Laporan Struktur dan Fungsi Subseluler

Hari/tanggal : Senin, 12 Maret 2012 PJP : Ramdan Hidayat, S.Si, M.Si Nama Asisten : Didit Haryadi Eka Purwatresna Elsa May Susanti Tati Husniyati

FRAKSINASI SUBSELULER (PREPARASI HOMOGENAT SEL HATI TIKUS)

Kelompok : 3C Sylvia (G84100080) Dwi Fauziah (G84100065) Riswan Dwi Cahyana (G84100092) Natasha Arviana (G84100095)

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

Pendahuluan Hati merupakan salah satu organ terpenting yang terdapat dalam tubuh makhluk hidup. Hati memiliki banyak fungsi di dalam tubuh, antara lain sebagai faktor biokimia utama dalam tubuh dan melakukan fungsi metabolisme terhadap zatzat dalam darah yang diubah menjadi zat antara atau zat sisa (Sabiston 1987). Selain itu, hati juga dapat menguraikan dan mendetoksifikasi racun yang masuk ke dalam tubuh melalui darah (Sacher & McPherson 2000). Fraksinasi subseluler adalah proses perusakan sel dan dan pemisahan organelorganelnya dengan cara sentrifugasi (Campbell et al 2002). Sentrifus merupakan perangkat yang bekerja dengan kecepatan rotasi untuk menghasilkan suatu gaya pemusing atau sentrifugal (Thackray & Myers 2000). Alat ini berfungsi untuk memisahkan material yang ada dalam larutan sehingga terpisah menjadi dua bagian, yaitu supernatan dan pelet. Umumnya kecepatan rotasi sentrifus mencapai 40 ribu permenit sehingga dapat memisahkan material dengan perbedaan densitas yang kecil. Sentrifus dapat digunakan untuk memisahkan komponen sel, darah, mengisolasi sampel murni protein, serta mengisolasi virus. Selain itu, teknik sentrifugasi dapat digunakan untuk mengisolasi partikel-partikel sel dalam mempelajari morfologi, aktivitas, dan komposisi dari partikel tersebut (Bintang 2010). Terdapat dua teknik sentrifugasi, yaitu sentrifugasi preparatif dan sentrifugasi analitik. Sentrifugasi preparatif terbagi atas tiga teknik, yaitu teknik sentrifugasi diferensial, gradien densitas, dan elutriasi. Dalam teknik preparasi homogenat suatu sampel, dapat digunakan teknik sentrifugasi diferensial dan sentrifugasi gradien densitas. Sentrifugasi diferensial merupakan teknik yang berdasarkan perbedaan laju sedimentasi suatu partikel yang berbeda ukuran dan densitas, sehingga partikel yang berukuran lebih besar akan mengendap lebih dahulu (Bintang 2010). Pada awalnya, semua partikel dalam homogenat bercampur secara homogen dalam tabung sentrifus. Setelah dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan dan waktu tertentu, diperoleh pelet berupa endapan yang berada dibawah dan supernatan berupa cairan yang berada diatas. Pelet

selanjutnya disentrifugasi kembali untuk mengurangi kontaminasi, memperbaiki pemisahan partikel, dan menghasilkan pelet yang lebih murni. Sentrifugasi gradien densitas merupakan teknik yang menggunakan kolom dengan cairan yang densitasnya meningkat menuju arah pangkal tabung (Bintang 2010). Teknik ini dilakukan dengan cara meletakkan suatu larutan tertentu diatas larutan lainnya yang kemudian disentrifugasi. Tujuan dari teknik ini adalah untuk memisahkan partikel-partikel berdasarkan densitasnya, bukan untuk menghasilkan pelet. Setelah dilakukan sentrifugasi, cairan yang densitasnya yang lebih besar akan berada dibawah dan semakin menurun densitasnya akan semakin keatas. Teknik gradien densitas dapat berfungsi untuk mencegah pencampuran partikel,

menstabilkan larutan yang ada dalam tabung sentrifus, dan mencegah pemecahan komponen yang dipisahkan.

Tujuan Tujuan percobaan kali ini adalah memahami prinsip fraksinasi subseluler dalam mempersiapkan homogenat sel hati tikus yang akan digunakan dalam percobaan isolasi fraksi inti dan mitokondria selanjutnya.

Alat dan Bahan Alat-alat yang dipakai adalah gelas piala, wadah berisi es, pisau bedah, gunting, botol timbang, tabung vial, neraca analitik, pipet tetes, pipet volumetrik, gelas ukur, homogenizer, dan Sentrifus Beckman JA-20. Bahan-bahan yang digunakan adalah tikus jantan,larutan eter, larutan sukrosa 0.25 M-EDTA 1 Mm (sukrosa-EDTA), larutan sukrosa 0.34 M-EDTA 1 mM, kertas tisu, larutan sukrosa 0.25 M-CaCl2 3 Mm, dan air destilata.

Prosedur Percobaan Larutan sukrosa-EDTA dimasukkan ke dalam gelas piala dan diletakkan dalam wadah yang berisi es. Kemudian seekor tikus jantan dan kertas tisu yang sudah

diberi eter dimasukkan ke dalam sebuah wadah. Tikus yang pingsan selanjutnya di telentangkan dengan bagian dada berada diatas. Kemudian bagian perut tikus dibedah menggunakan pisau bedah dan dibuat sayatan memanjang ke arah dada menggunakan gunting. Selanjutnya organ hati tikus diambil dan langsung diletakkan dalam gelas piala yang sudah berisi larutan sukrosa-EDTA dingin. Organ hati kemudian dikeringkan menggunakan kertas tisu, ditimbang bobotnya, dan langsung dimasukkan ke dalam larutan sukrosa-EDTA. Selanjutnya, organ hati dipotong-dipotong dan dicuci dengan larutan sukrosa-EDTA hingga larutan hampir tidak berwarna lagi. Kemudian potongan hati dipindahkan ke dalam homogenizer sedikit demi sedikit dan ditambahkan sedikit larutan sukrosa-EDTA dingin. Potongan hati selanjutnya digerus menggunakan tangkai penggerus dengan cara menekan potongan hati ke dasar tabung. Homogenat yang diperoleh kemudian dipindahkan ke dalam botol timbang sebanyak 15 ml dan dua tabung vial masing-masing sebanyak 3 ml dan 5 ml. Setelah itu, botol ditimbang dan di sentrifus dengan kecepatan 700 g atau 26.000 rpm selama 10 menit. Setelah dilakukan sentrifus, supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam botol timbang dan diberi label yang akan digunakan untuk isolasi mitokondria pada percobaan selanjutnya. Sedangkan pelet hasil sentrifus

ditambahkan 10 ml larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM dan disaring dengan menggunakan kain blacu. Kemudian partikel seluler dicuci dengan 10 ml larutan sukrosa-CaCl2 dan larutan hasil saringan disimpan ke dalam botol timbang yang telah diberi label untuk selanjutnya digunakan dalam percobaan isolasi inti berikutnya.

Hasil Pengamatan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh data hasil fraksinasi seluler seperti yang ditunjukkan pada tabel 1. Tabel 1 Hasil fraksinasi seluler Meja 1 2 Bobot hati (g) 9.6511 28.9766 Volume homogenat (ml) 20 13

Lanjutan tabel 1 Hasil fraksinasi seluler Meja 3 4 5 6 7 Bobot hati (g) 10.7847 10.0968 9.1068 10.1379 9.6374 Volume homogenat (ml) 23 18 13 12 13

Contoh perhitungan: RCF = 1.119 x 10-5 x r x (rpm)2 700 g = 1.119 x 10-5 x 0.07 m x (rpm)2 rpm2 = rpm = 29894.06 rpm

Pembahasan Fraksinasi subseluler merupakan teknik pemisahan organel-organel di dalam sel dengan cara sentrifugasi. Organ hati dalam tubuh tikus diambil dan dihancurkan untuk memperoleh homogenat hati tikus yang kemudian ditambahkan larutan sukrosa-EDTA dan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 700 g. Pelet yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk isolasi fraksi inti dengan menambahkan larutan sukrosa-CaCl2 sedangkan supernatannya digunakan untuk isolasi fraksi mitokondria. Gambar 1 menunjukkan skema fraksinasi homogenat hati tikus dengan cara sentrifugasi diferensial. Fraksinasi yang dilakukan harus secepat mungkin untuk mencegah terjadinya agregasi komponen-komponen di dalam homogenat (Wilson 1975). Dalam fraksinasi subseluler ini, digunakan tikus jantan sebagai hewan percobaan karena tikus jantan tidak mudah stres dan tidak mengalami siklus menstruasi sehingga dapat memudahkan dalam proses analisis subseluler. Organ tubuh dari tikus yang digunakan dalam percobaan adalah organ hati. Hati merupakan pusat dari semua proses metabolisme tubuh dalam mengubah suatu zat menjadi zat sisa termasuk menetralkan racun yang masuk melalui darah sehingga hati lebih sering digunakan untuk menganalisis komposisi, aktivitas, maupun morfologi dari organelorganel yang terdapat di dalam sel.

Homogenat hati tikus Sentrifugasi 700 g, 10 menit pelet Resuspensi, Sukrosa-CaCl2 Sentrifugasi 1500 g, 10 menit supernatan Sentrifugasi 50000 g, 15 menit

Fraksi Inti

Buang supernatan

pelet Resuspensi, Sukrosa-EDTA, Sentrifugasi 24000 g, 10 menit

supernatan

Ultrasentrifugasi 250000 g, 15 menit

mitokondria

Buang supernatan

mikrosom

sitosol

Gambar 1 Skema fraksinasi homogenat hati tikus Setelah organ hati dipotong-potong, harus terlebih dahulu dibilas dengan larutan sukrosa-EDTA yang berfungsi sebagai desinfektan atau penghilang kuman. Saat dilakukan proses homogenisasi, larutan sukrosa-EDTA kembali ditambahkan ke dalam organ hati yang berfungsi sebagai pelarut. Selain larutan sukrosa-EDTA, juga digunakan larutan sukrosa-CaCl2 yang juga berfungsi sebagai pelarut. Selama percobaan, homogenat harus selalu dalam keadaan dingin untuk menjaga agar struktur dan fungsi dari organel-organel yang diisolasi selama sentrifugasi tetap aktif (Bettelheim 1972). Dari hasil percobaan, diperoleh data hasil sentrifugasi selama 10 menit untuk seluruh kelompok praktikum. Kelompok dua memiliki bobot hati paling besar, yaitu 28.9766 g dengan volume homogenat 13 ml. Kelompok tiga, empat, dan enam

memiliki bobot hati yang hampir sama, yaitu masing-masing 10.7847 g dengan volume homogenat 23 ml, 10.0968 g dengan volume homogenat 18 ml, dan 10.1379 g dengan volume homogenat 12 ml. Sedangkan untuk kelompok satu dan lima juga memiliki bobot hati yang sama, yaitu masing-masing-masing 9.6511 g dengan volume homogenat 20 ml dan 9.1068 g dengan volume homogenat 13 ml. Data-data tersebut memiliki bobot dan volume homogenat yang berbeda-beda. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh beberapa kesalahan yang mungkin terjadi selam percobaan. Kesalahan-kesalahan tersebut antara lain penggerusan hati tikus yang terlalu lama, larutan sukrosa-EDTA yang ditambahkan saat penggerusan masih kurang, pengukuran volume dan bobot larutan yang kurang tepat, dan kesalahan dalam menggunakan pelarut yang harus ditambahkan ke dalam homogenat.

Simpulan Fraksinasi subseluler dapat dilakukan dengan teknik sentrifugasi untuk memisahkan organel-organel di dalam sel yang dapat digunakan untuk isolasi fraksi berikutnya melalui preparasi homogenat hati tikus. Hasil percobaan yang diperoleh pada semua kelompok hampir sama, baik data bobot hati maupun volume homogenat. Beberapa kesalahan yang dapat terjadi, antara lain kesalahan dalam menggunakan bahan pelarut, kesalahan dalam pengukuran, dan kesalahan dalam melakukan penggerusan.

Daftar Pustaka Bettelheim Landserberg. 1972. Laboratory Experiment for General, Organic, and Biochemistry Fourth Edition. USA: Carcourt Inc. Bintang Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga. Campbell Neil A., Jane B. Reece, & Lawrence G. Mitchell. 2002. Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Penterjemah, Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology Fifth Edition. Sabiston David C. 1987. Sabistons Essentials Surgery. USA: W. B. Sanders. Sacher Ronald A. & Richard A. McPherson. 2000. Widmanns Clinical Interpretation of Laboratory Tests. USA: F. A. Davis Company.

Thackray Arnold & Minor Myers. 2000. Arnold O. Beckman: One Hundred Years of Excellence. USA: Chemical Heritage Foundation. Wilson Brian et al. 1975. Fractionation of Nuclei and Analysis of Nuclear Proteins of Rat Liver and Morris Hepatoma. Cancer Research 35: 2954-2958