Kinetika enzim

Mengukur Kadar Enzim

Enzim sebagai katalisator juga mempunyai sifat-sifat seperti katalisator pada umumnya, seperti ikut bereaksi, tetapi padaakhir reaksi didapatkan kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh kita tidak membutuhkan enzim dalam jumlah yang besar. Jumlah/kadar enzim yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis pengukuran kadar enzim sangat penting dilakukan. Disamping untuk mengetahui kadar suatu enzim pada seorang penderita, Enzim plasma nonfungsinal dapat dijadikan sebagai petanda adanya kerusakan organ tertentu. Pengukuran kadar enzim dapat dilkaukan denga dua cara, yaitu: (1) dibandingkan dengan enzim murni; (2) Mengukur kecepatan reaksi yang dikatalisisnya. Cara ke-1 dilakukan dengan membandingkan enzim yang ingin diukur kadarnya dengan enzim murni yang sudah diketahui kadarnya. Kadar enzim dinyatakan dengan satuan g. Sebagai contoh misalnya enzim murni dengan kadar 2 ug dapat mengkatalisis substrat dengan jumlah tertentu selama 10 detik. Jika memakai enzim yang ingin diukur kadarnya membutuhkan waktu 20 detik, maka kadar enzim yang bersangkutan adalah 1 ug. Pengukuran dengan cara diatas, jelas membutuhkan tersedianya enzim murni. Kenyataannya banyak enzim yang belum tersedia bentuk murninya. Untuk mengatasi hal ini digunakanlah cara ke-2. Satuan enzim dinyatakan dalam unit. Kadar enzim diukur berdasarkan jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu. Satu unit internasional disepakati sebagai jumlah enzim yang perlukan untuk mengkatalisis pembentukan 1 mol produk per menit pada kondisi tertentu. Pengukuran aktifitas enzim dapat pula dilakukan menggunakan alat spektrofotometer. Sebagai contoh misalnya aktifitas enzim dehidrogenase yang bergantung NAD(P)+ diperiksa secara spektofotometris dengan mengukur perubahan absorbsi nya pada 340 nm yang menyertai oksidasi atau reduksi NAD(P)+/NAD(P)H. Oksidasi NADH menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas optik (OD, optical density) pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH yang dioksidasi. Demikian pula, kalau NAD+ direduksi,

OD pada 340 nm akan meningkat sebanding dengan jumlah NADH yang terbentuk. Perubahan OD pada 340 nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim dehidrogenase yang bergantung NAD+ atau NADP+. Bagi enzim dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi NADH oleh substratnya yang teroksidasi, kecepatan penurunan OD pada 340 nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran kecepatan penurunan OD pada 340 nm memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim.

Kecepatan Reaksi Enzimatik Kecepatan reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang diubah atau produk yang dihasilkan persatuan waktu, seperti yang diperlihatkan pada kurva perjalanan reaksi enzimatik (progess curve). Grafik berbelok karena: (1) kadar substrat berkurang; (2) terdapat product inhibition. Kecepatan reaksi enzimatik pada suatu waktu yang sangat pendek, atau pada satu titik tertentu pada grafik diatas disebut kecepatan sesaat (instantaneus velocity). Kecepatan sesaat merupakan tangens dari garis singgung terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan sesaat pada waktu mendekati nol, yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan awal (Vo). Pada reaksi enzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah kecepatan awal. Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui kondisi/ keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap waktu.

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Kecepatan Reaksi Enzimatik Kecepatan reaksi enzim dipengaruhi oleh banyak faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi tersebut diantaranya adalah: (1) suhu; (2) pH; (3) kadar enzim; (4) kadar substrat; (5) aktivator; (6) inhibitor.

KINETIKA ENZIM Enzim sebagai katalisator juga mempunyai sifat-sifat seperti katalisator pada umumnya, seperti ikut bereaksi, tetapi pada akhir reaksi didapatkan kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh kita tidak membutuhkan enzim dalam jumlah yang besar. Jumlah/kadar enzim

yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis pengukuran kadar enzim sangat penting dilakukan. Disamping untuk mengetahui kadar suatu enzim pada seorang penderita, Enzim plasma nonfungsinal dapat dijadikan sebagai petanda adanya kerusakan organ tertentu. Fungsi khusus enzim adalah: 1.merendahkan energy aktivasi 2.mempercepat reaksi 3. mengendalikan reaksi 1.Merendahkan energy aktivasi Untuk merubah zat A menjadi zat B di butuhkan energy yang cukup untukmencapai keadaan aktif atau dalam keadaan transisi,yang kemudian bisa berubah menjadi zat B.energi tersebut dinamakan energy aktivasi. 2.Kecepatan reaksi Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Kecepatan Reaksi Enzimatik Kecepatan reaksi enzim dipengaruhi oleh banyak faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi tersebut diantaranya adalah: (1) suhu; (2) pH; (3) kadar enzim dan kadar substrat Nilai Km beberapa enzim Enzim katalase Heksokinase(otak) Subtrat H2O2 ATP D-glukosa D-fruktosa Anhidrase karbonat khimotripsin HCO3Glisiltirosinilglisin N-benzoiltirosinamida -galaktosidase D-laktosa Km 25 0.4 0.05 1.5 9 108 2,5 4.0

Dehidrase trionin

L-treonin

5.0

Persaman michaelis- menten Vo = Vmaks[S] [S] + Km Dapat ditrasformasi secara aljabar menjadi bentuk lain yang lebih bermanfaat di dalam pemetaan data percobaan. Suatu trasformasi yang umum dilakukan diturunkan secara sederhana dengan membuat kebalikan dari kedua sisi persamaan Michaelis-Menten, sehingga memberikan : 1 = Km + [s] Vo Vmaks[s] Dengan memisahkan komponen pembilang pada sisi kanan persamaan, diperoleh : 1 = k . + [S] . Vo Vmaks[S] Vmaks [S] Yang dapat disederhanakan menjadi: 1=k.1.+1. Vo Vmaks [S] Vmaks Persamaan (b) adalah trasformasi persamaan MIchaelis-Menten yang disebut persamaan lineweaver-Burk. Bagi enzim-enzim yang mengikuti hubungan Michaelis- Menten secara benar pemetaan 1/Vo terhadap 1/ [S]-nya menghasilkan garis lurus ( gambar 1 ). Garis ini akan memiliki sudut Km/ Vmaks, perpotongan garis terhadap simbu y sebesar 1/ Vmaks( pada sumbu 1/ Vo) dan perpotongan -1/ Km pada sumbu 1/ [s] Lineweaver-Burk memiliki banyak manfaat, karena menghasilkan penentuan Vmaks secata lebih tepat yang hanya dapat diduga pada pemetaan Vo terhadap [S], seperti dilihat pada gambar 2 Trasformasi lain dari persamaan Micheles- Menten telah diturunkan dan di pergunakan. Masing-masing memiliki manfaat khusus dalam menganalisa data kinetika enzim pemetaan

kebalikan ganda dari data kecepatan reaksi enzim amat bermanfaat dalam mengalakisa penghambatan enzim.

INHIBISI REAKSI ENZIM Inhibitor adalah molekul yang mengikat enzim dan dapat menurunkan aktivitasnya . Tidak semua molekul yang mengikat adalah inhibitor enzim; enzim aktivator mengikat enzim dan meningkatkan aktivitas enzimatik . Pengikatan inhibitor dapat menghentikan sebuah substrat dari enzim memasuki situs aktif dan / atau menghalangi enzim dari reaksi katalisisnya. Hampir semua enzim dapat diracuni atau dihambat oleh senyawa kimiawi tertentu. Dari penelitian mengenai senyawa penghambat enzim, telah diperoleh informasi yang berguna mengenai spesifisitas substrat enzim, sifat-sifat alamiah gugus fungsional pada sisi aktif, dan mekanisme aktivitas katalitik. Senyawa penghambat enzim juga amat berguna dalam menjelaskan lintas metabolic di dalam sel. Lebih lanjut, beberapa obat yang bermanfaat di dalam dunia kedokteran nampaknya berfungsi karena senyawa ini dapat menghambat enzim-enzim tertentu yang mengganggu kerja sel. Jenis-jenis penghambat enzim : 1. Hambatan yang bekerja secara tidak dapat balik (irreversible inhibitor) yaitu golongan yang bereaksi dengan, atau merusakkan suatu gugus fungsional pada molekul enzim yang penting bagi aktivitas katalitiknya. Suatu contoh dari penghambat tak dapat balik adalah senyawa diisoprofilfluorofosfat (DFP), yang menghambat enzim asetilkolinesterase, yang penting di dalam transmisi impuls syaraf. Apabila penggabungan tidak bersifat reversibel maka pendekatan Michaelis-Menten tidak dapat dilakukan. Hambatan tidak reversible ini dapat terjadi karena inhibitor bereaksi tidak reversibel dengan bagian tertentu pada enzim, sehingga mengakibatkan berubahnya bentuk enzim. Dengan demikian mengurangi aktivitas katalitik enzim tersebut. Sebagai

contoh inhibitor dalam hal ini ialah molekul iodoase-tamida yang dapat bereaksi dengan gugus SH suatu enzim tertentu. Enzim-SH + ICH2CONH2 enzim-S-CH2CONH2 + HI Reaksi ini berlangsung tidak reversible sehingga menghasilkan produk reaksi dengan sempurna. Inhibitor lain ialah diisopropil fosfofluoridat. Inhibitor ini termasuk senyawa fosfor organic yang bersifat racun, karena dapat berkaitan dengan asetilkolin esterase yang terdapat dan berfungsi pada system syaraf pusat. Dengan terbentuknya ester ini maka enzim tidak dapat berfungsi sebagaimana mestinya, sehingga dapat mengganggu kerja sel syaraf pusat. Ester yang terbentuk barsifat stabil dan tidak mudah terhidrolisis. Dengan demikian hambatan ini diakibatkan oleh

diisopropilfosfoflouridat ini merupakan hambatan tidak reversible.

2. Hambatan yang bekerja secara dapat balik (reversible inhibitor) a. Hambatan kompetitif (competitive inhibition) Suatu penghambat kompetitif berlomba dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Tetapi, sekali terikat tidak dapat diubah oleh enzim tersebut. Ciri penghambat kompetitif adalah penghambatan ini dapat dibalikkan atau diatasi hanya dengan meningkatkan konsentrasi substrat. Sebagai contoh, jika suatu enzim 50% dihambat pada konsentrasi tertentu dari substrat dan penghambat kompetitif, kita dapat mengurangi persen penghambat dengan meningkatkan konsentrasi substrat. Penghambat kompetitif biasanya menyerupai substrat normal pada struktur tiga dimensinya. Karena persamaan ini, penghambat kompetitif menipu enzim untuk berikatan dengannya. Sebenarnya, penghambatan kompetitif dapat dianalisa secara kuantitatif oleh teori Michaelis-Menten. Penghambat kompetitif (I) hanya berikatan secara dapat balik dengan enzim, membentuk suatu kompleks EI

E + I EI Akan tetapi, penghambat tidak dapat dikatalisa oleh enzim untuk menghasilkan produk yang baru. Pengaruh inhibitor bersaing ini tidak tergantung pada konsentrasi inhibitor semata, tetapi juga pada konsentrasi substrat. Pengaruh inhibitor dapat dihilangkan dengan cara menambah substrat dalam konsentrasi besar. Pada konsentrasi substrat yang sangat besar, peluang terbentuknya kompleks ES juga makin besar. Kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) dapat tercapai pada konsentrasi substrat yang besar. Jadi makin besar konsentrasi inhibitor, makin besar pula sudut kemiringan garis grafik tersebut dan bila [I ]= 0, artinya reaksi tanpa inhibitor, kemiringan garis dinyatakan dengan harga Km/Vmaks. Titik potong grafik dengan sumbu -X besarnya ialah: Untuk reaksi tanpa inhibitor atau [I] = 0, maka titik ,potong dengan sumbu -x besarnya ialah 1/Km. Apabila harga titik potong grafik dengan sumbu -x dapat ditentukan dari hasil eksperimen, sedangkan harga Km dan[I] telah diketahui, dapat dihitung harga K1. Untuk memperoleh grafik Lineweaver-Burk tersebut dapat dilakukan serangkaian eksperimen dengan [I] yang sama dengan harga [S] yang berbeda-beda. Untuk membandingkan suatu hasil eksperimen, dapat pula dilakukan serangkaian eksperimen lagi dengan harga [I] lain yang tetap dan harga [s] yang berbeda-beda. b. Hambatan Nonkompetitif (noncompetitive inhibition) Pada penghambatan nonkompetitif, penghambat berikatan pada sisi enzim selain sisi tempat substrat berikatan, mengubah konformasi molekul enzim, sehingga mengakibatkan inaktifasi dapat balik sisi katalitik. Penghambatan nonkompetitif berikatan secara dapat balik pada kedua molekul enzim bebas dan kompleks ES, membentuk kompleks EI dan ESI yang tidak aktif : E + I EI ES + I ESI (Lehninger. 1982 :251-255)

Hambatan tidak bersaing ini (non competitive inhibition) tidak dipengaruhi oleh besarnya konsentrasi substrat dan inhibitor yang melakukannya disebut inhibitor tidak bersaing. Dalam hal ini inhibitor dapat bergabung dengan enzim pada suatu bagian enzim diluar bagian aktif. Hambatan tidak bersaing ini dapat pula diketahui grafik yang menggambarkan hubungan antara V dengan [S], atau hubungan antara1/V dengan 1/[S]. Baik dari grafik Michaelis-Menten (Gambar 6-10) maupun grafik Lineweaver-Burk (Gambar 6-11) tampak bahwa pada harga [S] yang sangat besar pun harga Vmaks untuk reaksi dengan inhibitor atau dengan kata lain hambatan tidak bersaing pada suatu reaksi tidak dapat diatasi dengan jalan memperbesar konsentrasi substrat. Contoh inhibitor tidak bersaing yang banyak dikenal ialah ion-ion logam berat (Cu++, Hg++ dan Ag+) yang dapat berhubungan dengan gugus -SH yang terdapat pada sistein dalam enzim. c. Hambatan Unkompetitif Pada inhibisi unkompetitif, inhibitor tidak dapat berikatan dengan enzim bebas, namun hanya dapat dengan komples ES. Kompleks EIS yang terbentuk kemudian menjadi tidak aktif. Jenis inhibisi ini sangat jarang, namun dapat terjadi pada enzim-enzim multimerik. 3. Hambatan Alosetrik Model Michaelis-Menten dapat digunakan untuk menerangkan terjadinya hambatan bersaing maupun hambatan tidak bersaing. Namun ada beberapa enzim yang sifat kinetiknya tidak dapat diterangkan dengan model Michaelis-Menten. Sebagai contoh bila dibuat grafik kecepatan reaksi terhadap konsentrasi substrat, maka untuk beberapa enzim tersebut tidak terbentuk hiperbola seperti halnya dengan enzim-enzim yang telah dibahas sebelumnya, tetapi akan terjadi grafik yang berbentuk sigmoida .Kelompok enzim yang mempunyai sifat demikian ini disebut alosterik. Hambatan yang terjadi pada enzim alosterik dinamakan hambatan alosterik, sedangkan inhibitor yang menghambat dinamakan inhibitor alosterik. Bentuk molekul inhibitor alosterik ini berbeda dengan molekul substrat. Lagipula inhibitor alosterik berikatan dengan enzim pada tempat diluar bagian aktif enzim. Dengan demikian

hambatan ini tidak akan dapat diatasi dengan penambahan sejumlah besar substrat. Terbentuknya ikatan antara enzim dengan inhibitor mempengaruhi konformasi enzim, sehingga bagian aktif mengalami perubahan bentuk. Akibatnya ialah penggabungan substrat pada bagian aktif enzim terhambat. Treoin sebaai substrat tidak dapat bergabung dengan enzim karena bentuk bagian aktif enzim berubah setelah enzim berikatan dengan isoleusin sebagai inhibitor.