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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIA

FIP-640: BACTRIAS FITOPATOGNICAS

ISOLAMENTO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS A PARTIR DE RGOS VEGETAIS INFECTADOS

Reginaldo da Silva Romeiro Professor Titular da UFV

A OPERAO DE ISOLAMENTO COMO MTODO CIENTFICO DE INDIVIDUALIZAO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS E SUAS IMPLICAES Na grande maioria das vezes, para que se possa identificar com segurana o agente etiolgico de uma enfermidade, faz-se necessrio dispor desse organismo sob forma de cultura pura em meio artificial de cultivo. Somente aps isso, estudos podero serem feitos sobre sua patogenicidade, anatomia, fisiologia, ecologia, etc., facilitando identificao e caracterizao (Kiraly et al., 1970). O isolamento de bactrias fitopatognicas demanda especiais cuidados da assepsia, pois o nmero de operaes envolvidas grande e bactrias saprfitas acham-se quase sempre presentes, associadas ao tecido enfermo, principalmente nas leses mais velhas (Fahy & Persley, 1983; Goto, 1990; Kiraly et al., 1970; Klement et al., 1990; Leben, 1981; Romeiro, 1988). Outro aspecto a considerar a importncia de se praticarem as operaes que envolvem o isolamento de modo a dominar com mestria todos os passos. Somente a execuo, por repetidas vezes, das operaes, levam familiaridade e perfeio.

COLETA E TRANSPORTE DO MATERIAL INFECTADO Em se desejando isolar um determinado patgeno bacteriano, buscaremos por ele em plantas infectadas, exibindo sintomas tpicos da enfermidade. Em situaes menos comuns, o isolamento pode ser a partir de solo ou mesmo de gua. O material deve ser coletado (rgo vegetal ou planta inteira) nos estgios iniciais da infeco. Leses velhas devem ser evitadas, pois nelas abundam fungos e bactrias no fitopatognicos que mascaram e comprometem o sucesso do isolamento. O transporte do material do campo para o laboratrio deve ser rpido e em recipientes de papel. O uso de sacos ou de recipientes plsticos proporciona um ambiente super-mido, altamente favorvel ao desenvolvimento de organismos saprfitas e por isso deve ser evitado (Chaves et al., 1973).

MEIO DE CULTURA RECOMENDADOS EM TENTATIVAS DE ISOLAMENTO Em princpio, a maioria dos meios de cultura rotineiramente empregados num laboratrio de Fitopatologia presta-se ao isolamento, desde que o pH esteja em torno de 7,0, contenham uma fonte orgnica de carbono, no contenham antibiticos e que em sua composio figurem ingredientes mnimos para suportar o crescimento de um procariota quemioeterotrfico (Fahy & Persley, 1983; Goto, 1990; Kiraly et al., 1970; Klement et al., 1990; Lelliott & Stead, 1987; Romeiro, 1995; Schaad, 1988; Scortichini, 1995; Sigee, 1993). Contudo, existem meios tradicionalmente utilizados para o cultivo de fitobactrias e que proporcionam melhores condies nutricionais e, consequentemente, crescimento mais rpido. Esses meios devem ter seu pH ajustado para 7,0 a 7,2 antes de autoclavagem e, caso se queira prevenir o crescimento de fungos saprfitas, pode-se adicionar, como inibidor de microrganismos eucariotas, o anti-fngico cicloheximida (Romeiro, 1976) a 50 ppm (concentrao final no meio). Deve-se preparar uma soluo estoque de cicloheximida, esteriliz-la por filtrao e mant-la em geladeira, ao abrigo da luz. Sua incorporao ao meio fundente
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deve ocorrer imediatamente antes do preparo das placas. Todos os meios devem ser autoclavados por 20 minutos a l5 lb de presso. No Laboratrio de Bacteriologia de Plantas do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Viosa, tem-se usado como de rotina para isolamentos o meio 523 (Kado & Heskett, 1970), cuja composio a que se segue: Sacarose Casena cida hidrolisada Extrato de levedura K2HPO4 (anidro) MgSO4.7H2O Agar gua destilada (q.s.p.) 10,0 g 8,0 g 4,O g 2,0 g 0,3 g 15,0 g 1000 ml

PREPARO DA CMARA DE REPICAGEM O sucesso de um isolamento est, em grande parte, na dependncia de se trabalhar num local adequadamente limpo, livre de poeira e correntes de ar. Muitos laboratrios dispem de cmaras de fluxo laminar que, quando com os filtros e pr-filtros esto em bom estado, oferecem excelentes condies de trabalho (Klement et al., 1990). No se dispondo dessas cmaras, deve-se reservar um pequeno cmodo do laboratrio exclusivamente para isolamentos, repicagens etc. Esse cmodo deve ser mantido rigorosamente limpo, sem lata de lixo em seu interior e, a intervalos de tempo, ser pulverizado com etanol 50% ou NaClO (2 a 5%). A superfcie de trabalho deve ser preferencialmente de frmica e limpa com lcool antes de qualquer atividade. Lmpadas de UV no teto ajudam em muito reduzir as contaminaes se ligadas por cerca de 30 minutos antes de se iniciar o trabalho. Contudo, vale lembrar que radiao UV mutagnica, bem como h o risco de cegueira se se olha diretamente para a fonte (Gerhardt, 1994).

PREPARO DAS PLACAS COM MEIO DE CULTURA PARA O ISOLAMENTO As placas devem ser individualmente embrulhadas em papel e esterilizadas em estufa (calor seco) por vrias horas a 100-200 oC. Estar o papel envolvente quebradio indica que o processo de esterilizao foi eficiente. Quando desembrulhadas, as placas devem ter, ainda fechadas, seus bordos passados pela chama de um bico de Bunsen ou de lamparina de lcool. O meio de cultura, aps fundido por fervura em banho-maria ou em forno de microondas, deve ter sua temperatura mantida em torno de 48-50 oC. Se mais frio, pode solidificar-se no momento de ser vertido. Se mais quente, pode ocasionar condensao de vapor dgua na tampa da placa, o que dificulta a visualizao da superfcie do meio. Um modo emprico de se verificar se a temperatura est ideal colocar o recipiente contendo o meio fundido em contato direto com a plpebra ocular - se o calor estiver suportvel, pode-se verter o meio. Abrir as placas apenas o suficiente para verter o meio, jamais remover totalmente a tampa e trabalhar rapidamente antes que o meio se solidifique so recomendaes importantes.
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MTODO PADRO DE ISOLAMENTO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS NO-FASTIDIOSAS A PARTIR DE RGOS VEGETAIS INFECTADOS De um rgo vegetal infectado, deve-se tentar o isolamento a partir dos bordos da leso, onde a chance menor de existirem microrganismos saprfitas e oportunistas e onde espera-se estar a fitobactria fisiologicamente mais ativa (Chaves et al., 1973; Romeiro, 1976). A metodologia padro de isolamento, uma operao essencialmente realizada com absoluta assepsia, pressupe que no interior do tecido existem somente as fitobactrias e que no exterior estariam tambm saprfitas, tanto fungos como bactrias. Casos de 2 ou mais fitobactrias infectando o mesmo tecido no so comuns, assim como no o so fitobactrias e saprfitas vivendo lado a lado, no mesmo nicho ecolgico, a no ser nos estgios finais da infeco quando o tecido entra em colapso e organismos secundrios no patognicos comeam a se desenvolver. Os principais passos relativos ao mtodo padro de isolamento acham-se ilustrados no esquema da Figura 1.

PREPARO DO MACERADO DE TECIDO ENFERMO a) Lavar e enxugar cuidadosamente o rgo vegetal de onde se tenciona realizar o isolamento. Se se tratar de caule, fruto ou outro rgo volumoso, mergulh-lo em lcool absoluto e flamb-lo. Repitir a operao por 1 ou 2 vezes. b) Com escalpelo ou lmina de barbear, remover parte do tecido afetado (preferencialmente dos bordos das leses mais recentes), de modo a obter pequenos fragmentos, no maiores que 0,5cm x 0,5 cm. c) Expor os fragmentos de tecido enfermo a lcool a 50% (20 - 30 segundos). d) Com pina flambada, transferir os fragmentos para soluo a 2% de NaClO por 1 a 5 minutos. O tempo de desinfeco varia de acordo com a consistncia e espessura do material. e) A lavagem com gua destilada esterilizada dos fragmentos por, pelo menos, trs vezes se faz necessria, para retirar o excesso de desinfectante. f) Por meio de pipeta, depositar, no fundo de uma placa de Petri estril, uma gota grande de gua destilada esterilizada. Transferir, para essa gota, 3 a 4 fragmentos j esterilizados. g) Com tesoura, estilete ou escalpelo flambados, macerar os fragmentos de tecido dentro da gota, de modo a obter a suspenso. Deixar em repouso por 20 a 30 minutos para que haja a difuso das bactrias do interior do tecido enfermo para o seio da gota.

SEMEIO DO MACERADO NA SUPERFCIE DO MEIO DE CULTURA Findo o preparo do macerado do tecido enfermo, pressupe-se conter ele uma populao varivel mas detectvel de clulas viveis do patgeno bacteriano. H mister agora de se realizar o semeio deste macerado na superfcie de um meio slido de cultura, em placas de Petri. Este semeio feito por diferentes tcnicas mas todas elas implicam um concomitante processo de diluio para que se atinja um nvel de diluio tal que possam ser conseguidas, na
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placa de isolamento, colnias distintas e individualizadas (Figura 2). Isso importante pois a inspeco visual de colnias individualizadas permite um estudo mais esclarecedor de suas caractersticas (forma, tamanho, cor, brilho, elevao, bordos, opacidade, etc.) e comparao com o tipo de colnia esperado ou descrito em literatura. Alm disso, colnias individualizadas so interpretadas como sendo originrias de uma nica clula bacteriana e, portanto, isolamentos delas obtidos so esperadamente mais homogneos no que tange a caractersticas genotpicas e fenotpicas da populao.

SEMEIO PELO MTODO DE ESTRIAS OU RISCAS Esse um mtodo de semeio em que usa-se uma ala de repicagem comum. A diluio est implcita pelo entrecruzamento das estrias, conforme se depreende da metodologia a seguir detalhada (Figura 3). a) Com ala de repicagem flambada, retirar uma gota da suspenso e depositar o excesso em uma pequena rea, prxima aos bordos da placa b) Sem flambar a ala, traar trs a 4 riscas paralelas espaadas de 0,5 cm, sendo a primeira distanciada do local onde foi feito o depsito de, aproximadamente, 1 cm. Essas riscas no devem ultrapassar o meio da placa. c) Flambar a ala. Depois de fria, fazer outras trs a quatro riscas paralelas, em ngulo reto com as primeiras, partindo da primeira risca da primeira srie. d) Observando os mesmos princpios, traar outras 3 - 4 riscas paralelas em ngulo reto com as da segunda srie. e) Repetir a operao, traando riscas paralelas em ngulo reto com as da terceira srie. f) Etiquetar as placas, invert-las e incub-las a 25-30oC. g) Cerca de 24 a 48 horas aps o semeio, repicar colnias bem isoladas para os tubos de cultura com o meio inclinado. Colnias que surgem com 24 horas ou menos so, geralmente, de bactrias saprfitas. h) Cuidados especiais devem ser tomados para no se ferir a superfcie do meio quando as riscas ou estrias so feitas.

SEMEIO PELO MTODO DE DILUIO EM PLACAS Nesse caso, o macerado serialmente diluido de forma asstica e cada diluio semeada separadamente, sendo necessrio o preparo de tantas placas quantas forem as diluies. O procedimento como se segue: a) Com uma pipeta estril, depositar uma gota de gua destilada esterilizada no centro de trs ou mais placas. Numer-las de 1 a 3, etc. b) Transferir, com ala de repicagem uma gota da suspenso para a gota de gua estril da placa no. 1. Misturar bem com a ala e transferir uma gota dessa nova suspenso para a gota da placa no 2. Repetir a operao para a placa no 3 e, assim sucessivamente, para outras placas, se se desejar maior diluio. c) Fundir o meio de cultura. Deix-lo esfriar at 48 - 50oC. Caso seja possvel, fazer uso de banho- maria. Verter o meio nas placas e, em seguida, com o fundo da placa tocando o

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tampo da superfcie de trabalho, fazer movimentos suaves, rotatrios, de modo que a suspenso de bactrias se distribua bem no meio e a ele se incorpore. d) Etiquetar e incubar conforme descrito anteriormente.

SEMEIO PELO USO DE ESPTULA DE DRIGALSKY a) Proceder diluio do macerado em soluo salina (NaCl a 0,85%) estril ou em PBS (soluo salina em tampo de fosfato 0,1 M, pH = 7,0) tambm estril. b) Para isso, preparar tubos com 2 ml do diluente e esteriliz-los em autoclave. Com pipeta estril, transferir 0,5 ml da suspenso para o 1o. tubo e agitar. Retirar 0,5 ml desse tubo e transferir para o segundo. Proceder assim sucessivamente (diluio 1:5) at ter diluies de 5-12 ou maior. c) Com outra pipeta estril, comeando da maior diluio para as menores, retire 0,1 ml e depositar na superfcie do meio em placa de Petri (pelo menos 1 placa para cada diluio). d) Com esptula de Drigalsky (Figura 4) flambada em lcool vrias vezes e resfriada, espalhar a suspenso sobre a superfcie do meio, sem feri-la. e) Incubar conforme indicado, aps etiquetar ou identificar as placas. Procurar por colnias individualizadas em placas correspondentes s diluies maiores.

ISOLAMENTO DIRETO DE FITOBACTRIAS A PARTIR DE RGOS VEGETAIS VOLUMOSOS Tem sido postulado que incomum duas bactrias colonizarem o mesmo tecido vegetal de forma concomitante (Romeiro, 1995). Adicionalmente, sabe-se que certos procariotas, denominados endofticos (Hallmann et al., 1997; Misaghi & Donndelinger, 1990), podem estar associados a tecidos de caule infectados por uma dada fitobactria, embora o fenmeno no seja assim to usual bem como esses endofticos, quando presentes, o faam em baixas populaes e apresentem caractersticas de crescimento e aparncia bem diversas das de fitobactrias. Consequentemente, se o material vegetal enfermo colhido nos estgios iniciais de infeco, quando ainda no houve invaso secundria do tecido infectado por microrganismos saprfitas, quer procariotas quer eucariotas, lcito assumir-se que nos espaos celulares e, ou, feixes vasculares, h uma boa chance da bactria fitopatognica estar isoladamente presente ou, pelo menos, em populaes bem maiores qye eventuais saprfitas. Assim, tentativas de isolamento direto, por prospeco de tecidos mais internos do rgo, dispensando-se a fase de esterilizao superficial do fragmento de tecido infectado, podem culminar em sucesso, com grande economia de tempo e material ((Chaves et al., 1973)). Esse tipo de isolamento direto aplicvel para rgos vegetais volumosos como pores relativamente espessas de caules, tubrculos, rizomas, bulbos, frutos e, eventualmente, sementes no muito pequenas. Pelas caractersticas peculiares da metodologia a ser executada, toda nfase deve ser dada esterilizao superficial do rgo e, ou, fragmento de rgo, antes de ter incio a operao de isoamento.

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PROCEDIMENTO a) O rgo vegetal deve ser exaustivamente lavado com gua e detergente, devidamente enxaguado e, em seguida, secado com papel toalha ou similar. A seguir, deve ser mergulhado em lcool absoluto e flambado duas a trs vezes. b) Com escalpelo flambado, faz-se uma inciso no profunda no rgo. Essa inciso ser como uma cunha ou linha de fraqueza a ser usada para cindir o rgo no plano desejado. Feita a inciso, parte-se o rgo, expondo seu exterior. c) De um local longe da periferia e tambm do local onde a inciso foi feita, que no foi tocado e que apresente sintomas ou alteraes de cor, rigidez e, ou, consistncia, retiram-se com escalpelo flambado e resfriado, pequenos fragmentos de tecido putativamente infectado que so assepticamente macerados em uma gota de gua estril. d) Observa-se, que nesse caso, as operaes de desinfeco superficial e lavagem em gua estril dos fragmentos so dispensadas. e) Patgenos que tipicamente colonizam o sistema vascular de caules, como R. solanacearum em tomate ou batata, so isolados com sucesso por esse mtodo.

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Etanol 50%

NaClO (2%)

30 seg.

3 min.

H2O Estril

H2O Estril

H2O Estril

MACERADO

ESTRIAS

Figura 1: Esquema de procedimento padro para isolamento de fitobactrias a partir de rgos vegetais infectados

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Figura 2: Placa de isolamento de X. campestris pv. campestris a partir de folha de couve, mostrando colnias individualizadas

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Figura 3: Esquema do mtodo de estrias ou riscas para semeio em placa da suspenso bacteriana

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Figura 4: Esptula de Drigalsky, instrumento de largo emprego em laboratrios de bacteriologia

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