Conceptos generales de Biologa Molecular. Extraccin de DNA y Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Olga Redondo Gonzlez MIR 3 Anlisis Clnicos Hospital Universitario de Guadalajara, 25 abril 2007

Conceptos bsicos: estructura del DNA Tipo de muestra Obtencin de la muestra Caractersticas de la muestra: Pureza/ Concentracin Amplificacin de fragmentos de DNA mediante Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) Anlisis e identificacin de fragmentos:
Electroforesis Enzimas de Restriccin Hibridacin Secuenciacin

Objetivos

Etapas principales del desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante

1869 1944 1953 1957 1959 1961 1962 1966 1967 1975 Miescher. Primer aislamiento del DNA Abery. El DNA y no la protena, contiene la informacin gentica Watson y Crick. Modelo de doble hlice del DNA Kornberg. DNA polimerasa I Severo Ochoa. Polinucietido-fosforilasa, sntesis de ARN Marmur y Doty. Renaturalizacin del DNA, especificidad e hibridacin de los cidos nucleicos Alber, Nathans y H. Smith. Nucleasas de restriccin Nirenberg, Ochoa y Khorana. Cdigo gentico Geller. DNA ligasa Southern. Hibridacin y transferencia sobre gel, para la deteccin de secuencias especficas de DNA

1972-73 Boyer, Cohen, Berg. Tcnicas de clonaje del DNA

1975-77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert. Mtodos rpidos de secuenciacin del DNA 1985 Mullis y cols. PCR Mullis y cols. PCR

En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de la doble hlice para la estructura del DNA, basados en los resultados de los rayos X de Franklin y Wilkins.

La Real Academia de las Ciencias de Suecia concede el Premio Nobel en Qumica 1993, a Kary B. Mullis, USA, por su invento del mtodo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Estructura del DNA

Ncleo de la clula eucariota Cromosoma Enrollamiento de la cromatina 5 3

0.34 nm (2-desoxiD-rribosa)

3.4 nm

Doble hlice y Fibra de cromatina 2 nm 3 5

Tipo de muestra
Caractersticas de la muestra: DNA = huella gentica
1 mg de DNA = 150.000 clulas 6.6 pg de DNA/clula

ESTABILIDAD MUTABILIDAD
Evolucin especies Patologas

De dnde se obtiene la muestra? De cualquier tipo de clula nucleada: Sangre Tejidos Clulas bucales Races de pelo Semen Vellosidades coriales Lquidos biolgicos

Obtencin de la muestra
Sangre + Solucin hipotnica Tejido + Homogeneizador + 300 l Buffer de Extraccin (SDS al PELLET 10% P/V) + 15 l Proteinasa K
Incubar 1 hora a 55C Inactivar 10a 98C

cidos Nucleicos Protenas Lpidos, Protenas

Fase Acuosa

Fase Orgnica

Extraccin Fenol: CH3Cl (1:1)

Centrifugacin

Fase acuosa Precipitacin: 0.1 V AcNa 0.3M + 2.5 V Etanol

Precauciones: Sensibilidad al cizallamiento Precauciones Ojo con las DNAsas!

Incubar 1 h a 70C 24 h a -20C

Resuspender pellet en 30 l de solucin amortiguadora de TE.

Agitacin suave 37C, 2h.
SDS= dodecil sulfato de sodio TE= Tris 2 mol/L, EDTA 0.25 mol/L pH 7.5

Caractersticas de la muestra
Concentracin:
Espectrofotometra
1 Unidad de Absorbancia a 260 nm = 50 g/ml de doble hebra de DNA 40 g/ml de hebra sencilla de DNA o RNA.
[ DNA ] = A 260 * 50g * dilucin

Fluorometra

Pureza:
2.2 A260/ A280 1.8

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1985, K. Mullis y cols.

Para qu sirve?:
1) Identifica el fragmento de DNA que nos interesa 2) Genera in vitro grandes cantidades de ese fragmento a partir de una cantidad mnima del mismo

En qu se fundamenta?: mimetiza el proceso de replicacin que tiene lugar in vivo

1) Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse por calor/fro 2) Propiedad de las polimerasas de reparar el DNA que se fragmenta, aadiendo bases complementarias sobre la hebra sencilla, siempre y cuando se encuentren un fragmento de doble cadena

Doble hebra de DNA diana

Esquema de un ciclo de PCR convencional

T (C) 100

Ciclo 1
Desnaturalizacin 95C

Ciclo 2

Ciclo 3

Programa de PCR
Sntesis 70C

80

60 Anillamiento 50-60C Tiempo Primer ciclo

Segundo ciclo

Tercer ciclo

Termociclador

n=20-50 ciclos

Electroforesis Electroforesis

Enzimas de restriccin

Hibridacin

Secuenciacin

Electroforesis (EF)
cidos nucleicos: molculas polianinicas uniformemente cargadas que pueden migrar en un campo elctrico. Geles:
poliacrilamida fragmentos < 500 pb; agarosa (fragmentos 200 pb-50Kb). EF en gel de campo pulsante (agarosa al 1%).

Visualizacin: colorante bromuro de etidio, marcaje radiactivo (32P). Identificacin fragmentos de DNA por tamao:
Virus/ bacterias Deleciones

700-800 pb 400-500 pb

Transiluminador

Marcadores de peso molecular

Aparato de electroforesis horizontal

Electroforesis

Enzimasde Enzimas de restriccin restriccin

Hibridacin

Secuenciacin

Enzimas de restriccin
In vivo
Reconocen y cortan el DNA de doble hlice en sitios especficos (secuencias de reconocimiento) endonucleasas. Origen bacteriano: supervivencia a lisis por fagos (no existente en eucariotas).

In vitro

Localizan secuencias mutadas dentro del genoma.

Secuencias de reconocimiento de algunos enzimas de restriccin

Extremos cohesivos 5

Extremos cohesivos 3

Extremos romos

Secuencias de bases palindrmicas, 4-6 pb

: enlaces fosfodister hidrolizados por el enzima de restriccin (sitio de corte) N: cualquier base

M1 DNA normal
400 pb

M2 DNA mutado -ACCGTG-TGGCACEl enzima de restriccin no reconoce la secuencia

-ACCATG-TGGTAC-

100 pb

300 pb

400 pb

400 pb 300 pb

WM

M1

M2

100 pb

Electroforesis

Enzimas de restriccin

Hibridacin Hibridacin

Secuenciacin

Hibridacin molecular
Fundamento: Apareamiento de dos secuencias
nucleotdicas por complementariedad de bases C-G y A-T

- Reconocimiento de secuencias diana por apareamiento con secuencias conocidas (SONDAS).

Utilidad:

Deteccin:
Radioactiva (32P) Fluorescente (fluorocromo) Quimioluminiscente (luminol)

Tipos: Northern, Southern y Western blot.

Electroforesis

Enzimas de restriccin

Hibridacin

Secuenciacin Secuenciacin

Identificacin completa de la secuencia del fragmento amplificado

Electroforesis

Enzimas de restriccin

Hibridacin

Secuenciacin

Lo logramos Crick!!! Cmo te parece que nos qued el modelo del ADN? En 1962, Watson, Crick y Wilkins, recibieron el Premio Nobel por su descubrimiento

Elemental mi querido Watson, elemental!! Nos qued como una doble hlice!!!

Muchas gracias por vuestra atencin!!