ISSN 0568-3076

agron. 17(1): 62 - 72, 2009

EVALUACIN IN VITRO DEL EXTRACTO DE Brugmansia aurea PERS. (CACAOSABANERO) PARA EL CONTROL DE Rosellinia bunodes BERK. Y BR.
Alejandro Snchez Taborda*, Juan Pablo Martnez Arango*, Mara Elena Bernal Vera**, Elmer Castao Ramrez***
* Ingenieros Agrnomos. Universidad de Caldas ** M.Sc. Fitopatologa. Profesora Catedrtica Universidad de Caldas. *** Esp. Profesor Titular Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Programa de Ingeniera Agronmica.
Recibido: 16 de marzo; aprobado: 14 de mayo de 2010

RESUMEN
Se evalu el efecto del extracto de hojas, or y tallo de Borrachero, Brugmansia aurea, en diluciones de 50% y 100% para el control de la Llaga Negra, enfermedad causada por el hongo Rosellinia bunodes Berk. y Br. La evaluacin se dividi en varias partes: in vitro e in vivo. La primera parte se realiz en el Laboratorio de Fitopatologa de la Universidad de Caldas, la segunda y la tercera parte de la evaluacin, se hicieron en el invernadero del Jardn Botnico de la Universidad de Caldas ubicado a 2153 msnm, zona de vida de formacin vegetal correspondiente al Bosque Hmedo Montano Bajo (bhMB segn Holdrige), con temperatura media de 17,5 C y precipitacin media anual de 1800 mm. En plntulas de caf se valoraron los siguientes tres tratamientos: aplicacin preventiva, tres das antes de la inoculacin del hongo; aplicacin simultnea, al momento de la siembra del hongo con aplicacin del extracto; tres das despus de la siembra del hongo se inici la aplicacin del extracto al suelo infestado. A nivel de laboratorio, el control ejercido por el extracto de Borrachero (Brugmansia aurea) fue total para las tres experiencias evaluadas. En las pruebas en plntulas de caf, el extracto retras la muerte de las chapolas en tres das, y el hongo tratado con el extracto en comparacin con el tratamiento testigo presentaba problemas para la formacin de rizomorfos, mostrando una apariencia frgil. Con respecto al avance en suelo (tercera evaluacin), el extracto retras el avance del hongo, el tratamiento preventivo fue el que ms retard su progreso en comparacin con el testigo; la apariencia del hongo tratado con el extracto fue delgada, frgil, dbil y poco densa; al observar el micelio tratado en microscopio, los septos presentaron una apariencia deshidratada, atroada y delgados.

ABSTRACT
IN VITRO EVALUATION OF Brugmansia aurea PERS. EXTRACT FOR Rosellinia bunodes BERK. & BR. CONTROL
The effect of the leaf, ower and stem extract of Brugmansia aurea, in 50% and 100% dilutions for the Rosellinia bunodes (Berk. and Br.) control was evaluated. The evaluation was divided into different parts: in vitro and in vivo. The rst part was carried out in the Phytopatology Laboratory of the Universidad de Caldas, the second and third evaluation, were carried out in the greenhouse of the Botanical Garden of the Universidad de Caldas located at 2153 m.a.s.l., plant formation life zone corresponding to cool temperate humid forest according to Holdrige, with 17.5 C average temperature and 1800 mm annual average precipitation. In seeded coffee plants the following three treatments were evaluated: preventive application, three days prior to fungal seedtime; simultaneous application, at the time of fungal seedtime and extract application; three days after fungal seedtime, the extract application is iniciated over infested soil. At laboratory level, the control exerted by the Brugmansia aurea extract was complete in the three evaluated experiences. In the coffee seeded plants tests, the extract delayed the death of the buds in three days, and the fungus treated with the extract in comparison with the witness treatment showed problems associated with hyphaea, with a weak appearance. Regarding soil advancement (third evaluation), the extract delayed fungal activity, the preventive treatment delayed its progress the most, in comparison with the witness; the appearance of the fungus treated with the extract was thin, weak and scarcely dense. When observing treated mycelium under microscope, the septa were dehydrated, atrophied and thin. Key words: entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana, preformulation, coffee berry borer.

Palabras clave: Brugmansia aurea sobre Rosellinia bunodes

Berk. y Br; extracto Brugmansia; Roselinia bounodes en caf

Key words: Brugmansia aurea; Rosellinia bunodes Berk. and Br; Brugmansia extract; Rosellinia bunodes in coffee.

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INTRODUCCIN
Las plantas han evolucionado por ms de 400 millones de aos, y para oponerse al ataque de enfermedades y plagas, han desarrollado un gran nmero de mecanismos de proteccin tales como resistencia, repelencia y accin insecticida (Garca, 1991). Los plaguicidas de origen qumico, que son productos sintticos destinados al control de plagas y enfermedades en las plantas, han tenido importancia en el incremento de la produccin agrcola; sin embargo, el uso continuo e indiscriminado de estas sustancias, no slo ha causado enfermedades y muertes por envenenamiento a corto y largo plazo, sino que tambin han afectado al medio ambiente, acumulndose en humanos, animales, en el suelo y en el agua (Maggi, 2004). De las 700.000 especies de plantas que hay en el mundo la mayora en los trpicos, solamente algunas se conocen y se han investigado con nes de aprovechamiento. Ms de 2.000 especies en el mundo tienen propiedades plaguicidas (Munich, 1988). Solamente un nmero reducido de estas especies han sido aprovechadas hasta el momento para el control de enfermedades y plagas. El sector cafetero genera 631.000 empleos directos al ao, 3,7 veces ms que las flores, el banano, el azcar y la palma juntos; del cultivo del caf dependen directamente ms de 2`000.000 de colombianos (Silva, 2007). Los problemas sanitarios que reducen la poblacin de rboles de caf son de vital importancia, pues disminuciones en la densidad de siembra original, conducen a obtener mermas en la productividad del caf. Las denominadas Llagas Radicales del Caf, ocasionadas por los patgenos del suelo Rosellinia bunodes Berk. y Br. y R. pepo Pat., son consideradas de importancia econmica en la zona cafetera colombiana, debido a que provocan la muerte de los cafetos, especialmente, cuando los cultivos se establecen sobre antiguos bosques o despus de la eliminacin de rboles de sombro (Fernndez y Lpez, 1964; Castro, 1992). El impacto econmico

de Rosellinia est representado en la disminucin progresiva del nmero de rboles productivos, los costos del manejo de esta enfermedad y en muchos casos por la inutilizacin de los suelos contaminados para la siembra de cualquier tipo de especie perenne debido al amplio rango de hospedantes que facilitan la presencia de estos hongos (Castro, 1999; Castro, Duque y Montoya, 2003). Rosellinia fue detectada por primera vez en 1870 por Berkeley y Broome en fragmentos de races podridas provenientes de Ceyln (Saccas, 1956). En ataques de R. bunodes Berk. y Br., los signos se observan debajo de la corteza y corresponden a masas de micelio en forma de puntos y rayas negras incrustadas entre los tejidos, que pueden ir acompaadas de un micelio blanquecino o de color gris y consistencia de pelo de rata. Las plantas muestran un amarillamiento general del follaje, seguido de marchitamiento y secamiento total de la planta, y frecuentemente se observan las hojas adheridas a las ramas. La muerte de rboles ocurre en focos, que con el transcurso del tiempo, incrementan su tamao sin alcanzar una forma determinada. Desde hace ya varios aos, se han realizado experimentos con el propsito de determinar un mtodo eciente de control de la enfermedad, probando diferentes condiciones de manejo qumico, agronmico, gentico y biolgico. El control qumico ha demostrado no ser una herramienta viable para el control de la enfermedad en cacao como lo demuestran Merchn (1993) y Restrepo (1997) quienes mencionaron, que el uso de productos qumicos contra Rosellinia puede favorecer el desarrollo del patgeno mediante la reduccin de la microora antagonista del suelo. En general, el control qumico dio resultados insatisfactorios, errticos y antieconmicos (Cubillos, 1988; Merchn, 1989). El control agronmico es otro mtodo utilizado; entre sus recomendaciones se describen la erradicacin de rboles muertos, la poda de races laterales, el repique del suelo en una franja no

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menor a un metro de ancho y la quema de residuos infectados (Aranzazu, 1997). La incorporacin de enmiendas al suelo, como carbonato de calcio para elevar el Ph, tambin podra ayudar a controlar la enfermedad (Nowell, 1916; Aranzazu et al., 1999; Mendoza et al., 2003). Es importante observar que, dadas las caractersticas propias de la enfermedad, donde los sntomas muchas veces no son visibles inmediatamente despus de la infeccin, este procedimiento puede resultar ineciente como mtodo de control. Brugmansia Pers. es un gnero de plantas perteneciente a la familia Solancea, descrito por Christian Hendrik Persoon en 1805, teniendo como especie tipo a Brugmansia candida Pers. y que agrupa ocho especies, distribuidas de manera natural en Centro y Suramrica. Plantas de este gnero fueron usadas por casi todos los indgenas del continente y en Colombia, especialmente por los Chibchas, Catos y los Cunas. En la Amazona colombiana lo llaman Borrachero y dicen que los Pays lo utilizan con precaucin por el respeto que les causa su poderoso espritu. En el pasado, se consideraba la Brugmansia como representativa del gnero Datura, pero estudios recientes de biologa de estas plantas lo clasican en gneros distintos. Como en el caso de Datura, todas las partes de Brugmansia son altamente txicas. Las plantas, son algunas veces ingeridas para recreacin o para ceremonias shamnicas ya que contienen alcaloides como la escopolamina y atropina; el consumo de Brugmansia es un importante aspecto ritual en algunos pueblos indgenas del oriente del Amazonas como los Jvaros. Tiene varios usos en la medicina clsica, se utiliza en muy pequeas cantidades para prevenir y tratar mareo, nuseas y vmitos. Por su accin sedante sobre el sistema nervioso central, se usa como antiparkinsoniano, antiespasmdico y como analgsico local. Sirve para provocar dilatacin de la pupila en exmenes de fondo de ojo, adems, se administraba junto a la morna como analgsico en los partos, pero posteriormente se

abandon al verse implicada como factor causal en la tasa excesivamente alta de mortalidad infantil. Las semillas son ampliamente utilizadas como un aditivo de la chicha. Las hojas molidas y las ores se preparan en agua caliente o fra para tomarse como t. Las hojas pueden mezclarse con una infusin de tabaco. Se cultiva como planta ornamental en jardines e invernaderos. Partiendo de trabajos realizados con plantas del gnero Brugmansia, a la cual se le han demostrado efectos fungicidas como en el estudio realizado por Orozco et al., (1996) y siguiendo la recomendacin de Bedoya, en su tesis Descripcin de las relaciones ecolgicas del borrachero (Brugmansia sp.) en Manizales y Villamara (Bedoya et al., 2009, de evaluar el efecto del extracto de este gnero sobre diferentes microorganismos, se valoraron con este trabajo las consecuencias de la aplicacin del extracto de Brugmansia aurea sobre el hongo Rosellinia bunodes Berk y Br. METODOLOGA Evaluacin in vitro (primer ensayo) Coleccin del material vegetal: las hojas, tallos y ores, de Brugmansia aurea se recolectaron en el Jardn Botnico de la Universidad de Caldas ubicado a 2100 msnm, con temperatura promedio de 17 C y humedad relativa de 65%. El material recolectado se someti a 0 C de temperatura por 24 horas para inducir lisis celular y facilitar la extraccin de sus componentes qumicos. Obtencin del extracto: la obtencin de los extractos se realiz en el Laboratorio de Procesos Agroindustriales y la rotavaporacin de los mismos en el Laboratorio de Suelos de la Universidad de Caldas. Extraccin por el mtodo de Soxhlet: se tomaron 100 gramos de las ores, tallos y hojas de la planta respectivamente, se picaron y se llevaron a la campana de extraccin de un equipo Soxhlet. En un baln de vidrio se depositaron 146 ml de etanol a 96% y se afor con agua destilada hasta

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completar 200 ml considerando nalmente 70% de concentracin de etanol y se conect a la campana de extraccin. El baln con el alcohol se calent, inicindose el proceso de extraccin continua, procurando 80C de temperatura inferior, hasta completar entre tres y cinco ciclos dependiendo de la parte de la planta; con tiempo de dos y media a tres y media horas. Al material as obtenido, se le retir el solvente mediante evaporacin con el equipo Rotavapor Buchi Waterbth b-480 a 50C para evitar la desintegracin de sus componentes. El extracto se conserv en recipientes de vidrio mbar en refrigeradores a temperaturas entre 3C y 5C. La concentracin terica Peso/Volumen obtenida fue de 0,75 g/ml (g de parte de planta / ml extracto puro). Obtencin del patgeno: las muestras de las plantas con los sntomas caractersticos de la Llaga Negra (Rosellinia bunodes Berk. y Br.) fueron suministrados por el Departamento de Fitopatologa del Centro Nacional de Investigacin

en Caf, CENICAF, y replicados en cajas petri en el Laboratorio de Fitopatologa de la Universidad de Caldas. Preparacin del medio para los tratamientos: para los tratamientos se utilizaron diluciones de 50% y 100% de los extractos de ores, hojas y tallo. Estas se prepararon en Extracto Malta Agar EMA (50 g/l) en cajas petri esterilizadas en autoclave a 121C y 15 lb/cm2 de presin. Para las diluciones de 50%, al momento de preparar Extracto Malta Agar EMA, se utiliz la mitad del volumen requerido con el extracto de cada una de las partes de la planta a evaluar, y la mitad restante del volumen se afor con agua destilada estril. Para las diluciones de 100%, se utiliz en su totalidad el extracto de cada una de las partes de la planta para la preparacin del medio, ms el EMA en la cantidad demandada. Tratamientos: el nmero de tratamientos totales fue de siete con cinco replicaciones cada uno.

Tabla 1. Clases de tratamientos evaluados en la investigacin. No. de tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 Parte de la planta usada Tallo Tallo Hojas Hojas Flores Flores Testigo Dilucin utilizada 50% 100% 50% 100% 50% 100% Sin extracto

Evaluacin in vivo Preparacin del inculo de Rosellinia bunodes Berk y Br. para las pruebas in vivo: basados en la metodologa utilizada por Castro y Esquivel (1991), el hongo se sembr en semilla de sorgo a partir de la colonia pura. En un erlenmeyer de 250 ml se colocaron 60 g de sorgo y 20 ml de agua destilada que posteriormente se esterilizaron durante 15 minutos en autoclave. Una vez esterilizado el sorgo, se procedi a sembrar un trozo de micelio del patgeno obtenido de cultivo puro en la cmara de

ujo laminar. El erlenmeyer con el sorgo y despus de inoculado con el hongo, se coloc en incubacin a temperatura ambiente y en total oscuridad hasta que las semillas estuvieron totalmente recubiertas por micelio del hongo y listas para ser implantadas en las races del caf y las chapolas. Inoculacin de chapolas de caf Coffea arbiga con el hongo Rosellinia bunodes Berk. y Br (segundo ensayo): para obtener el material vegetal requerido para este procedimiento, se construy un germinador de 1 m. Se utiliz semilla

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de caf certicada variedad Colombia, a la cual se le retiro el pericarpio para acelerar su nacimiento. 60 das despus de germinacin, se trasplant a vasos desechables de icopor de 16 onzas llenos de suelo obtenido del jardn botnico de la Universidad de Caldas, y desinfestado con agua hirviendo. Una vez sembradas en los vasos desechables se inocularon las chapolas utilizando las semillas de sorgo con el hongo, stas se colocaron en el cuello de la chapola; la boca del vaso se cubri con plstico negro. La cantidad de inculo colocado en los vasos fue de 8 gramos por kilogramo de suelo. Los tratamientos evaluados fueron: Tratamiento 1. Rosellinia bunodes slo. Tratamiento 2. Rosellinia bunodes + extracto de Borrachero. Tratamiento 3. Testigo absoluto. Chapolas regadas con agua. Para conocer la dinmica de infeccin del patgeno se realizaron muestreos a diferentes tiempos as: 3-6-9-12 y 15 das despus de la inoculacin. Se utilizaron cinco chapolas por tratamiento. Evaluacin del avance Rosellinia bunodes Berk. y Br. en presencia del extracto de Brugmansia aurea (tercer ensayo) Obtencin del inculo de Rosellinia bunodes Berk y Br., para la medicin del avance en presencia y ausencia del extracto de Brugmansia aurea: las muestras radiculares fueron obtenidas de la nca La Esperanza, vereda Lembo, municipio de Santa Rosa de Cabal. Las races fueron colectadas de plantas que no presentaban sntomas caractersticos de la enfermedad y de apariencia sana; se procur que las races recolectadas fueran homogneas en dimetro (1 cm). Las races se lavaron con agua procurando eliminar todas las partculas de suelo, se les retiraron las raicillas, se cortaron en trozos de 8 cm y con peso promedio de 5 g, se sumergieron en hipoclorito de sodio a 5% por 2 minutos, posteriormente, se lavaron con abundante agua destilada estril en repetidas

ocasiones y se depositaron en envases de vidrio humedecido con agua destilada estril, imitando una cmara hmeda. En la cmara de ujo laminar, se introdujo el sorgo inoculado con el hongo en el envase de vidrio, cuidando que el sorgo hubiese quedado en contacto con las races y distribuido uniformemente en el recipiente. Treinta das despus de la inoculacin de Rosellinia bunodes Berk. y Br. en las races, estaban cubiertas en su totalidad por el micelio, y en ese momento se sembraron en guaduas con el suelo esterilizado para medir as el avance longitudinal del hongo. Variables a evaluar Tamao de la colonia (in vitro): una porcin de micelio del hongo se extrajo de las cajas de crecimiento inicial mediante un sacabocado estril de tres milmetros de dimetro, y fue colocada en el centro de cajas petri que contenan 20 ml de Extracto Malta Agar (50 g/l) ms el extracto en la dilucin a evaluar. Las colonias del hongo sembradas en las cajas se incubaron a 17C por un lapso de 2 a 3 semanas, posterior a esto, se midi con una regla el crecimiento radial en centmetros de las colonias. Efecto del extracto sobre el hongo Rosellinia bunodes inoculado en chapolas de caf: en cada lectura (con tres das de diferencia) se evaluaron: cinco testigos absolutos sin el hongo (TA), cinco testigos inoculados con Rosellinia bunodes (T + Rb) y sin riego con el extracto y cinco chapolas inoculadas con Rosellinia bunodes y riego con extracto (Rb + Ex). A los testigos se les reg con agua diariamente, y a las dems plantas se les aplic el extracto que tena el mejor resultado en las pruebas de laboratorio (in vitro), intercalado el riego con agua. Se realizaron muestreos peridicos con evaluacin cualitativa de sntomas areos, utilizando una escala de 1 a 5, donde 1 = chapola sana, 2 = prdida de brillo en hojas, 3 = leve amarillamiento, 4 = marchitamiento y 5 = muerte de las hojas; adems se evaluaron las races para encontrar diferencias en los muestreos realizados. Avance del hongo en suelo: la inoculacin del suelo se hizo con trozos de races de

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cafeto previamente colonizadas en su totalidad por Rosellinia bunodes, se sembraron en trozos de guadua partidos por la mitad; se les hicieron aplicaciones del extracto con mejor respuesta en las pruebas de laboratorio de la siguiente manera: Aplicacin simultnea: al momento de sembrar las races invadidas por el hongo. Aplicacin preventiva: tres das antes de la siembra de las races invadidas por el hongo. Aplicacin fungicida: tres das despus de la siembra de las races invadidas por el hongo. Testigo: se sembraron las races invadidas por el hongo y se regaron con agua. Se hicieron mediciones peridicas para determinar el avance longitudinal del hongo, y el efecto que tuvo el extracto sobre el mismo.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Pruebas in vitro Tratamiento testigo: 18 das despus de la inoculacin, el hongo Rosellinia bunodes haba

invadido con un micelio blanquecino el total de la caja petri. En ninguno de los tratamientos con presencia del extracto de Brugmansia aurea se observ crecimiento del hongo Rosellinia bunodes, esto quiere decir, que el extracto ejerci control total sobre el hongo en condiciones de laboratorio en diluciones de 50% y 100%; todas las partes de la planta evaluadas (hojas, or y tallo) inhibieron el crecimiento del hongo. Dieren estos resultados con los encontrados por Orozco (1996) quien observ el extracto de or de Datura (Brugmansia) suaveolens como el mejor tratamiento en el control de Rosellinia sp. en condiciones de campo; divergencias que pueden ser debidas a que, las especies de Brugmansia usadas en sendos estudios pueden tener variadas concentraciones de alcaloides como agentes inhibitorios del hongo, variaciones que hipotticamente dependen de la parte de la planta utilizada y de las condiciones agroecolgicas regionales (Brugmansia aurea en Colombia puede tener ms alcaloides en hojas que Brugmansia suaveolens en Centro Amrica). En el tratamiento testigo, 18 das despus de la inoculacin, el hongo Rosellinia bunodes haba invadido de un micelio blanquecino el total de la caja petri.

Figura 1. Diferencia en la apariencia del micelio de Rosellinia bunodes. A) Septos del tratamiento testigo. B) Septos en contacto con el extracto de Brugmansia aurea.

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Efecto fungicida del extracto de Borrachero Brugmansia aurea sobre el hongo Rosellinia bunodes inoculado en chapolas de caf Aunque, con los extractos procedentes de las tres partes de la planta (hoja, or y tallo), se obtuvieron

resultados similares en cuanto a la inhibicin del crecimiento del hongo Rosellinia bunodes, para las pruebas in vivo, tanto en chapolas como en el avance del hongo en suelo, se utiliz el extracto de hojas de Brugmansia aurea por la facilidad en su consecucin.

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Mediante el uso de la escala descriptiva de sntomas areos, se calic el proceso infectivo de Rosellinia bunodes con el n de encontrar diferencias entre las chapolas que se regaron con el extracto de Brugmansia aurea, y las que se regaron con agua nicamente. Contrario a lo encontrado por Ibarra (1998), en esta evaluacin no se observaron sntomas de amarillamiento en las chapolas, por lo que se omiti la escala 3 en la que se describa un leve amarillamiento. Al tercer da despus de la inoculacin (T + Rb), no se observaron sntomas areos, correspondientes al grado nmero 1 en la escala descriptiva, aunque en las races ya comenzaba la colonizacin del hongo. En las races evaluadas, se observ micelio blanco similar a una telaraa, enredndose en las races secundarias de las chapolas; caractersticas similares se encontraron en el tratamiento Rb + Ex. En la siguiente evaluacin, seis das despus de la inoculacin, las chapolas T + Rb evaluadas presentaban una tonalidad opaca y las hojas cidas; sntomas que corresponden al grado 2 de infeccin; y el avance del micelio en las races fue ms marcado que en la primera evaluacin (tres das); notndose una mayor cantidad de micelio con forma de telaraa y de color blanco brillante. En el cuello de la raz se dio un cambio de tonalidad de verde a caf claro, sntoma del avance de la enfermedad; esto concuerda con lo observado por Fernndez y Lpez (1964), quienes hallaron que los sntomas areos en chapolas se manifestaron al quinto da despus de la inoculacin y diere con lo encontrado por Ibarra (1998) quien determin (1998), que los sntomas areos se presentaban despus del noveno da de la inoculacin. La diferencia en los tiempos de aparicin de sntomas se da, debido a las discrepancias en los mtodos de inoculacin empleados, donde Fernndez y Lpez causaron heridas a las races antes de inocularlas, e Ibarra mezcl el suelo con semillas de sorgo invadidas con el hongo Rosellinia bunodes y sembr en l las chapolas. En el caso de las chapolas tratadas con el extracto (Rb + Ex), aunque se notaba la prdida de brillo

en las hojas, sta no fue tan marcada como en el tratamiento T + Rb y las hojas no mostraban sntomas de acidez. El sistema radicular de las chapolas evidenci el avance del hongo afectando las races secundarias, y ste fue mayor en comparacin con la primera evaluacin realizada tres das despus de la inoculacin, aunque en menor proporcin que el tratamiento T + Rb. Nueve das despus de la inoculacin, el tratamiento T + Rb, mostraba claros sntomas de acidez y sus hojas estaban cadas aunque conservaban una coloracin verde plida. Las races estaban en gran parte invadidas por el micelio del hongo, que haba alcanzado la raz principal, el color del micelio se notaba de una coloracin ms opaca que en los primeros das de evaluacin, y en forma de red muy tupida, abarcando no slo la raz sino tambin el suelo que estaba alrededor. El cuello de la raz se torn de color marrn, lo que concuerda con la observacin de Ibarra (1998), aunque el autor menciona que es debido a tejido putrefacto, aspecto que no es evidente en las plntulas evaluadas. El tratamiento Rb + Ex presenta acidez en hojas, sin amarillamiento, sus races tienen un mayor grado de invasin del micelio del hongo que en la evaluacin realizada seis das despus de la inoculacin, pero es menor que el tratamiento T + Rb, pues no se ve la telaraa envolviendo races ni suelo. La coloracin del cuello de la raz es de apariencia marrn clara. Doce das despus de la inoculacin del patgeno, las chapolas inoculadas con Rosellinia bunodes y con riego con agua (T + Rb), presentaban hojas completamente cidas, opacas, aunque sin amarillamiento, en posicin vertical adheridas al talluelo de la chapola. En comparacin con evaluaciones anteriores, las chapolas exhibieron menos races secundarias y terciarias al momento de la evaluacin; el cuello de la raz de las chapolas estaba de coloracin marrn oscura y los tejidos se sentan blandos y ms delgados que el resto del tallo.

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Las chapolas regadas con el extracto de hojas de Borrachero (Brugmansia aurea) tuvieron sntomas similares a los descritos para el tratamiento T + Rb. Aunque las hojas del tratamiento Rb + Ex conservaban su coloracin verde y presentaban un grado de acidez avanzado; no se not la prdida de races que fue muy evidente en el tratamiento sin el riego con el extracto. El micelio del tratamiento T + Rb, comparado con el encontrado en el tratamiento Rb + Ex, era ms abundante y vigoroso, aunque su coloracin fue muy similar. Hasta esta evaluacin no se notaron cambios signicativos en el color del micelio, diriendo con lo encontrado por Ibarra (1998), quien not cambios progresivos en la coloracin del micelio, presentndose esta estructura del hongo de color blanco brillante, blanco opaco, gris claro y oscuro; aunque s hay concordancia en la apariencia del micelio que estaba a la vez delgado y tupido. La diferencia de resultados encontrados en la coloracin del micelio se debi al tiempo de desarrollo de la evaluacin, pues en 15 das, las plantas estaban muertas, en comparacin con el ensayo de Ibarra (1998), en el cual la muerte de las chapolas se dio slo hasta los 30 das, tiempo suciente para notar las diferencias en el color del micelio de Rosellinia bunodes. El tratamiento testigo (T + Rb), 15 das despus de la inoculacin, presentaba chapolas completamente marchitas, las hojas tenan color pardo oscuro, el tallo en general se encontraba blando y putrefacto, races secundarias escasas o ausentes, y el micelio del hongo esparcido por todo el vaso. En el caso del tratamiento Rb + Ex, a diferencia del tratamiento T + Rb, las chapolas no se encontraban marchitas completamente, las hojas mostraban una quemazn en sus bordes, el tallo estaba putrefacto en partes y la prdida de races secundarias fue menor. El micelio haba invadido el total del vaso. Las chapolas del tratamiento Rb + Ex, se marchitaron completamente 18 das despus de la inoculacin, aunque la prdida de races nunca fue tan severa como en el tratamiento sin riego con el extracto.

El hecho de que a nivel de laboratorio no haya habido crecimiento del hongo por accin del extracto en comparacin con las pruebas en chapolas donde el hongo pudo desarrollarse, se debe a que a nivel de laboratorio, solamente estaban presentes el hongo y el extracto en el medio de cultivo (EMA), mientras que en suelo hay otros factores que inciden tanto en el desarrollo del hongo como en la eciencia del extracto (luz, temperatura, fotodescomposicin del extracto, interaccin del extracto con el suelo), adems del hecho de que el hongo Rosellinia bunodes es un habitante natural del suelo. La ubicacin del inculo inuye en el desarrollo del hongo acelerando el proceso infectivo. Evaluacin del avance en suelo de Rosellinia bunodes Berk.y Br en presencia del extracto de Brugmansia aurea Las evaluaciones del avance del hongo en suelo se realizaron cada cinco das, midiendo con una cinta mtrica el avance que el hongo haba alcanzado en centmetros, y realizando una descripcin cualitativa del hongo. Inicialmente la siembra de Rosellinia bunodes en el suelo se realiz con raicillas de caf invadidas por el micelio de hongo, pero tras varios das sin observar el avance del mismo, se decidi inocular el suelo con la semilla de sorgo utilizada para las pruebas en chapolas. Las evaluaciones realizadas a los tratamientos que involucraban el riego con el extracto de hojas de Borrachero mostraron comportamientos similares en cuanto al avance longitudinal y apariencia del hongo. Las diferencias encontradas entre el tratamiento testigo y los tratamientos con riego con extracto de Borrachero (Brugmansia aurea), se dieron principalmente en la apariencia y densidad del micelio del hongo Rosellinia bunodes; el micelio regado con el extracto, tena apariencia mucho ms delgada y opaca que el testigo y su densidad era mucho menor. El avance del hongo en las guaduas era ms disperso en los tratamientos regados con el extracto, comparado con un avance compacto del micelio del hongo en el tratamiento testigo.

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Tabla 2. Evaluacin del tratamiento testigo: riego con agua. DA 5 10 15 20 AVANCE (cm) 0,7 3,5 7,2 12 OBSERVACIONES El micelio del hongo presenta mayor crecimiento en el sitio de inoculacin. Se da un crecimiento del micelio alrededor de las semillas de sorgo, entrando en contacto con el suelo. El micelio es blanco, delgado y comienza a adherirse al suelo. El micelio se esparci sobre el ancho de la guadua. Toma apariencia ms gruesa y es ms denso. En algunos segmentos est entretejido. Blanco brillante - blanco opaco. Micelio bien distribuido a lo ancho de la guadua y avanza ms rpido que en los primeros das.

Al terminar la evaluacin del avance del hongo en el suelo, se tomaron placas del micelio del hongo para determinar diferencias entre el tratado y el no tratado con el extracto, encontrando que el micelio tratado con el extracto presentaba caractersticas similares a las observadas a nivel microscpico en la evaluacin in vitro y en chapolas: el micelio del hongo en contacto con el extracto se notaba mucho ms delgado y deshidratado.

tratamiento testigo inoculado con Rosellinia bunodes (T + Rb) y sin riego con el extracto. Las evaluaciones realizadas a los tratamientos que involucraban el riego con el extracto para la medicin del avance en suelo mostraron comportamientos similares. No se encontraron diferencias sustanciales en cuanto al avance del hongo, si se regaba antes, despus o simultneamente a la inoculacin del suelo. A nivel microscpico, el hongo tratado con el extracto de hojas de Borrachero Brugmansia aurea mostraba deformaciones y deshidratacin en comparacin con el tratamiento testigo.

CONCLUSIONES
Las tres partes del Borrachero (Brugmansia aurea) ( evaluados (hoja, tallo y or) ejercieron control total sobre el hongo Rosellinia bunodes Berk. y Br. en condiciones de laboratorio o in vitro en diluciones de 50 y 100%. El extracto de hojas de Borrachero retras la muerte de las chapolas inoculadas con el hongo Rosellinia bunodes Berk. y Br. tres das en comparacin con chapolas inoculadas con el hongo y sin aplicacin del extracto, demostrando efecto fungisttico. El hongo tratado con extracto de hojas de Brugmansia aurea mostr deformaciones y deshidratacin a nivel microscpico, a nivel macroscpico, se observ micelio dbil, con menor densidad y diferencias de color en comparacin con el micelio observado en el

RECOMENDACIONES
Realizar evaluaciones con el n de determinar el perodo de degradacin de los compuestos qumicos del extracto de Borrachero. Determinar la concentracin o dosis mnima inhibitoria del desarrollo del hongo Rosellinia bunodes a nivel de laboratorio. Determinar cul o cules de los compuestos qumicos presentes en la planta de Borrachero Brugmansia aurea, es el responsable de la accin fungi-txica.

Evaluacin In Vitro del extracto de Brugmansia aurea PERS. (CACAOSABANERO) para el control de Rosellinia bunodes BERK. Y BR.

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Realizar pruebas sobre plantas de mayor edad en campo, ya que stas pueden resistir ms tiempo el ataque del hongo y probar el efecto fungisttico del extracto. Evaluar el efecto que pueda tener el extracto de Brugmansia aurea sobre otros hongos.

Evaluar otros mtodos de extraccin del complejo de alcaloides, diferentes al utilizado en esta investigacin. Determinar los porcentajes de alcaloides presentes en cada una de las partes de la planta y con ubicacin agroecolgica diferente.

BIBLIOGRAFA
lvarez G., J. A. (1945). Studies of Coffea root disease in Puerto Rico. In: The Journal of Agriculture of the University of Puerto Rico (Puerto Rico) 29(1): 1-29. American Brugmansia & Datura Society (ABADS). (2005). Description and identication of Brugmansia species and Hibrids [En lnea]. Citado por Bedoya, J.G. Descripcin de las relaciones ecolgicas del Borrachero (brugmansia sp.) en Manizales y Villamara. Aranzazu, HF, Crdenas, LJ; Mujica, JJ; Gmez, QR. (1999). Manejo de las llagas radicales (Rosellinia sp.). Boletn de Sanidad Vegetal 23. Santaf de Bogot: Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) y Corpoica. 35 p. Aranzazu, HF. (1997). Control de la llaga estrellada en cacao causada por Rosellinia pepo Pat. Fitopatologa Colombiana 21:5-9. Ayala V., H; Sotelo F., J. (1993). Cuanticacin de los alcaloides de Brugmansia arborea (oripondio) y estudio de su efecto farmacolgico sobre la funcin memoria del SNC / Brugmansia arborea (oripondio). Bedoya, J.G., Bernal, M.E. y Castao, J.E. (2009). Descripcin de relaciones ecolgicas de Brugmansia aurea con plantas , insectos y hongos en manizales y Villa mara. En: Boletn Cientco Centro de Museos Museo de Historia Natual 13 (2): 26 - 39 Castro C., B.L. (1992). Manejo y control de la llaga radical negra. Informe anual de labores de la disciplina de topatologa. Centro Nacional de Investigaciones de Caf CENICAF. Chinchin, Colombia. ________. (1999). Las llagas del cafeto. En: Avances tcnicos Cenicaf 268: 1-8. Castro C., B.L.; Duque O., H.; Montoya R., E.C. (2003, junio). Incidencia de llagas radicales (Rosellinia sp.) en el sistema de caf-yuca en el departamento del Quindo. Memorias Congreso de la Asociacin Colombiana de Fitopatologa y Ciencias Anes, 24. Ascol. Armenia, Colombia. pp. 3233. Castro C., B.L.; Esquivel R., V.H. (1991). Las llagas radicales del cafeto. En: Avances tcnicos Cenicaf 163: 1-4. Cubillos, G. (1988). Eciencia de campo del fungicida sistmico tridemorph en el control de la Rosellinia del cacao. El cacaotero colombiano 11: 27- 33. Federacin Nacional de Cafeteros de Colombia. (1997). Sistema de informacin cafetera, SICA. Santa fe de Bogot: Federacaf.. 178 p.
agron. 17(1): 62 - 72, 2009

Fernndez, B. O. y Lpez, S. (1964). Llagas radiculares negras (Rosellinia bunodes) y estrellada (Rosellinia pepo) del cafeto. Parte I. Patogenicidad e inuencias de la clase de inculo en la infeccin. En: Revista Cenicaf. Vol. 15, no. 3; p. 126-144. Garca M., M. (1991). Aplicacin de polvos y extractos de plantas para el combate del gusano cogollero del maz (Spodoptera frugiperda) en la regin costera del estado de Veracruz, Mxico. Tesis. Ingeniera Agronmica. Universidad Autnoma Chapingo.

72

Alejandro Snchez Taborda, Juan Pablo Martnez Arango, Mara Elena Bernal Vera, Elmer Castao Ramrez

Ibarra Gaon, N. L. (1998). Estudio del proceso infectivo de Rosellinia bunodes (Berk. y Br.) Sacc. en caf. Popayn. Tesis: Licenciada en Biloga. Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y de la Educacin, Programa Biologa, Universidad del Cauca. Junguito B., R.; Pizano S., D. (1991). Produccin de caf en Colombia. Santa fe de Bogot: Fedesarrollo-Fondo Cultural Cafetero.. 320 pp. Macis del E. S., Gebhardt, C.G., Lester, R.N. (1999). Anlisis de AFLP de relaciones genticas en la tribu Datureae (Solanaceae). [En lnea]: 2005. Citado por Bedoya, J.G. 2005. Descripcin de las relaciones ecolgicas del borrachero (brugmansia sp.) en Manizales y Villamara. Maggi, M. (2004). Insecticidas naturales. Ciencia Unidad. CEPROCOR. Argentina. pp. 8. Mendoza, R.A., Ten Hoopen, G.M., Kass, D.C.J., Snchez, V.A., Krauss, U. (2003). Evaluation of mycoparasites as biocontrol agents of Rosellinia root rot in cocoa. Biological Control 27: 210227. ( Merchn, VM. (1989). Evaluacin de funguicidas para el control de la llaga estrellada (Rosellinia pepo) del cacao. En: Congreso de la Asociacin Latinoamericana de Fitopatologos, Divisin APS-Caribe, y la Asociacin Colombiana de Fitopatlogos y Ciencias Anes. Resmenes. Cali, Colombia, CIAT. p. 44. ______________. (1993). Experiencias en el manejo de Rosellinia. Ascol Informa 19: 23- 24. Munich, E.L. (1988). Plantas con propiedades plaguicidas de Choluteca. Honduras: Lithaca. Nowell, W. (1916). Rosellinia root diseases in the Lesser Antilles. In: West Indian Bulletin 16: 31-77. Orozco, VX; Bertsch, HF; Rivera, CG; Mora, UF; Navarro, FJ y Badilla, W. 1996. Prueba preliminar sobre el efecto de extractos de reina de la noche (Datura [Brugmansia] suaveolens) en el combate de Rosellinia sp. en manzana (Malus sp.) bajo condiciones de campo. Direccin de Investigaciones Agrcolas, Departamento de Fitoproteccin. Ministerio de Agricultura y Ganadera. Costa Rica. X Congreso Nacional Agronmico. III Congreso de Fitopatologa. Restrepo, F. (1997). Efecto de los hongos micorrizgenos Entrophospora colombiana y Glomus stolosum en el control de la llaga negra del cafeto Rosellinia bunodes. M.Sc. Tesis. Universidad Catlica, Manizales. Saccas, A. M. (1956). Les Rosellinia de cafiers en Qubangul Chan. En: Agronomie Tropical (Francia) 11(5): 551-595; 11(6): 687-706. Silva, G. 2007. Informe del Gerente General. Bienestar social para los cacultores. En: Red cafetera. Captulo IV. Federaci[on Nacional de Cafeteros. P. 28.