Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad Ciencias Biolgicas Gentica y Evolucin BIO226E

Informe N 1 Confeccin del Mapa Fsico del plsmido pBR322

Nombre: Josefina Philippi Profesores: Dra. Pilar Carvallo Dr. Sylvain Faugeron Instructora: Patricia Gajardo Ayudantes: Federico Rengifo Mara Alicia Carrasco Fecha: Lunes 9 Abril 2012

INTRODUCCIN
Los mapas fsicos de los genomas consisten en ubicar fsicamente los distintos genes, teniendo en cuenta la cantidad de pares de bases que mide cada gen estudiado. Para esto se realizan cortes en el DNA a investigar con distintas enzimas de restriccin. Estas enzimas pertenecen a distintas bacterias, de las cuales se sabe exactamente en que secuencias cortan el DNA ya que son especficas. Los extremos que dejan las enzimas de restriccin luego de cortar la hebra son cohesivos, ambos extremos quedan iguales, cada hebra es reflejo de la otra y se pueden volver a ligar con extremos igualmente cortados fcilmente. Luego de la digestin con enzimas, los trozos de DNA se hacen correr por un gel de agarosa para comparar con un estndar de tamaos conocidos, as se identifican aproximadamente los tamaos de los cortes. Posteriormente se puede formar el mapa fsico del plsmido.

OBTETIVO
Familiarizarse con tcnicas bsicas para el manejo de cidos nucleicos, ya sea DNA simple o de doble hebra o RNA. Como por ejemplo la preparacin de DNA genmico con distintas enzimas de restriccin, luego las distintas muestras hacerles una electroforesis para hacerlas correr por gel de agarosa, y con los datos obtenidos confeccionar el mapa fsico requerido (en este caso del plsmido pBR322).

METODOLOGA
Materiales y Soluciones Cmaras de electroforesis Tubos de 0,6 ml Micropipetas Transiluminador Fuentes de poder Agarosa Tampn de muestra Bromuro de Etidio Tampn TBE

Procedimiento Se digiri el plsmido pBR322 usando distintas enzimas como AvaI, EcoRI y PstI, hacienda digestiones simples y dobles. Estas muestras fueron entregadas listas por los ayudantes. Luego los productos de las distintas digestiones se separaron en un gel de agarosa al 1% el cual se carg en el siguiente orden en los pocillos: 8. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Estndar peso molecular /HindIII DNA genmico DNA genmico digerido con EcoRI/AvaI DNA plsmido pBR322 DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/AvaI DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/PstI DNA plsmido pBR322 digerido con PstI/AvaI

Una vez cargado el gel, se comenz la electroforesis, que una vez finalizada se observ sobre en transiluminador con luz UV. Para realizar el mapa fsico primero se debi medir las distancias entre los pocillos de carga y las bandas observadas para cada muestra. Usando el estndar de peso molecular se realiz un grfico con los datos conocidos para luego haciendo una regresin se calcularan los tamaos de las muestras digeridas usando la ecuacin de la recta. El grfico se estructura de la siguiente forma: en el eje de las abscisas se encuentran las distancias del pocillo a la banda correspondiente, mientras que en el eje de las ordenadas el logaritmo del tamao correspondiente a cada banda.

RESULTADOS
Lo primero que se hizo para analizar el gel de la electroforesis fue medir las distancias de todas las bandas que se observaron con respecto a su pocillo de carga, Figura 1.

Disgestin de DNA plasmidia

2 3 4 5 6 7 8 1 2

Figura 1: Fotografa del gel de agarosa al 1% luego de la electroforesis, muestra las bandas de cada muestra observan dos fotografas del gelindicado en los cargado dur FIGURA 1. Se de DNA numeradas arriba segn lo de agarosa 1% procedimientos. La lnea roja indica brillo (izquierda) gel desde donde con ms brillo (derecha primera con menos el lugar de carga del y la segunda se mide la distancia a cada banda.

a la misma fotografa. La carga de los carriles estn indicados en la siguie

Estndar de peso molecular LAMBDA/HindIII

23130pb 9416pb 6557pb 4361pb 2322pb 2027pb
Figura 2: Muestra las bandas del estndar peso molecular /HindIII correspondientes a la primera columna del gel de electroforesis (Figura 1). Al lado de cada banda se indicant el tamao en pares de bases de cada fragmento.

564pb

Luego utilizando solo los datos de la columna 8 del Estndar de peso molecular bandas /HindIII se construy la Tabla 1 para posteriormente hacer la curva estndar. en pares Tabla 1: Se indican los tamaos de las bandas vistas en la columna del estndar peso molecular /HindIII, el logarito de los tamaos y las distancia a la cual se encuentran del pocillo del gel, lnea roja en la Figura 1. Tamao (pb) Log(Tamao) Distancia (cm) 23130 4,364 3,0 9416 3,974 3,2 6557 3,817 3,5 4361 3,640 3,9 2322 3,366 4,8 2027 3,307 5,0 564 2,751 8,7 Con los datos que se ven en la Tabla 1 se realiz un grfico de Distancia vs Log(Tamao) y luego su regresin lineal, Grfico 1.

Gel Agarosa 1%; tamao de bases

Curva Calibrado Estndar l/HindIII

5,000

4,500

4,000

3,500 Log(Tamao)
Log(Tamao(pb))

3,000 Linear (Log(Tamao))

2,500

2,000

1,500

y = -0,2435x + 4,7192 R = 0,84313

1,000

0,500

0,000 0 1 2 3 4 5 Distancia (cm) 6 7 8 9 10

Grfico 1: Se muestran los datos de la Tabla 1, con la distancia en las abscisas y el logaritmo del tamao en las ordenadas. Adems se ve la regresin lineal realizada y al costado la ecuacin de la recta correspondiente. Luego, usando la ecuacin de la recta de la regresin lineal se calcularon los tamaos de el resto de las bandas que se ven el gel reemplazando la distancia por la X en la Ecuacin 1. Luego se calcul el antilogaritmo en base 10. Ecuacin 1 Donde representa la distancia en centmetros y la del tamao del fragmento de DNA en pares de bases. el logaritmo en base 10

A modo de ejemplo se muestra el clculo para la banda del DNA de plasmidio pBR322 digerido con EcoRI.

))

En la Tabla 2 se muestran lo clculos para todas las bandas de los DNA digeridos siguiendo el mtodo mencionado anteriormente.

Tabla 2: Muestra las distancias de las bandas para cada fragmento de DNA con respecto a los pocillos del gel, con su logaritmo del tamao segn la Ecuacin 1 y finalmente el tamao de la banda en pares de base. Fragmento DNA Distancia (cm) Log(Tamao) Tamao (pb) DNA plsmido pBR322 4,4 3,648 4446,313 DNA plsmido pBR322 digerido con 3,8 3,794 6223,000 EcoRI 5,8 3,307 2027,683 DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/AvaI 4,4 3,648 4446,313 7,8 2,820 660,693 DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/PstI 4,1 3,721 5260,173 DNA plsmido pBR322 digerido con 4,9 3,526 3357,376 PstI/AvaI Finalmente, con los datos obtenidos en la Tabla 2 se pudo construir el mapa fsico del plsmido pBR322.

MAPA FSICO Plasmido pBR322 Ava I

1903 pb 4446 pb

660 pb

EcoRI

Pst I Figura 3: Mapa fsico del plsmido pBR322 construido a partir de la informacin de la Tabla 2 y lo observado en el gel de electroforesis, Figura 1.

DISCUSIN En la electroforesis se ve que la columna demarcada con el nmero 3, la cual corresponde al plsmido pBR322 sin digerir, el DNA se encuentra sobrenrrollado. Por lo tanto la macromolcula corre ms fcilmente por el gel ya que su tamao es menor. Dado lo anterior no se puede estimar correctamente el tamao en pares de base del plsmido completo. Luego analizando la digestin del plsmido solo con EcoRI, la cual corta el DNA solo en un sitio, hace que el la hebra quede extendida y no pueda correr por el gel tanto como el caso anterior debido a que no se encuentra sobreenrrollado. Por lo cual, el tamao estimado de esta banda corresponde al tamao del plsmido en pares de base, que segn la Tabla 2 es de 6223 pb. Luego, analizando las bandas correspondientes al DNA digerido con EcoRI y Ava I, en la columna del gel marcada con el 5, se observan dos bandas. Esto se debe a que el plsmido fue cortado en dos sitios, uno por cada enzima de restriccin, lo que deja como resultado dos fragmentos sueltos de DNA plasmidial. Estos dos fragmentos por lo dems se ve que son de menor tamao que el plsmido entero (columna 4) ya que se encuentra por debajo de esa banda y por lo tanto pudieron correr ms fcilmente por el gel. Dado que ambos fragmentos son de diferente tamao, a mayor lejana del pocillo menor tamao, es que se ve en la Tabla 2 dos tamaos aproximados muy diferentes. Observando la columna 6, que corresponde al DNA de pBR322 digerido con EcoRI y PstI, tambin se tienen dos bandas. Lo anterior se explica por la presencia de dos enzimas de restriccin que cortan en diferentes sitios, dejando dos fragmentos de DNA sueltos los cuales corren distinto en el gel debido a las diferencias en el tamao de cada uno. Para esta digestin la diferencia de tamao es significativa, ya que una es aproximadamente 4600 pb ms pequeo que la otra (Tabla 2), lo que explica la separacin de bandas en el gel. Con respecto a la sptima columna, que representa el DNA del plsmido digerido con PstI y AvaI tambin se debiesen ver dos bandas en el gel ya que hay dos enzimas que cortan en sitios distintos al plsmido. No se observa lo esperado debido a que ambos fragmentos son de tamao similar, por lo que se sobreponen mostrando solo una banda. Comparando entre dobles digestiones con las distintas enzimas, se puede ver que cuando se producen dos bandas, la suma de sus tamaos es cercana a 6000 pb, el cual es aproximadamente el tamao del plsmido pBR322 completo. Las relaciones que se dan entre los distintos cortes enzimticos en el plsmido se pueden observar en el mapa fsico (Figura 3)construido a partir de la informacin de la Tabla 2 y lo visto en la Figura 1, el gel de electroforesis. En el mapa fsico se pueden ver las posiciones relativas de los sitios de corte de cada enzima. As tambin se puede calcular el tamao aproximado del plsmido pBR22 que se analiz.

CONCLUSIN Es posible concluir que combinando las tcnicas de las digestiones con enzimas de restriccin y la electroforesis en gel de agarosa para correr DNA, es posible calcular el tamao de la molcula que se quiera analizar. Como tambin ubicar aproximadamente los sitios de corte de las enzimas de restriccin. Con esto es posible construir un mapa fsico de la molcula en cuestin y adems tener una idea de su tamao. Pero tambin hay que tener en cuenta que al determinar las relaciones entre las diferentes enzimas de restriccin hay que realizar diferentes combinaciones de enzimas para digerir el DNA, como se hizo durante el prctico. As es ms fcil lograr la caracterizacin de los cortes enzimticos y sus relaciones.

BILBIOGRAFA Gentica, Texto y Atlas. Passarge (2010) 3 edicin. Apuntes de clases , Mapeo del Genoma Humano, Pilar Carvallo, 14 y 21 marzo 2012. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal ; Gmez, M., Echenique, V. Captulo 3.