Anda di halaman 1dari 24

TEKNIK ELECTROSPINNING UNTUK MENGENDALIKAN DEPOSISI DAN PENYESUAIAN STRUKTUR WADAH NANOFIBROUS UNTUK ORIENTASI SELULER DAN REORGANISASI

SITOSKELETAL Joke K. Wise, Michael Cho, Eyal Zussman, Constantine M. Megaridis, dan Alexander L. Yarin

2.1 PENDAHULUAN Fibril sel dan matriks ekstraseluler (ECM), pada sebagian besar jaringan, tidak random, tetapi yang jelas menunjukkan pola dan orientasi spasial tertentu. Temuan terbaru menunjukkan bahwa biopolimer berorientasi berbasis wadah nanofibrous memiliki potensi untuk pembuluh darah rekayasa [1], jaringan saraf [2], dan jaringan ligamen [3]. Selain itu, telah terbukti bahwa sel adhesi dan proliferasi [1] secara signifikan meningkat pada wadah berbasis nanofibrous. Teori pedoman yang berhubungan menunjukkan bahwa sel memiliki probabilitas migrasi terbesar dalam orientasi yang lebih disukai yang berhubungan dengan sifat kimia, struktural, dan mekanis dari substrat [4-6]. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa wadah berbasis nanofibrous akan memandu deretan sel sepanjang nanofibers. Susunan sel ke nanofibrous wadah berorientasi bisa disebabkan paduan yang berhubungan dan/atau reorganisasi sitoskeletal. Sel yang selaras kemudian bisa digunakan untuk mengubah bentuk dan memodulasi regenerasi dan lingkungan mikro ECM [7]. Tujuan khusus untuk pekerjaan ini adalah untuk merencanakan konsep seperti jaringan yang akan meniru zona dangkal dari kartilago artikular. Diketahui bahwa kartilago artikular secara garis besar terdiri dari setidaknya empat zona berbeda, masing-masing dengan sel tertentu dan organisasi atau orientasi ECM [810]. Zona ini dikenal sebagai zona dangkal atau tangensial, menengah atau transisi, dalam atau radial, dan zona kalsifikasi. Penyusunan sel khusus dan ECM dalam setiap zona kartilago dapat dikaitkan dengan riwayat perkembangan dan masing-masing zona kartilago ini terkena daya mekanik, sehingga mendukung fungsi keseluruhan jaringan artikular kartilago [12,13]. Beberapa laporan yang diterbitkan telah difokuskan pada susunan zonal dari kondrosit dalam polimer

17

18

biokompatibel untuk rancangan rekayasa jaringan kartilago artikular [14-18]. Selanjutnya, jurnal yang baru-baru ini diterbitkan telah menggunakan kondrosit dan sel induk mesenkimal manusia (hMSCs) dan tiga dimensi polimer wadah secara acak untuk rancangan jaringan nanofibrous kartilago [19-23]. Namun, upaya khusus untuk rancangan zona superfisial dari kartilago artikular menggunakan hMSCs dan wadah berbasis nanofibrous belum dilaporkan. Zona superfisial dari jaringan artikular kartilago alam tampak rata, kondrosit seperti ellipsoid dan fibril kolagen skala nano, yang berorientasi sejajar terhadap bidang permukaan artikular, dengan derajat signifikan dengan orientasi pada bidang [81]. Meskipun hanya beberapa lapis tipis, pentingnya zona superfisial ini sering ditekankan karena memberikan daya tarik tinggi yang dipertahankan oleh orientasi sel dan fibril kolagen [12,13], dan karena itu sangat penting untuk fungsi normal di artikular permukaan kartilago. Langkah pertama menuju rancangan jaringan fungsional dari zona superfisial kartilago memerlukan evaluasi kuantitatif dari adhesi dan orientasi sel. Untuk berfungsi dengan baik, pembenihan sel dalam wadah harus mampu berhubungan dengan lingkungan mereka melalui sinyal biokimia, bioelectrical, dan topologi yang tepat. Topografi dan komposisi mikro (yaitu, ECM asli) mempengaruhi fungsi seluler, seperti adhesi, pertumbuhan, motilitas, sekresi, ekspresi gen, dan apoptosis. Hal ini juga diketahui bahwa struktur fisik dari ECM asli memiliki dimensi nano. Permukaan luas-volume rasio tinggi dari wadah nanofibrous dan diameter nano dari serabut cenderung memberikan kondisi yang baik untuk perlekatan dan pertumbuhan sel. Sebagai contoh, karena kolagen merupakan komponen ECM paling banyak, wadah berbasis kolagen terdiri dari fibril dalam kisaran diameter 10-300 nm tidak hanya biokompatibel tetapi juga bisa memberikan salah satu struktur nanofibrous paling ideal untuk merancang jaringan [24]. Memang, sel telah diketahui untuk menempel padam dan tersusun di sekitar serabut dengan diameter lebih kecil daripada sel tersebut [24,25]. Sel induk memiliki sifat unik untuk pembaruan diri tanpa diferensiasi sampai dan setidaknya selama sinyal biologis dan fisik yang sesuai tersedia. Dalam konteks rekayasa jaringan, penggunaan sel induk memiliki banyak

19

keuntungan. Tidak seperti konstruksi jaringan rekayasa menggunakan sel didiferensiasi, sel induk (1) memiliki kapasitas proliferatif yang lebih tinggi, (2) menyediakan kemampuan regeneratif yang sangat baik yang memungkinkan integritas dan fungsi dari jaringan rekayasa yang diinginkan, (3) memungkinkan untuk melihat konstruksi jaringan multifungsi (misalnya, jaringan osteochondral), dan (4) mengurangi atau menghilangkan penolakan jaringan dan kegagalan. Sekarang juga ditetapkan bahwa hMSCs dapat dibudidayakan dan dikembangkan secara in vitro, dan dapat didorong untuk berkembang biak dan berdiferensiasi menjadi jaringan sel fenotipe spesifik seperti khondrogenik, sel osteogenik, adipogenik, dan myogenik dengan menggunakan rangsangan biologis dan fisik [26-29], dan karena itu menyediakan potensi untuk perbaikan dan regenerasi jaringan otot. Sementara potensi terapi hMSCs yang besar telah diakui untuk pengobatan jaringan yang rusak atau sakit, kompleksitas peristiwa yang berkaitan dengan transformasi sel-sel prekursor meninggalkan pertanyaan yang belum terjawab tentang perubahan morfologi, struktur, proteomika, dan fungsional dalam sel batang. Pengetahuan yang lebih rinci mengenai sifat hMSC akan memungkinkan pendekatan yang lebih baik dan lebih efektif untuk ekspansi sel in vitro, dan regulasi keterkaitan mereka terhadap fenotip tertentu. Sebagai contoh, kontrol orientasi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC telah terbukti memodulasi aspek fungsional konstruksi jaringan rekayasa [30,31]. Rekayasa lingkungan yang kondusif untuk orientasi, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC, oleh karena, itu sangat penting dalam rekayasa jaringan. Electrospinning [32-37] adalah teknik menjanjikan untuk menciptakan arsitektur pola serabut untuk mengatur interaksi seluler dan molekuler dari adhesi, proliferasi, diferensiasi, dan orientasi sel induk. Berbagai polimer alam atau sintetis telah digunakan dalam rangka electrospinning untuk membuat dan merancang wadah nanofibrous yang biokompatibel untuk aplikasi jaringan rekayasa. Sebagai contoh, polikaprolakton (PCL) adalah bahan biodegradable yang menunjukkan hampir tidak ada toksisitas, degradasi terkendali, dan tidak mahal [38]. PCL adalah polimer yang semikristalin milik keluarga dari poliester

20

-hidroksi (misalnya, PLA, PGA) dan secara signifikan dapat meningkatkan sifat mekanik dari wadah karena modulus tarik yang tinggi (400 MPa; [39401]). Sifat mekanik tersebut melebihi modulus elastisitas jaringan kartilago (~ l0 MPa) dan di kisaran modulus elastis dari serat kolagen (~500 MPa), menunjukkan bahwa wadah PCL nanofibrous menunjukkan kemungkinan yang sangat baik untuk rekayasa jaringan kartilago. Selanjutnya, PCL baru-baru ini telah digunakan untuk menunjukkan kompatibilitas untuk benih dan mengakomodasi hMSCs dan mendukung diferensiasi multi-lineage [20,21,38]. Pada penelitian ini, pertama kita meninjau teknik berbeda yang digunakan untuk menyelaraskan nanofibers selama electrospinning. Pada bagian berikutnya, kami bertujuan untuk mengatur dan mengukur orientasi hMSC paling tidak pada dua wadah PCL nanofibrous berbeda yang dibuat menggunakan electrospinning. Dengan menggunakan analisis citra canggih, orientasi hMSC pada wadah berorientasi nanofibrous acak dan dihitung selama periode kultur 18 hari. Selain itu, kelangsungan hidup sel jangka panjang, reorganisasi cytoskeletal, dan adhesi sel-nanofiber dieksplorasi dan berkaitan dengan kontak yang disebabkan orientasi hMSC pada nanofibers. Terapi aplikasi stem sel dan jaringan rekayasa dapat ditingkatkan dan difasilitasi oleh pendekatan fisik, seperti yang disajikan di sini, untuk mengendalikan lingkungan mikro untuk pertumbuhan dan diferensiasi sel.

2.2 PEMBUATAN WADAH NANOFIBER DENGAN ELECTROSPUN Teknik untuk baris pintalan nanofibers in situ menggunakan daya repulsi elektrostatik untuk kembali bekerja [41,42] dimana lensa elektrostatik pertama untuk electrospinning diperkenalkan. Ide dari lensa elektrostatik pada

electrospinning didapatkan dengan cepat dalam penelitian lain [43-46] dimana beberapa pengaturan tambahan menggunakan prinsip ini digunakan. Sebuah sketsa dari pengaturan eksperimental digunakan pada referensi [41.42] yang ditunjukkan pada Gambar 2.1. Pancaran mengalir ke bawah dari permukaan tetesan tambahan larutan polimer berhenti pada akhir jarum menuju roda kolektor

21

yang berputar dan ditempatkan pada jarak 120 mm di bawah tetesan itu. Roda aluminium (dengan diameter 200 mm) memiliki tepi runcing dengan sudut setengah dari 26,6 untuk membuat medan elektrostatik yang sangat konvergen. Sebuah perbedaan potensial listrik sekitar 8 kV awalnya diterapkan antara permukaan tetesan cairan dan roda berputar. Ketika beda potensial antara tetesan dan roda meningkat, tetesan mengakuisisi bentuk kerucut seperti (kerucut Taylor). Pada beda potensial cukup tinggi, pancaran stabil muncul dari corong dan pindah ke bawah menuju roda. Pancaran mengalir jauh dari tetesan dalam garis hampir lurus dan kemudian ditekuk ke dalam jalur kompleks yang berada dalam wilayah yang berbentuk kerucut (sampul kerucut, [32]), dengan puncaknya di bagian atas. Kemudian, pada suatu titik tertentu di atas roda, sampul kerucut mulai menyusut, menghasilkan sebuah sampul kerucut terbalik dengan puncaknya di tepi roda. Selama proses elektrospinning, roda diputar pada kecepatan konstan untuk mengumpulkan nanofibers yang berkembang ke tepi yang tajam. Ketika pintalan nanofiber mencapai tepi roda, mereka akan bersinggungan di sekitar roda. Sebuah meja kecil (5 x 4 mm) yang terbuat dari aluminium juga dapat ditempelkan pada tepi roda untuk memudahkan pengumpulan berikutnya dari nanofibers. Meja ini dapat diputar pada sumbu Z (lihat Gambar 2.1) ketika rotasi roda berhenti untuk sementara, maka, arah nanofibers dikumpulkan dapat dikendalikan. Nanofibers dikumpulkan biasanya selama 10 detik. Susunan nanofiber dua dimensi yang khas dibuat dari poli(etilena oksida) (PEO) dengan metode ini ditunjukkan pada Gambar 2.2. Kecepatan linear di ujung kolektor disk adalah 11 rn/s dalam kasus ini. Diameter nanofibers pada Gambar 2.2A tidak seragam dan bervariasi 250-400 nm, dan 200-500 nm. Pemisahan antara nanofibers paralel bervariasi dari 1 sampai 2 m di kedua gambar.

22

Gambar 2.1 Skema proses electrospinning menunjukkan pancaran sampul kerucut ganda. Roda kolektor dapat dilengkapi dengan meja yang membantu untuk mengumpulkan nanofibers. Lempengan ini dapat diputar mengelilingi sumbu Z-ketika rotasi roda untuk sementara berhenti untuk memungkinkan pengambilan lapisan demi lapis pada sudut yang diinginkan antara susunan lapisan nanofiber. (dari Zussman, E., Theron, A., dan Yarin, AL, Appl Phys Lea., 82, 973, 2003. dengan izin.)

Sebuah bagian dari nanofiber yang panjang disimpan di meja tetap dihitung untuk periode singkat. Karena itu, ketika putaran baru nanofiber mengendap ke meja, nanofiber itu sebelumnya ditolak oleh bagian yang mengendap, yang mana masih tetap dihitung. Mekanisme ini memungkinkan pembentukan susunan dua dimensi di meja yang sama dengan yang ditunjukkan pada Gambar 2.2. Kecepatan rotasi linier roda memainkan peran penting dalam peregangan dan penyesuaian bagian nanofiber pada meja setelah pendaratan mereka (lihat Gambar 2.3). Pada kecepatan rotasi roda linear 5-10 m / s, keselarasan nanofiber cukup bisa dicapai (Gambar 2.3c dan e). Sudut (terhadap arah rotasi roda) distribusi yang ditunjukkan pada Gambar 2.3b, d, dan f mengungkapkan bahwa pada kecepatan rendah tidak ada serabut yang diinginkan

23

yang tercapai (Gambar 2.3b); pada kecepatan yang lebih tinggi, distribusi sudut menunjukkan serat yang diinginkan menjadi sempit dengan kecepatan rotasi meningkat linier (Gambar 2.3d dan f). Mekanisme yang sama pada dasarnya bekerja ketika electrospun nanofibers pada Mandril berputar [46-48]. Namun, ketika tidak ada pembatasan lateral yang dikenakan oleh tepi tajam roda (lensa elektrostatik), ekskursi lateral dari serat yang cukup signifikan dan tingkat lebih rendah dari keselarasan mungkin terjadi. Sebuah varian menengah sesuai dengan pita logam (yang setara dengan meja sempit memanjang) dipasang di atas tepi roda yang tajam. Akumulasi strip nanofiber seperti pada pita juga bisa disesuaikan. Ini merupakan alasan mengapa tikar nanofiber terorientasi yang digunakan dalam bagian berikutnya dari buku ini adalah nanofiber electrospun pada pita yang ditempatkan di atas roda tajam yang berputar.

(a)

(b)

24

Gambar 2.2 Pengamatan gambar nanofibers dengan elektron mikroskop (SEM) dengan PEO yang dikumpulkan pada pita karbon yang menempel pada tepi roda kolektor. Dalam (a), diameter serat bervariasi 250-400 nm. Pada (b), diameter serat bervariasi 200-500 nm. Lemparan (pusat ke pusat) bervariasi dari 1 sampai 2 guci di kedua gambar. (Dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL., Nanorechnology, 12, 384, 2001 Dengan izin..)

Ditekankan bahwa tarikan pada bagian nanofiber setelah pendaratan pertama pada kolektor yang berputar, di samping meningkatkan kekuatan tarik, juga diharapkan untuk sejumlah aplikasi biomedis [46-48]. Susunan tiga dimensi nanofiber yang khas (lintang) digambarkan pada Gambar 2.4. Kumpulan nanofiber PEO menunjukkan derajat tinggi kesesuaian. Diameter nanofibers dalam hal ini juga seragam dan bervariasi di kisaran 100-800 nm. Ketika nanofibers yang electrospun ke tepi tajam roda tanpa meja, diperoleh bundel (tali) nanofiber. Gambaran khas dari tali nanofiber dilepaskan dari tepi roda ditunjukkan pada Gambar 2.5. Lamanya proses pengumpulan pada kasus ini adalah 60 detik. Tali itu secara manual terlepas dari tepi roda [41]. Dua detail tali serat polimer SEM yang dihasilkan dengan cara ini diperlihatkan pada Gambar 2.6. Para nanofibers berada dalam kontak, dan hampir tetap paralel hingga jarak jauh.

25

Gambar 2.3 Orientasi nanofiber pada berbagai kecepatan rotasi roda linear: (a) 2,9 m / s; (b) orientasi distribusi serabut yang sesuai dinyatakan dalam sudut sehubungan dengan arah rotasi roda (standar deviasi, SD = 23,44) ; (c) 5,3 m/s ; (d) distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 3,7); (e) 7,7 m/s (f) distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 1,8). Bagian gelombang serabut pada (e) tersebut diberikan merupakan bagian terakhir dari filamen yang dikumpulkan saat medan listrik telah dimatikan. Nanofiber electrospun dari 4 wt% polietilen oksida, PEO (MW = 1000 kDa) dalam etanol / air.

26

Gambar 2.4 Gambaran khas SEM susunan silang dari PEO berbasis nanofibers dikumpulkan di meja aluminium. Struktur crossbar diperoleh dalam proses perakitan berurutan dengan arah penempatan tabel ortogonal. (a) kumpulan dua lapisan dan (b) kumpulan empat lapisan. (dari Zussman, E., Theron, A., dan Yarin, AL, Appl Phys Len.., 82, 973, 2003. dengan izin.)

Gambar 2.5 Sebuah bundel (tali) dari nanofibers manual terlepas dari kolektor. Hampir semua nanofibers dikumpulkan di tepi roda kolektor yang tajam. (dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL., Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan izin.)

27

Gambar 2.6 Gambaran khas SEM dua bundel (tali) nanofibers dengan PEO. Kepadatannya sekitar 100 nanofibers per mikrometer persegi. (Dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL, Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan izin.)

2.3 METODE DAN MATERIAL 2.3.1 Elektrospinning dari Wadah Nanofiber PCL Nanofibers dengan diameter beberapa ratus nanometer diproduksi dengan menggunakan electrospinning seperti yang telah dijelaskan sebelumnya

[32,33,41,42] (lih. Bagian 2.2). Semua wadah polimer nanofiber electrospun dibuat dari PCL dengan berat molekul 80 kDa (Sigma-Aldrich) electrospun dari 10wt% dari larutan metilen klorida / dimetilformamida dengan perbandingan 75/2 (volume). Dua jenis wadah nanofiber PCL electrospun yang berbeda diperoleh dan ditandai sebagai random atau terarah. Wadah acak diproduksi oleh electrospinning polimer nanofibers ke sebuah substrat aluminium datar, menghasilkan wadah nonwoven tanpa orientasi nanofiber yang terpilih. Wadah terarah diproduksi dengan mengumpulkan nanofibers pada pita logam sempit di tepi sebuah roda yang berputar [41,42] (lih. Bagian 2.2), menghasilkan wadah nanofibrous dengan orientasi yang jelas. Cairan electrospun polimer dari semprotan 5 ml melekat pada jarum hipodermik (diameter bagian dalam 0,1 mm) dan menggunakan laju aliran 1 mL / jam. Sebuah elektroda tembaga ditempatkan dalam larutan polimer dan akhirnya electrospun menuju tepi yang tajam dari kolektor listrik beralas (Gambar 2.1). Kekuatan medan listrik adalah 1,1 kV / cm.

28

Kecepatan linier dari tepi kolektor roda adalah 10 rn/s. Semua percobaan dilakukan pada suhu kamar (~25 C) dengan kelembaban relatif udara 40%. SEM digunakan untuk mendapatkan gambar dari setiap jenis wadah nanofibrous PCL. Pengamatan SEM dari wadah PCL dibuat dengan mikroskop S-3000N variabel tekanan elektron hitachi. Instrumen ini memiliki sumber elektron tungsten dan mampu mencitrakan spesimen dalam tekanan variabel mulai 1-270 Pa. Di bawah tekanan variabel, spesimen nonconducting dapat dicitrakan tanpa lapisan film konduktif. Tegangan mempercepat dapat bervariasi selama rentang 0,3-30 kV dengan resolusi 5 nm pada 25 kV. Diameter nanofiber diperkirakan dengan menggunakan prosesor gambar (MetaMorph, Device Molekuler Corp.,

Downingtown, Pennsylvania).

2.3.2 Kulturasi Sel Stem Mesenkimal Manusia dan Pembibitan dalam Wadah Nanofibrous PCL hMSCs diperoleh dari Sumber Sel Stem Mesenkimal Dewasa (Tulane University, New Orleans, Louisiana). Sel dikultur dalam medium pertumbuhan lengkap yang terdiri dari medium Dulbecco eagle yang dimodifikasi (DMEM) ditambah dengan 15% serum janin sapi (FBS), 2 mM L-glutamin, 1%antibiotik, antimikotik (konsentrasi akhir: penisilin 100 g/mL, streptomisin 100 g/mL, dan amfoterisin B 0,25 g/mL). Sel pada tahap 6 yang digunakan dalam percobaan yang ini. Dari material anyaman dan strip nanofibrous electrospun dalam jumlah besar, piringan wadah kecil dengan luas sekitar 0,3 cm2 cocok untuk kultur sel dan percobaan penyemaian. Wadah awalnya direndam dalam etanol 70% selama 1 jam, kering, dan disterilkan di bawah sinar UV selama 6 jam di setiap sisi, dan sebelumnya dibasahi dengan merendam dalam medium kultur sel lengkap dengan serum selama 48 jam untuk meningkatkan adsorpsi protein. Untuk pembenihan hMSCs ke wadah nanofiber PCL, sel dipipet langsung ke wadah dengan kepadatan sel 7,5 x 104 sel/cm2. Medium kultur ditambahkan dan untuk pembiakan jangka panjang, diganti setiap 2 sampai 3 hari.

29

2.3.3 Pengamatan Microscopy Laser Confocal dan Analisis Orientasi Sampel diamati pada hari pertama (24 jam setelah pembibitan awal sel induk ke wadah), dan kemudian pada hari-hari 4, 8, 12, 15, dan 18. Untuk analisis sel orientasi, satu set sampel diwarnai dengan CellTracker CMFDA (15 M, 5chloromethylfluorescein diasetat, Probe Molekuler Invitrogen, Carlsbad,

California) untuk pengamatan fluoresensi dan difiksasi dalam cairan formalin fosfat buffered saline 3,7% (PBS) untuk memastikan bahwa arah dan morfologi sel berada tetap stabil selama pencitraan. Rasio sinyal-suara yang kuat memungkinkan analisis gambaran kuantitatif terpercaya dari orientasi sel. Pengamatan confocal mikroskop multiphoton/laser (Radiance 2000, Bio-Rad, Hercules, California) dan Nikon TE2000-S mikroskop inversi dengan 20x sasaran Plan Apo (NA = 0,75) digunakan untuk menghasilkan gambar. Sementara fluoresensi sel yang diwarnai dengan CMFDA terdeteksi, nanofibers PCL sendiri digambarkan dalam modus refleksi [49]. Bergantian antara mode fluorosensi dan refleksi, sel dan nanofibers dari area yang sama pada sampel dapat dicitrakan. Gambar diambil dari setidaknya lima gambaran yang berbeda dan dipilih secara acak pada setiap sampel pada titik kultur sel yang berbeda dari hari 1 sampai hari 18. Dengan menggunakan analisis pencitraan, orientasi dan serabut sel dengan mengikuti petunjuk (misalnya, sumbu horisontal) dihitung untuk setiap tampilan pencitraan. Pengukuran orientasi sel difasilitasi oleh bentuk memanjang dari hMSCs, yang menampilkan sumbu utama yang jelas.

2.3.4 Viabilitas dan Visualisasi Fluoresensi hMSC Sampel diwarnai menggunakan uji viabilitas sel (Probe Molekuler). Secara singkat, calcein AM (2 M) berdifusi melintasi membran sel hidup dan bereaksi dengan esterase intraseluler untuk memancarkan fluoresensi hijau, sementara etidium homodimer-1 (4M) hanya dapat masuk ke sel mati dengan membran sel yang rusak dan memancarkan fluoresensi merah ketika berikatan dengan asam nukleat. Untuk setiap sampel, jumlah sel dan persentase sel hidup dan mati ditentukan dari setidaknya tiga area yang dipilih secara acak.

30

Mikrofilamen diwarnai menggunakan rhodamine-phalloidin (170 nM, Probe Molekuler). Sampel dari hari 4 dan 18 dipilih untuk pewarnaan microfilament dan difiksasi dalam larutan formaldehida PBS 3,7%. Untuk permeabilisasi membran sel, sampel ditempatkan pada Triton X-100 0,5% dalam larutan PBS selama 5 menit pada suhu 4 C dan dicuci tiga kali dengan PBS. Untuk menahan daerah ikatan non spesifik, sampel sebelumnya diinkubasi dengan BSA 1% selama 30 menit dan dicuci tiga kali dengan PBS. Filamen aktin diwarnai semalaman dengan rhodamine-phalloidin dalam BSA 1%. Adhesi struktur khas hMSC-nanofiber ditemukan dan selanjutnya diperiksa menggunakan mikroskop perbesaran tinggi.

2.3.5 Statistik Untuk setiap gambaran sel yang disemai pada sampel wadah berorientasi nanofibrous hari 1, 4, 8, 12, 15, dan 18, arah sudut rata-rata sel dan arah sudut rata-rata serabut sehubungan dengan arah petunjuk dihitung. Perbedaan antara dua kuantitas menentukan sudut relatif sel-nanofiber. Selain itu, distribusi sudut relatif sel yang mengikuti sudut rata-rata arah serabut rata-rata yang diperoleh untuk tiga gambaran pada setiap sampel wadah. Ketiga distribusi dianalisis secara statistik dengan uji dua sisi t dan varians Students tidak ditentukan signifikan secara statistik (p> 0,05). Oleh karena itu, dengan menggabungkan data dari tiga gambaran terpisah, distribusi secara keseluruhan dibentuk setiap hari. Sudut ratarata sel-serat relatif diperoleh bersama dengan standar deviasi yang sesuai untuk setiap hari. Rata-rata sudut relatif sel-serat 10o atau kurang mengisyaratkan keselarasan paralel sel dengan arah nanofibers di dasarnya. Mengenai wadah nanofibrous acak, semua nilai dalam distribusi sudut sel-nanofiber memiliki probabilitas yang sama dan karena itu nilai sudut rata-rata tidak dapat ditentukan. Meskipun demikian, distribusi sel-nanofiber sudut dalam wadah nanofibrous acak dapat secara kualitatif dibandingkan dengan wadah nanofibrous yang terorientasi.

31

2.4 HASIL DAN PEMBAHASAN 2.4.1 Karakterisasi Wadah Nanofibrous PCL Electrospun Pencitraan SEM dilakukan untuk mengamati struktur morfologi nanofibers masing-masing pada dua jenis wadah (acak atau terarah). Wadah acak (Gambar 2.7a) terbukti terdiri dari nanofibers yang tidak memiliki arah yang ditentukan. Sebaliknya, wadah terarah (Gambar 2.7b) menunjukkan nanofibers dengan arah yang ditentukan (pada kasus ini utara-selatan). Mayoritas nanofibers dalam wadah yang berorientasi selaras satu sama lain. Diameter rata-rata nanofiber diperkirakan sekitar 820 340 nm. Berdasarkan gambaran SEM, porositas wadah jenis ini yang cocok untuk adhesi, proliferasi, dan kelangsungan hidup sel.

(a) (b)

Gambar 2.7 SEM gambar nanofibers PCL dalam (a) acak dan (b) wadah PCL terarah. Gambaran putih terlihat di kedua frame fragmen PCL yang berasal dari pembentukan kerak polimer di pintu keluar nosel aparat electrospinning.

2.4.2 Arah Sel dan Nanofibers pada Wadah Acak dan Terarah hMSCs dan nanofibers dicitrakan secara bersamaan oleh pengamatan microskopi laser confocal (LSCM) untuk mengetahui pengaruh arah electrospun nanofiber PCL pada barisan sel. Gambar 2.8 menampilkan gambar superimpose, pseudocolored dari hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) pada (a1) acak dan (b1) wadah nanofibrous berorientasi PCL setelah kultur sel 1 hari. Ketika gambar superimpose jelas terlihat bahwa hanya setelah 24 jam inkubasi, ada perbedaan

32

yang signifikan dalam orientasi hMSCs dikultur di atas wadah acak dibandingkan dengan bahwa pada wadah berorientasi. Sudut orientasi hMSCs terhadap sumbu horisontal ditentukan untuk sampel wadah acak dan berorientasi. Histogram mewakili distribusi sudut orientasi hMSC setelah kultur sel 1 hari ditampilkan di bar hijau grafik Gambar 2.8. Sebagaimana yang dijabarkan oleh distribusi terbatas sudut sel ditunjukkan pada histogram Gambar 2.8b2 (standar deviasi 16), hMSCs diinduksi agar sesuai pada wadah nanofibrous berorientasi. Selanjutnya, deretan sel pada wadah berorientasi hampir serupa dengan wadah nanofiber terarah (Gambar 2.8b3), dimana standar deviasi dari distribusi sudut nanofiber adalah 15. Di sisi lain, penyemaian sel di wadah nanofibrous acak selama 24 jam tidak menunjukkan arah sel yang diharapkan (Gambar 2.8a1), dipastikan oleh besarnya sudut distribusi di histogram 2.8a2 Gambar. Demikian juga, di wadah nanofibers acak juga menunjukkan distribusi sudut yang besar (Gambar 2.8a3). Arah hMSCs dan nanofibers pada setiap jenis wadah setelah kulturasi yang lebih lama dari 18 hari sangat mirip dengan yang ditemukan setelah kulturasi sel hari pertama. Hasil hari ke-18 ditampilkan dalam Gambar 2.9. hMSCs yang dikultur pada wadah nanofibrous terarah (Gambar 2.9b1) selama 18 hari terus mempertahankan tingkat yang sangat baik dari deretan sel berbentuk bola. Hal ini ni dikonfirmasi lagi oleh histogram untuk deretan sel spasial pada wadah terarah (Gambar 2.9b2) dan nanofiber terarah (Gambar 2.9b3); keduanya menunjukkan distribusi sudut yang terbatas (standar deviasi 20 dan 32, masing-masing) dan korespondensi yang baik satu sama lain. hMSCs yang dikultur pada wadah terarah menunjukkan morfologi yang lebih tipis dan lebih memanjang secara kualitatif dibandingkan sel yang dikultur pada wadah acak, menunjukkan bahwa bentuk sel mungkin telah terpengaruh oleh susunan struktur nanofiber. Mirip dengan hasil yang diperoleh setelah 1 hari masa inkubasi, hMSCs yang dikultur di wadah acak setelah 18 hari (Gambar 2.9a1) tidak menunjukkan arah sel yang signifikan dan mempertahankan distribusi sudut orientasi sel yang lebih luas, lebih dari 180 (Gambar 2.9a2), yang berkorelasi dengan distribusi dari sudut orientasi nanofiber acak (Gambar 2.9a3). Harus dicatat, bahwa bagaimanapun,setelah 18 hari kultur sel, hMSCs muncul untuk menunjukkan beberapa bidang self-alignment "Lokal"

33

di wadah acak. Seperti yang terlihat di bagian kiri bawah Gambar 2.9a, beberapa sel tampaknya menunjukkan orientasi sesuai arahan, seperti ditegaskan oleh bagian berbentuk lonceng dari distribusi sudut sel yang sesuai di Gambar 2.9a2. Temuan ini berkaitan dengan proliferasi dan konfluen kultur sel daripada deretan sel diarahkan oleh nanofibers di dasarnya. Kumpulan hMSCs lokal ini, yang terjadi meskipun keacakan dari serabut yang mendasari, tidak memiliki ciri susunan berbentuk bola yang dilihat pada wadah berorientasi (Gambar 2.9b1). Tetapi, kurangnya kontrol atas sel orientasi-meskipun dengan skala lokalmenyebabkan efek lokal ini berarti mempengaruhi keseluruhan hasil dari percobaan ini, yaitu, untuk menyesuaikan sel secara global dan terkendali.

Gambar 2.8 (Lihat sisipan warna halaman 206.) Gambar superimpose dan pseudocolored hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) dalam (al) dan acak (b1) wadah nanofibrous PCL terarah setelah 24 jam kultur sel. Histogram mewakili

34

distribusi sudut arah sel dengan terhadap sumbu horisontal hMSCs pada (a2) wadah acak dan (b2) terarah. Histogram menggambarkan distribusi sudut orientasi nanofiber dengan arah horisontal untuk (a3) wadah acak (b3) dan berorientasi. Histogram pada (a2) dan (a3) dibangun berdasarkan ukuran 127 sel dan 234 nanofibers, sedangkan 124 sel dan 242 nanofibers digunakan untuk membuat histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.

Gambar 2.9 Gambar superimpose dan pseudocolored hMSCs (terang) dan nanofibers (gelap) dalam (al) wadah nanofibrous PCL acak (bi) dan beriorentasi setelah 18 hari kultur sel. Histogram mewakili distribusi sudut orientasi sel

35

dengan terhadap sumbu horisontal untuk hMSCs pada wadah (a2) acak (b2) dan berorientasi. Histogram menunjukan distribusi sudut orientasi nanofiber dengan terhadap sumbu horisontal untuk wadah (a3) acak (b3) dan berorientasi. Histogram di (a2) dan (a3) dibuat berdasarkan pengukuran dari 132 sel dan 194 nanotibers, sedangkan 138 sel dan 258 nanofibers digunakan untuk membangun histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.

2.4.3 Kesejajaran

hMSC

Konsisten

Jangka

Panjang

dalam Wadah

Nanofibrous Terarah Efektivitas wadah nanofibrous PCL terarah dalam meningkatkan barisan sel dari penyemaian hMSCs ini dianalisis secara kuantitatif pada waktu yang berbeda. Distribusi sudut relatif sel ditentukan untuk wadah berorientasi dengan mengurangi sudut rata-rata nanofiber dari distribusi sudut, sel dan menentukan sudut rata-rata relatif sel-serat pada setiap titik waktu. Hasil untuk sampel yang dibiakkan dari hari ke-1 sampai hari ke-18 yang digunakan sebagai ukuran untuk menilai efikasi dan pengaruh waktu terhadap perubahan deretan hMSC. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2.10, untuk semua sampel wadah nanofibrous berorientasi dari hari 1 sampai hari ke-18, sudut sel relatif sekitar 10. Oleh karena itu, keakuratan dan konsisten keselarasan sel pada wadah nanofibrous berorientasi ditetapkan untuk kulturasi awal dan jangka panjang. Dari hari ke-1 hingga hari ke-18, standar deviasi distribusi sudut relatif sel-serat untuk wadah nanofibrous berorientasi tetap pada kisaran 15 - 30 , dengan semua nilai ratarata harian dalam satu standar deviasi dari sudut referensi umum dari 0 (keselarasan sempurna). Hal ini menunjukkan bahwa lampiran hMSC awal untuk wadah nanofibrous bertahan untuk periode inkubasi 18 hari.

36

Gambar 2.10 Kesesuaian hMSC sementara pada wadah nanofibrous berorientasi. Analisis uji t (dua-sisi, tidak berpasangan) menunjukkan bahwa setidaknya tiga gambaran dari setiap wadah nanofibrous setiap hari secara statistik tidak signifikan (p> 0,05), dan sudut rata-rata orientasi relatif sel dan deviasi standar yang ditentukan untuk yang sampel wadah nanofibrous berorientasi pada hari ke1, 4, 8, 12, 15, dan 18. Rata-rata sudut relatif sel-serat pada wadah nanofibrous berorientasi setiap hari nya berkisar 10 , menunjukkan keselarasan yang sangat baik dengan nanofibers didasarnya. Garis kekeliruan menunjukkan dua standar deviasi ( o). 2.4.4 Viabilitas hMSC dalam Wadah Nanofibrous PCL Kelangsungan hidup jangka pendek dan jangka panjang dari kultur hMSCs pada wadah acak dan terarah diuji dengan menggunakan alat tes fluoresensi hidup/mati. Untuk setiap jenis wadah, jumlah sel-sel hidup dan mati dihitung dari setidaknya tiga bidang sel biakan yang berbeda setelah 4 dan 18 hari. Persentase sel hidup dari jumlah total sel dihitung dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2.1. Selanjutnya, dari jumlah total sel yang diamati, kepadatan rata-rata sel dihitung dengan mengukur bidang dan ekstrapolasi data dalam satuan sel per sentimeter persegi. Sebagian besar sel yang ditanam pada kedua jenis wadah yang hidup (> 70%), tetapi viabilitas mereka lebih rendah daripada yang sel dikultur diamati dalam percobaan kontrol (misalnya, pada piring petridis). Persentase viabilitas sel yang lebih rendah dapat dikaitkan dengan fakta bahwa kami menggunakan

37

hMSCs yang tidak berdiferensiasi tetapi tinggi proliferasi. Sebagai contoh, meskipun kerapatan penyemaian awal hMSC sedang (7,5 x cells/cm2), hMSCs cepat berkembang biak dan mengumpul. Seperti terlihat pada Tabel 2.1, kepadatan sel pada kedua wadah nanofibrous, acak dan terarah, meningkat secara signifikan dari hari ke hari ke-4 hingga ke-18, sedangkan persentase sel hidup relatif tetap konstan. Karena PCL adalah bahan yang dikenal biokompatibel, mungkin pengaruh untuk kelangsungan hidup hMSC lebih rendah. Sebaliknya, dicurigai bahwa kepadatan penyemaian sel yang optimal bisa meningkatkan viabilitas sel. Sebagai contoh, kepadatan awal penyemaian sel pada wadah nanofibrous PCL telah terbukti menjadi faktor penting untuk viabilitas, proliferasi, dan diferensiasi hMSC awal dan jangka panjang [20,21,38,50]. Diharapkan, bagaimanapun, bahwa ketika hMSCs diinduksi untuk berdiferensiasi keturunan sel tertentu, penurunan proliferasi hMSC akan menghasilkan viabilitas sel lebih baik. Selain tu, meskipun wadah nanofibrous electrospun yang digunakan dalam percobaan ini disterilisasi dengan udara kering dan berikutnya direndam dalam medium kultur sel, tidak ada wadah yang ditempatkan dalam ruang vakum sebelum sterilisasi. Melakukan langkah ini dalam penelitian selanjutnya harus menghilangkan pelarut organik sisa dari proses electrospinning yang dapat merugikan kelangsungan hidup sel.

TABEL 2.1 Viabilitas hMSC yang Dinyatakan sebagai Persentasi Sel Hidup dan Jumlah Total Sel yang Diperiksa Hari 4 Sampel Acak Terarah 8 Acak Terarah % Hidup 76 80 73 76 Sel yang dilihat /cm2 7,0 x 104 11,6 x 104 32,9 x 104 20,2 x 104

38

2.4.5 Reorganisasi Sitoskeletal dan Adhesi hMSC-Nanofiber Elongasi sel yang disebabkan oleh nanofibers PCL diharapkan untuk mengubah struktur sitoskeletal yang mengatur morfologi, adhesi, dan pergerakan sel. Mikrofilamen dari hiMSCs dibiakan selama 4 hari pada wadah nanofibrous PCL acak dan berorientasi pada kaca diwarnai fluoresens terang dengan rhodamine-phalloidin dan dicitrakan menggunakan LSCM. hMSCs dikultur pada substrat kaca menunjukan penyebaran morfologi sel yang khas dan diharapkan (Gambar 2.lla). Serabut aktin yang besar terlihat dan bertanggung jawab untuk adhesi hMSC yang lebih kuat pada substrat datar (2D) [51]. Banyak serat yang tegang muncul untuk berkumpul dan berakhir pada satu titik yang sama pada membran sel, dapat membentuk daerah titik kontak. Dibandingkan dengan mikrofilamen yang ditemukan di kultur hMSCs pada substrat datar,susunan aktin sitoskeletal diamati pada kultur hMSCs di atas wadah nanofibrous PCL acak dan berorientasi jauh berbeda. Sebagai contoh, hMSCs yang ditanam pada wadah nanofibrous acak dan berbudaya selama 4 hari (Gambar 2.11 ib) menunjukan elongasi morfologi sel dan actins berkonsentrasi padat. Menariknya, struktur aktin tipis berserat antara hMSCs dan nanofibers sekitarnya jelas, dan mudah terlihat pada daerah yang dilingkari pada Gambar 2.l1b dengan panah menunjuk ke nanofiber PCL berdekatan. Ketika hMSCs adalah disemai di wadah nanofibrous PCL berorientasi, sel lebih memanjang dan sejajar di samping bundel nanofiber, yang digambarkan juga dengan anak panah pada Gambar 2.llc. Actins pada bderetan sel tersebut juga berkonsentrasi padat, dan bundel filamen aktin ada yang sebagian besar berderet dalam arah yang sama dengan nanofibers berdekatan. Bagaimanapun, lapisan tipis fibrous seperti struktur aktin menghubungkan hMSC dengan bundel nanofiber disebelahnya juga diamati, terutama pada daerah yang dilingkari dari Gambar 2.llc. Temuan ini mengarah pada gagasan mengenai karakteristik unik ikatan hMSC ke nanofibers. Hasil kami, konsisten dengan sebelumnya, menyatakan bahwa kultur sel otot polos pembuluh darah pada wadah polimer nanofibrous juga mengembangkan hubungan fibrous yang serupa [1]. Perlu diingat, bagaimanapun, bahwa gambar yang dilaporkan memberikan bukti kemungkinan adhesi Celi-nanofiber diperoleh dengan menggunakan SEM.

39

Sebaliknya, temuan kami menunjukkan bahwa tidak hanya koneksi fibrous yang serupa yang ditemukan di interaksi hMSC-nanofiber, tetapi juga kemungkinan keterlibatan filamen aktin dalam perkembangan unik struktur seperti adhesi ini. Menarik juga untuk dicatat bahwa jaringan aktin padat diamati pada kultur MSCs terelongasi pada wadah nanofibrous acak dan berorientasi yang muncul mirip dengan sitoskeleton yang diamati dalam kondrosit artikular yang matang, terutama pada permukaan artikular [52], menunjukkan bahwa penggunaan wadah polimer nanofibrous berorientasi bisa menguntungkan untuk meniru jaringan tulang rawan artikular lebih baik [19-21]. Karena rekayasa jaringan yang sukses akan memerlukan bahwa konstruksi jaringan rekayasa meniru struktur mikro dan nano, keselarasan spasial, dan fungsi dari jaringan alami, penggunaan wadah nanofibrous yang optimal dikombinasikan dengan manipulasi hMSCs dapat menghasilkan wadah biomimetik yang paling kompatibel.

Gambar 2.11 Gambaran fluorescent dari mikrofilamen hMSCs setelah 4 hari kultur sel pada (a) permukaan kaca datar, dan (b) dalam wadah PCL acak (c) atau

40

berorientasi. Tidak ada adhesi fibrous seperti batas ditemukan ketika sel-sel ditempatkan pada substrat khusus, tetapi perbatasan yang mengandung aktin tampak, dibentuk oleh hMSC untuk melekat pada nanofibers. Struktur unik ini akan diteliti lebih lanjut untuk menguji keberadaan adhesi protein seperti integrin dan protein intraseluler lainnya. 2.5 KESIMPULAN Dalam penelitian ini, teknik untuk penyelarasan nanofiber di electrospinning telah dibahas dan digunakan dalam kultur sel induk. hMSCs berhasil dikultur pada dua jenis wadah nanofibrous PCL electrospun. Orientasi sel terhadap jaringan pendukung nanofiber dihitung. Efektivitas hMSCs untuk menyesuaikan arah nanofibers terarah diamati. Kultur hMSCs pada wadah nanofibrous PCL berorientasi menunukan deretan sel yang paling akurat dan konsisten. Viabilitas sel diuji untuk memastika bahwa hMSCs yang layak dan berproliferasi pada wadah nanofibrous PCL selama 18 hari kulturasi sel. Selain itu, perubahan aktin sitoskeletal hMSC pada wadah nanofibrous diamati, dan keberadaan

mikrofilamen itu terungkap dalam adhesi serabut yang menyerupai batas yang menghubungkan hMSCs dengan nanofibers yang berdekatan. Penelitian lebih lanjut sedang dilakukan untuk menguji diferensiasi chondrogenic dari hMSCs pada wadah nanofibrous PCL berorientasi dan efek dari berbagai diameter nanofiber dan porositas wadah. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan bahwa rekayasa lingkungan ECM yang terorientasi untuk mengatur keselarasan jaringan dapat dioptimalkan oleh nanofibers electrospun oriented, dan bahwa aplikasi rekayasa jaringan tertentu seperti membuat zona dangkal kartilago artikular dapat meningkat secara signifikan dengan menggabungkan sel batang dan nanomaterials.