ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO BIOLOGA MOLECULAR III Nombre Katherine Campaa Fecha:2011-11-24

TEMA: DIVERSITY AND DYNAMICS OF PLANT GENOME SIZE: AN EXAMPLE OF POLYSOMATY FROM A CYTOGENETIC STUDY OF TAHITIAN VANILLA (VANILLA TAHITENSIS, ORCHIDACEAE) Originalmente Vanilla tahitensis J. W. Moore fue descrita como una especie de origen no-hibrido al encontrarse nicamente en la isla Polinesia, sin embargo, en la actualidad estudios genticos indican que es un hibrido entre Vanilla planifolia G. Jackson y Vanilla odorata C. Presl. Esta planta difiere principalmente de V. planifolia en las caractersticas de su grano, que desarrolla una intensa fragancia y por lo que es cultivada. Por otro lado, se ha reportado la complejidad de la citogentica en Vanilla spp. Muchos valores 2C, niveles de poliploida en este gnero no se encuentran claramente establecidos, adicionalmente se ha observado que presentan comportamiento mittico anormal y variacin en su nmero cromosmico, incluso Kausch y Horner (1984) han reportado la ocurrencia de endoreplicacin parcial somtica. Valores como el 2C son importantes para reconocer si comportamientos mitticos anormales se transmiten por reproduccin sexual, lo que constituye informacin fundamental en el mejoramiento gentico. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es establecer el nmero y organizacin cromosmica y la variacin del tamao del genoma para V. tahitensis usando bandeo CMA, FISH, y citometra de flujo, para lo cual se trabajo con 28 variedades de Vanilla tahitensis J. W. Moore, una variedad de Vanilla planifolia G. Jackson y un hibrido V. planifolia V. tahitensis (VxT).

La cantidad de ADN nuclear y su contenido de CT y AG fueron determinados en tejido de hojas de la especie estudiada y del estndar (Triticum aestivum cv. Chinese Spring) mediante citometra de flujo, siguiendo diferentes tcnicas. El valor 2C se calculo dividiendo la fluorescencia entre el estndar y el primer pico de Vanilla, el valor C se expres en Mbp usando el factor de conversin 1pg DNA=978 pg DNA. Anlisis repetidos y de amplio muestreo fueron esenciales para evitar supervisin, que ha producido datos errneos en citometra. Se determin el nmero de cromosomas en pices radicales pretratadas con colchicina, fijadas en etanol/actico (3/1) y teidas con Schiff. Mientras que en polen de brotes jvenes de flores se vio removido, fijado en etanol/a.actico (3/1 v/v), y sumergido en 1% de carmina actica, para determinar el numero cromosmico haploide. Adems el polen se tio con el reactivo de Alexander; tie rojo el polen normal y al abortado verde, para determinar la frecuencia de granos normales, y as estimar la viabilidad del polen. Mediante tincin con CMA se tio la heterocromatina rica en GC. Las sondas 18S 5.8S 26S rDNA y 5S se utilizaron para el anlisis con FISH. En las hojas se observ 5-6 rondas de endoreplicacin en Vanilla tahitensis o V. planifolia V. tahitensis. La endoreplicacin se observ parcial en V. tahitensis. Las razones marginales, es decir, la razn entre picos consecutivos, fueron diferentes a 2, es decir no se duplicaba completamente. Estos valores se mantuvieron constantes independientemente del mtodo usado y confirmada mediante una referencia interna (ncleo de tomate de 4C a 2C). La composicin media de bases fue 39.3% GC 40.2 %GC para Vanilla tahitensis y V. planifolia, respectivamente. En base al valor 2C en V. tahitensis se distinguieron tres grupos significativamente diferentes: diploides, triploides y tetraploides, y el diploide V. planifolia fue similar al diploide V. tahitensis. No todas las clulas de una sola yema radical presentaban el mismo nmero de cromosomas. Los cromosomas eran pequeos y similar morfologa. Los rangos fueron 22-31; 31-41 y 43-60 para diploides,

triploides y tetraploides en V. tahitensis. En V. planifolia fue 26-32 y 43-48 para V. planifolia V. tahitensis. Ciertas variedades presentaban un valor ms frecuente. En general los ms frecuentes fueron para diploides 24-28; para triploides 37-38 y para tetraploides 48-52. Sin embargo, para cada variedad de V. tahitensis, el numer cromosmico y el valor 2C concordaban. No se midi en triploides al ser estriles. Fue diferente de diploides y tetraploides. Diploides: n=15; v: 92.4%. Tetraploides: n=31; v= 93.6%. Dos bandas CMA (cromatina rica en G-C) fueron frecuentemente observadas en la variedad diploide. Tres bandas CMA en el triploide S88 y cuatro en el tetraploide H5-40. FISH se hizo en 5 variedades de V. tahitensis; 2 haploides, 1 triploide y 2 tetraploides, una variedad de V. planifolia y un hibrido V. planifolia V. tahitensis. Mediante FISH se identific dos sitios rDNA 18S 5.8S 26S en las variedades diploides Vanilla tahitensis, cuatro en las variedades tetraploides y 3 en la triploide. El hibrido presento 2 sitios dobles y dos simples. Adems el rDNA 5S no se observo en V. tahitensis o in V. planifolia, pero rDNA 18S 5.8S 26S si, este estaba localizado generalmente en posiciones telomricas. Se observo tambin que exista una variacin itra e interespecfica del nmero de genes y la posicin del 5S. El atribuir el estatus de holoploida a especies que en realidad presentaban endoreplicacin, podra explicar la mayora de valores de tamao genmico publicados. La endoreplicacin es el proceso de duplicacin endonuclear de los cromosomas sin que se d la segregacin y citoquinesis; adems es considerada el modo ms comn de poliploidizacion en plantas y presentndose en ms del 90% de las angiospermas. Se observa que es fenmeno es progresivo y parcial en V. tahitensis y V. planifolia, al no presentar sus razones marginales de replicacin iguales a 2, que se esperara si fuese una endoreplicacin total. Esta razn siempre diferente en cada ciclo. Al observarse que el fenmeno era parcial y progresivo, se simbolizo como P a la parte del genoma haploide que se replicaba y como F a la parte no replicada. En base a esto, se observ que la endoreplicacin segua la progresin 2C = 2F +2P, 2F + 4P, 2F + 8P, 2F + 16P, 2F + 32P. Se observa variacin interespecfica al analizar el nmero de cromosomas y la organizacin rDNA entre V. tahitensis y V. planifolia; que sin embargo tiene similares valores 2C. Estos reportes concuerdan con estudios de comparacin que indican que estas especies tienen diferentes ITS. En el anlisis de FISH que V. tahitensis no mostro la seal doble correspondiente al locus 18S 5.8S 26S rDNA de V. planifolia, sugirindose que no es hibrido de V. planifolia y V. odorata, sin embargo, esto se pudo haber dado por una reorganizacin cromosmica durante la hibridizacin de dos especies diferentes. Esta visible reorganizacin de los genes rDNA se explica por ms ciclos de meiosis al no ser hbridos de primera generacin. La endoreplicacin parcial, ha sido observada en plantas resultado de hibridacin entre especies, refutando una hiptesis inicial que la endoreplicacin parcial se reprime en la hibridacin. Adems ha demostrado ser fuente de todas las variedades de V. tahitensis. No se logro la estabilidad genmica tras reproduccin sexual. El estudio demuestra la gran complejidad del genoma de V. tahitensis al presentar poliploida, aneuplioda y endoreplicacin parcial somtica, cuyo conocimiento es importante para programas de mejoramiento de esta especie, ya que la hibridacin podra generar individuos infrtiles. COMENTARIO El nmero cromosmico, poliploida, valor 2C, etc., y fenmenos como la duplicacin endonuclear somtica representan parmetros fundamentales para programas de mejoramiento gentico, un ejemplo es que la poliploida y aneuploida estn relacionados con diversidad morfolgica entre variedades y especies.