Pendahuluan Tumbuhan tidak hanya melakukan metabolisme primer, tetapi juga melakukan metabolisme sekunder menggunakan jalur metabolisme

tertentu, yang akan menghasilkan pembentukan senyawa kimia khusus yang disebut metabolit sekunder (Endress, 1994). Karakteristik metabolit sekunder adalah heterogen struktur kimianya dan terbatas pada kelompok makhluk hidup bahkan jenis tertentu. Sintesisnya dibantu oleh enzim yang dikode oleh materi genetik khusus, serta terdapat kontrol pada biosintesisnya melalui regulasi aktivitas dan jumlah enzim, kompartemensasi enzim, prekursor, intermediat, serta produk yang terlibat dalam biosintesis, maupun penyimpanan dan penguraiannya (Luckner, 1984). Metabolit yang diproduksi oleh tumbuhan tersebut memiliki nilai

penting dalam berbagai industri, khususnya sebagai bahan baku industri farmasi, penyedap makanan, dan parfum (Wiendi et al., 1992), sehingga penelitian untuk meningkatkan produktivitasnya perlu terus dilakukan.

Gosipol adalah salah satu metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman kapas (Gossypium hirsutum). Gosipol merupakan senyawa fenolik-terpenoid (Nomeir dan

Abou-Donia, 1982) yang terdapat dalam kelenjar pada biji bermacam-macam kultivar tanaman kapas komersil (Schmidt dan Wells, 1990). Pada awalnya gosipol diketahui sebagai senyawa toksik yang mempengaruhi ternak non ruminansia (Tangendjaja, 1987), kemudian diketahui bahwa gosipol memiliki banyak manfaat, diantaranya sebagai anti fertilitas pada pria dan wanita, anti kanker, menghambat pertumbuhan organisme parasit, anti virus (Jagt, et al., 2000) dan agen kontrasepsi pada pria ( Gu et al., 2000). Heinstein (1985) menyebutkan bahwa kultur jaringan tumbuhan dapat digunakan sebagai metoda alternatif untuk memproduksi gosipol.

Metoda Kerja

Eksplan Sumber eksplan adalah kotiledon dan ujung akar dari kecambah kapas.

Gambar Kecambah kapas Medium Selama penelitian digunakan 3 macam medium. Medium yang pertama adalah medium perkecambahan biji, berupa tissue/kapas yang dibasahi oleh akuades dalam botol kultur pada kondisi steril. Selanjutnya adalah medium untuk induksi kalus dan akar, yaitu medium padat Linsmaier & Skoog (LS, lihat lampiran A) ditambah dengan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) 10-6 M 2,4 D dan 10-5 M NAA untuk kultur kalus dan medium cair Linsmaier & Skoog tanpa penambahan ZPT untuk kultur akar.

Cara Kerja Sterilisasi Alat dan Medium Semua alat dan medium yang akan digunakan terlebih dahulu disterilisasi dalam autoklaf dengan suhu 121C, pada tekanan 15 Psi selama 15 menit. Kotak pemindah beraliran udara disterilisasikan dengan etanol 70%, disinari ultra violet dan dialiri udara steril selama 30 menit

Sterilisasi Biji Dilakukan sterilisasi permukaan biji dengan cara mencuci biji dengan air mengalir selama 15 menit, kemudian direndam dalam alkohol 70% selama 30 detik dan dibilas

dengan akuades steril satu kali, lalu disterilisasi dengan larutan natrium hipoklorit 0,52% selama 10-15 menit, terakhir dibilas dengan akuades steril 3-4 kali.

Perkecambahan Biji Medium perkecambahan biji yang digunakan untuk mendapatkan kotiledon dan ujung akar adalah kapas steril. Kapas sebanyak 0,5 gr yang dibasahi dengan 10 ml akuades kemudian ditempatkan pada botol-botol kultur dan disterilisasi dalam autoklaf, dan setelah dingin dapat digunakan untuk perkecambahan biji.. Biji kapas terlebih dahulu direndam dalam air untuk seleksi viabilitas biji secara visual. Biji yang tenggelam kemudian diambil karena dianggap mempunyai viabilitas tinggi. Setelah itu biji dicuci dengan menggunakan air mengalir selama 15 menit dengan tujuan untuk menghilangkan residu atau kotoran yang terdapat di kulit luar biji. Biji kemudian direndam dalam alkohol 70% selama 30 detik, dilanjutkan dalam larutan yang

mengandung natrium hipoklorit (NaClO) 0,52% selama 10 menit. Setelah itu biji dicuci/dibilas dengan menggunakan akuades steril sebanyak 4 kali lalu ditiriskan pada kertas saring steril. Biji kemudian ditanam pada medium kapas steril yang telah dibasahi dengan akuades secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari dalam keadaan terang, sehingga diperoleh kotiledon dan ujung akar pada kondisi aseptik.

Kultur Akar Ujung akar dipotong sepanjang +2 cm dari ujung dan dikultur pada medium LS cair (tiap botol kultur diisi 50 ml medium) secara aseptik. Kultur diagitasi dengan kecepatan 120 rpm, diinkubasi pada suhu ruang dalam kondisi gelap selama 30 hari dan dilakukan sub kultur setiap 10 hari (2-3 kali subkultur) hingga siap untuk diekstraksi.

Kultur Kalus Kotiledon dipotong dengan ukuran 1 x 1 cm, lalu ditanam dalam medium padat LS secara aseptik (dalam Laminar steril). Botol kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada suhu kamar hingga 4 minggu, kemudian kalus disubkultur ke medium yang sama dan diinkubasi selama 2 minggu hingga siap untuk diekstraksi.

Analisis Kandungan Gosipol Ekstraksi kalus Terdapat dua metode : 1. Kalus yang telah kering dimaserasi dengan merendam dalam metanol {PA} selama 72 jam, lalu digerus dengan menambahkan metanol sedikit. Setelah halus disaring dengan kertas Whatman no.1. Filtrat yang diperoleh diuapkan dan residunya dilarutkan dalam 2 ml etil asetat

2. Kalus yang telah kering dimaserasi dengan merendam dalam petroleum eter dengan perbandingan 1 g akar : 5 ml petroleum eter, kemudian digerus dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Supernatan dibuang, endapan kalus dibiarkan selama satu malam. Endapan tersebut selanjutnya diekstraksi dengan aseton 10 ml secara bertahap, yaitu 5 ml, 2,5 ml, dan 2,5 ml. Setiap tahapan ekstraksi dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit atau disaring dengan kertas Whatman no.1. Ekstrak yang diperoleh dievaporasi pada suhu 45C selama 1 malam.

Ekstraksi akar Akar dengan berat kering konstan digerus sampai halus. Serbuk akar diekstraksi dengan petroleum eter dengan perbandingan 1 g akar : 5 ml petroleum eter, kemudian digerus dan disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, endapan akar dibiarkan selama satu malam. Endapan akar tersebut selanjutnya diekstraksi dengan aseton 10 ml secara bertahap, yaitu 5 ml, 2,5 ml, dan 2,5 ml. Setiap tahapan ekstraksi dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit . Ekstrak yang diperoleh dievaporasi pada suhu 45C selama 1 malam.

Ekstraksi Medium Medium kultur sebanyak 10 ml ditambah dengan NaCl anhidrous hingga jenuh ( 4 g). Larutan tersebut diekstraksi dengan aseton 10 ml secara bertahap, yaitu 5 ml, 2,5 ml, dan 2,5 ml. Ekstrak dievaporasi selama 1 malam pada suhu 45C.

Analisis : Kromatografi Lapis Tipis ( KLT). Diperlukan pelat aluminium pralapis silica gel 60 F 254 yang sudah dipanaskan dalam oven 50-60 oC selama 1 jam dan senyawa pembanding gosipol (Sigma).

Larutan gosipol standart dan ekstrak sampel dari kalus, akar dan medium ditotolkan pada pelat yang sudah didinginkan. Jarak totolan dari pinggir dan bawah pelat adalah 2 cm, sedang jarak antar totolan adalah 1.5 cm. Pelat yang sudah ditotol dikembangkan dalam bejana berisi larutan pengembang heksan : eter : asam format (65 : 35 : 1) sampai larutan pengembang naik pada pelat kira-kira 10 cm dari titik awal penotolan.. Bejana pengembang telah dijenuhkan sebelumnya selama 0.5 jam.

Setelah pelat dikeringanginkan selama 5 menit, pelat disemprot dengan larutan 5 % floroglusinol dalam etanol yang ditambah dengan HCL jenuh (1 : 1). Nilai Rf ditentukan dengan rumus :

Rf = a : jarak antara titik awal penotolan dengan pusat noda b : jarak antara titik awal penotolan dengan garis akhir lar.pengembang (10 cm)

b a