INTRODUCCIN A LA GENOMICA EN VID

Alejandro Riquelme y Manuel Pinto

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Grupo de Investigacin Enolgica (GIE). Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Agronmicas, Casilla www.gie.uchile.cl.

1004, Santiago, Chile, manpinto@uchile.cl,

GENERALIDADES Se define como Genmica a la disciplina que estudia el genoma de los seres vivos. Tiene como objetivo catalogar todos los genes que tiene un organismo, estudiar la organizacin y estructura de cada uno de ellos pero tambin descubrir la funcin, los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin y el modo en que unos genes interaccionan con otros. Desde un punto de vista conceptual, pero tambin metodolgico, los cambios que se estn produciendo en esta disciplina son muy importantes. Hasta ahora, con las tecnologas disponibles de Biologa Molecular se estudiaban la estructura y funcin de genes individuales. Las aproximaciones de la genmica en cambio permiten el estudio conjunto de los miles de genes, protenas y metabolitos que constituyen un organismo as como las complicadas redes de interacciones que entre ellos se establecen en el interior de las clulas durante su ciclo vital. Como consecuencia de lo anterior, la cantidad de informacin que se est generando es enorme y por tanto, ha sido necesario el desarrollo en paralelo de potentes herramientas bioinformticas que permitan almacenar y analizar de forma conveniente los datos obtenidos. Este caudal de conocimientos est permitiendo, cada vez ms, interpretar en trminos moleculares no slo la biologa del propio ser humano sino tambin la de aquellas especies animales y vegetales de inters para el hombre. A continuacin se presentar de una forma muy general algunos conceptos bsicos de genmica, de como se han articulado los estudios en eucariotas y como nuevas tecnologas estn emergiendo al amparo de esta actividad. 1. ADN Y GENES 1.1.- DEFINICIN DE GEN El concepto de gen ha ido variando a lo largo del tiempo. La idea original del gen proviene de los experimentos de Gregor Mendel, aunque l no los denomin genes, sino factores, y que vendran a ser los responsables de la transmisin de los caracteres de padres a hijos. Fue hacia 1950 es que se aportaron pruebas definitivas sobre la naturaleza molecular del gen. Por un lado se descubri que los genes estn constituidos por ADN (cido desoxirribonucleico). Por otro lado, se descubri que ese ADN contena la informacin

necesaria para la sntesis de una cadena determinada de protena. As pues, la definicin de gen pas a ser la cadena de ADN capaz de dirigir la sntesis de una protena. Posteriormente este concepto ha sido matizado. En primer lugar, se sabe que muchas protenas estn constituidas por ms de una cadena polipeptdica y que cada una de ellas est codificada por un gen diferente. Por ello la definicin pas a ser: la cadena de ADN capaz de dirigir la sntesis de un polipptido. Sin embargo, hoy se sabe que no es del todo correcta ya que determinados genes son capaces de codificar ms de un polipptido, y por otra parte, un mismo polipptido puede ser codificado por diferentes genes. Adems, existen algunos genes que no codifican protenas sino ARNs (cidos ribonucleicos). Por ltimo, dentro de lo que se entiende por gen no nicamente se incluyen las regiones que codifican para un polipptido sino tambin aquellas que determinan tanto en que tejidos, como en que momentos, o en que cantidades se ha de producir el mismo. A pesar de ello nos quedaremos con la siguiente definicin: Fragmento de ADN que contiene toda la informacin necesaria para la sntesis de un polipptido. 1.2.- ESTRUCTURA BSICA DEL ADN Como se ha comentado el ADN es la molcula que contiene la informacin gentica y la sustancia de la cual estn hechos los genes. Por eso, para comprender el funcionamiento de los genes se ha de conocer al menos su estructura bsica. El ADN es un polinucletido, es decir, est formado por la unin de nucletidos. Existen 4 nucletidos diferentes: Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) y Citosina (C). Cada nucletido, a su vez, est formado por una base nitrogenada, una pentosa (azcar) y un grupo ortofosfrico, a travs de este ltimo componente se realizan las uniones entre nucletidos. La unin del grupo fosfato tiene lugar en las posiciones 5 o 3 de la pentosa, lo cual hace que las cadenas estn orientadas (es decir posee direccin 5 3). El orden en que se sitan los nucletidos se denomina secuencia del ADN. El mtodo ms usado para la secuenciacin es el conocido como tcnica de terminacin de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conocindose actualmente como la tcnica del didesoxi. Esta sera la estructura bsica del ADN, sin embargo, la mayor parte de las veces el ADN se encuentra formando una estructura ms compleja que consiste en dos cadenas como la anterior que se enlazan una con otra de manera complementaria y siempre se mantiene la siguiente regla las bases A se une con T, y C con G. Estas dos cadenas, se enrollan una sobre otra, formando la famosa doble hlice (Figura 1). Medidas del tamao de los fragmentos de ADN: nmero de pares de bases. pares de bases = pb ; mil pares de bases = Kb

Cromosoma

Ncleo

Clula

Histonas

Pares de bases

ADN doble hebra

A se une a T G se une a C

Figura 1. Los cromosomas se encuentran en el ncleo y estn formados por hebras de ADN superenrrolladas que a su vez estn formadas por dos hebras unidas por las bases nitrogenadas. 1.3.- PARTES DE UN GEN Como se ha comentado antes los genes son segmentos de ADN capaces de dirigir la sntesis de protenas determinadas (Figura 2), y ello lo hacen a travs de un ARN intermediario. El siguiente diagrama muestra la forma en que la informacin gentica se transmite desde el ADN hasta la protena. ADN
Transcripcin

ARN (mensajero)

Traduccin

PROTENAS

Por lo tanto, estos segmentos de molculas de ADN que son los genes han de contener las seales o informacin necesaria para realizar estos procesos. Estos segmentos se pueden dividir en diferentes partes segn un criterio de funcionalidad. Bsicamente, un gen estara constituido por 3 partes: 1. Promotor: que establece cundo y en qu cantidad se transcribir el gen. 2. Regin codificante: el fragmento de ADN que determina la secuencia de aminocidos de la protena codificada. 3. Terminador: que contiene las seales que determinan el trmino del proceso de transcripcin, evitando que contine hacia otros genes que se encuentran ms adelante. Todas estas seales son "ledas" y decodificadas por interacciones establecidas con protenas especficas. Adems, algunos genes contienen intrones. Los intrones son secuencias dentro de un gen que son eliminadas en el procesamiento del mensajero mediante un proceso denominado de splicing y que, por tanto, no estn presentes en el mRNA maduro. El nmero, tamao y posicin de los intrones vara de un gen a otro (Figura 3).

Trascripcin

mRNA maduro membrana nuclear

Transporte al citoplasma para la sntesis de protena (traduccin)

membrana celular

Figura 2. Un gen es aquella zona del ADN que codifica para una protena o polipptido. En el proceso de transcripcin se forma el mARN a partir del ADN y luego este mARN sale del ncleo para entrar en el proceso de traduccin, obtenindose finalmente el polipptido.

Gen

Exon Intron Transcripcin Traduccin

contituye el mARN y se traduce a protena secuencia no traducida

Amino acidos

Cadena polipeptdica

Figura 3. El gen posee zonas que no son traducidas en protenas llamadas intrones y que deben ser sacados del mARN para obtener un mARN maduro.

2. LIBRERAS DE ADN o GENOTECAS 2.1.- CONCEPTO DE LIBRERA Una librera de DNA es una coleccin de clones de vectores que contienen fragmentos de DNA diseada de tal manera que, mediante un determinado sistema de seleccin, se pueden llegar a separar los clones de inters. As pues, una librera de ADN podra ser una coleccin de fagos que contienen una muestra representativa de fragmentos de un genoma (librera genmica) o una coleccin de bacterias que contienen plsmidos en los que se ha clonado una muestra significativa de los genes que se transcriben en un determinado tejido. Por tanto, para tener una librera deberemos tener: Un sistema eficiente de clonaje de ADN, puesto que deberemos manejar un nmero considerable de clones (Figura 4). Un sistema de seleccin de los clones que nos interesan de entre toda la coleccin. Un sistema para la obtencin de una muestra representativa del ADN a estudiar. Segn cual sea el propsito de nuestro estudio existen diversos tipos de libreras: Libreras genmicas: se elaboran a partir de ADN genmico de una especie que se digiere hasta un tamao suficientemente pequeo para ser clonado en el vector de una manera mas o menos al azar. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de cromosomas especficos: como las anteriores pero a partir de ADN de determinados cromosomas purificados. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de cDNA: se realizan a partir de mRNAs de un tejido particular. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de expresin: como el anterior pero el clonaje se realiza de tal manera que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la protena codificada por el fragmento de ADN. La seleccin se realiza detectando la protena en s mediante anticuerpos, o bien alguna manifestacin de su actividad.
Commentaire : (un DNA de pequeo tamao capaz de autoreplicarse conteniendo un DNA forneo y de perpetuarse en clulas husped)

pool de filas pool de columnas pool de placas

Figura 4. Representacin esquemtica de una configuracin y concentracin de una librera de cDNA. (A) Los clones fueron primero propagados en placas individuales sobre medio slido en discos de cultivo de 24 posillos. Seguido de lisis, las suspensiones de los fagos fueron preparadas de cada posillo por elusin con buffer SM y transferidos a placas con 96 microposillos. (B) Las placas de 96 microposillos fueron arregladas en ocho bloques de seis placas cada uno

3.- PROYECTOS GENOMA La secuenciacin de un genoma completo obviamente permite descubrir la secuencia de todos los genes. Sin embargo, el trabajo no es tan sencillo. Por un lado, a partir de la secuencia total hay que identificar los genes, cosa que no siempre es obvia. En segundo lugar, una vez identificados los genes hay que conocer como se regulan y para que sirven. Por tanto, si bien la obtencin del genoma completo es de grandsima ayuda, no lo es todo. 3.2.- PROYECTOS DE SECUENCIACIN DE ESTs Un EST (Expressed Sequence Tag) no es ms que una secuencia parcial de un cDNA clonado. Por lo tanto, un proyecto de secuenciacin de ESTs consistir en la obtencin de un nmero elevado de secuencias parciales a partir de una coleccin de cDNAs clonados, o sea, a partir de una librera de cDNAs. Como a librera de cDNAs, los ESTs sern una representacin de los genes que se estn transcribiendo en un tejido, en un momento determinado en una especie concreta. Particularidades: - Normalmente se secuencian una sola vez, por lo que no son secuencias 100 % libres de errores. - Son redundantes, es decir, aquellos genes que ms se transcriben son los que ms secuencias presentan (existen mtodos para reducir la redundancia). Para que sirven? Saber que genes se transcriben en un determinado momento Saber si nuestro gen se transcribe en un tejido. Descubrir genes o confirmar posibles genes descubiertos en un proyecto genoma. Confirmar los lmites de un gen y sus intrones. Secuenciar genes (en especies donde no se tiene el genoma completo)

Particularidad: Hemos visto que las libreras de cDNA se realizan a partir de cDNA sintetizado usando poliT como iniciador de la transcriptasa reversa. Esto no siempre tiene que ser as. Por ejemplo, si nos interesa un gen en concreto podemos usar un iniciador especfico de ese gen. Tambin podemos usar iniciadores ( partidores) al azar, o ms o menos al azar. Esto quiere decir que no siempre los ESTs han de representar las secuencias de los extremos del ARN. Adems, la transcriptasa reversa puede no copiar completamente el mARN con lo que las secuencias 5 no siempre corresponden al extremo del mensajero. Esto, que en otras circunstancias puede ser malo, en el caso de los ESTs no necesariamente ya que nos permite tener secuencias parciales a lo largo de todo el gen, con lo que se pueden solapar y obtener una secuencia mucho ms completa del mismo.

3.3.- GENERACIN DE BANCOS DE ESTS. La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la biologa del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de cDNAs que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales o ESTs (Expressed Sequence Tags). Estas secuencias cortas (300-500 pb) suelen ser suficientes para la identificacin de los genes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL) utilizando para ello poderosos programas de anlisis informtico. Si la informacin contenida en la secuencia parcial no es suficiente habra que determinar la estructura de cDNAs completos para estudiar su funcin por otros mtodos. La realizacin de bancos de ETSs de diferentes tejidos en diferentes situaciones fisiolgicas conducira al descubrimiento sucesivo de nuevos genes hasta elaborar un catlogo de la mayora de los que se expresan en un ser vivo. 3.4.- SECUENCIACIN GENMICA La aproximacin anterior, sin embargo no permita identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiolgicas no consideradas. La nica forma de tener un catlogo completo de los genes de un individuo es secuenciar su genoma. Para ello el DNA genmico total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas para generar fragmentos de gran tamao (100-300 kb) que se clonan en vectores apropiados (p.ej BACs, cromosomas artificiales bacterianos) para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma distribuida en decenas de miles de volmenes diferentes que se pueden estudiar con detalle y secuenciar uno a uno. Un gran problema en el estudio de las secuencias genmicas es distinguir las zonas codificantes para genes (que en muchos organismos representa un porcentaje bastante pequeo del genoma), de las no codificantes. Ello se consigue mediante comparacin con las secuencias de ESTs y cDNAs previamente estudiadas. 3.5.- MICROCHIPS DE DNA La tcnica de microchips (o microarrays) de ADN es un mtodo que lo que pretende es identificar genes que se transcriben ms o menos en una determinada circunstancia respecto a otra. Por ejemplo, todos los genes de hoja de arroz que se inducen por calor. Por lo tanto, en sus objetivos no es diferente a, por ejemplo, un northern, un differential display o una librera de sustraccin. La diferencia radica en que en el caso de microchips el nmero de genes que se estudia en un solo experimento es muchsimo mayor (potencialmente, se pueden estudiar todos los genes). La tcnica de los microchips est basada en la existencia de bancos de ESTs. Si uno secuencia el nmero suficiente de cADNs en un nmero suficiente de tejidos podra, en teora, aislar ADN de cada uno de los genes de un organismo, ADNs que podran usarse como sondas. Si uno pudiera inmovilizar estas miles de sondas sobre un filtro podra marcar mARN mediante transcriptasa reversa y nucletidos marcados, e hbridar esas sondas, apareciendo cuales y cuanto se transcriben en ese tejido concreto.

Esta es la base del microchip solo que: - Las sondas no se fijan sobre una membrana sino sobre un vidrio ( placas plsticas) - Las cantidades de sonda utilizadas son mnimas para reducir el espacio - Los mARNs se marcan con fluorescencia - Se realizan dos hibridaciones simultneas con ARNs marcados con distinta fluorescencia, esto permite comparar la expresin de los genes en dos condiciones diferentes. Los microordenamientos (microarrays) son soportes slidos sobre los que se han fijado pequeas cantidades de ADN cuya secuencia es especfica para un gen distinto de modo que cada punto en el microordenamiento corresponde a un gen determinado. La informacin gentica es copiada en el ncleo celular en forma de ARN mensajero (ARNm) y transferida luego a los ribosomas, partculas citoplsmicas en las que tiene lugar la sntesis de protenas. Para establecer qu genes se encienden (es decir inician o aceleran la sntesis de la protena que codifican) ante cierta respuesta biolgica o situacin metablica, los microordenamientos de ADN se hbridan (esto es, se aparean a travs de bases complementarias) en forma simultnea con dos colecciones de ARNm obtenidas del mismo organismo, una en ausencia y otra en presencia del estmulo. Estas dos poblaciones de ARNm estn unidas a dos sustancias fluorescentes distintas (fluorforos). El ARNm hibridado (cuya secuencia es complementaria a la secuencia de los genes) se visualiza bajo un microscopio por su emisin fluorescente. De acuerdo con las relaciones entre los dos tipos de emisin fluorescente, puede determinarse si un determinado ARNm se ha transcripto ms o menos o si el nivel de su transcripcin no se ha modificado. Ello permite establecer qu genes estn involucrados en cada situacin experimental. Existen variaciones de este mtodo. Por ejemplo, en lugar de usar soportes de vidrio se pueden usar soportes de nylon e hibridarlos con sondas marcadas radioactivamente. La ventaja es el precio, pero la desventaja es que no permiten dobles marcajes y que los puntos no pueden ser tan pequeos, por lo que se precisa mayor espacio para estudiar el mismo nmero de genes. Otra variacin del mtodo consiste en que en lugar de fijar ADN en el vidrio, se utilizan oligos, es decir, pequeas cadenas de ADN, que se sintetizan en el mismo porta y cuya secuencia puede ser diseada a gusto del consumidor.

3.6.- GENMICA FUNCIONAL Cul es la funcin de cada uno de estos genes y como interaccionan para definir un fenotipo determinado? La genmica funcional intenta responder a estas preguntas. Transcriptoma El trmino transcriptoma se refiere al estudio de los perfiles de expresin de todos los genes presentes en el genoma. Los estudios de expresin sugieren pistas sobre la funcin de los genes. Aunque son muchos los mtodos para estudiar el transcriptoma el ms utilizado es el microarray de DNA, que permite el anlisis simultneo de la expresin de miles de genes. Por ejemplo 6400 genes (ESTs, cDNAs, oligonucletidos) de levadura se pueden disponer utilizando un sistema robotizado sobre un portaobjetos (18x18 mm) de microscopio [DeRisi JL et al., Science, 278, 680-686 (1997)]. Sobre este chip de DNA se realizan experimentos de hibridacin con muestras marcadas radiactivamente o con fluorforos apropiados, y los resultados se cuantifican mediante anlisis con phosphorimager o microscopa confocal. De esta manera se pueden identificar, de forma simultnea, patrones de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. El anlisis bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin importante sobre la funcin de los mismos. 4.- LA ERA GENMICA En el comienzo del tercer milenio estamos asistiendo a una revolucin en el conocimiento y la comprensin de los procesos biolgicos debido a la convergencia de dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnolgico enorme a finales del siglo XX: la Biologa Molecular y la Informtica. Un nuevo campo de investigacin y desarrollo emerge a gran velocidad y sus aplicaciones empiezan a vislumbrarse en todos los mbitos de la actividad humana relacionados con la Biologa, como la Medicina, Farmacologa, Ganadera, Agricultura y Silvicultura, Medio Ambiente, entre otros. La era de la genmica ha comenzado! En el mes de Febrero de 2001, la revista Nature [The Genome International Sequencing Consortium, Nature, 409, 860-921 (2001)] publica el primer borrador del genoma humano cuyo desciframiento completo se prev para este ao (2003), coincidiendo con el cincuenta aniversario de la publicacin del modelo estructural del DNA por Watson y Crick [Watson JD y Crick F., Nature, 171, 737 (1953)]. A este logro hay que aadir el desciframiento en los ltimos aos de los genomas completos de procariotas (ms de 30 bacterias) y varios eucariotas: un hongo, la levadura Saccharomyces cerevisiae [The Yeast Genome Directory, Nature, 387, supplement 1-105 (1997)], dos animales, el nematodo Caenorhabitis elegans [The Caenorhabitis elegans Sequencing Consortium. Science, 282, 2012-2018 (1998)], la mosca del vinagre Drosophila melanogaster [Varios autores, Science, 287, 2185-2195 (2000)] y una planta Arabidopsis thaliana [The Arabidopsis Genome Initiative, Nature, 408, 796-815 (2000)]. Actualmente estn en marcha proyectos de secuenciacin de los genomas de diferentes modelos animales (rata, ratn, perro, gato, cerdo, entre otros) y

vegetales (arroz, maz, poroto, soya, vid, entre otros) de gran importancia econmica para el hombre.

4.1.- GENMICA DE LA VID No cabe duda que la identificacin de los genes responsables de caracteres de inters agronmico y de calidad en vid (como los genes de resistencia a plagas y patgenos o los determinantes de caracteres de calidad de fruto y vino) y el estudio de su participacin en el fenotipo permitir disear nuevas estrategias de mejora de las variedades de vinificacin. Esta informacin es relevante no slo para el desarrollo de nuevas variedades sino tambin para la mejora gentica de las variedades clsicas mediante seleccin clonal o ingeniera gentica. Adems, esta informacin tiene mltiples aplicaciones en el seguimiento de la fisiologa de la planta bajo distintas condiciones de cultivo. De hecho, todas estas posibilidades han despertado el inters de varias iniciativas pblicas y privadas, en distintos pases, para acceder al conocimiento del genoma de la vid. El 31 de mayo de 2001 se celebr una reunin internacional en la Universidad de California en Davis (California, EUA), que cont con investigadores de casi todos los pases productores de vid (Alemania, Australia, Chile, Espaa, Estados Unidos, Francia, Hungra, Italia y Sudfrica), con el fin de intercambiar informacin y coordinar las iniciativas respecto del genoma de la vid. La reunin sirvi para conocer las iniciativas en curso en distintos pases. Dada la envergadura de la inversin econmica requerida para el anlisis del genoma de la vid, ningn gobierno o empresa privada puede abordarlo de manera independiente y se requiere la cooperacin y coordinacin internacional. Para ello se propuso la creacin de una Comisin Organizadora Internacional en la que participan investigadores de todos los pases presentes en la reunin. Esta Comisin tiene como objetivos la coordinacin de las actividades en curso y la elaboracin de un Documento Blanco sobre el inters del anlisis el genoma de la vid. Se pretende que este documento sirva como bases para la coordinacin internacional de la investigacin genmica de la vid y para promover la financiacin pblica y privada de esta iniciativa a travs de programas de investigacin genmica nacionales o supranacionales (UE, cooperacin internacional, etc.). En la siguiente tabla se muestra los principales grupos de investigacin y los resultados hasta ahora obtenidos:

RESUMEN DE LAS ACTIVIDADES EN PROGRESO DE LOS PROYECTOS VITIS (10-01-2003) INVESTIGADORES GENOTIPO Sector pblico: Grupo de (Francia) Romieur Shiraz/Cab Chard/Cab Cab Vitis x Musc Cab Pinot noir Sultana SECUENCIAS DE EST (Unigenes) 30.000 (~3.200) 80.000 (~4.600) 40.000 (~7.000) 30.000 8.000 20.000 2.000 50.000 10.000 Si Si Si Si Si Planificado Planificado Planificado Planificado MICROARRAY

Cramer/Cushman (Nevada, USA) Cook (CA, USA) Cook (CA, USA) Thomas/Davis (AUS) Velasco (Italia) Adams (CA, USA)

Topfer/Zyprian (FRG) Regent Delrot (Francia) Sector comercial: Southern Cross (AUS) Chard Dupont (DE) VitisGen Total Varios Gewur Chard/Pinot

5.000 45.000 30.000 (9.432) 3.800.000

Arrays de oligos

4.2 .- LA GENMICA DE LA VID EN CHILE Dada la importancia del cultivo de la vid en nuestro pas, en 2002 se form un consorcio de universidades e institutos de investigacin nacionales con el fin de aunar esfuerzos y capacidades e iniciar el proyecto Plataforma Cientfico Tecnolgica para el Desarrollo de la Genmica Funcional en Chile cuya primera etapa es el desarrollo del proyecto Desarrollo de la Genmica Funcional en Vid. (DEGECHIVID) Los motivos tcnicos y econmicos que originaron la necesidad y conveniencia de implementar el proyecto fueron las siguientes: El desarrollo de la ciencia genmica durante los ltimos aos ha concentrado sus mayores esfuerzos en obtener la secuencia de genomas de organismos con el objetivo de generar nuevos conocimientos que contribuyan al desarrollo cientfico-tecnolgico de las ms diversas disciplinas cientficas. En la actualidad existen, en el mundo entero, iniciativas genmicas relacionadas a organismos animales, vegetales y microorganismos generando una cantidad de informacin tal que para su manejo involucra el desarrollo paralelo de una nueva disciplina como lo es la bioinformtica. Iniciativas destinadas a financiar este tipo de estudios en el pas estn siendo apoyadas a travs de dineros provenientes del crdito obtenido por nuestro pas con el Banco Internacional de desarrollo (BID). As, en Octubre del ao 2002 la "Convocatoria del programa de recursos naturales renovables. Iniciativa genoma Chile. Programa de desarrollo e innovacin tecnolgica gobierno de Chile" ha financiado la realizacin de nuestro proyecto "Plataforma cientfico-tecnolgica para el desarrollo de la genmica de vegetales en chile. Etapa I: Genmica funcional en vid". Estudios de genmica vegetal se estn realizando en numerosos pases y estos contemplan las ms diversas especies. Sin embargo, problemas especficos relacionados a la calidad de los frutos en perodos determinados (pre- o postcosecha) debido a condiciones climticas y geogrficas son en muchos casos propios o exclusivos de nuestro pas. Proyectos de genmica funcional enfocados en tales problemticas podran aportar muy significativamente para mejorar y desarrollar nuevas tecnologas para el manejo de productos de exportacin. Estudios de genmica funcional requieren una infraestructura capaz de realizar tareas como secuenciamiento en gran escala, anlisis bioinformtico de las secuencias obtenidas y anlisis simultneo de miles de genes a travs de microarreglos o chips de ADN. Este tipo de infraestructura no existe en la actualidad en el pas, por lo que la realizacin de un proyecto nacional utilizando tecnologas genmicas implica la implementacin de una infraestructura bsica que permita alcanzar los objetivos planteados como tambin la formacin de nuevos profesionales en reas muy poco desarrolladas o en algunos casos inexistentes en el pas. La realizacin de este proyecto, por lo tanto, contempla establecer una infraestructura mnima para realizar proyectos de genmica nacional lo que permitir al pas contar con las bases cientfico-tecnolgicas para el desarrollo de nuevas estrategias para el manejo de la vid as como explorar nuevas iniciativas relacionadas con el genoma de otras especies de inters comercial en un futuro inmediato.

Objetivos Estratgicos del Proyecto Desarrollar la investigacin genmica vegetal en Chile Obtener informacin sobre la estructura y funcin del genoma de especies vegetales de importancia econmica Proteger derechos de propiedad intelectual Transferencia tecnolgica (instituciones investigacin Industria) Creacin de una red cientfica en el rea de investigacin genmica vegetal Colaboracin con otras iniciativas genmicas internacionales

Objetivos Cientficos del Proyecto El objetivo de este proyecto ser implementar: Secuenciamiento de 100.000 ESTs e implementacin de la infraestructura mnima requerida para anlisis de secuencias de genes en gran escala, almacenamiento de datos y confeccin de microarreglos (chips de ADN). Caracterizar la funcin biolgica de los genes de vid de una variedad no semillada (Sultanina) y una semillada (Carmenre) a travs de la secuenciacin de segmentos de genes (Expresin Sequenced Tags, EST) y perfiles trancripcionales mediante el uso de microarreglos Utilizar la informacin adquirida sobre los genes de la vid para investigacin aplicada en aspectos como: - Formacin de semillas y desarrollo del fruto - Resistencia a enfermedades (interaccin con Botrytis cinerea)

Estructura del Proyecto DEGECHIVID El proyecto que tendr una duracin de TRES AOS (2002-2005) ser dirigido por un Directorio que estar constituido por el representante legal, o su representante, de cada entidad participante en el proyecto. Las entidades participantes son: Universidad de Chile (UCh) Universidad de Santiago de Chile (USACH) Universidad de Talca (UT) Universidad Tcnica Federico Santa Mara (UTFSM) Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) Fundacin Chile Asociacin de Exportadores de Chile Fundacin para el desarrollo frutcola (FDF)

El proyecto ser Administrado y dirigido por un director cientfico (Dr. H. Pea-Corts, UTFSM) y un Gerente (P. Pastenes, UTFSM).

Resultados Esperados del Proyecto DEGECHIVID Resultados esperados al trmino del Proyecto (3er ao) 1. Obtencin de Genotecas de genes expresados durante distintos estados de desarrollo del racimo y bayas de la vid 2. Base de datos de genes involucrados en el proceso de formacin de la semilla y desarrollo del racimo de variedades semilladas y no semilladas de vid. 3. Identificacin de genes:

Relacionados con la formacin de semillas. Activados o reprimidos por tratamientos actuales con giberelinas. activados o reprimidos por la presencia de semillas. Presuntamente relacionados con el crecimiento y desarrollo de la baya (pedicelo, exocarpo, pericarpo, mesocarpo, epidermis)

Resultados y Productos de importancia comercial a mediano plazo 1. Catlogo de clones de ESTs 2. Genes o fragmentos de stos relacionados con:

El proceso de la apirenia u aborto de las semillas relacionados con la obtencin de bayas no semilladas en variedades de mesa y/o con la generacin de bayas semilladas lo cual puede ser importante para la correccin de corrimiento y el aumento de la relacin semilla/pulpa en variedades vineras que lo presenten. El crecimiento del mesocarpio (pulpa) relacionados con el aumento de calibre de las bayas en variedades de mesa para exportacin El metabolismo y la acumulacin de azcares relacionados con el control de la madurez de las bayas El proceso de abscicin de flores y bayas importantes para regular el raleo y el desgrane de postcosecha La respuesta de la planta a la infeccin con hongos patgenos.

Proyecciones a largo plazo:

Disponer de la informacin sealada permitir desarrollar a ms largo plazo: 1. Nuevas estrategias para el mejoramiento asistido de la vid con el fin de disear y obtener nuevas variedades de vid no semilladas de acuerdo con la demanda del mercado internacional 2. Uso directo de genes (transgenia) para inducir partenocarpia o estenoespermocarpia en cultivares con potencial comercial en los mercados externos por su tamao, color, sabor, aroma etc. 3. Deteccin o capturas de promotores gnicos potencialmente importantes para la induccin de genes relacionados con el crecimiento de la baya (hormonas) en tejidos especficos de esta. 4. Mejoramiento de la calidad (tamao) sin tratamiento hormonal exgeno y por lo tanto, disminucin de los costos de produccin y ms estabilidad en los mercados externos cada vez ms exigente en productos limpios. 5. Desarrollo de programas de mejoramiento de uva para vino. Induccin de semillas en variedades que se corren o con tendencia al millerandage como la Carmenre 6. Utilizacin de esta informacin en otras especies frutales y hortcolas con el fin de inducir o eliminar las semillas en sus frutos.

Impacto Cientfico-Tecnolgico del Proyecto

Desarrollo y fortalecimiento de la investigacin genmica en Chile. Obtencin de informacin sobre estructura y funcin de genes expresados de especies vegetales de importancia econmicaProporcionar una plataforma cientfico-tecnolgica para preparar cientficos jvenes con experiencia multidisciplinaria en genmica funcional de especies vegetales de importancia agronmica contribuyendo al desarrollo de la industria agrcola del pas. Preparacin de profesionales en el rea de la genmica funcional a travs del fortalecimiento de programas de doctorado existentes en la instituciones participantes. Proteccin de derechos de propiedad intelectual. Transferencia tecnolgica (instituciones de investigacin e industria). Creacin de una red cientfica en el rea de investigacin genmica en vegetales.

Participacin de Chile a un consorcio internacional participando activamente en un proyecto mundial sobre el genoma de la vid (IGGP, http://www.vitaceae.org). Potenciar las actividades econmicas relacionadas a la vid nacional e internacionalmente a travs de la investigacin y tecnologa de genmica funcional.

4.3.- MAYOR INFORMACIN SOBRE EL PROYECTO Director : Dr. Hugo Pea C. (Univ. Tc. Federico Sta.Mara) hugo.pena@biotec.utfsm.cl Director Alterno : Dr. Manuel Pinto C ( Universidad de Chile ) manpinto@uchile.cl Pagina web del Proyecto: http://www.genoma-frutos.cl