Bilogo Paulo Francisco Naoum

MTODOS DE AVALIAO LABORATORIAL

I) Cromatografia Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Fundamenta-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura. formada por duas fases imiscveis: uma fase mvel e uma fase estacionria. De acordo com o tipo de fase mvel e estacionria utilizados as cromatografias podem classificadas em Cromatografia Gasosa, Cromatografia de Troca Inica e HPLC (sigla de High Pressure Liquid Chromathography).

Sentido da migrao

Coluna Cromatogrfica

Fase Mvel

Fase Estacionria

Mistura a ser separada

a) Cromatografia Gasosa A cromatografia gasosa consiste na vaporizao (sem que haja decomposio) da substncia em um gs chamado gs de arraste, e posterior migrao de uma atravs da coluna de cromatografia; isto , a amostra tem que se dissolver ao menos em parte, em um gs que participar da composio da fase mvel. Esse gs deve, obrigatoriamente, ser inerte em relao fase estacionria. Gases como hidrognio, nitrognio, argnio e hlio so os mais utilizados. As substncias saem ento da coluna e passam por um detector que gera um sinal proporcional quantidade de substncia eluda no gs em funo do tempo (anlise quantitativa). Por exemplo, em uma mistura, cada componente ter sua presso

de vapor caracterstica (volatilidade), assim substncias que forem mais volteis, ficaro dissolvidas no gs de arraste e passaro mais rapidamente pela coluna cromatogrfica. Trata-se de uma tcnica muito utilizada pois capaz de separar substncias com concentraes de nanogramas e at picogramas. A cromatografia gasosa usada no fracionamento de protenas, enzimas, peptdeos e aminocidos.

1 2

5 3
1 Reservatrio do gs de arraste (N2 ou H2 ou He ou Ar) 2 Local onde a amostra ser injetada (vaporizao da amostra) 3 Coluna Cromatogrfica 4 Detector 5 Amplificador de sinal 6 Formao do Cromatograma (grfico concentrao de amostra x tempo)

b) Cromatografia Inica Tambm conhecida como cromatografia de troca inica. Tcnica cromatogrfica onde a fase estacionria representada por uma resina trocadora de ons. Essa resina possui em sua composio ons que iro interagir quimicamente com os ons presentes na soluo da fase mvel.

Coluna Cromatogrfica

ons da Resina (-)

ons da Soluo (+)

ons da Soluo (-)

Aps a interao dos ons da amostra com a resina, uma soluo chamada eluente passada pela coluna de cromatografia liberando assim os ons que estavam interagindo com a resina. O tempo de reteno/separao das diferentes espcies que determinar a concentrao dos diferentes ons na amostra. Antes de passar pelo detector, as amostras passam por uma segunda coluna cromatogrfica, a coluna supressora de eluente, que ir bloquear a deteco de ons que por ventura possam fazer parte da constituio do eluente e que poderiam interferir na concentrao inica real da amostra; ou seja, somente os ons da amostra so encaminhados para anlise. Desvantagens: tcnica de custo extremamente elevado e que requer mo de obra altamente especializada na operao do sistema e anlise de dados. usada para fracionar peptdeos, aminocidos, hemoglobinas e hemoglobina glicada.

c) Cromatografia Lquida de Alta Presso (HPLC) HPLC: sigla do ingls que significa High Pressure (or Performace) Liquid Chromatography. Atualmente chamada de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE). Possui como caractersticas: a elevada sensibilidade, a alta velocidade de reao e o grande desempenho com confiabilidade e rapidez na liberao de resultados. Trata-se de um tipo de cromatografia que utiliza um lquido como fase mvel, que injetado na coluna cromatogrfica a altas presses e diferentes tipos de fase estacionria, variando de acordo com aquilo que se quer analisar. Os constituintes da fase estacionria, em geral se encontram altamente particionados, o que gera uma separao mais eficiente. Constitui-se de reservatrios para os reagentes, bombas que propulsionam a fase mvel a altas presses, injetor de amostra, coluna cromatogrfica e um detector acoplado a um computador. A tcnica de CLAE (HPLC) a base para o entendimento e realizao de outras tcnicas como a cromatografia gasosa e de troca inica. A utilizao de partculas ainda mais finas (0,1 nm) e presses ainda mais elevadas (15.000 psi) tem gerado o que se chama de CLUE (Cromatografia de Ultra Eficincia). usada principalmente para fracionar hemoglobinas e hemoglobina glicada. Pode ser usada para protenas, peptdeos e aminocidos.

Esquema geral de um cromatgrafo.

II) Quimioluminescncia Tipo de reao qumica, que ao se processar gera energia luminosa. Durante uma reao qumica, os reagentes se transformam em estados intermedirios eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de menos excitado, liberam a energia absorvida na forma de luz. O composto qumico Luminol, um dos representantes mais conhecidos da quimioluminescncia. Quando em contato com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador para a reao de liberao de luz. Esse composto muito usado em percia criminal, quando se quer investigar a presena de vestgios de sangue em uma cena de crime. Mesmo que o local tenha sido limpo, o luminol evidencia a presena do sangue. Laboratorialmente, hormnios, drogas e microorganismos podem ser identificados por testes colorimtricos. Tais mtodos utilizam-se de anticorpos ligados a um marcador luminescente (cromgeno) que pode ser o prprio luminol ou mais modernamente derivados de acridina, sistema avidina-biotina, entre outros.

III) Colorimetria Mtodo de anlise quantitativa que se baseia na comparao da cor produzida por uma reao qumica com uma cor padro. De acordo com a intensidade da cor produzida, infere-se a concentrao do determinado analito (substncia que se quer analisar). O mtodo mais seguro de se verificar a colorao de uma reao atravs do uso do espectrofotmetro, que compara a intensidade de cor com uma cor padro, chamada de branco (soluo padro em que o espectrofotmetro zerado). o mtodo mais usado em anlises laboratoriais de bioqumica clnica. IV) Cintico Geralmente utilizado em reaes em que o analito uma enzima. A atividade da enzima analisada por meio da reao dela com um composto qumico denominado substrato. Essa reao gera um produto. Em geral, a reao acoplada a uma reao colorimtrica: medida que a converso enzimtica se processa e o produto gerado, h mudana de cor que deve ser observada em espectrofotmetro. Leituras sucessivas em intervalos de tempos iguais devem ser feitas. Aos valores obtidos na leitura espectrofotomtrica deve-se aplicar fatores de correo que variam de acordo com o exame a ser realizado.

Substrato

analito (enzima)

Produto (reao colorimtrica)

V) Cintico Enzimtico: Muito semelhante ao mtodo cintico, porm o analito no uma enzima e sim o substrato que ser utilizado por uma enzima especfica. O produto dessa primeira reao enzimtica pode ento ser captado por outra(s) enzima(s) que est acoplada a uma reao colorimtrica, de liberao de gs ou formao de precipitado.

Analito (substrato) Produto 1

enzima 2

enzima 1

Produto 1 Produto Final reao colorimtrica; liberao de gs ou formao de ppt

Obs.: podem haver outras enzimas entre o produto 1 e o produto final. VI) Radioimunoensaio (RIA Radio Imuno Assay) Baseia-se na competio de um antgeno presente na amostra em anlise com um antgeno marcado com istopo radioativo pelo mesmo anticorpo. A concentrao do antgeno em anlise ser inversamente proporcional radiao emitida. Trata-se de uma tcnica com alta especificidade e sensibilidade, porm com elevado custo e grande risco operacional por manipular material radioativo.

Esquema mostrando como funciona o Radioimunoensaio

VII) Imunodifuso Radial Trata-se de uma tcnica de difuso de antgeno e anticorpo seguida de precipitao. Ao se adicionar um antgeno solvel com um anticorpo tambm solvel forma-se um agregado antgeno-anticorpo que insolvel e sofre precipitao. a) Imunodifuso Dupla de Ouchterlony: Utiliza como meio de difuso o gel de agarose. Antgeno e anticorpo se difundem em todas as direes. Ao se encontrarem forma-se uma linha de precipitao. de grande utilidade na identificao de microrganismos patognicos e auto anticorpos em doenas auto-imunes. Porm somente pode ser utilizada em reaes antgeno-anticorpo que formem precipitado, e requer grande tempo para que ocorra a difuso e precipitao (at 24 horas).

b) Imunodifuso Radial de Mancini: Mtodo realizado em gel de agarose com anti-soros especficos j incorporados ao gel. As amostras so aplicados em poos circulares j feitos no gel. medida que a difuso ocorre, a reao antgeno-anticorpo forma anis de precipitao e a concentrao de antgeno proporcional ao raio do anel de precipitao. Ao medir o dimetro do crculo de precipitado, utiliza-se com uma tabela contendo os valores de dimetro relacionados com a concentrao de antgeno.

X mg/dL

Y mg/dL

Z mg/dL

Esquema mostrando os anis de precipitao (reao antgeno-anticorpo) pelo mtodo de Imunodifuso Radial de Mancini. No caso, as concentraes so X < Y < Z.

VIII) Hemaglutinao (HA) Reao que gera agregao de eritrcitos devido presena de anticorpos (ou vrus ou lecitinas). Hemcias sensibilizadas por antgenos especficos para um patgeno so usadas para testar o soro do paciente. Quando na ausncia de agente hemaglutinante (anticorpo), as hemceas sedimentam na forma de boto e quando h aglutinao as hemceas sedimentam na forma de tapete (difusa). IX) Fluorescncia e Imunoflorescncia (IF) Fluorescncia um processo onde um elemento chamado fluorocromo absorve energia na forma de espectro luminoso, tornando-se eletricamente excitado; ao liberar essa energia emitem luz num comprimento de onda especfico. A imunofluorescncia uma tcnica baseada na ligao de anticorpos com fluorocromos. A imunofluorescncia pode ser direta ou indireta. Na IF direta detecta-se o antgeno pesquisado propriamente dito: coloca-se a amostra a ser analisada numa placa especifica para fluorescncia, a seguir, adiciona-se o conjugado (anticorpo especfico marcado com fluorocromo). Na IF indireta a placa de fluorescncia j vem com antgenos especficos, testa-se o soro do paciente e depois adiciona-se um anti-anticorpo marcado com fluorocromo.

Ex.: IFD

Amostra a ser pesquisada (bipsia de tumor por exemplo)

adio do anticorpo marcado

Revelao

IFI
adio do soro contendo anticorpos do paciente

Placa contendo antgenos especficos Adio do anti-anticorpo Revelao

X) Nefelometria e Imunoturbidimetria A Nefelometria uma tcnica para medir as concentraes de Ig A, Ig M e Ig G e outras protenas plasmticas de uma amostra. Um aparelho especfico que mede a turbidez utilizado e mede a difrao (desvio) da luz ao passar por uma soluo contendo complexos imunolgicos. J a Imunoturbidimetria mede a diminuio da luz ao passar por um complexo antgeno-anticorpo, em outras palavras, a turbidimetria mede o quanto a soluo antgeno-anticorpo absorve da luz e o quanto ela deixa passar. Essa tcnica, assim como a nefelometria, usada para medir a concentrao plasmtica de diversas protenas.

A principal diferena entre nefelometria e turbidimetria que na nefelometria a luz difundida ou seja aquela que atravessa a soluo medida, enquanto que na turbidimetria a luz no difundida (a absorvida) medida.

XI) ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay) Tambm chamado teste ou ensaio imunoenzimtico. Consiste num anticorpo conjugado a uma enzima capaz de modificar um cromgeno, atravs da reao com seu substrato especfico, gerando coloraes diferentes de acordo com o cromgeno:

Substrato da enzima E +

Substrato modificado Oxida o cromgeno

Cromgeno incolor Cromgeno colorido

enzima Existem vrios tipos de ELISA: os para pesquisa de antgenos, onde as placas contm anticorpos especficos; o ELISA para pesquisa de anticorpos, em que as placas esto sensibilizadas por antgenos, a pesquisa feita atravs da amostra contendo anticorpos e evidenciada pela adio de um anti-anticorpo marcado (anticorpo 2rio); os testes por competio dentre outros. XII) Eletroquimioluminescncia Utiliza a emisso de luz atravs da aplicao de potenciais de oxidao ou reduo a um eletrodo imerso em solues que emitem radiao (em geral compostos de rutnio). Dentre os mtodos automatizados mais utilizados encontra-se o Elecsys da Roche Diagnstica que utiliza micropartculas revestidas de estreptavidina, anticorpo monoclonal especfico biotinilado e um anticorpo monoclonal especfico para cada analito. Essa mistura fixada magneticamente na superfcie do eletrodo e o que no se fixar removido. Por fim, h uma aplicao de corrente eltrica no eletrodo que induz uma emisso quimioluminescente, medida por um fotomultiplicador.

XIII) Imunofluorimetria Tcnica basicamente automatizada que utiliza, em geral, anticorpo marcado com fluorocromo (rodamina, fluorescena e eurpio so os mais utilizados). Caso a reao seja positiva ocorre a associao do fluorocromo (aps lavagens sucessivas) com uma soluo amplificadora de fluorescncia e conseqente emisso de luz fluorescente, que intensa porm pouco duradoura, da a necessidade de automao.

XIV) Espectrofotometria de Absoro Atmica Tcnica analtica que se baseia na absoro de radiao eletromagntica por tomos gasosos no estado fundamental. um mtodo de anlise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presena de metais. O mtodo consiste em determinar a presena e quantidade de um determinado metal em uma amostra qualquer, usando como princpio a absoro de radiao ultravioleta por parte dos eltrons que, ao sofrerem um salto quntico depois de devidamente excitados por uma chama de gs acetileno a 3000 graus celsius, esses devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de origem. A energia devolvida na forma de um fton de luz, por sua vez, absorve a radiao ultravioleta emitida pela fonte especfica (ctodo oco) do elemento qumico em questo. Dessa forma, eltrons que esto contidos na amostra, e que sofrem tambm um salto quntico e que no pertencem ao mesmo elemento que constitui o ctodo oco que est sendo usado no momento, no sero capazes de causar uma interferncia, isso porque eles absorvero apenas radiao com comprimento de onda referente ao elemento qumico do qual fazem parte.

XV) on Seletivo ou Potenciometria Um eletrodo de on seletivo um sensor (ou um transdutor) capaz de converter a atividade de um on presente numa soluo em um potencial eltrico que ento captado por um voltmetro ou medidor de pH. So necessrios um eletrodo especfico para o on que se quer testar (Ca, K, Na...) e um eletrodo de referncia; ambos so imersos na soluo a ser analisada e a atividade do on diretamente proporcional voltagem medida pelo voltmetro. A partir da atividade do on, por meio de clculos matemticos, pode-se obter a concentrao do on na amostra.

XVI) Qumica Seca Processo em que no existe despejo de resduos contaminados no meio ambiente, pois no utiliza gua na execuo dos exames. Os reagentes ficam dispostos em 6 camadas numa placa de vidro e medida que a amostra vai passando por elas, as reaes qumicas vo se procedendo. Os dejetos produzidos ficam contidos nas placas de vidro que podem ser autoclavados ps uso. Requer pequena quantidade de amostra (cerca de 10 L), calibragem reduzida (apenas 2 por ano), alta taxa de preciso e rapidez e cobre cerca de 95% dos testes laboratoriais em bioqumica. A anlise se d por reflectncia (processo luminoso): os reagentes so dispostos em multicamadas nas lminas de vidro e medida que a amostra entra em contato com as lminas, ocorrem reaes em multicamadas e a luz incidida transformada em voltagem que gera o resultado solicitado. O Sistema Vitros da Johnson & Johnson Produtos Profissionais um dos mais utilizados no processo.