ HO VLWLR D WUDWDU SRU OR que usualmente se requiere adicionar consideUDEOHV FDQWLGDGHV GH QXWULHQWHV SDUD SURPRYHU el crecimiento bacteriano. /D WRUUHPHGLDFLyQ DSOLFDFLRQHV ventajas y desventajas /D WRUUHPHGLDFLyQ HV XQD WpFQLFD GH UHFLHQWH GHVDUUROOR TXH SHUPLWH GHVFRQWDPLQDU GH PDQHUD HFLHQWH FRPSXHVWRV Wy[LFRV RUJiQL-
cos e inorgnicos. La mayora de los contamiQDQWHV RUJiQLFRV VRQ JHQHUDGRV SRU OD DFFLyQ del hombre, siendo muchos de ellos carcinoJpQLFRV 6H SURGXFHQ FRPR FRQVHFXHQFLD GH derrames (combustibles y solventes) y activiGDGHV DJUtFRODV SHVWLFLGDV KHUELFLGDV LQGXVWULDOHV GHVKHFKRV TXtPLFRV \ SHWURTXtPLFRV R PLOLWDUHV H[SORVLYRV \ DUPDV TXtPLFDV 'HSHQGLHQGR GH VXV SURSLHGDGHV SXHGHQ VHU GHJUDGDGRV HQ OD UDt] GH OD SODQWD R LQFRUSRUDGRV D WDOORV \ KRMDV SDUD VX GHJUDGDFLyQ VHFXHVWUR R YRODWLOL]DFLyQ $OJXQRV HMHPSORV GH FRPSXHVWRV RUJiQLFRV HFLHQWHPHQWH GHVFRQWDPLQDGRV SRU WRUUHPHGLDFLyQ LQFOX\HQ VROYHQWHV RUJiQLcos (tricloroetileno), herbicidas (atrazina), exSORVLYRV WULQLWURWROXHQR KLGURFDUEXURV GHULYDGRV GHO SHWUyOHR JDVROLQD EHQFHQR WROXHQR KLGURFDUEXURV DURPiWLFRV SROLFtFOLFRV \ ELIHQLORV SROLFORULQDGRV GLR[LQDV SROLHWLOHQR HQWUH RWURV (Q FRPSDUDFLyQ FRQ ORV FRQWDPLQDQWHV inorgnicos, son relativamente menos txicos SDUD ODV SODQWDV \D TXH VRQ PHQRV UHDFWLYRV \ no se acumulan. /RV FRQWDPLQDQWHV LQRUJiQLFRV SXHGHQ HVWDU SUHVHQWHV QDWXUDOPHQWH HQ OD FRUWH]D WHUUHVWUH y/o en la atmsfera, o resultar de actividades humanas como la minera, la industria, el transSRUWH \ OD DJULFXOWXUD $ GLIHUHQFLD GH ORV FRPSXHVWRV RUJiQLFRV QR SXHGHQ VHU GHJUDGDGRV SRU ODV SODQWDV SHUR SXHGHQ DFXPXODUVH HQ ODV SDUWHV FRVHFKDEOHV GH ODV PLVPDV $OJXQRV HMHPSORV H[LWRVRV GH WRUUHPHGLDFLyQ GH HVWD clase de contaminantes incluyen, entre otros, macronutrientes vegetales (nitratos y fosfatos), elementos traza (Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, 9 \ : H LVyWRSRV UDGLRDFWLYRV U, 137Cs y 90 6U 0XFKRV GH HVWRV FRPSXHVWRV VRQ QRUPDOPHQWH QHFHVDULRV SDUD HO GHVDUUROOR GH ODV SODQWDV SHUR FXDQGR VH DFXPXODQ HQ H[FHVR generan estrs oxidativo daando a las clulas vegetales. Ms all de la naturaleza qumica del conWDPLQDQWH OD WRUUHPHGLDFLyQ SXHGH XWLOL]DUVH SDUD GHWR[LFDU VXVWUDWRV GH QDWXUDOH]D VyOLGD OtTXLGD R JDVHRVD (QWUH ODV SULQFLSDOHV DSOLFDFLRQHV GH HVWD WpFQLFD SXHGHQ PHQFLRQDUVH HO tratamiento de: Sustratos slidos: sitios militares (metaOHV H[SORVLYRV VXHORV DJUtFRODV KHUEL-
FLGDV SHVticidas, metales, selenio), sitios LQGXVWULDOHV FRPSXHVWRV RUJiQLFRV PHtales), minas (metales) y sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos aroPiWLFRV SROLFtFOLFRV Sustratos lquidos: aguas residuales (nutrientes, metales), drenajes agrcolas QXWULHQWHV IHUWLOL]DQWHV $V 6H % SHVWLFLGDV KHUELFLGDV HXHQWHV LQGXVWULDOHV PHWDOHV HXHQWHV GH PLQHUtD PHWDOHV Sustratos gaseosos: aire (xidos de nitrgeno, SO2, ozono, CO2, gases neurotxiFRV SDUWtFXODV GH KROOtQ KLGURFDUEXURV voltiles). /D WRUUHPHGLDFLyQ SUHVHQWD XQD VHULH GH ventajas sobre otras tcnicas de descontamiQDFLyQ TXH SRGUtDQ UHVXPLUVH GH OD VLJXLHQWH manera: a) costos energticos muy inferiores GHELGR DO XVR GH HQHUJtD VRODU E HPSOHR GH tratamientos in situ, con las consiguientes reGXFFLRQHV GH FRVWRV \ ULHVJRV SDUD ORV KXPDQRV F DGDSWDELOLGDG SDUD OD GHVFRQWDPLQDFLyQ GH JUDQGHV VXSHUFLHV R SDUD OD QDOL]DFLyQ GH iUHDV UHVWULQJLGDV HQ SOD]RV SURORQJDGRV G PD\RU YHORFLGDG GH GHJUDGDFLyQ SDUD HO FDVR GH GHWHUPLQDGRV FRPSXHVWRV H PHQRU SURduccin de residuos secundarios. $VLPLVPR HV LPSRUWDQWH FRQVLGHUDU WDPELpQ las limitaciones inherentes a esta tcnica, entre ODV FXDOHV SXHGHQ LQFOXLUVH D OD WRWR[LFLGDG SXHGH OLPLWDU HO FUHFLPLHQWR GH ODV SODQWDV HQ iUHDV IXHUWHPHQWH FRQWDPLQDGDV E OD SHQHWUDcin de las races restringe la utilidad de la tcQLFD D SURIXQGLGDGHV GH KDVWD P \ DO WUDWDPLHQWR DJXDV SRFR SURIXQGDV F HQ DOJXQRV FDVRV HO SURFHVR GH UHPHGLDFLyQ VXHOH VHU PX\ SURORQJDGR VLHQGR PiV OHQWR HQ ORV VXHORV TXH HQ ORV FXHUSRV GH DJXD G OD ELRGLVSRQLELOLGDG GH ORV FRPSXHVWRV R PHWDOHV SXHGH FRQVWLWXLU XQ IDFWRU OLPLWDQWH SDUD XQD FDSWDFLyQ HFD] H ODV FRQWDPLQDFLRQHV SRWHQFLDOHV GH ODV FDGHQDV DOLPHQWDULDV \ GH ODV QDSDV GH DJXD VRQ riesgos que deben considerarse seriamente; f) ORV SURGXFWRV GH GHJUDGDFLyQ in planta SURFHVRV GH WRGHJUDGDFLyQ QR HVWiQ ELHQ HVWDEOHcidos en muchos casos; g) el marco regulatorio SDUD SURFHVRV GH WRUUHPHGLDFLyQ VH KDOOD D~Q HQ SURFHVR GH HODERUDFLyQ Algunas de las limitaciones mencionadas SXHGHQ DWHQXDUVH LQWURGXFLHQGR PRGLFDFLRQHV D ODV WpFQLFDV XWLOL]DGDV 3RU HMHPSOR OD SURIXQGLGDG GH FDSWDFLyQ SXHGH LQFUHPHQWDU-
VH PHGLDQWH LPSODQWDFLyQ GH iUEROHV HQ SHUIRUDFLRQHV SURIXQGDV R PHGLDQWH HO ERPEHR GH DJXDV FRQWDPLQDGDV SDUD LUULJDU SODQWDV WRUUHPHGLDGRUDV $VLPLVPR OD ELRGLVSRQLELOLGDG GH FLHUWRV FRQWDPLQDQWHV SXHGH LQFUHPHQWDUVH PHGLDQWH HO DJUHJDGR GH FRPSXHVWRV TXH DXmenten su solubilidad. (O PHUFDGR DFWXDO GH OD WRUUHPHGLDFLyQ HQ (VWDGRV 8QLGRV UHSUHVHQWD HQWUH \ PLllones de dlares al ao (en 1999 fue de cerca GH PLOORQHV GH GyODUHV UHSDUWLpQGRVH HQ XQ SDUD HO WUDWDPLHQWR GH FRQWDPLQDQWHV RUJiQLFRV \ XQ SDUD FRQWDPLQDQWHV LQRUJiQLFRV (VWH PHUFDGR HV WRGDYtD LQFLSLHQWH VL VH FRQVLGHUD TXH OD WRUUHPHGLDFLyQ DEDUFD VyOR XQ GHO PHUFDGR WRWDO GH UHPHGLDFLyQ OD ELRUUHPHGLDFLyQ HQ VX FRQMXQWR UHSUHVHQWD FHUFD GHO GHO PHUFDGR WRWDO (O XVR GH HVWH WLSR GH WpFQLFDV QR HV D~Q VLJQLFDWLYR HQ (XURSD SHUR VH HVSHUD TXH GHELGR D ODV LQYHUVLRQHV UHDOL]DGDV HQ HVWH FDPSR VH YD\D DPSOLDQGR HQ HO FRUWR \ PHGLDQR SOD]R /D 7DEOD PXHVWUD XQD FRPSDUDFLyQ GH ORV FRVWRV GH GHVFRQWDPLQDFLyQ SDUD GLIHUHQWHV FRPSXHVWRV Wy[LFRV FRQ GLVWLQWDV HVWUDWHJLDV &RPR SXHGH YHUVH HQ HO FDVR GH ORV FRQWDPLQDQWHV OLVWDGRV OD WRUUHPHGLDFLyQ UHVXOWD OD RSFLyQ PHQRV FRVWRVD Estrategias de WRUUHPHGLDFLyQ El tUPLQR WRUUHPHGLDFLyQ HQJORED GLIHUHQWHV HVWUDWHJLDV SDUD GHVFRQWDPLQDU HO HQWRUQR PHGLDQWH HO XVR GH ODV SODQWDV (VWDV HVWUDWH-
gias se resumen en la Figura 1 y se detallan a FRQWLQXDFLyQ 6X XVR GHSHQGH GH OD VXSHUFLH y caractersticas del ambiente a remediar y de OD QDWXUDOH]D GHO FRQWDPLQDQWH VLHQGR SRVLEOH LPSOHPHQWDU FRPELQDFLRQHV GH ODV PLVPDV HQ algunos casos )LWRH[WUDFFLyQ esta estrategia tiene FRPR Q FRQFHQWUDU HO FRQWDPLQDQWH HQ WHMLGRV FRVHFKDEOHV GH ODV SODQWDV SULQFLSDOPHQWH HQ OD SDUWH DpUHD (O PDWHULDO FRVHFKDGR SXHGH FRQYHUWLUVH HQ FHQL]DV XVDUVH FRQ QHV QR DOLPHQWDULRV R FRPR HQ HO FDVR GH DOJXQRV PHWDOHV SDUD UHFLFODU HO FRQWDPLQDQWH WRPLQHUtD (VWD WpFQLFD VH XVD SULQFLSDOPHQWH SDUD OD UHmediacin de metales y de otros txicos inorgnicos (Se, As, radionucletidos). )LWRHVWLPXODFLyQUL]RGHJUDGDFLyQ el SURSyVLWR GH HVWD HVWUDWHJLD HV IDFLOLWDU OD GHJUDGDFLyQ GH FRQWDPLQDQWHV SUHVHQtes en la rizsfera mediante la actividad de microorganismos (bacterias y hongos) DVRFLDGRV D ODV SODQWDV (V FRP~QPHQWH XVDGD SDUD UHPHGLDU FRQWDPLQDQWHV RUJiQLFRV KLGURIyELFRV TXH QR SXHGHQ VHU LQFRUSRUDGRV SRU ODV SODQWDV SHUR TXH SXHGHQ VHU GHJUDGDGRV SRU ORV PLFURRUJDQLVPRV /RV HMHPSORV PiV GHVWDFDGRV GH DSOLFDFLRQHV GH HVWD HVWUDWHJLD VH UHHUHQ D KLGURFDUEXURV DURPiWLFRV SROLFtFOLFRV ELIHQLORV SROLFORULQDGRV H KLGURFDUEXURV GHULYDGRV GHO SHWUyOHR
Tabla 1. $GDSWDGD GH &KDSSHOO
Contaminante Metales petrleo 4 Ha de tierra contaminada con plomo Radionucletidos en agua superficial (4.000 litros) 1 hectarea a 15 cm de profundidad (varios contaminantes) Adaptada de Chappell, 1998.
Costo de Fitorremediacin U$D 87,5 por m3 U$D 70.000 por sitio U$D 500,000 U$D 2 a U$D 6 U$D 2.500 a U$D 15.000
Costo estimado usando otras tecnologas U$D 250 por m3 U$D 850,000 U$D 12 millones No determinado No determinado
)LJXUD 3URFHVRV LQYROXFUDGRV HQ OD WRUUHPHGLDFLyQ /D WRUUHPHGLDFLyQ SXHGH LQYROXFUDU YDULRV SURFHVRV ORV FRQWDPLQDQWHV HQ HO VXHOR \ HQ HO DJXD VXEWHUUiQHD SXHGHQ VHU LQFRUSRUDGRV D ORV WHMLGRV YHJHWDOHV WRH[WUDFFLyQ R DGVRUELGRV D ODV UDtFHV UL]ROWUDFLyQ ORV FRQWDPLQDQWHV GHQWUR GH OD SODQWD SXHGHQ VHU WUDQVIRUPDGRV SRU HQ]LPDV YHJHWDOHV WRWUDQVIRUPDFLyQ R YRODWLOL]DGRV \ OLEHUDGRV D OD DWPyVIHUD WRYRODWLOL]DFLyQ ORV FRQWDPLQDQWHV GHO VXHOR SXHGHQ VHU GHJUDGDGRV SRU PLFURRUJDQLVPRV GH OD UL]yVIHUD ELRUUHPHGLDFLyQ UL]RVIpULFD R LQFRUSRUDGRV DO PDWHULDO GHO VXHOR WRHVWDELOL]DFLyQ $GDSWDGR GH YDQ $NHQ
)LWRHVWDELOL]DFLyQ esta estrategia se EDVD HQ XWLOL]DU SODQWDV SDUD HVWDELOLzar in situ los contaminantes del suelo. 3RU HVWH PHGLR VH SUHYLHQH HO OWUDGR R HVFDSH GH ORV FRQWDPLQDQWHV D FDSDV PiV SURIXQGDV R D QDSDV GH DJXD \ VH los convierte en formas menos biodisSRQLEOHV SRU HMHPSOR SRU SUHFLSLWDFLyQ HQ OD UL]yVIHUD 3DUD LPSOHPHQWDU HVWH HQIRTXH SXHGHQ SODQWDUVH FREHUWXUDV vegetales en sitios contaminados, o rboles que actan como barreras hidruliFDV WDQWR SDUD FRQWDPLQDQWHV RUJiQLFRV como inorgnicos. )LWRGHJUDGDFLyQILWRWUDQVIRUPDFLyQ PHGLDQWH HVWD HVWUDWHJLD ODV SODQWDV GHgradan los contaminantes orgnicos me-
GLDQWH DFWLYLGDGHV HQ]LPiWLFDV SURSLDV JHQHUDQGR DVt VXESURGXFWRV QR Wy[LFRV R PHQRV Wy[LFRV (O SURFHGLPLHQWR KD UHVXOWDGR ~WLO SDUD FRPSXHVWRV RUJiQLFRV que se movilizan fcilmente en los tejiGRV GH OD SODQWD FRPR ORV KHUELFLGDV HO trinitrotolueno, y el tricloroetileno. )LWRYRODWLOL]DFLyQWRWUDQVIRUPDFLyQ HQ HVWH FDVR ODV SODQWDV LQFRUSRUDQ HO contaminante y lo convierten a formas voltiles que se liberan luego a la atmsIHUD D WUDYpV GH OD WUDQVSLUDFLyQ (VWH SURFHGLPLHQWR SHUPLWH H[WUDHU HOHPHQtos como el selenio y algunas formas GHO PHUFXULR GH EDUURV \ VXHORV SDUD luego liberarlos a la atmsfera como vaSRU GHWR[LFDGR 3XHGH XWLOL]DUVH SDUD
FRPSXHVWRV RUJiQLFRV FRQ IRUPDV YROiWLOHV WULFORURHWLOHQR \ SDUD FRPSXHVWRV LQRUJiQLFRV TXH SXHGHQ H[LVWLU HQ IRUPD voltil, como Se y Hg. 5L]ROWUDFLyQ: HVWH SURFHGLPLHQWR FRQsiste en la eliminacin de txicos de ambientes acuticos mediante el sistema UDGLFXODU GH OD SODQWD (Q HVWH SURFHVR ODV SODQWDV VRQ FUHFLGDV HQ KLGURSRQLD SDUD OXHJR VHU WUDQVSODQWDGDV DO FXHUSR de agua contaminado, donde adsorben y acumulan metales en sus races. Si el SURFHVR VH UHDOL]D HQ FRQWHQHGRUHV HV UHODWLYDPHQWH FDUR GH LPSOHPHQWDU VLHQGR PiV ELHQ DSURSLDGR SDUD YRO~PHQHV SHTXHxRV GH DJXDV UHVLGXDOHV FRQWDPLQDGDV SRU HMHPSOR FRQ FRPSXHVWRV LQRUJiQLFRV SHOLJURVRV FRPR UDGLRQXFOHytidos.
/RV SURFHVRV PHQFLRQDGRV QR VRQ PXWXDPHQWH H[FOX\HQWHV 3RU HMHPSOR HQ XQ WHUUHQR DQHJDGR DUWLFLDOPHQWH SXHGHQ RFXUULU VLPXOWiQHDPHQWH SURFHVRV GH DFXPXODFLyQ HVWDELlizacin y volatilizacin de los contaminantes. $OJXQRV HMHPSORV GH GLVHxRV SODQWHDGRV GH torremediacin que resultan de la combinacin de las estrategias mencionadas se esquematizan en la Figura 2. Caractersticas deseables en XQD SODQWD SDUD WRUUHPHGLDU (O GLVHxR GHO VLVWHPD D XWLOL]DU SDUD OD GHVFRQWDPLQDFLyQ YDULDUi VHJ~Q HO WLSR GH FRPSXHVWR FRQWDPLQDQWH \ VX FRQFHQWUDFLyQ \ GH ODV FRQGLFLRQHV HVSHFtFDV GHO VLWLR D UHPHGLDU 8QR GH ORV IDFWRUHV PiV LPSRUWDQWHV D GHWHUPLQDU HV OD VHOHFFLyQ GH OD HVSHFLH YHJHWDO. (Q JHQHUDO VH XWLOL]DQ HVSHFLHV GH UiSLGR FUH-
)LJXUD (VTXHPDV GH WRUUHPHGLDFLyQ SDUD WUDWDU GLIHUHQWHV VXVWUDWRV FRQWDPLQDGRV Tecnologas GH WRUUHPHGLDFLyQ XWLOL]DGDV SDUD UHPHGLDU GLVWLQWRV VXVWUDWRV FRQWDPLQDGRV DJXD VXHOR \R DLUH /RV FtUFXORV URMRV UHSUHVHQWDQ DO FRQWDPLQDQWH $GDSWDGR GH 3LORQ6PLWK
cimiento, fciles de crecer y mantener, y que desarrollen gran cantidad de biomasa. Pueden XWLOL]DUVH SODQWDV iUEROHV SDVWRV R DOJDV SUHULpQGRVH HQ DOJXQRV GLVHxRV ODV HVSHFLHV DXWyFWRQDV SDUD QR PRGLFDU OD RUD ORFDO /DV HVSHFLHV PiV XWLOL]DGDV FRPSUHQGHQ ODV IUHDWyWDV SODQWDV GH UDtFHV SURIXQGDV FRPR HO iODPR VDXFH DOJRGRQHUR ODV SDVWXUDV GHELGR D TXH VXV UDtFHV VRQ SDUWLFXODUPHQWH DSWDV SDUD UHWHQHU HO VXHOR ODV OHJXPEUHV SRUTXH SHUPLWHQ OD MDFLyQ VLPELyWLFD GH 12) y las acuWLFDV TXH SHUPLWHQ OD GHJUDGDFLyQ GH FRQWDPLQDQWHV HQ FLpQDJDV DUWLFLDOHV &RPR HV REYLR OD HVSHFLH VHOHFFLRQDGD GHEHUi GHVFRQWDPLQDU HFLHQWHPHQWH OD VXVWDQFLD Wy[LFD &DGD HVWUDWHJLD GH WRUUHPHGLDFLyQ UHTXLHUH OD SUHVHQFLD GH FDUDFWHUtVWLFDV HVSHFLDOHV HQ OD SODQWD D XWLOL]DU 3RU HMHPSOR VL VH GHVHD HPSOHDU OD WpFQLFD GH WRH[WUDFFLyQ SDUD FRQWDPLnantes inorgnicos, stos deben concentrarse HQ OD SODQWD HQ DOWRV QLYHOHV WUDQVORFDUVH Hcazmente y acumularse en los tejidos cosechaEOHV (Q XQ HVTXHPD EDVDGR HQ WRGHJUDGDcin, se requerirn sistemas radiculares densos y abundantes y altos niveles de enzimas degra-
GDWLYDV (Q FDPELR VL VH HPSOHD XQD HVWUDWHJLD GH WRHVWLPXODFLyQ HV LPSRUWDQWH TXH OD SODQWD WHQJD XQD JUDQ VXSHUFLH UDGLFXODU \ SURGX]FD ORV H[XGDGRV QHFHVDULRV SDUD SURPRYHU HO FUHcimiento microbiano. ([LVWHQ HVSHFLHV GH SODQWDV FRQRFLGDV FRPR KLSHUDFXPXODGRUDV TXH WLHQHQ OD FDSDFLGDG GH DFXPXODU FRPSXHVWRV WRWy[LFRV SDUWLFXODUPHQWH PHWDOHV HQ FRQFHQWUDFLRQHV HQWUH \ YHFHV VXSHULRUHV D XQD SODQWD SURPHGLR (O DOWR SRGHU GH FRQFHQWUDFLyQ GHO FRPSXHVWR Wy[LFR VXPDGR D XQ VLVWHPD HFLHQWH GH WUDQVSRUWH GHVGH OD UDt] DO WDOOR FDOLFD D ODV KLSHUDFXPXODGRUDV FRPR FDQGLGDWDV SURPLVRULDV SDUD FLHUWRV SURFHVRV GH GHWR[LFDFLyQ 7DEOD Procesos biolgicos que afectan OD WRUUHPHGLDFLyQ (O SURFHVR GH WRUUHPHGLDFLyQ GHSHQGH GH XQD VHULH GH SURFHVRV ELROyJLFRV DTXHOORV UHlacionados con las interacciones a nivel rizosIpULFR ORV PHFDQLVPRV GH FDSWDFLyQ WUDQVORFDFLyQ \ WROHUDQFLD SUHVHQWHV HQ OD SODQWD OD SUHsencia de quelantes vegetales involucrados en WUDQVSRUWH \ DOPDFHQDPLHQWR \ HO PRYLPLHQWR
Tabla 2. $GDSWDGD GH &KHULDQ

Plantas comunes Mostaza parda
Hiperacumuladoras Thlaspi caerulescens Berkheya coddii Astragalus racemosus Pteris vittata Ipomoea alpina Haumaniastrum robertii Iberis intermedia Gysophila spaerocephala
Metal zinc(Zn), cadmio (Cd) nquel (Ni) selenio (Se) arsnico (As) cobre (Cu) cobalto (Co) talio (Tl) boro (B)
Contaminantes y entorno
Metales pesados, selenio y radionucletidos en el suelo Solventes clorados y nitratos lamo en aguas subterrneas, metales pesados en el suelo Solventes clorados en agua lamo carolino subterrneas; metales, nitratos Desechos explosivos en Lenteja de agua aguas subterrneas Hidrocarburos aromticos mora policclicos (PAHs) en el suelo Radionucletidos en aguas girasol subterrneas Metales pesados e pastos hidrocarburos en el suelo Hidrocarburos en suelos y alfalfa, enebro aguas subterrneas
Adaptada de Cherian, 2005
de los contaminantes en los ecosistemas haFLD QLYHOHV WUyFRV VXSHULRUHV $OJXQRV GH ORV SDUiPHWURV PiV LPSRUWDQWHV UHODFLRQDGRV FRQ HVWRV SURFHVRV VH FRPHQWDQ D FRQWLQXDFLyQ %LRGLVSRQLELOLGDG GHO FRQWDPLQDQWH la ELRGLVSRQLELOLGDG GH XQ FRQWDPLQDQWH GHSHQGH IXHUWHPHQWH GH VXV SURSLHGDGHV TXtPLFDV HQ SDUWLFXODU GH VX KLGURIRELFLGDG \ YRODWLOLGDG 3RU HMHPSOR ODV PROpculas de extrema hidrofobicidad (bifeniORV SROLFORUDGRV KLGURFDUEXURV DURPiWLFRV SROLFtFOLFRV \ RWURV KLGURFDUEXURV VH unen fuertemente a la materia orgnica y QR VH GLVXHOYHQ HQ HO DJXD DWUDSDGD HQ VXV SRURV SUHVHQWDQGR DVt EDMD ELRGLVSRQLELOLGDG /DV SURSLHGDGHV GHO VXHOR WDPELpQ LQX\HQ VREUH OD ELRGLVSRQLELlidad; los suelos arcillosos y con mayor concentracin de materia orgnica retienen ms agua que los suelos arenosos \ WLHQHQ PiV VLWLRV GH XQLyQ SDUD LRQHV HVSHFLDOPHQWH FDWLRQHV /D ELRGLVSRQLbilidad de los contaminantes inorgnicos TXH HVWiQ SUHVHQWHV FRPR FDWLRQHV HV DIHFWDGD SRU HO S+ GHO VXHOR ORV S+V iFLGRV OD LQFUHPHQWDQ SRUTXH ORV UHHPSOD]DQ SRU SURWRQHV HQ ORV VLWLRV GH XQLyQ Las condiciones medioambientales son RWUR SDUiPHWUR LPSRUWDQWH SRU HMHPSOR OD WHPSHUDWXUD \ OD KXPHGDG SXHGHQ DXmentar la migracin de contaminantes GLVXHOWRV HQ DJXD 'DGD OD LPSRUWDQFLD GH HVWH IDFWRU VREUH OD WRUUHPHGLDFLyQ H[LVWHQ QXPHURVDV HVWUDWHJLDV SDUD DXPHQWDU OD ELRGLVSRQLELOLGDG GH ORV FRQWDminantes, que incluyen el agregado de TXHODQWHV \ OD DFLGLFDFLyQ GH ORV VXHORV HQ HO FDVR GH ORV PHWDOHV WRH[WUDFFLyQ asistida) y el agregado de surfactantes SDUD FRQWDPLQDQWHV KLGURIyELFRV 3URFHVRV UL]RVIpULFRV en la rizsfera, OD ]RQD FRPSUHQGLGD KDVWD PP GH GLVtancia de la raz, existe una mayor concentracin de microorganismos como consecuencia de la liberacin de fotoVLQWDWRV 0XFKRV SRVHHQ FDSDFLGDG UHmediadora y la liberacin de metabolitos VHFXQGDULRV SRU SDUWH GH OD SODQWD SXHGH DFWLYDU HQ HOORV OD H[SUHVLyQ GH JHQHV UH-
lacionados con la degradacin de contaPLQDQWHV (Q OD UL]yVIHUD RFXUUHQ SURFHVRV TXH SXHGHQ FRQWULEXLU D LQFUHPHQWDU OD ELRGLVSRQLELOLGDG GHO FRQWDPLQDQWH $OJXQRV HMHPSORV GH HVWRV SURFHVRV VRQ a) la liberacin de biosurfactantes bacterianos que aumentan la solubilidad de FRPSXHVWRV KLGURIyELFRV E OD OLEHUDFLyQ GH H[XGDGRV YHJHWDOHV TXH SURPXHYHQ la sntesis de biosurfactantes bacterianos; c) la liberacin de enzimas vegetaOHV \ EDFWHULDQDV FDSDFHV GH PRGLFDU DOJXQRV FRPSXHVWRV RUJiQLFRV DXPHQWDQGR VX ELRGLVSRQLELOLGDG G OD OLEHUDFLyQ GH TXHODQWHV SRU SDUWH GH SODQWDV \ bacterias (siderforos, cidos orgnicos \ IHQyOLFRV TXH SHUPLWHQ LQFUHPHQWDU OD GLVSRQLELOLGDG GH PHWDOHV H OD H[WUXVLyQ GH SURWRQHV SRU ODV SODQWDV SDUD DFLGLcar el suelo; f) la liberacin de enzimas vegetales que convierten los metales en IRUPDV PHQRV Wy[LFDV R PiV ELRGLVSRQLEOHV SRU HMHPSOR &U9, D &U,,, &DSWDFLyQ SRU OD SODQWD HO SURFHVR GH FDSWDFLyQ GHSHQGH GH OD QDWXUDOH]D GHO FRQWDPLQDQWH 3RU OR JHQHUDO ODV SODQWDV QR SRVHHQ WUDQVSRUWDGRUHV HVSHFtFRV SDUD ORV FRQWDPLQDQWHV RUJiQLFRV ORV FXDOHV VRQ HQ VX PD\RUtD SURGXFWRV GH la actividad humana. De acuerdo con su JUDGR KLGURIRELFLGDG HVWRV FRPSXHVWRV difunden a travs de los tejidos vegetales. En cambio, los contaminantes inorgQLFRV VRQ LQFRUSRUDGRV PHGLDQWH WUDQVSRUWDGRUHV GH PHPEUDQD SUHH[LVWHQWHV debido a que son naturalmente utilizados como nutrientes o guardan relacin con FRPSXHVWRV QRUPDOPHQWH FDSWDGRV SRU ODV SODQWDV 3RU HMHPSOR HO DUVHQDWR HV LQFRUSRUDGR SRU WUDQVSRUWDGRUHV GH IRVIDWR \ HO VHOHQDWR SRU WUDQVSRUWDGRUHV GH VXOIDWR $ SHVDU GH TXH VRQ SRFR UHDFtivos, su acumulacin causa toxicidad debido a que daan la estructura celular PHGLDQWH HVWUpV R[LGDWLYR \ UHHPSOD]DQ nutrientes esenciales. 4XHODFLyQ \ FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ HVWRV SURFHVRV TXH LQFOX\HQ GLVWLQWRV WLSRV GH FRQMXJDFLRQHV \ PRGLFDFLRQHV
o bien el secuestro en localizaciones VXEFHOXODUHV GRQGH QR LQWHUHUHQ FRQ HO PHWDEROLVPR FHOXODU OH SHUPLWHQ D ODV SODQWDV WROHUDU GLVWLQWRV FRQWDPLQDQWHV $OJXQRV GH HVWRV SURFHVRV VH UHVXPHQ en la Figura 3. 'HJUDGDFLyQ HVWH SURFHVR SXHGH DSOLcarse VROR D FRQWDPLQDQWHV GH WLSR RUJiQLFR TXH SXHGHQ VHU FRPSOHWDPHQWH FDWDEROL]DGRV SURFHVR TXH VH GHQRPLna "mineralizacin" y que tiene como SURGXFWRV &22, H2O y/o Cl2 R ELHQ SDUcialmente degradados a intermediarios HVWDEOHV TXH VH DOPDFHQDQ HQ OD SODQWD
FRPR FRQMXJDGRV /D GHJUDGDFLyQ SXHGH RFXUULU WDQWR HQ UDtFHV FRPR HQ OD SDUWH DpUHD GH OD SODQWD PHGLDQWH HQ]LPDV TXH PRGLFDQ ORV JUXSRV ODWHUDOHV GH ORV FRPSXHVWRV RUJiQLFRV SHUPLWLHQGR DVt su solubilizacin. Algunas enzimas invoOXFUDGDV HQ HVWH SURFHVR VRQ ODV GHKDORJHQDVDV PRQRGLR[LJHQDVDV SHUR[Ldasas, lacasas, nitrilasas, fosfatasas y nitroreductasas. 'LVHxR GH XQ HVTXHPD GH WRUUHPHGLDFLyQ (O GLVHxR GHO VLVWHPD D XWLOL]DU SDUD OD GHV-
Figura 3. Mecanismos de tolerancia de las clulas vegetales a contaminantes orgnicos e inorgnicos. /D GHWR[LFDFLyQ JHQHUDOPHQWH LQYROXFUD SURFHVRV GH FRQMXJDFLyQ VHJXLGRV SRU HO VHFXHVWUR DFWLYR GHO FRPSOHMR HQ OD YDFXROD \R HO DSRSODVWR OXJDUHV GRQGH HO FRQWDPLQDQWH JHQHUD PHQRV GDxR /RV FRPSXHVWRV TXHODQWHV PRVWUDGRV HQ HO HVTXHPD VRQ *6+ JOXWDWLRQ *OX JOXFRVD 07 PHWDORWLRQHLQDV 1$ QLFRWLQDPLQD 2$ iFLGRV RUJiQLFRV 3& WRTXHODWLQDV /RV WUDQVSRUWDGRUHV DFWLYRV VH PXHVWUDQ FRPR FDMDV FRQ HFKDV $GDSWDGR GH 3LORQ6PLWK
contaminacin variar segn la naturaleza de ORV FRPSXHVWRV FRQWDPLQDQWHV OD FRQFHQWUDcin de los mismos y las condiciones del sitio D UHPHGLDU /D HVWUDWHJLD GH WRUUHPHGLDFLyQ D XWLOL]DU HV PX\ LPSRUWDQWH \D TXH HO GLVHxR GHO VLVWHPD GHSHQGHUi GH HOOR $OJXQRV IDFWRUHV clave a tener en cuenta son: Naturaleza de los contaminantes y VHOHFFLyQ GH OD HVSHFLH YHJHWDO SDUD asegurar la correcta eleccin del sistema GH WRUUHPHGLDFLyQ HV QHFHVDULR HVWDEOHFHU IHKDFLHQWHPHQWH HO WLSR GH FRQWDPLQDFLyQ &RQ HO Q GH XWLOL]DU HO VLVWHPD PiV DSURSLDGR SXHGHQ UHDOL]DUVH HQVD\RV D SHTXHxD HVFDOD SDUD FRPSDUDU OD HIHFWLYLGDG GH GLVWLQWDV HVSHFLHV GH SODQWDV (V QHFHVDULR DQDOL]DU WDPELpQ OD cantidad y las caractersticas de los comSXHVWRV TXH OD SODQWD SURGXFH \R OLEHUD Esquema y densidad de las plantaciones: OD GHQVLGDG GH SODQWDFLyQ GHSHQGHUi GH OD SODQWD XWLOL]DGD \ GHO WLSR GH DSOLFDFLyQ (V LPSRUWDQWH FDOFXODU OD FDQWLGDG GH ELRPDVD SURGXFLGD SRU XQLGDG GH VXSHUFLH D OR ODUJR GHO WLHPSR \ VL HV QHFHVDULR UHDOL]DU SODQWDFLRQHV VXFHVLYDV TXH SHUPLWDQ DOFDQ]DU WDVDV GH descontaminacin adecuadas. 7DVD GH FDSWDFLyQ GHO FRQWDPLQDQWH \ WLHPSR GH OLPSLH]D UHTXHULGR el tiemSR WRWDO UHTXHULGR SDUD XQ GHWHUPLQDGR HVTXHPD GH WRUUHPHGLDFLyQ GHSHQGHUi GH ODV YDULDEOHV DSXQWDGDV DQWHULRUPHQWH /D WDVD GH GHVFRQWDPLQDFLyQ SXHGH GHWHUPLQDUVH DSOLFDQGR GLVWLQWDV HFXDFLRQHV GHVDUUROODGDV HVSHFLDOPHQWH FRQ HVWH Q ,UULJDFLyQ LQVXPRV DJURQyPLFRV \ mantenimiento: la frecuencia y cantidad de las lluvias y las caractersticas del cliPD UHJLRQDO VRQ IDFWRUHV TXH SRGUtDQ GHWHUPLQDU OD QHFHVLGDG GH DJXD SDUD ULHJR OR TXH SUHVXSRQH OD H[LVWHQFLD FRVWRV DGLFLRQDOHV SDUD ORV SURFHVRV GH WRUUHPHGLDFLyQ WHUUHVWUH (V LPSRUWDQWH DQDOL]DU ORV SURFHVRV GH PRYLPLHQWR \ GHVWLQDFLyQ QDO GHO DJXD 3RU HMHPSOR XQ iUERO PDGXUR HV FDSD] GH OLEHUDU PiV GH OLWURV GH DJXD SRU DxR (Q DOJXQRV FDVRV ODV SODQWDV OLEHUDUiQ DO DPELHQWH
SURGXFWRV PHQRV Wy[LFRV TXH HO FRQWDPLQDQWH RULJLQDO PHGLDQWH HO SURFHVR GH WUDQVSLUDFLyQ 2WURV FRVWRV LPSRUWDQWHV a considerar en el esquema son los de LPSODQWDFLyQ IHUWLOL]DFLyQ PDQWHQLPLHQto y control, y tareas de cosecha y recoleccin. Finalmente, no debe excluirse la ocurrencia de eventos recurrentes en la DJULFXOWXUD WDOHV FRPR SODJDV VHTXtDV KHODGDV R OD GHSUHGDFLyQ SRU DQLPDOHV ORV TXH SXHGHQ LQWURGXFLU VLWXDFLRQHV QR SUHYLVWDV HQ HO HVTXHPD SODQWHDGR 3RU HVWD UD]yQ HV UHFRPHQGDEOH GLVSRQHU GH HVWUDWHJLDV GH FRQWLQJHQFLD SDUD DVHJXUDU HO p[LWR GHO SURJUDPD (VWUDWHJLDV SDUD LQFUHPHQWDU OD HFLHQFLD GH OD WRUUHPHGLDFLyQ 6H KDQ SODQWHDGR GLIHUHQWHV HVWUDWHJLDV SDUD PHMRUDU OD HFLHQFLD GH ORV VLVWHPDV GH WRUUHPHGLDFLyQ KDFLHQGR XVR GH SODQWDV WUDQVJpQLcas. Algunas de estas estrategias son: a) auPHQWR GH OD LQFRUSRUDFLyQ GH FRQWDPLQDQWHV mediante la VREUHH[SUHVLyQ \R DOWHUDFLyQ GH OD HVSHFLFLGDG GH GLVWLQWRV WUDQVSRUWDGRUHV GH PHPEUDQD R OD H[SUHVLyQ \ VHFUHFLyQ GH SURWHtQDV R FRPSXHVWRV TXHODQWHV E DXPHQWR GH OD HFLHQFLD GH GHJUDGDFLyQ GH FRQWDPLQDQWHV RUJiQLFRV PHGLDQWH VREUHH[SUHVLyQ GH HQ]LPDV HVSHFtFDV F DXPHQWR GH OD DFXPXODFLyQ GH PHWDOHV SHVDGRV PHGLDQWH H[SUHVLyQ GH HQ]LPDV FDSDFHV GH IDYRUHFHU VX FRQMXJDcin a molculas tales como el glutation y/o las WRTXHODWLQDV (Q PXFKRV FDVRV ORV JHQHV XWLOL]DGRV SDUD KDFHU PiV HFLHQWH OD WRUUHPHGLDFLyQ SURvienen de animales o de microorganismos, ya TXH pVWRV SRVHHQ HO FRPSOHPHQWR HQ]LPiWLFR QHFHVDULR SDUD GHJUDGDU \R PLQHUDOL]DU ODV PROpFXODV RUJiQLFDV FRPSOHPHQWDQGR DVt ODV FDSDFLGDGHV PHWDEyOLFDV GH ODV SODQWDV (Q OD medida en que se diluciden las bases molecuODUHV \ VLROyJLFDV GH ORV SURFHVRV GH FDSWDFLyQ WUDQVSRUWH \ DFXPXODFLyQ GH ORV FRQWDPLQDQWHV HQ ODV SODQWDV WRUUHPHGLDGRUDV VHUi SRVLEOH HQFDUDU QXHYDV HVWUDWHJLDV GH PRGLFDFLyQ JHQpWLFD HQ RWUDV HVSHFLHV YHJHWDOHV 2WUDV OtQHDV GH LQYHVWLJDFLyQ SURPLVRULDV DSXQWDQ D LQFUHPHQWDU OD HFLHQFLD GHO SURFHVR GH WRUUHPHGLDFLyQ PHMRUDQGR ODV LQWHUDFFLR-
QHV HQWUH ODV SODQWDV \ VXV PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV \D VHDQ QDWXUDOHV R JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV (MHPSORV GH WRUUHPHGLDFLyQ /D WRUUHPHGLDFLyQ SDUD OD GHVFRQWDPLnacin de aguas, suelos y aire ha resultado exitosa en un nmero considerable de casos. /RV HMHPSORV GH HVWDV DSOLFDFLRQHV YDQ GHVGH SUXHEDV DO QLYHO GH ODERUDWRULR R HVFDOD SLORWR KDVWD SURFHGLPLHQWRV D JUDQ HVFDOD HQ ]RQDV DIHFWDGDV SRU GHWHUPLQDGRV FRQWDPLQDQWHV $ continuacin se resumen algunos de los casos exitosos. )LWRUUHPHGLDFLyQ GH PHUFXULR el mercuULR SUHVHQWH QDWXUDOPHQWH HQ OD FRUWH]D WHUUHVWUH HV XQ PHWDO FDSD] GH FDXVDU JUDYHV GDxRV FHUHEUDOHV FDUGtDFRV KHSiWLFRV \ SXOPRQDUHV tanto en animales como en humanos. Se han XWLOL]DGR GLVWLQWDV WpFQLFDV SDUD PLQLPL]DU HO LPSDFWR DPELHQWDO GHO PHUFXULR \ XQR GH ODV PiV SURPLVRULDV HV HO XVR GH SODQWDV SDUD H[traer este elemento de aguas contaminadas. 3RU HMHPSOR VH KD GHPRVWUDGR TXH HO SHTXHxR helecho Azolla caroliniana HV FDSD] GH UHPRYHU KDVWD HO GHO PHUFXULR SUHVHQWH HQ XQD muestra de agua contaminada en slo 12 das. 3RU RWUR ODGR VH REVHUYy TXH SODQWDV DFXiWLFDV como la milhojas acutica (Myriophyllum aquaticum), o la menta de agua (Mentha aquatica) UHPXHYHQ HO GHO PHUFXULR HQ XQ SHUtRGR de 21 das. Investigaciones similares, realizadas con el jacinto de agua (Eichornia crassipes), la lechuga de agua (Pistia stratiotes), el junco de agua (Scirpus tabernaemontani) y el taro (Colocasia esculenta UHIXHU]DQ HO SRVLEOH XVR GH SODQWDV SDUD OD UHPRFLyQ GH PHUFXULR de aguas contaminadas. 8QD HVWUDWHJLD DOWHUQDWLYD HV HO XVR GH SODQWDV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGDV 6H KDQ UHDOL]DGR SUXHEDV GH FRQFHSWR HQ Arabidopsis thaliana, tabaco, canola y lamo introduciendo los genes merB y merA de Desulfovibrio desulfuricans, TXH FRGLFDQ XQD RUJDQRPHUF~ULFR OLDVD \ XQD PHUF~ULFR UHGXFWDVD /D SULPHUD HV FDSD] GH WUDQVIRUPDU ODV IRUPDV Wy[LFDV GHO PHUFXULR PHWLOPHUFXULDOHV HQ FRPSXHVtos ms inocuos (mercurio inico y metano); PLHQWUDV TXH OD VHJXQGD SHUPLWH WUDQVIRUPDU HO mercurio inico en mercurio elemental. La ex-
SUHVLyQ FRPELQDGD GH ORV JHQHV merB y merA HQ XQD PLVPD SODQWD KD SHUPLWLGR OD REWHQFLyQ de lneas que resisten concentraciones de fenilmercurioacetato 100 veces mayores a las que UHVLVWHQ ODV SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV )LJXUD
Figura 4. Plantas de Arabidopsis TXH H[SUHVDQ WDQWR merA como merB son altamente resistentes a merFXULR RUJiQLFR /D H[SUHVLyQ GH DPERV WUDQVJHQHV SHUPLWH TXH HO PHWLOPHUFXULR R HO 30$ VH FRQYLHUWD D IRUPDV PHQRV Wy[LFDV FRPR +J /DV SODQWDV 0HU$0HU% SDQHO LQIHULRU L]TXLHUGR FUHFHQ HQ SUHVHQFLD GH DOWDV FRQFHQWUDFLRQHV GH 30$ 0 SHUR ODV WUDQVJpQLFDV VLPSOHV 0HU$ SDQHO LQIHULRU GHUHFKR 0HU% \ ODV SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV PXHUHQ 7RPDGD GH 0HDJKHU \ +HDWRQ
)LWRUUHPHGLDFLyQ GH IHQRO los contaminanWHV IHQyOLFRV VRQ FRQVLGHUDGRV DOWDPHQWH SHOLgrosos debido a su carcinogenicidad, su alta toxicidad, y su resistencia a la degradacin. En general, esta clase de contaminantes se geneUD D SDUWLU GH GLYHUVDV DFWLYLGDGHV LQGXVWULDOHV GHQWUR GH ODV TXH VH HQFXHQWUDQ ODV UHQHUtDV GH SHWUyOHR OD SURGXFFLyQ GH SOiVWLFRV \ HO tratamiento de maderas. Los mtodos convenFLRQDOHV SDUD HOLPLQDUORV VRQ FRVWRVRV \ SRFR HFLHQWHV LQFOXVR SXHGHQ JHQHUDU VXESURGXFWRV TXH UHVXOWDQ D~Q PiV SHUMXGLFLDOHV TXH ORV FRPSXHVWRV RULJLQDOHV 8Q PpWRGR LQWHUHVDQWH SDUD VX GHVFRQWDPLQDFLyQ HV HO WUDWDPLHQWR enzimtico, que consiste en la remocin bioOyJLFD GH IHQROHV PHGLDQWH HO XVR GH SHUR[Ldasas y oxidasas. Sin embargo, se necesitan JUDQGHV FDQWLGDGHV GH HQ]LPDV SDUD ORJUDU XQD HFLHQFLD GH GHVFRQWDPLQDFLyQ DGHFXDGD OR TXH GLFXOWD VX DSOLFDFLyQ D HVFDOD LQGXVWULDO
8QD HVWUDWHJLD SDUD VXSHUDU HVWD OLPLWDFLyQ HV HO XVR GH SODQWDV HQWHUDV FRPR WUDQVIRUPDGRras de fenoles. 8QD SRVLEOH KHUUDPLHQWD SDUD SURFHVRV GH WRUUHPHGLDFLyQ HV HO FXOWLYR GH UDtFHV WUDQVIRUmadas con Agrobacterium rhizogenes ("races en cabellera"). Las races de tomate tratadas con esta bacteria contienen altos niveles de SHUR[LGDGDV \ HQ FRQVHFXHQFLD VRQ FDSDFHV de remover fenoles. En un trabajo realizado en HO DxR HQ OD 8QLYHUVLGDG GH 5tR &XDUWR (Crdoba, Argentina), se obtuvieron races en cabellera transgnicas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill. cv. Pera) que sobreexSUHVDQ HO JHQ tpx1 )LJXUD (VWH JHQ FRGLFD XQD SHUR[LGDVD EiVLFD TXH VH ORFDOL]D HQ OD SDUHG FHOXODU GH ODV UDtFHV GH WRPDWH 6H DQDOL]y OD FDSDFLGDG GH GLFKDV UDtFHV SDUD UHPRYHU fenol utilizando como controles races en caEHOOHUD GH SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV /DV UDtFHV WUDQVJpQLFDV IXHURQ FDSDFHV GH UHPRYHU KDVWD XQ GHO IHQRO DGLFLRQDGR PLHQWUDV TXH ORV controles no transgnicos slo removieron un (VWRV UHVXOWDGRV VXJLHUHQ TXH ODV UDtFHV HQ FDEHOOHUD SRGUtDQ UHVXOWDU KHUUDPLHQWDV PX\ ~WLOHV SDUD OD OLPSLH]D GH HXHQWHV FRQWDminados.
Figura 5. (A) Planta transgnica de tomate in-vitro. (B) Races en cabellera transgnicas luego de 1 semana en medio lquido. (C) Races en cabellera WUDQVJpQLFDV GHVSXpV GH VHPDQDV HQ PHGLR OtTXLGR 7RPDGR GH :HDYHU 2OOHU \ FRO
)LWRUUHPHGLDFLyQ GH DUVpQLFR el arsnico $V HV XQ FRPSXHVWR DOWDPHQWH Wy[LFR VXV IRUPDV SUHGRPLQDQWHV VRQ HO DUVHQDWR $V 9
\ DUVHQLWR $V ,,, (O SULPHUR LQWHUHUH FRQ SURcesos celulares como la fosforilacin oxidativa y la sntesis de ATP, mientras que el segundo VH XQH D JUXSRV VXOIKLGULOR HQ GHWULPHQWR GH OD IXQFLyQ SURWHLFD HQ JHQHUDO /D PD\RU IXHQWH de contaminacin del agua bebible y de la cadena alimentaria son los cursos de agua, suelos y sedimentos contaminados con As. Esto ha causado envenenamientos masivos que, entre otros sntomas, generan lesiones y cnFHUHV HQ OD SLHO En la naturaleza, las actividades geoqumicas y microbianas contribuyen tambin a la movilizacin del As hacia el ambiente. Sin embargo, es la actividad humana la que ms contribuye a HVWH SURFHVR H[DFHUEDQGR DVt HO SUREOHPD (Q India y Bangladesh, la contaminacin de aguas FRQ $V SRQH HQ ULHVJR OD DOLPHQWDFLyQ EDVDGD en cultivos tales como el arroz y el maz. EsWDV HVSHFLHV VRQ FDSDFHV GH DFXPXODU $V HQ VXV JUDQRV OR TXH JHQHUD ULHVJRV SRWHQFLDOHV SDUD ORV FRQVXPLGRUHV KXPDQRV /RV PpWRGRV ItVLFRV \ TXtPLFRV DSOLFDGRV KDVWD KR\ SDUD disminuir las contaminaciones de As no han resultado exitosos. En este contexto, las algas y SODQWDV DFXiWLFDV KLSHUDFXPXODGRUDV GH $V VH SUHVHQWDQ FRPR XQD RSFLyQ SURPHWHGRUD (Q HO DxR XQ JUXSR GH LQYHVWLJDGRUHV GLVHxy XQ VLVWHPD GH WRUUHPHGLDFLyQ GH $V EDVDGR HQ SODQWDV GH Arabidopsis thaliana WUDQVJpQLFDV FDSDFHV GH FRQYHUWLU HO DUVHQDWR en arsenito, el cul era luego secuestrado en ODV KRMDV HQ FRPSOHMRV GH SpSWLGRV TXH FRQWLHQHQ WLROHV (Q SULPHU OXJDU JHQHUDURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ HO JHQ EDFWHULDQR de la arsenato reductasa (arsC), bajo la direcFLyQ GH XQ SURPRWRU GH KRMD LQGXFLEOH SRU OX] En consecuencia, la enzima transgnica slo VH H[SUHVD HQ ODV KRMDV \ HVWDV SODQWDV VRQ KLSHUVHQVLEOHV DO DUVHQDWR 3RU RWUD SDUWH VH REWXYLHURQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDEDQ el gen bacteriano J-glutamilcisteina sintetasa (-ECS EDMR XQ SURPRWRU FRQVWLWXWLYR (VWDV SODQWDV PRVWUDURQ XQD PRGHUDGD WROHUDQFLD DO $V HQ FRPSDUDFLyQ FRQ SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV )LQDOPHQWH HQ DTXHOODV SODQWDV TXH H[SUHVDQ VLPXOWiQHDPHQWH DPERV WUDQVJHQHV (arsC/-ECS VH REVHUYy XQ HIHFWR SRWHQFLDGR de tolerancia al As. En medios con concentraFLRQHV HOHYDGDV GH $V ODV SODQWDV DUV&J-ECS FUHFHQ \ VRQ FDSDFHV GH JHQHUDU HQWUH \ YHFHV PiV ELRPDVD TXH ODV SODQWDV QR WUDQVJpQLFDV R ODV WUDQVJpQLFDV TXH H[SUHVDQ VROR
una de las enzimas. Adems, se observ que acumulaban entre 2 y 3 veces ms arsnico SRU JUDPR GH WHMLGR TXH ODV SODQWDV FRQWURO Aplicaciones comerciales Tratamiento de contaminaciones con metales pesados /D HPSUHVD QRUWHDPHULFDQD Edenspace Systems Corporation FRPHUFLDOL]D SODQWDV FRQ DSOLFDFLRQHV HQHUJpWLFDV \ DPELHQWDOHV /D FRPSDxtD SURYHH WHFQRORJtDV WRDPELHQWDOHV EDVDGDV HQ SODQWDV KLSHUDFXPXODGRUDV GH PHWDOHV \ EULQGD VHUYLFLRV SDUD GHVFRQWDPLQDU DUVpQLFR SORPR XUDQLR \ FRPSXHVWRV RUJiQLFRV GH VXHORV \ DJXDV $GHPiV SURYHH SUHVWDFLRQHV FRPSOHPHQWDULDV D OD WRUUHPHGLDFLyQ TXH LQFOX\HQ DQiOLVLV GH IDFWLELOLGDG ELRGLVSRQLELOLdad, consultoras, etc. EdenfernTM )LJXUD HV un sistema que se desarroll en la Universidad GH )ORULGD \ VH OLFHQFLy D (GHQVSDFH 6H EDVD en el uso de un helecho (Pteris vittata FDSD] de absorber arsnico del suelo, lodo, o agua, FRQ XQD HFLHQFLD YHFHV PD\RU TXH FXDOTXLHU RWUD SODQWD /XHJR GH XQ FLHUWR SHUtRGR los helechos son removidos y descartados de manera segura, dejando el terreno libre de arsnico. Si se asume una concentracin de arVpQLFR HQ HO VXHOR GH PJNJ HVWH SURFHGLPLHQWR SHUPLWH UHGXFLU ORV QLYHOHV GH $V KDVWD PJNJ HQ PHVHV (VWH VLVWHPD SXHGH extraer arsnico del suelo en concentraciones TXH YDQ GHVGH PHQRV GH PJNJ KDVWD PJNJ (Q HVWH VLVWHPD IXH DSOLFDGR FRQ UHVXOWDGRV SURPLVRULRV HQ XQD SHTXHxD SURSLHGDG UHVLGHQFLDO HQ 9LUJLQLD ((88 FX\R VXHlo contena altas concentraciones de arsnico
GHELGR DO XVR GH SHVWLFLGDV /D PLVPD WpFQLFD GH UHPRFLyQ GH $V VH KD XWLOL]DGR SDUD GHVFRQWDPLQDU DJXD XWLOL]DQGR XQ VLVWHPD GH WROWUDcin. Pteris vittata SXHGH UHGXFLU OD FRQFHQWUDFLyQ GH $V SUHVHQWH HQ HO DJXD GHVGH FRQFHQWUDFLRQHV GH PJ/ D PHQRV GH PJ/ HQ VyOR GtDV SHUPLWLHQGR OD UHPRFLyQ FRPSOHWD al cabo de 3 das. Tratamiento de aguas residuales urbanas /RV VDXFHV SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV FRQ QHV GH WRUUHPHGLDFLyQ SDUD HO WUDWDPLHQWR GH aguas residuales urbanas que contienen altas concentraciones de nitrgeno y fsforo. Estas sustancias forman una solucin nutritiva que SXHGH VHU XWLOL]DGD SDUD HO ULHJR GH GLFKRV iUEROHV \ DVt VRQ ELRWUDQVIRUPDGDV HQ ELRPDVD ~WLO (Q (QN|SLQJ XQD FLXGDG GH 6XHFLD FRQ unos 20.000 habitantes, se utiliza un sistema GH WRUUHPHGLDFLyQ SDUD WUDWDU HO DJXD UHVLGXDO ULFD HQ QLWUyJHQR SURFHGHQWH GHO IDQJR GH DOFDQWDULOODGR SUHYLDPHQWH WUDWDGD HQ XQD SODQWD GHSXUDGRUD (O HXHQWH VH GLVWULEX\H SRU XQD SODQWDFLyQ GH VDXFHV GH KHFWiUHDV GXUDQWH HO SHUtRGR GH FUHFLPLHQWR )LJXUD /DV DJXDV FRQWDPLQDGDV FRQWLHQHQ XQRV PJ/ GH QLtrgeno. El sistema trata unas 11 toneladas de nitrgeno y 0,2 toneladas de fsforo al ao en un volumen de 200.000 m3 de aguas residuaOHV /RV SRVLEOHV ULHVJRV PHGLRDPELHQWDOHV como emisiones de xido nitroso (N2O) a la atmsfera, son analizados continuamente; los UHVXOWDGRV REWHQLGRV KDVWD HO SUHVHQWH LQGLFDQ que los mismos son mnimos.
Figura 6. EdenfernTM
Figura 7. 6LVWHPD GH WRUUHPHGLDFLyQ TXH XWLOL]D XQD SODQWDFLyQ GH KHFWiUHDV GH VDXFHV HQ (QN|SLQJ 6XHFLD 3ODQWD GH WUDWDPLHQWR GH DJXDV UHVLGXDOHV SULPHU SODQR SLOHWDV SDUD DOPDFHQDU ODV DJXDV HQ LQYLHUQR DO IRQGR \ FDPSRV GH VDXFHV UHJDGRV FRQ HXHQWHV GH IDQJRV 3 $URQVVRQ
Lecturas recomendadas %HQQLFHOOL 5 6WHSQLHZVND = %DQDFK $ 6]DMQRFKD . 2VWURZVNL - 7KH DELOLW\ RI $]ROla caroliniana to remove heavy metals (Hg(II), &U,,, &U9, IURP PXQLFLSDO ZDVWH ZDWHU &KHPRVSKHUH &KDSSHOO - 3K\WRUHPHGLDWLRQ RI 7&( LQ JURXQGZDWHU XVLQJ 3RSXOXV 86 (QYLURQPHQWDO 3URWHFWLRQ $JHQF\ (Q KWWSFOXLQRUJ SURGXFWVLQWHUQSK\WRWFHKWP &KHULDQ 6 $QG 2OLYHLUD 00 7UDQVgenic Plants in Phytoremediation: recent adYDQFHV DQG QHZ SRVVLELOOLWLHV (QYLURQPHQWDO Science and Technology, 39, 9377-9390. 'KDQNKHU 23 /L < 5RVHQ %3 6KL - 6DOW ' Senecoff JF, Sashti NA, Meagher RB. 2002. (QJLQHHULQJ WROHUDQFH DQG K\SHUDFFXPXODWLRQ RI DUVHQLF LQ SODQWV E\ FRPELQLQJ DUVHQDWH UHductase and gamma-glutamylcysteine syntheWDVH H[SUHVVLRQ 1DWXUH %LRWHFKQRORJ\ 'RW\ 6/ (QKDQFLQJ SK\WRUHPHGLDWLRQ WURXJK WKH XVH RI WUDQVJHQLFV DQG HQGRSK\WHV 1HZ 3K\WRORJLVW .DPDO 0 *KDO\ $( 0DKPRXG 1 &{Wp 5 2004. Phytoaccumulation of heavy metals by DTXDWLF SODQWV (QYLURQ ,QW
0HDJKHU 5% +HDWRQ $& 6WUDWHJLHV IRU WKH HQJLQHHUHG SK\WRUHPHGLDWLRQ RI WR[LF HOHPHQW SROOXWLRQ PHUFXU\ DQG DUVHQLF - ,QG 0LFURELRO %LRWHFKQRO 'LPLWULRX , \ $URQVVRQ 3 6DXFHV SDUD HQHUJtD \ WRUUHPHGLDFLyQ HQ 6XHFLD 8QDV\OYD Pilon-Smits E. 2007. Phytoremediation. Ann 5HY 3ODQW %LRORJ\ 6NLQQHU . :ULJKW 1 3RUWHU*RII ( 0HUFXU\ XSWDNH DQG DFFXPXODWLRQ E\ IRXU VSHFLHV RI DTXDWLF SODQWV (QYLURQPHQWDO 3ROOXWLRQ 9DQ $NHQ % 7UDQVJHQLF SODQWV IRU SK\WRUHPHGLDWLRQ KHOSLQJ QDWXUH WR FOHDQ XS HQYLRQPHQWDO SROOXWLRQ 7UHQGV LQ %LRWHFKQRORJ\ Wevar Oller AL, Agostini E, Talano MA, CaSR]XFFD & 0LOUDG 65 7LJLHU +$ 0HGLQD 0, 2YHUH[SUHVVLRQ RI D EDVLF SHUR[LGDVH in transgenic tomato (Lycopersicon esculentum 0LOO FY 3HUD KDLU\ URRWV LQFUHDVHV SK\WRUHPHGLDWLRQ RI SKHQRO 3ODQW 6FLHQFH ('(163$&( KWWSZZZHGHQVSDFHFRP 9LGHR H[SOLFDWLYR GH OD Environmental Protection Agency (EPA, USA), Crozet Phytorremediation KWWSZZZHSDJRYRHUUSDJHVXSHUIXQGPLVFFUR]HWBSK\WRKWP
V . CAPTULO 16 Plantas como biorreactores

Fernando Almonacid Bravo; Sonia Wirth; Mara Eugenia Segretin; Mauro Morgenfeld; Ezequiel Matas Lentz Introduccin En los ltimos aos, la demanda y el uso de SpSWLGRV \ SURWHtQDV WHUDSpXWLFRV HQ OD PHGLFLQD KXPDQD \ YHWHULQDULD KDQ H[SHULPHQWDGR un marcado incremento. El mercado mundial GH ELRIiUPDFRV SDUD XVR KXPDQR DOFDQ]D DFtualmente los 30.000 millones de dlares, y se HVWLPD TXH VH GXSOLFDUi SDUD HO DxR 0iV GH SURGXFWRV VH HQFXHQWUDQ HQ HYDOXDFLyQ FOtQLFD OLGHUDGRV SRU ORV DQWLFXHUSRV PRQRFORnales de los cuales unos 70 se estaran comerFLDOL]DQGR HQ ORV SUy[LPRV DxRV 6yOR FXDWUR PROpFXODV FRPSUHQGHQ HO GH OD SURGXFFLyQ DFWXDO \ VL ODV SUHGLFFLRQHV VRQ FRUUHFWDV OD GHPDQGD SRGUtD VXSHUDU OD FDSDFLGDG GH manufactura, a menos que se desarrollen nueYRV VLVWHPDV GH SURGXFFLyQ $FWXDOPHQWH OD SURGXFFLyQ GH ELRIiUPDFRV se realiza utilizando bsicamente dos sistemas: microorganismos y cultivo de clulas de mamfero. 5HVSHFWR DO SULPHU VLVWHPD H[LVWH OD GLFXOWDG DVRFLDGD D OD LQFDSDFLGDG TXH WLHQHQ ODV EDFWHULDV \ KRQJRV GH SURGXFLU HQ ODV SURWHtQDV DQLPDOHV FLHUWDV PRGLFDFLRQHV TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VRQ LQGLVSHQVDEOHV SDUD VX IXQFLRQDOLGDG FRPR SRU HMHPSOR HO DJUHJDGR de determinados azcares (glicosilacin). AdePiV HO SOHJDGR LQFRUUHFWR GH OD SURWHtQD \ OD IRUPDFLyQ GH DJUHJDGRV LQVROXEOHV FXHUSRV GH LQFOXVLyQ OLPLWDQ OD REWHQFLyQ GH SURGXFWRV ELROyJLFDPHQWH DFWLYRV R FX\R FRVWR GH SXULcacin sea econmicamente sostenible. Los cultivos de clulas de mamfero, en camELR WLHQHQ OD YHQWDMD GH TXH SHUPLWHQ OD VtQWHVLV GH SURWHtQDV DQLPDOHV PX\ VLPLODUHV D OD original. Sin embargo, la obtencin y manteniPLHQWR GH ODV OtQHDV FHOXODUHV HV XQ SURFHVR ODUJR \ FRVWRVR TXH LPSOLFD JUDQGHV LQYHUVLRQHV DGLFLRQDOHV FXDQGR VH SUHWHQGH LQFUHPHQWDU OD HVFDOD GH SURGXFFLyQ
(VWRV VLVWHPDV UHTXLHUHQ GH SHUVRQDO WpFQLFR HVSHFLDOL]DGR \ FRQOOHYDQ JUDQGHV ULHVJRV econmicos en caso de que ocurran contamiQDFLRQHV HQ OD OtQHD GH SURGXFFLyQ DXQTXH HO FRQWDPLQDQWH QR VHD SDWRJpQLFR SDUD OD VDOXG humana. En este entorno la agricultura molecular o molecular pharming, es decir, la utilizacin de DQLPDOHV R SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV SDUD OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV FRQVWLWX\H XQD DOWHUQDWLYD D ORV VLVWHPDV GH SURGXFcin basados en microorganismos y cultivos de clulas. /D SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV WHUDSpXWLFDV HQ DQLPDOHV WUDQVJpQLFRV SHUPLWH REWHQHU SURductos muy similares a los sintetizados en el RUJDQLVPR DQLPDO RULJLQDO SHUR UHTXLHUH GH XQ WLHPSR GH GHVDUUROOR PX\ ODUJR \ FRVWRVR (O DXPHQWR HQ OD HVFDOD GH SURGXFFLyQ HV OHQWR y se limita a los ciclos naturales de crecimienWR GH OD HVSHFLH XWLOL]DGD $GHPiV H[LVWH HO riesgo de contaminacin con virus animales y SULRQHV 7RGDV ODV GLFXOWDGHV PHQFLRQDGDV KDQ LQWHQVLFDGR ORV HVIXHU]RV SDUD GHVDUUROODU QXHYRV VLVWHPDV GH SURGXFFLyQ GH PROpFXODV UHcombinantes seguras y a bajo costo. (V SRU HOOR TXH ODV YHQWDMDV DVRFLDGDV D OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV HQ ELRrreactores vegetales han transformado a stos HQ XQD RSFLyQ DOWDPHQWH FRPSHWLWLYD Ventajas de las plantas como biorreactores /D SULQFLSDO YHQWDMD GH ODV SODQWDV FRPR VLVWHPDV GH SURGXFFLyQ HV OD GLVSRQLELOLGDG SUiFWLFDPHQWH LOLPLWDGD GH ELRPDVD TXH SXHGH REtenerse utilizando la infraestructura ya existenWH SDUD OD VLHPEUD FRVHFKD DOPDFHQDPLHQWR \ SURFHVDPLHQWR GH ORV FXOWLYRV (O FDSLWDO GH LQYHUVLyQ LQLFLDO \ HO FRVWR SDUD HO DXPHQWR HQ OD HVFDOD GH SURGXFFLyQ VRQ UHODWLYDPHQWH EDMRV 0iV D~Q HO YROXPHQ GH SURGXFFLyQ HV H[WUHPDGDPHQWH H[LEOH \ SXHGH DGDSWDUVH UiSLGDmente a las demandas del mercado incremenWDQGR R GLVPLQX\HQGR OD VXSHUFLH VHPEUDGD 3RU RWUD SDUWH XQD YH] HVWDEOHFLGR HO FXOWLYR QR VH UHTXLHUH GH SHUVRQDO HVSHFLDOL]DGR QR KD\ ULHVJRV GH FRQWDPLQDFLyQ FRQ SDWyJHQRV animales, endotoxinas bacterianas o secuenFLDV GH $'1 RQFRJpQLFDV \ SXHGH DSURYHFKDU-
VH HO FRQRFLPLHQWR SUHYLR GH ORV VLVWHPDV GH PROLHQGD \ H[WUDFFLyQ HQ ODV SULPHUDV HWDSDV GHO SURFHVR GH SXULFDFLyQ 8QD YHQWDMD DGLFLRQDO HV TXH ODV SODQWDV SHUPLWHQ HO DOPDFHQDPLHQWR HVWDEOH GH OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH en semillas y tubrculos, facilitando su conVHUYDFLyQ WUDQVSRUWH \ GLVWULEXFLyQ 0iV D~Q ORV PHFDQLVPRV GH VtQWHVLV \ PRGLFDFLRQHV SRVWHULRUHV VRQ ORV SURSLRV GH ODV FpOXODV GH PDPtIHURV SHUPLWLHQGR OD SURGXFFLyQ \ HQVDPEODGR GH SURWHtQDV PXOWLPpULFDV FRPR ORV DQWLFXHUSRV (V LPSRUWDQWH UHFDOFDU TXH H[LVWHQ GLIHUHQFLDV HQWUH SODQWDV \ DQLPDOHV HQ OD JOLFRVLODFLyQ GH SURWHtQDV HVWDV GLIHUHQFLDV SXHGHQ DIHFWDU OD HVWDELOLGDG OD DFWLYLGDG ELROyJLFD \ OD DQWLJHQLFLGDG HQ UHVXPHQ SRGUtDQ DIHFWDU OD DXWHQWLFLGDG GHO SURGXFWR QDO &XDQGR VH FRPSDUDQ ORV FRVWRV GH SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV HQ GLVWLQWRV sistemas se demuestra que, a menos que los QLYHOHV GH SURWHtQD UHFRPELQDQWH DOFDQ]DGRV VHDQ H[FHVLYDPHQWH EDMRV ORV FRVWRV GH SURGXFFLyQ HQ SODQWDV VRQ JHQHUDOPHQWH LQIHULRres a los de otros sistemas. 0iV GHO GHO FRVWR GH SURGXFFLyQ GH XQD SURWHtQD UHFRPELQDQWH GHSHQGH GHO SURFHVR GH SXULFDFLyQ $O UHVSHFWR ODV SODQWDV SRVHHQ YHQWDMDV SURSLDV TXH SHUPLWHQ UHGXFLU HVWRV YDORUHV D WUDYpV GH OD H[SUHVLyQ GLUHFWD HQ WHjidos comestibles o la acumulacin en tubrcuORV R VHPLOODV /DV SHUVSHFWLYDV GH DXPHQWDU D~Q PiV ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ TXH VH IDEULTXH XQD PD\RU FDQWLGDG GH OD SURWHtQD GH inters en los tejidos vegetales) y el desarrollo GH WpFQLFDV PiV HFRQyPLFDV GH SXULFDFLyQ SHUPLWLUiQ SURGXFLU SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV D costos entre 10 y 100 veces inferiores a los de los fermentadores bacterianos. 5HVXPLHQGR OR H[SXHVWR SDUD TXH OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV HQ SODQtas sea econmicamente rentable es necesaULR FXPSOLU FRQ WUHV UHTXLVLWRV SULPRUGLDOHV D DOFDQ]DU DOWRV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ E UHGXFLU ORV FRVWRV GH SXULFDFLyQ \ F ORJUDU XQ SURducto de caractersticas idnticas o similares al sintetizado en el sistema nativo (autenticidad). (VWUDWHJLDV SDUD OD RSWLPL]DFLyQ GH OD produccin /D RSWLPL]DFLyQ GH ORV QLYHOHV GH SURGXFFLyQ
GH OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH SXHGH ORJUDUVH VLguiendo diversas estrategias. La eleccin de la PLVPD R FRPELQDFLyQ GH HOODV GHSHQGHUi GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH OD SURWHtQD D VLQWHWL]DU GH OD HVSHFLH YHJHWDO XWLOL]DGD \ GH ODV QHFHVLGDGHV GH SURGXFFLyQ *HQHUDOPHQWH HV GLItFLO SUHGHFLU FXiO GH HVWRV DVSHFWRV WHQGUi PD\RU LPSDFWR SDUD SURGXFLU FRQ p[LWR XQD SURWHtQD SDUWLFXODU (OOR UHTXLHUH SRU OR WDQWR HQVD\DU P~OWLSOHV YDULDEOHV SDUD ORJUDU QLYHOHV ySWLPRV GH SURGXFFLyQ /RV HOHPHQWRV D WHQHU HQ FXHQWD VRQ OD HOHFFLyQ GHO VLVWHPD GH H[SUHVLyQ \ GHO JHUPRSODVPD D WUDQVIRUPDU \ HO XVR GH herramientas moleculares (secuencias regulaGRUDV GH OD H[SUHVLyQ SDUD HO GLVHxR GH ODV construcciones genticas que contengan las VHFXHQFLDV GH ODV SURWHtQDV D H[SUHVDU (OHFFLyQ GHO VLVWHPD GH H[SUHVLyQ En cuanto a la eleccin del sistema de exSUHVLyQ ODV RSFLRQHV FRPSUHQGHQ GRV JUDQGHV JUXSRV VLVWHPDV LQWHJUDWLYRV \ QR LQWHJUDWLYRV (O SULPHU JUXSR VH UHHUH D DTXHOORV VLVWHPDV TXH SHUPLWHQ OD LQWHJUDFLyQ HVWDEOH GH OD FRQVtruccin gentica en el genoma vegetal, tanto en el ncleo como en las organelas. El resultado es una transformacin estable y heredable, UHTXLHUH HWDSDV GH FXOWLYR GH WHMLGRV \ PpWRGRV GH WUDQVIRUPDFLyQ HFLHQWHV TXH SRU OR JHQHUDO LQVXPHQ XQ WLHPSR FRQVLGHUDEOH /D WUDQVIRUPDFLyQ QXFOHDU SUHVHQWD OD YHQWDMD GH FRQWDU FRQ SURWRFRORV GH WUDQVIRUPDFLyQ HVWDEOHFLGRV SDUD PXFKDV HVSHFLHV YHJHWDOHV OD GHVYHQWDMD HV TXH GHELGR D HIHFWRV GH SRVLcin y/o silenciamiento gnico, muchas veces ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ DOFDQ]DGRV QR VRQ OR VXFLHQWHPHQWH DOWRV FRPR SDUD KDFHU YLDEOH OD SURGXFFLyQ /D WUDQVIRUPDFLyQ GH FORURSODVWRV RUJDQHla caracterstica de las clulas vegetales que FRQWLHQH VX SURSLR JHQRPD KD UHVXOWDGR VHU XQD DOWHUQDWLYD PX\ LQWHUHVDQWH SDUD OD H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV SRU QXPHURVDV YHQWDMDV HQWUH HOODV HO JUDQ Q~PHUR GH FORURSODVWRV SRU FpOXOD \ HO JUDQ Q~PHUR GH FRSLDV GH VX PDWHULDO JHQpWLFR GHQWUR GH FDGD FORURSODVWR OR TXH SHUPLWLUtD DOFDQ]DU DOWRV QLYHOHV GH H[SUHsin. La insercin al genoma ocurre mediante UHFRPELQDFLyQ KRPRORJD SHUPLWLHQGR GLULJLU DO WUDQVJpQ D XQ HVSDFLR LQWHUJpQLFR \ KDVWD HO
PRPHQWR QR VH KDQ UHSRUWDGR HQ FORURSODVWRV HIHFWR GH SRVLFLyQ R VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR 0iV D~Q DO QR WUDQVPLWLUVH ORV FORURSODVWRV DO SROHQ HQ OD PD\RUtD GH ODV SODQWDV VH GLFXOWD HO XMR KRUL]RQWDO D HVSHFLHV UHODFLRQDGDV /D GHVYHQWDMD TXH SRVHH HVWH VLVWHPD HV ODV SURWHtQDV VLQWHWL]DGDV HQ HVWDV RUJDQHODV QR SXHGHQ VHU JOLFRVLODGDV Los sistemas no integrativos, en cambio, no requieren de la integracin del transgn, son PiV UiSLGRV SHUR QR VRQ KHUHGDEOHV D OD SURJHQLH (Q HVWH ~OWLPR JUXSR VH HQFXHQWUDQ OD transformacin transitoria con vectores virales \ OD DJURLQOWUDFLyQ 6L ELHQ QR VH SUHVHQWDQ HQ HVWRV VLVWHPDV ORV SUREOHPDV GH EDMD H[SUHVLyQ DVRFLDGRV D OD SRVLFLyQ GH LQWHJUDFLyQ Vt H[LVWHQ OLPLWDFLRQHV GH H[SUHVLyQ GHELGR D VLOHQFLDPLHQWR SRVWWUDQFULSFLRQDO Recientemente, mediante el uso de vectores virales de nueva generacin, se han logrado QLYHOHV GH H[SUHVLyQ PX\ DOWRV HQ XQ VLVWHPD GHQRPLQDGR magninfection. (OHFFLyQ GH OD HVSHFLH YHJHWDO (Q FXDQWR D OD HVSHFLH YHJHWDO H[LVWHQ GLVWLQWDV SODQWDV TXH KDQ VLGR XWLOL]DGDV FRPR SODWDIRUPD HQ ORV ELRUUHDFWRUHV HQWUH ODV TXH VH LQFOX\HQ WDEDFR SDSD WRPDWH PDt] HWF (Q SULQFLSLR QR H[LVWH XQD UHJOD TXH SHUPLWD HOHJLU OD SODQWD LGHDO SDUD XQ GHWHUPLQDGR REMHWLvo. Sin embargo, existen factores a tener en cuenta al momento de decidir cul ser el sisWHPD HOHJLGR (QWUH HOORV SRGHPRV FLWDU GLVSRQLELOLGDG GH SURWRFRORV GH WUDQVIRUPDFLyQ \ VLVWHPDV GH H[SUHVLyQ WUDQVLWRULRV IDFLOLGDG GH cultivo a gran escala, rendimiento de biomaVD HVWDELOLGDG GH OD SURWHtQD HQ ORV GLVWLQWRV WHMLGRV GH OD SODQWD SRVLELOLGDG GH H[SUHVDU OD SURWHtQD HQ WHMLGRV FRPHVWLEOHV IDFLOLGDG GH SXULFDFLyQ IDFLOLGDG GH FRQWHQFLyQ GHO FXOWLYR \ RWURV DVSHFWRV UHODFLRQDGRV FRQ OD VHJXULGDG alimentaria y medioambiental, entre otros. As SRU HMHPSOR OD SODQWD GH WDEDFR SUHVHQWD ODV siguientes ventajas: cuenta con diversos sistePDV GH WUDQVIRUPDFLyQ SHUPLWH DOFDQ]DU DOWRV rendimientos (biomasa), existe infraestructura SDUD HO SURFHVDPLHQWR D JUDQ HVFDOD \ SHUPLWH H[LELOLGDG HQ HO FDPELR GH HVFDOD GH SURGXFFLyQ (QWUH ODV GHVYHQWDMDV SRGHPRV FLWDU HO tejido (hojas) debe ser enfriado o deshidrata-
GR LQPHGLDWDPHQWH GHVSXpV GH OD FRVHFKD SDUD VHU WUDQVSRUWDGR SDUD VX SURFHVDPLHQWR HYLWDQGR OD GHJUDGDFLyQ GH ODV SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV $O VHU HO WDEDFR XQD SODQWD QR FRPHVWLEOH SUHVHQWD OD YHQWDMD GH QR LQJUHVDU D OD FDGHQD DOLPHQWDULD ELRVHJXULGDG SHUR HV QHFHVDULR SXULFDU OD SURWHtQD SDUD HOLPLQDU FRPSXHVWRV Wy[LFRV SUHVHQWHV HQ OD SODQWD de tabaco tales como alcaloides; no obstante, existen variedades de tabaco con bajo contenido de alcaloides. (O XVR GH FHUHDOHV FRPR HO PDt] SHUPLWH DFXPXODU OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH HQ ODV VHPLOODV OR TXH IDFLOLWD VX DOPDFHQDMH \ GD H[LELOLGDG DO SURFHVR GH SURGXFFLyQ \D TXH VH SXHGH DOPDFHQDU HO JUDQR KDVWD HO PRPHQWR TXH VHD QHFHVDULR FRPHQ]DU FRQ HO SURFHVR GH SXULFDFLyQ /D GHVYHQWDMD HV TXH DO VHU XQD SODQWD FRPHVWLEOH SRGUtD LQJUHVDU LQYROXQWDULDmente a la cadena alimentaria. /RV VLVWHPDV GH H[SUHVLyQ EDVDGRV HQ IUXWDV \ KRUWDOL]DV SHUPLWHQ XWLOL]DU GLUHFWDPHQWH HO WHMLGR YHJHWDO VLQ OD QHFHVLGDG GH SXULFDU OD SURWHtQD \ UHDOL]DQGR VRODPHQWH XQD HVWDQdarizacin de los niveles de acumulacin de OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH HQ HO WHMLGR YHJHWDO (VWR HV GH JUDQ XWLOLGDG HQ OD SURGXFFLyQ GH YDFXQDV RUDOHV DQWLFXHUSRV TXH VHUiQ XWLOL]DGRV HQ DSOLFDFLRQHV WySLFDV \ FXDQGR HO WHMLGR VHUi XWLOL]DGR FRPR VXSOHPHQWR GLHWDULR /D GHVYHQtaja de estos cultivos es similar a la mencionaGD SDUD HO PDt] 2WUD SODWDIRUPD GH SURGXFFLyQ HV OD TXH XWLOLza a las lentejas de agua (Lemna minor). Estas VRQ SODQWDV DFXiWLFDV TXH VH UHSURGXFHQ D XQ ULWPR PX\ DFHOHUDGR \ VH SXHGHQ FXOWLYDU HQ condiciones controladas usando medios cuya FRPSRVLFLyQ HV VHQFLOOD \ HFRQyPLFD /DV SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV SXHGHQ VHU VHFUHWDGDV DO PHGLR GH FXOWLYR R ELHQ SXULFDGDV D SDUWLU de la biomasa vegetal. 8QD DOWHUQDWLYD DO XVR GH SODQWDV HQWHUDV FRPR SODWDIRUPDV GH H[SUHVLyQ HV OD GH XWLOL]DU cultivos de clulas vegetales. Estos sistemas SHUPLWHQ XQD SURGXFFLyQ HQ FRQGLFLRQHV GH HVWHULOLGDG \ HV XQ VLVWHPD FRQWHQLGR /DV SURWHtQDV H[SUHVDGDV HQ VXVSHQVLRQHV GH FpOXODV YHJHWDOHV HQ FXOWLYR SXHGHQ VHU VHFUHWDGDV DO medio de cultivo o retenidas en el interior de la clula.
La tabla 1 muestra algunos de los sistemas XWLOL]DGRV \ VXV SULQFLSDOHV FDUDFWHUtVWLFDV 2SWLPL]DFLyQ GH ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ Existen muchas herramientas moleculares TXH SHUPLWHQ RSWLPL]DU HO VLVWHPD GH H[SUHsin, e incluyen: la eleccin de elementos genticos reJXODGRUHV SDUD H[SUHVDU OD SURWHtQD HQ WHMLGRV YHJHWDOHV HVSHFtFRV OD DGDSWDFLyQ GHO XVR GH FRGRQHV OD IXVLyQ D RWUDV SURWHtQDV OD ORFDOL]DFLyQ GH OD SURWHtQD HQ GLVWLQWRV FRPSDUWLPHQWRV LQWUDFHOXODUHV SDUD aumentar su estabilidad y/o facilitar su SXULFDFLyQ OD FRH[SUHVLyQ GH VXSUHVRUHV GHO VLOHQFLDPLHQWR YLUDOHV SDUD HYLWDU HO VLOHQFLDPLHQWR JpQLFR SRVWWUDQVFULSFLRQDO ([LVWHQ GLVWLQWRV WLSRV GH SURPRWRUHV TXH KDQ VLGR XWLOL]DGRV HQWUH HOORV SURPRWRUHV FRQVWLWXWLYRV SURPRWRUHV LQGXFLEOHV \ SURPR-
WRUHV HVSHFtFRV GH XQ GHWHUPLQDGR yUJDQR R WHMLGR /D HOHFFLyQ GH ORV GLVWLQWRV WLSRV GH SURPRWRUHV SHUPLWLUi HQWRQFHV H[SUHVDU OD SURtena recombinante en todos los tejidos de la SODQWD FRQVWLWXWLYDPHQWH R VyOR FXDQGR XQR OR GHWHUPLQD PHGLDQWH OD DSOLFDFLyQ GH XQ HVWLPXOR ItVLFR R TXtPLFR H[WHUQR SHUPLWLHQGR SURGXFLU SURWHtQDV TXH SRGUtDQ VHU GHOHWpUHDV SDUD OD SODQWD 2WUD RSFLyQ VHUtD H[SUHVDUODV HQ DTXHO DPELHQWH GRQGH OD SURWHtQD VHD PiV HVWDEOH PHGLDQWH HO XVR GH SURPRWRUHV WHMLGR HVSHFtFRV 'HVWLQR QDO GH OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH Otros factores a tener en cuenta a la hora GH GHFLGLU XQD HVWUDWHJLD SDUD OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV HQ SODQWDV DGHPiV GH OD HOHFFLyQ GH OD HVSHFLH YHJHWDO HV D TXp FRPSDUWLPHQWR GH OD FpOXOD YHJHWDO FLWRSODVPD UHWtFXOR HQGRSOiVPLFR YDFXROD FORURSODVWR VH GLULJH VX DFXPXODFLyQ 6L OD SURWHtQD HV LQHVWDEOH HQ HO FLWRVRO HV SRVLEOH DJUHJDU XQ SpSWLGR VHxDO HQ
Figura 1. 5L]RVHFUHFLyQ HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV 3ODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WDEDFR TXH H[SUHVDQ K(*) creciendo en medio MS sobre un disco de nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot realizado sobre HVWDV PHPEUDQDV \ UHYHODGR FRQ XQ DQWLFXHUSR DQWLK(*) GHUHFKD
Tomate
Consumo crudo de los frutos. Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en frutos. Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido. Contenido proteico en frutos relativamente bajo. Tecnologa de produccin ampliamente establecida. Almacenamiento estable de la protena recombinante en las semillas. Procesamiento industrial de las semillas bien establecido. Alto contenido proteico en hojas. Produccin de biomasa abundante.
Cereales
Alfalfa
Lemna (lenteja Alta eficiencia de proliferacin clonal. de agua) Alta tasa de duplicacin de la biomasa. Rizosecresin muy eficiente. Physcomitrella Genoma completamente secuenciado. (musgo) Transformacin por recombinacin homologa.
VX H[WUHPR 1WHUPLQDO SDUD TXH VHD WUDQVSRUWDGD DO UHWtFXOR HQGRSODVPiWLFR GH QR FRQWDU FRQ RWUD VHxDO OD SURWHtQD VHJXLUi VX FDPLQR \ OXHJR GH SDVDU SRU HO *ROJL VHUi HQYLDGD DO HVSDFLR LQWHUFHOXODU R HVSDFLR DSRSOiVWLFR 6L SRVHH OD VHxDO GH UHWHQFLyQ +.'(/ OD SURtena ser entonces retenida en retculo y se HYLWD DVt TXH VH SURGX]FDQ ODV JOLFRVLODFLRQHV PiV FRPSOHMDV TXH RFXUUHQ HQ HO *ROJL $OWHUQDWLYDPHQWH VH SXHGH DJUHJDU DGHPiV GHO SpSWLGR GH HQYtR D UHWtFXOR VHxDOHV SDUD TXH HO GHVWLQR QDO VHDQ ODV YDFXRODV )LQDOPHQWH VH SXHGHQ H[SUHVDU ODV SURWHtQDV HQ HO FORURSODVWR SODQWDV WUDQVSODVWyPLFDV R GLULJLUODV GHVGH HO FLWRVRO D ORV FORURSODVWRV XWLOL]DQGR seales amino-terminales adecuadas como, SRU HMHPSOR OD GH OD VXEXQLGDG SHTXHxD GH OD ULEXORVDELVIRVIDWR FDUER[LODVD R[LJHQDVD 5XELVFR ([LVWHQ SXEOLFDFLRQHV TXH PXHVWUDQ YDULDFLRQHV PX\ VLJQLFDWLYDV HQ ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ GH XQD GHWHUPLQDGD SURWHtQD HQ GLIHUHQWHV FRPSDUWLPHQWRV 'H HOODV VH GHGXFH OD QHFHVLGDG GH HQYLDU OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH D DTXHO HVSDFLR LQWUDFHOXODU GRQGH DOFDQFH XQ FRUUHFWR SOHJDPLHQWR \ HQ FRQVHFXHQFLD PHMRUHV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ DO HYLWDU ORV PHFDQLVPRV GH SURWHyOLVLV GHVWLQDGRV D UHFXSHUDU DPLQRiFLGRV GH SURWHtQDV PDO SOHJDGDV 3RU HMHPSOR OD H[SUHVLyQ GH K(*) IDFWRU GH FUHFLPLHQWR HSLGpUPLFR KXPDQR HQ WDEDFRV WUDQVJpQLFRV HV YHFHV PD\RU HQ DSRSODVWR TXH HQ FLWRSODVPD (O DXPHQWR FRQVLGHUDEOH GH ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ DO GLULJLU OD H[SUHVLyQ GH K(*) DO HVSDFLR LQWHUFHOXODU DSRSODVWR SUREDEOHPHQWH VH GHED D TXH DO WUDQVLWDU D WUDYpV GHO VLVWHPD GH VHFUHFLyQ SDVDQGR SRU UHWtFXOR SXHGHQ IRUPDUVH FRUUHFWDPHQWH ORV SXHQWHV GLVXOIXUR SUHVHQWHV HQ HVWD SURWHtQD TXH VRQ QHFHVDULRV SDUD DOFDQ]DU VX FRQIRUPDFLyQ PiV HVWDEOH )LQDOPHQWH OD SURtena es secretada al medio que rodea a las UDtFHV UL]RVHFUHFLyQ KHFKR TXH SHUPLWLUtD SXULFDU K(*) UHFRPELQDQWH GHO PHGLR GH FXOWLYR en el cul se encuentran inmersas las races GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV FUHFLHQGR HQ XQ VLVWHPD KLGURSyQLFR JXUD Por ltimo, otro factor a tener en cuenta a la KRUD GH SODQWHDU XQD HVWUDWHJLD GH H[SUHVLyQ GH SURWHtQDV KHWHUyORJDV HQ SODQWDV HV HO WHMLGR X yUJDQR GH OD SODQWD HQ FXiO KD GH DFXPXODUVH GLFKD SURWHtQD KRMDV WXEpUFXORV
Figura 1. 5L]RVHFUHFLyQ HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV 3ODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WDEDFR TXH H[SUHVDQ hEGF, creciendo en medio MS sobre un disco de nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot realizado sobre estas membranas y revelado con un DQWLFXHUSR DQWLK(*) GHUHFKD
VHPLOODV UDtFHV VXVSHQVLRQHV FHOXODUHV /D HOHFFLyQ LQXLUi HQ HO PHMRUDPLHQWR GH ORV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ \D VHD SHUPLWLHQGR REWHQHU una mayor estabilidad yo mejores condiciones SDUD VX DOPDFHQDPLHQWR \ DVt HYLWDU VX GHJUDdacin. 'H WRGR OR H[SXHVWR VH GHVSUHQGH TXH ODV SODQWDV SXHGHQ FRQVWLWXLU XQ VLVWHPD FRQ QXmerosas ventajas frente a otros sistemas GLVSRQLEOHV SDUD OD SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV GH DSOLFDFLyQ WHUDSpXWLFD R LQGXVWULDO $XQTXH SDUD FDGD SURWHtQD HQ SDUWLcular se deban evaluar distintas alternativas hasta encontrar aquella en la que los niveles GH H[SUHVLyQ VHDQ ySWLPRV HV GH HVSHUDU TXH D FRUWR SOD]R OD XWLOL]DFLyQ GH ODV SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV VHD OD RSFLyQ PiV DWUDFWLYD Estrategias para reducir los costos de SXULFDFLyQ 8QD HVWUDWHJLD FRP~QPHQWH XWLOL]DGD SDUD UHGXFLU ORV FRVWRV GH SXULFDFLyQ FRQVLVWH HQ DFXPXODU OD SURWHtQD VLQWHWL]DGD HQ HO HVSDFLR H[WUDFHOXODU R DSRSODVWR (O HQYtR DO HVSDFLR extracelular se logra fusionando el extremo FRUUHVSRQGLHQWH DO DPLQR WHUPLQDO GHO JHQ GH
inters a una secuencia seal que dirige el WUDQVSRUWH GH OD SURWHtQD DO UHWtFXOR HQGRSODVmtico y de all a la va de secrecin. Estos WLSRV GH SpSWLGRV VHxDO VH KDOODQ DPSOLDPHQWH FRQVHUYDGRV HQ VX IXQFLyQ \ VRQ SURFHVDGRV HQ IRUPD FRWUDGXFFLRQDO SRU XQD SHSWLGDVD HVSHFtFD SUHVHQWH HQ HO OXPHQ GHO UHWtFXOR HQGRSODVPiWLFR (O DSRSODVWR YHJHWDO HVWi HQ contacto directo con el medio externo, de manera tal que si la raz est creciendo en un VLVWHPD KLGURSyQLFR OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH se acumular en el medio. Como el nmero de SURWHtQDV VHFUHWDGDV HV JHQHUDOPHQWH EDMR HVWR IDFLOLWD HO SURFHVR GH SXULFDFLyQ 6L OD solucin que circula en torno a la rizsfera se UHQXHYD FRQVWDQWHPHQWH SXHGH GHVDUUROODUVH as un sistema de extraccin continua de la SURWHtQD HQ FXHVWLyQ 2WUD HVWUDWHJLD TXH SHUPLWH UHGXFLU ORV FRVWRV GH SXULFDFLyQ VH EDVD HQ OD IXVLyQ GH OD SURWHtQD GH LQWHUpV D XQD ROHRVLQD /DV ROHRVLQDV VRQ SURWHtQDV SHTXHxDV TXH VH HQFXHQWUDQ LQVHUWDGDV HQ OD PRQRFDSD GH IRVIROtSLGRV GH ORV FXHUSRV JUDVRV (VWDV SURWHtQDV VH DFXPXODQ HQ ODV VHPLOODV GH ODV SODQWDV oleaginosas a niveles elevados. En colza, reSUHVHQWDQ HQWUH HO \ HO GHO WRWDO GH ODV SURWHtQDV GH OD VHPLOOD /DV FRQVWUXFFLRQHV incluyen una secuencia de reconocimiento esSHFtFD SDUD XQD SURWHDVD 8QD YH] UHDOL]DGD OD SXULFDFLyQ OD SURWHtQD GH LQWHUpV VH UHVFDWD GH OD IXVLyQ SRU WUDWDPLHQWR FRQ OD SURWHDVD TXH UHFRQRFH HVWD VHFXHQFLD SHSWtGLFD /D SXULFDFLyQ GH OD SURWHtQD IXVLRQDGD D ROHRVLQDV HV VXPDPHQWH VHQFLOOD \ SHUPLWH FRQFHQWUDU YDULDV YHFHV HO SURGXFWR GH LQWHUpV %iVLFDPHQWH FRQVLVWH HQ HO SURFHVDGR \ homogeneizacin del material vegetal (semiOODV GH OD SODQWD ROHDJLQRVD VHJXLGR GH XQD FHQWULIXJDFLyQ HQ OD TXH VH VHSDUDQ OD IDVH DFXRVD GH OD OLStGLFD (VWD ~OWLPD TXH FRQWLHQH ORV FXHUSRV JUDVRV FRQ OD SURWHtQD GH IXVLyQ HV VHSDUDGD UHVXVSHQGLGD \ WUDWDGD FRQ OD SURWHDVD TXH UHFRQRFH OD VHFXHQFLD TXH SHUPLWH OLEHUDU OD SURWHtQD UHFRPELQDQWH /D VXVSHQVLyQ HV OXHJR FHQWULIXJDGD SDUD VHSDUDU QXHYDPHQWH OD IDVH DFXRVD GH OD OLStGLFD /D SURWHtQD GH LQWHUpV VH FRQFHQWUD DVt HQ OD IDVH DFXRVD OD FXDO VH XWLOL]DUi SDUD VX SXULFDFLyQ SRVWHULRU
Autenticidad del producto obtenido: glicosilacin 0XFKDV SURWHtQDV WHUDSpXWLFDV VRQ JOLFRSURWHtQDV HQ ODV FXiOHV OD JOLFRVLODFLyQ SXHGH afectar caractersticas fundamentales, como su resistencia a la desnaturalizacin trmica, GHJUDGDFLyQ SURWHROtWLFD VROXELOLGDG \ DFWLYLdad biolgica. 8QD GH ODV GLIHUHQFLDV PiV LPSRUWDQWHV HQ ODV PRGLFDFLRQHV SRVWWUDGXFFLRQDOHV HQWUH SODQWDV \ DQLPDOHV HV HO SDWUyQ GH 1JOLFRVLODFLyQ /DV SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV KXPDQDV VLQWHWL]DGDV HQ SODQWDV FRQWLHQHQ JUXSRV FDUERKLGUDWRV GHO WLSR [LORVD DXVHQWH HQ SURWHtQDV KXPDQDV \ FRQWLHQHQ XQD PROpFXOD GH IXFRVD XQLGD SRU XQ HQODFH GHO WLSR HQ OXJDU GH FRPR RFXUUH HQ KXPDQRV Adems, carecen de residuos terminales de galactosa y cido silico (cido N-acetilneuraQtPLFR HQFRQWUDGRV HQ PXFKDV SURWHtQDV QDtivas humanas. Aunque algunos trabajos han demostrado TXH DQWLFXHUSRV H[SUHVDGRV HQ VLVWHPDV YHJHWDOHV FRQWHQLHQGR JOLFDQRV HVSHFtFRV GH SODQWDV QR VRQ LQPXQRJpQLFRV HQ PDPtIHURV \ TXH ODV SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV H[SUHVDGDV en otros sistemas animales (incluyendo clulas HQ FXOWLYR GH PDPtIHUR FRPR ODV &+2 SUHVHQWDQ GLIHUHQFLDV HQ ORV SDWURQHV GH JOLFRVLODFLyQ UHVSHFWR GHO KXPDQR HO XVR WHUDSpXWLFR VHJXUR LPSRQH SURGXFLU SURWHtQDV FRQ ODV PLVPDV caractersticas. Por ello, se ha dedicado un gran esfuerzo en GLVHxDU HVWUDWHJLDV TXH SHUPLWDQ OD KXPDQL]DFLyQ GH OD JOLFRVLODFLyQ GH ODV SURWHtQDV VLQWHWL]DGDV HQ SODQWDV (VWDV HVWUDWHJLDV LQFOX\HQ D H[SUHVLyQ GH OD JDODFWRVLOWUDQVIHUDVD KXPDQD HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV SDUD OD SURGXFFLyQ GH DQWLFXHUSRV UHFRPELQDQWHV FRQ glicanos extendidos en galactosa; b) retencin GH OD SURWHtQD HQ HO UHWtFXOR HQGRSOiVPiWLFR OD GLIHUHQFLDFLyQ HQ ORV SDWURQHV GH JOLFRVLODFLyQ HQWUH SODQWDV \ PDPtIHURV RFXUUHQ D QLYHO GHO DSDUDWR GH *ROJL YHU JXUD F LQDFWLYDFLyQ GH OD IXFRVLOWUDQVIHUDVD \ OD [LORVLOWUDQVIHUDVD GH SODQWDV (VWR ~OWLPR KD sido logrado recientemente en Lemna minor PHGLDQWH VLOHQFLDPLHQWR SRVWWUDQVFULSFLRQDO \ en el musgo Physcomitrella patens mediante el DSDJDGR R knock-out del gen en cuestin. Al-
Figura 2. $GLFLyQ \ SURFHVDPLHQWR GH 1JOLFDQRV HQ HO UHWtFXOR HQGRSOiVPLFR (5 \ DSDUDWR GH *ROJL HQ clulas vegetales y de mamferos. 8Q ROLJRVDFiULGR SUHFXUVRU HQVDPEODGR HQ XQ WUDQVSRUWDGRU GH OtSLGRV HV WUDQVIHULGR D UHVLGXRV $VQ HVSHFtFRV HQ HO SROLSpSWLGR HQ VtQWHVLV 'XUDQWH ORV HYHQWRV GH PDGXUDFLyQ WDUGtRV HQ HO *ROJL VH JHQHUDQ GLIHUHQFLDV HQ HO SURFHVDPLHQWR GH ORV 1JOLFDQRV FRPSOHMRV HQWUH FpOXODV animales y vegetales.
WHUQDWLYDPHQWH VH SXHGH G SUHYHQLU FRPSOHtamente la glicosilacin inactivando los sitios de glicosilacin al mutar los residuos Asn y Ser/ 7KU (VWD HVWUDWHJLD IXH XWLOL]DGD HQ OD SURGXFFLyQ GH DQWLFXHUSRV \ VH SXGR FRPSUREDU TXH OD DXVHQFLD GH JOLFRVLODFLyQ QR PRGLFR VXV FDractersticas biolgicas. Protenas expresadas en plantas: vacunas, anticuerpos y otros ejemplos 8QD GH ODV DSOLFDFLRQHV PiV SURPHWHGRUDV GH ODV SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV HV VX SRWHQFLDO XVR SDUD OD SURGXFFLyQ GH DQWtJHQRV HQ tejidos comestibles (vacunas comestibles). La SURGXFFLyQ GH SURWHtQDV DQWLJpQLFDV HQ ORV WHMLGRV YHJHWDOHV SHUPLWLUtD SURWHJHUODV GH OD GHgradacin en el tracto gastrointestinal, un factor FUtWLFR SDUD GHVDUUROODU XQD YDFXQD RUDO H[LWRVD $ VX SRWHQFLDO EDMR FRVWR GH SURGXFFLyQ VH suma la ventaja de su fcil distribucin y admiQLVWUDFLyQ /D H[SUHVLyQ HQ WHMLGRV GH DOPDFHQDPLHQWR WXEpUFXORV R VHPLOODV SRU HMHPSOR HQ ORV TXH ODV SURWHtQDV VRQ HVWDEOHV D WHPSHUDWXUD DPELHQWH SHUPLWLUtD REYLDU OD QHFHVLGDG de mantener una cadena de fro, requerimiento que constituye una de las limitaciones econPLFDV PiV LPSRUWDQWHV SDUD OD GLVWULEXFLyQ GH
ODV YDFXQDV HQ PXFKDV UHJLRQHV JHRJUiFDV GHO PXQGR 6LQ HPEDUJR QR VH SXHGH REYLDU HO SULQFLSDO GHVDItR HQ OD SURGXFFLyQ GH XQD YDFXQD TXH WRGR VLVWHPD GH SURGXFFLyQ GHEH enfrentar; esto es, que el antgeno debe conservar su integridad estructural y actividad funFLRQDO SDUD LQGXFLU XQD UHVSXHVWD LQPXQH SURWHFWRUD (V LPSRUWDQWH PHQFLRQDU TXH GDGD OD QHFHVLGDG GH DSOLFDU GRVLV FRQWURODGDV GH ORV FRPSXHVWRV IDUPDFROyJLFRV VH SODQWHD OD SURGXFFLyQ GH FiSVXODV FRQ WHMLGR YHJHWDO SURFHsado en lugar del consumo de material vegetal IUHVFR VLQ SURFHVDU +DVWD OD DFWXDOLGDG VH KDQ H[SUHVDGR HQ SODQWDV XQ Q~PHUR FRQVLGHUDEOH GH DQWtJHQRV TXH LQFOX\HQ SRWHQFLDOHV YDFXQDV FRQWUD ORV agentes causales de diarreas, como los rotaYLUXV FHSDV HQWHURSDWRJpQLFDV GH Escherichia coli, Vibrio cholerae y el virus Norwalk, as FRPR FRQWUD ODV LQIHFFLRQHV SURGXFLGDV SRU ORV YLUXV GH OD KHSDWLWLV % \ & HO YLUXV GH LQPXQRGHFLHQFLD KXPDQD +,9 HO YLUXV GHO SDSLORPD KXPDQR HO YLUXV GH OD UDELD \ HO YLUXV GH OD HEUH DIWRVD 7DPELpQ VH KD UHSRUWDGR OD H[SUHVLyQ GH DQWtJHQRV SDUD YDFXQDV FRQWUD DJHQWHV SDWyJHQRV EDFWHULDQRV FRPR Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Baci-
llus anthracis \ HO SDUiVLWR UHVSRQVDEOH GH OD malaria, Plasmodium falciparum, entre otros. Algunos de estos antgenos ya se evaluaron en ensayos clnicos en humanos, incluyendo OD LQPXQL]DFLyQ SRU LQJHVWLyQ GH KRMDV GH OHFKXJD TXH FRQWLHQHQ DO DQWtJHQR GH VXSHUFLH GHO YLUXV GH OD KHSDWLWLV % KXPDQD +%V$J WXEpUFXORV GH SDSD TXH H[SUHVDQ OD VXEXQLGDG % de la toxina de E. coli HQWHURSDWRJpQLFDV R OD FiSVLGH GHO YLUXV 1RUZDON \ KRMDV GH HVSLQDFD TXH SURWHJHQ FRQWUD OD UDELD (Q WRGRV HOORV VH REVHUYy DOJ~Q WLSR GH UHVSXHVWD LQPXQH WDQWR VLVWpPLFD FRPR HQ PXFRVDV DOHQWDQGR OD SRsibilidad de desarrollar vacunas orales contra pVWRV \ RWURV SDWyJHQRV KXPDQRV 5HFLHQWHPHQWH OD HPSUHVD 'RZ$JUR6FLHQFH REWXYR OD DSUREDFLyQ HQ ORV (VWDGRV 8QLGRV GH $PHULFD SDUD FRPHUFLDOL]DU XQD YDFXQD FRQWUD HO YLUXV GH OD HQIHUPHGDG GH 1HZFDVWOH SURGXFLGD HQ clulas de tabaco cultivadas in-vitro. Si bien esta vacuna no ha sido introducida al mercado, HV FRQVLGHUDGR XQ SDVR LPSRUWDQWH TXH SXHGH VHU XWLOL]DGR FRPR UHIHUHQFLD SDUD IXWXUDV OLEHraciones comerciales. 2WURV HMHPSORV GH SURWHtQDV WHUDSpXWLFDV H[SUHVDGDV H[LWRVDPHQWH HQ SODQWDV LQFOX\HQ ORV DQWLFXHUSRV TXH UHFRQRFHQ DO DQWtJHQR GH VXSHUFLH GHO YLUXV GH OD KHSDWLWLV % KXPDQR +%V$J D OD JOLFRSURWHtQD % GHO YLUXV GHO KHUSHV VLPSOH KXPDQR GH WLSR +69 DQWLFXHUSRV DQWLHVSHUPD SDUD VX XWLOL]DFLyQ FRPR DQWLFRQFHSWLYRV DQWLLGLRWLSRV GHO OLQIRPD QR +RGNLQV \ UHDFWLYRV SDUD GLDJQyVWLFR GHO +,9 'HQWUR GH esta clase de molculas cabe destacar el caso de una IgA (inmunoglobulina A) secretoria exSUHVDGD HQ WDEDFR TXH UHFRQRFH XQ DQWtJHQR de Streptococcus mutans HO SULQFLSDO DJHQWH causal de la caries dental. En ensayos clnicos llevados a cabo en humanos, en los que VH DSOLFy HVWH DQWLFXHUSR HQ IRUPD WySLFD OXHJR GHO WUDWDPLHQWR FRQ XQ DQWLVpSWLFR VH YHULFy XQD SURWHFFLyQ HIHFWLYD \ HVSHFtFD FRQWUD OD UHFRORQL]DFLyQ SRU S. mutants durante al menos cuatro meses. Recientemente el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa de La +DEDQD &XED KD ORJUDGR SURGXFLU HQ SODQWDV WUDQVJpQLFDV GH WDEDFR XQ DQWLFXHUSR PRQRFORQDO TXH HVWD VLHQGR XWLOL]DGR SDUD OD SXULFDFLyQ GH XQ DQWtJHQR SDUD OD SURGXFFLyQ GH YDFXQD FRQWUD OD KHSDWLWLV % (Q FRPSDUDFLyQ
FRQ OD YDULDQWH WUDGLFLRQDO GH SURGXFFLyQ D SDUtir de lquido asctico de ratn, la obtencin del DQWLFXHUSR HQ SODQWDV GH WDEDFR WUDQVJpQLFDV que crecen en condiciones de invernadero, ofrece ventajas tales como un mayor nivel de seguridad y mejor escalado industrial. $GHPiV GH ORV DQWtJHQRV \ DQWLFXHUSRV H[LVWHQ GLYHUVRV HMHPSORV GH SURWHtQDV GH XVR IDUPDFROyJLFR H LQGXVWULDO H[SUHVDGDV HQ WHMLGRV YHJHWDOHV /D SURGXFFLyQ GH VRPDWRWURSLQD KXPDQD K67 HQ VHPLOODV GH WDEDFR OD VHURDOE~PLQD KXPDQD +6$ HQ SDSDV OD DSURWLQLQD ERYLQD HQ VHPLOODV GH PDt] \ HO IDFtor estimulante de granulocitos y macrfagos (hGM-CSF) en semillas de tabaco son slo DOJXQRV GH HOORV 7DPELpQ VH SXHGH GHVWDFDU OD H[SUHVLyQ HQ WDEDFR GH OD OLSDVD JiVWULFD FDQLQD XWLOL]DGD SDUD HO WUDWDPLHQWR GH LQVXFLHQFLDV SDQFUHiWLFDV \ EURVLV TXtVWLFD TXH VH HQFXHQWUD HQ OD HWDSD GH HQVD\RV FOtQLFRV 8Q HMHPSOR GH GHVDUUROOR ORFDO HQ QXHVWUR ODERUDWRULR HV OD H[SUHVLyQ GHO IDFWRU GH FUHFLPLHQWR HSLGpUPLFR KXPDQR K(*) HQ SODQWDV GH tabaco. El hEGF es un factor mitognico que interviene en el desarrollo, diferenciacin, reSDUDFLyQ \ SURWHFFLyQ GH WHMLGRV HSLWHOLDOHV 6H HPSOHD SDUD HO WUDWDPLHQWR GH KHULGDV \ TXHPDGXUDV FRPR DJHQWH UHSDUDGRU HQ WUDQVSODQWHV GH FyUQHD \ SDUD HO WUDWDPLHQWR GH ~OFHUDV gstricas y otras afecciones gastrointestinales. 7DPELpQ VH HVWiQ XWLOL]DQGR SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV SDUD OD SURGXFFLyQ GH HQ]LPDV GH XVR LQGXVWULDO FRPR OD DYLGLQD GH SROOR \ OD WULSVLQD ERYLQD SURGXFLGDV HQ VHPLOODV GH PDt] DPEDV DSUREDGDV SDUD VX FRPHUFLDOL]DFLyQ VXSOHPHQWRV DOLPHQWLFLRV FRPR OD WDVD GHO hongo Aspergillus niger en semillas de tabaco \ FRO]D R SROtPHURV FRPR HO FROiJHQR OD VHGD GH DUDxD \ SOiVWLFRV ELRGHJUDGDEOHV $GHPiV GH ODV HPSUHVDV PHQFLRQDGDV H[LVWHQ RWUDV TXH HVWiQ XWLOL]DQGR GLVWLQWDV SODWDIRUPDV \ VLVWHPDV GH H[SUHVLyQ SDUD SURGXFLU SURWHtQDV UHFRPELQDQWHV HQ SODQWDV FRPR VH PXHVWUD HQ la tabla 2. Marco regulatorio (O XVR GH SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV HQIUHQtar dos marcos regulatorios diferentes: uno UHODFLRQDGR FRQ HO GH ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV y el otro el que tiene que ver con el desarrollo
Tabla 2. $OJXQDV FRPSDxtDV TXH XWLOL]DQ SODQWDV FRPR VLVWHPD GH H[SUHVLyQ
Compania SemBioSys Genetics Biolex Therapeutics Meristem Therapeutics Ventria Bioscience Cobento Planet Biotechnology Down Agro Science CIGB (Cuba) Chlorogen Bayer (Icon Genetics)
Plataforma Crtamo Lemna Maiz Arroz Arabidopsis Tabaco Clulas de Tabaco Tabaco Tabaco Tabaco
Tecnologa utilizada Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transgnicas Transplastmicas Vectores Virales
GH QXHYRV IiUPDFRV (O SULPHUR HV PiV FRQRFLGR \ H[LVWHQ DQWHFHGHQWHV HQ QXHVWUR SDtV el ltimo marco an esta siendo desarrollado HQ YDULRV SDtVHV GHO PXQGR \ QR H[LVWHQ SRU HO PRPHQWR SDXWDV GHQLWLYDV GDGR HO EDMR QXPHUR GH SURGXFWRV GHULYDGRV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV TXH KDQ SDVDGR SRU WRGDV ODV HWDSDV hasta llegar a su comercializacin. /RV SULPHURV FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV WLHQHQ como objetivo el de mejorar caractersticas agronmicas tales como tolerancia a herbicidas y resistencia a insectos, o mejorar las cualidades nutricionales; en ambos casos el destino de estos cultivos es la alimentacin animal R KXPDQD (Q FDPELR ODV SODQWDV TXH VHUiQ XWLOL]DGDV FRPR ELRUUHDFWRUHV SDUD OD SURGXFcin de frmacos no deberan entrar a la cadeQD DOLPHQWLFLD \ VHUi QHFHVDULR WRPDU ODV SUHFDXFLRQHV QHFHVDULDV SDUD TXH HVWR QR RFXUUD eVWD MXQWR FRQ OD SRVLELOLGDG GH WUDQVIHUHQFLD horizontal de los transgenes, son las mayores SUHRFXSDFLRQHV HQ OR TXH KDFH DO XVR GH ODV SODQWDV FRPR ELRUUHDFWRUHV (Q QXHVWUR SDtV OD &RPLVLyQ 1DFLRQDO GH %LRWHFQRORJtD $JURSHFXDULD &21$%,$ HO Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Alimentaria (SENASA) y la Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa mdica (ANMAT) sern los organismos que tendrn a su cargo la regulacin de estos culWLYRV GHVWLQDGRV D OD SURGXFFLyQ GH IiUPDFRV
%RFN 5 3ODVWLG ELRWHFKQRORJ\ SURVSHFWV for herbicide and insect resistance, metabolic engineering and molecular farming. Curr Opin Biotechnol &KDGG + DQG &KDPRZ 6 7KHUDSHXWLF DQWLERG\ H[SUHVVLRQ WHFKQRORJ\ Current Opinion in Biotechnology, 'DQLHOO + 6WUHDWHOG 6 DQG :\FRII . 0HGLFDO PROHFXODU IDUPLQJ SURGXFWLRQ RI DQWLERGLHV ELRSKDUPDFHXWLFDOV DQG HGLEOH YDFFLQHV LQ SODQWV Trends in Plant Science 'DQLHOO + 3URGXFWLRQ RI ELRSKDUPDFHXWLFDOV DQG YDFFLQHV LQ SODQWV YLD WKH FKORURSODVW JHQRPH Biotechnol J 1:1071-1079. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. DQG 7Z\PDQ 5 3ODQWEDVHG SURGXFWLRQ RI ELRSKDUPDFHXWLFDOV Current Opinion in Plant Biology Floss D., Falkenburg D. and Conrad U. 2007. 3URGXFWLRQ RI YDFFLQHV DQG WKHUDSHXWLF DQWLERGLHV IRU YHWHULQDU\ DSSOLFDWLRQV LQ WUDQVJHQLF SODQWV DQ overview. Transgenic Res *LGGLQJV * 7UDQVJHQLF SODQWV DV SURWHLQ factories. Current Opinion in Biotechnology, *RPRUG 9 &KDPEHUODLQ 3 -HIIHULV 5 DQG )D\H / %LRSKDUPDFHXWLFDO SURGXFWLRQ LQ SODQWV SUREOHPV VROXWLRQV DQG RSSRUWXQLWLHV 7UHQGV %LRWHFKQRO *RPRUG 9 DQG )D\H / 3RVWWUDQVODWLRQDO PRGLFDWLRQ RI WKHUDSHXWLF SURWHLQV LQ SODQWV &XUU 2SLQ 3ODQW %LRO
/LHQDUG ' 6RXUURXLOOH & *RPRUG 9 DQG )D\H / 3KDUPLQJ DQG WUDQVJHQLF SODQWV %LRWHFKQRORJ\ $QQXDO 5HYLHZ 0D - 'UDNH 3 DQG &KULVWRX 3 7KH SURGXFWLRQ RI UHFRPELQDQW SKDUPDFHXWLFDO SURWHLQV LQ SODQWV Nature Reviews Genetics, Maliga P. 2004. Plastid transformation in higher SODQWV Annu. Rev. Plant Biol., 0DULOORQQHW 6 7KRHULQJHU & .DQG]LD 5 .OLP\XN 9 DQG *OHED < 6\VWHPLF $JUREDFWHULXP tumefaciens-mediated transfection of viral UHSOLFRQV IRU HIFLHQW WUDQVLHQW H[SUHVVLRQ LQ SODQWV Nat Biotechnol Plantas Biofactoria. Informe de vigilancia tecnolgica. *HQRPD (VSDxD 6HFWRU $JURDOLPHQWDULR KWWS ZZZJHQHVRUJBSXEOGRFV3/$17$6B %,2)$&725,$SGI 5\ELFNL ( 3ODQWSURGXFHG YDFFLQHV SURPLVH and reality. Drug Discov Today 6SRN $ 7Z\PDQ 5 )LVFKHU 5 0D - DQG 6SDUURZ 3 (YROXWLRQ RI D UHJXODWRU\ )UDPHZRUN IRU SKDUPDFHXWLFDOV GHULYHG IURP JHQHWLFDOO\ PRGLHG SODQWV 7UHQGV LQ %LRWHFKQRORJ\
Twyman R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. and )LVFKHU 5 0ROHFXODU IDUPLQJ LQ SODQWV KRVW V\VWHPV DQG H[SUHVVLRQ WHFKQRORJ\. Trends in Biotechnology 7Z\PDQ 50 6FKLOOEHUJ 6 )LVFKHU 5 7UDQVJHQLF SODQWV LQ WKH ELRSKDUPDFHXWLFDO PDUNHW ([SHUW 2SLQ (PHUJ 'UXJV :DOVK * DQG -HIIHULV 5 3RVWWUDQVODWLRQDO PRGLFDWLRQV LQ WKH FRQWH[W RI WKHUDSHXWLF SURWHLQV 1DW %LRWHFKQRO Wirth S., Calamante G., Mentaberry A., Bussmann L., Lattanzi M., Baraao L. and Bravo-Almonacid ) ([SUHVVLRQ RI DFWLYH HSLGHUPDO JURZWK IDFWRU K(*) LQ WREDFFR SODQWV E\ LQWHJUDWLYH DQG non-integrative systems. Mol. Breeding,
PARTE VI Manejo responsable de la tecnologa
VI. CAPTULO 1 Bioseguridad y Regulacin de Organismos Vegetales *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV (OVGM)

Clara Rubinstein &ULWHULRV &LHQWtFRV SDUD OD (YDOXDFLyQ de la Bioseguridad de Organismos *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV. /D SODVWLFLGDG LQWUtQVHFD GH ORV JHQRPDV YHJHWDOHV OHV FRQHUH XQD DOWD DGDSWDELOLGDG D ODV SODQWDV \ HV IXHQWH GH XQ DOWR SRWHQFLDO GH YDULDELOLGDG JHQpWLFD /DV WHFQRORJtDV GH PHMRUDPLHQWR GH YDULHGDGHV WUDGLFLRQDOPHQWH XWLOL]DGDV WUDEDMDQ VREUH HVWD EDVH H LQWURGXFHQ GLIHUHQWHV WLSRV GH PRGLFDFLRQHV JHQpWLFDV TXH DFWXDOPHQWH HVWiQ VLHQGR LGHQWLFDGDV \ FDUDFWHUL]DGDV en detalle. /DV WHFQRORJtDV GH $'1 UHFRPELQDQWH se han sumado a las de mejoramiento conYHQFLRQDO GXUDQWH ORV ~OWLPRV DxRV 6LQ HPEUDJR SUHVHQWDQ FDUDFWHUtVWLFDV SURSLDV TXH VH KDQ FRQVLGHUDGR OR VXFLHQWHPHQWH QRYHGRVDV D QLYHO GH ODV RUJDQL]DFLRQHV LQWHUQDFLRQDOHV TXH KDQ UHFRPHQGDGR VX regulacin. Las caractersticas de un orgaQLVPR YHJHWDO JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGR 29*0 VRQ HVWXGLDGDV \ HYDOXDGDV GHVGH ODV HWDSDV PiV WHPSUDQDV GH VX GHVDUUROOR GHVGH HO SXQWR GH YLVWD GH VX ELRVHJXULGDG 3DUD HOOR VH XWLOL]D XQ (QIRTXH &RPSDUDWLYR GHVFULSWR SRU SULPHUD YH] HQ HO FRQWH[WR GH ORV 29*0 HQ XQ GRFXPHQWR GH OD 2(&' 2UJDQL]DFLyQ SDUD OD &RRSHUDFLyQ \ HO 'HVDUUROOR (FRQyPLFR GH (VWH HQIRTXH DVt FRPR ORV FULWHULRV FLHQWtFRV XWLOL]DGRV SDUD VX LPSOHPHQWDFLyQ VRQ SUHVHQWDGRV HQ HVWH FDStWXOR FRQ pQIDVLV HQ OD LQRFXLGDG SDUD HO FRQVXPR A lo largo de la historia, los mejoradores han apelado a todo tipo de tecnologas para generar diversidad gentica, de la cual poder seleccionar aquellas caractersticas deseadas. En los captulos y secciones anteriores se han des-
cripto las ms recientes, que se suman a otras, XWLOL]DGDV GXUDQWH VLJORV FRQ HO PLVPR Q /D DSOLFDFLyQ GH ODV WpFQLFDV GH $'1 UHFRPELQDQWH DO PHMRUDPLHQWR YHJHWDO HQ OD GpFDGD GH VLQ HPEDUJR PDUFDQ XQ SXQWR GH LQH[LyQ, dada las preocupaciones que ham generado en diferentes mbitos y posteriormente, tambin debido a su impacto en la percepcin pblica, en especial en la Unin Europea. El National Research Council de los EEUU, public en 1989 un informe en el cual analiza las diferencias entre el mejoramiento tradicioQDO \ ODV QXHYDV ELRWHFQRORJtDV SDUD OD PRGLcacin gentica de plantas y microorganismos. (Q HVWH LQIRUPH VH LQFOX\H D ODV WHFQRORJtDV GH $'1 UHFRPELQDQWH FRPR SDUWH LQWHJUDQWH GH OD VHFXHQFLD GH ORV DYDQFHV GHO FRQRFLPLHQWR \ GH OD WHFQRORJtD FLHQWtFD D OR ODUJR GH DxRV GH GHVDUUROOR KXPDQR. (NRC, 1989, ver Fig 1). Tambin concluyen en que Las mismas leyes fsicas y biolgicas goELHUQDQ OD UHVSXHVWD GH ORV RUJDQLVPRV PRGLcados por los modernos mtodos moleculares y celulares y aquellos producidos por mtodos clsicos Al mismo tiempo, organismos internacionales como FAO y OMS (la Organizacin para la Alimentacin y la Agricultura y la Organizacin Mundial de la Salud, respectivamente), se han ocupado de la bioseguridad de las nuevas tecnologas aplicadas a la produccin de
Figura 1. $XPHQWR HQ OD FDSDFLGDG GH PRGLFDFLyQ gentica a travs del tiempo Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adaptado de NRC, 1989
alimentos. Asimismo, el Codex Alimentarius (FAO-OMS) ha desarrollado recomendaciones generales para la evaluacin de la inocuidad. Como se mencion anteriormente, todas las especies mejoradas por el hombre, son de XQ PRGR X RWUR JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGDV A pesar de esto, la aplicacin de las tcnicas de ingeniera gentica a la produccin de aliPHQWRV KD VLGR FRQVLGHUDGD OR VXFLHQWHPHQWH QXHYD \ GLIHUHQWH FRPR SDUD MXVWLFDU HO FRQtrol de su desarrollo e implementacin. Esto tiene sus antecedentes en las primeras etapas del desarrollo de la ingeniera gentica, en los aos 70. En 1974 y 1975, los Institutos Nacionales de Salud de los EEUU (NIH) convocan a las &RQIHUHQFLDV GH $VLORPDU (California); este fue el primer paso para la creacin de polticas para el control de la seguridad de organismos recombinantes. Desde all, y en todo el mundo, han evolucionado estas polticas y las regulaciones que controlan el desarrollo de nuevos organismos y sus productos mediante tcnicas de ADN recombinante. Estas regulaciones, se basan en criterios FLHQWtFRV \ WDPELpQ HPStULFRV HQ SDUWLFXODU en lo que hace a la seguridad de los alimentos. Aunque los alimentos tradicionalmente disponibles en las diferentes culturas VH DFHSWDQ FRPR VHJXURV se sabe que algunos pueden ser txicos, segn la parte de la planta que se consuma (por ejemplo el tallo se puede consumir, pero no as las hojas o las races) o el estado de su desarrollo (papas verdes). Tambin hay alimentos de origen vegetal que deben ser cocinados para ser seguros (por ej. legumbres), as como sabemos que hay grupos de alimentos que pueden provocar alergias en individuos sensibles (man, leche, nueces, huevo, soja). En 1986 la OECD (Organizacin para el Desarrollo y la Cooperacin Econmica) convoca a reuniones de expertos que renen sus UHFRPHQGDFLRQHV HQ HO OODPDGR %OXH %RRN Ms adelante, en 1993, OECD resumi estos conceptos: La seguridad de los alimentos para consumo humano se basa en que debe existir una certeza razonable de que no resultar dao alguno del uso debido bajo las condiciones de consumo anticipadas. Histricamente, los alimentos preparados y utilizados bajo las condiciones tradicionales han sido considera-
dos seguros , por su historia de uso y experiencia, an cuando pudieran contener txicos naturales o anti-nutrientes . En principio, los alimentos se han considerado seguros, a meQRV TXH XQ SHOLJUR VLJQLFDWLYR VH KD\D SRGLGR LGHQWLFDU En este captulo, se intentar dar un panoUDPD GH ORV FULWHULRV FLHQWtFRV TXH VH XWLOL]DQ internacionalmente para evaluar la seguridad de los cultivos transgnicos, tambin llamados genricamente OGM (Organismos GenticaPHQWH 0RGLFDGRV (O DQiOLVLV GH ULHVJRV \ OD LGHQWLFDFLyQ GHO SHOLJUR Se ha establecido que el anlisis de riesgos, consta de tres etapas fundamentales: /D LGHQWLFDFLyQ GHO SHOLJUR : es la identiFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ GH XQ HIHFWR DGYHUVR en general a partir de ensayos experimentales, por ejemplo de tipo toxicolgico, en modelos animales. 9DORUDFLyQ GH OD H[SRVLFLyQ: estimar cunto, con qu frecuencia y durante cunto tiempo se est expuesto a dicho peligro. Caracterizacin del riesgo: es la estimacin que surge de evaluar el peligro en funcin de la exposicin y evaluar diferentes escenarios de exposicin mxima, para establecer qu grado de exposicin es aceptable en cuanto a la seguridad. Este proceso se aplica a casos muy diferentes, y existe amplia experiencia en su aplicacin a la evaluacin de riesgos para aditivos alimentarios, agroqumicos y compuestos esSHFtFRV HQ JHQHUDO (Q HVRV FDVRV HV UHODtivamente simple someter cantidades exactas y conocidas de un compuesto a ensayos toxicolgicos clsicos en modelos animales, o evaluaciones de residuos en alimentos, aguas, suelos, etc. De esta forma, se establecen parmetros como el 12$(/ (por 1R $GYHUVH (IIHFW /HYHO), que es HO QLYHO GH H[SRVLFLyQ HQ HO TXH QR VH REVHUYDQ HIHFWRV DGYHUVRV. Este da una medida de la peligrosidad del compuesto: FXDQWR PD\RU HO 12$(/ PHQRU HO SRWHQFLDO Wy[LFR GHO FRPSXHVWR. Basndose en el NOAEL, es posible estimar un QLYHO GH H[SRVLFLyQ VHJXUR TXH GHQH HO ADI (dosis
GLDULD DFHSWDEOH H[SUHVDGD SRU NJ GH SHVR FRUSRUDO) y que dependiendo del tipo de sustancia y otras variables, suele estar unas 100 veces por encima del NOAEL. Este factor de multiplicacin se conoce como margen de seJXULGDG SDUD OD H[SRVLFLyQ. Sin embargo, estos principios no son tan directamente aplicables al anlisis de riesgos para OVGMs o sus derivados de uso alimentario, ya que constituyen mezclas complejas, que contienen miles de compuestos, macro y micro nutrientes, txicos naturales(compuestos txicos que estn naturalmente presentes en la especie), antinutrientes (compuestos que inhiben la absorcin o biodisponibilidad de algunos nutrientes), metabolitos secundarios, etc. Por lo tanto, la evaluacin de estos cultivos es ms una HYDOXDFLyQ GH VHJXULGDG R LQRcuidad ms que un anlisis de riesgos clsiFR \D TXH KDVWD DKRUD QR VH KDQ GHWHUPLQDGR SHOLJURV FXDQWLFDEOHV HQ ORV 2*0V HVWXGLDdos. De hecho, en la prctica, en caso de idenWLFDUVH HIHFWRV DGYHUVRV HVWRV FXOWLYRV QR VH autorizaran para su salida al mercado. Por todo lo anterior, se ha desarrollado para los OGMs un enfoque que ha sido utilizado para otros casos de alimentos y que se basa en la FRPSDUDFLyQ GHO QXHYR DOLPHQWR R FXOWLYR FRQ HO WUDGLFLRQDOPHQWH XWLOL]DGR \ considerado seguro. Este enfoque se ha desarrollado consensuadamente con la colaboracin de diferentes organismos internacionales (OECD, FAO ,OMS, International Life Sciences Institute o ILSI) que peridicamente convocan a paneles de expertos que revisan y actualizan las recomendaciones de acuerdo a los avances tecnolgicos y el estado del conocimiento. (O (QIRTXH &RPSDUDWLYR \ OD (TXLYDOHQFLD 6XVWDQFLDO En 1993 la OECD formul el concepto de (TXLYDOHQFLD 6XVWDQFLDO. Este concepto no FRQVWLWX\H HQ Vt OD HYDOXDFLyQ GH LQRFXLGDG DXQTXH HV XQ HOHPHQWR FODYH GH UHIHUHQFLD \ XQD FRQFOXVLyQ SRVLEOH D OD TXH OOHYD HO DQiOLVLV FRPSDUDWLYR Este enfoque no hace otra cosa que tomar como referencia los cultivos o alimentos conocidos y aceptados como seguros y compararlos con sus versiones mejoradas mediante ingeniera gentica.
Es oportuno aclarar que estas tcnicas no en todos los casos van a tener como resultado la expresin de un transgn, sino que hay otras estrategias experimentales - silenciamiento mediado por RNA de interferencia o anulacin GH OD DFWLYLGDG GH XQ JHQ SRU NQRFN RXW TXH si bien involucran manipulacin in vitro y transformacin, no resultan en la adicin de un gen y/o una protena nuevos. /D EDVH GH HVWD HVWUDWHJLD SDUD HVWDEOHFHU LQRFXLGDG GH QXHYRV DOLPHQWRV HV OD KLVWRULD GH XVR VHJXUR GHO FXOWLYR SDUHQWDO HV GHFLU DTXHO TXH HV OD EDVH GH OD PRGLcacin) . -Qu se compara y por qu (V FODUR TXH WRGD PRGLFDFLyQ WLHQH XQ REjetivo, ya sea obtener una mejora de tipo agronmica como resistencia a plagas o enfermedades, una mejora nutricional o de calidad o bien la sntesis de un producto en particular, desde un frmaco hasta biocombustibles, pasando por vacunas comestibles. Es decir, que OD PRGLFDFLyQ WLHQH HIHFWRV intencionales medibles, que se traducen en una carctersWLFD IHQRWtSLFD GDGD. Por otro lado, es posible que se produzcan efectos no intencionales GH OD PRGLFDFLyQ que pueden o no tener un impacto negativo en OD VHJXULGDG GH OD SODQWD PRGLFDGD SHUR TXH es pertinente estimar. Y es aqu donde el anlisis comparativo tiene un papel relevante. Los impactos no deseados de la introduccin de un gen o secuencia en el genoma de una planta, comprenden diferentes aspectos que son examinados durante el proceso de evaluacin: Toxicidad o alergenicidad de la(s) protenas expresadas ,QXHQFLD GH ORV SURGXFWRV GH H[SUHVLyQ sobre el metabolismo de la planta, que lleve a cambios en el valor nutricional o la concentracin de txicos o alrgenos naturales. Insercin no intencional en otros genes NQRFN RXW QR LQWHQFLRQDO TXH VHDQ esenciales o activacin de otros, que no se expresen normalmente. Efectos pleiotrpicos de los genes insertados (efectos sobre la actividad de otros
genes o vas metablicas, que se maniHVWHQ D GLIHUHQWHV QLYHOHV HQ HO IHQRWLSR de la planta). Es importante tener en cuenta que estos efectos tambin pueden producirse durante el PHMRUDPLHQWR FRQYHQFLRQDO GHQLGR FRPR HO que no utiliza ingeniera gentica), si bien los cultivos mejorados mediante tecnologas no recombinantes no se someten por el momento, a este tipo de evaluacin, con la excepcin de Canad, que s regula algunos casos especiales. La normativa canadiense, evala aqueOODV YDULHGDGHV FRQ UDVJRV VXFLHQWHPHQWH novedosos, independientemente del proceso utilizado para su obtencin, si bien menciona particularmente ciertas metodologas de mejoramiento, como la mutagnesis acelerada (inducida por agentes qumicos o irradiacin) o la fusin celular. Como veremos en detalle a continuacin, HO SURFHVR HYDOXDWLYR UHFRUUH XQD VHULH GH SDVRV TXH VH EDVDQ HQ HYLGHQFLD H[SHULmental, y que van llevando a conclusiones que permiten tomar decisiones respecto de la inocuidad del OGM en cuestin (Ver Figura 3). Las evaluaciones de seguridad, entonces, se concentran: 1. en la caracterstica introducida: para ello, se caracteriza completamente el gen insertado en el cultivo GM y se evala la seguridad de la/s protena/s resultantes. Si bien esta evaluacin la deben realizar los obtentores previamente a la transformacin , ya que no ser aprobado un cultivo que pueda presentar algn problema toxicolgico o de alergenicidad, las agencias regulatorias encargadas del control de estos productos efectan un exhaustivo anlisis de seguridad de los genes insertados y sus productos de expresin. 2. HQ HO FXOWLYR R DOLPHQWR FRPR XQ WRGR: sobre el cultivo GM, se analizan los rasgos fenotpicos / agronmicos y la composicin y se los compara con los de sus contrapartes no-GM o convencionales. Las diferencias encontradas, ya sean intencionales o no, se convierten en el centro de ulteriores evaluaciones de seguridad. El objetivo de estas evaluacio-
nes es demostrar que el cultivo o alimento GM es "tan seguro como" el alimento tradicional conocido (Figura 2). La evaluacin de inocuidad de las protenas de nueva expresin, as como del alimento completo, se fundamenta en lo que se denomina el 3HVR GH OD (YLGHQFLD. Este concepto se basa en el hecho de que no existe un solo estudio o ensayo que pueda establecer la inocuidad. Por ejemplo, en el caso del potencial alergnico de una protena, no es posible hoy contar con modelos que predigan adecuadamente la alergenicidad en humanos. Dado que H[LVWH XQD VHULH GH SDUiPHWURV VLFRTXtPLFRV que son compartidos por los alrgenos proteicos conocidos (que son un grupo reducido de protenas de origen animal y vegetal), stos pueden ser utilizados para estimar la posible alergenicidad de la protena introducida. Por ejemplo, OD UHVLVWHQFLD D OD GLJHVWLyQ OD SUHYDOHQFLD HQ HO DOLPHQWR (normalmente, los alrgenos proteicos son mayoritarios en OD FRPSRVLFLyQ QDO y la similitud con otras SURWHtQDV DOHUJpQLFDV, son algunos de estos parmetros. En efecto, se realizan anlisis ELRLQIRUPiWLFRV que comparan la secuencia de los productos de expresin presentes en los OGMs, contra bases de datos de todos los alrgenos conocidos. En el caso de cultivos con actividad alergnica conocida (como la soja) es posible comparar los patrones de protenas del suero de pacientes sensibles, que se unen a inmuglobulina E (la responsable de las reacciones alrgicas severas) en anlisis de Western sobre geles bidimensionales, para determinar si hay nuevas protenas o si el patrn endgeno se ha visto DOWHUDGR SRU OD PRGLFDFLyQ Como ya se dijo, an no se cuenta con moGHORV DQLPDOHV TXH VH HQFXHQWUHQ OR VXFLHQtemente desarrollados para ser validados a nivel internacional en cuanto a su capacidad predictiva de alergenicidad, pero numerosos organismos e instituciones internacionales se encuentran trabajando en ello. E En base a los 50 aos de experiencia ganada en mejoramiento tradicional (breeding), y evaluacin de seguridad de otros productos como medicamentos, alimentos, y qumicos,
las agencias internacionales recomiendan comparar los siguientes parmetros de los OGMs respecto de contrapartes convencionaOHV SDUD SRGHU FRQWDU FRQ VXFLHQWH LQIRUPDcin que permita arribar a una certeza razonaEOH GH LQRFXLGDG : -Parmetros fenotpicos: estos son ms relevantes para la evaluacin agronmica del nuevo cultivo. La caracterizacin fenotpica / agronmica del cultivo GM se hace tempranamente durante el proceso de seleccin. Los puntos evaluados ( por ej. morfologa, rendimiento) son muy sensibles a los cambios genticos y a las perturbaciones desfavorables en el metabolismo, por lo tanto son buenos indicadoUHV GH HTXLYDOHQFLDV HQWUH HO FXOWLYR PRGLFDGR y su contraparte tradicional.
Se observan y miden cuidadosamente las FDUDFWHUtVWLFDV PRUIROyJLFDV VLROyJLFDV \ UHproductivas, la resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades, e incluso caractersticas como perfume o sabor de los frutos. Este proceso, que dirige la seleccin de aquellas SODQWDV WUDQVIRUPDGDV R HYHQWRV TXH WHQgan las caractersticas deseadas, es crtico para eliminar efectos no intencionales. -Composicin Qumica: esta es la evaluacin en la que se fundamenta gran parte del anlisis comparativo. Se realiza la determinacin analtica de la composicin en diferentes tejidos de la planta, sobre muestras de ensayos a campo controlados, realizados en ambientes representativos de aquellos donde ese cultivo va a ser sembrado, a lo largo de varias
Figura 2. Esquema general del enfoque comparativo
)LJXUD Diagrama para la estimacin de seguridad de OGMs Adaptado de Cockburn , 2002
campaas de produccin (aos). Se determina la composicin de macro y micronutrientes (protenas, grasas, hidratos de carbono, aminocidos y cidos grasos, vitaminas, etc), PLQHUDOHV Wy[LFRV QDWXUDOHV y FRPSXHVWRV ELRDFWLYRV \R PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV, dependiendo del cultivo. Por ejemplo, se miden QLYHOHV GH WRHVWUyJHQRV \ DQWLQXWULHQWHV LQKLbidores de tripsina, lectinas) en soja, glucosinolatos en colza, cumarinas en apio y solaninas en papa. Tambien se pueden medir alrgenos en soja (glicinina), beta carotenos en zapallo, y gosipol en algodn . La OECD ha publicado reFLHQWHPHQWH UHFRPHQGDFLRQHV TXH HVSHFLFDQ qu componentes es ms apropiado analizar para cada cultivo en particular. $ SDUWH GH OD FRPSDUDFLyQ HQ FRPSRQHQWHV HVSHFtFRV VH UHDOL]DQ JHQHUDOPHQWH HQVD\RV GH DSWLWXG QXWULFLRQDO HQ PRGHORV animales. Estos, apuntan a detectar cualquier HIHFWR QR LQWHQFLRQDO GH OD PRGLFDFLyQ TXH pudiera haber afectado el YDORU QXWULFLRQDO del alimento o su inocuidad. Es comn que se utilicen ensayos de alimentacin de duracin variable (entre 42 y 120 das) dependiendo del modelo elegido. Uno de los ms utilizados y sensibles, es el de pollos parrilleros, ya que pasan de pesar 35 gramos a ms de 2 kg en 42 das. Este crecimiento rpido, hace que se SXHGDQ GHWHFWDU SHTXHxDV GHFLHQFLDV QXWULcionales del alimento. 0LHQWUDV TXH OD HYDOXDFLyQ GH VHJXULGDG GH ODV SURWHtQDV LQWURGXFLGDV VH OOHYD D FDER FRQ OD SURWHtQD V SXULFDGDV \ JHQHUDOPHQWH VLQWHWL]DGDV HQ PRGHORV EDFWHULDQRV SRU OD FDQWLGDG TXH VH QHFHVLWD SDUD ORV HQVD\RV WR[LFROyJLFRV ORV HVWXGLRV de alimentacin se realizan con el alimento FRPSOHWR, por ejemplo, grano o forraje en el caso de maz, harinas de soja tostadas, o semilla de algodn como suplementacin de la dieta . (Ver Tabla 2). Segn los resultados de todos los puntos DQDOL]DGRV HV SRVLEOH FODVLFDU DO FXOWLYR R DOLmento GM en una de estas tres categoras posibles (FAO/OMS/OECD): El producto GM es sustancialmente HTXLYDOHQWH a la contraparte tradicional, QR H[LVWLHQGR GLIHUHQFLDV VLJQLFDWLYDV Esta situacin se da principalmente en
SURGXFWRV DOWDPHQWH UHQDGRV (O DFHLWH o la fructosa derivados de maz GM, son totalmente equivalentes a los derivados de maz convencional. El cultivo o alimento GM es sustancialPHQWH HTXLYDOHQWH a su contraparte tradicional FRQ OD H[FHSFLyQ GH GLIHUHQFLDV FODUDPHQWH GHQLGDV (presencia de la/s protenas introducidas y/o diferencias bien caracterizadas en otros elementos individuales). Dentro de esta categora caen la mayora de los cultiYRV TXH H[SUHVDQ XQ UDVJR ~QLFR WDO FRPR OD UHVLVWHQFLD D KHUELFLGDV R OD SURWHFFLyQ FRQWUD LQVHFWRV \ DOJXQRV con mejoras nutricionales o de calidad. Para demostrar que los cultivos o alimentos GM son "tan seguros como" su contraparte tradicional, se debe mostrar que cada diferencia encontrada no tiene consecuencias toxicolgicas ni nutricionales. Esta evaluacin se lleva a cabo FDVR SRU FDVR, y segn se considere necesario, pueden conducirse ensayos de toxicidad o estudios de alimentacin en animales grandes con el cultivo entero. El cultivo o alimento GM no es sustanFLDOPHQWH HTXLYDOHQWH a su contraparte tradicional o no existe un cultivo equivalente con el cual compararlo. Ejemplo de esto seran FXOWLYRV FRQ FLHUWRV UDVJRV FRPELQDGRV R FXOWLYRV FRQ YDORU QXWULWLYR DXPHQWDGR TXH FRQWLHQHQ QXHYDV YtDV PHWDEyOLFDV R PRGLFDQ ODV endgenas. La evaluacin de seguridad se va a enfocar en las caractersticas de los nuevos productos expresados. En cada caso en particular se determinar el programa de estudios que corresponda . $FWXDOPHQWH WRGRV ORV FXOWLYRV PRGLFDdos y sus productos alimentarios derivados presentes en el mercado han sido analizados en profundidad para evaluar su seguridad, demostrndose que son sustancialmente equivalentes, con la excepcin de la/s protenas introducidas y son tan seguros como su contraparte tradicional. En la Tabla 1, se resume como ejemplo, el tipo de componentes analizados en diferentes
7DEOD componentes analizados en semillas enteras de soja y en varias fracciones de soja procesada (Tomado del Cuadernillo Tcnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (Monsanto Agricultura Espaa, 2001)
Soja entera Anlisis de macronutrientes Composicin de aminocidos Composicin de cidos grasos Inhibidor de tripsina Lectinas Fitoestrgenos Actividad ureasa Composicin fosfolipdica Anlisis de macronutrientes Inhibidor de tripsina Lectinas Fitoestrgenos Actividad ureasa Estaquiosa, rafinosa Fitato Solubilidad del nitrgeno
Anlisis de macronutrientes Inhibidor de tripsina Actividad ureasa Anlisis de macronutrientes Anlisis de macronutrientes Composicin de cidos grasos
Harina tostada
Harina desgrasada
Aislado de protenas Concentrado de protenas Aceite refinado, blanqueado y desodorizado
fracciones, para la evaluacin de seguridad alimentaria para el evento de soja GM 40-3-2, tolerante a glifosato (ver Parte VIII, captulo 6). En la Tabla 2 se listan los diferentes modelos animales utilizados para la evaluacin de aptitud nutricional de OGMs y los parmetros que se analizan en cada caso. a: los cultivos GM estudiados presentan toleUDQFLD D LQVHFWRV %W R D KHUELFLGDV JOLIRVDto, glufosinato) b: en la mayor parte de los ensayos tambin se efectuaron anlisis de deteccin del ADN o de las protenas introducidas, en leche, huevos, msculos, hgado, sangre o heces, con resultados negativos en todos ellos. (YDOXDFLyQ GH ,PSDFWR $PELHQWDO La evaluacin del impacto ambiental de nuevos cultivos GM es una parte fundamental de
su proceso de aprobacin y control. Esta evaluacin debe basarse en hiptesis de riesgo, y considerar el contexto de las tecnologas que VH XWLOL]DQ FRQ HO PLVPR Q \ GH WHFQRORJtDV alternativas, en caso de existir. En los Captulos 2 y 3 de esta seccin, se desarrolla este aspecto en mayor detalle, por lo que se enunciarn los principales temas en los que se enfoca la evaluacin que se realiza antes de la introduccin de un OGM en los agroecosistemas: &DSDFLGDG GH FRQYHUWLUVH HQ PDOH]D: en caso de que la planta GM tuviera caractersticas que la hicieran ms resistente a las condiciones ambientales, o tuviera mayor poder reproductivo que su contraparte convencional. 3RVLEOH LPSDFWR HQ HVSHFLHV EHQpFDV o VREUH OD RUD R IDXQD FLUFXQGDQWH HV HYDOXDGR
7DEOD Ensayos de alimentacin con OGMs en modelos animales (adaptado de Kuiper et al, 2001, Faust and Glenn, 2002)
a Cultivo GM / fraccin Maiz/grano Soja/alimento tostado. b Parmetros analizados Ganancia de peso, observaciones clnicas, ingesta, cal idad de carne, produccin y calidad de huevos, digestibilidad Ganancia de peso, ingesta, observaciones clnicas, produccin y calidad de carne, grasa abdominal. Ganancia de peso, ingesta, observaciones clnicas, calidad de carne, contenido graso. Ganancia de peso, ingesta, observaciones clnicas, pH rumi nal, produccin, calidad y composicin de la leche, caractersticas para produccin de queso. Digestibilidad
Modelo Animal Pollos parrilleros Gallinas ponedoras
Maz/ silaje/ forraje/ grano Soja/alimento tostado. Soja cruda M aiz/grano Soja/alimento tostado. Algodn/ semilla Maiz/grano Soja/alimento tostado.
Vacas (ganado de carne)
Cerdos
Vacas lecheras
Maiz/grano
Ovejas
el impacto que el cultivo podra tener en especies propias del agroecosistema. Por ejemplo, efectos sobre especies que no son el blanco de su actividad en el caso de cultivos GM protegidos de insectos . 0D\RU FDSDFLGDG GH FUX]DUVH con plantas de su entorno que la contraparte convencional. Incluso en caso de ser idntica, se evala cules seran las consecuencias de dichos cruzamientos (debido al llamado XMR JpQLFR PHGLDGR SRU SROHQ). (O XMR JHQpWLFR HQWUH SREODFLRQHV HV XQ fenmeno natural, responsable de una gran diversidad gentica. 3DUD HVWLPDU TXp SHVR SXHGH WHQHU XQ UDVJR QXHYR LQWURGXFLGR SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HQ HO XMR JpQLFR JHQHUDO HV LPSRUWDQWH WHQHU HQ FXHQWD TXp HIHFWR HQ SDUWLFXODU SURGXFLUi HVH JHQ VL VH HVWDEOHFH HQ RWUD SREODFLyQ. Todo esto se examina en funcin de la existencia de parientes silvestres de ese cultivo en la zona donde se lo quiere introducir. Por ejemplo, en el caso de la soja o el maz, no existen parientes silvestres en Argentina, pero s en Mxico (en el caso de maz) y en China (en el caso de la soja).
Todos estos puntos son analizados, del mismo modo que la inocuidad alimentaria, caso SRU FDVR. Tambin se estima el cambio que podra provocar en el manejo agronmico, la introduccin de un dado cultivo GM . El objetivo de las evaluaciones de riesgo amELHQWDO HV LGHQWLFDU LPSDFWRV HQ HO DPELHQWH QHJDWLYRV R SRVLWLYRV FXDQWLFDUORV \ SURSRUcionar elementos para aquellos que deben manejar y minimizar estos riesgos, siempre en el contexto de la prctica agronmica corriente y de las tecnologas alternativas disponibles (por HMHPSOR FXOWLYRV %W HYDOXDGRV HQ UHODFLyQ con las aplicaciones tradicionales de insecticidas qumicos, y en el contexto del Manejo Integrado de Plagas, como una herramienta ms de control biolgico). 1XHYDV WHFQRORJtDV SRWHQFLDOPHQWH DSOLFDEOHV D OD HYDOXDFLyQ GH OD ELRVHJXULGDG /RV DYDQFHV HQ OD WHFQRORJtD FLHQWtFD GH ORV ltimos aos han transformado profundamente la forma en la que se hace ciencia y se obtiene informacin de los sistemas biolgicos. La
enorme capacidad de secuenciacin en combinacin con la bioinformtica, han potenciado la LGHQWLFDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH JHQHV *Hnmica) y el estudio de su funcin (Genmica Funcional). Otras tecnologas derivadas de las primeras y en constante evolucin, se ocupan del estudio del 7UDQVFULSWRPD HO 3URWHRPD HO 0HWDERORPD, que abarcan todos los transcriptos, proteinas o metabolitos de una especie , respectivamente. Hoy se habla de las tecnoloJtDV yPLFDV en referencia global a este tipo de aproximacin. Paralelamente, estas tecnologas permiten el desarrollo de nuevos campos de la ciencia, como la Farmacogenmica, la Toxicogenmica y la Nutrigenmica, que son versiones miFDV GH ODV HVSHFLDOLGDGHV WUDGLFLRQDOHV TXH abordan el mismo problema. Estas tecnologas hoy se encuentran en una etapa inicial de generacin de enormes cantidades de datos; sin embargo, el potencial que presentan a corto y mediano plazo para el descubrimiento y la comprensin de procesos biolgicos, no tiene precedentes. Sin embargo, en el campo del anlisis de riesgo, especialmente en los aspectos toxicolgico y nutricional, aunque sera valioso contar con tecnologas que permitan determinar los SHUOHV ELRTXtPLFRV GH 2*0V \ VXV FRQWUDSDUWHV FRQYHQFLRQDOHV SUROLQJ), por el momento no es posible establecer metodologas validadas que permitan aplicar esta informacin al anlisis. El problema es que, al penetrar en niveles de resolucin tan altos, se encuentran una serie de cambios que incluso son evidentes entre individuos del mismo grupo (por ejemplo, individuos de la misma variedad no GM ) en niveles mayores a los que se encuentran entre un OVGM y su control, debido a la variabilidad natural. Esta variabilidad, hace muy difcil poder interpretar de manera clara muchos de los resultados que se obtienen, y VX VLJQLFDFLyQ ELROyJLFD UHDO SDUD SRGHU VDcar conclusiones en cuanto a su relevancia en la bioseguridad. 6LQ HPEDUJR D PHGLGD TXH VH DYDQ]D HQ HO FRQRFLPLHQWR GH ORV VLVWHPDV ELROyJLFRV VHUi SRVLEOH DSOLFDU QXHYDV WHFQRORJtDV D OD HYDOXDFLyQ GH OD VHJXULGDG DOLPHQWDULD QR VyOR GH 2*0V VLQR GH FXDOTXLHU DOLPHQWR
Conclusin (O REMHWLYR GHO DQiOLVLV GH ULHVJRV SDUD RUJDQLVPRV \R DOLPHQWRV GHULYDGRV GHO XVR GH OD LQJHQLHUtD JHQpWLFD *0 HV HVWLPDU HO LPSDFWR TXH ORV HIHFWRV LQWHQFLRQDOHV \ ORV QR LQWHQFLRQDOHV GH OD PRGLFDFLyQ SXGLHUDQ WHQHU VREUH OD LQRFXLGDG GHO DOLPHQWR R GHO RUJDQLVPR *0 R VREUH VX LPSDFWR DPELHQWDO (O HQIRTXH XWLOL]DGR SDUD DSOLFDU HVWH SURFHVR HO HQIRTXH FRPSDUDWLYR KD VLGR FRQVHQVXDGR D SDUWLU GH FRQVXOWDV \ GLVFXVLRQHV D QLYHO LQWHUQDFLRQDO \ VH EDVD HQ OD FRPSDUDFLyQ GH SDUiPHWURV FRPR FRPSRVLFLyQ Wy[LFRV QDWXUDOHV R DSWLWXG QXWULFLRQDO FRQ OD FRQWUDSDUWH FRQYHQFLRQDO TXH WLHQH KLVWRULD GH XVR VHJXUR \ HV DFHSWDGR FRPR DOLPHQWR LQRFXR 2(&' Lecturas y sitios sugeridos:
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3$57( 9, &$3,78/2 Bioseguridad

Moiss Burachik
Bioseguridad de Organismos *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV Marcos Regulatorios

Panorama Internacional Desde 1986, algunos pases como Japn, por ejemplo, se han ocupado de elaborar y desarrollar regulaciones para controlar la entrada en el mercado de productos derivados del uso de tcnicas de ADN recombinante. En ese momento el foco estaba puesto en los LQJUHGLHQWHV R DGLWLYRV DOLPHQWDULRV SURGXFLGRV SRU PLFURRUJDQLVPRV UHFRPELQDQWHV, pero a medida que la tecnologa avanzaba y se aplicaba a otros organismos, estas reglamentaciones se vieron extendidas D SODQWDV \ DQLPDOHV PRGLFDGRV Numerosos pases en los cinco continentes, tienen en este momento un marco regulatorio disponible para la evaluacin y aprobacin de OGMs antes de su entrada en el mercado. Entre los primeros pases que han desarrollado estos procesos, se encuentran los pases europeos, siendo la Comisin Europea, el rgano de evaluacin y control de la Unin Europea. En los Estados Unidos, diferentes agencias estn involucradas en estas evaluaciones: la Agencia de Alimentos y Drogas (FDA), la Agencia para la Proteccin del Medio Ambiente (EPA) y el Departamento de Agricultura (USDA). Canad y AustraliaNueva Zelanda, han establecido sus sistemas regulatorios ms recientemente (a partir de 1993). En cuanto a Amrica Latina, Argentina fue el pas pionero en esta materia, con la creacin de CONABIA en 1991, en el mbito de la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin . Otros pases de la regin han comenzado desde entonces a
establecer sistemas para la evaluacin de la bioseguridad de OGMs. Colombia, Chile, Brasil, Uruguay, Paraguay y Per, por ejemplo, poseen comisiones tcnicas evaluadoras, y en algunos de estos pases ya se han aprobado la comercializacin y el cultivo de variedades GM. Estos sistemas estn siendo establecidos en muchos otros pases, especialmente apuntando a la implementacin del 3URWRFROR GH %LRVHJXULGDG tambin conocido como Protocolo de Cartagena, vigente desde Septiembre de 2003. Este protocolo, UPDGR HQ HO DxR SRU PiV GH HVtados, regular los PRYLPLHQWRV WUDQVIURQWHUL]RV GH 2*0V YLYRV o OVGMs , con el objeto de asegurar un nivel adecuado de bioseguridad en el comercio internacional y la conservacin de la biodiversidad . Para una actualizacin sobre marcos regulatorios en America Latina, ver el listado de sitios recomendados.
Cules son los riesgos? Uno de los problemas inherentes a la concepcin de un marco regulatorio para los ensayos de campo de plantas GM es el de la LGHQWLFDFLyQ GH ORV ULHVJRV TXH GHEHQ FRQVLGHUDUVH (VWD LGHQWLFDFLyQ GHSHQGH GH ODV opciones que se acepten de un conjunto de posibilidades y de los YDORUHV a proteger. Estos valores deben ser establecidos por cada pas, con el aporte de la Sociedad ( cienWtFRV IXQFLRQDULRV SROtWLFRV HPSUHVDULRV pblico en general). Esto es, deben FRPSDWLELOL]DUVH FULWHULRV VREUH OR TXH VH FRQVLGHUDQ ULHVJRV DFHSWDEOHV, en un marco de intereses muy variados. 3RU RWUD SDUWH VL ELHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH los riesgos se basar en conocimiento cienWtFR GLVSRQLEOH DKRUD H[LVWLUi VLHPSUH XQ componente de H[WUDSRODFLyQ (si bien plausible) cuando se estimen efectos adversos SRWHQFLDOHV TXH HV OD PDWHULD PLVPD \ HO objetivo del anlisis de riesgos. No obstante estas limitaciones, la evaluacin de efectos potenciales de una entidad y VXV LPSOLFDFLRQHV SDUD YHULFDU \ HVWLPDU OD posibilidad de ocurrencia de un efecto adverso y caracterizar la naturaleza de tal efecto, HV GHQLEOH FRPR XQD DFWLYLGDG FLHQWtFD
como la ha declarado la Academia de Ciencias de los EEUU.

/D )RUPXODFLyQ GHO 3UREOHPD En la actualidad, se discute la aplicacin de la denominada Formulacin del Problema, a la evaluacin de seguridad ambiental de OGMs. Este proceso, es el primer paso en la ERA (Evaluacin de Riesgo Ambiental) y permite establecer un Marco Conceptual, en el que se consideran los objetivos, el alcance, los objetivos de estudio y las metodologas a aplicar, para llegar a plantear un SUREOHPD H[SOtFLWDPHQWH GHQLGR \ OD DSUR[Lmacin para su anlisis. La consistencia y la utilidad de la ERA para plantas GM puede ser mejorada mediante una rigurosa formulacin del problema, produciendo un SODQ GH DQiOLVLV que describa escenarios de exposicin relevantes y las consecuencias potenciales de estos escenarios. Una formulacin del problema ejecutada adecuadamente, asegura que los resultados del ERA sean relevantes para la toma de decisiones. Entre las caractersticas comnmente consideradas cuando se plantean los potenciales riesgos de las liberaciones de plantas GM, se pueden mencionar los siguientes (muchos de estos puntos son tambin aplicables a nuevas variedades o hbridos desarrollados convencionalmente): , 3pUGLGD GH 'LYHUVLGDG %LROyJLFD Aqu nos referimos a la prdida debida a la presin del mercado y de los costos sobre los productores, induciendo cambios en las prcticas agronmicas (menor uso de herbicidas e insecticidas) por la utilizacin (ventajosa) de OGMs, en desmedro de razas locales adaptadas (landraces) empleadas en la actualidad. Esto podra producirse si se cultivan OGMs en la vecindad de centros de origen o de diversidad de sus parientes silvestres o de especies sexualmente compatibles, por fenmenos de introgresin gnica (este riesgo es relativamente ms importante en el hemisferio Sur). II 7UDQVIHUHQFLD JHQpWLFD D HVSHFLHV VLOYHVWUHV R PDOH]DV sexualmente compatibles, con el resultado de la formacin de hbridos viables con fenotipos no deseados (p.ej., to-
lerancia a herbicidas, resistencia a insectos u otras plagas). III ,QFUHPHQWR GH OD SUHVLyQ GH VHOHFFLyQ, tal que favorezca un aumento de la tolerancia de plagas a insumos defensivos actualmente empleados. En el caso de insumos que por razones ambientales, econmicas o de manejo agrcola, son apreciados por el productor y/o por la Sociedad (p.ej., herbicidas post-emergentes, productos biodegradables, insecticidas biolgicos, productos de menor costo, o sin restricciones relacionadas con la propiedad intelectual, etc.), el aumento de la tolerancia de la plaga al producto es un efecto desfavorable, ya que puede convertir a dicho insumo en intil en el futuro. IV 0RGLFDFLyQ GH ODV UHODFLRQHV SUHGDGRUSODJD HQWUH LQVHFWRV, en detrimento de ORV LQVHFWRV EHQpFRV $TXt VH LQFOX\HQ ORV HIHFWRV VREUH RUJDQLVPRV QREODQFR (caso de cultivos con incorporacin de genes de resistencia a insectos). El conocimiento insuFLHQWH VREUH HVSHFLHV DPHQD]DGDV GH H[WLQFLyQ SHM LQVHFWRV EHQpFRV VXV SODQWDV refugios, etc.), tambin es un factor a tener en cuenta. 9 3RVLEOHV FDPELRV HQ ORV XMRV FRPHUciales. )XQGDPHQWRV GH ODV QRUPDWLYDV 'HQLFLRQHV La elaboracin y evolucin de un marco regulatorio para la bioseguridad de una tecnologa novedosa como la biotecnologa aplicada al mejoramiento vegetal, no est exenta GH GLFXOWDGHV Por una parte est la UHVSRQVDELOLGDG GH DVHJXUDU OD DSOLFDFLyQ VXVWHQWDEOH GH OD QXHYD WHFQRORJtD, y de preservar al homEUH OD RUD OD IDXQD \ HO PHGLR DPELHQWH GH los potenciales efectos perjudiciales de las innovaciones, tanto en el presente como en el futuro. Por otra parte, hay razones para QR REVWDFXOL]DU HO GHVDUUROOR GH ODV LQQRYDFLRQHV ELRWHFQROyJLFDV, que ya han demostrado poseer un gran potencial para EULQGDU EHQHFLRV D OD 6RFLHGDG 7RGD DFWLvidad humana (especialmente la innovacin tecnolgica) implica peligros (riesgos) y por lo tanto requiere la atencin (gestin) de su seguridad.
Figura 1. el sistema de regulacin y aprobacin de OGMs en Argentina
La seguridad se obtiene GHQLHQGR HYDluando y gestionando los riesgos asociados con la innovacin. Aplicando estos conceptos a la biotecnologa, que implica el uso de organismos vivos, podemos enfocar el anlisis de los riesgos de los ensayos hacia los siguientes aspectos generales: ,GHQWLFDFLyQ GH ORV todos organisPRV LQYROXFUDGRV (donantes, receptores, etc), Caractersticas de los organismos inYROXFUDGRV HQ OD REWHQFLyQ GHO 2*0 (familiaridad, patogenicidad, etc) 0DQHUD HQ TXH VHUiQ XWLOL]DGRV ORV OGMs (escala, contencin)
Caractersticas de las zonas y de los otros organismos (lugares, medio receptor potencial, incluyendo seres humanos) La normativa argentina ha tomado en consideracin estos aspectos, entre otros, para elaborar un marco regulatorio detallado para los (QVD\RV D &DPSR GH 3ODQWDV 7UDQVJpQLFDV, que se describe a continuacin en sus rasgos principales.
&RQVLGHUDPRV XQD GHQLFLyQ DFHSWDEOH GH ELRVHJXULGDG, como la SURWHFFLyQ GH OD VDOXG KXPDQD \ GHO DPELHQWH FRQ UHVSHFWR D ORV ULHVJRV FRQRFLGRV \R SHUFLELGRV GH OD WpFQLFD R SUR\HFWR HQ FXHVWLyQ de acuerdo al estado actual de nuestros conocimientos (VWi LPSOtFLWD HQ HVWD GHQLFLyQ TXH XQD UHJXODFLyQ SDUD OD ELRVHJXULGDG TXH VLJQLFD una regulacin de los riesgos aceptables para la Sociedad FRQOOHYD XQD FRQGLFLyQ GH H[LELOLdad y de adaptacin permanentes. Para la normativa argentina, un OGM es: un organismo (vegetal, animal, microorganismo o virus) en el cual se ha introducido informacin JHQpWLFD SUHFLVD \ GHQLGD en forma deliberada y dirigida a obtener un determinado fenotipo siendo aquella introduccin realizada de tal manera que dicha informacin gentica no podra haber sido adquirida por ese organismo por la va de mutaciones, recombinaciones u otras formas de transferencia gentica reconocidas como mecanismos que operan en la Naturaleza sin intervencin humana.
(VWD GHQLFLyQ KDFH UHIHUHQFLD DO mtodo de REWHQFLyQ GHO 2*0 con el propsito de establecer el campo de aplicacin de la norma excluyendo, por ejemplo, los cruzamientos tradicionales. Sin embargo, en el anlisis del riesgo de la liberacin de un OGM, la caracterstica dominante, esto es, aquella que constituye el foco del anlisis de la Comisin, es el inserto, esto es, OD SRUFLyQ GH '1$ HIHFWLYDPHQWH SUHVHQWH HQ HO JHQRPD WUDQVIRUPDGR, cuya naturaleza y consecuencias (geno- y fenotpicas) caracterizan al OGM como tal. Al OGM o conjunto de OGMs con un dado LQVHUWR VH ORV GHQRPLQD FROHFWLYDPHQWH HYHQWR. Varios OGMs pueden contener el mismo evento, y por lo tanto sus anlisis de riesgo sern equivalentes. Ocasionalmente, en etapas tempranas del desarrollo de un OGM, se admite que el evento puede no estar inequvocamente caracterizado, en el sentido de que no se ha GHQLGR HO LQVHUWR FRQ OD GHELGD SUHFLVLyQ SRU ejemplo, el inserto puede estar en diferentes posiciones en el genoma del vegetal). En estos casos, el anlisis se enfoca en la construccin gentica utilizada en la WUDQVIRUPDFLyQ. 'HQLPRV FRPR WUDQVIRUPDFLyQ HO PpWRGR utilizado para introducir la nueva informacin gentica, vehiculizada por el vector. Si bien la normativa argentina atiende aspectos del proceso de obtencin de un OGM en el anlisis de riesgo, esa atencin slo se HQIRFD HQ DTXHOODV FDUDFWHUtVWLFDV TXH LQWHUHVDQ HQ OD HYDOXDFLyQ GHO SURGXFWR (y no del proceso de su obtencin), en el sentido de que HVDV FDUDFWHUtVWLFDV VH HQFRQWUDUiQ QDOPHQWH en el OGM obtenido. Otra caracterstica del marco regulatorio administrado por la CONABIA es que considera cada producto o liberacin caso por caso. Si bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen HQ FXHQWD \ ORV FDVRV VLPLODUHV VRQ LGHQWLFDdos y considerados como objetos de informacin vlida para la evaluacin, los datos no VRQ WUDQVIHULEOHV, y cada caso y/o solicitanWH GHEHQ VHU FRKHUHQWHV \ DXWRVXFLHQWHV HQ cuanto a la informacin que provee a la ComiVLyQ /D GHQLFLyQ GH caso es entonces releYDQWH 8Q FDVR HVWi GHQLGR SRU /D HPSUHVD R HQWH VROLFLWDQWH. El HYHQWR GH WUDQVIRUPDFLyQ (es decir:
XQ LQVHUWR GHQLGR introducido en el genoma de la planta, admitindose un conjunto de eventos con un nico vector en las etapas muy preliminares del desarrollo del OGM). /D HVFDOD GH OD OLEHUDFLyQ.
Cualquiera de estas condiciones que no se conserve (p.ej., el mismo evento presentado por dos empresas o entes diferentes) representar un caso diferente. La normativa puesta en prctica es SURDFWLYD, en el sentido de que requiere un anlisis previo de todas las previsibles consecuencias de una liberacin antes de que tal liberacin sea autorizada. Como mencionamos antes, Argentina dispone desde 1991 de un marco regulatorio para el Anlisis y la Gestin de los Riesgos asociados con los Ensayos a Campo de Organismos GeQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV 2*0V (VWD QRUPDtiva es administrada por la Comisin NacioQDO $VHVRUD GH %LRWHFQRORJtD $JURSHFXDULD (CONABIA), que opera en el mbito del Ministerio de Agricultura, Ganadera y Pesca. Esta Comisin es multisectorial (la forman representantes de los sectores pblico y privado), PXOWLGLVFLSOLQDULD, y es la encargada de emitir las UHFRPHQGDFLRQHV FRQ UHVSHFWR D OD DXtorizacin para los ensayos solicitados (experimentacin y/o liberaciones a campo). Estas recomendaciones son remitidas a la autoridad decisoria. La consideracin bsica que gua el funcionamiento y los dictmenes de la CONABIA es la Bioseguridad, y su caracterstica esencial es que funda sus procedimientos operativos en FRQVLGHUDFLRQHV H[FOXVLYDPHQWH WpFQLFDV IXQGDGDV HQ ORV FRQRFLPLHQWRV FLHQWtFRV GLVSRQLEOHV. Los principales criterios aplicados en la normativa argentina son: el criterio de bioseguridad OD GHQLcin, evaluacin y gestin de los riesgos, es la consideracin primaria y su aplicacin es SURDFWLYD, esto es, debe realizarse DQWHV GH DXWRUL]DUVH OD OLEHracin; los ensayos son evaluados caso SRU FDVR; el foco del inters est en el SURGXFWR, pero aquellas caractersticas
del procedimiento de su obtencin que terminan afectando o manifestndose en HO SURGXFWR QDO VRQ WDPELpQ DQDOL]DGDV el enfoque precautorio: el marco regulatorio DFRPSDxD HO GHVDUUROOR del producto, y no se requiere la fundamenWDFLyQ FLHQWtFD completa para detener dicho desarrollo; basta que se presente alguna de las siguientes situaciones: i) QR H[LVWH VXFLHQWH LQIRUPDFLyQ VREUH HO sistema, ii) los riesgos no son aceptables en base a presunciones razonables, iii) la evaluacin no sea concluyente, o iv) el sistema es demasiado complejo La CONABIA no interviene en las etapas ulteriores (aprobacin alimentaria, dictamen sobre el impacto en las exportaciones y registro, para la comercializacin) del camino de una planta GM hacia el mercado (Ver Figura 1). Sin embargo, emite un GLFWDPHQ SDUWLFXODU IXQGDGR sobre la bioseguridad de la produccin masiva a escala comercial del cultivo en cuestin. De este modo, la CONABIA dictamina sobre la historia de bioseguridad de la planta transgnica, SDUD LQIRUPDFLyQ GH ODV DJHQFLDV HVSHFtFDV del Estado encargadas de aquellos pasos. En los documentos que presentan a la CONABIA, los solicitantes de autorizaciones de ensayos tienen la opcin de hacer reserva de LQIRUPDFLyQ TXH FRQVLGHUHQ FRQGHQFLDO /D LQformacin as considerada, ser examinada por solamente uno de los miembros de la Comisin, quien deber emitir un juicio fundado sobre la bioseguridad de la propuesta y exponer esta opinin (aunque no la informacin reservada) ante la Comisin. Esta operatoria de CONABIA permite asegurar, tanto para la Sociedad como para los sectores empresariales, un balance correcto entre la proteccin de la salud, la preservacin de la calidad ambiental y la sustentabilidad de los proyectos aprobados, con la implementacin regulada, en tiempo y forma, de las innovaciones tecnolgicas propuestas por los solicitantes. La CONABIA realiza las evaluaciones de todas las Solicitudes de liberaciones de OVGM al ambiente, y recomienda al Ministro de Agricultura sobre la conveniencia o no de autorizar dichas liberaciones. Estas evaluaciones comprenden dos fases:
1. las evaluaciones de las OLEHUDFLRQHV H[SHULPHQWDOHV cuyo propsito es determinar que la probabilidad de efectos sobre HO DPELHQWH HV QR VLJQLFDWLYD primera IDVH GH HYDOXDFLyQ-, y 2. las evaluaciones de las OLEHUDFLRQHV H[WHQVLYDV cuyo propsito es determinar que dichas liberaciones del OVGM no generarn un impacto sobre el amELHQWH TXH GLHUD VLJQLFDWLYDPHQWH GHO que producira el organismo homlogo QR *0 VHJXQGD IDVH GH HYDOXDFLyQ-. (Ver Figura 1) 3ULPHUD )DVH GH (YDOXDFLyQ (QVD\RV H[SHULPHQWDOHV Los solicitantes deben presentar un legajo GH LQIRUPDFLyQ HVSHFtFD que consta de una ,QIRUPDFLyQ *HQHUDO sobre la liberacin y sobre el OGM en cuestin y de un apartado sobre las Condiciones de Bioseguridad que se pondrn en prctica. El campo del anlisis de los riesgos abarcado por estas informaciones, que debe proveer el solicitante, es amplio, e incluye tanto las FDUDFWHUtVWLFDV GH OD OLEHUDFLyQ FRPR ODV GHO OGM. Con respecto a las caractersticas de la liberacin, la ,QIRUPDFLyQ *HQHUDO sometida al anlisis incluir: Si el material es importado: status regulatorio en el pas de origen. Propsito de la liberacin (objetivo, cronograma, protocolos, antecedentes). Si es a escala de invernadero o a campo Operaciones de transporte de OGM (ingreso al pas, transportes internos). Cantidad y tipo de material a liberar, antecedentes en otros pases. Lugar de la liberacin. Detalles operativos para auditar la liberacin (fechas, instituciones, personas). Con respecto a las caractersticas del OVGM, se analizar el JHQRWLSR del evento (es decir, ODV QXHYDV FDUDFWHUtVWLFDV JHQpWLcas introducidas), para lo cual el solicitante debe proveer informacin con respecto a: Descripcin de la biologa molecular del sistema donante-vector-receptor
Mtodo de transformacin utilizado Genes principales (y sus organismos donantes). Genes auxiliares (marcadores de seleccin). Secuencias regulatorias (promotores, terminadores, enhancers, etc.). Otros elementos genticos introducidos. Productos de expresin, tejidos de la planta en los que se expresan, niveles de expresin. Homologas de secuencia con protenas txicas o alergnicas. Descripcin fenotpica del organismo receptor, centros de origen o diversidad gentica. Estabilidad fenotpica y nmero de geneUDFLRQHV HQ ORV TXH VH YHULFy
En cuanto a la seccin sobre las Condiciones de Bioseguridad, la informacin solicitada depende de la escala de la liberacin: desde laboratorio/invernadero hasta pruebas a campo. En el caso de eventos que an no han obtenido la autorizacin de comercializacin en el pas, es decir, HYHQWRV UHJXODGRV que se siembran a gran escala para SURGXFFLRQHV de semilla en contra-estacin para el hemisIHULR 1RUWH R FRQ RWURV QHV H[LVWH XQ SURWRFROR HVSHFtFR TXH HV QHFHVDULR SUHVHQWDU SDUD REWHQHU OD DXWRUL]DFLyQ En todos los casos el solicitante debe proveer informacin relativa a varios aspectos bsicos de los Procedimientos de Bioseguridad, a saber: D 'XUDQWH OD OLEHUDFLyQ: Descripcin y ubicacin del lugar o instalacin donde se realizar la liberacin. Localizacin precisa (mapas detallados): distancia a caminos, lugares transitados, lmites del predio bajo control del solicitante. Caractersticas constructivas de bioseguridad (laboratorio o invernadero) y normas de acceso. Tamao y nmero de parcelas, su GLVHxR SODQR GH VLHPEUD \ VXSHUFLH D VHPbrar. Medidas de aislamiento En ensayos a campo: distancias, tiempos GH RUDFLyQ MDXODV FREHUWXUD SDUD HYLWDU la diseminacin del polen, por viento o insectos, control de vectores potenciales de polen u otro material con capacidad de propagacin, etc. En ensayos en laboratorio o invernade-
ro: mtodos o estructuras de contencin contra el ingreso de vectores potenciales de material gentico. b) (Q ORV PRYLPLHQWRV GH PDWHULDOHV: semillas, material vegetal acompaante, as FRPR ORV OXJDUHV QRUPDV H LGHQWLFDFLyQ GHO material que sea almacenado. c) (Q OR UHODFLRQDGR FRQ HO GHVWLQR GHO material cosechado: el solicitante deber informar sobre su utilizacin, aclarando si ser local o si ser exportado o destrudo, e idenWLFDQGR ORV OXJDUHV GH VX DOPDFHQDMH QDO R transitorio. d) (Q OR UHODFLRQDGR FRQ OD GLVSRVLFLyQ QDO 2*0 \ PDWHULDOHV UHPDQHQWHV En lo relacionado con la GLVSRVLFLyQ QDO del OGM y de los materiales remanentes, se requiere informacin sobre el tratamiento del suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno, los controles posteriores (deteccin de plantas voluntarias) y su duracin. H (Q HO FDVR GH XQ HYHQWXDO HVFDSH GHO 2*0 \R GH FXDOTXLHU PDWHULDO DVRFLDGR: El solicitante debe exponer con claridad los procedimientos que seguir en el caso de XQ HYHQWXDO HVFDSH GHO 2*0 y/o de cualquier material asociado. Normalmente, esto LQFOX\H PpWRGRV GH LGHQWLFDFLyQ GHO 2*0 procedimientos para limitar y controlar el esFDSH DVt FRPR OD REOLJDFLyQ GH QRWLFDU SHrentoriamente a la autoridad regulatoria. f) 7pFQLFDV TXH VH XVDUiQ SDUD GHWHFWDU OD WUDQVIHUHQFLD GH JHQHV GHVGH HO 2*0 DO DPELHQWH ELyWLFR. g) 8VRV SUHYLVWRV GHO WHUUHQR FRQ SRVWHULRULGDG D OD OLEHUDFLyQ VROLFLWDGD. Control posterior de la parcela, duracin de los controles post-cosecha.
Una vez completados los ensayos, es requisito indispensable para poder acceder a nuevas autorizaciones, la entrega de un InIRUPH GH &LHUUH GH OD /LEHUDFLyQ que incluye observaciones relativas al comportamiento agronmico del OVGM en cuanto a gerPLQDFLyQ FUHFLPLHQWR YHJHWDWLYR RUDFLyQ susceptibilidad a enfermedades y plagas, as como efectos sobre organismos no blanco y caractersticas de la cosecha, los tratamienWRV UHDOL]DGRV \ OD GLVSRVLFLyQ QDO
Es importante notar que estas liberaciones son peridicamente inspeccionadas por agentes habilitados por la SAGPyA. La normativa completa, as como los requerimientos de informacin detallados en los formularios que deben completarse para obtener una autorizacin de liberacin, se encuentran a disposicin para la consulta a travs del sitio de CONABIA.
6HJXQGD )DVH GH (YDOXDFLyQ HO FDPLQR hacia el mercado Como ya se ha enfatizado antes, la incumbencia bsica de la CONABIA est limitada a la gestin de los riesgos y la bioseguridad de los ensayos a campo de plantas GM a diferentes escalas. Los pasos siguientes hacia el mercado, es decir la aprobacin de su uso como materia SULPD DOLPHQWDULD OD YHULFDFLyQ GH TXH VX OLberacin comercial no afectar negativamente nuestro comercio internacional, el registro de la nueva variedad, y la autorizacin para la produccin comercial, son resorte de otras agencias del Estado (Ver Figura 1). Esas dependencias basan su decisin en dos clases de informacin: La informacin requerida a los solicitanWHV TXH HV HVSHFtFD D VXV QHFHVLGDGHV (la aptitud alimentaria, la estructura de nuestro mercado de exportacin). La informacin suministrada por la CONABIA sobre el comportamiento del OGM en cuestin a lo largo de los ensayos autorizados que se han realizado. Esta ltima informacin constituye una parte crucial del camino de la planta GM hacia el mercado, y es solicitada y analizada por la CONABIA. En la normativa argentina actual se la denomina 6HJXQGD )DVH GH (YDOXDFLyQ. La condicin necesaria para dar una respuesta positiva a estas solicitudes en la prctica, es que la CONABIA considere que: no existen riesgos para la salud humana, SDUD HO DJURHFRVLVWHPD \ SDUD OD RUD \ OD IDXQD DVRFLDGRV GHULYDGRV GHO FXOWLYR QR FRQQDGR GHO 2*0 HQ FRQVLGHUDFLyQ Esta categorizacin requiere del solicitante la presentacin de un breve Resumen (ca-
ractersticas del OGM; el evento, breve descripcin molecular del inserto; usos del OGM, GHVWDFDQGR ORV TXH GLHUDQ GHO RUJDQLVPR QR transformado; condiciones especiales, si las hubiera, para el cultivo extendido en gran escala) y de una 6ROLFLWXG que se compone de: A) ,QIRUPDFLyQ *HQHUDO TXH VH UHHUH D OD informacin anterior, pero de manera ms detallada. Deber incluir, entro otras informaciones, &DUDFWHUL]DFLyQ GHO 29*0 incluyendo protenas y/o RNAs que expresa el OGM originados en el inserto y el fenotipo que resulta de esa expresin; las ventajas DSRUWDGDV SRU OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD resultados de los ensayos de campo realizados, en el pas y en el extranjero, en lo que respecta a la bioseguridad . 8QD GHFODUDFLyQ GH HTXLYDOHQFLD GLIHUHQFLD R QR HTXLYDOHQFLD GHO 29*0 El solicitante declarar aqu si el OVGM es equivalente al organismo no GM de la misma especie, excepto por el fenotiSR DSRUWDGR SRU OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD introducida. La declaracin se referir a todas aquellas caractersticas del OVGM TXH QR IXH LQWHQFLyQ PRGLFDU HQ HO HYHQto. Se deben citar los trabajos que sostienen esta declaracin. La equivalencia se referir al menos a: a) composicin centesimal, procesamiento, productos y subproductos; y b) caractersticas y prcWLFDV DJURQyPLFDV iUHDV JHRJUiFDV tipos de ambientes, precauciones espeFtFDV SDUD HO FXOWLYR H[WHQVLYR VL ODV hubiera, con relacin a efectos ambientales. Asimismo, se declararn aqu las observaciones sobre cualquier diferencia no intencional o no esperada, observada en cualquier aspecto de la expresin fenotpica del OVGM en comparacin con el organismo no GM de la misma especie. Se deber incluir toda observacin que haya surgido en el monitoreo postcomercializacin de este evento (si ste ha sido liberado comercialmente en otros pases), como as tambin las que resultaran de investigaciones realizadas con posterioridad a dichas liberaciones comerciales.
En caso que corresponda, el solicitante GHFODUDUi DTXt VL HO WLSR GH PRGLFDFLyQ gentica tiene el propsito de introducir diferencias que determinan que el OVGM no pueda considerarse sustancialmente equivalente al no OVGM, explicando sucintamente aquellas diferencias. (Ver tambin Captulo1). Una historia de experimentaciones y ensayos previos, instrucciones sobre manejo (agronmico y del producto) y almacenaje (producto, subproductos y UHPDQHQWHV VL GLHUHQ GHO RUJDQLVPR QR transgnico. Propuestas para el envasado, rotulado y SURFHVDPLHQWR VL GLHUHQ GHO RUJDQLVPR no transgnico y medidas que deben tomarse en caso de liberacin accidental o mal empleo.
B) Caracterizacin general del OVGM: esta informacin se concentra en la metodologa y la construccin utilizada en la obtencin del OGM y en la caracterizacin exhaustiva del mismo a nivel molecular y fenotpico. Se debe proporcionar informacin sobre: /D HVSHFLH UHFHSWRUD (caractersticas fenotpicas, centros de origen i diversiGDG GLVWULEXFLyQ JHRJUiFD HQ $UJHQtina, estabilidad gentica, potencial de transferencia y/o intercambio de genes con otros organismos, reproduccin, supervivencia, diseminacin, interacciones con otros organismos, caractersticas patognicas, txicas, antinutricionales, DOHUJpQLFDV X RWUDV H KLVWRULD GH PRGLcaciones genticas previas). /D PRGLFDFLyQ JHQpWLFD mtodo de transformacin empleado, descripcin detallada del vector (cada elemento gentico componente, su origen, tamao y funcin; mapa del vector; secuencias nucleotdicas o regiones de la construccin cuyos productos o funciones no sean conocidas; capacidad para transferir genes, o para ser movilizados por conjugacin, recombinacin o integracin; regiones del vector que se incorporan al OGM, es decir constituyen el inserto).
Caracterizacin del inserto: anlisis molecular de la insercin en el genoma del OVGM (nmero de sitios de integracin, nmero de copias de cada gen, incorporacin de porciones de genes), origen y funcin de cada elemento insertado en el OVGM, informacin sobre si el inserto (esto es, alguno de sus elemenWRV FRQHUH DOJXQD IXQFLyQ QR UHTXHULGD para la expresin del fenotipo esperado en el OVGM, transposiciones y/o rearreglos dentro del inserto presente en la planta (con respecto a las posiciones que los elementos genticos tenan en el vector) y/o de/con porciones del genoma de la planta dentro del inserto y en VXV UHJLRQHV DQTXHDQWHV LQIRUPDFLyQ detallada de las secuencias del genoma YHJHWDO TXH DQTXHDQ GHO LQVHUWR \ VREUH la presencia/ausencia de fragmentos del inserto en regiones del genoma vegetal fuera del inserto funcional. Los organismos donantes: caractersticas patognicas (con relacin a las resultantes de la expresin de los elementos presentes en la construccin utilizada en la transformacin). Caractersticas perjudiciales para la salud humana o animal (con la observacin del punto anterior), potencial y/o antecedentes de transferencia natural (esto es, en hbitats y condiciones naturales) de los elementos que constituyen la construccin, desde los organismos donantes a otros organismos, su probabilidad o frecuencia, y fenotipos posibles u observados de los organismos receptores. &DUDFWHUL]DFLyQ GHO 29*0 SURSLDmente dicho: caractersticas fenotpicas incorporadas, si alguna caracterstica fenotpica del organismo receptor no GM no se expresa en el OVGM. Estabilidad gentica, segregacin y transferencia a la progenie. Anlisis molecular (Southern blot, PCR). Caractersticas de la expresin del nuevo material gentico. Productos expresados (debe incluir todos los elementos genticos que se incorporan al OVGM, total o parcialmente), caractersticas de la expresin (p.ej.,
FRQVWLWXWLYD WHMLGRHVSHFtFD WHMLGRV del OVGM en que se expresan los genes introducidos y niveles de expresin y su evolucin temporal, en relacin con el ciclo de la planta. Actividad biolgica de las secuencias expresadas, ARNs transcriptos no traducidos, sus niveles, funcin y caracterizacin. Anlisis detallado de las posibilidades de transcripcin, que comience dentro del inserto y se extienda hacia el genoma de la planta ignorando seales de terminacin, as como de transcripcin y traduccin de protenas de fusin o de marcos de lectura nuevos, generados como consecuencia de la insercin. Tambin, se deben detallar las tcnicas de deteccin del OVGM en el ambiente: Mtodos moleculares y Mtodos biolgicos: (IHFWRV VREUH OD VDOXG KXPDQD efectos txicos o alergnicos del OVGM, sus materiales derivados, sus productos metablicos, los productos resultantes del procesamiento industrial habitual (incluyendo pero no limitado a alimentos), o los resultantes de interacciones de estos productos con otros componentes normales de la dieta humana. Efecto de OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD VREUH DTXHOODV caractersticas del organismo no GM que constituyan un peligro o riesgo para la salud (incluyendo, pero no limitados a, los niveles de antinutrientes). Interacciones del OVGM con el amELHQWH supervivencia en el ambiente tasa de germinacin y dormicin, vigor vegetativo (calidad agronmica, susceptibilidad a patgenos, a insectos, a factores de estrs ambiental), ventajas adaptativas presentes o potenciales del OVGM frente al organismo no GM, en hbitats y condiciones naturales, y en condiciones de agroecosistemas para la misma especie y para otros cultivos geoJUiFDPHQWH FRPSDWLEOHV /RV PRGRV y tasas de multiplicacin y las formas naturales de propagacin. Informacin cuantitativa sobre interacciones: susceptibilidad a patgenos, plagas e insectos, capacidad de supervivencia (plantas voluntarias) y rendimiento.
,PSDFWR DPELHQWDO GHO 29*0 HQ HO agroecosistema: efectos del OVGM VREUH OD RUD IDXQD \ SREODFLyQ PLFURbiana, con nfasis en las especies beQpFDV (IHFWRV GHULYDGRV GH FDPELRV en las prcticas agronmicas (si los hubiera). Conceptos para el manejo de los efectos mencionados en los puntos anteULRUHV \ FRQGLFLRQHV HVSHFtFDV SDUD HO manejo de efectos ambientales debidos al OVGM. Estudios realizados sobre el escape de genes va polen. &RPSRUWDPLHQWR HVSHUDGR HQ OD SURduccin del OVGM a escala comercial: HVWD LQIRUPDFLyQ VH UHHUH HVSHFtFDPHQWH DO LPSDFWR DPELHQWDO D LQIRUmacin general sobre la inocuidad del OVGM o sus derivados alimentarios y a VX SHUO FRPSRVLFLRQDO ,PSDFWR $PELHQWDO: efectos sobre la RUD \ IDXQD PDQHMR GH HIHFWRV QR GHseados potenciales (p.ej., desarrollo de resistencia a Bt en insectos previamente sensibles), programa de investigaciones de seguimiento propuesto, para monitorear posibles efectos sobre el ambiente en el largo plazo. (IHFWRV VREUH OD VDOXG KXPDQD: conceptos y programa de investigaciones que se realizaron para la evaluacin de la inocuidad de las nuevas protenas expresadas en el OVGM; evaluacin de la toxicidad, digestin en jugo gstrico simulado, a diferentes pH: velocidad, caracterizacin de los fragmentos originados y su actividad biolgica. Toxicidad aguda de las nuevas protenas en animales de laboratorio; determinacin del nivel de efecto adverso no observable (sigla del ingls NOAEL), si es posible. Clculo de la ingesta diaria aceptable (IDA), y su comparacin con la ingesta habitual para humanos en dietas normales. Evaluacin del potencial alergnico, homologas de las secuencias de aminocidos de las nuevas protenas con otras protenas relevantes (toxinas, alrgenos, etc.). Composicin centesimal del OVGM, y comparacin con el correspondiente organismo no GM, en
todos los tejidos de la planta; protenas y composicin en aminocidos, lpidos y composicin de cidos grasos, carbohidratos y otros componentes (cenizas, EUD PDWHULD VHFD YLWDPLQDV HWF Como se presenta en el esquema correspondiente, la evaluacin completa y detallada de la inocuidad y aptitud alimentaria de los OVGMs es llevada a cabo por otra Comisin Evaluadora, que funciona en la rbita del SENASA (Servicio Nacional de Calidad y Sanidad Agroalimentaria). Las caractersticas de esta etapa de evaluacin son similares a las que lleva adelante CONABIA, y basa sus conclusiones en toda la informacin presentada a CONABIA, ms otra serie de datos, evidencias experimentales y estudios que deben ser preVHQWDGRV HVSHFtFDPHQWH HQ UHODFLyQ FRQ ORV DVSHFWRV QXWULFLRQDOHV \R WR[LFROyJLFRV del OVGM en cuestin, de acuerdo a los requisitos GH OD UHVROXFLyQ RFLDO (Q DPEDV LQVWDQFLDV GH HYDOXDFLyQ GH ELRVHJXULGDG VH DSOLFD HO HQIRTXH FRPSDUDWLYR GHVDUUROODGR HQ HO &DStWXOR \ OD FRQFOXVLyQ D OD TXH FRPR PtQLPR GHEH DUULEDUVH SDUD SRGHU UHFRPHQGDU OD DXWRUL]DFLyQ FRPHUFLDO HV (O 2*0 HV WDQ VHJXUR FRPR VX FRQWUDSDUWH QR PRGLFDGD SDUD HO PHGLR DPELHQte y la salud humana o animal y no menos QXWULWLYR /HFWXUDV VLWLRV UHFRPHQGDGRV
:ROW - .HHVH 3 5D\ERXOG $ )LW]SDWULFN - %XUDFKLN 0 *UD\ $ 2OLQ 6 6FKLHPDQ - 6HDUV 0 \ :X ) 3UREOHP IRUPXODWLRQ LQ WKH HQYLURQPHQWDO ULVN DVVHVVPHQW IRU JHQHWLFDOO\ PRGLHG SODQWV 7UDQVJHQLF 5HV '2, V %XUDFKLN 0 \ 7UD\QRU 3 $QiOLVLV RI D 1DFLRQDO %LRVDIHW\ 6\VWHP 5HJXODWRU\ 3ROLFLHV DQG 3URFHGXUHV LQ $UJHQWLQD ,61$5 &RXQWU\ UHSRUW www.isnar.cgiar.org 0F/HDQ 0$ 0DFNHQ]LH '- DQG &ROH %$ 3ROLF\ &KRLFHV LQ WKH 'HYHORSPHQW RI 1DWLRQDO )UDPHZRUNV IRU %LRVDIHW\ 5HJXODWLRQ 5HSRUW IRU WKH ,QWHUQDWLRQDO 6HUYLFH IRU 1DWLRQDO $JULFXOWXUDO 5HVHDUFK ,61$5 7KH +DJXH
5D\ERXOG $ &RRSHU , 7LHUHG WHVWV WR DVVHVV WKH HQYLURQPHQWDO ULVN RI WQHVV FKDQJHV LQ K\EULGV EHWZHHQ WUDQVJHQLF FURSV DQG ZLOG UHODWLYHV WKH H[DPSOH RI YLUXV UHVLVWDQW %UDVVLFD QDSXV (QYLURQ %LRVDIHW\ 5HV 86(3$ *XLGHOLQHV IRU HFRORJLFDO ULVN DVVHVVPHQW (3$5) 5HSRUW QU (3$5) ZZZPLQDJULJREDU (Biotecnologa $JURSHFXDULD QRUPDWLYD GHWDOODGD TXH SXHGH FRQVXOWDUVH OLEUHPHQWH ZZZVHQDVDJRYDU UHVROXFLyQ KWWSZZZFEGLQWELRVDIHW\SURWRFROVKWPO: Protocolo de Bioseguridad ZZZFWQELRJRYEU: sitio de la Comisin de Bioseguridad de Brasil www.oecd.org 2UJDQL]DFLyQ SDUD HO 'HVDUUROOR \ OD &RRSHUDFLyQ (FRQyPLFD ZZZIGDJRY: Agencia de Drogas y Alimentos GH ORV ((88 ZZZIDRRUJ $JHQFLD SDUD OD $JULFXOWXUD \ OD Alimentacin de la Naciones Unidas ZZZUHGELRRUJ LU D 0DUFR 5HJXODWRULR SDUD LQIRUPDFLyQ VREUH ELRVHJXULGDG HQ $PHULFD /DWLQD \ HO &DULEH KWWSZZZXQHSFKELRVDIHW\: Programa DPELHQWDO GH ODV 1DFLRQHV 8QLGDV ,QIRUPDFLyQ VREUH HO 3URWRFROR GH %LRVHJXULGDG \ PDUFRV regulatorios internacionales
9, &$378/2 )OXMR JpQLFR \ VX SRVLEOH LPSDFWR DPELHQWDO

Mnica Poverene; Soledad Ureta; Agustina Gutirrez
)OXMR JpQLFR \ ULHVJR GH HVFDSH GH WUDQVJHQHV DO DPELHQWH

El XMR JpQLFR HV HO SURFHVR GH LQFRUSRUDcin de genes de una poblacin dentro de otra y ocurre entre individuos formalmente considerados una especie o entre especies relacionadas. El intercambio de genes entre plantas es un proceso bien conocido en todos los cultivos mejorados por tcnicas tradicionales o mediante biotecnologa y en las plantas silvestres emparentadas con ellos. La mayora de los transgenes en cultivos comerciales genticamente PRGLFDGRV &*0 FRQHUHQ WROHUDQFLD D KHUbicidas o resistencia a plagas, caractersticas ciertamente favorables en ecosistemas agrcolas. Se denomina escape a la diseminacin no intencional de la construccin gentica de un CGM hacia otras poblaciones, mediante mecanismos biolgicos naturales como la reproduccin sexual o la transferencia horizontal. La reproduccin sexual implica la unin de gametos femeninos y masculinos, mientras que la transferencia gnica horizontal o lateral consiste en el intercambio de material gentico no sexual y ocurre generalmente en microorganismos. En el caso de las plantas, el escape gnico a travs del polen es el mecanismo natural. La prdida de semillas durante el transporte y su establecimiento en banquinas y vas de comunicacin es muy importante en la dispersin de plantas fuera del cultivo. La semilla puede trasladarse grandes distancias y sobrevive durante mucho ms tiempo que el polen. En regiones donde crecen parientes silvestres, se espera que ocurra hibridacin espontnea con el cultivo transgnico, a menos que las plantas GM estn especialmente diseadas para limiWDU HO XMR JpQLFR UHGXFLHQGR OD GLVSHUVLyQ GH semillas o el movimiento de genes a travs del polen. Para muchos CGM se asume que las plantas transgnicas se cruzarn abiertamente
y la evaluacin del riesgo se centra en la conVHFXHQFLD GHO XMR GH WUDQVJHQHV UHVXOWDQWH sobre el ambiente En especies algamas o parcialmente algamas, la difusin del transgn depender de los mecanismos de polinizacin, generalmente SRU HO YLHQWR DQHPyOD R ORV LQVHFWRV HQWRPyOD /D PHMRU HVWUDWHJLD SDUD SUHYHQLU OD difusin de transgenes es el aislamiento por distancia entre poblaciones. En los cultivos, se conocen las distancias mnimas de aislamiento necesarias para prevenir la polinizacin cruzada entre variedades. Estas constituyen la base para determinar las medidas de bioseguridad que se exigirn en cada caso durante la fase de liberacin experimental. Una vez aprobado el cultivo para su siembra a escala comercial, la aplicacin de esas distancias en la prctica agronmica queda en manos de los agricultores y depende de los intereses econmicos que para ellos represente la comercializacin de un cultivo transgnico. Cuando coexisten con cultivos tradicionales u orgnicos se requieren medidas adecuadas durante el cultivo, FRVHFKD WUDQVSRUWH \ DOPDFHQDPLHQWR D Q GH evitar la mezcla accidental de materiales GM y no GM. Engels y col. (2006) citan ejemplos de contaminacin de lotes de semilla y mezclas fsicas en colza y tomate. Las recomendaciones tendientes a evitarla consisten en: a) medidas a tomar dentro del establecimiento, como respetar las distancias de aislamiento, colocar barreras a la dispersin del polen, o intercalar lotes con cultivo de una especie distinta. b) cooperacin entre establecimientos vecinos sobre planes de siembra, o uso de variedades FRQ WLHPSR GH RUDFLyQ GLIHUHQWH F XVR GH servicios de extensin agrcola para informar a los productores, monitoreo, intercambio de informacin tcnica y servicios de alarma. /RV WUDQVJHQHV TXH FRQHUHQ WROHUDQFLD a herbicidas, resistencia a insectos o a patgenos podran transmitir las mismas caractersticas a plantas silvestres relacionadas, determinando una mayor supervivencia bajo la presin de seleccin natural (insectos herbvoros o patgenos) o de prcticas agronmicas usuales para el control de malezas, plagas o enfermedades (uso de pesticidas, agentes de control biolgico). En consecuencia, aumen-
tara el nmero o tamao de las poblaciones silvestres. El potencial impacto ambiental depende tanto de la probabilidad de transferencia del transgn a la poblacin silvestre como de sus consecuencias. Segn la probabilidad de WUDQVIHUHQFLD ORV FXOWLYRV SXHGHQ FODVLFDUVH en tres grupos: 1. Mnima probabilidad de transferencia a especies silvestres, sea porque stas no existen en el rea o no hay compatibilidad sexual entre el cultivo y su pariente silvestre. 2. Cultivos con baja probabilidad de transferencia, cuando la compatibilidad sexual es limitada. 3. Cultivos con alta probabilidad de transferencia, cuando especies silvestres sexualmente compatibles crecen en la vecindad del rea sembrada. Las consecuencias de la transferencia dependen de la capacidad potencial del transgn para conferir ventajas adaptativas a la especie silvestre receptora. De acuerdo a este criterio, tambin se pueden agrupar los genes en diferentes clases. En la clase 1 se sitan los transJHQHV TXH FRQHUHQ SHTXHxD R QLQJXQD YHQWDja adaptativa, como los marcadores de seleccin, genes de androesterilidad o de madurez retrasada. La clase 2 comprende genes que pueden conferir alguna ventaja bajo la adecuada presin de seleccin, como los de tolerancia a herbicidas o de resistencia a insectos y enfermedades. En la clase 3 se sitan genes para mejorar el crecimiento y la supervivencia, que conferiran ventajas adaptativas en cualquier DPELHQWH /D WDEOD SUHVHQWD XQD FODVLFDFLyQ de los cultivos GM autorizados o bajo ensayo en Argentina, segn esos criterios. La prdida de biodiversidad consiste en la erosin o prdida de variabilidad gentica atribuida al monocultivo o al uso de unas pocas variedades que dominen el mercado de semillas. Esta situacin no es privativa de los cultivos GM y puede prevenirse mediante una DGHFXDGD SODQLFDFLyQ GH OD DJULFXOWXUD UHJLRnal. Algunas especies crecen en ambientes HVSHFLDOL]DGRV R JHRJUiFDPHQWH OLPLWDGRV como raras especies silvestres o razas locales domesticadas (landraces) constituyendo reser-
vorios de diversidad gentica de potencial uso en el mejoramiento gentico. Cuando crecen en la vecindad de cultivos a gran escala, existe OD SRVLELOLGDG GH FUX]DPLHQWRV QDWXUDOHV \ XMR gnico a travs del polen del cultivo hacia la especie local. Esto puede resultar en una prdida de vigor y fertilidad en los descendientes, llamada depresin por alogamia, o prdida de identidad gentica por sucesivos ciclos de cruzamiento con el cultivo, de manera que paulatinamente la especie local decae hasta su completa extincin. El proceso es dependiente de la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez depende de la cantidad relativa de individuos de cada especie. Esto tambin puede evitarse mediante adecuadas medidas de conservacin y manejo del cultivo. Se puede concluir que la posibilidad de escape de transgenes es de orden diferente segn la poblacin recipiente. Una variedad no GM de la misma especie ciertamente adquirir HO WUDQVJpQ VL HV H[SXHVWD DO XMR GH SROHQ GHO cultivo GM. Una rara variedad local domesticada perder identidad por contacto gentico con el cultivo. La situacin no es tan simple si se trata de una poblacin silvestre emparentada, ya que depender de las relaciones genticas con el cultivo, que determinan la probabilidad de hibridacin. Se requerir de una evaluacin de la probabilidad de escape y del impacto que el transgn podra ocasionar en la poblacin silvestre. )DFWRUHV TXH GHWHUPLQDQ HO HVFDSH GH WUDQVJHQHV \ VX LPSDFWR DPELHQWDO Los cultivos en su mayora estn emparentados con especies silvestres o malezas, con las que pueden hibridar y producir descendientes total o parcialmente frtiles. Esta hibridacin ha sido documentada en 22 de los 25 cultivos ms importantes y es muy probable que sus genes se encuentren introgresados dentro de las poblaciones silvestres. Trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, maz, soja, girasol, colza, man, poroto, caa de azcar, remolacha azucarera algodn, papa, zapallo, frutilla, rbano, zanahoria, vid, trboles son algunas de las especies cultivadas que se encuentran en experimentacin biotecnolgica. El intercambio gentico de los cultivos con sus parientes silvestres es
7DEOD &ODVLFDFLyQ GH ODV HVSHFLHV *0 HQ $UJHQWLQD VHJ~Q OD SUREDELOLGDG GH WUDQVIHUHQFLD GHO WUDQVJpQ *UXSR \ ODV FRQVHFXHQFLDV ELROyJLFDV GH OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD &ODVH GH DFXHUGR D $KO *R\ \ 'XHsing (1996). Entre parntesis se indica el nmero de autorizaciones entre 1997 y 2007.
Grupo I
Cultivo Algodn Maz
Clase 1
Clase 2 Toler. herbicidas (47) Resist. insectos (46)
Clase 3
Calidad alterada (68) Caracteres agronmicos (2) Androesterilidad (3)
Toler. herbicidas (463) Toler. estrs ambiental (20) Resist. insectos (564) Resist. enfermedades (12) Toler. herbicidas (145) Tolerancia estrs ambiental (1) Resist. insectos (53) Toler. herbicidas (20) Resist. enfermedades (1) Toler. estrs ambiental (4)
Alto rendimiento (4)
Soja
Calidad alterada (64) Modif. calidad de semilla (1)
Alto rendimiento (97)
Tabaco
Calidad alterada (3)
Trigo
Calidad alterada (5) Calidad de marcadores visuales (1)
Toler. herbicidas (6) Resist. enfermedades (7) Toler. estrs ambiental (1) Toler. herbicidas (11) Resist. enfermedades (2) Toler. herbicidas (56) Resist. enfermedades (205) Resist.insectos (2)
II
Caa de azcar Papa
III
Alfalfa
Calidad alterada (2) Propiedades nutracuticas (31)
Toler. herbicidas (6) Resist. insectos (2) Toler. herbicidas (2) Tolerancia estrs ambiental (4) Alto rendimiento (27) Alteracin en la fertilidad (2)
Arroz
Calidad alterada (3)
Crtamo Colza Frutilla Girasol
Calidad alterada (3) Calidad alterada (1) Toler. herbicidas (7) Resist. insectos (1) Resist. enfermedades (1) Toler. herbicidas (3) Resist. enfermedades (49) Resist. insectos (31) Fijacin de nitrgeno (1)
Naranjo Remolacha, Acelga Tomate Trbol blanco
Resist. enfermedades (3) Toler. herbicidas (3) Resist. enfermedades (1) Retraso de la senescencia (1)
uno de los mecanismos de origen de las malezas. Los cruzamientos ocurren naturalmente en regiones donde las especies conviven. Aproximadamente la mitad de los caracteres que determinan invasividad estn controlados por genes nicos, de modo que existe la posibilidad de que los transgenes persistan y moGLTXHQ SREODFLRQHV VLOYHVWUHV 3RGUtD UHVXOWDU que stas se vuelvan ms abundantes en su hbitat o invadan nuevos hbitats. El concepto GH VXSHUPDOH]D KD VXUJLGR FRPR FRQVHFXHQFLD GH UHFRQRFHU OD GLFXOWDG TXH LPSOLFDUtD HO control de esas poblaciones. Tambin podran tener efectos adicionales sobre poblaciones de insectos o patgenos. No obstante, la probabilidad de introgresin de elementos transgnicos dentro de otras variedades o germoplasmas depender de la biologa de reproduccin, fertilidad de los hbridos, dispersin de semilla y presin de seleccin. Para que ocurra introgresin de genes, cultivos sexualmente compatibles o parientes silvestres deben estar presentes y cercanos al FXOWLYR IXHQWH HO HQWUHFUX]DPLHQWR GHEH VHU posible y los resultantes hbridos y sus respectivas retrocruzas tienen que ser frtiles. La introgresin de genes es mayor en especies algamas, como maz y es menor en autgamas, como soja y arroz, siendo mnima en especies de propagacin vegetativa, como papa. An en estos casos los transgenes pueden ser introducidos sin intencin mediados por mezclas fsicas de semillas o propgulos. La evaluacin del riesgo de escape de transgenes comprende tres etapas: a) Investigacin de barreras genticas o JHRJUiFDV SDUD HO HVFDSH GHO WUDQVJpQ GHVGH el cultivo hacia las poblaciones silvestres. b) Investigacin del efecto del transgn sobre la aptitud biolgica de las plantas silvestres. c) Investigacin de las consecuencias ecolgicas de la difusin del transgn en la poblacin silvestre. D %DUUHUDV JHRJUiFDV \ JHQpWLFDV HQWUH HO FXOWLYR \ HVSHFLHV VLOYHVWUHV Para evaluar el riesgo de escape de genes desde los cultivos a las poblaciones silvestres emparentadas, se plantean dos preguntas: La planta cultivada transgnica convive con la
especie silvestre emparentada? Esa variedad es sexualmente compatible con sus parientes silvestres? Todas las especies utilizadas para cultivo son derivadas de una o ms especies silvestres. Estos cultivos son sembrados en su mayora lindantes con sus parientes silvestres compatibles Para reducir el riesgo de hibridacin cultivo-silvestre se debera restringir el cultivo transgnico a determinadas reas donde no se encuentren los parientes silvestres. Por ejemplo, las poblaciones silvestres de maz y soja no son nativas ni se encuentran en Argentina, por lo tanto los transgenes provenientes de estos cultivos no pueden transferirse a poblaciones silvestres. En cambio, colza, arroz y girasol conviven con sus parientes silvestres y pueden cruzarse con ellos. El primer paso conVLVWH HQ HO HVWXGLR VLVWHPiWLFR GH OD RUD ORFDO De todos modos, restringir los cultivos transgnicos a determinadas reas fuera del rango de ocurrencia de sus parientes silvestres slo demorar el movimiento de transgenes. La hibridacin del cultivo con especies silYHVWUHV HPSDUHQWDGDV GHSHQGHUi GH OD DQLdad gentica que tengan entre ellos, la cual determinar desde fertilidad completa o parcial hasta imposibilidad de cruzamiento. Para que la cruza tenga lugar, ambos taxa GHEHQ RUHcer al mismo tiempo y el polen debe ser capaz de germinar y efectuar la fecundacin. La descendencia suele tener una fertilidad menor que las especies parentales, pero raramente es por completo estril. La fertilidad parcial de los hbridos permite la introgresin, la incorporacin estable de genes de una especie en otra mediante sucesivas retrocruzas de sus descendientes con una o ambas especies parentales. La fertilidad de los hbridos cultivo-silvestre vara drsticamente, aunque suele ser restaurada en las siguientes generaciones. Caracteres morfolgicos y fenolgicos intermedios entre la especie cultivada y la silvestre constituyen un buen diagnstico de hibridacin e introgresin, pero el estudio de marcadores moleculares resulta invalorable. Este ha demostrado que la mayor parte de los cultivos hibrida con sus parientes y que los alelos de las especies domesticadas persisten durante generaciones en las poblaciones silvestres, an cuando no se adviertan cambios morfolgicos. Este es el caso
del girasol cultivado con Helianthus annuus silvestre y H. petiolaris en Amrica del Norte. En Argentina, donde ambas especies silvestres se han naturalizado, hemos encontrado numerosas evidencias de hibridacin e introgresin con el cultivo en la regin central del pas, tanto por caracteres morfolgicos y fenolgicos como por marcadores moleculares, constatando adems la fertilidad parcial de los hbridos mediante estudios del polen y de la produccin GH VHPLOODV (O XMR JpQLFR D WUDYpV GHO SROHQ es una poderosa fuerza evolutiva y el impacto sobre las poblaciones silvestres depende de su magnitud, as como del efecto de los alelos transmitidos sobre la poblacin recipiente. /D PDJQLWXG GHO XMR PHGLDGR SRU SROHQ SXHde medirse a travs de la frecuencia de marcadores moleculares caractersticos del cultivo presentes en una poblacin silvestre o sus descendientes. Estos han demostrado que la ubicacin de un gen en el genoma tiene una importancia crucial para su difusin mediante hibridacin. En colza, un aloploide (AACC), la introgresin de tolerancia a herbicidas y androesterilidad hacia la especie diploide Brassica rapa (AA) sera menos probable si los transJHQHV TXH FRGLFDQ HVRV UDVJRV HVWXYLHUDQ HQ el genoma C, porque implicara una recombinacin intergenmica. En girasol, Helianthus annuus donde ha ocurrido una extensa remodelacin cromosmica mediante inversiones y translocaciones, la transferencia de un transgn hacia la especie silvestre H. petiolaris es improbable si ste no est situado en las porciones colineares entre ambos genomas. Se estn evaluando mtodos para reducir la probabilidad de introgresin, como por ejemplo, ubicar los transgenes dentro de cromosomas o segmentos cromosmicos que tengan menor probabilidad de ser transferidos a las poblaciones silvestres. Otra alternativa es colocar el transgn muy cercano a algn gen de GRPHVWLFDFLyQ TXH FRQHUD XQD PHQRU DSWLWXG en las poblaciones silvestres y el uso de tecnologas de restriccin para controlar la viabilidad o fertilidad de la progenie hbrida. /D FXDQWLFDFLyQ GH OD WDVD GH KLEULGDFLyQ e introgresin entre el cultivo y la especie silvestre mediante experimentos adecuados es previa a la investigacin de las consecuencias gnicas y ecolgicas del escape del transgn,
ya que si la tasa de hibridacin fuera despreciable, no cabra preocuparse por las consecuencias. E (IHFWR GHO WUDQVJpQ VREUH OD DSWLWXG ELROyJLFD GH ODV SODQWDV VLOYHVWUHV Una vez comprobada la posibilidad de hibridacin y la presencia de un transgn en plantas silvestres, surge la pregunta: Se espera que el transgn incremente su frecuencia en las poblaciones silvestres? El destino de un alelo en una poblacin depender de su efecto sobre la aptitud biolgica de los individuos que lo adquieren. La aptitud biolgica o valor DGDSWDWLYR HV XQD PHGLGD UHODWLYD GH OD HFDFLD reproductiva de un genotipo cuando se lo compara con otro genotipo. Sus componentes son la supervivencia y la fecundidad, que pueden resultar afectados en distintas fases del ciclo vital: germinacin, establecimiento de plntula, RUDFLyQ IRUPDFLyQ GH SROHQ \ VHPLOOD Si el alelo no tiene efecto alguno en el ambiente ecolgico, se trata de un alelo neutro y su destino depender del azar, o sea que su frecuencia en la poblacin estar sujeta a la deriva gnica y persistir o eventualmente se SHUGHUi 6L HO DOHOR HV EHQHFLRVR HO XMR Jpnico acelerar su diseminacin en la poblacin silvestre y la frecuencia allica aumentar rpidamente, en forma proporcional al movimiento de polen desde el cultivo a la poblacin silvestre. Si su efecto es deletreo conducir a una depresin alogmica, con disminucin de la viabilidad y fertilidad de los hbridos. El efecto nuevamente depender de la magnitud del XMR JpQLFR \ FXDQWR PD\RU VHD PD\RU VHUi el riesgo de extincin de la poblacin silvestre. La diseminacin de un transgn en la poblacin silvestre requiere que los hbridos cultivosilvestre se reproduzcan en condiciones naturales. Estudios previos de hibridacin entre cultivos no transgnicos de colza, sorgo, girasol, rbano, poroto y trigo y sus parientes silvestres han demostrado que no slo lo hacen, sino que su aptitud biolgica puede ser incluso mayor que la de sus progenitores silvestres. En uno de los primeros estudios de transmisin de un transgn a poblaciones silvestres, se encontr una baja frecuencia de plantas hbridas de Brassica rapa portadoras de un transgn de
colza considerado neutral y se concluy que el riesgo de transmisin era bajo. Diez aos desSXpV VH FRQUPy OD SHUVLVWHQFLD GH WUDQVJHQHV de resistencia a herbicida en poblaciones de B. rapa durante seis aos consecutivos. Los hbridos entre calabaza GM y zapallo silvestre UHVXOWDURQ OR VXFLHQWHPHQWH YLJRURVRV FRPR para permitir la rpida introgresin de transJHQHV QHXWUDOHV \ EHQHFLRVRV HQ ODV SREODciones silvestres. En girasol, un transgn que FRQHUH UHVLVWHQFLD D OHSLGySWHURV PHGLDQWH OD produccin de la protena Bt Cry1Ac, aument considerablemente la fecundidad de las plantas silvestres recipientes, aunque este efecto vari entre localidades y aos. De acuerdo a estas observaciones, podra esperarse que el gen Bt aumente la aptitud biolgica de girasoles silvestres e incremente rpidamente su frecuencia en las poblaciones naturales, debido a que reduce el dao producido por varias especies de insectos herbvoros. Sin embargo, el transgn OxOx, TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD DO KRQJR Sclerotinia, QR DXPHQWy VLJQLFDWLYDPHQWH OD IHFXQGLGDG GH plantas de girasol silvestre, sugiriendo que su diseminacin sera prcticamente neutral luego de un escape hacia poblaciones naturales. En Brassica rapa un transgn Bt adquirido por cruzamiento con colza transgnica disminuy su agresividad como maleza en un 20% comparado con B. rapa no GM. Estos son ejemplos contrastantes de los efectos de transgenes sobre la aptitud y comportamiento ecolgico de poblaciones silvestres. &yPR HVWLPDU ORV FRVWRV \ EHQHFLRV GH XQ transgn para la aptitud biolgica de una especie silvestre? En este caso, los genotipos a comparar son el que ha adquirido el transgn por hibridacin con el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el genotipo silvestre de la poEODFLyQ HQ DXVHQFLD GH XMR JpQLFR GHO FXOWLvo. En general, las poblaciones silvestres son menos susceptibles a patgenos y plagas que sus parientes cultivados. Mayor diversidad genotpica, menor densidad de plantas y ausencia de laboreo son algunas de las causas de esa diferencia. Por ello, un transgn que conHUH UHVLVWHQFLD D XQD SODJD R SDWyJHQR SXHGH no representar para la especie silvestre una ventaja tan grande como para el cultivo. Por HO FRQWUDULR SXHGH VLJQLFDU XQ FRVWR SDUD OD
planta que lo adquiera debido a efectos pleiotrpicos sobre otros caracteres fenotpicos que D VX YH] DIHFWHQ OD DSWLWXG (O EHQHFLR GH XQ transgn asociado a la resistencia a determinada plaga debe ser evaluado comparando la aptitud biolgica de plantas con y sin el transgn que hayan sido expuestas a esa plaga. Por el contrario, el costo de adquirir el transgn debe ser medido comparando la aptitud biolgica de plantas que lo llevan o no, en ausencia de la plaga. Hbridos transgnicos entre B. rapa y B. napus que contienen el transgn Bt han demostrado una mayor aptitud en presencia de herbvoros, mientras que su aptitud disminua en ausencia de los mismos comparado con B. rapa GHPRVWUDQGR XQ FRVWR VLROyJLFR del transgn. Adems, los caracteres que determinan supervivencia y fecundidad pueden ser afectados por las condiciones ambientales, por lo que es necesario estimarlos en distintos ambientes y a lo largo de varias estaciones de crecimiento. (V HO HTXLOLEULR GH ORV FRVWRV \ EHQHFLRV HO que determina el impacto total de un transgn en trminos de aptitud. En el caso de resistencia a herbicidas, el valor positivo del rasgo ser restringido a los hbitats en el agroecosistema en donde se aplica el herbicida. Esto demuestra la importancia de conducir estudios de riesgo en hbridos transgnicos bajo condiciones realistas de agricultura y ecologa ya que cualquier costo de llevar transgenes puede ser evidente solamente bajo ciertas condiciones. c. Consecuencias ecolgicas de la GLIXVLyQ GHO WUDQVJpQ HQ OD SREODFLyQ VLOYHVWUH Finalmente, si el transgn aumenta la aptitud de las poblaciones silvestres se espera que aumente su frecuencia por seleccin natural. La siguiente pregunta es: Cules son las consecuencias ecolgicas del escape del transgn en una poblacin silvestre? El impacto ambiental depender no slo de la frecuencia, sino del cambio en las interacciones biticas y abiticas de ese genotipo silvestre en su ambiente. La prediccin de las consecuencias de un escape de transgenes requiere del estudio de la alteracin de las interacciones ecolgicas existentes entre las especies. Un gen de resistencia a in-
VHFWRV R D HQIHUPHGDGHV PRGLFDUi OD KHUELvora o la relacin husped-patgeno entre la especie silvestre y otras especies de su hbitat, as como un transgn que favorezca el creFLPLHQWR PRGLFDUi ODV UHODFLRQHV GH FRPSHWHQFLD LQWUD H LQWHUHVSHFtFDV &XDQWR PiV VH conozca acerca de la dinmica poblacional de una especie, ms fcilmente se podr evaluar el impacto ambiental. En Cucurbita pepo, hbridos entre un cultivar GM y plantas silvestres mostraron amplias variaciones en fecundidad entre aos y localidades que fueron atribuidas a condiciones de suelo y clima, densidad de herbvoros, competencia con malezas, enfermedades y otros factores ambientales. El crecimiento poblacional a travs de la produccin de semilla es una limitante para especies anuales, por ello caracteres que aumenten la produccin o germinacin de semilla tienen un gran efecto ecolgico. Resultados preliminares en poblaciones experimentales de girasol silvesWUH VRPHWLGDV D XMR JpQLFR GH XQ FXOWLYR *0 (Bt) indicaron que el aumento de la produccin de semilla determin mayor nmero de plntulas, mayor supervivencia hasta la edad reproGXFWLYD PD\RU Q~PHUR GH LQRUHVFHQFLDV FRQ semilla y mayor rea total de captulo al ao siguiente. El incremento en tamao y nmero de las poblaciones silvestres de una especie afectar a otras especies vegetales del hbitat, cuya frecuencia relativa podra disminuir. Uno de los riesgos asociados al escape de un transgn Bt de resistencia a insectos en una poblacin silvestre es el potencial efecto adverso sobre especies no-blanco (aquellas que no reducen la produccin del cultivo) algunas de las cuales pueden ser especialistas, alimentndose con exclusividad de la especie silvestre receptora. Como ejemplo, se pueden citar especies de artrpodos que cumplen importantes funciones como controladores biolgicos, polinizadores y descomponedores. Las toxinas Bt VRQ DOWDPHQWH HVSHFtFDV SDUD GHWHUPLQDGRV tipos de herbvoros (lepidpteros, colepteros, dpteros) y la disminucin de uno de ellos puede alterar las relaciones de competencia con los dems. Las relaciones ecolgicas entre herbvoros suelen implicar un delicado equiliEULR GHPRJUiFR FX\R FRODSVR SRGUtD FRQWULbuir a mayores niveles de infestacin y dao.
El uso comercial de cultivos Bt ejerce una presin selectiva que podra favorecer la seleccin de insectos resistentes a las toxinas. La descendencia podra heredar los genes de resistencia y en unos pocos aos, la biotecnologa desarrollada para el control de insectos se volvera inefectiva. Para evitar esta situacin se ha ideado la estrategia del cultivo refugio, que consiste en sembrar una franja de variedad no transgnica junto a la variedad Bt. Los insectos se reproducen libremente en esa franja, de modo que los raros portadores de resistencia se mantendrn en una frecuencia relativamente baja en la poblacin total de insectos. Esta estrategia se detalla en el captulo 5. En cultivos de algodn y maz el sistema de refugios es efectivo y ayuda a retrasar la resistencia en LQVHFWRV /D SpUGLGD GH OD HFDFLD %W HV DFWXDOmente uno de los mayores riesgos ambientales derivados del uso de biotecnologa agrcola. El primer caso de insectos Bt-resistentes seleccionado en laboratorio se encontr en una poblacin de Plodia interpunctella. Sin embargo, la situacin en el campo es muy diferente. Hasta la fecha, las nicas poblaciones naturales que han desarrollado resistencia a Bt han sido poblaciones de Plutella xylostella (L.) en plantas de berro en Hawai. La transgnesis tambin puede tener efectos inesperados en los cultivos. El contenido de lignina del maz Bt es perceptiblemente ms alto que el de maz no-Bt. Un cambio en el contenido de lignina pude afectar la accin de herbvoros y tener consecuencias ecolgicas. Conclusiones El estudio de impacto ambiental precede a la liberacin de cualquier nuevo evento de transformacin en plantas para tener resultaGRV FRQDEOHV HQ HO DPELHQWH GH OD OLEHUDFLyQ La mayor parte de los efectos no deseados del escape de un transgn pueden evitarse meGLDQWH DFFLRQHV SODQLFDGDV DQWLFLSDGDPHQWH manejo del cultivo, bancos de germoplasma, cultivos refugio, etc. Sin embargo, la difusin de un transgn hacia poblaciones silvestres emparentadas es difcil de evitar debido a que el polen de los cultivos puede alcanzar grandes distancias. Los cultivos GM ya se utilizan en gran escala, por lo que es necesario evaluar
cuidadosamente el riesgo de escape de transgenes para cada uno de ellos. Esa evaluacin, realizada por equipos multidisciplinarios, debera considerar los siguientes aspectos: a) Presencia de especies silvestres sexualmente compatibles con el cultivo y la probabilidad de que el transgn difunda en ellas. b) Cambios en las caractersticas de poblaciones de patgenos, insectos y malezas relacionadas con el cultivo GM y medidas para evitar o retardar la aparicin de biotipos resistentes. c) Cambios en la dinmica de poblaciones de otras especies vegetales y animales que comparten el hbitat (polinizadores, parsitos y predadores, PLFURRUD \ IDXQD GHO VXHOR Lecturas recomendadas
$GDP ' 7UDQVJHQLF FURS WULDO
V JHQH RZ turns weeds into wimps. Nature 421:462. Ahl Goy P, Duesing JH. 1996. Assessing the environmental impact of gene transfer to wild relatives. Biotechnology 14: 39-40. Burke JM, Rieseberg LH. 2003. Fitness effects of WUDQVJHQLF GLVHDVH UHVLVWDQFH LQ VXQRZHUV Science 300: 1250. Clark A. 2006. Environmental risks of genetic engineering. Euphytica 148: 4760 Craig W, Tepfer M, Degrassi G, Ripandelli D. 2008. An overview of general features of risk DVVHVVPHQWV RI JHQHWLFDOO\ PRGLHG FURSV Euphytica DOI 10.1007/s10681-007-9643-8. Ellstrand NC. 2003. Dangerous Liasons? When cultivated plants mate with their wild relatives. The Johns Hopkins University Press, Baltimore and London. Engels JMM, Ebert AW, Thormann I, de Vicente MC. 2006. Centres of crop diversity and/or origin, JHQHWLFDOO\ PRGLHG FURSV DQG LPSOLFDWLRQV IRU plant genetic resources conservation. Genetic Resources and Crop Evolution 53:16751688. Hails RS, Morley K. 2005. Genes invading new populations: a risk assessment perspective. Trends in Ecology and Evolution 20: 245-252. Hills MJ, Hall L, Arnison PG, Good AG. 2007. Genetic use restriction technologies (GURTs): strategies to impede transgene movement. Trends in Plant Science 12: 177-183. McGaughey WH. 1985. Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis. Science 229: 193195.
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VI. CAPTULO 4 Deteccin de OGM en la Cadena Agroalimentaria

Florencia Longo; Ana Vicario
Introduccin En el ao 1996 se aprob para su comercializacin en Argentina la primera variedad vegetal mejorada que llevaba una caracterstica transgnica. Se trat de una variedad de soja con tolerancia a un herbicida. A partir de ese momento y hasta la actualidad Argentina ha aprobado 10 eventos transgnicos ms: 9 en maz y 2 en algodn. A grandes rasgos, una planta genticamente PRGLFDGD HV DTXHOOD D FX\R JHQRPD VH KDQ incorporado uno o ms transgenes mediante alguna de las tcnicas de ingeniera gentica. Estos transgenes poseen una secuencia QXFOHRWtGLFD HVSHFtFD \ DOJXQRV GH HOORV VH expresan generando una protena nueva en el organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fenotipo, o caracterstica especial a la planta. 6HJ~Q OD GHQLFLyQ GH OD &RPLVLyQ 1DFLRQDO Asesora de Biotecnologa Agropecuaria (CO1$%,$ XQ RUJDQLVPR JHQpWLFDPHQWH PRGLcado (OGM), es un organismo al cual se le ha introducido, en forma deliberada y controlada, DOJXQD PRGLFDFLyQ HQ VX PDWHULDO JHQpWLFR haciendo uso de las tcnicas modernas de bioORJtD PROHFXODU (VWD PRGLFDFLyQ FRQVLVWH HQ incorporar informacin para conseguir que el organismo adquiera una determinada caracteUtVWLFD TXH DQWHV QR SRVHtD 6H GHQRPLQD HQtonces HYHQWR WUDQVJpQLFR a un OGM caracWHUL]DGR SRU XQ VHJPHQWR HVSHFtFR GH $'1 QXHYR TXH VH KD LQVHUWDGR GH PDQHUD GHQLGD \ FRQWURODGD HQ HO JHQRPD RULJLQDO Mundialmente existen otros eventos aprobados por distintos pases, en otras especies como colza, alfalfa, papaya y tomate, entre otros (www.ISAAA.org). Segn datos de la International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), en el ao 2007 existan 23 pases que cultivan semillas transgnicas, siendo los ocho principales Estados
Unidos, Argentina, Brasil, Canad, India, China, Paraguay y Sudfrica. Dentro de los pases de la Unin Europea se encuentran Francia, Espaa y Polonia quienes cultivan semillas con algunos de los eventos existentes. En total suman 114,3 millones de hectreas OGMs para sembradas con la campaa 2007/2008. La aplicacin de la biotecnologa moderna en la cadena de produccin de los alimentos ha generado grandes controversias en todo el mundo. Esto ha provocado que muchos pases, especialmente los de la Unin Europea, impongan restricciones al ingreso de productos TXH FRQWHQJDQ RUJDQLVPRV PRGLFDGRV JHQpticamente. As se han generado normativas que regulan las transacciones internacionales de estos productos, como el Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnologa del Convenio sobre la Diversidad Biolgica. Este protocolo establece un sistema regulatorio para el intercambio y manejo de los orgaQLVPRV YLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV FRQ especial nfasis en su movimiento transfronterizo. Esto requiere de entrenamiento especializado tanto en tcnicas de laboratorio como de gestin de la produccin y de la armonizacin internacional de estos mtodos. Aunque las normas de etiquetado y comerFLDOL]DFLyQ GH JUDQRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV *0 \ VXV GHULYDGRV GLHUHQ GH XQ SDtV D otro, en todos los casos se requiere de metodologas capaces de detectar niveles muy bajos de protenas, cido desoxiribonucleico (ADN), semillas o granos GM, stos ltimos, con distinto grado de procesamiento industrial, y para los cuales se puede solicitar determinar tanto la presencia de estructuras comunes a cualquier HYHQWR OR TXH VH GHQRPLQD VFUHHQLQJ FRPR OD GH HYHQWRV SDUWLFXODUHV \ VX FXDQWLFDFLyQ Como se mencion anteriormente, la secuencia que se introduce en un OGM puede dar origen a una protena y sta, a su vez, a un determinado fenotipo. Es por eso, que para determinar la presencia de organismos transgnicos en una muestra o lote de un determiQDGR SURGXFWR VH SRGUi YHULFDU OD SUHVHQFLD de determinadas secuencias de ADN, de proWHtQDV R GH FDUDFWHUtVWLFDV VLROyJLFDV GH ODV plantas. Estas determinaciones podrn ser de tipo cualitativa o cuantitativas, dependiendo del mtodo analtico se que utilice.
A continuacin se detallan los mtodos y enfoques de anlisis ms utilizados. Asimismo, se enuncian algunas consideraciones generales al momento de llevar adelante los ensayos y la estructura fsica que se recomienda que dispongan los laboratorios que realizan este tipo de ensayos. Finalmente se hace una revisin de las normas internacionales que existen en la materia. (VWUDWHJLDV GH DQiOLVLV (QVD\RV FXDOLWDWLYRV /RV HQVD\RV FXDOLWDWLYRV VH UHHUHQ D DTXHllos que dan una respuesta positiva o negativa respecto de la presencia de un analito. Es decir, en el caso de los transgnicos, aquellos que determinan presencia o ausencia de una secuencia de ADN, de protena o fenotipo debido al transgn. Un ensayo tpicamente cualitativo es el bioensayo, pero tambin lo es una PCR (Polymerase Chain Reaction) en tiempo QDO XQ DQiOLVLV GH SURWHtQDV XWLOL]DQGR WLUDV reactivas o un ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) cualitativo. (QVD\RV VHPLFXDQWLWDWLYRV VXEPXHVWUHR Estos ensayos implican el anlisis de una determinada cantidad de sub-muestras de anlisis (grupos o pooles 3DUD FDGD VXE muestra, la presencia o ausencia de un determinado analito, se determina de manera cualitativa. La estrategia radica en el anlisis de una determinada cantidad de grupos (N) de tamao conocido de semillas o granos (m) y la estimacin estadstica (siguiendo una distribucin binomial o de poisson) del porcentaje de analito presente en la muestra. Existen planillas de clculo con ayuda de las cuales se puede decidir sobre el nmero de semillas o granos a utilizar y el tamao y cantidad de grupos, segn XQ SRUFHQWDMH GH FRQDQ]D HVWDEOHFLGR SDUD OD prueba y un lmite mximo de OGM aceptado para la muestra o lote en estudio (Programa estadstico SeedCalc v8). Esta estrategia puede llevarse a cabo utili]DQGR WDQWR XQD 3&5 HQ WLHPSR QDO FRPR HQsayos para determinacin de protenas (ensayo inmunolgico del tipo ELISA en placa o tiras
reactivas), teniendo en cuenta que el tamao de los grupos de anlisis no debe ser mayor a la sensibilidad del mtodo utilizado (es decir, si el mtodo es capaz de detectar una semilla transgnica en 500 semillas, los grupos de anlisis no deben ser mayores a 500 semillas). (QVD\RV FXDQWLWDWLYRV /RV HQVD\RV FXDQWLWDWLYRV VH UHHUHQ D OD determinacin del porcentaje de OGM en una PXHVWUD R ORWH (VWD FXDQWLFDFLyQ HV SRVLEOH debido a la metodologa empleada y no debido a una estimacin estadstica, como en el caso del sub-muestreo. La tcnica cuantitativa por excelencia, ampliamente utilizada en las transacciones comerciales, es la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa. Mtodos de Deteccin Bioensayos Este mtodo cualitativo consiste en la evaOXDFLyQ GH OD UHVSXHVWD VLROyJLFD GH PDQHUD de determinar la presencia del transgn buscado, como por ejemplo la tolerancia a un herbicida. En el caso de plantas tolerantes a un herbicida, el ensayo consiste en poner a germinar las semillas y evaluar la emergencia de plntulas normales bajo el efecto del herbicida. El porcentaje de plntulas tolerantes se determina contando a aquellas normales sobre las semillas totales. Paralelamente a este ensayo debe realizarse el ensayo control, que consiste en la prueba de germinacin sin el herbicida, de manera de determinar el poder germinativo de la muestra. La evaluacin de la resistencia a insectos se realiza mediante ensayos biolgicos complejos y de larga duracin, y es por eso que los bioensayos no son una alternativa prctica para dicha caracterstica. El bioensayo para tolerancia a herbicida requiere aproximadamente una semana para completarse, o el tiempo que tome lograr obtener una plntula para la especie en estudio. La cantidad de semillas a evaluar se determina VHJ~Q HO SRUFHQWDMH GH FRQDQ]D FRQ HO TXH VH desee realizar la prueba y en funcin del lmite mximo de OGM aceptado para la muestra o lote (www.seedtest.org).
'HWHUPLQDFLyQ GH SURWHtQDV Las protenas producto de la expresin de un transgn pueden determinarse utilizando una reaccin inmunolgica de tipo protena GM-anticuerpo que es posible realizar tanto en placa (ELISA), como sobre un soporte de nitrocelulosa (tiras reactivas o inmunostrips). Bsicamente estos ensayos consisten en la deteccin de la sustancia de inters (la protena) mediante la formacin de un complejo antgeno-anticuerpo que luego es detectado mediante un compleMR HQ]LPiWLFR TXH VH XQH HVSHFtFDPHQWH DO complejo anterior permitiendo su visualizacin. Es aconsejable que se realicen sobre semillas/ JUDQR X RWUR PDWHULDO YHJHWDO MRYHQ \D TXH las protenas se degradan con facilidad, y es por eso tambin que no se recomienda su uso para casos de alimentos procesados. El nivel de expresin de las protenas vara segn el tejido del que se trate, desde niveles muy altos hasta trazas casi imperceptibles. Es por eso que se recomienda, adems de seguir HQ HO FDVR GH XWLOL]DU ORV NLWV FRPHUFLDOHV las instrucciones del fabricante, contar con los correspondientes controles de los ensayos. Utilizando esta metodologa se pueden obtener resultados en unas pocas horas. Segn el evento transgnico del que se trate, los niveles de protenas varan en los distintos tejidos de la planta. Pueden ser mucho ms altos en hojas o races y prcticamente nulos en granos y por lo tanto es bueno considerarlo antes de tomar decisiones sobre los ensayos a realizar. Para obtener ms informacin sobre tejidos de expresin de protenas transgnicas se puede consultar el sitio AGBIOS (http://www.agbios. com). Asimismo, hay que considerar que distintos eventos trangnicos han incorporado las mismas protenas por lo que no es posible, en estos casos, determinar de qu evento se trata si el resultado es positivo. Este tipo de anlisis solo tiene utilidad cuando se lo realiza sobre muestras o tejidos que expresan la protena GM y en productos sin procesamiento como hojas, granos y los primeros productos de la molienda, pero no en alimentos donde las protenas se desnaturalizan por completo y pierden sus propiedades inmunolgicas. Por otra parte, la deteccin de
la protena GM depende de que sta se exprese en el tejido de anlisis. Puede ocurrir que no sea posible generar un anticuerpo para detectar la protena introducida debido a que es muy similar a protenas propias de la planta original y por lo tanto no se pude obtener un anticuerpo que detecte a la protena introducida sin detectar tambin la ya presente en la planta, lo que se denomina reaccin cruzada. La determinacin de protenas es un ensayo de tipo cualitativo, aunque en el caso de ELISA en placa, es posible ajustarlo de manera tal de poder realizar una determinacin cuantitativa. En el caso que se realicen ensayos utilizando una estrategia de sub-muestreo, debe tenerse en cuenta el nivel de sensibilidad del ensayo (tanto en ELISA como en tiras reactivas). La cantidad de semillas o granos a evaluar as como la cantidad de grupos y su tamao, se GHWHUPLQD VHJ~Q HO SRUFHQWDMH GH FRQDQ]D con el que se desee realizar la prueba y en funcin del lmite mximo de OGM aceptado para la muestra o lote (www.seedtest.org). Este tipo de determinacin es sencilla de realizar y no necesita alta capacitacin del persoQDO QL PDWHULDOHV R HTXLSRV VRVWLFDGRV (QWUH los inconvenientes que presenta se encuentran TXH QR SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ HQWUH FXOWLYRV distintos que presentan la misma protena GM (ya sea en cuanto a especie o con relacin a la construccin introducida). Sumado a ello, es preciso aclarar que su utilizacin para la cuanWLFDFLyQ SXHGH FRQGXFLU D HUURUHV GHELGR D ODV diferencias en los niveles de expresin de la protena GM por el origen del tejido, su variacin con la edad de la planta o por el efecto de las condiciones ambientales en las cuales se desarrolla. Existe una gran diversidad de anticuerpos para distintas protenas provenientes de un transgn. Se puede obtener ms informacin visitando las pginas web de distintos proveedores. Determinacin de secuencias transgnicas La determinacin de secuencias de ADN, molcula que lleva la informacin gentica de un organismo, es uno de los ensayos ms utilizados para estudiar la presencia de un tran-
gn. Este anlisis se lleva a cabo mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa, o PCR en sus siglas en ingls. Esta reaccin imita lo que ocurre naturalmente al momento de duplicarse la carga gentica de una clula (duplicacin del ADN), slo que en este caso se copia un solo y relativamente pequeo fragmento de ADN de manera tal de generar miles de copias. La PCR es una reaccin qumica exponencial, es decir, a partir de un fragmento de ADN, se obtienen dos, y de esos dos, cuatro y luego ocho, etc. Esto hace TXH OXHJR GH FLFORV GH DPSOLFDFLyQ VH REtengan miles y miles de fragmentos iguales, permitiendo as la visualizacin de los mismos. Esta visualizacin puede hacerse mediante distintos procedimientos. Los ms frecuentes son en geles de agarosa, geles de poliacrilamida o sistemas cuantitativos de deteccin como en el caso de la PCR en tiempo real. /D 3&5 HV XQ SURFHVR DOWDPHQWH HVSHFtFR que permite determinar el evento transgnico que contiene una muestra, algo que no se puede lograr de manera fehaciente con los otros mtodos, como los que nos permiten evaluar XQD UHVSXHVWD VLROyJLFD R OD SUHVHQFLD GH GHWHUPLQDGDV SURWHtQDV (VWD HVSHFLFLGDG HVWi dada por los primers R FHEDGRUHV TXH VRQ SHqueos fragmentos de ADN que reconocen la VHFXHQFLD D DPSOLFDU \ VH DGKLHUHQ D HOOD OR que se conoce como annealing SHUPLWLHQGR LQLFLDU OD UHDFFLyQ GH DPSOLFDFLyQ 'LVWLQWRV primers VRQ FDSDFHV GH SHJDUVH HQ GLIHUHQtes zonas del fragmento de ADN introducido. Estas zonas son cuatro: secuencias promotoras o terminadores que suelen ser comunes a varios eventos; el gen TXH FRQHUH HO FDUiFWHU HVSHFtFR XQD UHJLyQ GHQRPLQDGD construcFLyQ HVSHFtFD TXH HV DTXHOOD TXH YLQFXOD distintos elementos del fragmento de ADN introducido, por ejemplo la regin promotora y el gen; y lo que se denomina HYHQWR HVSHFtFR que es una regin que vincula el fragmento introducido con el genoma original de la planta. El ensayo de PCR puede ser de tipo cualitativo, lo que se conoce como PCR convencional R HQ WLHPSR QDO R FXDQWLWDWLYR UHULpQGRVH a la PCR en tiempo real. En el primer caso, se puede estimar el porcentaje de un OGM en una muestra o lote siguiendo una estrategia
de sub-muestreo, como se explic ms arriba, siempre contando con los controles adecuados para el ensayo. En el caso de la PCR en tiempo real, se obtienen resultados cuantitativos, debido a que se realiza una reaccin con caractersticas especiales. La tcnica de PCR en tiempo Real resulta ser una alternativa a la PCR convencional con la que se obtienen resultados cuantitativos muy precisos del nmero de copias o la actividad transcripcional de un gen particular en un menor tiempo. La denominacin de tiempo UHDO VH GHEH D TXH HO $'1 DPSOLFDGR SXHde ser detectado en lnea durante el proceso GH 3&5 \ QR DO QDO GHO PLVPR FRPR VXFHGH con la PCR convencional. La lectura de los resultados se realiza durante la fase exponencial GH OD UHDFFLyQ JDUDQWL]DQGR DVt XQD FXDQWLcacin ms adecuada y precisa del producto DPSOLFDGR La PCR en tiempo real permite obtener una PD\RU VHQVLELOLGDG \ HVSHFLFLGDG \ UHGXFH OD posibilidad de contaminacin por presencia de productos de PCR ya que no es necesario, una vez terminada la reaccin, manipular los proGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ YHU PiV DGHODQWH ODV consideraciones generales para los ensayos). Entre las desventajas que presenta frente a la PCR convencional se puede sealar su mayor costo, tanto en el equipo como en los reactivos utilizados y la complejidad del diseo de los cebadores y sondas, que en muchos casos resulta ms exigente. La PCR en tiempo real combina el uso de un WHUPRFLFODGRU XQ XRUtPHWUR \ XQ RUGHQDGRU (O termociclador efecta la PCR en condiciones GRQGH XQ XRURFURPR H[FLWDGR SRU XQ OiVHU YD emitiendo una seal de manera proporcional a la cantidad de ADN que se va generando durante los sucesivos pasos de la reaccin. La HPLVLyQ GH OD VHxDO XRUHVFHQWH HV HQYLDGD DO OHFWRU GH XRUHVFHQFLD TXH FXDQWLFD OD VHxDO emitida. El ordenador procesa la informacin \ GHVSOLHJD GXUDQWH FDGD FLFOR GH DPSOLFDFLyQ OD XRUHVFHQFLD OHtGD HQ FDGD PXHVWUD La seal aparecer claramente a partir de un nmero determinado de ciclos, dependiendo de la concentracin de partida de la secuencia de inters, es decir, la seal es apreciable por el equipo una vez que sobrepasa el lmite infe-
rior de deteccin. A partir de se momento, la cintica de la reaccin debe permitir la acumulacin de la seal de manera exponencial en el WLHPSR /D VHxDO GH XRUHVFHQFLD JHQHUDGD HV directamente proporcional a la cantidad de proGXFWR GH 3&5 DPSOLFDGR ([LVWHQ DFWXDOPHQte distintas metodologas para la deteccin del SURGXFWR GH DPSOLFDFLyQ XWLOL]DQGR OD 3&5 HQ WLHPSR UHDO (OODV VRQ ODV VRQGDV XRUHVFHQtes y los agente intercalantes de ADN. Desde hace algunos aos, esta metodologa ha sido adoptada para realizar los anlisis de validez comercial. 1XHYDV PHWRGRORJtDV Cada vez son ms los eventos transgnicos aprobados para su comercializacin. Anteriormente, utilizando primers SDUD OD DPSOLFDcin de la secuencia promotora denominada 35S, o el terminador NOS, comunes a la mayora de los eventos, era posible determinar la presencia de ADN transgnico en una muestra. Si no se detectaba la presencia de alguna de esas secuencias en la muestra, se poda inferir que sta no contena el 90% de los eventos comerciales. Se prev que en el futuro, existirn gran diversidad de secuencias a determinar (debido a nuevos genes introducidos) y que, si las exigencias comerciales de etiquetado conWLQ~DQ VH UHTXHULUi GH VLVWHPDV PiV VRVWLFDdos que permitan detectar varias secuencias a la vez y de manera rpida. Existe una tecnologa, relativamente nueva, denominada de microchips o microarrays o micromatrices, que podra permitir detectar y FXDQWLFDU HQ XQ VROR HQVD\R OD SUHVHQFLD GH cientos o miles de secuencias. A grandes rasgos, una micromatriz es un pequeo soporte slido del tamao de un cubre objetos de los utilizados en microscopa ptica, en el cual se KDQ MDGR SXQWRV RUGHQDGRV \ PLFURVFySLFRV de secuencias de ADN de simple cadena conocidas. Estas secuencias tienen la capacidad de pegarse (hibridar) con un ADN que le sea complementario, y que estar marcado con XQD PROpFXOD XRUHVFHQWH 6L H[LVWHQ VHFXHQcias complementarias, ocurrir la hibridacin y el punto de la micromatriz quedar marcado. Para poder realizar la observacin de este pequeo punto, un aparato de barrido especial
UHDOL]DUi OD OHFWXUD LGHQWLFDQGR ORV SXQWRV marcados y por lo tanto las secuencias que estn presentes en la muestra bajo anlisis. La ventaja que presentan las micromatrices es que posibilita la deteccin simultnea de decenas de miles de secuencias de ADN distintas. Entre los inconvenientes que se presentan se puede sealar los costos elevados, la falta de referencias adecuadas para la validacin del mtodo, la complejidad sobre los criterios a utilizar para la interpretacin estadstica de ORV GDWRV REWHQLGRV DVt FRPR ODV GLFXOWDGHV para obtener resultados cuantitativos sensibles y reproducibles para los niveles exigidos en la actualidad para la deteccin de OGMs. Actualmente se encuentra en el mercado un sistema para deteccin simultnea de eventos transgnicos que se basa en una PCR en tiemSR QDO (V HO GHQRPLQDGR *02 'XDOFKLS TXH contiene 14 genes y 20 controles en triplicado. Para ms informacin se puede consultar www.coextra.eu/researchlive/reportage 1120. html. 9DORUDFLyQ FRPSDUDWLYD GH ORV GLVWLQWRV mtodos de anlisis Ver Tabla comparativa (tabla 1). &RQVLGHUDFLRQHV JHQHUDOHV VREUH los ensayos )DOVRV 1HJDWLYRV 6H GHQH FRPR IDOVRV QHJDWLYRV D DTXHOODV reacciones para las que NO se detecta protena o secuencia de ADN, cuando en realidad s la contienen. Estos resultados pueden darse por diversas razones: la presencia de sustancias inhibidoras de la reaccin que se est llevando a cabo; ADN o protenas degradados por diversos motivos (por ejemplo, tratamientos y tiempos excesivos previo al envo de la muestra al laboratorio, por tratamientos de preparacin de la muestra en el laboratorio); tamao de la muestra inferior al requerido para el anlisis; incorrecta eleccin del mtodo o de la estrategia de anlisis, presencia del analito a detectar por debajo del lmite de deteccin del mtodo. Para la deteccin de los falsos negativos se utilizan de manera rutinaria distintos controles
7DEOD.
Bioensayo Deteccin de protenas. Determinacin de la reaccin protena GM-anticuerpo Deteccin de secuencias de ADN Determinacin de protenas PCR tiempo final PCR tiempo real Deteccin de secuencias de ADN
Objetivo del ensayo
Deteccin de caractersticas biolgicas o de una respuesta fisiolgica Cualitativo Semillas, granos, material verde joven, races, alimentos sin procesamiento Cualitativo Semi-cuantitativo (utilizando la estrategia de sub-muestreo) ELISA en placa puede ser cuantitativo Cualitativo Semi-cuantitativo (utilizando la estrategia de sub-muestreo)
Tipo de resultado
Cuantitativo
Matriz sobre la que se puede realizar Mtodo sencillo y fcil de llevar a cabo. Permite la deteccin in situ. No necesita material ni instalaciones sofisticadas. Preciso, exacto y rpido. Semillas, granos, tejidos, alimentos con y sin procesamiento Mtodo sensible, exacto y especfico. Permite la identificacin especfica de eventos. Utilizacin sobre cualquier tipo de matriz sin importar grado de procesamiento
Semillas, granos, plntulas
Semillas, granos, tejidos, alimentos con y sin procesamiento Mtodo sensible, exacto y especfico. Permite la identificacin y cuantificacin especifica de eventos. Utilizacin sobre cualquier tipo de matriz sin importar grado de procesamiento. Mtodo rpido Cuantificacin compleja si no se definen adecuadamente el muestreo, la estrategia de deteccin y los materiales de referencia. Mayor costo en equipos y reactivos
Ventajas
Para tolerancia a herbicidas (TH): Mtodo sencillo, preciso y econmico

Necesita una buena expresin de la protena en la matriz de anlisis. Debe conservarse intacta la estructura proteica a detectar. No permite la identificacin entre eventos GM distintos que expresen la misma protena. Problemas para la cuantificacin directa (ELISA en placa). No permite la identificacin de protenas similares entre la protena GM y la convencional Preparacin sencilla Requiere de pasos previos para la extraccin de protenas. En general son procedimientos sencillos Horas Deteccin compleja si no se definen adecuadamente el muestreo, la estrategia de deteccin y los materiales de referencia. Mayor posibilidad de contaminacin. Mayor costo en equipos y reactivos. Requiere de pasos previos para la extraccin de ADN. En general son procedimientos de mayor complejidad. Das (2 a 3 das) Das (1 a 2 das) Requiere manejo mnimo de la tcnica. Requiere mayor capacitacin en el caso de ELISA en placa. Laboratorio con instalaciones bsicas. Puede realizarse in situ (tiras reactivas) y laboratorios bsicos de inmunologia (ELISA en placa) Determinacin de pureza del carcter y presencia adventicia por parte de organismos de control y/o la industria semillera. Capacitacin en tcnicas de biologa molecular Laboratorio de Biologa Molecular Determinacin de pureza del carcter y presencia adventicia por parte de organismos de control y/o la industria semillera. Transacciones comerciales. Transacciones comerciales en todo tipo de matriz Mtodo de screening rpido en semillas, tejidos varios y alimentos sin procesamiento Semillas o granos GM y no GM Material GM y no GM(Granos, semillas y/o tejidos). Disponibles comercialmente para algunas especies y eventos. Harinas GM, ADN y plsmidos. Disponibles comercialmente para algunas especies y eventos.
Desventajas
Demora para la lectura de los resultados (al menos una semana para TH) Para resistencia a insectos: Mtodo costoso y de dificultosa realizacin
Preparacin de la muestra
Requiere de pasos previos para la extraccin de ADN. En general son procedimientos de mayor complejidad.
Tiempo promedio para obtencin de los resultados
Dependiendo del cultivo, entre 7 y 10 das
Requiere manejo mnimo de la tcnica.
Capacitacin en tcnicas de biologa molecular Laboratorio de Biologa Molecular Por tratarse de determinaciones cuantitativas, es el mtodo de eleccin para transacciones comerciales.
Nivel de preparacin del personal Exigencia para instalaciones
Instalaciones bsicas
Aplicacin del mtodo
En general para determinacin de pureza del carcter por organismos de control o la industria semillera.
Uso habitual
En semillas (para TH) No se aplica hasta el momento para la caracterstica de resistencia a insectos
Transacciones comerciales en todo tipo de matriz donde exigen resultados cuantitativos
Material de referencia a utilizar
Harinas GM, ADN y plsmidos. Disponibles comercialmente para algunas especies y eventos.
durante el anlisis. Entre estos controles, se encuentran las muestras positivas para la caUDFWHUtVWLFD D GHWHFWDU \ FRQWUROHV HVSHFtFRV para la deteccin de sustancias inhibidoras del anlisis. )DOVRV SRVLWLYRV 6H GHQH FRPR IDOVRV SRVLWLYRV D DTXHOODV reacciones para las que se detecta protena o secuencia de ADN, cuando en realidad NO la contienen. Gran parte de este tipo de resultados no provienen de la muestra original, sino que se deben a la contaminacin de la misma por errores de manipuleo. La contaminacin puede darse a lo largo de todo el proceso de anlisis. Esta puede ser previa al envo de la misma al laboratorio as como dentro del laboratorio, ya sea durante la preparacin de la misma para el anlisis como en el momento GH VX GHWHFFLyQ HVSHFtFD /D WpFQLFD GH 3&5 HV PX\ VHQVLEOH SRU OR WDQWR QLYHOHV tQPRV de contaminacin con ADN en una muestra pueden generar un resultado positivo falso. La DPSOLFDFLyQ UHSHWLGD GHO PLVPR IUDJPHQWR GH ADN (amplicn) va generando cientos de miles de millones de copias dentro del mismo laboratorio y estas copias pueden contaminar las nuevas muestras y los reactivos si no se tienen cuidados especiales. Adems, restos de molienda de semillas o granos u otros tejidos vegetales de muestras previas, pueden llevar la contaminacin a nuevas muestras. Asimismo, en el caso de la PCR pueden informarse falsos positivos por eleccin de una estrategia de deteccin inadecuada. Los casos ms comunes se dan cuando se realiza la deteccin del Promotor 35S en crucferas o en alimentos que las contengan (por infeccin con el virus del 0RVDLFR GHO &ROLRU \ HQ HO FDVR GH Agrobacterium con la deteccin del Terminador NOS. Para la deteccin de los falsos positivos se utilizan de manera rutinaria controles negativos. Estos controles consisten en muestras que no contienen la caracterstica especial que cada mtodo permite detectar (secuencia de ADN, protena o directamente la matriz a analizar). Lmite de Deteccin y Lmite de &XDQWLFDFLyQ Se considera como lmite de deteccin a la mnima concentracin del analito de inters
presente en la muestra, que puede ser detectado. Este lmite vara de acuerdo al mtodo de eleccin y dentro de cada mtodo, de acuerdo al tipo de muestra analizada. (O OtPLWH GH FXDQWLFDFLyQ HV OD PHQRU FRQcentracin del analito de inters presente en la PXHVWUD GH HVWXGLR TXH SXHGH VHU FXDQWLFDGR con un aceptable nivel de exactitud y precisin. En ambos casos, depender de la matriz sobre la que se realiza el anlisis y del mtodo en s mismo. Es de suma importancia conocer estos lmites de manera de aplicar adecuadamente los mtodos. El laboratorio deber entonces validar sus metodologas mediante ensayos de validacin y en lo posible mediante pruebas de interlaboratorio. /RV PDWHULDOHV GH UHIHUHQFLD Los materiales de referencia son una herramienta fundamental para cualquier anlisis. Por un lado, permiten conocer como se comporta el mtodo con una muestra positiva y con una negativa para la caracterstica a detectar, y por otro son fundamentales para la validacin del mismo y su comparacin con otros laboratorios. Comercialmente se encuentran materiaOHV GH UHIHUHQFLD GLVSRQLEOHV \ FRQDEOHV SDUD distintos eventos y concentraciones. Los ms utilizados y difundidos son las harinas o granos GM, las secuencias de ADN y los plsmidos. En la actualidad no existe un nico material de referencia que pueda aplicarse para la deWHFFLyQ \R FXDQWLFDFLyQ GH WRGRV ORV SURGXFtos a ser analizados. Ello conduce a que, cuando estn disponibles, stos deben ser elegidos y utilizados de acuerdo al tipo de matriz que se quiere analizar. No siempre es sencillo establecer cul es el mejor material de referencia a ser utilizado como control positivo, sobre todo para HIHFWRV GH FXDQWLFDFLyQ \D TXH HO Q~PHUR GH copias por genoma haploide vara para cada evento, adems de la existencia de variables propias para las matrices de cada muestra. En relacin a los controles negativos, se debe asegurar la ausencia de la caracterstica GM por debajo de cierto umbral y con un rango de tolerancia. La temtica de los materiales de referencia presenta una serie de consideraciones, complejidades, problemticas y usos que exceden
los lmites de este captulo. Es por ello que slo se hace esta mencin a los mismos. 5HGDFFLyQ GHO LQIRUPH GH UHVXOWDGRV Los resultados de cada ensayo efectuado por el laboratorio, deben ser informados en forma exacta, clara, no ambigua y objetiva. Es QHFHVDULR TXH VH HVSHFLTXHQ ORV GDWRV GHO ODboratorio que realiz el ensayo y los datos del cliente, as como tambin la descripcin del mtodo utilizado con sus respectivos lmites de GHWHFFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ FXDQGR FRUUHVSRQda. Adems, deben indicarse las condiciones y cantidad de muestra recibida en el laboratorio as como la cantidad utilizada para hacer el anlisis, los materiales de referencia utilizados y su resultado (que deben ser segn lo HVSHUDGR HO QLYHO GH FRQDQ]D GH OD SUXHED \ cualquier observacin o interpretacin que se considere necesaria. La forma correcta de presentar los resultados para anlisis de tipo cualitativo debe contener: No se detect o en el caso de dar positivo Se detect la presencia de material GM o de la secuencia XX o protena XX en la muestra al lmite de deteccin de la tcnica. Cuando corresponda, se puede informar el lote a partir del cual se tom la muestra analizada. En el caso de resultados para anlisis cuantitativos, se informar como "Menor al lmite de deteccin de la tcnica SDUD DTXHOORV UHVXOWDdos donde no se detecte el analito en estudio) y en valor numrico (porcentaje) cuando el resultado sea positivo y no supere el rango de linealidad del mtodo de laboratorio. Siempre deben quedar indicadas en el informe las unidades en las que se expresan los resultados DVt FRPR ORV OtPLWHV GH GHWHFFLyQ GH FXDQWLcacin y la incertidumbre para la matriz en estudio. En el caso de anlisis por PCR todava no existe una nica forma de expresar los resultados. Es por ello muy importante para la comprensin de los resultados que cada laboratorio indique claramente las unidades en que informan los mismos. Algunas de estas expresioQHV UHHUHQ D PDVD *0PDVD WRWDO GH OD PDWUL] VHFXHQFLDV GH $'1 *0 $'1 WRWDO HQ OD PDWUL] SRU HVSHFLH 3DUD HO FDVR GH VHPLOODV ISTA se ha manifestado al respecto (consultar www.seedtest.org).
Existen adems mltiples consideraciones, ya sean biolgicas, de muestreo o del mtodo analtico a tener en cuenta cuando se realiza la FXDQWLFDFLyQ (QWUH HOODV VHxDODPRV HO HVWDGR de ploida de la matriz bajo anlisis, el estado de cigosis, el mtodo de deteccin elegido, el muestreo utilizado y la cantidad de muestra para la realizacin del anlisis as como los materiales de referencia utilizados y la presencia de eventos apilados en la matriz bajo estudio. &RQVLGHUDFLRQHV JHQHUDOHV SDUD OD LQIUDHVWUXFWXUD EiVLFD GH ORV ODERUDWRULRV El laboratorio donde se realizan los anlisis debe ser un mbito de trabajo que permita la adecuada realizacin de los mismos. Para ello se requiere contar con instalaciones y condiciones ambientales que cumplan con los requisitos de confort y con los recursos necesarios para no poner en riesgo al personal que trabaja en el mismo ni la calidad de los anlisis realizados. El grado de complejidad de esta infraestructura depende del tipo de anlisis en cuestin. Los laboratorios con mayor grado de VRVWLFDFLyQ HQ VX LQIUDHVWUXFWXUD \ FRQGLFLRnes de trabajo son aquellos que utilizan la tcnica de PCR. Debido a la contaminacin cruzada que se puede originar, especialmente cuando se realizan ensayos por PCR, es fundamental tener mximos cuidados en el manipuleo de las muestras y de todos los materiales e instrumentos utilizados para realizar los ensayos. En este tipo de laboratorios se requiere de un mbito de trabajo especialmente diseado con cuatro reas separadas para las distintas etaSDV GHO DQiOLVLV \ FRQ XQ XMR XQLGLUHFFLRQDO de la muestra desde el ingreso (zona limpia, GRQGH QR KD\ SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ KDVta la zona donde se leer el resultado (zona "sucia"). En el primer cuarto se realiza la preparacin -y en aquellos caso que se requiera- molienda de la muestra, en el segundo se realiza la H[WUDFFLyQ \ SXULFDFLyQ HO $'1 HQ XQ WHUFHUR se prepara la reaccin de PCR y en el ltimo VH SURGXFH OD DPSOLFDFLyQ \ REVHUYDFLyQ GHO resultado en el caso de la PCR cuantitativa) y luego la electroforesis. En este ltimo paso, SDUD HO PpWRGR GH 3&5 HQ WLHPSR QDO VH DEUH
el tubo de reaccin y es donde existe mayor SRVLELOLGDG GH HVFDSH GH ORV SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ SRU OR WDQWR HV HO SXQWR GH PD\RU posibilidad de contaminacin. Es conveniente que el primer y ltimo cuarto tengan presin negativa (de manera de sacar al exterior la posible fuente de contaminacin), mientras que HQ HO GH SXULFDFLyQ \ 3&5 OD SUHVLyQ GHEH VHU positiva (permitiendo el ingreso de aire limpio). Cada cuarto debe ser limpiado regularmente con hipoclorito de sodio, en lo posible poseer un sistema de luz ultra violeta (UV) para la destruccin del ADN y contar con sus propios elementos de seguridad para el trabajo (guardapolvos, guantes, anteojos protectores), instrumentos y materiales (equipos en general, pipetas, tips). Se recomienda que slo personal autorizado para el trabajo dentro de cada rea ingrese a los laboratorios para minimizar HO WUDQVSRUWH GH SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ GH un cuarto a otro. Los organismos internacionales y la determinacin de OGM 1RUPDV ,62 La Internacional Standarization Organization (ISO en sus siglas en ingls), a travs del Working Group 7 (WG 7) se ha ocupado en los ltimos 8 aos de la redaccin de normas esSHFtFDV HQ HO WHPD (VWDV VH KDQ GHVDUUROODGR bajo el Acuerdo de Viena donde la Comisin Europea de Normas (CEN) es quien lidera el desarrollo normativo. En la actualidad 5 normas han sido publicadas bajo el Acuerdo y una (VSHFLFDFLyQ 7pFQLFD 76 TXH VyOR IXH SXEOLcada por ISO. Estas normas son: Protein Based Methods (ISO 21572 - PubliFDGD HQ 0RGLFDGD HQ HO DxR GRQde el anexo pas a ser informativo). Nucleic Acid Extraction (ISO 21571 Publicada en febrero 2005). Qualitative Nucleic Acid Based Methods (ISO 21569 - Publicada en julio 2005). Quantitative Nucleic Acid Based Methods (ISO 21570 - Publicada en noviembre 2005). *HQHUDO 5HTXLUHPHQWV DQG 'HQLWLRQV ,62 24276 - Publicada en febrero 2006). Acceptability Criteria for Methods (TS ISO 21098 - Publicada en febrero 2006). La norma que discute el tema de toma de
muestras propuesta por la CEN, fue rechazada por ISO, dado que manifest que ya contDED FRQ QRUPDV HVSHFtFDV SDUD OD WRPD GH muestra para el caso de cereales y oleaginosas. Este documento slo continu su estudio dentro de la normativa CEN. 5HJODV ,67$ La Asociacin Internacional de Anlisis en Semillas (ISTA en sus siglas en ingls) public en el ao 2006 su estrategia para la deWHUPLQDFLyQ GH VHPLOODV *0 (VSHFtFDPHQWH PDQLHVWD TXH GHELGR D TXH ODV WpFQLFDV SDUD determinacin de trangnicos son tan diversas, y que se espera que continuamente se incorporen nuevos ensayos debido a la aparicin GH QXHYRV HYHQWRV QR HV SRVLEOH MDU PHWRGologas. Es por ello, que elabora una estrategia de acreditacin de laboratorios para la detecFLyQ GH FDUDFWHUtVWLFDV HVSHFtFDV /D PLVPD se basa en el cumplimiento de una serie de requisitos tcnicos, de capacitacin, de desempeo y de la gestin por parte de los laboratorios. Ms detalles sobre los documentos referidos a este tema se pueden encontrar en www. seedtest.org. &RQVLGHUDFLRQHV QDOHV El desarrollo y aprobacin para la comercializacin de los distintos cultivos genticamente PRGLFDGRV HQ HO PXQGR KD JHQHUDGR GLYHUVDV y variadas acciones y reacciones. En el mbito del comercio mundial se han puesto en marcha distintos procedimientos, legislaciones y protocolos tendientes a conocer y regular su produccin y comercializacin. /D QHFHVLGDG GH PRQLWRUHDU LGHQWLFDU \ HQ DOJXQRV FDVRV FXDQWLFDU OD SUHVHQFLD R QR de OGMs y sus derivados ha generado el desarrollo y la implementacin de distintas herramientas analticas que permiten la deteccin de los diferentes cultivos GM y sus derivados. Asimismo, los laboratorios han debido desarrollar, adaptar y validar mtodos para poder detectar este tipo de eventos. Distintos organismos internacionales dedicados a la elaboracin de normas se han ocupado del desarrollo de diversos procedimientos con OD LQWHQFLyQ GH XQLFDU FULWHULRV SDUD OD GHWHUPLnacin de OGMs. Este desarrollo normativo se
encuentra todava en discusin, principalmente para el caso de granos y alimentos. Los princiSDOHV SXQWRV GH FRQLFWR VH UHHUHQ D OD WRPD de muestra y a la expresin de los resultados para las PCR cuantitativas. La constante aprobacin de nuevos eventos en los distintos pases plantea el desafo de la continua actualizacin y el desarrollo de nuevos mtodos y sistemas para la determinacin de OGMs en semillas granos y alimentos que se dirigen a pases con sistemas de control de OGMs Es de esperar que en el futuro las decisiones que involucren la implementacin de sistemas de control de OGMs tengan en cuenta las distintas y mltiples voces y situaciones, aun aquellas que parecen antagnicas. Para ello, ser fundamental que las decisiones polticas \ ORV IXQGDPHQWRV FLHQWtFRV WUDEDMHQ GH PDQera conjunta y coordinada. Lecturas recomendadas
&21$%,$ 'HQLFLyQ GH HYHQWRV h t t p : / / w w w. s a g p y a . m e c o n . g o v. a r / n e w / 0 - 0 / programas/biotecnologia/respuestas.php CONABIA. Eventos aprobados comerciales. h t t p : / / w w w. s a g p y a . m e c o n . g o v. a r / n e w / 0 0/programas/conabia/bioseguridad_ agropecuaria2.php#eventos ISAAA. www.ISAAA.org. http://www.isaaa.org/resources/publications/ briefs/37/executivesummary/default.html ISTA www.seedtest.org. Herramientas estadsticas para el anlisis de semillas. http://www.seedtest.org/en/content---1--1143.html ISTA www.seedtest.org. Informacin referida a anlisis de OGM. http://www.seedtest.org/en/info_platform_for_gm_ seed_content---1--1195.html. ISTA www.seedtest.org. Acreditacin de Laboratorios que realizan ensayos de determinacin de OGM. http://www.seedtest.org/en/for_specified_traits_ content---1--1184.html ISTA www.seedtest.org. Posicin respecto de las unidades de medida. h t t p : / / w w w. s e e d t e s t . o r g / e n / c l a r i f i c a t i o n _ document_+units+_content---1--1273.html Longo, F, y Castro, IG. 2006. Mtodos de Deteccin GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV (OGMs) en la Cadena Alimentaria. Conceptos bsicos para su implementacin. Buenos Aires. Editor: Juan Dellacha. 64 pginas.
Tozzini, Alejandro. 2004. Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Parte IX, Captulo 4. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. Editores Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Luis Mroginski, Buenos Aires. Ediciones INTA.
VI. CAPTULO 5 0DQHMR LQWHJUDGR GH SODJDV 3URJUDPD GH 5HIXJLRV

Viviana Confalonieri; Cecilia Roca La bioseguridad es uno de los puntos clave que debe ser abordado cuando se introducen RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0 en un ecosistema, as como la perduracin en HO WLHPSR GHO HIHFWR EHQpFR GH HVWRV 2*0 particularmente en aquellos casos en los que se han introducido genes de tipo insecticida. Los cultivos GM con propiedades insecticidas que se encuentran actualmente en el mercado, producen una protena cristalina (Cry) que proviene de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). Estas protenas son letales para los insectos susceptibles ya que al ser ingeridas degradan las paredes de su tubo digestivo. Este efecto constituye la base de la defensa contra insectos plaga de todos de los OGM comerciales que se cultivan de la actualidad, reduciendo de este modo el uso de insecticidas qumicos, OR TXH VH WUDGXFH HQ EHQHFLRV WDQWR HFRQyPLcos como para la salud y el medio ambiente. Los organismos Bt fueron cultivados por primera vez a gran escala en 1996, gracias al DYDO GH OD (QYLURQPHQWDO 3URWHFWLRQ $JHQF\ (EPA) que permiti su uso comercial. En el ao 2007, casi 42 millones de hectreas en todo el mundo presentaban estos cultivos, con una cantidad acumulativa de ms de 200 millones desde 1996. Aunque en la actualidad existe una gran diversidad de toxinas Bt, durante la primera dcada se cultivaron casi exclusivamente algodn y maces transgnicos para las toxinas Cry1Ac y Cry1Ab, respectivamente. Estas toxinas matan alguna de las ms importantes plagas de lepidpteros. El aval dado por la EPA en 1996 fue consiGHUDGR SRU PXFKRV FLHQWtFRV \ DPELHQWDOLVWDV como muy prematuro. La mayor preocupacin era que se careca de informacin sobre la forma de evitar que las especies blanco generaran resistencia al carcter introducido, ya que existan evidencias de que ste fenmeno poda ocurrir en el laboratorio. Esto implicaba
no slo un riesgo en cuanto a la efectividad de los cultivos Bt, sino que tambin en cuanto a la prdida de uno de los ms exitosos insecticidas microbianos con los que se contaba hasta ese momento. Se consider necesario entonces crear un programa de manejo integrado GH SODJDV HVSHFtFDPHQWH GLVHxDGR SDUD HO sector agropecuario, que prevenga justamente el aumento de la resistencia en las poblaciones de insectos que se quera atacar. El programa de manejo mas conocido que se aplica en la actualidad es el de alta dosis + UHIXJLR D WUDYpV GHO FXDO DOWRV QLYHOHV GH H[SUHsin de la toxina en las plantas Bt se asocian a UHIXJLRV R H[WHQVLRQHV GH FDPSR FXOWLYDGRV con plantas libres de Bt. Este programa se viene aplicando hasta ahora con relativo xito en plantas transgnicas para una nica toxina y se cree que ser necesario de aplicar tambin SDUD ORV FXOWLYRV GREOHV %W La funcin de los refugios es la de mantener alelos susceptibles en las poblaciones de insectos. Los insectos susceptibles que se desarrollan en gran nmero sobre plantas no transgnicas se cruzarn con los potenciales insectos resistentes que puedan sobrevivir en las plantas transgnicas. La progenie heterocigota que resulte de estos cruzamientos ser eliminada por las altas dosis de protena insecticida SUHVHQWH HQ ODV SODQWDV WUDQVJpQLFDV JXUD En este sentido, juega un papel importante la dosis de la toxina en las plantas Bt, ya que la dominancia funcional de los resistentes disminuye a medida que aumenta la concentracin de la toxina. Si los heterocigotos mueren en las plantas Bt, condicin que se cumple a medida que el alelo resistente se hace mas recesivo, la resistencia tardar muchas mas generaciones HQ MDUVH La teora que subyace a los programas de manejo integrado se basa fundamentalmente en modelos gentico-poblacionales. Los modelos son conjuntos de hiptesis sobre como se relacionan determinados parmetros en un VLVWHPD \ SHUPLWHQ VLPSOLFDU XQD UHDOLGDG HQ la que interactan diversos factores de manera compleja. Los parmetros que se incorporan en este caso son poblacionales, tales como las frecuencias iniciales de los alelos de resistenFLD \ ORV FRHFLHQWHV GH VHOHFFLyQ DVRFLDGRV D
neraciones. El carcter se supone que presenta cierto valor selectivo, el cual vara de acuerdo al microambiente disponible: zona con plantas Bt y zona libre de plantas Bt (refugio). Asimismo, existiran slo dos alelos para ese carcter, S o alelo de sensibilidad y R, o alelo de reVLVWHQFLD 6H GHQLUi S FRPR la frecuencia poblacional del DOHOR 5 \ T FRPR OD IUHFXHQFigura 1. RR, RS y SS genotipos homocigotos resistentes, FLD GHO DOHOR 6 heterocigotos y homocigotos sensibles a la toxina Bt, respecOtros supuestos sern que: WLYDPHQWH /DV HFKDV LQGLFDQ TXH ORV LQVHFWRV SXHGHQ FLUFX las generaciones de inlar libremente entre las regiones con plantas transgnicas Bt sectos no se superponen. y con plantas libres de Bt, o refugios. las poblaciones son de taPDxR LQQLWR el apareamiento es al azar. no existe migracin. los distintos fenotipos sensibles y resistentes. no existe mutacin. De este modo, es posible predecir bajo distin ORV FRHFLHQWHV GH VHOHFFLyQ VRQ VLPLODtas condiciones ambientales, como ser la evores en ambos sexos. lucin del carcter en cuestin y estimar valoA continuacin se deducir el cambio en la res de fundamental importancia para el sector agropecuario, como lo es el porcentaje mnimo frecuencia del alelo R luego de una generaGH VXSHUFLH OLEUH GH %W TXH VH UHTXLHUH FXOWLYDU cin de seleccin, siguiendo el modelo clsico descrito en Hartl y Clark (1989) (tabla 1). En la SDUD HYLWDU TXH HO DOHOR GH UHVLVWHQFLD VH MH El propsito de este captulo es explicar des- JHQHUDFLyQ W VH SDUWH GH JDPHWDV SRUWDGRUDV de una perspectiva gentico-poblacional los del alelo de resistencia R y gametas portadoras fundamentos de estos modelos tericos y su del alelo de sensibilidad S, en frecuencias p y q valor como herramienta predictiva en progra- respectivamente. Debido a que existe apareamas de manejo integrado de plagas. Asimismo, miento aleatorio, las frecuencias de los zigotos otro objetivo es el de describir los elementos que se formen respondern a las frecuencias tpicos que componen un plan de manejo de del equilibrio de Hardy Weinberg: p2 , 2pq y q2. resistencia de insectos y por ltimo, presentar Sin embargo, sobre esos zigotos actuar la seun panorama sobre la manera en que estos leccin natural (ejercida en este caso particular SRU ORV HIHFWRV GH OD WR[LQD %W PRGLFDQGR OD planes se aplican en Argentina. contribucin de adultos a esa generacin t + 1 de los genotipos RR, SR y SS en un factor que 0RGHORV SREODFLRQDOHV \ OD depender del valor adaptativo (W) de cada HYROXFLyQ GHO JHQ GH UHVLVWHQFLD Como se mencion previamente, los mode- uno de ellos (WRR, WSR y WSS respectivamente) ORV VRQ VLPSOLFDFLRQHV GH XQD UHDOLGDG TXH (tabla 1). Las frecuencias genotpicas relativas HV GH SRU Vt FRPSOHMD (VWDV VLPSOLFDFLRQHV se calculan dividiendo por el valor adaptativo implican supuestos que se deben cumplir si se medio de la poblacin (W M) que es igual a: TXLHUH TXH HO PRGHOR HIHFWLYDPHQWH UHHMH HVD WM = p2 W RR +2pq W SR + q2 W SS = p (p W RR realidad. En el caso particular que se trata en este captulo se trabajar con una poblacin + q W SR) + q (q W SS + p W SR) de insectos que presenta variabilidad para el Las frecuencias de las gametas de cada tipo FDUiFWHU UHVLVWHQFLD D OD WR[LQD %W \ VH DQDlizar, mediante modelos matemticos, como (p y q) en la generacin t + 1 se calculan meevolucionara ese carcter a travs de las ge- diante la frmula:
7DEOD Cambio en las frecuencias genotpicas relativas luego de una generacin de seleccin.
Generacin
Estadio del ciclo de vida Gametas Frecuencia de las gametas Genotipos Frecuencia de los genotipos (zigotos) Fitness (viabilidad) R p RR p2 W RR
Frecuencias
S q SR 2pq W SR SS q
2
t+1
W SS
Contribucin ponderada 2 2pq W SR p2 W RR q W SS (adultos) Frecuencia relativa de cada genotipo luego de p2 W RR / W M 2pq W SR / W M Q2 W SS / W M una generacin de seleccin
p= frecuencia relativa de homocigotos RR + de la frecuencia relativa de het. SR q= frecuencia relativa de homocigotos SS + de la frecuencia relativa de het. SR Reemplazando de acuerdo a la tabla 1, se obtiene: pt+1= (p2 WRR + 2pq WSR ) / WM = (p (p WRR + q WSR))/ WM qt+1= (q2 WSS + 2pq WSR) / WM = (q (q WSS + p WSR)) / WM El cambio en la frecuencia gnica luego de una generacin de seleccin para el alelo R, S VHUi HQWRQFHV S St+1 pt =((p (p WRR + q WSR)) / WM ) - p
(VWLPDFLyQ GH ORV YDORUHV DGDSWDWLYRV Los valores adaptativos de los homocigotas susceptibles y resistentes sern distintos dependiendo del origen de dichos individuos. El valor adaptativo medio de estos dos genotipos deber tener en cuenta entonces el porcentaje relativo de refugio y plantas Bt cultivado, como sigue: WRR = ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) WSS = ref (WSS/ref ) + Bt (WSS/Bt ) ec.2 ec.3
que es lo mismo que, S S T S :RR - WSR) + q (WSR WSS))) / ec.1 WM De este modo se llega a un modelo poblacional que permitir estimar cmo ser el cambio en la frecuencia del gen de resistencia, el cual depender de su frecuencia inicial y de los valores adaptativos de los tres genotipos.
donde ref y Bt (= 1- ref ) son las proporciones de hectreas cultivadas de refugio y plantas Bt, respectivamente; WRR/ref y WRR/Bt son los valores adaptativos de los individuos RR en el refugio y en los campos con plantas Bt, respectivamente; y WSS/ref y WSS/Bt son los valores adaptativos de los individuos SS en el refugio y en los campos con plantas Bt, respectivamente. Si bien existen distintos valores de dominancias funcionales para el alelo resistente, se considerar para todos los clculos que la resistencia es recesiva. De hecho, las altas
dosis de toxina Bt tienen por objeto llevar a la dominancia funcional del resistente a cero, lo que favorece el retraso en el aumento de la frecuencia de este alelo en las poblaciones. Por lo tanto, se considerar que WSS = WRS. En Tabashnik y col. (2005) se describe detalladamente cmo calcular empricamente los costos selectivos, lo cual se lleva a cabo, en trminos generales, analizando la supervivencia relativa de las larvas de lneas sensibles y resistentes sobre plantas Bt y libres de Bt, tanto en el campo como en estaciones experimentales. (VWLPDFLyQ GHO SRUFHQWDMH GH UHIXJLR HQ FRQGLFLRQHV GH HTXLOLEULR En gentica de poblaciones se denomina FRQGLFLyQ GH HTXLOLEULR DTXHOOD HQ OD TXH QR existe un cambio neto en las frecuencias allicas de un determinado carcter a travs de las generaciones. En el caso particular de los cultivos transgnicos Bt, el objetivo que se quiere lograr es el de llegar a ese equilibrio, manteniendo estable la frecuencia del alelo de resistencia en las poblaciones de insectos, con el Q GH TXH QR VH GLOX\D HO HIHFWR LQVHFWLFLGD GHO %W (O SURJUDPD GH UHIXJLRV TXH LPSOLFD FXOtivar zonas con plantas libres de Bt junto a los campos con plantas Bt, persigue justamente ese objetivo: el de generar un microambiente en donde los valores selectivos de los individuos sensibles a la toxina Bt sea mximo, asegurando de este modo que el alelo S nunca se pierda. El problema que surge entonces para el productor agrcola es cul ser el porcentaje mnimo que se debe cultivar con plantas libres de Bt para que el programa funcione, ya que es obvio que el rendimiento econmico de estas plantas susceptibles de ser atacadas por los lepidpteros ser menor. El porcentaje de refugio necesario para que se alcance la condicin de equilibrio se puede deducir de la ecuacin 1 (ec.1) como sigue: S S T S :RR - WSR) + q (WSR WSS))) / WM = 0
por lo tanto en el equilibrio p (WRR - WSR) + q (WSR WSS) = 0 ec.4 Si se supone que el alelo de resistencia es completamente recesivo, entonces WSS = WSR por lo tanto el segundo trmino de la ecuacin 4 se anula, y al reemplazar WSR por WSS en el primer trmino, esta ecuacin se reduce a: p (WRR - WSS) = 0 ec.5
Sustituyendo WRR y WSS segn las ecuaciones 2 y 3 del apartado anterior, se obtiene: p ((ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt )) (ref (WSS/ref ) + Bt (WSS/Bt ))) = 0 Teniendo en cuenta que p>0, y que el valor selectivo de los individuos homocigotas susceptibles en los campos Bt (WSS/Bt) es 0, entonces, ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) ref (WSS/ref )= 0 es decir, Bt (WRR/Bt) - ref (WSS/ref - WRR/ref) = 0 ec.6 La resistencia se mantendr estable, entonces, cuando el efecto neto de la seleccin para resistencia que favorece a los RR en los campos Bt sea igual al efecto neto de los costos de seleccin en contra de ese mismo genotipo en los refugios. La frecuencia de la resistencia disminuir si aumenta el porcentaje de refugio, disminuye el valor selectivo de los resistentes en campos libres de Bt, y aumenta la desventaja de los resistentes en los campos Bt en relacin a los campos libres de Bt. Por lo tanto, el porcentaje de refugio adecuado para que el alelo de resistencia se mantenga estable se puede estimar mediante la ecuacin 6 siempre y cuando se conozcan los distintos valores selectivos. Por ejemplo, en un estudio realizado en campos de algodn de Arizona entre los aos 1997 y 2004, Tabashnik y col. (2005) estimaron que, de acuerdo a valores selectivos empricos medios de los RR en los refugios, y en los campos Bt de esa regin, la frecuencia del alelo de resistencia se
mantendr estable con valores de porcentaje de refugios que ronden el 23%. Sin embargo, este valor obtenido de tamao de refugio para el equilibrio, que como veremos mas adelante es un valor relativamente bajo en comparacin a los que se consideran en la prctica valores efectivos de tamaos de refugios, se bas en estimas de valores selectivos de los individuos resistentes en los campos Bt (WRR/Bt) que tambin fueron bajos. 0RGHORV WHyULFRV YV GDWRV UHDOHV IXQFLRQDQ ORV UHIXJLRV" Un estudio recientemente publicado que recav informacin de monitoreo de la evolucin de la resistencia en distintos pases de todo el mundo, demostr que la estrategia de los refugios es en general efectiva y que los modelos tericos son herramienta tiles para predecir dicha evolucin bajo distintos escenarios. El estudio se bas en resultados previos de anlisis de la resistencia a Bt en campos de Australia, China, Japn, Espaa y Estados Unidos, de seis de las principales plagas de insectos: +HOLFRYHUSD DUPLJHUD + ]HD +HOLRWKLV YLUHVFHQV 2VWULQD QXELODOLV 3HFWLQRSKRUD gossypiella y Sesamia nonagrioides. Slo en +HOLFRYHUSD ]HD se observ evolucin para la resistencia, medida mediante bioensayos, los que demostraron un aumento en la concentracin media letal (LC50) de toxina Bt Cry 1Ac para poblaciones coleccionadas en campos cultivados con plantas Bt, en comparacin con FHSDV HVSHFtFDV GH ODERUDWRULR TXH QXQFD haban sido expuestas a una dieta Bt. Cuando se incorporaron los parmetros reales iniciales del monitoreo (frecuencias iniciales, porcentaje de refugio, valores selectivos) a los modelos tericos, se obtuvieron resultados similares en el cambio esperado terico en dichas frecuencias que las obtenidas al cabo de unos aos de observacin, demostrando la efectividad de los modelos para la prediccin futura en programas de manejo integrado de plagas. Los modelos tericos predicen que H. zea evolucionar mas rpido para resistencia que las otras plagas antes mencionadas. De hecho, el aumento en la frecuencia del alelo de resistencia en esta especie fue mayor en Arkansas y Missisipi que en Carolina del Norte, siendo
el porcentaje de refugio para las dos primeras regiones de 39%, y para Carolina del Norte del 82%. Con estos tamaos, H. zea MDUtD OD UHVLVtencia en 9 aos en Arkansas y Missisipi, y en mucho mas de 20 aos en Carolina del Norte. Es evidente entonces que el porcentaje ms alto de refugio, est impidiendo que la resistencia evolucione ms rpidamente en poblaciones de H. zea de Carolina del Norte. Altos porcentajes de refugios tambin retardaron la evolucin de la resistencia de H. armigera a Cry1Ac en Australia y China, de P. gossypiella en Arizona, y de S. nonagrioides en Espaa. En Australia, el tamao del refugio fue del 70%, en China del 87-95%, en Arizona, del 50% y en Espaa fue de alrededor del 95%. Sin embargo, en estas especies una ventaja adicional con respecto a H. zea fue la dominancia funcional (h) del gen de resistencia, que en la mayora de ellas es completamente recesivo (h=0) y en H. zea tiene un valor alto (h=0,826) IDYRUHFLHQGR OD MDFLyQ UiSLGD GH OD UHVLVWHQFLD Por ltimo, cabe destacar que un estudio reciente de simulacin que aplica modelos gentico poblacionales como los expuestos aqu, pero que contemplan un mayor nmero de parmetros en el clculo de los valores adaptativos (por ejemplo la reduccin en la tasa de mortalidad de los genotipos sensibles a medida que aumenta la edad de la planta y disminuye la expresin de la toxina, o la mortalidad inducida por insecticidas qumicos fumigados en la zona de refugios) demuestra de manera terica que los refugios siguen siendo esenciales incluso en el caso de cultivos de algodn que expresan dos toxinas. Estos cultivos doEOHV %W VH FRPHQ]DURQ D FRPHUFLDOL]DU KDFH relativamente poco tiempo, por lo que faltan algunos aos para poner a prueba mediante datos de monitoreo a campo estas simulaciones tericas y demostrar, una vez mas la efectividad real de los refugios. (OHPHQWRV WtSLFRV GH XQ SODQ GH manejo de resistencia El desarrollo de resistencia en las poblaciones de insectos, consecuencia del proceso natural de evolucin, surge como adaptacin a las prcticas de manejo y por ende no se limita a un sistema particular de cultivo. Los insectos
pueden adaptarse a cualquier prctica de manejo dependiendo de la presin de seleccin ejercida sobre ellos. Hay numerosos ejemplos de este fenmeno en insectos que han desaUUROODGR PHFDQLVPRV GH GHIHQVD VLROyJLFRV de comportamiento y metablicos frente a insecticidas qumicos, agentes de control biolgico y controles culturales. En el caso particular de la tecnologa Bt la presencia de la protena durante todo el perodo de crecimiento del cultivo, aumenta la presin de seleccin y hace necesaria la incorporacin de refugios para el manejo de resistencia de insectos (IRM) y como parte integrada del mtodo de manejo de plagas. En todos los pases donde esta tecnologa se encuentra disponible se han desarrollado programas de manejo de resistencia de insectos. Estos programas son desarrollados en forma local y en colaboracin entre los sectores acadmicos y de investigacin, los gobiernos y la industria, VREUH EDVHV FLHQWtFDV \ DQDOL]DQGR OD VLWXDcin local en cuanto a plagas presentes y el ambiente agroecolgico. Los elementos tpicos de un plan de manejo de resistencia incluyen: ,QYHVWLJDFLyQ. Las caractersticas de los refugios estn dadas por su tamao (porcentaje sobre el total del rea sembrada con maz), distancia entre ellos y forma. Si bien generalmente en todos los pases se utilizan recomendaciones similares que garantizan ampliamente un correcto manejo de resistencia de insectos, las caractersticas de los refugios estarn dadas entre otras cosas por las plagas objetivo presentes, por lo tanto los programas se sustentan sobre ensayos que permiten ampliar las herramientas disponibles para evaluar las recomendaciones de IRM dadas al productor. 2) Comunicacin. Debido al papel clave del conocimiento del productor en el logro de un manejo exitoso y responsable de los maces Bt, la comunicacin es uno de los pilares de los programas de IRM. Los materiales educativos, la difusin en los medios especializados y la capacitacin directa a los productores son algunas de las herramientas ms utilizadas para lograrlo. Por otra parte es importante el
diagnstico de la situacin con respecto a la adopcin de los refugios, no slo para medir la aplicacin real de la prctica, sino tambin como herramienta para ajustar la estrategia de comunicacin dirigida al productor. Las encuestas peridicas son una herramienta utilizada en muchos pases para estas mediciones. 0RQLWRUHR. El objetivo del monitoreo es GHWHFWDU \ FRQUPDU FXDOTXLHU SRVLEOH GHVDUUROOR GH UHVLVWHQFLD FRQ OD VXFLHQWH DQWHODFLyQ como para implementar medidas de remediacin que permitan retrasar o prevenir la difusin de la resistencia y evitar que se pierda la capacidad de control de los maces Bt. La herramienta apropiada para monitorear la resistencia a campo depende del patrn de evolucin de la resistencia. El patrn espacial de evolucin de la resistencia en el campo puede surgir en un foco localizado que evoluciona rpidamente y se expande, o a partir de una poblacin donde la resistencia est dispersa y evoluciona lentamente con un incremento ms gradual en la frecuencia de alelos resistentes. Es improbable que el muestreo al azar de la poblacin permita detectar resistencia localizada, a menos que se lleve a cabo a una escala impracticable. En estos casos es mejor utilizar FRPR KHUUDPLHQWD GH PRQLWRUHR OD LGHQWLFDcin de lotes del cultivo con daos no esperados en las plantas. Para esto es fundamental que los productores estn capacitados para informar a la empresa proveedora de semilla la presencia de plantas del lote con daos de larvas. Una vez detectado e informado el dao QR HVSHUDGR VH GHEHUi FRQUPDU TXH OD SODQWD es una planta Bt, que se est expresando en sus tejidos el nivel de protena esperado y que el dao no haya sido producido por otra especie no susceptible al maz Bt o por cuestiones climticas. Por otra parte, si la resistencia evoluciona lentamente a partir de reas dispersas, los daos no esperados slo podrn ser detectados cuando una gran proporcin de la poblacin se haya vuelto resistente. En este caso, la herramienta de monitoreo apropiada es el muestreo al azar de la poblacin y el anlisis en laboratorio para detectar frecuencias relativamente bajas de alelos de resistencia. 4) Remediacin (Q FDVR GH FRQUPDUVH OD aparicin de resistencia, deber aplicarse un plan de remediacin que permita reducir la fre-
cuencia de insectos resistentes. Cuando la resistencia se detecta a travs de la aparicin de plantas con daos no esperados en el cultivo, es esperable que la proporcin de resistencia HQ OD SREODFLyQ GH LQVHFWRV VHD VLJQLFDWLYD (Q este caso las acciones a tomar podrn incluir la aplicacin de insecticidas qumicos para reducir la frecuencia de insectos resistentes e incluso la suspensin de la aplicacin de cultivos Bt en la zona afectada. Por el contrario, si a travs de un programa de monitoreo al azar y del anlisis en laboratorio se detectara la presencia de alelos de resistencia en una poblacin de insectos, pero la resistencia no se hubiera manifestado an a campo, se podran tomar otras medidas para caracterizar la resistencia y, de ser necesario, disminuir su dispersin. (VWDV PHGLGDV SRGUtDQ LQFOXLU OD FRQUPDFLyQ de la heredabilidad de la resistencia, determinar si la resistencia es recesiva o dominante, su frecuencia, etc.
que permita retrasar cualquier potencial desarrollo de resistencia y detectar inmediatamente cualquier cambio en la susceptibilidad de la poblacin de insectos. 3DUD FXPSOLU FRQ HO REMHWLYR SURSXHVWR $6$ nancia estudios locales realizados por del INTA, la Estacin Agro Industrial Obispo Colombres, y profesionales de laboratorios privados, que permiten ampliar la comprensin de la bioecologa de las plagas objetivo y contar con herramientas para monitorear su susceptibilidad a las protenas Bt actualmente en el mercado. Con respecto a la comunicacin hacia el productor y a la difusin del manejo adecuado de la tecnologa Bt, ASA hace especial hincapi en la GLIXVLyQ GH XQ PHQVDMH XQLFDGR HQWUH WRGDV ODV empresas quienes se encuentran activamente comprometidas con el programa, como sigue: Los refugios deben sembrarse con un maz no Bt de ciclo similar en la misma fecha de siembra que el lote Bt. (O UHIXJLR GHEH VHU HO GH OD VXSHUFLH GHO (O PDQHMR GH OD UHVLVWHQFLD D lote. Por ejemplo, cada 9 hectreas sembradas insectos en Argentina En Argentina, el Programa de Manejo de Re- con maz Bt, debemos sembrar 1 hectrea con sistencia de Insectos (MRI) en maz Bt apro- maz no Bt. Los refugios deben sembrarse en bloque en bado por la Comisin Nacional Asesora de uno de los bordes del lote. Si el lote mide ms Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) en 1999, es llevado a cabo por la Asociacin de de 1500 m de lado, el bloque de refugio deber Semilleros Argentinos (ASA) entidad que nu- sembrarse en el centro del mismo, para aseguclea a todas las empresas que comercializan rar que los insectos del refugio puedan volar y maz Bt en el pas. El objetivo del programa es cruzarse con cualquier potencial sobreviviente promover un uso responsable de la tecnologa, GHO PDt] %W JXUD Tratamientos qumicos: a) No deben realizarse aplicaciones de insecticidas para el control del barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) en los refugios. b) En caso de detectarse ataque de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) por encima del umbral de accin, pueden aplicarse insecticidas. El mejor control del gusano cogollero se obtiene con aplicacin de insecticidas en los primeros estadios del cultivo. De esta forma, adems de facilitarse el trabajo, se disminuye la presin de la Figura 2: Distribucin del refugio en el lote de acuerdo a las plaga en estadios ms avanzados, dimensiones del mismo. Bt= zona sembrada con maz Bt. preservando la funcin del refugio. Ref.= zona de refugio.
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VI. CAPTULO 6 Resistencia de malezas a KHUELFLGDV HYROXFLyQ \ estrategias de manejo

Danie l Tuesca; Luisa Nisensohn; Mario R Sabbatini; Guillermo Chantre Introduccin En los agroecosistemas la presencia de PDOH]DV LQWHUHUH GLFXOWDQGR ODV WDUHDV GH siembra y cosecha y generando prdidas de rendimiento por competencia con los cultivos. La magnitud de estas prdidas vara en funcin de la interaccin de numerosos factores tales como la composicin de la comunidad de malezas, la abundancia relativa de cada una de las especies que la integran, las condiciones ambientales, la modalidad de conduccin del cultivo, entre otros. Los niveles de prdida causados por las malezas pueden oscilar entre 0 y 30% para especies poco agresivas con bajos niveles de infestacin hasta un 80% para malezas ms competitivas, en densidades muy altas y frecuentemente coexistiendo con el cultivo durante todo su ciclo. La reduccin del grado de abundancia de las poblaciones de malezas que acompaan los cultivos puede efectuarse mediante el control mecnico, empleando diversas herramientas de labranza; el control biolgico, que utiliza agentes biocontroladores (fundamentalmente insectos y hongos) que afectan malezas esSHFtFDV; el control cultural, donde se aprovechan las caractersticas propias de los cultivos que integran la secuencia, y el control qumico, que involucra el empleo de herbicidas. Actualmente, el control mecnico tiene una utilidad limitada debido a la adopcin masiva de sistemas con labranza mnima o directamente sin labranza (siembra directa). El control biolgico, si bien es una metodologa de manejo de plagas altamente recomendado por su bajo impacto ambiental, se encuentra limitado a aquellas especies de malezas de las cuales se han aislado y autorizado el uso de agentes biocontroladores. El control cultural, utilizado por los agricultores desde el inicio mismo de la agricultura, ha recibido en los ltimos aos una
especial atencin, por constituir una alternativa ante el uso excesivo de herbicidas. Una de las opciones ms conocidas y aplicadas es la rotacin de cultivos con diferente ciclo y hbito de crecimiento, la eleccin de cultivares competitiYRV OD PRGLFDFLyQ GH OD IHFKD GH VLHPEUD \ HO acortamiento de la distancia entre surcos a los QHV GH DXPHQWDU OD KDELOLGDG FRPSHWLWLYD GH los cultivos frente a las malezas. En las ltimas dcadas el enfoque alternativo ms utilizado para solucionar el problema de las malezas consisti en el control qumico utilizando herbicidas. Una de las razones de este predominio radica en la relativa simplicidad de la tecnologa, que permite su empleo an con conocimientos escasos de los fundamentos en que se sustenta. La eleccin de estrategias de reduccin o de erradicacin de malezas en reemplazo de estrategias de prevencin y contencin se vio favorecida no slo por IDFWRUHV WHFQROyJLFRV FRPR OD HFDFLD GH ORV principios activos y la tecnologa de aplicacin, sino tambin por factores econmicos y socioculturales como la disminucin de los costos relativos, el aumento de la escala productiva y las caractersticas de los actores involucrados en el proceso de produccin. A pesar de la continua generacin y sustitucin de diversos herbicidas en las ltimas dos dcadas no fue posible erradicar a las malezas sino que por el contrario se seleccionaron biotipos tolerantes y/o resistentes a algunos principios activos. La resistencia de diferentes biotipos de insectos a diversos plaguicidas es el mayor desafo del control de plagas desde hace medio siglo en todo el mundo. En los ltimos aos, este mismo desafo se ha trasladado al control de malezas, fundamentalmente en aquellos cultivos en los que se aplican intensamente herbicidas. En el manejo de malezas en cultivos se han diferenciado dos conceptos que se relacionan con la capacidad que tienen algunas plantas de sobrevivir a los tratamientos con herbicidas. $Vt HO WpUPLQR WROHUDQFLD VH HPSOHD SDUD GHQLU la capacidad natural heredable de una especie para sobrevivir y reproducirse luego de un tratamiento herbicida, mientras que la resistencia D KHUELFLGDV VH GHQH FRPR OD FDSDFLGDG KHredable de una poblacin o biotipo para sobrevivir y reproducirse despus de la aplicacin
de una dosis de herbicida que era letal para la poblacin original. Desde la aparicin de los primeros herbicidas selectivos en el mercado argentino en los aos 60, los agricultores han lidiado con el problema de la tolerancia. As por ejemplo, varias especies de malezas son tolerantes al 2,4-D y a la atrazina, dos herbicidas selectivos ampliamente utilizados desde hace muchos aos en los cultivos de trigo y maz, respectivamente. Para controlar esas malezas tolerantes se utilizan otros herbicidas o se emplean diferentes mtodos de control. En cambio, la resistencia es un fenmeno relativamente nuevo, y si bien en nuestro pas se ha manifestado en unas pocas especies, est generando una creciente preocupacin en los agricultores. Desarrollo de resistencia en SREODFLRQHV GH PDOH]DV El primer registro de resistencia a herbicidas se report en 1970 en Estados Unidos, en una poblacin de 6HQHFLR YXOJDULV (senecio) que mostr resistencia a simazina y atrazina luego de un perodo de diez aos en el que estos principios activos se aplicaban una o dos veces por ao. A nivel mundial, la tasa de aparicin de biotipos resistentes se ha incrementado notablemente. En 1983 se haban detectado 60 casos de resistencia y en la actualidad se registran 321 biotipos resistentes que corresponden a 185 especies, de las cuales 111 son dicotiledneas y 74 son gramneas. Si bien se ha documentado resistencia a la mayora de los grupos qumicos, un alto porcentaje de los casos corresponden a inhibidores de la enzima acetolactato sintasa (ALS), de los fotosistemas I y II, de la sntesis de cidos grasos y de las DX[LQDV VLQWpWLFDV JXUD En las poblaciones de malezas, el desarrollo de resistencia es un proceso evolutivo en respuesta a la presin de seleccin ejercida por el uso repetido de herbicidas con el mismo sitio de accin. Los biotipos susceptibles mueren, mientras que los resistentes sobreviven y producen semillas. Si contina la aplicacin de herbicidas que actan sobre el mismo sitio de accin, la proporcin del biotipo resistente se incrementa en relacin al biotipo susceptible JXUD
Figura 1. Distribucin de los casos registrados de resistencia en funcin de los distintos grupos de herbicidas.
Figura 2. Evolucin de la resistencia. (A) una poblacin de malezas que presenta mayora de plantas susceptibles es pulverizada con un herbicida. Como el biotipo resistente al herbicida se encuentra en una frecuencia muy baja, la poblacin en general HV HFLHQWHPHQWH FRQWURODGD % &RQ OD DSOLFDFLyQ recurrente del mismo herbicida (u otros herbicidas que actan en el mismo sitio de accin) las plantas susceptibles son eliminadas antes de formar semillas que garantizan su supervivencia. Contrariamente, la frecuencia del biotipo resistente se incrementa ya que dispersan sus semillas normalmente. (C) Al persistir la aplicacin de estos herbicidas, la densidad del biotipo resistente se incrementa signiFDWLYDPHQWH ' /XHJR GH DOJXQRV DxRV OD PD\Rra de los individuos de la poblacin es resistente y HO KHUELFLGD \D QR UHVXOWD XQD KHUUDPLHQWD HFLHQWH para el control de la maleza.
La deteccin de biotipos resistentes no es inmediata; este proceso slo comienza a percibirse cuando los individuos resistentes representan aproximadamente el 30% de la poblacin. Uno de los requisitos para la evolucin de resistencia en las poblaciones de malezas es la presencia de variacin gentica heredable para la resistencia. As, en poblaciones no seleccionadas se pueden distinguir dos situaciones: OD SREODFLyQ QR SRVHH DOHORV TXH FRQHUHQ UHsistencia al herbicida cuando se inicia el proceso de seleccin. En este caso la probabilidad de que la poblacin adquiera resistencia a travs de mutacin, depender de i) la frecuencia de mutacin, ii) las desventajas selectivas de los DOHORV R JHQHV TXH FRQHUHQ UHVLVWHQFLD HQ XQ ambiente sin seleccin y iii) el tamao de la poblacin. preexistencia de genes resistentes. En este FDVR ORV DOHORV TXH FRQHUHQ UHVLVWHQFLD HVWiQ presentes en la poblacin antes de aplicarse el herbicida, aunque en una frecuencia muy baja para ser detectados. En esta situacin, la evolucin de la resistencia ser ms rpida que en 1. Mecanismos de resistencia Existen tres mecanismos por los cuales se DQXOD OD DFWLYLGDG WRWy[LFD GHO KHUELFLGD GHQWUR de la planta y se genera resistencia: 0RGLFDFLyQ GHO VLWLR GH DFFLyQ Se producen cambios estructurales en la molcula que constituye el sitio de accin del herbicida. De esta manera, el herbicida no puede unirse a GLFKD PROpFXOD \ VH LQKLEH HO HIHFWR WRWy[LFR (ej.: resistencia a las triazinas o a los inhibidores de ALS). 'HWR[LFDFLyQ SRU PHWDEROL]DFLyQ Se SURGXFHQ FDPELRV HQ OD WDVD GH GHWR[LFDFLyQ del herbicida. En una planta resistente, el herELFLGD VH GHJUDGD D PHWDEROLWRV QR WRWy[LFRV en forma ms rpida que en una planta susceptible (ej.: algunos casos de resistencia a los inhibidores de la sntesis de cidos grasos). 5HGXFLGD DEVRUFLyQ WUDQVSRUWH R VHcuestro. El secuestro o aislamiento implica que el herbicida sea apartado de las regiones metablicamente activas de la clula vegetal, y trasladado a sitios menos activos (por ejemplo, una vacuola) donde es inocuo para el cre-
cimiento vegetal. Este paso frecuentemente es precedido por una desactivacin por conjugacin con otra molcula (por ejemplo, un azcar). Se produce de este modo una reduccin de la concentracin del herbicida en el sitio de accin. Este mecanismo ha sido sugerido en algunos casos de resistencia a los inhibidores de la sntesis de cidos grasos y del fotosistema I. )DFWRUHV TXH PRGLFDQ OD WDVD GH HYROXFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD En las poblaciones de malezas existen diIHUHQWHV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ ORV SURFHVRV evolutivos y que interactan para determinar tanto la probabilidad como la velocidad a la que puede ocurrir la resistencia. Estos factores estn relacionados con caractersticas de las poblaciones de malezas, de los herbicidas y de los sistemas de manejo del agroecosistema. )DFWRUHV UHODFLRQDGRV FRQ OD ELRORJtD \ JHQpWLFD GH ODV SREODFLRQHV GH PDOH]DV 1.a. Frecuencia de alelos resistentes. A medida que dicha frecuencia aumenta en una poblacin, la tasa de evolucin de la resistencia ser mayor. E El modo de herencia de la resistencia. Si la resistencia es conferida por alelos dominantes la evolucin ser ms rpida, debido a que tanto los individuos homocigotas como heterocigotas resultarn resistentes. 1.c. 1~PHUR GH JHQHV TXH FRQHUHQ UHVLVtencia. La herencia de la resistencia es comnmente monognica, es decir que est controlada por un solo gen, dando lugar a tasas de evolucin relativamente elevadas. Por el contrario, cuando la resistencia es polignica y est asociada con varios genes, la evolucin es ms lenta, ya que se requieren recombinaciones genticas durante varias generaciones SDUD UHXQLU XQ Q~PHUR VXFLHQWH GH DOHORV TXH den lugar a un genotipo resistente. 1.d. &DUDFWHUtVWLFDV UHSURGXFWLYDV GH OD HVpecie. En las especies algamas, los alelos de resistencia pueden dispersarse no slo a travs de las semillas, sino tambin mediante el polen transportado por el viento o por insecWRV (Q ODV HVSHFLHV DXWyJDPDV HO XMR JpQLFR es sumamente reducido entre individuos, y en
este caso la dispersin de alelos resistentes se produce casi exclusivamente a travs de semillas. 1.e. &DSDFLGDG UHSURGXFWLYD GH OD PDOH]D. La produccin de un elevado nmero de semillas favorece la dispersin de la resistencia. I Tamao de la poblacin de malezas. En poblaciones de malezas con densidades elevadas, la probabilidad de que algunos individuos resistentes estn presentes ser mayor. 1.g. /RQJHYLGDG GH ODV VHPLOODV HQ HO VXHlo. En las especies que poseen un banco de semillas persistente, slo una fraccin de ste estar expuesto a la seleccin por el herbicida en cada estacin de crecimiento. As, en aos sucesivos las poblaciones de plntulas reclutadas a partir del banco incluirn una proporcin de individuos susceptibles. Esto resultar en una disminucin de la frecuencia de alelos resistentes y har ms lenta la evolucin de la resistencia. 1.h. Mecanismos de dispersin de semillas. (Q HO FDVR GH HVSHFLHV DQHPyODV HO YLHQWR puede dispersar semillas de genotipos resistentes a reas no infestadas. La dispersin por efecto antrpico tambin debe tenerse en cuenta, ya que la maquinaria es una va de transporte de estos genotipos hacia reas libres de individuos resistentes. 1.i. Perodo de emergencia. En la medida en que las poblaciones de malezas tengan perodos prolongados de germinacin, la probabilidad de que el herbicida afecte slo a una parte de dicha poblacin se incrementa. Los individuos susceptibles que emerjan con posterioridad a la aplicacin contribuirn a disminuir la frecuencia de alelos resistentes y la evolucin de la resistencia ser ms lenta. 1.j. (O YDORU DGDSWDWLYR WQHVV UHODWLYR GH ORV genotipos resistentes y susceptibles. El valor adaptativo de un genotipo se mide a travs del xito reproductivo, es decir la cantidad de descendientes que estn presentes en la siguiente generacin. En poblaciones que se aparean al azar casi todos los alelos de la poblacin van a estar en forma heterocigota durante los primeros estadios de la evolucin de la resistencia. En el caso que frente a las aplicaciones de herbicidas, los individuos heterocigotas (RS) tengan ms WQHVV que los homocigotas suscep-
tibles (SS), la evolucin de la resistencia ser rpida. Si en cambio, los heterocigotas poseen un WQHVV similar al de los susceptibles, la resistencia evolucionar ms lentamente. En algunos casos, el genotipo resistente tiene un valor adaptativo menor que el susceptible, y en esta situacin si se reduce la presin de seleccin. Por ejemplo, utilizando herbicidas con distinto sitio de accin, la frecuencia del genotipo resistente disminuye rpidamente en la poblacin. )DFWRUHV UHODFLRQDGRV FRQ HO KHUELFLGD 2.a. Dosis empleadas. Cuando la resistencia es monognica, el empleo de dosis elevadas aumenta la presin de seleccin y favorece la evolucin de la resistencia. Por el contrario, la utilizacin de sub-dosis, al disminuir la presin de seleccin, puede atrasar la aparicin de la resistencia. En esta situacin, las semillas provenientes de plantas susceptibles sobrevivientes al herbicida, contribuirn a que en la siguiente generacin disminuya la frecuencia de alelos resistentes en la poblacin total. 6L OD UHVLVWHQFLD HV SROLJpQLFD HV QHFHVDULR TXH VH SURGX]FDQ UHFRPELQDFLRQHV HQWUH LQGLYLGXRV GXUDQWH YDULDV JHQHUDFLRQHV SDUD DOFDQ]DU XQ Q~PHUR VXFLHQWH GH DOHORV TXH JHQHUHQ XQ JHQRWLSR UHVLVWHQWH (Q HVWH FDVR OD XWLOL]DFLyQ GH VXEGRVLV GH KHUELFLGDV SHUPLWLUi TXH DTXHOORV LQGLYLGXRV que expresan mecanismos de resistencia relativamente dbiles por no poseer la cantidad de aleORV VXFLHQWHV VREUHYLYDQ \ FRQWULEX\DQ DO pool de genes de resistencia. En cambio, al aplicar dosis altas se elimina la mayora de la poblacin disminuyendo as la frecuencia de alelos resistentes en la poblacin total. E (FDFLD /D HFDFLD GH XQ KHUELFLGD est relacionada con la mortalidad que causa en una poblacin de malezas. Como se indic en el punto anterior, en caso que la resistencia VHD PRQRJpQLFD ORV KHUELFLGDV PiV HFDFHV eliminarn una mayor proporcin de individuos susceptibles y de este modo facilitarn la evolucin de la resistencia. En cambio, si la resisWHQFLD HV SROLJpQLFD XQD PHQRU HFDFLD GH ORV KHUELFLGDV SRGUtD EHQHFLDU OD VREUHYLYHQFLD de algunos alelos que, por acumulacin, incrementarn el pool de genes resistentes. As, WDQWR ORV KHUELFLGDV HFDFHV FRPR LQHFDFHV
contribuyen a aumentar, mediante diferentes mecanismos, el desarrollo de la resistencia. La evolucin de la resistencia por ello puede demorarse, pero es un proceso inevitable mientras se usen herbicidas como nica herramienta del manejo de malezas. 2.c. (VSHFLFLGDG GHO VLWLR GH DFFLyQ. En el FDVR GH KHUELFLGDV TXH LQWHUHUHQ FRQ XQ VROR sitio de accin, el cambio en un solo gen puede VHU VXFLHQWH SDUD DIHFWDU OD XQLyQ GH OD PRlcula herbicida al sitio de accin. El uso de herbicidas con mltiples sitios de accin tendr menor probabilidad de generar biotipos resistentes. 2.d. Residualidad. Los herbicidas no residuales slo actan sobre los individuos de la poblacin ya emergidos. Los herbicidas residuales afectan adems a las cohortes que emergern posteriormente a la aplicacin, eliminando as una mayor proporcin de individuos susceptibles de la poblacin y favoreciendo la evolucin de la resistencia. 2e. Patrones de uso. El empleo repetido, dentro de la misma campaa agrcola o en campaas sucesivas del mismo herbicida o de herbicidas con igual sitio de accin favorecer la evolucin de poblaciones resistentes. &ODVLFDFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD /D FODVLFDFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD VH DVRFLD con los mecanismos de resistencia involucrados. As pueden distinguirse dos tipos de resistencia: cruzada y mltiple. 5HVLVWHQFLD FUX]DGD VH UHHUH D OD UHVLVtencia a dos o ms herbicidas del mismo o de diferentes grupos qumicos provocada por un nico mecanismo. Dentro de este tipo se pueGHQ GHQLU GRV FDWHJRUtDV 1. Resistencia cruzada asociada con la moGLFDFLyQ GHO VLWLR GH DFFLyQ (V HO WLSR ms frecuente de resistencia cruzada y ocurre cuando un cambio en el sitio de DFFLyQ GH XQ KHUELFLGD FRQHUH UHVLVWHQcia a herbicidas que inhiben el mismo siWLR GH DFFLyQ (VWD PRGLFDFLyQ QR QHFHsariamente resulta en resistencia a todos los grupos de herbicidas con similar sitio de accin ni a todos los herbicidas dentro de un mismo grupo qumico. Es el caso de biotipos de Amaranthus quitensis resistentes a sulfonilureas, imidazolinonas
y triazolopirimidinas, debido a una alteracin de la ALS. 2. Resistencia cruzada no asociada con la PRGLFDFLyQ GHO VLWLR GH DFFLyQ (Q HVWH caso, la resistencia a dos o ms herbicidas es debida a un mecanismo de resisWHQFLD GLIHUHQWH D OD PRGLFDFLyQ GHO VLWLR de accin. Los mecanismos potenciales incluyen: reducida absorcin y transporWH VHFXHVWUR \ GHWR[LFDFLyQ GHO KHUELFLda. Biotipos de Lolium rigidum presentan resistencia cruzada a herbicidas del grupo de las triazinas y de las ureas debida D XQ DXPHQWR HQ OD WDVD GH GHWR[LFDcin de esos herbicidas. 5HVLVWHQFLD P~OWLSOH comprende la resistencia a uno o ms herbicidas del mismo o de diferentes grupos qumicos debida a dos o ms mecanismos. Los casos ms simples de resistencia mltiple son aquellos donde un individuo o poblacin posee dos o ms PHFDQLVPRV TXH OH FRQHUHQ UHVLVWHQFLD D un herbicida o grupo de herbicidas. Una situacin ms compleja es aquella donde la resistencia es a diferentes grupos qumicos. Tal es el caso de un biotipo de Lolium rigidum en Australia que presenta resistencia a nueve grupos de herbicidas conferida por distintos mecanismos. Diagnstico de malezas resistentes a KHUELFLGDV La deteccin temprana de la resistencia permite maximizar la efectividad de los programas de manejo y prevenir su dispersin a campos vecinos. Las fallas en el control de malezas no siempre estn asociadas con la presencia de biotipos resistentes sino que pueden relacionarse con empleo de dosis de herbicidas inadeFXDGDV GHFLHQWH LQFRUSRUDFLyQ GHO KHUELFLGD incorrecto uso de coadyuvantes y surfactantes, condiciones ambientales desfavorables para la actividad del herbicida, momento inadecuado GH DSOLFDFLyQ R XMRV GH HPHUJHQFLD SRVWHriores a la aplicacin en el caso de herbicidas poco residuales. Una vez que estas causas han sido descartadas deben considerarse los siguientes aspectos que caracterizan lotes con poblaciones de malezas que han desarrollado resistencia:
La especie sospechosa est inicialmente FRQQDGD HQ SHTXHxRV PDQFKRQHV Todas las especies susceptibles al herbicida son bien controladas, excepto la especie sospechosa. Se detectan individuos de la especie sospechosa sin sntomas y dispersos entre plantas de la misma especie que han sido controladas. La especie sospechosa normalmente es muy susceptible al herbicida empleado. Se ha utilizado el mismo herbicida en forma repetida sin emplear otros mtodos de control (mecnico o cultural). La historia del lote indica un uso extensivo e intensivo a lo largo del tiempo del herbicida aplicado o de herbicidas con el mismo sitio de accin.
Otro indicador utilizado para comparar los diferentes grados de resistencia entre biotipos es el factor de resistencia que indica el nmero de veces que es necesario aumentar la dosis de un herbicida en un biotipo resistente para alcanzar un control similar al obtenido en el biotipo susceptible. Este factor resulta del cociente entre valores de DL , GR o I del biotipo re50 50 50 sistente y los valores de estos mismos ndices del biotipo susceptible. Casos de resistencia en Argentina Hasta el ao 2005, el nico caso de resistencia documentado en Argentina corresponda a Amararanthus quitensis (yuyo colorado) resistente a herbicidas inhibidores de la enzima acetolactato sintasa (ALS) como por ejemplo, LPD]HWDSLU FORULPXUyQ HWLO \ XPHWVXODP El empleo generalizado de siembra directa y la introduccin de cultivares de soja resistentes a glifosato a partir de 1997 produjo imporWDQWHV PRGLFDFLRQHV HQ ODV FRPXQLGDGHV GH malezas. Asociado con algunas caractersticas HVSHFtFDV GHO JOLIRVDWR VH HVWLPDED XQD EDMD probabilidad de que las malezas desarrollaran resistencia a este principio activo; no obstante hasta la fecha se han detectado 15 casos de resistencia a glifosato en distintas especies de malezas a nivel mundial. El primer caso de resistencia a glifosato en $UJHQWLQD VH FRQUPy HQ HO DxR HQ ELRWLpos de sorgo de Alepo (Sorghum halepense). /DV SULPHUDV GHFLHQFLDV HQ HO FRQWURO FRQ HVWH herbicida se observaron en las provincias de Salta y Tucumn, en el ao 2003 y experimentos realizados posteriormente corroboraron la resistencia a ese principio activo. Investigaciones recientes permiten asegurar que el nmero de biotipos de sorgo de Alepo resistente a glifosato est aumentando, y el rea de distribucin de los mismos incluye la regin sojera ncleo. En ensayos realizados comparando estos biotipos con otros susceptibles, se determin un grado relativamente alto de resistencia a glifosato. Resta evaluar si estos biotipos resistentes se han generado en forma independiente o guardan alguna relacin con los casos encontrados en el noroeste argentino. Estudios realizados en el sudoeste de la Provincia de Buenos Aires indican la existencia
&XDQWLFDFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD /D UHVLVWHQFLD SXHGH VHU FXDQWLFDGD FRPparando valores experimentales derivados de biotipos resistentes y susceptibles. Por ejemplo, se puede comparar la dosis de herbicida requerida para controlar el 50 % de la poblacin de malezas (DL ), la dosis que causa un 50 50% de reduccin en la biomasa (GR ) o la 50 dosis que disminuye en un 50% la actividad GH XQD HQ]LPD HVSHFtFD I ). La metodologa 50 empleada para la estimacin de estos valores se basa en la construccin de FXUYDV GH GRVLV respuesta. Los valores de estos ndices sern menores en biotipos susceptibles y aumentarn a medida que los biotipos presenten mayor JUDGR GH UHVLVWHQFLD JXUD
)LJXUD Curvas dosis-respuesta para biotipos con distinto grado de resistencia.
de poblaciones de raigrs (/ROLXP PXOWLRUXP) con una menor sensibilidad al glifosato, lo cual sugerira el desarrollo de biotipos resistentes. En poblaciones con un historial de alta frecuencia de aplicacin de glifosato se detectaron valores de GR50 entre 3,6 y 4 veces superiores al de poblaciones sin registro de uso de este herbicida. Adems, se observaron valores de hasta 20% de supervivencia en individuos de poblaciones tolerantes a dosis de 1440 gr e.a.ha-1, mientras que la supervivencia fue nula para los individuos de poblaciones sensibles a una dosis de 360 gr e.a.ha-1. Experiencias recientes indicaron valores de supervivencia de hasta 40% a una dosis de 1680 gr e.a.ha-1 en plntulas obtenidas a partir de semillas cosechadas de una poblacin que sobrevivi a una aplicacin comercial de glifosato. Existen caVRV FRQUPDGRV GH ELRWLSRV GH UDLJUiV UHVLVtentes a glifosato en Chile y Brasil. El contexto favorable para el mercado internacional de commodities, el precio relativamente bajo del glifosato respecto a otros herbicidas \ VX SUREDGD HFDFLD HQ XQ DPSOLR HVSHFWUR GH malezas, redundarn en un creciente aumento del rea sembrada con cultivos resistentes a este herbicida. Es necesario implementar medidas de manejo integrado para prevenir el incremento en las poblaciones de malezas tolerantes y resistentes a glifosato. 0DQHMR LQWHJUDGR SDUD SUHYHQLU OD HYROXFLyQ GH OD UHVLVWHQFLD Existen dos estrategias principales para demorar la manifestacin de la resistencia utilizando herbicidas: 1. Rotar herbicidas con distintos sitios de accin y no realizar ms de dos aplicaciones consecutivas de herbicidas con el mismo sitio de accin en el mismo lote a menos que se incluyan otras prcticas de control efectivas en el manejo del sistema. 2. Emplear mezclas de herbicidas con distintos sitios de accin o aplicar en forma secuencial herbicidas con distintos sitios de accin pero similar espectro de accin sobre las malezas a controlar. Como ya se indic anteriormente, el uso del control qumico como nica medida de manejo
de las malezas puede demorar la aparicin de resistencia, pero no erradicarla. Las prcticas conducentes a la erradicacin de la resistencia son las del control integrado, que resulta de combinar el control qumico con el control mecnico, cultural y/o biolgico. As, resulta aconsejable sumar al uso de herbicidas, algunas de las siguientes prcticas: Realizar rotaciones de cultivos con diferentes ciclos de crecimiento. Esta prctica presenta varias ventajas: permitir el uso de herbicidas con diferentes sitios de accin; y permite utilizar diferentes fechas de siembra en los distintos cultivos, formas de preparacin del suelo y otros mtodos culturales para controlar un problema particular de malezas. Laboreo antes de la siembra para controlar las plantas nacidas y enterrar semillas no germinadas. Retraso de la siembra de manera de FRQWURODU ORV SULPHURV XMRV GH HPHUJHQcia de malezas con control mecnico o herbicidas no selectivos. Evitar la dispersin de semillas de malezas resistentes. Para ello utilizar herbicidas no selectivos en precosecha de los cultivos antes de la madurez de las semillas de las malezas y limpiar los equipos de labranza y cosecha antes de transportarlos a otros lotes. Relevar los campos regularmente, identiFDQGR ODV PDOH]DV SUHVHQWHV GH PDQHUD de responder rpidamente a cambios en las poblaciones de malezas para restringir la dispersin de biotipos resistentes que puedan haber sido seleccionados. Iniciar programas de control biolgico a ORV QHV GH LGHQWLFDU ELRFRQWURODGRUHV que disminuyan los perjuicios ocasionados por las especies de malezas ms importantes de la regin. Si bien la combinacin de diferentes mtodos de control es la estrategia ms recomendada para demorar o evitar la evolucin de resistencia, un enfoque interdisciplinario de esta problemtica surge como esencial para una solucin de largo plazo. Un programa de Manejo Integrado de Malezas es un sistema de manejo que enfoca el problema de forma compatible con la preservacin de la calidad
del ambiente, utilizando diferentes tcticas y estrategias de control con el objeto de reducir la poblacin de malezas a niveles tales que los perjuicios econmicos producidos resulten inferiores a un umbral econmico aceptable para el sistema general de produccin. Este programa puede involucrar, adems de los mtodos de control ya sealados, estudios bsicos de la bioecologa de las malezas, medidas preYHQWLYDV HQWUHQDPLHQWR GH SHUVRQDO FDOLFDGR extensin a agricultores, entre otros. Un manejo integrado de malezas, en el que mltiples estrategias son implementadas de una manera racional, es la nica solucin en el marco de un manejo sustentable del sistema productivo. Lecturas recomendadas
Bradshaw L. D., S. R. Padgette S. L. Kimball, and Wells B. H. 1997. Perspectives on glyphosate resistance. Weed Technology, 11:189198. Christoffoleti, P.J. 2008. Aspectos de resistncia de plantas daninhas a herbicidas. 3 Edio, Associao Brasileira de Ao Resistncia de Plantas Daninhas aos Herbicidas (HRAC-BR). Piracicaba, Brasil. De Prado, R.; Cubero, S. y Osuna, M.D. 2001. Biotipos resistentes a herbicidas. Distribucin mundial. En: Uso de herbicidas en la agricultura del siglo XXI. Captulo 22: 279-291.De Prado, R. y Jarrn, J. (Eds). Servicio de Publicaciones, Universidad de Crdoba. Crdoba, Espaa. Devine, M.D.; Duke, O. y Fedtke, C. 1993. Phsiology of herbicide action. P.R.T. Prentice Hall. Englewood Clifs, New Jersey. Garca Torres, L. y Fernndez Quintanilla, C. 1991. Fundamentos sobre malas hierbas y herbicidas. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, Madrid - Mundi-Prensa, Madrid. Hall, L. Beckie, H. y Wolf, T.M. 1999. How herbicides work. Biology to application. Alberta Agriculture, Food and Rural Development Publishing Branch. Edmonton, Alberta. Canada. Jasieniuk, M., 1995. Constraints on the evolution of glyphosate resistance in weeds. Resistant Pest Management, 7: 31-32. Kogan, M. y Prez, A. 2003. Herbicidas. Fundamentos VLROyJLFRV \ ELRTXtPLFRV GHO PRGR GH DFFLyQ Ediciones Universidad Catlica e Chile. Santiago, Chile. Michitte, P., De Prado, R., Espinoza, N., Ruiz-Santaella, P. and Gauvrit, C. 2007. Mechanisms of resistance to glyphosate in a Ryegrass (/ROLXP PXOWLRUXP) byotipe from Chile. Weed Science 55:435-440. Powles S.B. y Preston C. 2006. Evolved Glyphosate
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PARTE VII Biotecnologa y Sociedad
VII. CAPTULO 1 La transformacin tecnolgica y los nuevos desafos

Carmen Vicin Durante los ltimos 20 aos, los sistemas productivos agropecuarios sufrieron una transformacin sustancial, lo cual dio por resultado no slo una sucesin de niveles record de produccin y productividad, sino tambin una UHGHQLFLyQ GH OD FRPSRVLFLyQ GH OD RIHUWD JUDnaria. La expansin de la frontera agrcola argentina gener cambios en el uso de la tierra en varias regiones del pas. La mayor parte del crecimiento productivo se concentr en la regin pampeana, pero la transformacin alcanz, en mayor o menor medida, a casi todas las reas del pas con aptitud agrcola. La disponibilidad tecnolgica, las caractersticas de los suelos, la capacitacin de la mano de obra local, las tendencias climticas, la relacin de los preFLRV GH ORV SURGXFWRV \ ORV LQVXPRV LQX\HURQ en la tasa de difusin de los cultivos en las diferentes regiones. (Q GHQLWLYD HO HMH FHQWUDO GH HVWH GHVDUURllo agropecuario consisti en la difusin de un paquete tecnolgico que combinaba innovaciones genticas, fundamentalmente derivadas de la biotecnologa moderna, insumos y equipos, prcticas agronmicas y nuevos, o en algunos casos, remozados agentes especializados, que llevaron a la creacin de redes de DUWLFXODFLyQ PXFKR PiV FRPSOHMDV Esto fue acompaado por un proceso de especializacin, tanto en lo productivo como en las exportaciones, basado en la trama oleagiQRVD IXQGDPHQWDOPHQWH GHO FXOWLYR GH VRMD Los potenciales efectos ambientales negativos fueron mitigados por el uso de tecnologas, como la siembra directa, la rotacin de cultivos, la mayor aplicacin de fertilizantes y herbicidas, y la agricultura de precisin. Primeramente haremos un breve repaso de algunos de los aspectos ms destacados de esta transformacin, para luego plantear algunos desafos pendientes.
La maquinaria y los sistemas de labranza La renovacin del parque de tractores se dio HQ IRUPD SDUDOHOD D XQ FDPELR GH JUDQ VLJQLcacin: la modernizacin de la maquinaria de arrastre y autopropulsada. En el caso de sembradoras, pulverizadoras y herramientas para la aplicacin de fertilizante, se desarrollaron sistemas de precisin, que permitieron el logro GH PD\RU XQLIRUPLGDG GH VLHPEUD \ HFLHQFLD en la aplicacin. Los sistemas de labranza tradicionales fueron reemplazados gradualmente por otros que LPSOLFDEDQ PHQRU UHPRFLyQ GHO SHUO /D VLHPbra directa, de escasa difusin a comienzos de la dcada del 90, abarca hoy ms del 50 GHO iUHD EDMR FXOWLYR /D LQWURGXFFLyQ \ UiSLGD H[SDQVLyQ GH OD VLHPEUD GLUHFWD TXH UHGXMR OD HURVLyQ GHO VXHOR \ SURGXMR PRGLFDFLRQHV importantes en la organizacin del ecosistema agrario, probablemente sea el cambio de DOFDQFHV DPELHQWDOHV PiV VLJQLFDWLYR JHQHrado por las innovaciones tecnolgicas de la agricultura argentina en las dos ltimas dcaGDV (O LQFUHPHQWR HQ OD VXSHUFLH LPSODQWDGD con siembra directa fue acompaado de una mayor utilizacin de herbicidas asociados a esta tcnica y un crecimiento en la venta de VHPEUDGRUDV HVSHFtFDV La cosecha y el almacenaje La tecnologa de cosecha progres en forma FRQVLGHUDEOH PHMRUDQGR OD FDOLGDG GH WULOOD OR cual permiti reducir las prdidas. Los navegadores satelitales constituyeron otra nueva herramienta a emplear. La confeccin de mapas GH ULQGH DO SRVLELOLWDU PHMRUDU HO FRQRFLPLHQWR GHO WHUUHQR D\XGD D ORJUDU XQ XVR PiV HFLHQWH GHO UHFXUVR HGiFR 6LPXOWiQHDPHQWH HO PDQHMR GH ORV YRO~PHnes cosechados presenta aspectos importantes por resolver, como la falta de un sistema de almacenamiento adecuado en origen, la GLFXOWDG HQ LQVWUXPHQWDU XQ DOPDFHQDPLHQWR GLIHUHQFLDO SRU FDOLGDG R ODV GHFLHQFLDV HQ LQIUDHVWUXFWXUD SDUD HO PDQHMR GH OD SURGXFFLyQ \ su traslado. /RV SURGXFWRV WRVDQLWDULRV En cuanto a la evolucin del mercado de proGXFWRV WRVDQLWDULRV HQ OD GpFDGD GHO QRYHQWD
se observa que hasta 1999 hubo un aumento en el consumo, en especial de herbicidas. Durante el perodo 2000 a 2002, descendi el total de ventas, debido a la recesin de casi FXDWUR DxRV TXH YLYLy HO SDtV D SDUWLU GH QHV del 2001. En el ao 2003 hubo una marcada recuperacin, equivalente a un crecimiento del 32 % en la cantidad total comercializada y del 9 %, en el valor monetario del mercado. A pesar de esta cada, se triplic la cantidad fsica comercializada, con un notable aumento para los insumos empleados en los sistemas de siembra directa, en especial el glifosato. Los fertilizantes y el uso del suelo El de los fertilizantes constituye una incorporacin tecnolgica destacada de comienzos de los aos noventa. Si se toma como base el ao 1991, en cuatro aos se cuadriplic el consumo aparente de fertilizantes. En el ao 2007, el consumo de nutrientes (N+P2O5+K2O+S) puede ser estimado en 1,75 millones de t, con una tasa de incremento de 98700 t por ao en el perodo 1993-2007. Este crecimiento en el consumo de fertilizante fue ocasionado por auPHQWRV HQ ODV VXSHUFLHV FXOWLYDGDV \ PHMRUDV en la tecnologa aplicada a los principales cultivos. Al respecto cabe mencionar que, en aos recientes, se registra una marcada disminucin en el uso de fertilizantes (el ao 2008 concluy con un consumo 30% inferior al de 2007). Los nmeros de la campaa 2008/2009 son an PiV EDMRV GRQGH VL ELHQ OD FRVHFKD \ OD H[traccin de nutrientes fue menor, la reposicin GH QXWULHQWHV IXH PX\ EDMD La trascendencia del uso de fertilizantes en Argentina no pas inadvertida y, en consecuencia, las empresas distribuidoras comenzaron a realizar una importante inversin en logstica portuaria y de distribucin, con el propsito de adaptarse a los cambios ocurridos. Varias empresas comercializadoras de fertilizantes han instalado centros de distribucin y aplicacin de fertilizante en el interior del pas. Las mezclas de fertilizante a granel han aparecido en el mercado como una nueva forma de diferenciacin de producto, destinadas a FXEULU FDUHQFLDV HVSHFtFDV GH ORV FXOWLYRV 6LQ HPEDUJR OD XWLOL]DFLyQ GH PH]FODV HVSHFtFDV
resulta de utilidad cuando se conocen las carencias de macro y micro nutrientes del suelo, los requerimientos del cultivo y las recomendaciones de aplicacin. En este sentido, subsisWHQ D~Q GHFLHQFLDV HQ FXDQWR DO FRQRFLPLHQto de los requerimientos de los cultivos y los aportes necesarios. Existe adems necesidad de contar con la posibilidad de realizar anlisis GH VXHORV FRQ PD\RU JUDGR GH FRQDELOLGDG Los balances de nutrientes continan siendo negativos para los suelos. La necesidad de sostener los niveles de produccin no se logra solamente con el aporte de nutrientes a travs de una fertilizacin balanceada, sino tambin FRQ SUiFWLFDV GH PDQHMR WDOHV FRPR URWDFLyQ de cultivos, siembra directa, incorporacin de FXOWLYRV GH FREHUWXUD \ PDQHMR LQWHJUDGR GH plagas y enfermedades, de manera de contriEXLU D SUHVHUYDU \ PHMRUDU OD VXVWHQWDELOLGDG \ calidad del recurso suelo. Se destaca adems la gran reduccin de la VXSHUFLH RFXSDGD SRU SDVWXUDV SHUPDQHQWHV en las regiones ms productivas. Esto supone el riesgo que disminuya la incorporacin de carbono originado en materia orgnica, el cual es crucial para el mantenimiento de las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas de los suelos. Por otra parte, en muchas regiones no se dispone de informacin con cierto nivel de detalle sobre cmo los cambios en el uso del suelo pueden afectar los servicios que brindan los agro-ecosistemas (regulacin, hdrica, control de la erosin, conservacin de la biodiversidad). Las semillas y la biotecnologa En casi todos los cultivos se ha observado XQD PHMRUD HQ OD FDOLGDG GH OD VHPLOOD XWLOL]Dda, mayor adaptacin de los hbridos y de las variedades a los ecosistemas presentes en el SDtV \ PHMRU LPSOHPHQWDFLyQ GH ODV SUiFWLFDV GH PDQHMR GH ORV FXOWLYRV (V FRQRFLGR \ VLJQLFDWLYR HO KHFKR TXH GHVde hace unos nueve aos Argentina presenta el segundo lugar en el mundo, en cuanto a suSHUFLH FXOWLYDGD FRQ PDWHULDOHV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV *0 $O SUHVHQWH PiV GHO GH OD VRMD HO GHO PDt] \ HO GHO DOJRdn son sembrados con esos materiales. En el
mercado existen once eventos de transformacin, que corresponden a dos caractersticas funcionales relacionadas con aspectos de la produccin agrcola (tolerancia a herbicidas y UHVLVWHQFLD D LQVHFWRV HQ WUHV HVSHFLHV VRMD maz y algodn). (Q HO FDVR SDUWLFXODU GH OD VRMD OD UiSLGD DGRSFLyQ GH ORV PDWHULDOHV *0 FRLQFLGLy FRQ el proceso de expansin del rea dedicada al FXOWLYR /D GLIXVLyQ GH OD VRMD *0 WROHUDQWH D glifosato es uno de los casos de mayor dinamismo en el mbito internacional en cuanto a la incorporacin a gran escala de una innovacin tecnolgica, desde su aprobacin para ser comercializada en el ao 1996. Otro aspecto a puntualizar es el hecho que la introduccin GH HVWH PDWHULDO VH SURGXMR SUiFWLFDPHQWH HQ el mismo momento en que estas tecnologas estuvieron disponibles en el mundo. (QWUH ORV IDFWRUHV TXH PRWLYDURQ VHPHMDQte incorporacin y expansin se encuentra la H[FHOHQWH DVRFLDFLyQ GH OD VRMD JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGD FRQ HO VLVWHPD GH VLHPEUD GLUHFWD $ HOOR VH XQHQ ODV PHMRUDV LQWURGXFLGDV HQ HO PDQHMR \ ODERUHR GHO FXOWLYR TXH UHGXQGDURQ en un sistema productivo ms simple que el empleado anteriormente. Sin embargo, es obvio que una de las razones principales para la rpida adopcin de los FXOWLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV VH EDVy HQ HO EHQHFLR REWHQLGR SRU ORV SURGXFWRUHV DJURSHFXDULRV /RV UHVXOWDGRV HFRQyPLFRQDQFLHURV GH OD VRMD REWHQLGRV HQ ODV H[SORWDciones agropecuarias muestran la estabilidad que este cultivo da a los sistemas productivos, pues su predominancia se conserva an ante profundos cambios en los precios de los insumos y de los productos. Los servicios para el agro (Q IRUPD SDUDOHOD D OD LQWHQVLFDFLyQ HQ HO uso de tecnologa crecieron las empresas de servicios para el agro, fundamentalmente en el FDVR GH DSOLFDFLyQ GH SURGXFWRV WRVDQLWDULRV abonos qumicos, confeccin de reservas foUUDMHUDV \ FRVHFKD El acceso a la informacin ha sido otro factor de progreso; los sistemas de comunicacin KDQ PHMRUDGR HQ HO LQWHULRU GHO SDtV $ HOOR VH suma la proliferacin de muestras agropecuarias y reuniones tcnicas en el interior del pas.
Las formas de administracin de las empresas La profesionalizacin de la administracin de las empresas agropecuarias constituye otro importante factor de cambio tecnolgico. Los SURGXFWRUHV FRPSUHQGHQ FDGD YH] PHMRU TXH la adquisicin de insumos y la comercializacin de los productos son componentes fundamentales de su actividad. Cuando el tamao de la explotacin constituye una limitante, estos productores recurren a diferentes formas de asociacin con el propsito de incrementar el UHVXOWDGR QDO GH VX DFWLYLGDG PHMRUDQGR OD logstica de compra o la colocacin de sus productos. La integracin con las cadenas comerciales e industriales ha sido otro recurso que ha cobrado auge en los ltimos tiempos. Las diferentes formas de integracin han creado un amplio espectro de modalidades, donde el factor comn suele ser la contribucin de los agentes ms avanzados de la cadena en la incorporacin y difusin de tecnologa en el agro. Algo similar ha ocurrido en la etapa de comercializacin de productos. Abundan los HMHPSORV GH DVRFLDFLyQ HQWUH SURGXFWRUHV SDUD FRPHUFLDOL]DU SURGXFWRV HVSHFtFRV WDQWR HQ el mercado interno como en el mercado internacional. La adaptacin a nuevas modalidades de comercializacin no ha sido tarea sencilla para muchos productores agropecuarios. Los actores sociales La innovacin tecnolgica se convirti en el factor central de la rentabilidad de las explotaciones agrarias, pero fue ms fcilmente incorporada por las grandes que por las pequeas, porque una parte importante del nuevo patrn tecnolgico estaba asociado con bienes permanentes de capital, como maquinaria para VLHPEUD GLUHFWD R FRQ FDSLWDO GH WUDEDMR FRPR SURGXFWRV WRVDQLWDULRV Este contexto econmico y tecnolgico favoUHFLy OD JXUD GHO FRQWUDWLVWD FRQ FDSDFLGDG SDUD HQGHXGDUVH \ KDFHU XVR HFLHQWH GHO FDSLWDO /D situacin dio tambin lugar a la aparicin de nuevas formas de organizacin, adems del mencionado contratista, y contribuy a establecer un mercado especial de capitales urbanos interesados en la agricultura. Se trata de gestores
del negocio agropecuario que combinan la posesin de la tierra, obtenida a travs de distintas formas de arrendamiento o aparcera, con el capital de terceros, aportando la tecnologa y OD FDSDFLGDG GH JHUHQFLDPLHQWR (Q HO FRQMXQWR de nuevas y remozadas formas de organizacin de la produccin se encuentra una gran diversidad. Como contrapartida, se increment la cantidad de medianos y pequeos propietarios rurales que se convirtieron en rentistas. Durante la ltima parte de la dcada del 90 las condiciones de precios relativos de la produccin agropecuaria con relacin a los bienes no transables, que inciden considerablemente en el costo de vida, hicieron inviables a las explotaciones de menor tamao, que por muchos aos haban sido viables. Esto gener un proceso de desmantelamiento de explotaciones familiares de menor tamao, la emigracin de sus propietarios a zonas urbanas, especialmente rurales, y el arrendamiento de sus parcelas a vecinos u otras empresas de mayor tamao. Tambin hubo situaciones de prdida de las propiedades. La cada en el nmero de productores, vinculada con procesos de concentracin del capital, no es asimilable estrictamente a la disminucin GHO Q~PHUR GH SHUVRQDV TXH WUDEDMDQ HQ HO iPbito rural. Una gran cantidad de oferentes de servicios agropecuarios, especialmente de tareas mecnicas, y los familiares y asalariados que los acompaan, viven generalmente en los pueblos y ciudades intermedias. Adems de los proveedores de servicios para tareas realizadas en el campo, existe una gama de actividades como la venta de insumos, talleres de reparacin de vehculos y maquinaria, el transporte y el comercio, que ocupan a importantes ncleos de poblacin. Los casos ms visibles son los de las poblaciones donde funcionan fbricas de maquinaria e implementos agrcolas. Hacia el futuro /DV PRGLFDFLRQHV PHQFLRQDGDV VRQ UHOHvantes, tanto por el nivel de hectreas consideradas, como por el hecho que los procesos no se restringieron a un grupo limitado de productores de avanzada. Los cambios experimentados en la agricultura argentina han permitido alcanzar
un nuevo piso de produccin, pero an queda mucho por hacer, ms all de las pequeas menciones efectuadas anteriormente, que no pretenden ser exhaustivas. En el caso particular de la biotecnologa, soEUH OD EDVH GH ORV PDWHULDOHV *0 HQ HYDOXDFLyQ en Argentina y en el mundo, los desarrollos que se avizoran en el mediano y corto plazo incluyen una amplia gama de caracteres agronmicos. As se cuenta con tolerancia a diferentes herbicidas, resistencia a insectos Lepidpteros y Colepteros, y resistencia a virus; resistencia a stress (hdrico, salinidad y restriccin de nuWULHQWHV HQ HO VXHOR \ PHMRUD HQ HO YDORU QXWULWLYR GH ORV FXOWLYRV DOLPHQWLFLRV PRGLFDFLyQ HQ OD FRPSRVLFLyQ GH DFHLWHV PHMRUDV SURWHLFDV PRGLFDFLyQ HQ]LPiWLFD SDUD XVR HQ SURFHVRV LQGXVWULDOHV PRGLFDFLyQ HQ HO FRQWHQLGR GH carbohidratos en el grano). 6LQ HPEDUJR FDEH UHH[LRQDU TXH OD RIHUWD de tecnologa en Argentina, salvo la incorporacin al paquete de alternativas productivas de OD VRMD \ HQ PHQRU PHGLGD HO PDt] PXHVWUD HVFDVD GLYHUVLFDFLyQ (VWD HVSHFLDOL]DFLyQ productiva es, en gran medida, inconsistente con la amplitud agro-ecolgica de los recursos del pas que puede ser empleada para obtener una cartera de productos mucho ms amplia. Los actores sociales que han sido parte de la transformacin tecnolgica de los ltimos aos tienen que avanzar, enfrentando nuevos desafos. Lecturas recomendadas
Barsky O. 2003. Censo del campo: una foto ntida. Clarn Rural. 9 de abril de 2003. Bertolasi, R. 2004. Formas de organizacin de la produccin. www.bancomundial.org.ar %LVDQJ 5 \ *XWPDQ * 'LQiPLFDV UHFLHQWHV en la produccin agroalimentaria Argentina. 5HYLVWD (QFUXFLMDGDV 1 )HEUHUR 'HOOD 9DOOH & \ *DUFtD 0 (O FXOWLYR GH PDt] en alerta amarillo. Secretara de Agricultura, *DQDGHUtD 3HVFD \ $OLPHQWRV 6XEVHFUHWDUtD de Economa Agropecuaria. Direccin de Agricultura. 47 p. *KHUVD & \ 0DUWtQH]*KHUVD 0 $ &RQVHFXHQFLDV de los recientes cambios agrcolas. Ciencia Hoy. Volumen 15 N 87. Junio/Julio 2005.37- 45 p. +XHUJD 0 \ 6DQ -XDQ 6 (O FRQWURO GH SODJDV
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VII. CAPTULO 2 Adopcin de los cultivos JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV HQ Argentina y en el mundo

*DEULHOD /HYLWXV /RV SULPHURV FXOWLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV *0 R WUDQVJpQLFRV VH VHPEUDURQ FRmercialmente en 1996 y desde ese entonces su adopcin global ha aumentado en forma consistente y con tasas sin precedentes en la historia de la agricultura. Esta rpida adopcin, que creci de 1,7 a 125 millones de hectreas en trece aos, reHMD OD VDWLVIDFFLyQ GHO DJULFXOWRU FRQ ORV SURductos de la tecnologa, que ofrecen varios beQHFLRV FRPR OD UHGXFFLyQ GH ORV FRVWRV GH SURGXFFLyQ PD\RU H[LELOLGDG HQ HO PDQHMR GH los cultivos, disminucin en el empleo de insecWLFLGDV PD\RU UHQGLPLHQWR \ PHMRU FDOLGDG Distribucin por pas Segn el Servicio para la Adquisicin de Aplicaciones Agrobiotecnolgicas (ISAAA), en 2008 13,3 millones de agricultores de 25 pases sembraron 125 millones de hectreas con cultivos transgnicos. Catorce lo hicieron en 100.000 hectreas o ms, aunque el 98% del rea global se concentr slo en ocho: Estados Unidos, Argentina, Brasil, India, Canad, China, Paraguay y Sudfrica (Fig. 1 y Tabla 1). Distribucin por cultivo y caracterstica En 2008, el 52,6% de las hectreas sembraGDV FRQ FXOWLYRV *0 FRUUHVSRQGLHURQ D VRMD HO 29,8% a maz, el 12,4% a algodn y el 4,7% a FDQROD (VWDV VXSHUFLHV VLJQLFDURQ HO 24%, 46% y 20% de las reas totales de cada uno de esos cultivos, respectivamente. Tambin se sembraron, aunque en reas muy pequeas, variedades transgnicas de alfalfa, papaya, zapallo, lamo, clavel y remolacha azucarera. Con respecto a las caractersticas introduciGDV HO GH OD VXSHUFLH WRWDO GH FXOWLYRV *0 se sembr con cultivos tolerantes a herbicida
Figura. 1. UHD FXOWLYDGD FRQ FXOWLYRV *0 HQ por pas, sobre 125 millones de hectreas. Otros: 8UXJXD\ %ROLYLD )LOLSLQDV $XVWUDOLD 0p[LFR (VSDa, Chile, Colombia, Honduras, Burkina Faso, Repblica Checa, Rumania, Portugal, Alemania, Polonia, Eslovaquia, Egipto. Fuente: ISAAA.
VRMD PDt] DOJRGyQ FDQROD \ DOIDOID HO con cultivos resistentes a insectos-Bt (maz y algodn), y el 22% con cultivos que contenan ambas caractersticas acumuladas por cruzamiento convencional (maz y algodn). Tambin se sembraron cultivos resistentes a virus SDSD\D \ ]DSDOOR DXQTXH HQ VXSHUFLHV PXcho menores. Los cultivos transgnicos en Argentina En 2008 Argentina se mantuvo en el segundo lugar en la lista de pases productores de transgnicos, sembrando en la campaa 2008/2009 una proporcin mayor de variedades transgnicas que en la campaa anterior (Fig. 1). Efectivamente, casi el 100% de la suSHUFLH GH VRMD IXH VHPEUDGD FRQ VRMD WROHUDQte al herbicida glifosato, mientras que el maz transgnico ocup el 83% del rea destinada a maz (comparado con el 74% en 2007/08) y HO DOJRGyQ JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGR RFXSy HO 94% del rea total del cultivo (comparado con el 90% en 2007/08) (Fig. 2). Cultivos tolerantes a glifosato El crecimiento de las malezas disminuye drsticamente el rendimiento y la calidad de
Tabla 1: Adopcin de cultivos transgnicos en 2008, por pas. Fuente: ISAAA. * Slo para produccin se semillas
Pas EEUU Argentina Brasil Canad India China Paraguay Sudfrica Uruguay Bolivia Filipinas Australia Espaa Mxico Colombia Chile* Honduras Portugal Alemania Rumania Polonia Burkina Faso Egipto Cultivos GM Soja, algodn, maz, canola, alfalfa, papaya, zapallo, remolacha azucarera Soja, algodn, maz Soja, algodn, maz Maz, soja, canola, remolacha azucarera Algodn (Bt) Algodn, tomate, papaya, lamo, petunia, pimiento Soja Algodn, maz, soja Maz, soja Soja Maiz Algodn, canola, clavel Maz Algodn, soja Algodn, clavel Maz, soja, canola Maz Maz Maz Maz Maz Algodn Maz
Rep. Checa Maz
Eslovaquia Maz
ORV FXOWLYRV 0XFKRV KHUELFLGDV VLUYHQ SDUD XQ GHWHUPLQDGR WLSR GH PDOH]DV \ VXHOHQ GHMDU UHsiduos que permanecen en el suelo por aos. El empleo de cultivos tolerantes a herbicidas resuelve estos problemas, ya que estos cultivos son tolerantes a los herbicidas glifosato o glufosinato, ambos de amplio espectro (es decir, eliminan a casi todas las plantas, excepto aquellas tolerantes a dichos herbicidas) y de menor efecto residual que los herbicidas tradiFLRQDOHV $GHPiV HO SURGXFWRU VH EHQHFLD HQ gran medida porque con puede usar mtodos de labranza ms conservacionistas, como la siembra directa, que ayuda a conservar el sueOR \ OD KXPHGDG VLPSOLFD HO PDQHMR \ UHGXFH los costos de produccin.
En las plantas, la enzima 3-enolpiruvil-shiquimato-5-fosfato sintasa (EPSPS) es clave en las rutas metablicas que llevan a la produccin de los aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina y triptfano). Esta enzima slo est presente en plantas y microorganismos, tales como bacterias y hongos, y ausente en animales y humanos. En la dcada de 1970 se descubri que el glifosato inhiba a la enzima EPSPS, impidiendo la produccin de aminocidos aromticos. Los aminocidos son esenciales para la sntesis proteica y las protenas son necesarias para el crecimiento y las funciones vitales, por lo tanto, la aplicacin del glifosato lleva a la muerte de la planta. Las plantas tolerantes a glifosato tienen el gen epsps de
Fig. 2: (YROXFLyQ GH OD VXSHUFLH VHPEUDGD FRQ FXOWLYRV *0 HQ $UJHQWLQD
la cepa CP4 de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens. Como la enzima EPSPS producida en esta cepa bacteriana no es afectada por el glifosato, su introduccin en el genoma de las plantas las vuelve tolerantes al herbicida. Uno de los nombres comerciales del glifosato es Roundup, por eso, quienes desarrollaron esta tecnologa denominaron a los cultivos tolerantes al glifosato con el nombre de Roundup Ready, o RR. Como mtodo alternativo, tambin se obtuvo maz tolerante a glifosato por introduccin del JHQ GH OD (3636 GHO PDt] SHUR FRQ PRGLcaciones en su secuencia para que la enzima resulte resistente al herbicida. (Q $UJHQWLQD VH FXOWLYDQ VRMD PDt] \ DOJRGyQ WROHUDQWHV D JOLIRVDWR /D VRMD IXH HO SULPHU cultivo en el mercado argentino en incorporar una caracterstica a travs de transgnesis. En 1996 fueron inscriptas en el Registro Nacional de Propiedad de Cultivares las primeras varieGDGHV GH VRMD WROHUDQWH D JOLIRVDWR GH OD HPSUHsa Nidera y ya en la campaa 97/98 se sembraron 1.750.000 de hectreas. Hoy hay varias empresas semilleras que ofrecen al mercado XQ JUDQ Q~PHUR GH YDULHGDGHV GH VRMD FRQ esta caracterstica, encontrndose variedades de los grupos III a VIII, adaptadas a una amplia gama de regiones y necesidades. En 2008/09, OD VXSHUFLH GH VRMD WUDQVJpQLFD DVFHQGLy D millones de hectreas.
El maz tolerante a glifosato se aprob para su siembra comercial en 2004, y desde ese entonces su adopcin creci en forma sostenida, alcanzando en la campaa 2008/09 las 320 mil hectreas (el 10% del maz transgnico total). Tambin se han cultivado hbridos de maz que contienen dos caractersticas acumuladas: la resistencia a insectos y la tolerancia a glifosato (800 mil hectreas). La adopcin del algodn tolerante a glifosato tambin se increment en gran medida en los ltimos aos, alcanzando en la campaa 2008/09 las 210 mil hectreas (el 70% del algodn sembrado en Argentina). Cultivos resistentes a insectos El barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) es un insecto lepidptero que constituye la principal plaga de los cultivos de maz en nuestro pas. Sus larvas se alimentan de los WDOORV \ ODV KRMDV GHMDQGR JDOHUtDV TXH GDxDQ la planta, la quiebran, impiden el transporte de nutrientes y sustancias y son va de entrada para hongos, cuyas toxinas (micotoxinas) son muy peligrosas para nuestra salud. La denominacin Bt deriva de Bacillus thuringiensis, una bacteria que normalmente habita el suelo y cuyas esporas contienen protenas txicas para ciertos insectos. Estas protenas, denominadas Cry, se activan en el sistema digestivo del insecto y se adhieren a su epitelio intestinal, alterando el equilibrio os-
mtico del intestino. Esto provoca la parlisis GHO VLVWHPD GLJHVWLYR GHO LQVHFWR HO FXDO GHMD de alimentarse y muere a los pocos das. Las toxinas Cry son consideradas inocuas para PDPtIHURV SiMDURV H LQVHFWRV QREODQFR+D\ varias protenas Cry (y por lo tanto diferentes JHQHV FU\ \ FDGD XQD HV HVSHFtFD SDUD XQ tipo o grupo de insectos. El maz Bt es un maz transgnico o gentiFDPHQWH PRGLFDGR TXH SURGXFH HQ VXV WHMLGRV protenas Cry. As, cuando las larvas del barreQDGRU GHO WDOOR LQWHQWDQ DOLPHQWDUVH GH OD KRMD o del tallo del maz Bt, mueren. Actualmente, el 48% del maz cultivado en Argentina es Bt. Cabe mencionar que tambin se han cultivado en la campaa 2008/09 hbridos de maz que contienen dos caractersticas acumuladas: la resistencia a insectos y la tolerancia a glifosato (800 mil hectreas). /RV EHQHFLRV TXH SUHVHQWD HO PDt] %W VH centran en la posibilidad que tiene el agricultor de controlar las plagas sin emplear insecticidas, OR TXH FRQVWLWX\H DGHPiV XQ EHQHFLR GLUHFWR para el medio ambiente. En particular, el conWURO HFLHQWH GH ODV SODJDV SHUPLWH XQD Pi[LPD expresin del potencial de rendimiento, un maQHMR PiV H[LEOH GH ODV IHFKDV GH VLHPEUD \ FRVHFKD \ XQD PHMRU FDOLGDG GHO JUDQR 3RU VX parte, la reduccin en el nivel de micotoxinas HV XQ EHQHFLR SDUD OD VDOXG KXPDQD \ DQLPDO De la misma manera que el maz Bt, el algodn Bt resulta de la incorporacin de los genes Cry al genoma del algodn. As, el algodn Bt que se cultiva en la Argentina tambin es resistente a insectos lepidpteros y en particular, a la RUXJD GHO FDSXOOR OD RUXJD GH OD KRMD GHO DOJRdonero y la lagarta rosada. En 1998 se comercializ la primera variedad de algodn Bt en el pas. Los principales beneFLRV GHO XVR GH DOJRGyQ %W VRQ HO DXPHQWR HQ los rendimientos debido al control de insectos y la disminucin de costos y del impacto ambiental y para la salud debido al menor nmero de aplicaciones de insecticidas. En la campaa 2008/09 se sembraron unas 72.000 hectreas de algodn Bt en Argentina.
Lecturas y sitios recomendados:

-DPHV & *OREDO 6WDWXV RI &RPPHUFLDOL]HG %LRWHFK*0 &URSV ,6$$$ %ULHI 1 Servicio para la Adquisicin de Aplicaciones Agrobiotecnolgicas (ISAAA) www.isaaa.org &RQVHMR $UJHQWLQR SDUD OD ,QIRUPDFLyQ \ HO Desarrollo de la Biotecnologa, ArgenBio, www. argenbio.org Trigo E, Cap, E. 2006. Diez aos de cultivos JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV HQ OD $JULFXOWXUD Argentina. ArgenBio.
VII. CAPTULO 3 Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin

Durand, Valeria Qu es la percepcin? Segn el Diccionario de la Real Academia Espaola y la psicologa la percepcin es un proceso cognoscitivo, a travs del cual los suMHWRV FDSWDQ LQIRUPDFLyQ GHO PHGLR OD HODERUDQ e interpretan y forman con estos datos una representacin de la realidad de su entorno y/o de un tema en particular dentro de dicho entorno. (VWD UHSUHVHQWDFLyQ HV OR TXH HQ HO OHQJXDMH cotidiano se conoce como opinin o creencias que las personas tienen sobre determinados aspectos, hechos o temas de su realidad. 6L VH WUDVODGD HVWD GHQLFLyQ TXH EULQGD OD psicologa al terreno de la sociologa surgen los trminos percepcin pblica y opinin pblica. Si la psicologa explica este proceso cognoscitivo desde lo individual, la sociologa lo explica y estudia desde lo grupal. De esta manera, se llama percepcin pblica al proceso por el cual un grupo de personas interpreta y ve la realidad de su entorno, y en base a esta interpretacin forma determinadas creencias sobre los hechos y temas de su medio. El FRQMXQWR GH HVWDV SHUFHSFLRQHV GDQ RULJHQ D OD opinin pblica, entendida como las creencias y puntos de vista sostenidos por un pblico en cierto momento y sobre un tema en particular, que no necesariamente concuerdan entre s. Si bien existe un paralelo entre lo que la psicologa y la sociologa entienden por percepcin y opinin, la naturaleza de lo grupal hace que estos trminos tengan determinadas particularidades que sern detalladas a continuacin. Haciendo historia Antes del advenimiento de la Revolucin Industrial, las comunicaciones y la tecnologa, la sociedad estaba conformada por comunidades pequeas y aisladas. Los intereses de los integrantes de estas comunidades se limitaban a su pequea ciudad o vecindario y a temas que
los involucraban a todos: los impuestos, las tierras, los cdigos de convivencia. En este contexto, las personas se reunan en asambleas donde trataban los temas de inters comn o controversiales, haba personas destacadas que cumplan el papel de lderes (la persona de mayor de mayor edad, el patriarca) quienes dirigan el debate y luego se llegaba a un acuerdo. La sociedad moderna, por el contrario, es globalizada, es una sociedad de masas y no de pequeas comunidades, est hiper-comunicada, los intereses comunes son amplios, dada la diversidad cultural e ideolgica de los miembros que la integran y los problemas son QR VyOR ORFDOHV VLQR JOREDOHV (VWR GHQH D OD VRFLHGDG PRGHUQD FRPR FRPSOHMD PyYLO \ cambiante. Han aparecido nuevos factores y GLFXOWDGHV HQ HO SURFHVR GH HODERUDFLyQ GH opiniones y acuerdos sobre temas en comn. Por un lado, dada la diversidad cultural, cabe preguntarse qu se puede considerar de inters comn? Existen temas que sin duda son importantes para todos, como la salud y la seguridad; pero qu grado de importancia le da cada individuo o cun relevante es realmente un tema para todos? Lo que puede ser de sumo inters para un grupo, puede no serlo tanto para otro. Por otro lado, el individuo ya no puede cubrir el rea total de los intereses de la sociedad. Son demasiados los temas en el tapete y adems, no siempre son los mismos temas los que estn en el foco de la escena. Esto es clave para comprender que, dada esta imposibilidad de abarcar y conocer el rea total de los intereses, el individuo y los grupos que integran la sociedad moderna recurren a diversas fuentes de informacin y de interpretacin para crear una representacin de la realidad y formar una opinin. Es decir, los individuos delegan en otros la tarea de elaborar e interpretar la realidad de una determinada forma y, lo que HV PiV LPSRUWDQWH GHMDQ TXH HVRV RWURV KDEOHQ por ellos. Las instituciones y organizaciones en las cuales el hombre moderno ha depositado estas funciones son principalmente: los medios de comunicacin, los lderes de opinin (periodistas, celebridades) y las organizaciones sin QHV GH OXFUR JUXSRV DFWLYLVWDV RUJDQL]DFLRQHV QR JXEHUQDPHQWDOHV 21*V DVRFLDFLR-
nes de defensa del consumidor). La sociedad KD GHSRVLWDGR VX FRQDQ]D HQ HOORV D TXLHQHV HQ HVWH FDStWXOR OODPDUHPRV LQXHQFLDGRUHV por considerarlos crebles. Asimismo, estas personas e instituciones, concientes de este YRWR GH FRQDQ]D VH KDQ DSURSLDGR GH HVWH URO \ VH DXWRGHQHQ FRPR ORV YRFHURV GH OD RSLQLyQ S~EOLFD ORV TXH UHSUHVHQWDQ \ GHHQden los intereses comunes de la sociedad. Zonas grises No todo es blanco y negro en el mundo de la percepcin y la opinin pblica. La primer zona JULV TXH SRGHPRV LGHQWLFDU HVWi UHODFLRQDGD con el hecho de que el hombre no es slo un VHU UDFLRQDO \ REMHWLYR VLQR WDPELpQ HPRFLRQDO Por lo tanto, la opinin pblica no se forma H[FOXVLYDPHQWH HQ EDVH D MXLFLRV REMHWLYRV QL anlisis fros y desinteresados de un tema. Por el contrario, en la formacin de opinin tambin intervienen una serie de factores de ndole emocional de gran importancia: deseos, miedos, creencias religiosas, mitos, leyendas, FRVWXPEUHV HQWUH RWURV /RV LQXHQFLDGRUHV saben esto muy bien y lo utilizan de manera apropiada para lograr adhesin a sus causas. 6H PHQFLRQDUiQ HMHPSORV PiV DGHODQWH HQ este captulo). La segunda zona gris tiene que ver con una caracterstica mencionada en prrafos anteriores de la sociedad moderna: Es una sociedad de masas. Por lo tanto, su comportamiento es ms similar al comportamiento de las masas que al del individuo. La masa es irracional, difusa, son todos y a su vez nadie, es cambiante y est dispersa. La tercer y ltima zona gris est relacionada con los mtodos de medicin de la percepcin S~EOLFD ORV FXDOHV SXHGHQ DUURMDU UHVXOWDGRV poco precisos que brindan una interpretacin errnea de lo que el pblico cree o siente en relacin a un tema. Tener en cuenta estas zonas grises es clave para comprender determinadas manifestaciones de la percepcin pblica: cmo reacciona una sociedad ante cierto problema o tema de controversia. Cmo se mide la percepcin pblica Antes de pasar al tema central de este cap-
tulo: la percepcin pblica de la biotecnologa, brevemente se har referencia a los mtodos utilizados para medir la percepcin. Existen diversas metodologas, entre las cuales se destacan tres: Focus groups. Observaciones de campo. Sondeos o encuestas de opinin. Tomaremos el sondeo o encuesta de opinin, por ser uno de los mtodos ms utilizados, de tipo cuantitativo y, cuando bien diseado e implementado, con menor margen de error. La encuesta o sondeo de opinin consiste en tomar una muestra representativa de cierto segmento de la sociedad y, en forma peridica o en un momento determinado, se le hacen una serie de preguntas en relacin con el tema en cuestin. Dichas preguntas son de tipo cerradas. La periodicidad de este mtodo permite predecir la direccin o tendencia hacia donde va un determinado punto de vista o, cul es dicha tendencia en un momento y circunstancias determinadas. ,QFOXLU R GHQLU D ODV HQFXHVWDV GH RSLQLyQ FRPR XQD ]RQD JULV VLJQLFD TXH dicho mtodo, mal empleado, es imperfecto y puede llevar a conceptos errneos bsicamente porque: Los resultados se pueden ver afectados por la forma como es formulada la pregunta. La toma de la muestra puede ser incorrecta o no representativa. /DV SUHJXQWDV DELHUWDV \ VXEMHWLYDV VL VH incluyen, se prestan a interpretaciones y confusiones. (MHPSORV Se presentan a continuacin dos preguntas extradas de dos sondeos de opinin realizados en los aos 2003 y 2005. a) Est interesado en informarse acerca del consumo de alimentos transgnicos? (Consulta sobre Biotecnologa en Argentina 6$*3\$ b) El consumidor tiene derecho a decidir y VDEHU VL FRQVXPH R QR WUDQVJpQLFRV" *UHHQSHDFH 0p[LFR 6HSWLHPEUH
Ambas preguntas apuntan a recavar datos acerca del derecho a la informacin y el inters del consumidor por estar informado. La respuesta a la pregunta a marcara una tendencia hacia el querer recibir informacin o bien mostrara una tendencia hacia el desinters por el tema, si la mayora de las respuestas fuesen negativas. Por otra parte, la respuesta a la pregunta b no dara como resultado una tendencia sino una creencia o punto de vista VXEMHWLYR GH TXLHQ UHVSRQGH En relacin al derecho a la informacin y yendo al anlisis de las dos preguntas ms en profundidad, en primer lugar nadie pone en duda que todo individuo en una sociedad democrtica tiene derecho a estar informado, por lo cual la respuesta a b sera obvia. Extraamente alguien respondera de manera negativa, fuese cual fuese el tema en cuestin. Por otro lado, en ciertos aspectos pueden aparecer SDUDGRMDV (O ,),& &RQVHMR ,QWHUQDFLRQDO SDUD la Informacin sobre Alimentos de los Estados Unidos), present en 2008 en Argentina los resultados de una encuesta de percepcin cuantitativa realizada en 2007 en Estados Unidos FRQ HO Q GH VHJXLU OD WHQGHQFLD GH ODV DFWLWXdes de los consumidores hacia la biotecnologa en alimentos. Sorprendentemente, ante la pregunta Qu informacin desea Ud. que brinden las etiquetas de los alimentos?, 84% respondi que no saba y slo un 1% respondi que deseaba informacin sobre biotecnologa. El 15% restante de los encuestados que nombraron qu informacin deseaban obtener de ODV HWLTXHWDV SDUDGyMLFDPHQWH SLGLHURQ LQIRUmacin que ya aparece en las mismas. De lo expuesto es posible sacar algunas FRQFOXVLRQHV D PRGR GH HMHPSOR La pregunta apropiada tal vez no sera Deseara informacin sobre? ya que todos, si nos preguntan si deseamos contar con informacin para nuestra salud y alimentacin tenderamos a responder que s. La pregunta ms apropiada podra ser Qu informacin desea saber? e incluir opciones para que el HQWUHYLVWDGR HOLMD La incongruencia entre decir S, deseo informacin pero luego no saber responder qu informacin se desea o pedir
informacin que ya se brinda, demuestra que: algunos consumidores dicen querer informacin pero no tienen el hbito de leer las etiquetas de los alimentos, y que la opinin pblica es irracional y a veces no sigue el sentido comn. En conclusin, el sondeo de opinin es importante y sus resultados vlidos y tiles en muchos casos. De todos modos, es una herramienta que debe ser utilizada y diseada por profesionales expertos y sus resultados interSUHWDGRV EDMR HO FRQWH[WR \ PRPHQWR HQ TXH VH llev adelante la investigacin. La percepcin pblica: el caso de la biotecnologa +HFKD OD EUHYH LQWURGXFFLyQ D OD GHQLFLyQ de la percepcin pblica y cmo se conoce y estudia, se proceder a continuacin a analizar el caso en particular de la percepcin pblica de la biotecnologa, con especial foco en la situacin en Argentina. En ciertos sectores de la sociedad, existe una percepcin negativa, o al menos una miUDGD GHVFRQDGD KDFLD ORV SURGXFWRV GH OD ELRtecnologa, especialmente los cultivos transgnicos. Ante dicha situacin, surge la pregunta Cules son los factores que dieron origen a esta percepcin negativa? Los mismos pueden resumirse en tres puntos: Factores psicolgicos inherentes al ser humano. /D DFFLyQ GH ORV LQXHQFLDGRUHV Tendencias en la sociedad moderna. El hombre: ser racional y emocional Como ya se mencion en la primera parte, el hombre no acta slo en base a lo que le dicta la razn, sino tambin el corazn. A lo largo de la historia, el advenimiento de nuevas tecQRORJtDV WUDMR FRQVLJR PXFKRV EHQHFLRV SHUR tambin supuestos riesgos e inconvenientes, y GHVSHUWy WHPRUHV \ GHVFRQDQ]D .ODXV $Pmann, profesor emrito de la Universidad de Berna (Suiza) y experto en biotecnologa, en una visita a Argentina en diciembre de 2007 plante que el camino que usualmente recorre toda nueva tecnologa ni bien es conocida por la sociedad es:
1. 6RVSHFKDGHVFRQDQ]D 2. Rechazo absoluto y combate. 3. La tecnologa sigue su curso y se dePXHVWUDQ VXV EHQHFLRV \R LQRFXLGDG 4. Neutralidad/precaucin. 5. Aceptacin, incorporacin y uso. 'HVSXpV GH WRGR HV OyJLFR GHVFRQDU GH OR QXHYR GH OR TXH QR VH FRQRFH 3RU HMHPSOR HO rechazo de muchos en el siglo XIX a las vacunas, aceptadas hoy en da y utilizadas por toGRV SRQH GH PDQLHVWR TXH OD OOHJDGD GH XQD nueva tecnologa no siempre es bien recibida \ TXH VH GHVFRQItD GH VXV VXSXHVWRV EHQHcios. Cuenta la historia que los experimentos de Luis Pasteur conmocionaron en su poca a OD FRPXQLGDG FLHQWtFD TXH YHtD FRQ KRUURU OD introduccin deliberada de un microorganismo mortal en el cuerpo humano. Algunos seguidores de Pasteur se escandalizaron de su proceder y hasta abandonaron su laboratorio como protesta. Si pensamos en el caso de la biotecnologa, quizs podramos decir que nos encontramos entre los puntos 3 y 4 del camino que marca Klauss Ammann. Quedaron atrs las pocas de rechazo absoluto, motivadas por fuertes campaas de ciertas organizaciones activistas. La tecnologa ha seguido su curso, ciertos sectores, como la agricultura, la industria farmacutica y la alimenticia, la han aceptado y la estn utilizando, pero an queda un largo camino por recorrer en el terreno de lo que percibe y sabe el consumidor. Continuando con los factores de tipo psicolgicos que afectan la percepcin de la biotecnologa, adems del miedo a lo nuevo, las recientes teoras de comunicacin del riesgo ponen GH PDQLHVWR TXH ORV ULHVJRV DVRFLDGRV FRQ una percepcin errnea de la realidad son ms preocupantes y nocivos que los reales riesgos que estas nuevas tecnologas puedan implicar. Asimismo, est comprobado que ante la ecuaFLyQ ULHVJREHQHFLR VL HO KRPEUH SHUFLEH TXH HO EHQHFLR HV PD\RU R VXPDPHQWH UHOHYDQWH asume los riesgos implicados. De lo contrario, VL QR SHUFLEH EHQHFLRV FODURV R LQPHGLDWRV GD prioridad o mayor importancia al supuesto riesJR (O HMHPSOR PiV FODUR GH HVWR HV HO FRQVXmo de medicamentos. Si leemos un prospecto,
conocemos los riesgos o posibles contraindicaciones; sin embargo, consideramos el beQHFLR GH FXUDUQRV GHO GRORU HVSHFtFR FRPR prioritario y consumimos el medicamento de toGRV PRGRV <HQGR D XQ HMHPSOR PiV FRWLGLDQR FRQRFHPRV ORV ULHVJRV GH PDQHMDU XQ DXWR VLQ embargo, lo hacemos porque damos prioridad D ODV YHQWDMDV GH FRPRGLGDG UDSLGH] HQWUH otras. En el caso de la biotecnologa, algunos VHFWRUHV VLQWLHURQ FODUDPHQWH ORV EHQHFLRV GH la biotecnologa, como el caso de los productores, sin embargo, el consumidor comn no ORJUD YHU D~Q ORV EHQHFLRV GLUHFWRV GH HVWD tecnologa, por lo tanto, an desconfa. Asimismo, es ms fcil comprender por qu la biotecnologa aplicada al desarrollo de productos IDUPDFpXWLFRV JR]D GH PHMRU SUHQVD TXH OD biotecnologa aplicada al desarrollo de cultivos transgnicos. Por ltimo, se enumerarn algunos factores que sirven para comprender un poco ms por qu el hombre tiende a rechazar una nueva tecnologa: La inmediatez y disponibilidad de gran XMR GH LQIRUPDFLyQ TXH KR\ KD\ GLVSRQLble. La sobredosis de informacin puede generar confusin e incertidumbre. El historial del uso no tico o incorrecto de ciertas tecnologas y avances cientFRV La propia naturaleza humana que responde no slo a fundamentos racionales sino que tambin se mueve por emociones. /D GHVFRQDQ]D GH OD VRFLHGDG HQ VXV organismos reguladores y controladores. Los cambios sociales y econmicos, directos e indirectos, generados por toda nueva tecnologa que se perciben como buenos para algunos sectores y neutros R SHUMXGLFLDOHV SDUD RWURV El devenir de la ciencia (el estado del DUWH 3RU HMHPSOR DOJXQRV FRQVXPLGRres dicen Recin ahora se conoce que las grasas trans son nocivas. Qu ms se descubrir en unos aos? Y si estamos comiendo hoy algo que se cree inocuo y aos ms tarde se descubre que no lo es?
(O WUDEDMR GH ORV LQXHQFLDGRWHV La teora de las comunicaciones presenta HO FRQFHSWR GH LQXHQFLDGRU (O LQXHQFLDGRU es toda persona o institucin referente en una industria o especialidad, que es considerada fuente experta autorizada en dicha especialiGDG UHIHUHQWH GH OD PLVPD FRQDEOH \ YHUD] /DV FUHHQFLDV R DUPDFLRQHV GH XQ LQXHQFLDGRU SRU OR JHQHUDO QR VRQ SXHVWDV HQ WHOD GH MXLcio y tienen un efecto multiplicador en el sentido que otros las copian, adoptan o toman como PRGHOR (O LQXHQFLDGRU VXHOH VHU XQD SHUVRQD con amplias habilidades comunicativas, con un alto poder de convencimiento y argumentacin. En el mbito de la biotecnologa, hay diverVRV LQXHQFLDGRUHV TXH HQYtDQ LQIRUPDFLyQ al consumidor e intervienen en el proceso de percepcin de la biotecnologa. No actan en forma aislada, sino que conforman una red donde interactan entre s e intercambian inIRUPDFLyQ (Q OD JXUD VH PXHVWUD FXiOHV VRQ HVWRV LQXHQFLDGRUHV
Figura 1.
%DMR HO WpUPLQR FRPXQLGDG FLHQWtFD VH LQFOX\HQ ORV HTXLSRV GH WUDEDMR GH FHQWURV GH investigacin pblicos, las universidades, los mdicos, asociaciones mdicas, y dems asociaciones profesionales. El consumidor recibe informacin de muchos otros sectores: las empresas o la industria, a travs de la publicidad; el poder poltico, a travs de sus campaas; los educadores. Sin emEDUJR ORV YHUGDGHURV LQXHQFLDGRUHV VRQ ORV TXH DSDUHFHQ HQ OD JXUD SRUTXH Son grupos con alta credibilidad, la sociedad confa en ellos y simpatiza con
ellos. Adems, como se vio en la primeUD SDUWH HOORV VH DXWRGHQHQ FRPR ORV voceros de la opinin pblica, los que UHHMDQ OR TXH OD JHQWH TXLHUH (ODERUDQ VXV PHQVDMHV GH PDQHUD LQWHligente, apelando a lo emocional y al alto impacto. Son, en general, proactivos para comunicar. 7UDEDMDQ HQ FRQMXQWR ODV 21*V XWLOL]DQ a los medios para transmitir sus mensaMHV PRQWDQGR FDPSDxDV PHGLiWLFDV \ tienen como voceros a diversas celebriGDGHV (MHPSOR /D SDUWLFLSDFLyQ GH DFtores, cantantes y famosos en campaas GH 21*V Si bien, todos estos grupos tienen poder para que el pblico se adhiera o no a una causa, no todos tienen el mismo nivel de llegada o actan de la misma forma. Por WDO PRWLYR VX JUDGR GH LQXHQFLD YDUtD A continuacin se mencionarn brevemente algunas caractersticas de estos LQXHQFLDGRUHV \ HQ DOJXQRV FDVRV FLHUtas problemticas que afectan su grado o QLYHO GH LQXHQFLD La FRPXQLGDG FLHQWtFD PDQHMD JUDQ cantidad de informacin, pero suele encerrarse en s misma y ser poco proactiva con respecto a las actividades de divulgacin. Si bien en los ltimos aos aparecieron muchos proyectos de comunicacin (a travs del Canal Encuentro, SRU HMHPSOR OD $JHQFLD GH 1RWLFLDV &LHQWtFDV &\WD GHO ,QVWLWXWR /HORLU HQWUH RWURV ORV FLHQWtFRV HVWiQ SDUD WUDEDMDU HQ OD PHVDGD (V QHFHVDULR WUDGXFLU VXV PHQVDMHV D XQ OHQJXDMH DFFHVLEOH \ comprensible para que las personas no expertas comprendan el tema en cuesWLyQ $GHPiV HO FLHQWtFR KDEOD FRQ XQ OHQJXDMH REMHWLYR \ EDVDGR HQ HYLGHQFLD FLHQWtFD QR DSHOD D OR HPRFLRQDO QR busca adeptos a una causa. Por el contrario, las organizaciones activistas y ONGs tienen una fuerte relacin con los medios de comunicacin, D TXLHQHV OOHJDQ FRQ PHQVDMHV GH DOWR impacto emocional (demostraciones, piquetes, etc.) que los medios encuentran
atractivos o prensables. Asimismo, a travs de artculos, campaas publicitarias, propagandas con lderes de opinin \ SHUVRQDMHV IDPRVRV ORV FRQVXPLGRUHV reciben de estos grupos diversos menVDMHV $GHPiV D WUDYpV GH DFWLYLGDGHV de lobby y recursos legales tales como MXQWDU UPDV SHWLWRULRV FDGHQDV GH FRrreo electrnico, etc., los grupos opositores se relacionan con el poder poltico e LQWHQWDQ LQXLU VREUH ODV SROtWLFDV FLHQWtcas y tecnolgicas. Las celebridades o personajes famosos, se suman a causas relacionadas con el medio ambiente, la educacin y otros temas sociales. Al consumidor poco OH LPSRUWD TXH GLFKR SHUVRQDMH FRQR]FD o no el tema sobre el cual predica. Aqu HQWUD HQ MXHJR OR HPRFLRQDO SHVD PiV OD VLPSDWtD SRU HO SHUVRQDMH \ VX LPDJHQ que su formacin o conocimiento acadmico. En cuanto a los periodistas, reciben inIRUPDFLyQ GH WRGRV HVWRV LQXHQFLDGRUHV \ GLYXOJDQ R QR VXV PHQVDMHV VHJ~Q los ven prensables o no. Todo tema de controversia genera inters en la prensa, todo lo que diga un famoso, tambin. De este modo, los medios eligen los hechos que consideran noticia y los difunden. Usualmente, las demostraciones de alto impacto que realizan grupos activistas suelen tener cabida en la prensa y esWRV JUXSRV PDQWLHQHQ XQD XLGD UHODFLyQ con los medios. Un hecho importante a destacar es que en ciertos temas que despiertan controversia, los medios esFXGDGRV EDMR HO OHPD GH PRVWUDU ODV GRV caras presentan con igual importancia a XQ H[SHUWR TXH D XQ QR H[SHUWR (MHPSOR En un programa de TV emitido en 2007 por Amrica, se presentaron expertos en minera de una empresa del rubro y XQD MRYHQ DFWUL] TXLHQ UHSUHVHQWDED D XQD 21* SDUD GHEDWLU VREUH OD PLQHUtD qumica a cielo abierto. Sin duda, la presencia de la actriz, su imagen positiva y habilidades comunicacionales frente a cmara opacaron e hicieron poco efectivos los argumentos de los desconocidos expertos.
Afortunadamente en nuestro pas, cada vez VRQ PiV ORV SHULRGLVWDV FLHQWtFRV \ ORV GHSDUWDPHQWRV GH SUHQVD GH LQVWLWXWRV FLHQWtFRV \ universidades, con lo cual las actividades de GLYXOJDFLyQ FLHQWtFD KDQ FUHFLGR \ H[LVWH D~Q mucho por hacer en este terreno. El nivel de impacto de los mensajes de ORV LQXHQFLDGRUHV Se entiende por nivel de impacto la fuerza FRQ TXH HO PHQVDMH OOHJD DO S~EOLFR (V UHJLVtrado con inmediatez? La comunidad habla y FRPHQWD HVWH PHQVDMH R SDVD GHVDSHUFLELGR" Provoca alguna reaccin en el pblico (manifestacin de rechazo, apoyo, acuerdo, desacuerdo o indiferencia)? Se entiende por grado GH LQXHQFLD HO SRGHU GHO PHQVDMH SDUD PRGLFDU KiELWRV \ R FRVWXPEUHV GHO S~EOLFR TXH lo recibe. Es posible representar estos parmetros LPSDFWR H LQXHQFLD HQ UHODFLyQ FRQ ORV LQXHQFLDGRUHV \ RWURV FRPXQLFDGRUHV PHGLDQWH XQ JUiFR GRQGH HO HMH YHUWLFDO VLPEROL]D HO JUDGR GH LQXHQFLD H LPSDFWR \ HO HMH KRUL]RQWDO OD SURDFWLYLGDG GHO LQXHQFLDGRU R FRPXQLFDGRU es decir, su iniciativa para salir a contar su hisWRULD R WUDQVPLWLU VX PHQVDMH JXUD (O FXDdrante del ngulo izquierdo inferior est vaco, lo cual indica que ninguno de los grupos menFLRQDGRV HV LQDFWLYR QL HPLWH PHQVDMHV carentes de impacto. Se observa que la comuQLGDG FLHQWtFD HV XQ JUXSR GH JUDQ FUHGLELOLGDG H LQXHQFLD FXDGUDQWH L]TXLHUGR VXSHULRU HV GHFLU VXV PHQVDMHV VRQ DOWDPHQWH HVFXFKDdos y tenidos en cuenta. La sociedad cree en
Figura 2.
pacio a que todos opinen. ORV FLHQWtFRV DUJHQWLQRV \ ORV YDORUD \ DGPLUD Las pocas actividades de divulgacin De todos modos, las estrategias de comuniFLHQWtFD GH OD ELRWHFQRORJtD cacin que emplean son escasas y de ningn El impacto tipo de impacto emocional. Son divulgadores En base a lo expuesto en los prrafos anpero no buscan adeptos, no son activistas. Por otra parte, el pblico escucha con atencin los WHULRUHV UHH[LRQHPRV DFHUFD GHO WHPD GH OD PHQVDMHV GH ORV DFWLYLVWDV \ OD SUHQVD D TXLH- percepcin de la biotecnologa a travs del QHV SHUFLEHQ FRPR FRQDEOHV GHQXQFLDQWHV \ DQiOLVLV GH DOJXQRV HMHPSORV FRQFUHWRV El folleto siguiente (Folleto informativo del defensores de los derechos de los consumidores y del medio ambiente, por ello es que sus &RQVHMR SDUD OD ,QIRUPDFLyQ GH OD %LRWHFQRORPHQVDMHV WLHQHQ XQ DOWR LPSDFWR HQ OD VRFLHGDG ga en Brasil www.cbi.org.br \ HO SDQHWR GH OD (cuadrante derecho superior). Por ltimo, el GHUHFKD JXUD DPERV EUHJDQ SRU HO GHUHgrupo comprendido por las empresas, el sector agrcola incluyendo la prensa especializada, el poder poltico y los organismos reguladores pueden ser proactivos en cuanto a sus estrategias de comunicacin y se acercan al pblico de inters que quieren contactar utilizando diferentes medios: conferencias y comunicados de prensa, publicidad, propaganda, campaas de comunicacin, entre otros. Asimismo, sus menVDMHV SXHGHQ SDVDU GHVDSHUFLELGRV R no producir impacto alguno, dado que el ndice de credibilidad de alguno de HVWRV JUXSRV HV EDMR R SRUTXH HO S~EOLco al que se dirigen es reducido o con Figura 3. LQWHUHVHV HVSHFtFRV \ QR DSXQWDQ DO pblico en general, como es el caso de la prensa rural. Cabe mencionar que la imagen cho a la informacin. Cul cree el lector que o credibilidad de los organismos regulatorios tiene mayor impacto en el pblico? Qu menHV YDULDEOH HQ ORV GLIHUHQWHV SDtVHV 3RU HMHP- VDMHV WUDQVPLWHQ" plo, los norteamericanos confan en sus sistemas de regulacin y control, pero los europeos, Tendencias en la sociedad moderna: GHELGR D FDVRV KLVWyULFRV FRPR HO GHO 0DO GH RWURV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ OD la Vaca Loca, confan menos. En los pases en percepcin de la biotecnologa desarrollo la gente no confa en general en las +D\ RWURV IDFWRUHV TXH WDPELpQ LQX\HQ HQ instituciones polticas y de control, y ante estas la aceptacin o rechazo de ciertas tecnologas, FLUFXQVWDQFLDV ORV PHQVDMHV GH HVWRV RUJDQLV- DOLPHQWRV R DYDQFHV FLHQWtFRV \ OD ELRWHFQRmos pierden fuerza. ORJtD WDPELpQ VH YH LQXHQFLDGD SRU HOORV 6H De lo expuesto anteriormente sobre el accio- GHQRPLQDUi HVWH ~OWLPR JUXSR GH IDFWRUHV EDMR QDU GH ORV LQXHQFLDGRUHV HV VLPSOH GHGXFLU el nombre de tendencias o modas, es decir, que la mala imagen de la biotecnologa, espe- usos, gustos, costumbres que se imponen cialmente de la biotecnologa agrcola, surge de: en un determinado momento, logran muchos El xito de las campaas de las organi- adeptos y con el correr del tiempo pueden perzaciones activistas. durar, desaparecer o perder fuerza. /RV PHQVDMHV GH WLSR HPRFLRQDOHV TXH Estas tendencias son las siguientes: ellos han sabido transmitir. La moda, la industria de la belleza y las El accionar de la prensa que ha dado escelebridades promueven el cuidado del
medioambiente. La tendencia de volver a las races o lo natural es pregonada por ciertos grupos y asociaciones. La belleza y lo natural van de la mano. Las empresas deben ser socialmente responsables.
Existe una tendencia actual a que muchas de las empresas y marcas del mundo de la moda y los cosmticos traten de asociar su imagen al concepto del cuidado del medio ambiente y la solidaridad. De esta forma, transmiten mensaMHV WDOHV FRPR QR DO XVR GH SURGXFWRV TXtPLFRV HQ ODV EUDV QR D OD PDQLSXODFLyQ QR a la explotacin de campesinos para sembrar algodn, no a la matanza de animales para hacer carteras, etc.. La palabra de moda es sustentable. &RQ PHQVDMHV FRPR pVWRV ODV HPSUHVDV desarrollan Campaas de Responsabilidad Social Corporativa o Empresaria que consisten en realizar actividades al servicio de la comunidad relacionadas con la industria en que la empresa se desempea. Usualmente estas campaas tienen que ver con la educacin, el medioambiente y la salud. Por ltimo, existe una tendencia que en este captulo denominamos vuelta a las races o vuelta a lo natural. Existen grupos y asociaciones que pregonan el rechazo a las tecnologas, al confort de la sociedad moderna, y al consumo; y bregan por volver a las races. 6RQ HMHPSORV GH HVWR HO PRYLPLHQWR OODPDGR 3HUPDFXOWXUD GHQLGR VHJ~Q VX SiJLQD web de la siguiente forma: Permacultura es produFLU DOLPHQWRV VLQ WUDEDMDU OD WLHUUD QR FRPSUDU electricidad, agua, gas, no generar basura, soluciones regionales, la armona en el plano material. Este modo de vida que sus seguidoUHV GHQHQ FRPR VDOXGDEOH SOHQR \ DUPRQLRso con el planeta se desarrolla en las llamadas eco villas situadas en diferentes puntos del mundo, inclusive en Argentina. Principalmente, rechazan la agricultura convencional. Algunas celebridades y marcas tambin bregan por la vuelta a lo natural. Es comn escuchar hoy que actrices y modelos son, por HMHPSOR YHJHWDULDQDV OR FXDO LQPHGLDWDPHQWH asocia en el imaginario del consumidor los con-
ceptos vegetariano natural = belleza perfecWD 9HDPRV D FRQWLQXDFLyQ XQ HMHPSOR GH OD LQGXVWULD GH OD FRVPpWLFD JXUD VH QRWDUiQ en l los conceptos de natural, sustentable y GH YXHOWD D ODV UDtFHV (Q EDVH D HVWRV HMHPplos, se aprecia cmo se interrelacionan los conceptos de natural, sustentable, belleza, espritu, salud como opuesto a tecnologa, consumo, negocio, capitalismo, manipulacin y maltrato del medioambiente. A estos factores se debe sumar un concepto que especialmente afecta a la percepcin de
Figura 4.
la biotecnologa y es el hecho de entender a la biotecnologa como un negocio. Las organizaciones activistas han hecho importantes campaas y de hecho ste es el argumento que continan esgrimiendo, denunciando que OD PDQLSXODFLyQ JHQpWLFD QR WLHQH RWUR Q PiV que generar ganancias para la empresa que desarrolla el transgnico. La sociedad parece simpatizar con esta idea, sin embargo, castiga a la agrobiotecnologa como negocio pero no a la biotecnologa aplicada al desarrollo de medicamentos, que tambin es un negocio para la industria farmacutica. Asimismo, en la pelea S~EOLFR SULYDGR HO FLHQWtFR TXH WUDEDMD SDUD el sector pblico es un hroe para los argentiQRV PLHQWUDV TXH HO FLHQWtFR TXH WUDEDMD SDUD la industria goza de menor prestigio. Nuevamente se percibe ante esto la irracionalidad de OD RSLQLyQ S~EOLFD \ OD FRQMXJDFLyQ GH GLYHUVRV LQWHUHVHV TXH YDQ PiV DOOi GH OR FLHQWtFR
/D VLJXLHQWH LOXVWUDFLyQ \ OD FDULFDWXUD JXUD 5) que fueron publicadas en el Diario La Nacin en noviembre de 2005 para ilustrar una nota sobre ingeniera gentica, muestran el concepto La biotecnologa es un negocio.
(LQVHOH $UWKXU 7KH *DS EHWZHHQ 6FLHQFH and Perception: The Case of Plant Biotechnology in Europe. Adv. Springer, Verlag, Berlin. International Food Information Council, ZZZLF org. 0F+XJKHQ $ODQ 3XEOLF 3HUFHSWLRQV RI biotechnology. University of California, Riverside, CA, USA. 5LGQHU (GJDUGR *DPEHUDOH 0DUtD &ULVWLQD %XUDFKLN 0RLVpV /HPD 0DUWtQ 5XELQVWHLQ &ODUD /HYLWXV *DEULHOD $OLPHQWRV WUDQVJpQLFRV PLWRV \ UHDOLGDGHV HGLFLyQ Buenos Aires: Nutricin y Salud. 6$*3\$ www.sagpya.mecon.gov.ar. Young, K y otros. 1986. La opinin pblica y la SURSDJDQGD 3DLGRV 6WXGLR 0pMLFR
Figura 5.
Conclusiones La aceptacin o rechazo de una tecnologa por parte de la sociedad puede determinar su xito o su fracaso, la introduccin de algo nuevo siempre genera debate y las campaas de informacin son fundamentales. La divulgacin FLHQWtFD REMHWLYD VHULD \ VLQ WLQWH HPRFLRQDO es una herramienta muy til para desenterrar mitos e interrogantes. La sociedad necesita inIRUPDFLyQ YHUD] \ GH EDVH FLHQWtFD OD LQIRUmacin y la educacin son la clave.
Auspicios
ArgenBio es el Consejo Argentino para la Informacin y Desarrollo de la Biotecnologa. Es una organizacin sin fines de lucro que tiene como misin divulgar informacin sobre la biotecnologa, contribuyendo a su comprensin a travs de la educacin y estimulando su desarrollo. Consideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnologa y dirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro cubre una necesidad importante ya que aporta informacin completa y actualizada sobre las tecnologas de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita por especialistas y en idioma espaol. Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarn en este libro una excelente fuente de informacin. Para conocer ms sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org
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86 100 121 136 146 157 170 183

Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad

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211 217 229 243 259 271 283

3DUWH ,,, 0pWRGRV SDUD DFHOHUDU SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR H LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO

297 311 325 339

Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma

353 363 369

Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetal

379 389 403 421

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435 447 457

467 481 495 507 519 529 539 545 559

Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa

571 583 595 603 613 621

Parte VII: Biotecnologa y sociedad

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LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)

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PARTE I Herramientas bsicas

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I - CAPTULO 1 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales

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Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.

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I - CAPTULO 3 La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales

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