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Captulo III

Cromatografia - Teoria Geral


Principles of Instrumental Analysis Skoog, West, Holler, Nieman
Thomson Learning; ISBN: 0030020786

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Mtodos de Separao

Teoria Geral de Cromatografia


Mikhail Semenovich Tswett foi um botnico russo que usou pela primeira vez (1906) o termo cromatografia. Tswett russo. Tswett separou pigmentos de plantas. significa cor em

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Desde 1906 a 1941 pouco utilizao se deu tcnica. Em 1941 Martin e Synge pretenderam separar amino-cidos da l por extraco em contra-corrente (o que no conseguiram). Desenvolveram a Cromatografia de Partio. Em 1952, A.J.P. Martin e R.L.M.Synge receberam o Prmio Nobel devido ao trabalho desenvolvido em Cromatografia de partio lquido-lquido. Em 1952 comeou a Cromatografia em Fase Gasosa. Em 1938 comeou a Cromatografia em Camada Fina (TLC).

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Cromatografia um mtodo fsico de separao, no qual os componentes a serem separados se encontram distribudos entre duas fases, sendo uma delas uma fase estacionria de grande superfcie, e a outra um fludo que circula atravs ou por da primeira. Todas as cromatografias so baseadas num tempo de reteno ou num tempo de permanncia diferente para os vrios solutos.
mvel estacionria

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Os vrios nomes dados s diferentes tcnicas cromatogrficas, so inconsistentes: papel e gel absoro e partio gasosa em coluna fase reversa ascendente devido ao suporte cromatografico. devido ao tipo de processo fsico. devido ao estado da fase mvel. devido ao meio fsico em que se processa. porque ao contrrio do normal (?) devido ao caminho dos solventes.

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Classificao dos Mtodos Cromatogrficos


Os mtodos cromatogrficos podem ser de dois tipos: - cromatografia em coluna a fase estacionria encontrase dentro de uma coluna e a fase mvel passa atravs da coluna ou sob presso ou pela fora da gravidade. Quanto natureza da fase mvel, podemos dividir a cromatografia em coluna em:
- cromatografia lquida - cromatografia gasosa - cromatografia de fludos super-crticos

Tanto a cromatografia lquida como a gasosa ainda podem ser classificadas quanto natureza da fase estacionria e quanto ao tipo de equilbrio entre as duas fases - cromatografia planar cromatografia em papel ou em camada fina.
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Classificao dos Mtodos Cromatogrficos em Coluna


Classificao Geral
cromat. lquida

fase estacionria
lq.adsorvido num slido slido resina permuta inica

Equilbrio
partio adsoro permuta inica partio adsoro

cromat. fase gasosa

lq.adsorvido num slido slido

cromat. fludo supercrtico

esp. orgnicas ligadas a uma superfcie slida

partio

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Processo Cromatogrfico
enchimento da coluna
amostra

Exemplo: processo em coluna

f. mvel

Cromatograma Representao grfica das concentraes dos solutos funo do tempo

t0

t1

t2

t3
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Descrio de um Processo Cromatogrfico


a coluna empacotada com a fase estacionria. a amostra dissolvida na fase mvel carregada na coluna. a fase movl passada continuamente pela coluna arrastando a amostra. os componentes da amostra so separados e eludos. quanto mais solvel um componente na fase mvel, mais depressa eludo. um componente completamente insolvel na fase mvel ficar no topo da coluna.

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Eluio processo de remoo de todos os componentes da coluna. Eluente solvente usado (fase mvel) para remover componentes da amostra, da coluna (fase estacionria). os

Eludos conjunto dos componentes separados e a respectiva fase mvel. Efeito da velocidade de migrao e alargamento das bandas t2

t3

o alargamento das bandas inevitvel

distncia
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Apesar de o alargamento das bandas ser inevitvel, possvel encontrar condies experimentais que resultam numa melhor resoluo do cromatograma. A eficincia de uma coluna cromatogrfica em separar dois componentes depende em parte da velocidade relativa com que as duas espcies so eludas. Estas velocidades dependem do equilbrio de distribuio das vrias espcies entre a fase mvel e a fase estacionria.

fase mvel fase estacionria

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Cest KD = Cmvel

Coeficiente de Partio

Cest concentrao na fase estacionria Cmvel concentrao na fase mvel Quanto maior o valor de KD mais tempo o soluto permanece na fase estacionria. A fraco de tempo total que uma molcula passa na fase mvel est directamente relacionada com a fraco da populao total presente na fase mvel:

fraco de tempo na f. mvel =

n molculas f. mvel n total de molculas

tM =

CM VM CM VM + CEVE
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tM

CM VM CM VM 1 1 = = = CM VM CEVE VE 1 + K ' 1+ KD + CM VM CM VM VM
KD Factor de Capacidade

VE K = KD VM
'
'

CEVE n moles f. estacionria K = CM VM n moles f. mvel


d-nos uma medida do comportamento do soluto num determinado processo cromatogrfico.

K'

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O soluto entra no processo cromatogrfico e move-se da fase mvel para a fase estacionria. A velocidade de eluio, pode ser relacionada com a velocidade linear da fase mvel.

u - velocidade linear da fase mvel


velocidade de eluio = u . tM A velocidade de eluio depende de: velocidade da fase mvel,

1 vel = u 1+ K '

razo dos volumes da fase estacionria e da fase mvel coeficiente de distribuio, KD


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Para um dado processo cromatogrfico, a velocidade da fase mvel e a razo VE/VM so constantes. A razo porque os solutos so eludos com velocidades diferentes devido ao facto de terem diferentes valores de KD. O tempo que leva um componente a atravessar uma coluna de comprimento L, o tempo de reteno, tR:

comprimento L tR = t R = (1 + K ' ) velocidade u

Tempo de Reteno

t R = tM (1 + K ' )
tM tempo da fase mvel, tempo requerido para a fase mvel atravessar a coluna.
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Por convenincia, usa-se muitas vezes o parmetro de volume de reteno, pois uma grandeza que indica a quantidade de volume da fase mvel que necessria para eluir o soluto. Sabendo que: volume = tempo x caudal

VR = t R F

temos:

VE VR = VM (1 + K ) = VM + K D VM VM
'

VR = VM + K DVE

Volume de Reteno

VM volume morto (vazio) da coluna. o espao da coluna no ocupado pela fase estacionria. VE volume da fase estacionria
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O tempo de reteno depende do tipo de coluna e condies experimentais (temperatura, caudal, etc). Este efeito de variveis operacionais pode ser eliminado se os valores forem referidos a uma substncia padro. A substncia padro tem que ser medida nas mesmas condies experimentais. Antes de se calcular a razo de dois tempos de reteno necessrio subtrair o tempo requerido para eluir um componente no retardado. Todos os componentes tm que atravessar o comprimento L da coluna, pelo que passam uma mesma fraco de tempo na fase mvel. Sendo assim, o que interessa ter em conta o tempo que passam na fase estacionria.
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t R tM
* tR

tM

VR VM
* VR

VM

KD
* KD

reteno relativa ou factor de selectividade

* substncia padro Outro parmetro utilizado nas tcnicas cromatogrficas razo de reteno, Rf:
Rf = 1 soluto no retido Rf = 0 soluto no solvel na f. mvel

tM Rf = tM + tE

Razo de Reteno

Este parmetro pode ser escrito de modos diferentes:

d soluto VM tM v Rf = = = = vM t d solvente V
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d - distncia

RF

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Forma do Cromatograma
Ideal
resposta resposta

No ideal

tempo

tempo

Um processo tanto mais eficiente quanto mais perto estiver do cromatograma ideal.

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Mtodos para descrever a eficincia de uma Coluna


Existem dois termos que usados como uma medida quantitativa da eficincia de uma cromatografia em coluna: altura dos pratos tericos, H nmero de pratos tericos, N

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Teoria dos Pratos Tericos


Esta teoria tem grande analogia com o processo de destilao e mtodo de extraco descontnua em contra-corrente.

que necessrio para se atingir o equlbrio entre duas fases. O processo cromatogrfico um exemplo do mtodo de Craig. Os pratos tericos correspondero s unidades (ampolas) de transferncia. Cada caixa um prato terico. Ver exemplo da figura seguinte.

Prato Terico - comprimento de coluna

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Espcie A (DA=1.0) dissolve-se igualmente na fase est. Espcie B (DB=0.25) dissolve-se 75% na fase mvel
6 5 4 3 2 1 1 1 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3

Modelo para a Separao Cromatogrfica

e na fase mvel

6 5 4 1

1/2A 1/4B

1/2A 3/4B

1 2

1/4A 1/16B 1/4A 3/16B

1/4A 2 3/16B 1/4A 1 9/16B

1/8A 1/8A 1/64B 3/64B 1/4A 1/4A 3/32B 9/32B

1A 1B

2 3 4 5 6 3 4 5 6

1/8A 1/8A 1 9/64B 27/64B

2 3 4 5 6

4 5 6

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Grfico da distribuio de A e B ao longo da coluna aps 5 adies de solvente B ao ser mais solvel na fase mvel, sai 1 da coluna e espalha-se menos originando uma banda mais estreita.

Ateno: os eixos dos xx esto em distncia; no em tempo!!


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Quanto maior o nmero de pratos tericos , mais eficiente o processo cromatogrfico. O nmero de pratos tericos, NT, pode ser obtido atravs do cromatograma, utilizando as expresses:

tR N T = 16 w

nmero de pratos tericos

tR NT = 5.54 w1 2

w largura da banda tR tempo de reteno w1/2 largura a meia altura

ATENO s unidades de tR e w
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O nmero de pratos tericos no depende s do comprimento da coluna, mas tambm de quase todos as variveis existentes na cromatografia (Ex: solvente, fase estacionria, temperatura, caudal) Para um dado tR, quanto maior o nmero de pratos tericos calculado menor a largura do pico (mais perto do ideal). Como se aumenta o nmero de pratos tericos? - Aumentando o comprimento da coluna. NT directamente proporcional a L. Se se duplicar o comprimento L, duplica-se NT e tR. No entanto, todos os picos ficaro mais afastados uns dos outros, mas tambm mais largos por um factor de 2. - Dimuindo a altura de cada prato terico, ou seja aumentando o nmero de pratos tericos por unidade de comprimento.

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L L w H = = N T 16 t R

H - altura equivalente do prato terico

H (abreviatura de HETP) Height Equivalent to a Theoretical Plate Como variar o valor de H? Quanto menor a altura do prato terico, mais estreita a banda obtida no cromatograma. Van Deemter demonstrou que o alargamento de uma banda devido soma de vrios efeitos inter-dependentes : A - empacotamento da coluna ou estrutura da fase estacionria. B difuso do soluto (gradiente de concentrao) das altas para as baixas concentraes. C equilbrio entre fase mvel e fase estacionria.
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A difuso de Eddy

B difuso longitudinal

fase mvel fase est.

C transferncia de massa

http://edusolns.com/hplc/hplctutorial/
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A difuso de Eddy

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H=

contribuio contribuio de percursos + de difuso ao longo da no ideais coluna Difuso de Eddy Difuso longitudinal

contribuio situao de no equilbrio


transferncia de massa

H = A + B/u + Cu
u velocidade da fase mvel (caudal)

Equao de Van Deemter

A, B e C so constantes para uma dada coluna e uma dada fase estacionria. Os fenmenos que provocam alargamento nas bandas, uns so proporcionais ao caudal, outros inversamente proporcionais ao caudal e outros independentes do caudal, como se pode ver na Figura seguinte:
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Representao grfica da Equao de Van Deemter


H
H = A + B/u + Cu Cu

A B/u

caudal

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Em colunas empacotadas no laboratrio, os trs termos da equao de Van Deemter contribuem para o alargamento das bandas. Para colunas de HPLC, o termo A=0. Como a difuso longitudinal em gases muito mais rpida do que em lquidos, o parmetro B, tem valores mais elevados em cromatografia de fase gasosa do em cromatografia lquida, razo pela qual o caudal ptimo em cromatografia de fase gasosa mais elevado do que em cromatografia lquida. A transferncia de massa diminui com o aumento de temperatura, devido ao aumento do coeficiente de difuso do soluto na fase estacionria. O aumento de temperatura permite aumentar o caudal sem diminuio da resoluo.
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Como calcular o valor dos parmetros A, B e C da equao de Van Deemter? Obter 3 cromatogramas a 3 diferentes velocidades da fase mvel. Calcular para cada velocidade, o valor de H:

H=

Lw 16 t R

e resolver o sistema de 3 equaes a 3 incgnitas (A, B e C). Como calcular a velocidade ptima da fase mvel? A velocidade ptima corresponde ao valor mnimo de H (dH/du)=0.

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Resoluo

A resoluo de uma coluna, fornece uma medida quantitativa da capacidade dessa coluna separar 2 solutos.

R=0.75

R=

2 ( t R ) B ( t R ) A wA + wB

R=1.0

2 (VB VA ) R= wA + wB

R=1.5

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Relao entre Resoluo e caractersticas de um Soluto


Dois solutos A e B com tempos de reteno de tal modo que: wA wB w 2 4t R tR w= sabendo que: NT = 16 NT w2 resoluo: R

( tR )B ( tR ) A
w

( t R ) B ( t R ) A NT R= 4 ( tR )B

relembrando que: tR = tM(1+K) = tM + tMK

R=

' ' tM + tM K B tM + tM K A ' tM + tM K B

NT 4
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R=

' ' tM K B K A ' tM 1 + K B

NT 4

R=

' ' KB K A ' 1+ KB

NT 4
' KB

reteno relativa

' KB ' KA

R=

' KB

1+ KB

NT '
4

' ' KB KB NT R= '

1+ KB

1 ' KB NT R= ' 4 1+ KB

dividindo ambos os termos por KB:


' 1 KB NT R = ' 1+ KB 4
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Por vezes torna-se til, saber qual o nmero de pratos tericos necessrios para
2

se

obter

uma

determinada

resoluo:

NT = 16 R 2 1

' 2 1+ KB ' KB

Uma vez obtido um nmero de NT para uma dada resoluo, se se considerar que H (alturado prato) constante, necessrio modificar o comprimento L da coluna: H = L/NT Esta a nica forma de se obter tal valor. As grandezas e K mantm-se constantes apesar de mudanas nos valores de L e NT. Quando os dois solutos A e B so muito difceis de separar (KA KB) as equaes tomam a forma:
' ' ' KB K A KB K ' = ' 1 KA
2 ' 2

K ' NT R = ( 1) 1+ K ' 4
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1 1+ K NT = 16 R 2 ' 1 K

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Relao entre Resoluo e o Tempo de Reteno


tR = vB = comprimento L = velocidade v

( tR )B
NT H

1 vB = u ' 1+ KB

L = NT H

u velocidade da fase mvel

( tR )B =
vem:

' 1+ KB

substituindo em: NT = 16 R 2 1
2 2 3

' 2 1+ KB ' KB

' 16 R H (1 + K B ) tR = ' 2 u 1 ( KB )

Esta expresso permite saber o tempo necessrio para separar (eluir) um componente, com uma dada resoluo.
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Optimizao de uma Coluna


NT 1 R= ' 1+ KB 4
' KB

16 R H (1 + K ) tR = u 1 ( K )
2 2

' 3 B ' 2 B

As equaes so constitudas por 3 partes: 1 - O termo um parmetro de selectividade que depende unicamente das propriedades de dois solutos. 2 - Termo que contm K que depende das propriedades do soluto da coluna. 3 - NT relacionada com os efeitos cinticos que influenciam a largura das bandas.

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Para optimizar as condies de uma coluna, no esquecer que os parmetros fundamentais (, Ke H ou NT) podem ser mexidos de uma forma independente.

e K podem ser mexidos, mudando a temperatura, ou a


composio da fase mvel. NT pode ser mudado directamente, mudando L e H pode ser mudado alterando a velocidade (caudal), o tamanho das partculas de resina, etc.

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Exemplo: Dois solutos A e B tm tRA=16.4 min. e tRB=17.63 min (wA=1.11min. e wB=1.21 min). A coluna mede 30 cm e o tempo da fase mvel de 1.3 min. Calcular: a) Resoluo b) NT mdio c) H d) L para R = 1.5 e) tRB necessrio para eluir o soluto B com novo L f) o valor de H para R=1.5 Resoluo:

2 (17.63 16.40 ) = 1.06 a) R = 1.11 + 1.21


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R=1.06
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b)

( NT ) A = 16
NT =

16.42 1.11
2

= 3493

( NT ) B = 16
NT = 3445

17.632 1.21
2

= 3397

3493 + 3397 = 3445 2

c) H =

L 30 = = 8.7 103 cm NT 3445

H = 8.7x10-3 cm

d)

K e no mudam com o aumento de NT e L

1+ K NT = 16 R 2 ' 1 KB
2 ' B

( NT )1 = 16 R12 (......)(......) constante

1- coluna original 2 nova coluna

( NT )2 = 16R22 (......)(......) constante


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( NT )1 R1 3445 1.06 = = ( NT ) 2 R2 ( NT ) 2 1.5


(NT)2 = 6.9x103 como L=NTH L= 6.9x103 x 8.7x10-3 = 60 cm L = 60 cm e) da expresso com tR e resoluo:

( tR )1 ( R1 )2 17.63 (1.06 )2 = = 2 ( tR )2 (1.5)2 ( tR )2 ( R2 )


(tR)2 = 35 min (o tempo de reteno passa a ser 2 vezes maior) f)
2 (1.06 ) 8.7 103 t RB R1 H1 = 2 = 2 t RB R2 H 2 H2 (1.5) 2
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H2 = 4.3x10-3 cm (a altura do prato terico diminui para metade).

Variao de H
Analisando a alnea f) do exemplo anterior verifica-se que possvel melhorar a resoluo, sem aumentar o valor de tR, dimuindo o valor de H. Diminuio do valor de H: reduzir a viscosidade da fase mvel (aumentando a temperatura). reduzir o tamanho das partculas. reduzir a velocidade de eluio.

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Variao de KB
O aumento do valor de KB, produz um aumento de resoluo (com aumento do tempo de eluio). ' 3
' KB

R=Q

' 1+ KB

O valor de K mexido na fase gasosa por aumento da temperatura. Em fase lquida, mudando a composio da fase mvel.

(1 + K B ) t RB = Q ' 2 ( KB )
'

- valores de K>7 so de evitar. A resoluo pouco aumenta e o tR aumenta pronunciadamente. - tR mnimo obtido para K = 2. - habitualmente trabalha-se com valores de K entre 1 e 5.

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Variao de
Quando se aproxima da unidade, optimizar K e aumentar NT pode no ser suficiente para uma boa separao. Assim necessrio mexer em mantendo K entre 1 e 10. 1) Mudar a fase mvel (composio) 2) Mudar o pH da fase mvel 3) Mudar a temperatura 4) Mudar a fase estacionria ? 5) Adicionar espcies qumicas fase estacionria melhor a soluo 1. pior a 5.

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