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CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS MEDICINAIS

Profa. Dra. Ana Maria Soares Pereira Unidade de Biotecnologia Vegetal da UNAERP, Av. Costabilie Romano 2201 Cep 14096-380. Ribeiro Preto-SP. E-mail: Apereira@unaerp.br. As plantas produzem substncias destinadas ao seu crescimento a exemplo dos polissacardeos, acares e protenas os quais so considerados compostos do metabolismo primrio. Compostos especiais, tambm denominados de metablitos secundrios so sintetizados por diferentes rotas metablicas produzindo uma imensa diversidade de estruturas qumicas dentro da classe dos alcalides, flavonides, cumarinas, terpenides etc. Os metablitos secundrios exercem importantes papis de proteo contra microorganismos, herbvoros, intempries ambientais, alm de interferirem em processos simbiticos e atrao de polinizadores (Briskin, 2000). So tambm fontes armazenadoras de carbono e nitrognio que retornam ao metabolismo primrio quando isso requerido pela planta. O balano entre a atividade do metabolismo primrio e secundrio da planta dinmico e pode ser consideravelmente afetado pelo crescimento da planta, diferenciao dos tecidos, fase vegetativa e estresse ambiental. Mais de 100.000 compostos secundrios de plantas j foram isolados e identificados, e a cada ano centenas de novas descobertas tem aumentado esse nmero (Verpoorte et al., 1988). Muitos destes compostos so consumidos diariamente por ns na forma de dentifrcios, sabonetes, perfumes ou mesmo ingeridos em de alguns alimentos, condimentos, chs, xaropes etc. O consumo de cosmticos e medicamentos elaborados a partir de produtos naturais tem crescido nos ltimos anos e isso tem estimulado empresas como a Merck & Co a investir 10% de seus recursos financeiros em pesquisas com novas substncias de origem vegetal (Nader & Mateo, 1998). Apesar do grande consumo direto ou indireto e tambm do investimento financeiro de muitas empresas em produtos naturais, esses sem dvida alguma tm sido pouco estudados em relao ao seu potencial farmacolgico.

A eficcia e segurana de muitas plantas medicinais j foram comprodavas cientificamente o que as legitimizam como recurso teraputico benfico e

indispensvel para humanidade. Entretanto, h problemas de vrios nveis que limitam o seu uso. Entre eles podemos citar: Dificuldade de identificao botnica, muitas plantas possuem

semelhanas morfolgicas que s podem ser distinguidas por especialista. Algumas espcies sintetizam os metablitos secundrios em

concentraes muito baixas o que exige processos de extrao dispendiosos e elaborao de fmulaes farmacuticas complexas. Os exemplos mais importantes so os das substncias com atividade anti-cancer. Algumas espcies apresentam enorme obteno de droga padronizada. Muitas espcies esto sob forte presso antrpica, expostas a eroso gentica e reduo drstica de populaes endmicas o que dificulta a utilizao em larga escala. A cultura de clulas e tecidos pode ser empregada no sentido de resolver ou minimizar alguns dos pontos citados acima, seja na multiplicao sistematizada de plntulas elites pelo processo de micropropagao ou seja na produo de metablitos secundrios que tenham relevncia do ponto de vista teraputico e que por algum tipo de impedimento no podem ser produzidos por sntese. A produo de clulas e tecidos vegetais por meio de cultura de calos, de razes, de plntulas, de clulas em suspenso, fuso de protoplasto etc. so estabelecidas a partir dos objetivos que se pretende alcanar. Vrias tcnicas podem, por exemplo, auxiliar na seleo de sementes ou propagulos para domesticao e multilplicao de plantas. A grande maioria das plantas medicinais so coletadas em hatitat natural e por maior que seja o nmero de indivduos numa localidade no so suficientes para atender uma demanda constante e ininterrupta, principalmente quando a espcie tem multi-usos. Apenas o cultivo sistematizado pode garantir produo variabilidade gentica com

alteraes quanti e qualitativas nos metablitos secundrios o que dificulta a

regular e em larga escala. Para se estabelecer sistemas de cultivo adequados se faz necessrio material propagativo como sementes, tubrculos, estoles, enfim algum tipo de estrutura que permita a multiplicao da planta alvo. Muitas espcies mecidinais apresentam problemas com as sementes ou com partes vegetativas que limitam a sua multiplicao em escala. para essas espcies que as tcnicas de cultivo in vitro so indicadas. Exemplos importantes so: espcies de Dioscorea, Digitalis, Chlorophytum, Pysichotria ipecacuanha, Commiphora wightii, Taxus brevifolia, Cinchona etc. A germinao de sementes de algumas espcies medicinais podem aumentar muito quando so utilizados mtodos de cultura de tecidos, principalmente quando as sementes apresentam dormncia, endosperma reduzido, ou grande infestao de microorganismos (Fay, 1992). A micropropagao a tcnica de maior aplicabilidade da cultura de tecido e tem sido utilizada para multiplicar centenas de espcies medicinais. Essa tcnica usada rotineiramente para multiplicar gentipos selecionados, ou para substituir acessos que tenham adquirido caracteres indesejveis como baixa produtividade e susceptibilidade doenas. Plantas que so cultivadas em larga escala, fora de seu centro de origem, tambm tm sido micropropagadas como, por exemplo a Atropa belladonna, Rauwolfia serpentina, Dioscorea floribunda, varias espcies de Mentha etc. O declnio no teor de princpios ativos ou de leos essenciais em plantas medicinais comum quando estas so cultivadas por longos perodos e

submetidas vrios cortes. Nesses casos, renovao e reintroduo de plantas so necessrias quando se deseja manter alta produtividade desses constituintes ativos para a manuteno de programas de cultivo viveis economicamente. Espcies de Mentha, Citronella e Cymbopogon tm sido micropropagadas em larga escala para atender a esses programas. Eclipta alba (L) Hassk. uma Asteraceae cosmopolita, possui atividade anti-hepatotxica que atribuda a dois cumestanos: wedelolactona e demetilwedelolactona. As sementes dessa espcie apresentam boa germinao,

entretanto o estabelecimento de um cultivo em escala, a partir de sementes, visando a produo de extratos invivel, uma vez que apresenta diferentes quimiotipos com produo irregular dos compostos de interesse. Frana et al (1995) desenvolveram a micropropagao a partir de segmentos nodais dessa espcies e estabeleceram um protocolo eficiente para produo em escala de E. alba. Esse tipo de propagao promove o desenvolvimento de estruturas morfologicamente pr-existentes e a exposio de segmentos nodais a concentraes adequadas de fitoreguladores e nutrientes estimula a quebra de dormncia das gemas axilares e promove uma rpida multiplicao de novas plntulas. Protocolos de micropropagao de Maytenus aquifolia e Maytenus ilicifolia, espcies que tambm apresentam quimio e morfotipos, foram desenvolvidos em nossos laboratrios da Unidade de Biotecnologia da UNAERP visando o cultivo em escala. Plantas micropropagadas apresentaram a mesma produtividade em fitomassa e o mesmo perfil qumico das matrizes doadoras de explantes (Pereira et al, 1994; Pereira et al 1995). A mesma metodologia de propagao in vitro foi desenvolvida com o Stryphnoclendron polyphythum (barbatimo) cuja

atividade cicatrizante atribuda aos taninos presentes na casca da rvore (Frana et al, 1995). Pothomorphe umbellata uma espcie medicinal tambm conhecida como caapeba ou pariparoba, est inscrita na farmacopia brasileira devido sua ao anti-lcera, colagoga e anti-hepatotxica. Recentemente, foi isolado dessa espcie um composto denominado N-benzoilmescalina que tem atividade bactericida contra Helicobacter pylori (Isebe, et al 2002). Micropropagao via organognese direta a partir de segmento de folha foi estabelecida com objetivo de se obter plntulas em escala para cultivo convencional, uma vez que as sementes apresentam graves problemas com a germinao (Pereira et al, 2000). Atualmente, as tcnicas de biologia molecular com marcadores do tipo RAPD, AFLP, RFLP e microsatelite tem permitido conferir a fidelidade gentica dos clones obtidos a parti da micropropagao. Estudos realizados com Angelica

acutiloba e Angelica sinensis cultivadas na sia, utilizando marcadores do tipo RAPD e RFLP, mostraram a proximidade gentica existente entre as plantas avaliadas, e os acessos que foram micropropagados a partir de Angelica acutiloba quando comparados com a planta matriz no apresentaram bandas polimrficas (Watanabe et al, 1988). Angelica sinensis, espcie extremamente popular na China, contm ligustilido como componente majoritrio do leo essencial e a planta utilizada por mulheres para regular a menstruao, e tambm para prevenir doenas vasculares. Achillea millefolium uma espcie medicinal utilizada em vrios pases da Europa e Amrica, e consta nas principais farmacopias do mundo devido sua ao anti-inflamatria atribuda ao azuleno e ao espasmdica devido a presena de flavonides. Entretanto, h quimiotipos nessa espcie que

apresentam substncias alergnicas, o que compromete a questo de eficcia e segurana da droga. Alm disso, espcies denominadas Achillea asplenifolia, A. roseoalba e A. collina so quase sempre confundidas com A. millefolium devido a semelhana morfolgica. Wallner et at, (1996) desenvolveram um protocolo de micropropagao de Achillea e avaliaram a proximidade gentica de todas essas plantas com objetivo de encontrar uma metodologia adequada para avaliar

diferentes acessos de Achillea. Os resultados obtidos com marcadores do tipo RAPD e RFLP apontaram variaes intra e interespecficas nos materiais avaliados e num dos clones foi registrado uma mutao, o que permitiu constatar variabilidade criada sob condies in vitro. Gavidia et al. (1996) selecionaram 15 plantas de Digitalis obscura, espcie medicinal que produz cardenoldeo, e aps quantificarem esse composto em todos os acessos selecionaram a planta que apresentou maior teor da droga e a micropropagaram por dois anos consecutivos. Aps esse perodo, compararam o perfil gentico do clone e da matriz, concluindo que o protocolo de micropropagao utilizado preservou a integridade gentica do material estudado e esse resultado foi corroborado pelas anlises realizadas em CLAE

(cromatografia liquida de alta eficincia) cujos similaridade entre o clone e a matriz.

cromatogramas mostraram

Estudos realizados sobre fidelidade gentica usando RAPD tambm foram conduzidos com plantas micropropagadas de Zingiber officinales e os resultados foram semelhantes aos obtidos com Digitalis obscura, ou seja dos quinze

primers utilizados todos promoveram bandas monomrficas confirmando a fidelidade gentica entre clones e plantas doadoras de explante (Routet al, 1998). Uma importante aplicabilidade da cultura de tecidos a conservao de germoplasma in vitro. Segundo Villalobos & Engelmann (1995) de todo material vegetal do mundo conservados representam apenas 0,07%. As colees in vitro, alm de conservarem acessos que sejam em colees ex situ as plantas medicinais

representativos da diversidade gentica das populaes naturais, permitem fornecer um fluxo constante de explantes e plntulas com excelentes condies fitossanitrias . A conservao de germoplasma in vitro pode ser realizada com sementes sintticas, fragmentos de aglomerados celulares. Os diferentes tipos de estruturas vegetais podem ser conservados sob dois diferentes sistemas: o primeiro conservado por curto ou mdio tempo sob condies de temperatura que variam de 12 a 18C e o meio de cultura tecidos e rgos assim como a partir

suplementado com compostos promotores de estresse osmtico e substncias que retardam o crescimento; o segundo sistema realizado tempera tura de criopreservao. Diferentes

-196C em nitrognio lquido e

denominado

sistemas de criopreservao tm sido desenvolvidos para preservar gemas apicais, embries zigticos e somticos, calos e clulas em suspenso. Mannonen et al. (1990) trabalharam com clulas de Catharanthus roseus e Panax ginseng com objetivo de estudar a conservao dessas clulas em dois diferentes sistemas. Clulas de P. ginseng com teor de 37,22 mg/g de ginsenosdeo foram preservadas em leo mineral e tambm criopreservadas. No primeiro sistema houve reduo drstica no teor de ginsenosdeo (0,89 mg/g)

enquanto que o material criopreservado se

manteve com o mesmo teor

(37,22mg/g), resposta semelhante foi obtida com os teores de ajmalicina e catharantina em clulas de C. roseus. Tubrculos de Diocorea so fontes de saponinas esteroidais e a diosgenina considerada do ponto de vista econmico, a mais importante substncia dessa classe por ser matria prima para a indstria farmacutica que a converte em derivados esteroidais. Malaurie et al. (1993) estabeleceram, no centro ORSTOM em Montpellier na Frana um banco de germoplasma in vitro de Dioscorea, com acessos de 11 espcies coletados em diferentes pases, inclusive no Brasil.

Esses autores determinaram que 12 indivduos por clone, com duas replicatas, o nmero adequado para garantir que o material introduzido no banco de germoplasma esteja assegurado do ponte de vista da conservao dos acessos. Em nossos laboratrios vrias espcies de plantas medicinais esto sendo introduzidas no Banco de Germoplasma de Plantas Medicinais do Cerrado (UNAERP), cujo os protocolos de conservao in vitro foram estabelecidos como parte de um projeto temtico dentro do programa Biota/Fapesp. O Biota um programa que tem como objetivo inventariar e caracterizar a biodiversidade do Estado de So Paulo definindo os mecanismos para potencial econmico e sua utilizao sustentvel. A Cultura de tecidos tambm tem sido extensivamente usada para o entendimento da questo nutricional das clulas e tambm na compreenso mais ampliada das vias metablicas e das enzimas envolvidas nas vias de sntese de compostos secundrio bioativos. O uso de precursores marcados radiativamente tem auxiliado nessas elucidaes de forma eficiente. O crescimento de clulas em ambiente totalmente controlado com relao a fatores qumicos e fsicos promove um excelente ambiente para estudar mudanas no metabolismo secundrio, os quais quase sempre so produzidos em pequenas quantidades. Os estudos bsicos realizados a respeito do metabolismo secundrio de plantas tem provido informaes importantes sobre o funcionamento de genes, permitindo assim a sua conservao, seu

manipulao de sistemas ensimticos e rota biossintetica com vistas a produo mais eficiente de metablitos de interesse. Um exemplo importante desse tipo de estudo o da Catharanthus roseus, cujos alcalides indlicos vinblastina e vincristina so compostos importantes no tratamento de cncer e a ajmalcina que utilizada no tratamento de doenas relacionadas ao sistema circulatrio. As duas primeiras substncias, so encontradas na planta em baixas concentraes (0,0005%). A rota metablica longa, abrange mais de 20 passos envolvendo diferentes enzimas e a produo desses metablitos por sntese at o momento invivel. Produo de clulas em suspeno em larga escala tem sido apontada como soluo vivel para contornar o problema de baixa produtividade de vinblastina, vincristina, assim como de outras substncias de interesse farmacolgico (Dicosmo & Misawa, 1995) Podofilotoxina uma substncia extrada principalmente de Podophyllum pelpatum cuja atividade citotxica considerada de elevada toxicidade para humanos, inibe a formao de microtubulo e portanto a diviso celular. Os seus derivados elaborados a partir de semi-sintese (etoposide e teniposide) so

utilizados em terapia contra o cncer. Essa planta originria da Amrica do Norte e contm em seus rizomas de 3-5% de podofilotoxina e uma outra espcie que cresce no Himalaia ,Podophyllum hexandrum, produz entre 10-18% da droga. Recentemente estudos de bioprospeo demosntraram que essa lignana esta presente no apenas na familia Podophyllaceae como tambm em

Berberidaceae, Cupressaceae, Linaceae e Polygalaceae. Estudos realizados in vitro com clulas de P. hexandrum, P. pelpatum, Linum flavum, Linun nodiflorum e Linun album so promissores e mostraram que essas clulas podem produzir at 0,7% de podofilotoxina (Empt et al., 2000). Embora esse teor seja muito menor do que aquele produzido pelo rizoma da planta in natura, o sistema in vitro oferece vantagens quanto aos processos de extrao e controle contnuo na produo de biomassa. A produo de metablito secundrio pode aumentar ou diminuir quando a composio do meio de cultura alterada, principalmente quando se modifica a

concentrao e natureza de compostos com nitrognio, fsforo, potssio, clcio, magnsio, reguladores de crescimento e fonte de carbono ou ainda quando adicionado ao meio substncias que interferem na rota metablica do composto de interesse. Adio de 1 mM de cido acetilsalisilico (ASA) em cultura de clulas de Catharanthus roseus por 72 h, promoveu um aumento no teor de alcalides na ordem de 160% de alcalides, 20 mM aumentou os fenlicos em 1587% e as furanocumarinas aumentaram em 612% quando 10mM de SAS foi adicionado ao meio (Godoy & Loyola, 1997). Duboisia myoporoides fonte de alcalides tropanos hiosciamina e

escopolomina. Estudos realizados in vitro com essa espcie mostraram que calos e plntulas induzidos na presena de BA (benziladenina) e ANA naftalenoactico) (cido

produziram os referidos alcalides tropanos. Entretanto a

substituio de ANA por IBA nas mesmas concentraes inibiu a formao de hiosciamina e escopolomina em plntulas cultivadas em meio lquido (Khanam et al,2000). At bem recentemente, os resultados de pesquisas com leo essencial mostravam que clulas indiferenciadas no eram capazes de produzir esses monoterpenos uma vez que os calos no produzem estruturas secretoras como os tricomas nem to pouco unidades de reservas capazes de armazenar substncias txicas. Entretanto, experimentos com adio de homogenatos de fungos promoveram acmulo de leo essencial (0,39 g/L) em calos de Mentha piperita e alm disso a temperatura tambm afetou diretamente essa produo, ou seja a reduo de 27 C para 10 C por um perodo de 6 horas elevou a quantidade de leo para 0,53 g/L. Os fatores que afetam o acmulo de leo essencial em clulas indiferenciadas, independente de estruturas especializadas, precisam ainda ser melhor investigados (Dornenburg and Knorr,1996). Uma outra classe de substncias importante do ponto de vista farmacolgico so os alcalides indlicos como a ajmalcina, serpentina e reserpina que so acumulados principalmente em espcies do gnero Rauwolfia.

Estudos com R. sellowi mostraram que cultura de clulas em suspenso foram capazes de acumular no final do estgio de crescimento os alcalide que so encontrados em planta intacta, sendo a sellowina encontrada como composto majoritrio nas clulas cultivadas in vitro (Rech et al., 1998). Abdullah et al. (1998) trabalharam com Morinda elliptica uma Rubiaceae nativa da Malsia que produz antraquinonas com atividade bactericida, fungicida e anti-leucemica. A cultura de clulas em suspenso foi estabelecida na presena de ANA e cinetina e ao crescer em meio suplementado com alta concentrao de sacarose (5-6%) produziu elevado acmulo de biomassa (24g/L). Entretanto

nveis ainda maiores de sacarose (8%) foram necessrios para obter a mxima concentrao de antraquinona (6,4 mg/L). Resultado semelhante foi obtido com Carthamus tinctorius, uma planta medicinal da sia, cuja cultura de clulas em suspenso quando realizada com elevada concentrao de sacarose (10%) promoveu o mximo acumulo dos metablitos de interesse (Gao et al 2000). O taxol tem sido mencionado como uma das sustncia mais importantes em tratamentos oncolgicos, com acentuada atividade anti-tumoral que interfere na fase G2-M do ciclo celular. O taxol extrado da entre-casca de Taxus brevifolia na proporo de 2 Kg a cada 27. 273 Kg de casca (0,007%), essa baixa produtividade associada ao valor comercial e importncia dessa substncia estimulou vrios trabalhos em cultura de tecidos. Uma reviso feita por Jaziri et al. (1996) mostrou que j foram estabelecidos protocolos para a produo de calos, cultura de clulas em suspenso, razes transformadas, micropropagao e embriogenese somtica de Taxus. Segundo esses autores a cultura de clulas em suspenso at o momento o sistema mais vivel para a produo de paclitaxel (Taxol) sob condies in vitro, apesar de no ser ainda um sistema economicamente vivel. O principal entusiasmo com relao a cultura de clulas para produo desse composto que segundo Furmanowa (1997) a cultura de calos de Taxus x media var Hatfieldii produziu 0,6% de paclitaxel. Essa porcentagem alta, mas ainda no economicamente vivel. O custo de produo, de metablito secundrio via cultura de clulas em suspenso,

considerado economicamente vivel da ordem de $ 1.500/Kg e no momento o custo do taxol por meio desse sistema foi calculado ao redor de $ 200,000 /Kg (Collin, 2001). Atualmente o taxol tem sido obtido por processo de semi-sntese a partir dos precursores bacatina III e ou 10-deacetilbacatina II que so encontrados em abundncia em diferentes espcies arbreas, o que tem tornado a produo de taxol economicamente vivel e menos impactante do ponto de vista ambiental (Collin, 2001). possvel que no futuro, tecnologias utilizando produo de clulas em biorreatores, tornem viveis a cultura de clulas de Taxus. De maneira geral, grande parte dos trabalhos apresentados na literatura especializada em cultura de tecido vegetal, tem mostrado que o mximo acmulo de metablitos secundrios ocorre aps a fase mxima de crescimento das clulas. Esse fato tem levado muitos pesquisadores a desenvolverem suas culturas em um sistema de duas fases: a primeira conduzida no sentido de estimular o mximo de produo celular, ou seja maior biomassa e na segunda fase o meio de cultura alterado reduzindo os promotores de crescimento celular tais como nitratos, fosfatos, e reguladores de crescimento estimulantes e os suplementos de carbono aumentado. nessa segunda fase, onde h reduzido crescimento e elevada fonte de carbono que a vias biossintticas dos metablitos secundrios so ativadas e os compostos especiais so formados. Esses sistemas de duas fases tm sido muito utilizados em cultura de clulas em biorreatores. Crescimento de cultura de clulas de plantas em biorreatores promovem grande quantidade de biomassa e sob condies adequadas tambm produzem elevados teores de metablitos secundrios. O sistema semelhante ao usado com fungos para a produo de antibiticos e possui modificaes que foram adequadas ao cultivo de clulas vegetais. Biorreatores de 20,000 litros tm sido desenhados e testados com vrias espcies de plantas e produzem grande

quantidade de biomassa num curto perodo de tempo (10-20 dias). Alguns compostos j esto sendo produzidos em biorreatores em escala comercial:

shikonin de Lithospermum erythrorhizon, berberina de Coptis japonica e cido rosmarnico de Coleus blumei. Cultivo de clulas de Solanum chrysotrichum em sistema de biorreatores airlift produziram saponina com atividade antifungica (composto antimictico). Foram usadas duas linhagens celulares, uma advinda de tecido de cotildone (LC) e a outra de hipoctilo (LH) ambas produziram saponina entretanto a linhagem LC produziu duas vezes mais clulas e tambm o dobro do metablito de interesse em relao a linhagem LH. Tambm foi observado diferenas no tamanho, forma e desenvolvimento de vacolo entre as diferentes linhagens (Villarreal et al 1997). A cultura de clulas e tecidos de muitas espcies de plantas tem produzido tambm compostos que no foram isolados nas plantas intactas. Esses resultados tem representado uma oportunidade valiosa de investigar novos e inditos compostos. Substncias que so encontradas apenas em plantas cultivadas sob condies in vitro so resultados de alteraes na parte funcional de genes que ocorrem devido a estmulos qumicos e fsicos em que a cultura fica exposta. As plantas mais citadas onde se tem obtido esses resultados so: Catharanthus roseus, Ochrosia elliptica, Papaver somniferum e Ruta graveolens. A engenharia gentica e a biologia molecular so assuntos tambm muito abordados atualmente dentro das tcnicas de cultura de tecido e tem caminhado a passos largos nas ltimas dcadas com grande sucesso obtido com espcies de cereais e algumas leguminosas. Entretanto, o estudo com plantas medicinais e a introduo de uma variedade melhorada em campos tradicionais de cultivo, ainda uma realidade distante. Apesar disso, extenso volume de trabalho tem sido realizado e publicado respeito de manipulaes genticas envolvendo inseres de genes com Agrobacterium rhizogenes e A. tumefaciens em plantas medicinais. Centenas de espcies medicinais dentro de mais de 60 gneros de plantas j foram transformadas e dezenas de diferentes classes de produtos secundrios foram obtidos por esse sistema (Bajaj & Ishimaru, 1999).

Da maneira semelhante as transformaes gnicas, podemos afirmar que apesar de encontrarmos na literatura exemplos de produo de plantas medicinais haploides (Laurain et al., 1993) a diaploidizao e obteno de homozigotos puros com vistas produo de metablitos secundrios para atender programas de cultivos em escala ainda no uma rotina.

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