Medicinski fakultet Sveuilita u Rijeci Katedra za drutvene i humanistike znanosti Akademska godina 2011./2012.

Integrirani preddiplomski i diplomski studij medicine/2. Godina

Pre-differentiated Th1 and Th17 effector T cells in autoimmune gastritis: Agspecific regulatory T cells are more potent suppressors than polyclonal regulatory T cells / Huter, Stummvoll et al.
(izvorni znanstveni lanak) Impact factor 2.325 (seminarski rad)

Kolegij: Uvod u znanstveni rad Voditelj kolegija: prof. dr. sc. Amir Muzur, dr.med. Student : Igor Vlatkovi

Rijeka, travanj 2012. godine

Uvod

Prije same analize lanka valjalo bi rei nekoliko stvari o samim temama ovoga istraivanja; autoimuni atrofini gastritis te openito o vrstama T stanica. Autoimuni gastritis je histopatoloki entitet kojega karakterizira kronina upala gastrine mukoze uzrokovana imunolokim stanicama. Naime, zbog upale dolazi do gubitka parijetalnih i glavnih stanica koje se nalazi u gastrinoj mukoze te njihove zamijene s epitelom slinom crijevnom, "goblet" stanicama i fibroznim tkivom; takoer u lamini proprii dolazi do blage kronine upale. Atrofija eluane sluznice je sam kraj kroninog procesa i javlja se u starijoj dobi. Zbog gubitka parijetalnih stanica koje proizvode unutarnji faktor, koji je bitan za apsorpciju B12, moe doi do perniciozne anemije. Autoimuna bolest je gubitak imunoloke tolerancije na nae vlastite antigene pri kojem dolazi do upalnog odgovora te konzekventno do destrukcije ciljanih tkiva ili organa. Kod AIG (autoimuni gastritis) dolazi do stvaranja antitijela protiv neke od membranskih proteina eluanih stanica ili unutarnjeg faktora. Stanice koje igraju bitnu ulogu su B limfociti te gotovo sve porodice limfocita T; Th1 stanice aktiviraju citotoksine limfocite, Th2 aktiviraju limfocite B, Th17 stanice su proupalne stanice te stvaraju IL-17, a razliite vrste Treg pokuavaju smanjit intenzitet upalnog odgovora.

Istraivanje koje je prethodilo ovome

Stummvoll je u svom prijanjem radu na ovu temu dokazao da Th17 stanice uzrokuju najvea epitelna oteenja te da se stanini infiltrati sastoje primarno od eozinofila, a da se u serumu nalazi poviena koliina IgE.1 Pokazalo se da poliklonalne nTreg suprimiraju Th1 i Th2 efektorske stanice, a Th17 induciranu bolest samo u ranim fazama. Glavni uinak Treg stanica je inhibicija ekspanzije T efektorskih stanica. U to govori injenica da kad su ih izolirali iz zatienih ivotinja one nisu bile anergine te su bile potpuno sposobne proliferirat i stvarati citokine ex vivo. Zakljuili su da bi snani inhibitorni uinak Treg na neke od T efektorsih stanica mogao postati jedan od novih oblika terapije autoimunog gastritisa. Ohrabreni ovim rezultatima ista skupina autora je napravila svoj idui rad gdje su odluili vidjeti utjecaj razliitih tipova Treg stanica na T efektorske stanice. Iz toga proizlazi i njihova hipoteza koja se moe jasno iitati iz naslova lanka; antigen-specifine Treg su snaniji supresori T efektorskih od poliklonalih Treg stanica. Svojim radom su uspjeli pokazati da antigen specifine iTreg stanice mogu snano suprimirati Th1 i Th17 efektorske stanice. Ponovno su bili ustvrdili kako nTreg utjeu na Th1, a ne na Th17 te da WT (wild type) iTreg nemaju nikakvog utjecaja niti na jedne od njih. Uz pomo PubMeda sam utvrdio da je ovo istraivanje originalno tako to sam pretraio bazu podataka s dvije kljune rijei iz lanka, Autoimmune Gastritis AND T helper cells, i dobio samo 30 rezultata. Kada sam ponovio pretraivanje s te dvije rijei i Regulatory T cells dobio sam samo 3 rezultata od kojih su dva bila ova upravo spomenuta od iste skupine autora.
1 Stummvoll GH, DiPaolo RJ, Huter EN, et al. Th1, Th2, and Th17 effector T cell-induced autoimmune gastritis differs in pathological pattern and in susceptibility to suppression by regulatory T cells. J Immunol. Aug 1 2008;181(3):1908-16.

Materijali i metode

Na poetku lanka su sustavno izloili sve to su koritili za izvrenje ovog istraivanja. BALB/c Thy1.1+ i BALB/c nu/nu su nabavili od National Cancer Institute i to TxA23 TCR-

transgenine koje su se pokazale kao povoljni za obavljanje istraivanja na AIG.2 Sve mieve koje su kupili su uvali u sterilnim uvijetima u svojim postrojenjima gdje su se pridravali svi propisanih smjernica. Za antitijela koja su koristili kao biomarkere za razne T stanice su naveli vrste i dobavljae. Rezultate su mjerili uz pomo protone citometrije, a ureaj, FASCalibur (BD Biosciences), i koriteni software, FlowJo (TreeStar) su definirali. Postupak staninog proiavanja i diferencijacije T efektorsih i nTreg su teorijski objasnili te potkrijepili preciznim uputama i grafovima s jednim reprezentativnim uzorkom. Glavni cilj pokusa, a u konanici i samog istraivanja, je bilo vidjeti interakciju T efektorskih i Treg stanica. Njih su dobili uzimanjem intravenskom injekcijom 0.25 ml krvi miu gdje se nalazilo 50k TxA23 T efektorskih i 1x10^6 Treg stanica. Kako bi odredili toan stupanj AIG u svakom od BALB/c nu/nu mieva nakon 6 tjedana od prenoenja TxA24 efektorskih stanica iz BALB/c napravili su rutinsku nekropsiju eluca, obojali ga H&E te upalu mjerili na skali od 0 do 6 gdje su 5-6 oznaavali teak sluaj AIG.

2 McHugh RS, Shevach EM, Margulies DH, Natarajan K. A T cell receptor transgenic model of severe, spontaneous organ-specific autoimmunity. Eur J Immunol Jul 2001;31 (7):2094103.

Grupne rezultate su mjerili prema aritmetikoj sredini +/- SD, a za one gdje nije bilo raspodjele po Gaussu su koristili Mann-Whitneyev test. U svojim istraivanjima su imali jednu varijablu, stupanj inflamacije, gdje su traili razlike, a skupine su bile neovisne jedna o drugoj. Koristili su ordinalnu mjernu ljestvicu, od 0 do 6, a raspodjele su bile nenormalne jer su inae koristili Gaussovu krivljuju. Usporeujui sve ove parametre uz pomo tablice statistikih testova koje je Marui dao u svojoj knjizi mogu rei da statistiki test koji su koristili je valjan.3 Faktor sigurnosti im je bio manji od 0.05 stoga njihove opaene razlike moemo smatrati stvarnima, a ne sluajnima.

Ispitanici, kontrolne grupe i kvaliteta pokusa

Pokusi su se vrili na sojevima mieva koji su bili spomenuti pod materijalima i metodama te se njih moe smatrati jedinim ispitanicima u ovom istraivanju. U svim od ukupno 4 pokusa postojale su relativne i apsolutne kontrolne grupe. Apsolutne kontrolne grupe su u svakom od njih bile one koje su se sastojale od iskljuivo Th1 ili Th17 stanica, a relativne one s Th1/Th17 i nTreg/WT iTreg. Ispitane grupe su bile one koje su imali Th1 ili Th17 efektorske stanice i TxA23 iTreg stanice jer su antigen-specifine iTreg stanice i njihov utjecaj na razliite T efektorske stanice bile glavni cilj ovog rada. S obzirom da su ispitanici i kontrolne skupine bile valjano definirane; statistiki testovi, materijali i metode prikladno odabrane; kvaliteta pokusa je bila dobra. Kako bi pokuali dokazat svoju hipotezu koristili su 4 pokusa koja su bila dizajnirana tako da svaki od nadolazeih bi
3 Marui, Matko, ur. Uvod u znanstveni rad u medicini, 105, 4. izdanje. Zagreb: Medicinska naklada, 2008.

Primjerice, da bi pokazali kako TxA23 iTreg stanice nisu bilo toliko efikasnije protiv Th17 od nTreg zbog injenice da su bile prethodno aktivirane, u jednom od pokusa su aktivirale nTreg in vitro te ih onda stavili s Th17 efektorskim stanicama; nije bilo nikakve znaajne razlike izmeu njih i svjee izoliranih nTreg koje su sluile kao kontrolna skupina.

Diskusija, njihovi i moji zakljuci

U svojem istraivanju autori su koristili pokuse te stoga ono spada u pokusna istraivanja, koje je uistinu i bilo naprikladnije za dokazivanje njihove hipoteze. Uz pomo pomno pripremljenih pokusa su usporeivali utjecaj razliitih skupina Treg na Th1 i Th17 efektorske stanice te ih njihovih rezultata izveli valjane zakljuke s kojima su potvrdili svoju hipotezu. Takoer su spomenuli jedan rad koji je pokazao da antigen-specifine iTreg nemaju nikakvog utjecaja na Th17 u jednoj drugoj autoimunoj bolesti to smatram hvalevrijednim primjerom njihove samokritinosti te dobrim poznavanjem granica znanstvene spoznaje njihova rada.4

Na kraju rada su napomenuli svoje donatore; Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases ; te istakli kako nije postajao nikakav sukob interesa izmeu autora i neke druge grupe.

4 Korn T, Reddy J, Gao W, Bettelli E, Awasthi A, Petersen TR, et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nat Med Apr 2007;13(4):42331.