Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioqumica III- 2009

Trabajo Prctico Nro 4 Extraccin de RNA y DNA bacteriano

INTRODUCCIN El RNA es el cido nucleico ms abundante en la clula, y puede purificarse fcilmente. Una clula tpica contiene 10 veces ms RNA que DNA. El azcar presente en el RNA es la ribosa, que posee un grupo hidroxilo (OH) libre en la posicin 2'. Este grupo participa en la formacin de un intermediario en el mecanismo de hidrlisis y determina que el RNA sea qumicamente inestable, y se hidrolice fcilmente en una solucin acuosa alcalina. En la mayor parte de los casos, el RNA es un polmero monocatenario (ssRNA), pero las secuencias nucleotdicas de estas molculas poseen, en mayor o menor medida, regiones complementarias que determinan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria en forma de dsRNA). Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catlisis alcalina, pero la mayora de estas enzimas atacan exclusiva- o preferentemente la ssRNA. Cuando se desea clonar un determinado gen para luego analizar su expresin resulta de mucha importancia la obtencin de preparaciones de RNA limpias y que contengan molculas intactas. El RNA proveniente de cualquier clula puede ser copiado a molculas de DNA de doble hebra y estas luego pueden ser clonadas en un vector resultando en la produccin de bibliotecas de cDNA especficas del tipo celular en cuestin. Para que estos clones sean tiles en el anlisis resulta crtico que se cuente con RNAs ntegros y completos como material de partida. La mayor dificultad para la obtencin de dichas preparaciones es que la mayora de las RNAsas, que degradan nuestras molculas de inters, son enzimas muy estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequea cantidad de las mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparacin puede constituir un verdadero problema. Existen tres pasos fundamentales en la extraccin de un cido nucleico (DNA o RNA): 1) Homogeneizacin de la muestra: Permite la disgregacin de la estructura tisular y celular para facilitar la salida de los cidos nucleicos. Dentro de los mtodos para la homogenizacin podemos mencionar los fsicos como la sonicacin, hervido, congelacin-descongelacin, choque osmtico, etc; los qumicos como la utilizacin de detergentes (SDS) y tambin los enzimticos como la lisozima, la proteinasa K, etc. El agregado de quelantes de magnesio, como el EDTA, a las soluciones de extraccin contribuye tambin a la reduccin de la integridad de las membranas. 2) Separacin y Purificacin: Permite la eliminacin progresiva de protenas y otros contaminantes celulares y la obtencin de un material gentico cada vez mas limpio. Dentro de las metodologas utilizadas las ms comunes son la extraccin con mezclas de fenol-cloroformo y la separacin cromatogrfica. En el caso del fenol-cloroformo, el primero se utiliza para la desnaturalizacin y solubilizacin de las protenas y componentes celulares y el cloroformo permite la separacin de las fases durante la centrifugacin, adems de tambin ser desnaturalizante. Cuando lo que se utiliza es una separacin cromatogrfica generalmente se recurre a columnas preempaquetadas ya sea de afinidad o de intercambio inico previa unin del cido nucleico a resinas o matrices de slice. Estas son lavadas varias veces para eliminar contaminantes y posteriormente se procede a la elucin del cido nucleico. 3) Precipitacin: Permite la obtencin del cido nucleico listo para ser almacenado o diluido a la concentracin deseada para su utilizacin. Este paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volmenes de etanol.

Se pueden mencionar muchas metodologas para la extraccin de DNA y RNA de las clulas en funcin del tipo de muestra (clulas procariotas o eucariotas, vegetales, animales, etc) y del grado de pureza que se quiera obtener condicionado por las tcnicas posteriores de anlisis. Extraccin de DNA: Entre los mtodos de purificacin de DNA se destacan los que emplean gradientes de cloruro de cesio y los que incluyen extracciones con solventes orgnicos en presencia del detergente catinico CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio). Los primeros tienen la ventaja de obtener DNA de muy buena calidad pero son muy trabajosos y requieren una cantidad importante de bromuro de etidio. Los protocolos con CTAB son ms sencillos y se basan en la propiedad que posee este compuesto de solubilizar membranas celulares y complejar el DNA a bajas concentraciones de NaCl. En el caso del trabajo prctico realizaremos la recuperacin del DNA genmico bacteriano a partir de una precipitacin selectiva del RNA con LiCl utilizando una concentracin de dicha sal que deja en solucin al DNA. Extraccin de RNA: Existen variadas metodologas para la extraccin de RNA. Son bastante comunes los protocolos que incluyen isotiocianato de guanidinio o fenol para el lisado celular. Dichos compuestos inactivan RNAsas lo que resulta muy favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de RNAsas endgenas. Una de las metodologas ms sencillas es la que utilizaremos en este trabajo prctico y consiste en la utilizacin de un detergente suave como es el SDS par el lisado de las clulas que se combina con el calentamiento de la muestra de manera de favorecer la solubilizacin del material. Posteriormente se realiza una desproteinizacin con cloroformo y una precipitacin diferencial con LiCl 2M. Deben considerarse tambin a la hora de seleccionar una metodologa de extraccin los diversos y verstiles sistemas comerciales tipo kits para la extraccin de DNA y RNA existentes en el mercado. Muchos de ellos se basan en procedimientos cromatogrficos para la purificacin. En la siguiente figura se muestran los principales pasos a realizarse cuando se utilizan columnas cromatogrficas de este tipo:

Posteriormente a la extraccin del cido nucleico de inters es necesario evaluar la cantidad y calidad del mismo. Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si el DNA no ha sufrido roturas veremos una nica banda de alto peso molecular. Para el caso de muestras de RNA la corrida electrofortica de preparaciones de buena calidad mostrar claramente los diferentes RNAs ribosomales y de transferencia.

rRNA28S rRNA18S mRNAs

tRNA

Muestras de RNAs corridas en gel de agarosa 1% teidas con bromuro de etidio rRNA28S y rRNA18S: RNAs ribosomales tRNA: RNAs de transferencia mRNAs: RNAs mensajeros Para la cuantificacin de los cidos nucleicos aislados se realiza la medida de absorbancia de la muestra a 260nm y 280nm en un espectrofotmetro. Se sabe empricamente que la densidad ptica a 260nm de una solucin de DNA puro de doble cadena de 50ug/ml es igual a 1. Con esta relacin puede calcularse la concentracin de DNA de nuestra muestra. Para estimar la pureza de la muestra medimos la absorbancia a 280nm y calculamos la relacin A260/ A280. Un DNA sin contaminantes tiene una relacin de 1.8 a 2.0. Valores menores indican contaminacin con protenas mientras que valores mayores se deben a contaminacin con sales. Para el caso del RNA la relacin es de 40ug/ml para una unidad de absorbancia a 260 nm. La estimacin de la pureza se realiza tambin utilizando la relacin A260/ A280. RECOMENDACIONES: A la hora de trabajar con RNA, deben tomarse las mximas precauciones para evitar contaminaciones con RNAsas y la degradacin del RNA. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNAsas, y debe tratarse todo el material para su eliminacin: horneado del material de vidrio, tratamiento se soluciones acuosas con DEPC (dietilpirocarbonato, compuesto que inactiva las RNAsas por unin covalente). Debe usarse guantes a lo largo de todo el proceso ya que las manos son la mayor fuente de RNAsas. Intentar trabajar lo ms rpido posible, con el fin de evitar la degradacin del RNA durante la manipulacin. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Si es necesario acumular muestras antes de comenzar a procesarlas, se deben congelar tras su recoleccin en nitrgeno lquido y almacenarlas a -70 C. Una vez que las muestras han sido homogeneizadas en el Buffer de Extraccin, pueden ser almacenadas a -70 C sin necesidad de congelacin en nitrgeno lquido. Es importante utilizar RNA purificado recientemente. El almacenamiento del RNA a -70 C evita su degradacin, y la conservacin del RNA se ve favorecida si se re-precipita con acetato de sodio antes de colocarlo a -70 C para su almacenamiento. OBJETIVOS DEL TP Extraccin de RNA y DNA genmico de un organismo procariota (E. coli). Comparacin entre los distintos tipos de RNA. Establecimiento de las diferencias y similitudes entre los protocolos de extraccin de RNA y de DNA y de su grado de pureza y calidad. ORGANIZACIN GENERAL Dentro de cada una de las comisiones, se generarn 6 grupos de trabajo. Cada uno de los grupos realizar dos tubos de extraccin de RNA. El 2do da del TP, se terminar con la extraccin del RNA que se dej precipitando desde el 1er da del TP y se realizar la precipitacin del DNA.

Tcnicas Experimentales
Da 1 Extraccin de RNA total de bacteria Previamente calentar a 80C el Buffer de Extraccin en un bao de agua, o fraccionar en tubos de 1,5ml y calentar en bloque. 1) Transferir 1,5 ml de cultivo de E. coli a un tubo de microcentrfuga (Eppendorf) y centrifugar a mxima velocidad durante 1 minuto. 2) Retirar el tubo de la microcentrfuga, descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo y eliminar los restos de medio de cultivo tomndolos con una pipeta P-200. 3) Repetir la operacin un total de 3 veces (de esta manera, se obtiene un sedimento de bacterias provenientes de 4,5 ml del cultivo). 4) Resuspender el pellet en 400 l de Buffer de Extraccin caliente y 400 l de cloroformo, mezclar rpidamente por inversin. 5) Incubar 1 minuto a 80C. 6) Mezclar nuevamente el contenido del tubo con Vortex durante 1 minuto. 7) Centrifugar a mxima velocidad por 10 minutos. 8) Retirar el tubo de la microcentrfuga con cuidado para no mezclar las dos fases formadas: tomar la fase superior acuosa (aprox. 400 l) y trasvasarla a un tubo estril nuevo de 1,5ml. 9) Adicionar 1 volumen de LiCl 4M (aprox. 400 l). 10) Incubar ON (OverNight) a 4C. Da 2 11) Centrifugar a mxima velocidad por 15 minutos. (De ser posible a 4C). Trasvasar el sobrenadante a un tubo estril nuevo de 1,5ml y guardar (de aqu recuperaremos el DNA. NO TIRE EL SOBRENADANTE!) 12) Lavar el pellet con etanol 70%. Para ello, agregar 500 l de etanol 70%, luego centrifugar a 14000rpm por 5 minutos, y por ltimo, descartar el sobrenadante (eliminar los restos de etanol tomndolos con una pipeta P-200). 13) Dejar secar aproximadamente 5 minutos. 14) Resuspender en 50 l de agua bidestilada estril. Precipitacin de DNA desde el sobrenadante 1) Precipitar el DNA con 1 volumen de isopropanol. 2) Centrifugar a mxima velocidad por 1 minuto. 3) Descartar el sobrenadante, y lavar el pellet con 500 l de etanol 70%. Centrifugar 5 minutos a 14000rpm. 4) Dejar secar aproximadamente 5 minutos. 5) Resuspender en 50 l de agua bidestilada estril. Los docentes realizaran las corridas electroforticas de las muestras extradas y sern analizadas la siguiente semana.

SOLUCIONES EMPLEADAS Buffer de Extraccin: Tris-HCl 100mM, pH= 8,0 EDTA 10mM, pH= 8,0 SDS 1 % LiCl 100mM Solucin de cloruro de litio: LiCl 4M

Preguntas
Para el aprovechamiento del trabajo experimental es imprescindible saber exactamente qu se est haciendo en cada momento y por qu. Recuerde que la experiencia de laboratorio es intransferible y no la encontrar en ningn libro; por lo tanto las oportunidades desaprovechadas durante el trabajo experimental en el laboratorio difcilmente puedan recuperarse con posterioridad en la carrera. Es por ello que sugerimos resolver el siguiente cuestionario antes de venir al trabajo experimental. 1) Qu funcin cumple cada una de las soluciones utilizadas en el TP? 2) Cul es el motivo de precalentar el Buffer de Extraccin a 80C, y cul es el fundamento de incubar a 80C? Se podra realizar la extraccin a temperatura ambiente? 3) Cuando Ud. debe agregar 1 Volumen, cmo hace para determinar la cantidad? En caso de que no lo haya hecho en el paso anterior, cmo hara para saberlo de manera rpida? 4) Cmo determinara si la fase superior en el punto 8) es verdaderamente la acuosa? Recuerde que debe ser de manera rpida ya que debe continuar con la experiencia. 5) Describa una manera fcil y rpida de determinar la concentracin y pureza del producto purificado. 6) Con el mtodo anterior Ud. ha determinado que tiene una alta concentracin y pureza, Hay algn otro parmetro que sea necesario analizar antes de utilizar el RNA total purificado? 7) Describa brevemente las diferencias entre los RNAs de organismos procariotas y eucariotas. 8) Cul es la abundancia aproximada de cada uno de los principales RNAs (mensajero, ribosmico, transferencia, pequeos nucleares)? Cmo espera ver esto experimentalmente. 9) Ud. es la/el mejor becaria/o que existe; sin embargo, entre halagos olvido rotular los tubos. Cmo podra determinar cul contiene RNA y cul DNA. Recuerde que est en juego su honor.. 10) No deje que los halagos lo distraigan, esta vez olvid preparar con antelacin el Buffer de Extraccin. Decide prepararlo rpidamente y, para ello, cuenta con soluciones de Tris-HCl 1M con los siguientes pHs 7,0; 7,5; 8,5 y 9,0. Cul utilizara y por qu? Podra utilizar una solucin de EDTA 10mM pH 8;0? Por qu? 11) Describa brevemente experiencias en las que utilizara RNA total purificado. Incluira en ellas un mapeo de restriccin? Por qu? 12) Uno de los principales inconvenientes es la contaminacin con RNAsas; para ello hay que tratar todos los materiales y preparar de manera especial los reactivos. Mencione cmo lo hace. 13) Qu otras precauciones tomara, adems de las que tom en el TP, para evitar contaminaciones o degradacin del RNA? 14) Cul es el fundamento de la purificacin de DNA por medio de columnas comerciales? 17) Cul es el coeficiente de Absorcin molar del DNA y del RNA a 260 nm? Cmo podra determinar que una muestra de DNA est pura? Y una de RNA? 18) Cmo distinguira si posee una muestra de de DNA contaminada con Fenol? Y si estuviera contaminada con Protenas? Qu hara en cada caso? 19) Idem pregunta anterior pero para RNA.