Nama : Putri Ramadani NRP : G34080053 Kelompok : 20 Lab.

Bio4

Asisten : Rian Pratiwi Lida Puspaningtyas Yulita Fitriana G340700 G34070062 G34062968

ISOLASI PLASMID, QUANTIFIKASI DNA, DAN ANALISIS KUALITAS

Pendahuluan Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA didalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti 2006). Plasmid dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing sehingga untuk mengetahuinya dilakukan beberapa percobaan (Anam 2010). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis, dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers 1999).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Anam 2010). Tujuan Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat mengetahui dan mengisolasi plasmid untuk vektor kloning sehingga konsentrasi dan analisis kualitas DNA/RNA dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Prosedur Percobaan a. Isolasi Plasmid sebanyak 1,5ml kultur bakteri Escherichia coli disentrifugase selama 5 menit, 10.000rpm peletnya diambil ditambahkan larutan A sebanyak 200L kemudian divortek ditambahkan larutan B sebanyak 200L

dibolak balik sebanyak 10x menambahkan larutan C sebanyak 200L dibolak balik sebanyak 10x kemudian disentrifugasi selama 10menit, 10.000rpm supernatan + PCI (1xvolume) divortek sampai terlihat endapan berwarna putih susu disentrifugasi selama 10menit, 10.000rpm supernatan (fase atas) 500L dipindahkan ke efendorf ditambahkan 0,1 volume NaOH dan 2-3x volume EtoH 100% diinkubasi freezer selama 30menit (seminggu) disentrifugasi selama 5menit, 14.000rpm dikeringkan ditambahkan dd H2O RNase 370C b. Elektroforesis hasil isolasi plasmid diambil sebanyak 10L ditambahkan 2L loading dye elektroforesis

Hasil Percobaan

Gambar1 hasil elektroforesis sel agarose DNA Keterangan : Sumur yang memiliki plasmid adalah sumur ke 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, dan 13 (dilihat dari kiri kekanan) Sumur yang tidak ada plasmidnya adalah sumur ke 4, 6, 12 (dilihat dari kiri kekanan) Sumur 1 adalah sumur lamda Sumur 2 adalah sumur pGEM Pembahasan Ukuran DNA dapat dilihat dari jarak pita yang muncul pada sumur ketika dielektroforesis. Kerusakan DNA ditandai oleh pita smear pada hasil elektroforesis. Tidak dapatnya DNA dipotong dengan enzim restriksi terlihat dari terbentuk tidaknya pita smear hasil elektroforesis setelah DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. EcoRI menghasilkan pita DNA smear ketika dielektroforesis karena enzim ini termasuk ke dalam frequent cutter (Vos et al 1995). Berdasarkan hasil pengamatan pada sumur hasil elektroforesis sel agarose DNA, dapat diketahui bahwa sumur yang berhasil yaitu sumur yang memiliki plasmid dan terlihat pendarannya (pita) yang dibedakan dengan pendaran kontrol, yaitu lamda dan pGEM seperti sumur 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, dan 13 (gambar1). Sementara yang tidak berhasil yaitu sumur 4, 6, dan 12 (gambar1). Ketidakberhasilan ini

dikarenakan pita DNA elektroforesis tidak terbentuk (pendaran). Hal ini disebabkan karena DNA tidak dapat dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan kemungkinan cairan DNA yang akan dielektroforesis kotor sehingga pada saat migrasi kotorannya ikut masuk. Pada saat percobaan terdapat beberapa larutan yang dipakai untuk mengisolasi plasmid sampai elektroforesis. Proses isolasi plasmid, endapan bakteri disuspensi menggunakan larutan A (EDTA). Hal ini disebabkan larutan A berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkelat yang dapat mengikat ikatan kation sehingga dapat menurunkan tegangan. Endapan yang telah tersuspensi diberi larutan B (NaOH dan SDS). Tujuan pemberian larutan ini untuk melisiskan bakteri dan menaikkan pHnya. Setelah lisis bakteri diberi larutan C (sodium asetat) yang berfungsi untuk menetralisasi serta menurunkan pH. Selain ketiga larutan tersebut, cairan DNA plasmid diekstrak dengan larutan PCI (Fenol/Kloroform/Isoamil alkohol) dan diberi etanol 70% untuk menghilangkan kandungan garamnya. Pada proses elektroforesis, DNA yang akan dimigrasikan dicampur dengan larutan loading dye dan blue bromophenol. Hal ini untuk menandai laju migrasi DNA dan sebagai larutan pewarna. Kesimpulan Dari hasil isolasi dan elektroforesis DNA gel agarose dapat disimpulkan bahwa elektroforesis dikatakan berhasil jika terlihat pita (pendaran) yang panjang dan dibedakan dengan sumur kontrol, yaitu lamda dan pGEM. Jarak pita ini menandakan ukuran DNA yang muncul pada sumur. Ketidakberhasilan dalam elektroforesis dikarenakan tidak terlihatnya pita DNA. Hal ini disebabkan karena DNA tidak dapat dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan kemungkinan cairan DNA yang akan dielektroforesis kotor sehingga pada saat migrasi kotorannya ikut masuk.

Daftar Pustaka Anam K. 2010. Isolasi dan pemetaan DNA plasmid. Bogor : Bioteknologi Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Saunders & Parker. 1990. Molekuler Biotechnology, Principles and Applications of
Recombinan DNA. Washinton DC : ASM Press. Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun praktikum pelatihan teknik pengklonan gen. Bogor : Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Vos et al. 1995. Pengantar kloning gen (terjemahan). Yayasan Essentia Medica.