As inmeras modificaes que esto sendo feitas em alguns dos milhares de genes de camundongos j oferecem uma lista de centenas

de animais knockouts ou transgnicos, disposio de cientistas de todo o mundo.

Aron Jurkiewicz

Diretor Geral do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) e Professor Titular de Farmacologia da EPM/UNIFESP
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A maioria dos genes humanos parece ter uma verso equivalente em outros animais, o que torna possvel obter novos e melhores conhecimentos sobre a fisiologia, farmacologia e enfermidades humanas usando, por exemplo, camundongos modificados geneticamente. Estima-se que, somente no ano passado, foram criados e utilizados 25 milhes de camundongos em todo o mundo, destinados a pesquisas em biomedicina, prevendo-se um aumento de 10% a 20% por ano, na primeira dcada do novo milnio (Malakoff, 2000). Parte desses camundongos pertence ao grupo dos animais geneticamente modificados (AnGMs ). As inmeras modificaes que esto sendo feitas em alguns dos milhares de genes de

Figura 1 Caixa de passagem (pass-through) de ao inoxidvel, aberta, em um laboratrio de criao. Notar: 1- As duas portas internas abertas mostram o interior da caixa de passagem. 2- Gaiolas de camundongos no interior, para dar uma idia do espao disponvel; 3A parte interna das duas portas do lado oposto, fechadas, ao fundo. Essas portas externas esto travadas, enquanto as portas internas esto abertas. Fechando-se as portas internas, acende-se uma luz UV interna, por algum tempo, sendo que as portas interna e externa ficaro travadas durante esse perodo. 4- Painel de controle, em que a lmpada piloto vermelha est acesa, indicando que alguma porta est aberta. H um outro painel e uma lmpada na parede oposta, que no so mostrados. 5- Visor de vidro isolante trmico e acstico, que permite a observao do laboratrio a partir do corredor externo
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camundongos j oferecem uma lista de centenas de animais knockouts (ou seja, com gens deletados) ou transgnicos, disposio de cientistas de todo o mundo. H dois anos atrs, o catlogo de um dos produtores comerciais, os Laboratrios Jackson (1998), nos Estados Unidos, listava modelos de animais com deficincia ou com superexpresso de receptores de drogas (como adrenalina, angiotensina e insulina), de enzimas (como as produtoras de xido ntrico), de substncias endgenas (como interferon), entre inmeros outros modelos. Sob o ponto de vista econmico, o uso de AnGMs tem sido alvo de importantes anlises, crticas e especulaes. Apenas para exemplificar sua importncia econmica, sabe-se que a manuteno de duas a trs mil gaiolas de camundongos transgnicos custa anualmente de US$ 800.000,00 a US$ 1.000.000,00 (Vogel, 2000). Outros aspectos, como os relativos a direitos de patentes, tm gerado muitas discusses (Marshall, 2000) que, entretanto, fogem do objetivo do presente artigo. Pretendemos, neste artigo, discorrer sobre a biosseguranca em relao a AnGMs, quanto produo, manuteno e utilizao desses animais em laboratrio. Por que biossegurana para AnGMs ? Embora possamos antever inmeros benefcios em conseqncia do desenvolvimento e das pesquisas com animais geneticamente modificados, existem, pelo menos, trs tipos de risco que devem ser

evitados. Basicamente, podemos enumerar: 1) contaminao acidental do pesquisador ou do tratador; 2) liberao acidental de um AnGM potencialmente danoso; 3) contaminao de animais no-GM ou de outros An-GMs. Portanto, a biossegurana trata fundamentalmente de medidas que visam a controlar e evitar esses riscos. Nveis de biossegurana Os riscos podem variar de acordo com as caractersticas do AnGM, j que, obviamente, esses animais diferem entre si segundo o risco que poderiam oferecer. Dessa forma, os AnGMs so classificados em 4 nveis de biossegurana (tabela 1). Em resumo, os AnGMs so de nivel de biossegurana cada vez mais elevado, conforme o eventual risco de transmissibilidade de doenas (devido, por exemplo, incorporao de uma parte do genoma de um vrus que tenha sido utilizado na fabricao do AnGM ), de produo de substncias txicas; de sua susceptibilidade a infeces que no ocorrem na espcie equivalente no geneticamente modificada; ou da sua maior aptido de sobrevivncia em relao aos equivalentes no geneticamente modificados. Segundo a instruo normativa n. 12 da CTNBio, considerando os respectivos nveis de biossegurana, os AnGMs so classificados em 2 grandes grupos de risco: o grupo I (compreendendo AnGMs do nivel de biossegurana 1) e grupo de risco II (compreendendo AnGMs dos nveis de biossegurana 2, 3 e 4). Obviamente, as medidas de biossegurana variam de acordo com o grupo de risco e o respectivo nvel de biossegurana. Critrios e normas de biossegurana para AnGMs como evitar e controlar os riscos Os mecanismos ou procedimentos disponveis para controlar e evitar riscos foram por ns divididos arbitrariamente em, pelo menos, sete grupos distintos, a saber: 1) Estabelecimento de um sistema de controle e de credenciamento institucional, em nvel governamental; 2) Existncia de edificaes especiais e adequadas; 3) Uso de equipamentos e outros materiais apropriados;

Tabela 1 - Classificao dos animais geneticamente modificados (AnGMs) quanto ao nvel de biossegurana Nvel 1 Aqueles que, aps manipulao gentica, no tiverem alteradas as caractersticas de transmissibilidade de doenas. Podem conter genoma, mesmo que completo, de vrus que no leva a doenas infecciosas transmissveis Nvel 2 Aqueles que, passam a expressar substncias sabidamente txicas, para as quais existam formas de preveno ou tratamento. Aqueles que tiverem mais de 75% do genoma de vrus (da classe de risco 2) capaz de levar a doenas infecciosas transmissveis; e aqueles que passam a ser susceptveis a infeces que no ocorrem na espcie equivalente. Nvel 3 Aqueles que tiverem mais de 75% do genoma de vrus (da classe de risco 3) capazes de levar a doenas infecciosas transmissveis. Aqueles que passam a ser mais aptos sobrevivncia que os equivalentes no geneticamente modificados. Nvel 4 Aqueles que tiverem mais de 75% do genoma de vrus (da classe de risco 4) capazes de levar a doenas infecciosas transmissveis. Aqueles que passam a expressar substncias sabidamente txicas, para as quais no existam formas de preveno ou tratamento.

4) Participao de pessoal treinado; 5) Uso de sistemas de controle e vigilncia institucionais; 6) Outros mecanismos como controle sanitrio, gentico, nutricional e ambiental; 7) Outras atividades: fabricao de AnGMs, pesquisa , banco de embries, etc. Controle institucional e governamental Esse setor est bem estruturado em nosso pas e permite o trabalho com AnGMs sob um controle eficiente e sem grandes exigncias burocrticas. Em 5 de janeiro de 1995, o Brasil regulamentou a competncia da Comisso Tcnica de Biossegurana (CTNBio), atravs da Lei 8.974, que foi recentemente alterada pela Medida Provisria 2.137, de 28 de dezembro de 2000. Compete CTNBio, entre outras atribuies, o estabelecimento de normas tcnicas de biossegurana para atividades que envolvam Organismos Geneticamente Modificados (OGMs). A manipulao de AnGMs s pode ser realizada por instituies que possuam Certificados de Qualidade em Biossegurana (CQBs) e que tenham constitudo Comisses Internas de Biossegurana (CIBios), segundo a Instruo Normativa n. 1 da CTNBio. Essas instituies devem apresentar

relatrios anuais de suas atividades com OGMs e podem ser vistoriadas pela CTNBio. Pelas instrues normativas 12, 13 e 15 da CTNBio foram estabelecidos critrios para trabalhos em conteno com AnGMs (cujos detalhes veremos, em parte, abaixo), para importao de AnGMs e para trabalho com animais no-AnGMs, onde AnGMs so manipulados. Normas para trabalho em conteno com AnGMs Essas normas envolvem critrios operacionais, descrio de edificaes e laboratrios, equipamentos e outros materiais apropriados, cuidados com o pessoal que manipula os animais e sistemas de vigilncia e controles locais. Os critrios mnimos necessrios, mas no suficientes, so simples. Basicamente, os animais devem estar alojados em rea fsica separada, de fcil limpeza e munida de barreiras contra insetos e outros animais. O acesso s deve ser permitido a pessoal credenciado (tabela 2). A partir desses critrios mnimos, os biotrios e salas de experimentao so divididos em quatro nveis de biossegurana, de NB-A1 a NB-A4, que esto apresentados nas tabelas de 3 a 6. Para animais de nvel NB-A1, a nica exigncia adicional que o descarte de animais e outros materiais e a criao sejam feitos com
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Tabela 2 - Caractersticas mnimas necessrias, mas no suficientes, para que Biotrios e Salas de Experimentao possam ser usados para trabalhos com AnGMs (Instruo normativa n. 12, de 27/5/98) Elemento Porta principal Acesso ao biotrio Construo Animais Barreiras fsicas para insetos e outros animais Condio Sempre trancada Restrito a pessoas credenciadas Dever: a) facilitar a limpeza e a desinfeco b) Evitar acmulo de poeira Alojados em reas fisicamente separadas, se de diferentes espcies e no envolvidos em um mesmo experimento. Presentes em todas as reas que permitam ventilao

ladores para os animais, incinerador e alarmes. Finalmente, para NB-A4 as exigncias so ainda maiores (tabela 6). Outros controles: sanitrio, gentico, nutricional, ambiental Embora esses controles, bem como as outras atividades referidas abaixo, no se relacionem diretamente com biossegurana de AnGMs, fundamental que os biotrios tenham um sistema de controle sanitrio (para detectar a presena de ecto e de endoparasitas, e de infeces por microorganismos e vrus); gentico (para detectar eventuais mutaes ); nutricional (para garantir a qualidade dos alimentos e do animal); e ambiental (para controlar eventuais alteraes de temperatura, umidade e presena anormal de gases e vapores). Outras atividades: fabricao de AnGMs, pesquisa, banco de embries Entendemos que um biotrio moderno deva estar envolvido com pesquisa cientfica em todos os nveis, incluindo aquela relacionada com a fabricao de animais transgnicos. Outro setor de maior importncia deve ser o da criopreservao, que deve manter um banco de embries congelados, que podem servir de salvaguarda em caso de acidentes que levem extino de uma ou mais colnias. Referncias Bibliogrficas CTNBio MCT, Resoluo n. 03, de 30/10/1996 - aprova o estatuto nacional da Comisso tcnica Nacional de Biosegurana - CTNBio, Cadernos de Biossegurana 1 (CTNBio) - Legislao, p. 61, 2000. CTNBio MCT, Instruo Normativa n. 01, de 6/9/1996 - Dispe sobre o requerimento e a emisso do certificado de qualidade em biossegurana CQB e a instalao e o funcionamento das comisses internas de biossegurana - CIBio, Cadernos de Biossegurana 1 (CTNBio) - Legislao, p. 75, 2000. CTNBio MCT, Instruo Normativa n. 12, de 27/5/1998 - Normas para trabalho em conteno com animais geneticamente modificados, Cadernos de Biossegurana 1 (CTNBio) - Legis-

Tabela 3 - Caractersticas do Biotrio e Sala de experimentao NB-A1 (Adequados para trabalhos com AnGMs de Nvel de Biossegurana 1) Elemento Caractersticas mnimas descritas na tabela 2 Descarte de material proveniente de OGMs Manipulao Condio Presentes Feito de forma que evite seu uso como alimento de outros animais, salvo em condies especiais. Feita de forma que evite a liberao acidental do animal no meio ambiente.

Tabela 4 - Caractersticas do Biotrio e Sala de experimentao NB-A2 (Adequados para trabalhos com AnGMs de Nvel de Biossegurana 1 e 2) Elemento Condies exigidas para NB-A1 Normas de acesso para pessoas autorizadas, qualificadas e cientes dos riscos inerentes aos experimentos. Vacinao de pessoal contra agentes infecciosos usados nos experimentos Presena de ante-sala Condio Presentes Elaboradas pela CIBio, Quando apropriado.

Obrigatria, entre rea de circulao e rea de alojamento dos animais Material contaminado Acondicionados apropriadamente para desinfeco, que poder ser feita fora do biotrio Agulhas, seringas, ou instrumentos que Devem ser acondicionados em recipientes resistentes, at o possam ferir a pele. momento da descontaminao Obrigatrio Uso de mscara, gorro, luva e protetores para os ps, todos descontaminados.
maior rigor, para evitar a liberao no meio ambiente (tabela 3). Para NB-A2, alm das caractersticas anteriores, aumentam-se as exigncias quanto ao pessoal (vestimenta especial e eventual vacinao), edificao (ante-sala) e descarte (tabela 4). Embora no exigvel, recomendvel o uso de cmara de passagem de dupla porta (pass32 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

throughs). Essa cmara permite a sada de gaiolas e outros materiais usados (Figura 1). Para NB-A3, as exigncias so ainda maiores (tabela 5), destacando-se, basicamente, a obrigatoriedade de autoclave de dupla porta para a entrada de material e alimentos, presso de ar diferenciada nas salas e corredores, com detectores, microiso-

Tabela 5 - Caractersticas do Biotrio e Sala de experimentao NB-A3 (Adequados para trabalhos com AnGMs de Nvel de Biossegurana 1, 2 ou 3) Elemento Condies exigidas para NB-A2 Quatro reas distintas: (1) ante-sala, (2) sala de materiais, (3) sala de a-nimais, (4) sala de experimentao. Fluxo de ar Presso de ar Detector de alteraes de presso de ar Alojamento dos animais em microisoladores. Animais Material biolgico capaz de propagar o agente infeccioso Lquido efluente do biotrio (pias, ralos, etc) Pia e chuveiro acionveis sem o uso das mos. Ralos Autoclave de dupla porta Incinerador de animais Descontaminao de superfcies Procedimentos de emergncia (incluindo o uso de alarmes) em caso de acidentes. Coleta de amostras de soros dos usurios no incio dos experimentos. Condio Presentes Presentes No sentido de 1 para 4, com filtros esterilizantes na entrada e na sada de ar. No final, o ar deve ser jogado no meio externo. Sala dos animais e de experimentao com presso negativa em relao sala anterior. Presentes Obrigatrio Jamais podero deixar as salas apropriadas No poder deixar o biotrio sem descontaminao. Dever ser descontaminado antes de esgo-tamento sanitrio, em caixas de conteno. Presentes na ante-sala e na sala de materiais. Ausentes na sala de animais ou de experimentao. Ausentes na sala de animais ou de experimentao. Presente Presente. Diariamente Presentes Obrigatrio

Tabela 6 - Caractersticas do Biotrio e Sala de experimentao NB-A4 (Adequados para trabalhos com AnGMs de Nvel de Biossegurana 1, 2, 3 ou 4) Elemento Condies exigidas para NB-A3 Construo Usurio Condio Presentes Prdio isolado, patrulhado 24 horas por dia. Acesso por carto magntico ou digital. Registro obrigatrio do nome do usurio e do tempo de cada permanncia. Toda informao ser arquivada por tempo 5 vezes maior que o maior perodo de incubao das doenas a que esto expostos. Duas reas adicionais: 1) sala de troca de vestimenta, Presentes, com incinerao obrigatria dos animais antes com chuveiro central, armrios e pia; 2) sala de do descarte. necropsia com incinerador. Comunicao entre salas Dupla porta, abertura sem mos. Filtrao e exausto de ar Dupla barreira de filtragem, para caso de mal funcionamento de uma delas. Sistema de conteno de 100% do ar circulante, em Presente relao aos usurios Sistema automtico de alarme com travamento de Presente portas em caso de vasamentos de ar
lao, p. 195, 2000. CTNBio MCT, Instruo Normativa n. 13, de 29/5/1998 - Normas para importao de animais geneticamente modificados (AnGMs) para uso em trabalho em regime de conteno, Cadernos de Biossegurana 1 (CTNBio) Legislao, p. 207, 2000. CTNBio MCT, Instruo Normativa n. 15, de 8/7/1998 - Normas para trabalho em conteno com animais no geneticamente modificados, onde organismos geneticamente modificados so manipulados, Cadernos de Biossegurana 1 (CTNBio) - Legislao, 212, 2000. MALAKOFF, D. , The rise of the mouse, biomedicines model mammal, Science 288, 217-388, 2000 MARSHALL, E., A deluge of patents creates legal hassles for research, Science 288, 217-388, 2000 THE JACKSON LABORATORY, Induced mutant resource, Bar Harbour, ME, 1998. VOGEL, G., The mouse facility as a recruiting tool, Science 288, 217-388, 2000.
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