El receptor de andrgenos humano pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares La tecnologa del DNA recombinado descubre una variedad

de receptores nucleares La primera evidencia emprica de la existencia de los receptores nucleares se remonta a 1961, cuando Jensen y Jacobson descubrieron que el 17-estradiol marcado se acumulaba en los rganos sexuales y estimulaba el crecimiento uterino sin ser metabolizado, contraviniendo la hiptesis de accin de la hormona esterodica ms aceptada a mediados del siglo pasado. El hecho de que tanto tero como vagina concentraran y retuvieran el estradiol tritiado sugera la existencia de una molcula receptora implicada en la iniciacin las respuestas celulares asociadas al tratamiento con la hormona sinttica. A tal efecto, los autores emplearon U-11,100A (un antiestrgeno no esterodico que posteriormente se conocera con el nombre de nafoxidina) para demostrar que la sustancia que una estrgeno en el tero era un receptor verdadero implicado en la accin hormonal con una inhibicin progresiva del crecimiento uterino y de la unin de estradiol marcado al rgano al tratamiento con dosis crecientes de nafoxidina1. Posteriormente Toft y Gorski aislaron el receptor de estrgenos (ER) mediante ultracentrifugacin con gradiente de sacarosa. La tcnica fue adaptada para identificar pequeas diferencias en el tamao del receptor observndose que el receptor 8S tratado con cloruro potsico daba lugar en una subunidad 4S liberada de lo que ahora conocemos como protenas del choque trmino y otras chaperonas moleculares. Al administrar estradiol, el receptor 4S se transformaba en un complejo 5S considerado la forma activa. Esto explicaba el hecho que los complejos aislados del tero de animales tratados con estradiol tritiado presentaban un tamao de 5S mientras que los obtenidos a partir de extractos citoplasmticos eran 4S. El modelo resultante, que explicaba la accin de los estrgenos en dos etapas: 1) unin al receptor produciendo un cambio de conformacin que permita la dimerizacin y 2) la incorporacin al ncleo activando la transcripcin gnica, fue posteriormente propuesto y adaptado al resto de receptores nucleares descritos1,2. Sin embargo, no fue hasta principios de la dcada de los aos ochenta del siglo pasado, con el desarrollo de la tecnologa del DNA recombinado, varios grupos trabajaron en la clonacin de distintos receptores nucleares: el laboratorio de OMalley en el receptor de progesterona (PR), el equipo de Chambon y Greene en el receptor de estrgenos (ER), y los grupos de Yamamoto y Evans en el receptor de glucocorticoides (GR). El trabajo resultaba particularmente complejo porque hasta el momento no se haba clonado ningn factor de trascripcin capaz de unirse a DNA, de forma que no se dispona de secuencia alguna a partir de la que construir una sonda de oligonucletidos especfica. De tal suerte que los investigadores estaban obligados a trabajar bien con genotecas de expresin cuyos lisados se analizaban meticulosamente empleando anticuerpos especficos en busca de fragmentos del receptor, bien con genotecas genmicas que cribaban con sondas complementarias a la secuencia deducida a partir de la estructura primaria del receptor3. En 1985 el equipo de Evans consigui clonar un receptor nuclear por primera vez en la historia. La sorpresa an fue mayor al descubrir la homologa del receptor con el oncogn del virus de la eritroblastosis aviaria (v-erb-a), hecho que pona sobre la mesa la posibilidad de que se tratara de una familia de genes: la clonacin del primer receptor nuclear ganaba en trascendencia no tanto por el logro en s, sino por las grandes perspectivas que abra3. De forma prcticamente simultnea, Greene y Jensen aislaban el primer clon que contena el ORF completo del ER. Poco despus, los autores clonaban el cDNA del receptor en el pollo y, tras compararlo con el humano, concluan la existencia de seis regiones (A a F) conservadas evolutivamente. Dos de ellas (C y E), las de mayor identidad, eran muy similares a la secuencia del gen que codificaba para el hGR y de v-erb-a. Cada vez resultaba ms evidente que ER y GR eran productos de una gran familia de genes4. Durante estos aos, adems de producirse importantes descubrimientos, se desarrollaron tcnicas extremadamente tiles que permitieron profundizar en el conocimiento de la fisiologa de los receptores nucleares y de otros factores de trascripcin. As, el equipo de Evans desarrollaba el primer ensayo de cotransfeccin, que consista en introducir dos vectores en un sistema heterlogo de forma transitoria: el primero con un gen testigo dirigido por el elemento de respuesta al factor, y el otro, el vector de expresin del receptor. Concretamente, los investigadores construyeron un gen hbrido que inclua el promotor del virus del cncer de mama de ratn (MMTV) que contena un elemento de respuesta a glucorticoides y la secuencia codificante de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT)5. Aos despus, el gen de la luciferasa sustitua la CAT como evitando las dificultades tcnicas que supone trabajar con radioactividad. Con todo, esta estrategia acabara trascendiendo la investigacin con receptores nucleares para convertirse en el estndar para caracterizar cualquier factor de transcripcin3. Greene y Jensen, por su parte, comprobaron que la regin E se corresponda con el dominio de unin a ligando (LBD) y la regin C, con el dominio de unin al DNA (DBD). Para confirmarlo, crearon un receptor hbrido en que la regin C del ER fue sustituida por la de GR y disearon un ensayo de cotransfeccin. Los autores observaron que el producto gnico era capaz unir estradiol pero no poda inducir la trascripcin del gen controlado por el elemento de respuesta incluido en el vector (pVit-TK-CAT). No obstante, el receptor hbrido era capaz de activar el gen testigo sometido al control de un GRE del vector pMMTV-CAT en presencia de estradiol, pero no de un glucocorticoide. Estos datos, amn de avalar la estructura modular de los receptores nucleares, abran la posibilidad de desarrollar receptores hbridos para identificar nuevos ligandos de una familia creciente de factores de trascripcin: ligandos qumicamente distintos interaccionaban con receptores estructuralmente relacionados. De hecho, poco despus los grupos de Evans y Chambon descubrieron el primer receptor de cido retinoico siguiendo esta estrategia hecho que acab de confirmar la existencia de la superfamilia4.

El receptor de andrgenos fue clonado simultneamente por varios grupos que seguan estrategias diferentes La clonacin de los receptores de estrgenos, glucocorticoides y hormonas tiroideas durante la segunda mitad de la dcada de los ochenta del siglo pasado demostr la homologa de todos aquellos receptores nucleares con el oncogn verb-a, con el que compartan el motivo dedos de zinc de unin al DNA, y alumbraba la superfamilia de los receptores nucleares. La evidencia de la existencia de un elevado grado de identidad entre los genes de la superfamilia invirti el paradigma en la investigacin de las hormonas al permitir clonar directamente los genes de los receptores nucleares: naca la endocrinologa inversa, que llegaba al paroxismo de describir una pltora de genes que codificaban para receptores hurfanos de ligando especfico. Siguiendo esta estrategia, el receptor de andrgenos humano (hAR) fue clonado por primera vez en 1988 por tres grupos distintos6,7,8. Previamente, el equipo de Migeon haba localizado el locus del gen que codifica para el hAR en la regin pericntrica del cromosoma X mediante anlisis de complementacin en sistemas hbridos. De hecho, la localizacin del gen se sospechaba por la transmisin segregada de la insensibilidad andrognica familiar y la heterogeneidad que mostraban mujeres heterocigotas respecto la unin celular de dihidrotestosterona (DHT)9. Precisamente, Lubahn et al. crearon una genoteca subgenmica a partir de la digestin parcial del cromosoma X para posteriormente seleccionar varios clones empleando la secuencia consenso DBD de los receptores de hormonas esteroideas y tiroideas7. En cambio, Chang et al. seleccionaron los diferentes clones de una genoteca de expresin de testculo humano6 mientras que Trapman et al. emplearon una genoteca de expresin de clulas T47D de cncer de mama 8. La expresin de algunos clones de cDNA seleccionados con secuencias del DBD de otros receptores daba lugar a productos capaces de unir andrgenos con alta afinidad y especificidad6,7,8 y de ser reconocidos por autoanticuerpos humanos contra el receptor nativo6. Meses despus, los equipos de Wilson y Liao deducan la estructura primaria del receptor de andrgenos humano a partir de la superposicin de la secuencia de varios cDNA parciales seleccionados a partir de genotecas subgenmicas de cromosoma X10 y de expresin de testculo humano11. Las secuencias predichas para el hAR diferan mnimamente en longitud (918 frente 919 residuos)10,11. El anlisis mediante el mtodo Northern descubri varias especies predominantes de mRNA tanto en prstata humana (10 kb y, en menor medida, 7 kb)10 como en clulas de la lnea de cncer de prstata LNCaP (11, 8,5 kb y, de forma minoritaria, 4,7kb)8, aunque posteriormente Faber et al. comprobaron que las especies de menor longitud eran fruto de la degradacin12. El receptor de andrgenos murino (rAR) se clonaba de forma prcticamente simultnea, revelndose secuencias idnticas en los dominios de unin a DNA y ligando, y un grado de similitud general del 85%13. Empleando el cDNA como sonda, se comprob como los niveles de mRNA en la regin ventral de la prstata de la rata respondan a la estimulacin con andrgenos y la castracin. Sin embargo, la secuencia completa del hAR fue publicada por primera vez por Tilley et al. Los autores aislaron un clon que inclua el receptor completo de una genoteca de expresin de prstata humana. Una vez secuenciado, los autores pronosticaron una longitud de 917 residuos y una masa molecular de 99 kDa. Adems, la secuencia demostr un elevado grado de identidad con los receptores de progesterona (PR) y, en menor medida, de mineralocorticoides (MR) y glucocorticoides (GR). De hecho, los autores sealaron el DBD y una pequea regin incluida en el dominio de unin a ligando (LBD) como las regiones de mayor identidad: 85% y 54%, respectivamente, en relacin al PR14. Posteriormente, el equipo de Brinkmann aisl la regin codificante del gen de hAR a partir de una genoteca genmica con el objeto de caracterizar su estructura. Los autores comprobaron que el gen presentaba una longitud total que superaba las 90 kb dividida en ocho exones: la secuencia codificante de la regin amino estaba incluida en un largo exn, mientras que la informacin del LBD estaba repartida en cinco. Los autores identificaron una secuencia con homologa a los dedos de zinc repartida en dos pequeos exones situados entre los que codificaban para el TAD y el LBD15. El estudio de la estructura primaria del receptor revel la existencia de secuencias de repeticin de glutamina y glicina en la porcin proximal del receptor16. Aunque se desconoce la funcin concreta de dichas secuencias, el polimorfismo de la regin de repeticin de tripletes CAG explica la variabilidad en la longitud de los receptores clonados y se ha relacionado con la susceptibilidad a desarrollar una variedad de trastornos17. Con todo, la transfeccin del cDNA en clulas de mamfero (COS-1) dio lugar a una protena de 110kDa16.

NTD
1 559

DBD H
623 705

LBD

CTD
870 919

Figura 1 Estructura del hAR propuesta por Brickmann et al. NTD: dominio del trmino amino; DBD: dominio de unin a DNA; H: regin bisagra; LBD: domino de unin a ligando; CTD: dominio del trmino carboxilo.

Posteriormente, el equipo de McPhaul identific dos formas de hAR en fibroblastos de piel genital. Los autores observaron una isoforma de 87 kDa, denominada AR-A, que contena el trmino carboxilo intacto aunque careca del extremo amino descrito en la isoforma de 110 kDa (AR-B), concretamente de los primeros 187 aminocidos de la estructura primaria. La ratio de concentraciones entre las formas halladas en los fibroblastos fue 10:1 B:A. El grupo de McPhaul propuso que las isoformas detectadas, en analoga a las del receptor de progesterona humano (tambin codificadas por un nico gen) podan participar en procesos fisiolgicos especficos 18. Sin embargo, esta hiptesis fue desechada posteriormente por Gregory et al. alegando que la isoforma AR-A era fruto de un proceso de protelisis in vitro relacionado con la manipulacin, procesamiento y almacenamiento de las muestras: los autores observaron que la

optimizacin del procedimiento de extraccin reduca severamente la concentracin de las forma alternativa, descartando su sntesis in vivo19. Evidencias indirectas apuntan hacia la existencia de nueva interfase de interaccin Dos mutaciones situadas en los extremos contrarios del hAR contribuyen a la resistencia andrognica Tras la clonacin del hAR y la determinacin de la secuencia completa a finales de la dcada de los aos 80 del siglo pasado14, diferentes grupos iniciaron su caracterizacin. Dichas investigaciones arrojaron resultados que evidenciaban la peculiaridad del AR respecto al resto de miembros de la superfamilia: la interaccin del extremo amino y la funcin activadora 2 (AF-2) de la protena en presencia de agonista. Aunque la primera evidencia directa que apoya la existencia de interaccin entre los trminos amino y carboxilo del AR se remonta a la segunda mitad de la dcada pasada, los primeros autores que la sugieren se basan en una variedad de hallazgos indirectos obtenidos en un estudio con receptores mutantes.
NTD Q12 DBD H LBD C761 CTD

Figura 2a Estructura del hAR sealando las mutaciones halladas por McPhaul et al. en los individuos de la familia estudiada: una repeticin de doce tripletes CAG (el nmero de repeticiones habitual en la poblacin general se sita entre 20 y 23 repeticiones) en el NTD y la sustitucin del residuo tirosina 761 por cistena en el LBD. El mutante Q787 incluye ambos defectos. [Figuras adaptadas de McPhaul et al. 1991]
unin especfica remanente (%) unin especfica remanente (%)

T 30 40

wt Q12

C761 Q787 0h 1h 2h 3h

actividad transactivadora (%) wt

wt

C761

Q787

Q12 C761 Q787

Figura 2b Proporcin de unin especfica de DHT a los distintos receptores salvaje y mutantes a diferentes temperaturas. Las pruebas con Q12 no revelan inestabilidad trmica [los autores no muestran los resultados].

Figura 2c Proporcin de unin especfica de DHT a los distintos receptores salvaje y mutantes en el tiempo. La transferencia de tipo western descarta que los cambios observados sean debidos a distintos grados de expresin del hAR.

Figura 2d Proporcin de actividad transactivadora respecto al receptor salvaje en el ensayo de cotransfeccin con pMMTV-CAT.

Concretamente, McPhaul et al. estudiaron las bases moleculares de la resistencia andrognica en varios varones de una misma familia que presentaban hipospadias (trastorno caracterizado por la apertura del meato urinario en la cara dorsal del pene), un defecto que se ha relacionado con una deficiente virilizacin. Paradjicamente, estos individuos mostraban un desarrollo adecuado de los caracteres sexuales secundarios durante la pubertad. Los autores comprobaron que el gen que codifica para el AR presentaba dos alteraciones estructurales: un acortamiento de la secuencia de repeticin de residuos glutamina en el trmino amino y una sustitucin del residuo tirosina en posicin 761 en el dominio de unin a ligando de la protena20. Al objeto de discernir la contribucin de cada una de estas mutaciones al fenotipo, el equipo gener plsmidos de expresin que contenan construcciones que codificaban para la protena salvaje o mutada para uno o ambos defectos con los que transfectaron clulas de mamfero (COS-1). McPhaul et al. compararon el comportamiento del receptor salvaje y mutado en diferentes apartados: afinidad de la protena por el ligando, estabilidad trmica y capacidad transactivadora en el ensayo de cotransfeccin (pMMTV-CAT). En esencia, los autores descubrieron que si bien el acortamiento de la secuencia de repeticin de la glutamina (Q12) no afectaba significativamente ni la estabilidad, ni las caractersticas cinticas, ni la capacidad activadora de la trascripcin gnica, el receptor Y761C mostraba un desempeo sensiblemente inferior al nativo. Sorprendentemente, la coexistencia de ambos defectos en el mismo gen (Q787) mermaba severamente la funcionalidad del producto, tal y como puede apreciarse en la figura superior. Es por esto que los autores interpretaron que la estructura tridimensional de la protena permita la interaccin de determinadas porciones del extremo amino con segmentos del LBD20. La delecin de los trminos amino o carboxilo retiene el receptor en el ncleo en ausencia de hormona El fenmeno de translocacin nuclear del receptor activado por ligando ya se describi durante los primeros aos de investigacin con el hER1. Sin embargo, con el advenimiento de las tcnicas del DNA recombinado, se inici la bsqueda de las estructuras del receptor implicadas en este proceso descubriendo el grupo de Picard la secuencia responsable en los receptores de glucocorticoides y estrgenos a finales de la dcada de los aos 80 del siglo pasado21. Precisamente, los equipos de Jenster y Wilson investigaron acerca de la secuencia mnima que determina la importacin nuclear de la protena en presencia de andrgenos mediante inmunocitoqumica en clulas de mamfero

(COS-1) en las que se expresaba transitoriamente una variedad de construcciones que codificaban para el receptor de andrgenos modificado mediante delecin, mutagnesis dirigida22,23,24 y fusin a la quinasa de piruvato24.
NTD
1 559

DBD H
623 705

LBD

CTD
870 919

Figura 3a Estructura del hAR. Figura 3b Localizacin celular de las diferentes construcciones diseadas por Zhou et al. en relacin a la presencia de agonista (R1881). [Figuras adaptadas de Zhou et al. 1994]
R1881 R1881

1-919 1-639 1-723 1-771 1-815 1-868 1-815

1-815: 1-815724-771

1-919 14-83 14-180 14-337 14-337 507-919 507-919

: incluye las mutaciones R617M, K616M, K632M, K633M en la NLS

+ N N

C N N C>N C C N>C

C C

C>N N C>N N C C C C N>C N

Ambos equipos identificaron una seal de localizacin nuclear (NLS) formada por dos grupos de aminocidos bsicos separados por una secuencia de diez residuos a caballo del dominio de unin al DNA y la regin bisagra del hAR (residuos 617 a 633). La mutacin de los residuos de lisina se traduca en la incapacidad de la protena para translocarse al ncleo en presencia del andrgeno empleado (R1881 o metiltrienolona en los tres estudios publicados). Adicionalmente, la delecin del dominio de unin al ligando comportaba la localizacin de la protena en el ncleo an en ausencia de ligando23,24, de lo que se dedujo el papel regulador de esta secuencia en el proceso de incorporacin nuclear: nicamente de esta forma poda entenderse la localizacin diferencial de este receptor nuclear en presencia de hormona24. A partir de estos datos, pudiera deducirse que la unin del ligando al receptor desencadena un cambio de conformacin que, trasladado a la regin bisagra que incluye la seal de incorporacin nuclear, equivale al que se produce por la delecin del dominio carboxilo de la protena. Paradjicamente, ambos grupos descubrieron que la delecin del extremo amino del receptor comportaba la entrada de la protena al ncleo an en ausencia de agonista. Con todo, la mutacin de los aminocidos bsicos integrados en la seal de localizacin nuclear de la regin bisagra contrarrestaba dicho efecto 23,24, evidenciando que la localizacin en condiciones basales no se deba a la prdida de una hipottica seal de retencin en el citoplasmtica localizada en el dominio amino o al cambio de conformacin de la protena como consecuencia del proceso de delecin: de hecho, Saporita et al. describiran posteriormente una seal de exportacin nuclear (NES) adyacente al sitio de unin al ligando del receptor cuya actividad dependa de la unin de andrgenos25. En este sentido, a diferencia de Jenster et al., el equipo de Wilson propuso la existencia de una interaccin fsica entre el trmino amino y el dominio de unin al ligando del receptor como explicacin a los hallazgos experimentales24. El estudio de movilidad electrofortica sugiere la interaccin entre la mitad amino y carboxilo del receptor Precisamente, el equipo de Wilson estudi la formacin del dmero del receptor de andrgenos y la dependencia de hormona de la interaccin con el DNA empleando ensayos de movilidad electrofortica (EMSA de electrophoretic mobility shift assay)26. Esta prueba permite estudiar la capacidad de interaccin de las protenas con secuencias especficas de cidos nucleicos mediante electroforesis en condiciones nativas en gel de acrilamida empleando oligonucletidos marcados (generalmente con P 32) como testigos. Al tratarse de electroforesis en condiciones nativas, no se afecta significativamente la estructura cuaternaria de las protenas aunque los cambios en su conformacin pueden modificar la velocidad de desplazamiento. Es caracterstica, adems, la utilizacin de anticuerpos para confirmar la participacin de la protena de inters en el complejo con la sonda, lo que se traduce en el retraso de la banda27. En este caso concreto, los investigadores disearon dos construcciones a partir del receptor de andrgenos: mientras la primera careca de la mitad amino de la protena (AR507-919); la segunda, del extremo carboxilo (AR1-660). En ambos casos, empero, se conservaba la regin central implicada en la dimerizacin y la unin del receptor nuclear al DNA. Una vez transfectadas en clulas de Spodoptera frugiperda empleando baculovirus (los sistemas heterlogos basados en clulas de insecto aseguran un patrn procesamiento postraduccional proteico similar al de los mamferos y permiten la sobreexpresin de receptores nucleares evitando la formacin de precipitados que se produce en clulas COS-1), se analiz la capacidad de los distintos productos gnicos para formar dmeros e interaccionar con el DNA y se evalu la dependencia de este fenmeno de la presencia de hormona. Para ello, los extractos de las clulas transfectadas (tratadas previamente con andrgeno en los casos precisos) se incubaron con oligonucletidos que contenan elementos de respuesta a andrgenos (ARE) para despus analizar la interaccin mediante EMSA26.

NTD
1 559

DBD H
623 705

LBD

CTD
870 919

AR1-660 AR507-919 Figura 4a Estructura de los receptores nativos y mutantes empleados por Wong et al. en el ensayo de movilidad electrofortica. [Figura adaptada de Wong et al. 1993] Figura 4b EMSA con el hAR y las mitades amino y carboxilo. Los carriles AB + se han cargado con muestras incubadas con anticuerpo anti-AR lo que se asocia a un menor desplazamiento o shift, hecho que confirma la participacin de la protena de inters en el complejo con los oligonucletidos marcados. Figura 4c El cambio de conformacin que provoca el ligando en la mitad amino modifica el desplazamiento (carriles 4 y 7).

N N N C

C C

Wilson y colegas observaron que las formas truncadas del receptor dotadas del dominio de unin a ligando (AR507919) eran capaces de formar homodmeros e interaccionar eficientemente con el DNA an en ausencia de hormona, a diferencia de los receptores completos, que requeran de la presencia de andrgeno para formar complejos e interaccionar con el oligonucletido marcado, tal y como puede apreciarse en la figura superior. Los receptores mutantes AR1-660, en cambio, formaban dmeros y se asociaban dbilmente al DNA independientemente del tratamiento con ligando. Adems, el producto gnico de AR507-919 era capaz de formar heterodmeros con el receptor salvaje o la mitad amino y unirse al DNA nicamente cuando ambas formas procedan de clula tratada con DHT. Esto es, la presencia de la mitad amino del receptor impeda que la protena truncada con el dominio de unin a ligando participara en la formacin del dmero en ausencia de hormona. A partir de estos resultados, el equipo dedujo que, en ausencia de andrgenos, el extremo amino interacciona con el trmino carboxlico e interfiere la formacin del dmero y, con ello, la unin de aquel con el DNA puesto que el AR requiere la dimerizacin para interaccionar eficientemente con el ARE 26. De estos resultados pudo deducirse que la presencia de ligando desencadenaba un cambio de conformacin en la mitad carboxilo del receptor que influa en la relacin fsica de la ltima con el trmino amino de la protena. La delecin del extremo carboxlico libera la actividad transactivadora constitutiva El equipo de Jenster dise una serie de construcciones de receptores mutantes para detectar y analizar las regiones esenciales para actividad transactivadora en el dominio amino. Las distintas construcciones fueron cotransfectadas de forma transitoria en clulas HeLa, junto con una el plsmido pG29GtkCAT, que inclua el gen testigo que codifica para la CAT bajo el control trascripcional del elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE), reconocido por el DBD del receptor de andrgenos. El mapeo de las deleciones introducidas en el receptor salvaje (AR0) revel que la actividad transactivadora completa de la protena requera de la integridad de la prctica totalidad del dominio amino: cualquier delecin de segmentos localizados en la porcin que inclua los primeros 485 residuos, identificada como TAU-1 (transactivation unit 1 anloga a AF1 de los receptores nucleares), afectaba la capacidad de inducir la trascripcin del gen testigo. Dentro de la unidad, se identific una regin mnima o central localizada entre los residuos 101 y 370 que retena ms del 50% de la actividad trascripcional28.
Figura 5 Las lneas finas sealan la secuencia completa de unidad de transactivacin o TAU en el receptor nativo (AR0) y el mutante truncado para la porcin carboxilo (AR5); las lneas gruesas delimitan el ncleo de dichas secuencias. [Figura adaptada a partir de Jenster et al. 1995]
NTD AR0
1

DBD H TAU-1
360 485

LBD

CTD

AR5 TAU-5
528

El equipo analiz la influencia de la misma serie de deleciones en el receptor mutante AR5 (AR628-910) que, a diferencia de receptor salvaje, careca del dominio carboxlico y presentaba una capacidad de activacin de la trascripcin constitutiva del 75% respecto del hAR ligado. En este caso, se observ un desplazamiento de la regin con actividad transactivadora. De hecho, la nueva TAU-5 (denominada as por surgir en el receptor mutante AR5) ocupaba la mitad distal del NTD y su regin nuclear se localizaba en el segmento delimitado por los residuos 360 y 485. En este caso, el segmento central contaba con una longitud menor y aseguraba la actividad trascripcional constitutiva de forma prcticamente completa. A partir de estos resultados, Jenster y colegas advirtieron el papel determinante de la mitad carboxilo de la protena en el funcionamiento de las TAU: la delecin de aquel comportaba la prdida de la actividad

TAU-1, dependiente de hormona, y la induccin de la TAU-5, constitutiva. De esto se dedujo la existencia de una interaccin funcional entre el LBD y el trmino amino del hAR28. Las deleciones del trmino amino afectan la cintica de la interaccin con el ligando El equipo de Wilson estudi la base molecular de la interaccin del hAR con el ligando mediante la caracterizacin de la cintica de asociacin de diferentes receptores recombinados. Aunque las mutaciones del receptor que abolan la formacin del complejo dimrico, la localizacin nuclear o la unin a DNA no influan en la interaccin con el ligando, los autores constataron que las deleciones del trmino amino se traducan en una mayor velocidad de disociacin, especialmente cuando afectaban los residuos 14-28. De hecho, la delecin del NTD completo comportaba una semivida de disociacin hasta cinco veces ms rpida respecto la del receptor completo: 0,8 h frente a 3,7 h, respectivamente. Adems, la mutacin del residuo V889, situado en el CTD, daba lugar a una inestabilidad similar a la de la delecin del NTD. Antes bien, los cambios en la cintica inducidos por esta variedad de mutaciones no se acompaaban de la afectacin de la afinidad aparente del receptor por el ligando29. Al objeto de definir la especificidad del NTD en el retraso de la disociacin del ligando del LBD, los autores disearon una variedad de protenas hbridas con diferentes dominios del hGR y hAR que expresaron en clulas de mamfero (COS-1). Sorprendentemente, la protena de fusin que inclua el dominio NTD del hAR y el LBD del hGR mejoraba la estabilidad de la con la dexametasona (DXM): semivida de disociacin de 1,2 h frente a 0,5 h del receptor nativo. La construccin inversa, no obstante, presentaba velocidades de disociacin de la DHT similares a las observadas con las mutaciones en el NTD. De esto, el equipo dedujo la participacin singular del NTD del hAR, y muy especialmente de sus residuos ms proximales, en la estabilizacin de la interaccin del LBD con el ligando a travs de una interaccin entre los segmentos extremos del receptor29. La interaccin N/C presenta caractersticas biolgicamente relevantes El ensayo de interaccin de protenas hbridas evidencia la interaccin N/C Poco despus (en 1995) el equipo de Wilson publicaba la primera evidencia directa de la existencia de interaccin entre los trminos amino y carboxilo del receptor de andrgenos30. Este hallazgo llegaba de la mano del reciente desarrollo de los ensayos genticos de interaccin de protenas hbridas en clulas de mamfero por Fearon et al.31, basado en la estrategia original de Fields y Song en levaduras32 cuyo desarrollo casualmente coincidi en el tiempo con la clonacin del gen del receptor de andrgenos6,7,8. A diferencia de los mtodos bioqumicos disponibles hasta el momento (entrecruzamiento proteico, inmunoprecipitacin y fraccionamiento cromatogrfico), el mtodo gentico permita un anlisis cuantitativo de alta especificidad que, como contrapartida, precisaba de la clonacin previa de la secuencia que codifica para las protenas para las que se deseaba estudiar la interaccin31,32. Independientemente de la naturaleza del sistema heterlogo empleado, esta estrategia se fundamenta en la expresin de dos protenas de fusin: cada una incluye la estructura proteica susceptible de participar en la interaccin que se ensaya y una parte de un factor de trascripcin: bien la implicada en el reconocimiento del promotor del gen testigo, bien el dominio de transactivacin. De esta forma, la existencia de interaccin entre los dominios o protenas en estudio comporta la formacin de un complejo estable en el promotor de un gen testigo y el reclutamiento de la maquinaria trascripcional, propiciando as la expresin de aqul31,32. En este caso concreto, el equipo de Wilson clon secuencias parciales del hAR y del dominio de interaccin con el DNA de la protena GAL4 de Saccharomyces cerevisiae o del dominio transactivador de la protena VP16 del virus Herpes simplex en vectores pGALO, tal y como se muestra en la imagen inferior30. A diferencia de las construcciones diseadas en los estudios de caracterizacin funcional previos, las protenas recombinadas carecan de DBD, evitando as la interferencia que pudiera originar la capacidad constitutiva para la interaccin y formacin de dmeros funcionales descrita para dicha regin22. Este material fue cotransfectado en clulas CHO junto con un plsmido (pG5E1bLuc) que contena el gen de la luciferasa dirigido por un promotor reconocido por GAL4. De esta forma, la lectura de la luminiscencia mediante espectrofotometra permitira cuantificar la interaccin entre las mitades amino y carboxilo del hAR, y comparar el grado de asociacin en estado basal con la inducida por la presencia de hormona. Cabe sealar que los autores eligieron las clulas CHO frente a las COS-1 por presentar las primeras una menor seal de fondo en ausencia de ligando, probablemente por el menor grado de expresin alcanzado en este sistema heterlogo30.

NTD
1 559

DBD H
623 705

LBD

CTD
870 919

GAL4 VP16

VPA1 GALA1 GALDH VPDH

Figura 5a Estructura de las protenas hbridas empleadas por Langley et al. en el ensayo de interaccin en clulas de mamfero (CHO). La construcciones GALDH y VPDH incluyen el segmento de hAR codificado por los exones D a H. [Figuras adaptadas de Langley et al. 1995] Figura 5b Representacin esquemtica del ensayo de interaccin de protenas hbridas en clulas de mamfero. El vector pG5E1bLuc incluye cinco sitios de unin a GAL4 (GBS) y el gen de la luciferasa bajo el control del promotor E1b.
250.000 4.6x Unidades pticas L + 2x 59x 21x

VPA1 VPDH VP16 GALDH

VPA1 VPDH VP16 GALA1

VPA1 VPDH VP16 GALO

VPJun GALFos

GBS

TATA

LUC

Figura 5c Actividad luciferasa inducida por receptores hbridos. Ntese el diferente grado de expresin que se alcanza el gen testigo en los ensayos GALDH-VPA1 y VPDH-GALA1, consecuencia de la actividad transactivadora intrnseca de la construccin GALA1. El ligando empleado es DHT 1 nM.

Los autores comprobaron asociacin entre el trmino amino y el dominio de unin a ligando en presencia de DHT, tal y como se puede apreciar en la figura superior. Lo que es ms, el grado de expresin del gen testigo de las clulas transfectadas con se correlacion con la concentracin y la potencia agonista del ligando y poda afectarse empleando inhibidores competitivos. Para el equipo de Wilson, estos hallazgos demostraban la relevancia biolgica de la interaccin N/C. No se observ, en cambio, asociacin homnima de los trminos carboxilo, independientemente del tratamiento con agonista. Se constat, empero, una fuerte induccin de la expresin del gen testigo en el ensayo de interaccin homnima entre trminos amino, hecho que los autores interpretaron como el resultado de la confluencia de tres unidades de transactivacin en el promotor del vector (una regin en GALA1 y dos en VPA1), y no de la existencia de interaccin homnima entre NTD30. En un intento de localizar las estructuras implicadas en la interaccin N/C dependiente de hormona y la asociacin homnima constitutiva entre mitades amino del hAR, los autores disearon una variedad de protenas hbridas VPA1 que carecan de segmentos de unos 150 residuos en el extremo amino, carboxilo o en su regin central. El equipo de Wilson interpret que la asociacin N/C se afectaba drsticamente con la delecin de los residuos distales de la mitad amino del receptor (VPA1339-499), no as la interaccin homnima, que dependa esencialmente de la regin central de VPA130. Estos resultados concuerdan con los obtenidos posteriormente por Ikonen et al. en un ensayo de protenas hbridas desarrolladas a partir del rAR empleando construcciones similares 33. Sin embargo, los resultados de los ensayos de interaccin en sistemas heterlogos deben interpretarse con cautela ya que alguna de las protenas para las que se estudia la interaccin cuente con actividad transactivadora intrnseca, como es el caso del segmento AR1-660 empleado por el grupo de Wilson. De hecho, el segmento 339-499 cuya delecin comportaba una reduccin marcada de la expresin del gen testigo inclua la regin central de la TAU-5 descrita meses antes por Jenster et al.28 Con todo, la principal aportacin del ensayo consista en la demostracin de la existencia de una interfase de interaccin fisiolgicamente significativa entre las mitades amino y carboxilo del receptor30 si bien restaba una cuestin crucial por resolver: la polaridad de la interaccin intermolecular del hAR. La polaridad de la interaccin N/C resulta controvertida Lo cierto es que a mediados de la dcada pasada se haban propuesto dos modelos diferentes de organizacin de los receptores nucleares. Por una parte, Kraus et al. haban empleando una estrategia experimental similar a la del equipo de Wilson y defendan que la actividad trasansactivadora del receptor de estrgeno ocupado responda a la accin sinrgica de AF1 y AF2, resultado de la interaccin fsica en un modelo de interaccin intermolecular paralela. De hecho, a diferencia de los resultados obtenidos por Wilson para el hAR30, los LBD eran capaces de establecer interacciones significativas entre s a travs de secuencias hidrofbicas34. Inspirado en la hiptesis formulada por Kraus, Doesburg et al. polemiz con el grupo de Wilson acerca de la polaridad de la interaccin. Lo cierto es que ambos grupos partan de una aproximacin experimental fundamentalmente similar, si bien Doesburg et al. interpetaron que la interaccin significativa entre los LBD no vena reflejada en los resultados del ensayo de interaccin de protenas de fusin, al formar homodmeros carentes de capacidad transactivadora. De hecho Doesburg et al. propuso que la interaccin N/C del receptor era intramolecular35.

Meses despus, Tetel et al. publicaron los resultados de un estudio sobre la capacidad para formar homodmeros del hPR, el receptor nuclear con el que el hAR presenta mayor identidad, mediante mtodos fsicos como la inmunoprecipitacin y la cromatografa de afinidad con metales inmovilizados. Concretamente, los investigadores observaron que el NTD truncado era capaz de asociarse con otro monmero siempre que retuviera el DBD aunque no el LBD36. No obstante, el grupo de Wilson continuaba defendiendo la singularidad del hAR y propona una modelo especfico de interaccin intermolecular y antiparalela argumentando que 1) la interaccin N/C haba demostrado estabilidad e intensidad suficientes para mediar la formacin del dmero activo, que 2) la asociacin entre LDB y NTD presentaba caractersticas biolgicas relevantes, que 3) la interaccin entre trminos carboxlicos no era posible, an en presencia de andrgeno30 y que 4) la asociacin antiparalela de los fragmentos amino y carboxlico interaccionaba eficazmente con el DNA26. En un intento de definir precisamente la polaridad de la interaccin N/C, el equipo de Wilson estudi el efecto de diferentes mutaciones del LBD asociadas a resistencia andrognica que afectaban la asociacin de las mitades amino y carboxilo del receptor pero no la afinidad aparente del receptor por su ligando. En esencia, los autores sealaron que ninguna de las mutaciones introducidas en el LBD la protena de fusin VP-AR afect significativamente la interaccin con GALD-H. Sin embargo, la sustitucin de los residuos R752 o V889 en GALD-H abola la asociacin tanto con VPAR1-660 como con el receptor completo a concentraciones fisiolgicas de ligando (DHT). Se aada, por tanto, una evidencia ms a favor del modelo de interaccin antiparalela propuesto por el grupo de Wilson, que de confirmarse, redundara en la singularidad de la asociacin N/C 37. Una dcada despus, empero, la utilizacin de tcnicas de microscopa de fluorescencia cuestionaran esta hiptesis38, tal y como se explicar posteriormente. La interaccin N/C reproduce la respuesta biolgica del hAR a agonistas y antagonistas Precisamente, uno de los principales argumentos del equipo de Wilson a favor de la interaccin N/C antiparalela consista en que la asociacin entre el LBD y el NTD en los ensayos de interaccin de protenas hbridas remedaba las caractersticas definidas previamente para el dmero hAR: respuesta a agonistas y antagonistas, intensidad y especificidad de la interaccin30,37. Los autores decidieron estudiar el efecto de una variedad de ligandos naturales y artificiales sobre la interaccin N/C mediante el sistema de protenas hbridas en clulas de mamfero (CHO) cotransfectadas con pG5E1b-Luc y as determinar in vivo la capacidad del complejo formado por el NTD y el LBD para discriminar agonistas de antagonistas. Concretamente, los investigadores observaron que el tratamiento con agonistas de alta afinidad (DHT, testosterona, R1881 y otros) a concentraciones de 0,1 a 1 M multiplicaba por cuarenta el grado de expresin del gen testigo. No se detect, empero, asociacin de las protenas de fusin en presencia de diferentes agonistas (hidroxiflutamida y acetato de ciproterona, entre otros), cuyo tratamiento era capaz de revertir la interaccin N/C desencadenada por DHT, especialmente el acetato de medroxiprogesterona39. Adems, los autores estudiaron la influencia de la naturaleza de los ligandos sobre otros parmetros biolgicamente relevantes. De hecho, una de las propiedades que distinguan agonistas de antagonistas del hAR era la capacidad de los primeros para estabilizar el receptor frente a la degradacin. En este sentido, se transfectaron clulas de mamfero (COS-1) para incubarlas posteriormente con aminocidos sulfurosos marcados y determinar la cintica de degradacin del receptor. Los autores confirmaron un buen grado de correlacin entre la potencia de los ligandos para desencadenar la interaccin del NTD y el LBD en el ensayo de protenas hbridas y la estabilizacin del hAR marcado radiactivamente. Sin embargo, la capacidad para inducir la interaccin del receptor con el DNA en el ensayo de cotransfeccin con el vector pMMTV-Luc no mostr relacin con la interaccin N/C. Esto es, la asociacin entre los extremos del receptor pudiera participar en la estabilizacin del AR, aunque no en la interaccin con el DNA39. El receptor de andrgenos humano presenta estructuras especficas implicadas en la interaccin N/C La regin central de la AF-2 participa en la interaccin N/C A finales de la dcada de los ochenta del siglo pasado, el equipo de Chambon descubri que la deleccin de parte del LBD daba lugar a un receptor con capacidad para reconocer el ERE dotado una capacidad transactivadora constitutiva del 5% respecto la protena nativa. Es por esto que los investigadores dedujeron la existencia de una unidad activadora de la trascripcin gnica localizada en el LBD del hER cuya actividad dependa de la presencia de ligando 40. Esta regin fue delimitada posteriormente por el equipo de Parker que, considerando el elevado grado de identidad entre los DBD y LBD de los distintos miembros de la superfamilia, sospechaba que algunas unidades de transactivacin pudieran estar conservadas en los receptores nucleares. En este sentido, los autores identificaron una secuencia de aminocidos hidrofbicos y cargados prximos al trmino carboxilo conservados en los receptores de glucocorticoides y estrgenos murinos cuya mutacin puntual afectaba la capacidad de inducir la trascripcin dependiente de ligando. Como resultado, los investigadores propusieron que dicha regin poda resultar esencial en la regulacin de la expresin gnica dependiente de ligando41. Poco despus, un equipo francs trabaj en las diferencias estructurales observadas entre los dominios LBD de RXR libre y RAR asociado a ligando para trasladarlas al cambio de conformacin que experimentan los receptores nucleares en general. Como resultado, Wurtz et al. proponan un mecanismo de activacin general para los receptores nucleares sealando la hlice 12, prxima al trmino carboxilo de la protena, como el elemento central de la AF-2. Segn los autores, la interaccin del receptor con el agonista posicionara la hlices 12 sobre la cavidad de unin a ligando generando una superficie de interaccin con los factores intermediarios de trascripcin (TIFs), implicados en la modulacin de la actividad trascripcional de una amplia diversidad de receptores nucleares. De hecho, Wurtz et al.

comprobaron que las mutaciones en la regin central de la hlice 12 comportaban la abolicin de la asociacin del receptor con los coactivadores in vitro42. Ahora bien, a diferencia de los receptores de glucocorticoides y estrgenos, los ensayos con receptores de andrgenos truncados demostraban que el trmino carboxilo dispona de una capacidad transactivadora pobre e independiente de la disponibilidad de hormona22,30. Berrevoets et al. presumieron que la ausencia de la AF-2 poda deberse a la participacin directa de la regin en la interaccin N/C. Por este motivo, los autores mutaron el residuo E888 de la hlice 12, altamente conservado en los diferentes receptores nucleares, substituyndolo por glutamina. Tras comprobar que ni la expresin ni la interaccin del receptor con el ligando se afectaban por la mutacin, los investigadores comprobaron que la introduccin de la mutacin E888Q se traduca en una importante reduccin de la interaccin N/C en el ensayo de protenas hbridas en levaduras. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en lo referente a la interaccin homloga entre LBD 43. De forma anloga, Slagsvold et al. observaron que la sustitucin del residuo E897 abola la asociacin N/C en un estudio comparativo sobre la estructura de la AF-2 en el que introducan mutaciones en el hAR descritas previamente para otros receptores nucleares44. Siguiendo una lnea argumental paralela a la hiptesis formulada por Berrevoets et al., el equipo de Wilson sospechaba que la pobre actividad AF-2 demostrada por el hAR era debido a la limitada capacidad del extremo carboxilo de la protena para interaccionar con los coactivadores de la familia p160 y organizarlos en torno al promotor. Con el objeto de demostrarlo, He et al. disearon un ensayo de sobreexpresin de coactivadores de p160 en un sistema heterlogo: cotransfectaron clulas CV-1 (rin de mono) con diferentes construcciones de hAR y de sus coactivadores, y un vector pMMTV-Luc. Los investigadores observaron que, para una determinada cantidad de ligando, la luminiscencia detectada en el extracto de las clulas transfectadas con el gen que codificaba para el receptor completo era significativamente superior a la de las clulas que expresaban el receptor truncado carente del dominio amino (AR507919). De este hecho se dedujo que la interaccin de los coactivadores de p160 con el receptor de andrgenos tena lugar de forma preferente con el extremo amino de la protena45. Los autores introdujeron mutaciones en las hlices 3, 4 y 12 de la AF-2 implicadas en la produccin de resistencia andrognica sin afectar sustancialmente la afinidad aparente del receptor por el ligando. La prctica totalidad de las mutaciones introducidas en la AF-2 reduca drsticamente la interaccin con el TIF2 y el LBD en el ensayo de interaccin de protenas hbridas en clulas de mamfero (CHO), mientras que la mayora de mutaciones ectpicas no afectaba significativamente el funcionamiento del receptor. De esto, el equipo de Wilson dedujo que muchos de los residuos de la AF-2 participaban en la unin a los coactivadores de la familia p160 y al LBD del receptor. Ahora bien, los autores acordaron que la interaccin N/C y con los coactivadores de la familia p160 no compartan la totalidad de los residuos puesto que la mutacin I898T (hlice 12 de la AF-2) limitaba sensiblemente la interaccin N/C pero no la asociacin con TIF2, a diferencia de la sustitucin K720A, que respetando la asociacin con el LBD, abola la interaccin del receptor con el coactivador45. El NTD participa en la interaccin N/C a travs de la secuencia 23FQNLF27 Adems, el equipo de Wilson observ en el ensayo de cotransfeccin con el vector pMMTV-Luc en clulas de mamfero (CHO) que la dbil interaccin del TIF2 con el mutante AR507-919 poda rescatarse con la sobreexpresin del coactivador siempre que no presentara mutaciones en la secuencia LXXLL45, que forma parte de un motivo recientemente implicado en la interaccin de los coactivadores de la familia p160 con la superficie hidrofbica de la AF-2. En este tipo de ensayo, se introducen cantidades crecientes de vectores de expresin de un determinado gen para determinar la forma en que se afecta la expresin del gen testigo. Precisamente, sospechando que la secuencia de interaccin de los coactivadores con la AF-2 poda estar implicada en la interaccin del extremo carboxilo con el LBD del hAR, los autores analizaron la estructura primaria del receptor buscando secuencias similares a LXXLL incluidas en estructuras secundarias del tipo hlice anfiflica46. Los autores descubrieron cuatro secuencias FXXLF (tres de las cuales estaban localizadas en las regiones crticas para la interaccin N/C determinadas mediante los ensayos de interaccin proteica realizados previamente) y una secuencia WXXLF (tambin en una regin descrita previamente como crtica) 43,45,46. De hecho, la secuencia FXXLF ms prxima al trmino amino y la secuencia WXXLF estaban incluidas en las regiones que Berrevoets et al. haban identificado previamente en un ensayo de interaccin de protenas hbridas diseado a partir de la hiptesis de que la TAU-5, liberada tras delecin del extremo carboxilo del receptor y de funcin desconocida, poda participar en la interaccin N/C. Al objeto de confirmarlo, transfectaron construcciones con AR truncados y el vector MMTV-Luc en clulas de mamfero (CHO). Los investigadores observaron que la coexpresin de AR.N1 (AR1-494) y AR.C (AR528-910) se traduca en un grado luminiscencia equiparable al detectado en los extractos de clulas que expresaban el receptor salvaje43. No obstante, la delecin de los segmentos delimitados tanto por los residuos 1 a 51 y como por 371 a 494 redujo severamente la expresin del gen testigo en respuesta al tratamiento con agonista (R1881), lo sugera la participacin de la TAU-5 en la interaccin N/C, no as de la TAU-1. Los autores replicaron los resultados mediante el ensayo de protenas hbridas en levaduras cuya sensibilidad permite descubrir interacciones dbiles y, en principio, reduce la interferencia que supone la capacidad de transactivacin intrnseca del AR.N sobre el resultado respecto del ensayo de cotransfeccin. A partir de los resultados, los autores destacaron el papel esencial de la secuencia delimitada por los residuos 3-36 del receptor en la produccin de la interaccin N/C comparando las diferencias de desempeo entre los mutantes GalAD-AR.N12, GalAD-AR.N15 y GalAD-AR.N13 y GalAD-AR.N16, respectivamente43.

TAU-1

TAU-5

Actividad luciferasa (% AR wt) 100

TAU-1

TAU-5

Actividad galactosidasa (U) 250

AR.N1 AR.N2 AR.N3 AR.N4 AR.N5 AR.N6 AR.N7 AR wt AR.C

GalAD-AR.N8 GalAD-AR.N9 GalAD-AR.N10 GalAD-AR.N11

L +

GalAD-AR.N12 GalAD-AR.N13 GalAD-AR.N14 GalAD-AR.N15 GalAD-AR.N16 GalDBD-AR.C

Figura 6 Estructura de las protenas hbridas empleadas por Berrevoets et al. en el ensayo de cotransfeccin (izquierda) y de interaccin en levaduras (derecha). Se han indicado la TAU-1 y su secuencia central (lnea gruesa). En el primero, se cotransfectaron las construcciones mutantes AR.N y AR.C, que inclua DBD, junto con el vector pMMTV-Luc empleando R1881 como agonista. En la figura de la derecha se muestra el resultado del ensayo de interaccin de protenas hbridas GalAD-AR.N y GalDBD-AR.C en levaduras. Las barras grises reflejan la actividad transactivadora intrnseca de AR.N. [Figura adaptada de Berrevoets et al. 1998]

El mutante GalAD-AR.N11, carente del segmento delimitado por los residuos 245 y 494, presentaba una reduccin en la capacidad de interaccin con GalDBD-AR.C. Lo que es ms, la delecin de los residuos 330-494 de GalAD-AR.N12 que daba lugar a GalAD-AR.N15 se asociaba a una importante reduccin de la expresin del gen testigo integrado. Sin embargo, un mapeo ms exhaustivo de la mitad carboxilo del TAD no fue posible al no poderse distinguir el efecto de deleciones sucesivas (GalAD-AR.N13 y GalAD-AR.N14). Adems, la influencia de la capacidad de transactivacin intrnseca de los mutantes sobre el resultado result especialmente visible en las diferencias de actividad luciferasa entre GALAD-AR.N9 y GALAD-AR.N10. Con todo, los resultados obtenidos por Berrevoets et al. descartaron la participacin de la TAU-1 en la interaccin N/C apuntando que la asociacin del NTD con los coactivadores y con la AF-2 se producira a travs de regiones distintas y especficas43. Precisamente, el grupo de Wilson emple una el anlisis de interaccin proteica in vitro para evitar los artefactos producidos por las funciones activadoras del NTD del receptor sobre la maquinaria trascripcional del sistema heterlogo. Tras analizar la estructura primaria del hAR en busca de secuencias similares a LXXLL, los autores disearon construcciones del receptor con deleciones de unos diez aminocidos entorno a las secuencias candidatas. Cada una de las protenas truncadas fue estudiada para comprobar cmo afectaban las mutaciones el funcionamiento del receptor mediante el ensayo de interaccin de protenas hbridas en clulas de mamfero (CHO) y pull-down, y la cintica de disociacin del ligando46.
NTD DBD H LBD CTD

21-34

177-201

351-359 395-405 432-434

LXXLL

LXXLL

LXXLL LXXLL WHTLF

Figura 7a Localizacin de las distintas hlices anfiflicas con secuencias similares a LXXLL descritas por el equipo de Wilson. Las lneas indican las regiones implicadas en la interaccin N/C propuestas por Berrevoets et al. [Figuras adaptadas de He et al. 2000]

Figura 7b Resultado del ensayo de interaccin con protenas de fusin GST in vitro. La interaccin de la porcin proximal del NTD depende de la integridad de la secuencia 23FQNLF27, aunque puede ser rescatada por el segmento distal del dominio.

Figura 7c La interaccin de la mitad distal del NTD depende de la integridad de la secuencia 429-439, que media el rescate de la interaccin N/C en ocasin de mutaciones en 23FQNLF27.

En el ensayo de interaccin de protenas hbridas in vitro, tambin conocido como pull-down, se expresa una de las protenas (denominada cebo) fusionada con la S-transferasa del glutatin (GST) en un sistema heterlogo (en este caso Escherichia coli) para despus obtener el extracto proteico que ha de incubarse con esferas magnticas recubiertas con glutatin. As, la protena hbrida que sirve de cebo es separada empleando un campo magntico para incubarla posteriormente con el extracto celular que contiene las protenas candidatas a la interaccin (presa), de tal manera que es posible recuperarlas aplicando un campo magntico de nuevo. A diferencia del ensayo gentico de interaccin proteica, en este caso es necesario emplear sistemas como la inmunoelectrotransferencia para identificar la presa. En

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este caso, la protena hbrida con el LBD del receptor estaba marcada radiactivamente. Este ensayo evita los artefactos producidos por la capacidad de transactivacin intrnseca de las protenas en estudio pero se afecta fcilmente por las interacciones dbiles que puede establecer el cebo con otras protenas del sistema: resulta menos sensible pero ms especfica que la variante in vivo47. He et. al descubrieron que nicamente la delecin de la secuencia 23FQNLF27 comportaba una prdida significativa de la interaccin con la mitad carboxilo de la protena en respuesta al agonista y de la velocidad de disociacin de ligando (que no de la afinidad aparente del receptor por aqul), hecho que el equipo haba relacionado previamente con la interaccin N/C29. Lo que es ms, la mutacin de cualquiera de los residuos de fenilalanina o leucina del motivo abola la interaccin con el LBD de las protenas hbridas que incluan hasta los primeros 333 residuos del extremo amino del hAR. Sorprendentemente, cuando el segmento del LBD inclua los ltimos doscientos residuos la mutacin de la secuencia 23FQNLF27 careca de efecto. Adems, el NTD mutado era capaz de la interaccin N/C siempre y cuando no presentara deleciones en la secuencia delimitada por los residuos 429 a 439: esto es, el motivo WHTLF 46. A partir de estos resultados, el equipo de Wilson dedujo que la interaccin entre los extremos amino y carboxlico del AR estaba mediada por la secuencia 23FQNLF27, aunque en su defecto poda ser rescatada por el motivo 433WHTLF437 en presencia de ligando. Para comprobar la equivalencia de ambos motivos, sustituyeron la secuencia 23FXXLF27 por 23WXXLF27, afectndose severamente la interaccin N/C. Esto es, los motivos presentaban propiedades de unin al LBD diferenciales, de lo que pareca deducirse que no equivalan funcionalmente. De hecho, los autores observaron que la delecin o la mutacin de la secuencia 23FQNLF27 se traduca en una velocidad de disociacin del ligando mayor que la mostrada por receptor nativo. Antes bien, la disociacin era significativamente ms lenta que en el caso de la protena truncada para el NTD. Adems, el tiempo no se vea afectado cuando la mutacin de 23FQNLF27 siempre y cuando se acompaara por las deleciones que excluyeran la secuencia 429-439. En este ltimo caso, la simultnea devolva cinticas similares a las del NTD truncado, hecho que traduca la contribucin de la secuencia 433WHTLF437 a la estabilidad de la interaccin N/C46. Las caractersticas estructurales del bolsillo de AF-2 fuerzan la interaccin preferentemente con la secuencia 23FQNLF27 Aunque la secuencia FXXLF resultaba paradjicamente similar al ncleo del motivo LXXLL mediante la que interaccionan los coactivadores de la familia de p160 con la AF-2 de la mayora de los receptores nucleares (hasta el punto que permiti localizar la primera), el equipo de Wilson observ que su sustitucin por el consenso (F23L y F27L) reduca drsticamente la interaccin N/C y aumentaba la velocidad de disociacin del ligando (R1881) 46. Este hecho, consistente con la pobre de capacidad de interaccin de los coactivadores de la familia p160 con la AF2 evidenciada previamente por los autores45, abundaba en la especificidad y la significacin fisiolgica de la asociacin N/C46. Este hecho haba sido atribuido por el equipo de Wilson a la superposicin de residuos que participaban en la interaccin con los coactivadores de la familia de p160 y otros implicados en la interaccin N/C en la AF-245. De hecho, estos hallazgos coincidan plenamente con los que posteriormente obtendra un equipo japons empleando un sistema de complementacin proteico dotado de bioluminiscencia. Concretamente, Kim et al. disearon una protena recombinada que, mediante la interaccin del LBD y un pptido especfico separados por segmento flexible aproximaban dos fragmentos de la luciferasa de lucirnaga de tal suerte que, a mayor afinidad de la asociacin, mayor era la lectura espectrofotomtrica obtenida. Los autores constataron que para una determinada concentracin de agonista (DHT), la luminiscencia obtenida en la interaccin LBD-FQNLF era significativamente superior a la asociacin LBD-LXXLL. Sin embargo, la complementacin proteica del fragmento del hGR requera de la secuencia LXXLL en el pptido48. Precisamente, la singularidad de la AF-2 del receptor de andrgenos humano en la interaccin con los motivos LXXLL y similares fue objeto de un extenso estudio por el equipo de Trapmann. Los autores emplearon modelos tridimensionales generados mediante el software RASMOL para comprobar la relacin estructural entre los motivos FXXLF y LXXLL con el sitio de unin en la AF-2 de los receptores de andrgenos y estrgenos. Caractersticamente, las cadenas laterales de los residuos de fenilalanina resultaron demasiado voluminosas para introducirse de forma completa en el bolsillo hidrofbico de la AF-2 del receptor de estrgenos, ms estrecho. Por el contrario, la interaccin entre las cadenas laterales de leucina y el bolsillo del hAR resultaba excesivamente lbil. Se trataba de la primera hiptesis formulada acerca de la estructura del bolsillo hidrofbico de la AF-2 que explicaba el comportamiento diferencial del hAR respecto el resto de miembros de la superfamilia49. Las tcnicas de microscopa de fluorescencia revelan la anatoma molecular y celular de la interaccin N/C La interaccin N/C intramolecular citoplasmtica precede a la formacin del dmero paralelo nuclear Schaufele et al. emplearon FRET para resolver la cuestin acerca de la polaridad de la interaccin N/C amn de la serie de interacciones proteicas que siguen la unin del agonista con el hAR 38. La tcnica de FRET, desarrollada originalmente como estrategia aplicable por el equipo de Herman, consiste en una tcnica de microscopa de fluorescencia que permite estudiar la proximidad entre estructuras y molculas de inters. Dicha estrategia se basa en la transferencia de energa mediante de resonancia entre dos fluorocromos, que han de estar prximos para que se produzca. Cuando esto se produce, la seal del canal del fluorocromo aceptor aumenta significativamente, mientras que decae la emisin del fluorforo del donante de la energa mediante resonancia. De esta forma, la seal del receptor

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(FRET) y la relacin entre la seal del receptor y del donante (FRET/donante) aumenta al producirse una aproximacin suficiente. Siguiendo esta estrategia es posible estudiar la interaccin tanto entre diferentes protenas como entre los dominios de una misma protena en tiempo real en clulas vivas50. As, si se unen dos fluorocromos a dos dominios proteicos es posible estudiar cambios de conformacin de la protena en tiempo real siempre que impliquen una modificacin su distancia relativa. Precisamente, el equipo de Schaufele emple esta estrategia para determinar la localizacin subcelular del AR y los cambios tridimensionales dependientes de ligando. Los autores transfectaron clulas HeLA con diferentes construcciones de hAR hbridos que incluan protenas fluorescentes amarilla (AR-Y) y cian (C-AR) que, en esencia, mostraron una localizacin y capacidad de transactivacin similares al receptor nativo en una experiencia previa de cotransfeccin con el vector MMTV-Luc en clulas HEK 293. El ensayo preliminar tena por objeto descartar que los resultados del ensayo fueran consecuencia de las limitaciones estructurales que supone asociar dos protenas de 30 kDa a los extremos del receptor38. Adems, estos resultados se vieron corroborados y reforzados en experimentos posteriores realizados por van Royen et al. en los que se concluy que, en esencia, la seal FRET estaba relacionada con el grado de interaccin N/C del hAR 51.
NTD CFP DBD H LBD CTD

C-AR AR-Y C-AR-Y Figura 8a Estructura de las construcciones diseadas por Schaufele et al. en el ensayo de FRET. [Figuras adaptadas de Schaufele et al. 2005]
unin especfica remanente (%)

YFP

0,5

L -

FRET/donante

Figura 8b Ntese la distribucin diferencial de dmero del receptor, acumulado en el ncleo celular. Figura 8c El tratamiento con la hormona desencadena la interaccin intramolecular del receptor y, posteriormente, la formacin del dmero paralelo.

C-AR-Y N C-AR-Y C C-AR/AR-Y N C-AR/AR-Y C 20m 30m

0m

10m

C-AR/AR-Y

C-AR-Y

La dbil seal FRET/donante observada en ausencia de ligando fue interpretada que el monmero del hAR est presente en las clulas en una conformacin extendida: en ausencia de hormona, se observa una seal de fondo muy dbil. Antes bien, Schaufele et al. detectaron un incremento sensible de la relacin FRET/donante en los diferentes compartimentos celulares de forma dependiente a hormona (DHT en concentracin 10 -8M). De hecho, en las clulas transfectadas, mientras que las clulas que expresan el par de protenas hbridas CPF-AR y AR-YFP, la relacin FRET/donante fue significativamente superior en el ncleo (la seal citoplasmtica apenas se altera con el tratamiento con DHT). Segn Schaufele et al., la interaccin N/C intramolecular es posible tanto en el ncleo como en el citoplasma, no as la intermolecular, que se produce esencialmente en el ncleo38. Al objeto de estudiar si la interaccin N/C intramolecular dependiente de hormona preceda u ocurra de forma simultnea a la formacin del dmero en el ncleo, los autores disearon un estudio de lapsos de tiempo durante los que se determinaba las seales relativas al plegamiento intramolecular y dimerizacin. Tal y como puede apreciarse en la figura superior, el tratamiento con DHT se segua de un rpido incremento de la relacin FRET/donante de las clulas que expresan la construccin C-AR-Y hasta alcanzar el mximo en poco ms de diez minutos (FRETt1/2 de 3,5 minutos) independientemente del compartimento celular estudiado. Esto no suceda as en las clulas transfectadas con la construccin que codificaba para el par C-AR y AR-Y: en este caso, el incremento de la seal de FRET era ms progresivo (FRETt1/2 de 9,5 minutos) y claramente superior en el ncleo que en el citoplasma38. De esta forma, el equipo concluy que la interaccin N/C intramolecular desencadenada por el agonista precede la formacin del dmero paralelo del hAR. De todos los hallazgos aportados, el desfase entre la seal producida por la interaccin entre monmeros C-AR-Y y C-AR/AR-Y permita discriminar meridianamente la polaridad de la interaccin: si el hAR formara dmeros antiparalelos las seales resultaran sincrnicas, puesto que en ambos tipos de construcciones se producira el FRET entre la CFP y la YFP al quedar prximas. Adems, la mutacin del motivo 23FQNLF27 redujo significativamente (aunque no elimin) la seal de FRET intramolecular sin afectar aparentemente el proceso de dimerizacin del receptor, de lo que Shaufele et al. dedujeron que la secuencia 23FQNLF27 participa esencialmente en la estabilizacin del plegamiento intramolecular, que no es indispensable para la formacin del dmero38. La interaccin N/C es desplazada transitoriamente por la unin del receptor al DNA En este sentido, van Royen y sus colaboradores emplearon la tcnica de recuperacin de fluorescencia tras el fotoblanqueamiento (FRAP) asociada al FRET para profundizar en el estudio espaciotemporal de la relacin entre la

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interaccin N/C y los correguladores. La tcnica de FRAP consiste en exponer el fluorocromo a un pulso de luz que fuerza la salida de los electrones resonantes del orbital y, con ello, la prdida irreversible de sus propiedades fluorescentes. De hecho, el blanqueamiento es un proceso espontneo que tradicionalmente ha limitado el rendimiento de las tcnicas de microscopa de fluorescencia. De esta forma, se produce una prdida de la seal del fluorocromo blanqueado en la zona irradiada. Sin embargo, si las molculas portadoras de fluorocromo difunden, se produce una atenuacin progresiva de la regin quemada51. Concretamente, el equipo de van Royen desarroll un mtodo basado en la determinacin simultnea de la fluorescencia procedente de donante (CFP) y aceptor (YFP) de FRET en intervalos de tiempo regulares tras el blanqueamiento irreversible del aceptor (abFRAP) en una regin definida del ncleo. La fluorescencia emitida por el donante aumenta tras el fotoblanqueamiento y, posteriormente, se reduce progresivamente como consecuencia de la difusin. Esta seal pona de manifiesto la movilidad de las molculas en las que aceptor y donante estn prximos (en este caso, receptores con interaccin N/C). No obstante, la recuperacin local de la fluorescencia emitida por el receptor se relacionaba con la movilidad del acervo total de molculas, tanto los que presentaban una conformacin plegada como extendida, dada la independencia del fotoblanqueamiento de la proximidad del donante. Esto es, la diferencia que se estableca entre las curvas de emisin del aceptor y del receptor evidenciaba la movilidad de las poblaciones de molculas (plegadas o no) de la zona irradiada con el pulso 51. Caractersticamente, la cintica de redistribucin del FRAP donante y aceptor tras el pulso fue similar para la construccin salvaje (C-Y-AR) expresada en clulas de mamfero (Hep3) reflejando la ausencia de diferencias de movilidad entre fluorocromo donante y aceptor puesto que estaban constitutivamente prximos. Ahora bien, la seal procedente del donante del receptor hbrido Y-AR-C (movilidad de los hAR con interaccin N/C) result considerablemente ms rpida que la del aceptor (movilidad del acervo total de receptores). Significativamente, esta diferencia no se observ en el caso de la protena de fusin Y-AR(A573D)-C, incapaz de interaccionar con el DNA. Estos resultados fueron interpretados por los autores como una clara evidencia de que la interaccin N/C del hAR ocurra en la fase mvil y resultaba abolida por la inmovilizacin transitoria que representaba la unin al DNA51. De hecho, los hallazgos concordaban con la ausencia de correlacin entre la capacidad del ligando para inducir la interaccin N/C y la asociacin al DNA39.

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