Relatrio de Bioqumica

Distino de formas de uma Protena pelo seu Espectro de Absoro

Docente: Professor Rui Abreu

Ano Lectivo:2011/2012
Trabalho elaborado por: Cristina Caetano, n26093 David Pereira, n24814 Ricardo Pereira, n27515 Samuel Fernandes, n25812 Sara Pereira, n26940 Engenharia do Ambiente

Bragana, 29 de Maro de 2012

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ndice
Introduo .................................................................................................................................... 2 Objectivos ..................................................................................................................................... 4 mbito .......................................................................................................................................... 4 Parte Experimental ....................................................................................................................... 5 Resumo ......................................................................................................................................... 5 Material utilizado ......................................................................................................................... 7 Procedimento ............................................................................................................................... 8 Anlise de Resultados .................................................................................................................. 9 Discusso dos resultados ........................................................................................................... 11 Concluso .................................................................................................................................... 12 Bibliografia .................................................................................................................................. 13

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Introduo
A luz uma forma de energia radiante e, como tal, composta por diversos comprimentos de onda. A luz "branca", por exemplo, composta por todas as cores do arco-ris. Essas cores tm diferentes comprimentos de onda. O espectro de cores visveis pelo olho humano ocupa uma pequena poro do espectro

electromagntico (400-800 nm). Vrios tipos de molculas interagem ou absorvem tipos especficos de energia radiante do espectro electromagntico. Mesmo materiais que so considerados transparentes vista (ex: gua, vidro) absorvem energia na gama do ultra-violeta ou infravermelho. Quando a luz branca ilumina um objecto, h absoro por parte do objecto de uma ou mais cores, a que correspondem comprimentos de onda caractersticos. Os comprimentos de onda restantes que no so absorvidos pelo objecto (so transmitidos) formam no seu conjunto uma determinada cor, que a visvel ao olho humano. A espectroscopia apresenta-se como uma tcnica bastante til bioqumica porque vrios compostos de interesse bioqumico absorvem luz na regio do ultravioleta, do infravermelho e visvel. Do estudo da absoro dos vrios comprimentos de onda por uma determinada substncia, obtm-se o denominado espectro de absoro, caracterstico, em certas condies, para cada composto bioqumico.
Espectro de absoro da Hemoglobina

A hemoglobina uma protena funcional existente nos eritrcitos (glbulos vermelhos). Esta protena possui uma parte inorgnica denominada heme (um grupo prosttico, na qual o ferro elemento central), mas 96% globina (quatro cadeias polipeptdicas). O grupo heme responsvel pela cor e pela capacidade fixadora de oxignio, enquanto a globina se apresenta responsvel pela fixao de CO2. Quando a hemoglobina se combina com O2 (oxi-hemoglobina), a cor do sangue muda de vermelho escuro para claro, verificando-se, no espectro de absoro desta soluo, uma variao nos comprimentos de onda onde se verificam as absores mximas (desvio do espectro de absoro).
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Uma mudana no sentido contrrio verifica-se por desoxigenao - que, em laboratrio pode ser conseguida por adio de hidrossulfito de sdio, que liga e remove o O2. Esta a razo porque existe diferena entre a cor do sangue arterial e o sangue venoso. De referir ainda que tanto na hemoglobina desoxigenada (desoxihemoglobina) como na hemoglobina oxigenada (oxi-hemoglobina), o ferro constituinte do grupo heme est presente na forma ferrosa (Fe2+) e no h variao na sua valncia durante todo o processo de oxigenao e desoxigenao. Se o io ferroso, Fe2+, oxidado a io frrico, Fe3+, por meio de um agente oxidante como o ferrocianeto, forma-se meta-hemoglobina, molcula que no consegue combinar com o oxignio. A hemoglobina combina-se ainda com monxido de carbono, CO, com uma afinidade 200 vezes superior do oxignio, formando a chamada carboxihemoglobina. Nesta situao a quantidade de hemoglobina disponvel para transportar oxignio muito reduzida e facilmente pode causar a morte por privao de oxignio. Assim, a hemoglobina apresenta espectro de absoro varivel consoante a forma em que se encontra (tabela I), espectros esses com mximos de absoro caractersticos para cada substncia presente, podendo-se assim, detectar essas substncias.

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Objectivos
Compreender o processo de separao de protenas (hemoglobina). Compreender o funcionamento de um espectrofotmetro. Quantificao da hemoglobina. Quantificao da meta-hemoglobina.

mbito
O presente trabalho foi elaborado no mbito da Unidade Curricular Bioqumica, com o intuito de compreender a forma como a luz se comporta ao atravessar materiais com diferentes propriedades, bem como caracterizar distinguir e quantificar a absorvncia da OxiHemoglobina e da Meta-hemoglobina, atravs da sua medio com recurso a um espectrofotmetro e posterior elaborao de um grfico para a respectiva comparao de ambas as situaes.

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Desoxi-hemoglobina

Oxi-hemoglobina

Carboxi-hemoglobina

Meta-hemoglobina

Parte Experimental

Resumo
Este trabalho teve como como objectivo verificar o espectro de absoro mximo da Oxi-hemoglobina e da Meta-Hemoglobina e assinalar os picos de absoro mxima de Absoro comparando com os valores de referncia. A espectrofotometria o mtodo de anlise ptico mais usado nas investigaes biolgicas e fisico-qumicas. O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visvel. A gua absorve fortemente na regio do infravermelho. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas dependem das estruturas das molculas, e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma substncia, parte da energia absorvida: a energia radiante no pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substncias se deve a absoro de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. O instrumento usado na espectroscopia
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UV/VIS chamado de espectrofotmetro. Para se obter informao sobre a absoro de uma amostra, ela inserida no caminho ptico do aparelho. Ento, luz UV e/ou visvel em certo comprimento de onda (ou uma faixa de comprimentos de ondas) passada pela amostra. O espectrofotmetro mede o quanto de luz foi absorvida pela amostra. A intensidade da luz antes de passar pela amostra simbolizada por I0, e a intensidade da luz depois de passar pela amostra simbolizada por I. A transmitncia da amostra definida pela razo (I / I0), a qual normalmente expressa em percentagem de transmitncia (%T). A partir dessa informao, a absorbncia de ambos determinada para esse certo comprimento de onda ou como uma funo de uma faixa de comprimentos de onda. Os espectrofotmetros mais sofisticados normalmente fazem isso automaticamente. Existem dois tipos de espectrofotmetros: de feixe simples e de feixe duplo. Os espectrofotmetros so instrumentos de anlise que permitem: Seleccionar o comprimento de onda (lambda) da radiao adequado anlise de um determinado componente; Medir a intensidade I do feixe emergente que corresponde a um determinado feixe incidente I0, convertendo o sinal recebido no detector em medida de Absorvncia para o comprimento de onda da anlise. Determinar a concentrao de uma espcie em soluo a partir do grfico da variao de absorbncia (ou transmitncia) em funo da concentrao de vrias solues-padro. A preciso dos comprimentos de onda para anlise chamada de bandas de passagem, mais comum na ordem de 10nm. O espectro da anlise mais comum de 360nm a 1000nm para a faixa visvel. Apesar de, as amostras poderem ser slidas (ou mesmo gasosas), elas usualmente so lquidas. Uma cela transparente (ou seja, que no absorve radiao na faixa de comprimentos de onda usada), comummente chamada de cubeta, preenchida com a amostra lquida e inserida no espectrofotmetro. O caminho ptico L pela amostra ento a largura da cubeta. Espectrofotmetros mais simples (econmicos) usam cubetas com a forma cilndrica (tubos de ensaio), porm os mais sofisticados usam cubetas rectangulares, geralmente com uma largura de 1 cm. Para espectroscopia apenas no visvel, simples cubetas de vidro podem ser usadas, porm a espectroscopia no ultravioleta
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requer cubetas especiais feitas de um material que (ao contrrio do vidro) no absorva luz UV, como o quartzo. Um espectro ultravioleta-visvel essencialmente um grfico (ou plotagem) da absorbncia versus o comprimento de onda na faixa do ultravioleta e/ou visvel. Tal espectro pode facilmente ser produzido pelos espectrofotmetros mais sofisticados. O comprimento de onda frequentemente representado pelo smbolo. Da mesma forma, para uma dada substncia, um grfico psilon; vs. Pode ser feito ou usado se um j est disponvel. Para uma dada substncia, o comprimento de onda no qual ocorre o mximo de absoro chamado de max (lambda mximo).

Material utilizado

Material: Sangue heparinizado. Soluo de ferricianeto de potssio a 1%. 2 Tubos de ensaio. H2O destilada. Espectrofotmetro. Cuvettes para espectrofotmetro. Centrfuga de bancada. Micro seringa ou pipeta de Gilson. Caneta de acetato. Papel milimtrico

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Procedimento
1- Depositaram-se duas ou trs gotas de sangue heparinizado, colhido recentemente, no fundo de um tubo de ensaio e encheu-se at cerca de 1/5 do seu volume com gua destilada. Misturou-se o contedo do tubo, por inverso, e centrifugou-se a 3500 rpm durante 10 minutos. Retirando o sobrenadante para outro tubo de ensaio. Dilui-se, em seguida, com gua destilada, at obter uma Absorvncia inferior a 1.

2- Colocou-se a soluo de oxi-hemoglobina numa cubete do espectrofotmetro, fezse o auto zero do aparelho (utilizou-se gua destilada como branco), e realizou-se a leitura correspondente a cada um dos comprimentos de onda que constam no quadro anexo.

3- Adicionou-se uma gota de soluo de ferricianeto de potssio a 1% soluo de hemoglobina (transformao da oxi-hemoglobina em Meta-Hemoglobina).

Homogeneizou-se a soluo, fez-se o auto zero do aparelho (utilizou-se gua com uma gota de ferricianeto de potssio a 1% como branco) e realizou-se a leitura correspondente a cada um dos comprimentos de onda.

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Anlise de Resultados
Comprimento de Onda () 380 395 405 415 430 450 470 490 500 510 520 525 530 535 540 545 550 555 560 570 575 580 585 590 600 610 620 630 640 650 Oxi-hemoglobina (Absorvancia) 0,2890 0,5820 0,9880 1,3220 0,5800 0,1670 0,0860 0,0610 0,0550 0,0520 0,0610 0,0790 0,1040 0,1290 0,1420 0,1380 0,1670 0,0920 0,0830 0,1160 0,1490 0,1350 0,0760 0,0330 0,0070 0,0010 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Meta-Hemoglobina (Absorvancia) 0,774 1,14 1,245 1,043 0,475 0,154 0,131 0,145 0,152 0,146 0,133 0,126 0,12 0,116 0,111 0,105 0,098 0,091 0,086 0,083 0,084 0,082 0,078 0,079 0,079 0,079 0,085 0,089 0,084 0,068

Tabela 1 : Resultados obtidos, absorvncia Oxi-Hemoglobina e Meta-Hemoglobina.

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1.4

1.2

0.8

Oxi-hemoglobina Meta-Hemoglobina

0.6

0.4

0.2

0 380 405 430 470 500 520 530 540 550 560 575 585 600 620 640

Grfico 1: Curvas e picos de absorvncia Oxi-Hemoglobiana, Meta-Hemoglobina. O grfico a cima apresenta as corvas de absorvncia da Oxi-Hemoglobina e da Metahemoglobina, como era de esperar a Oxi-Hemoglobina tem uma curva de absorvncia superior da meta-hemoglobina e com picos de absorvncia mais acentuados.

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Discusso dos resultados

Neste trabalho foram exagerados alguns procedimentos, como as gotas de sangue na preparao para a centrifugadora, pois o que era esperado que o grupo de trabalho tomasse conhecimento do funcionamento do espectrofotmetro e tambm para que fosse bastante perceptvel os mximos de absoro, que na Oxi-hemoglobina, quer na Meta-Hemoglobina. De referir tambm que alguns dos valores podem no estar completamente correctos pois o procedimento de fazer o auto-zero do espectrofotmetro, pois conclui-se em conjunto com o Docente que a margem de erro seria mnima.

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Concluso
Este trabalho laboratorial/experimental correu bem. Pois conseguiu-se verificar os pontos mximos de absoro na Oxi-hemoglobina foram no comprimento de onda () 413; 441;577 nm, com maior pico no comprimento de onda () 413nm. Consegue-se tambm verificar os pontos mximos de absoro na Meta-hemoglobina que foram no comprimento de onda () 406; 500; 630 nm, com o seu maior pico no comprimento de onda () 406nm.

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Bibliografia
http://pt.wikipedia.org, dia 25-03-2013

Sebenta das aulas prticas fornecida pelo Docente da Cadeira

http://www.ebah.com.br, dia 27-03-2012

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