a) Las enzimas citocromo P450 son consideradas de gran interes debido que son los catalizadores principales involucrados

en la oxidacion de farmacos, carcinogenos, pesticidas y otros quimicos xenobioticos (Se aplica a los compuestos cuya estructura qumica en la naturaleza es poco frecuente o inexistente debido a que son compuestos sintetizados por el hombre. Algunos son recalcitrantes a la biodegradacin, llegando a ser contaminantes. Recalcitrante: difcil biodegradacin debido a gran estabilidad qumica, insolubilidad (fsica)Para que una sustancia pueda ser biodegradada debe estar disponible). Existen mas de 40 genes P450 en el genoma humano las cuales son generalmente expresadas en altos niveles, pero las tasas de catlisis son relativamente lentas. Algunas enzimas P450 procariotas han sido caracterizadas presentando una actividad cataltica mayor. Probablemente la eficiencia puede ser atribuida al proceso de seleccin en algunos casos (ej. la alta actividad es necesaria para que el organismo sobreviva en una nica fuente de carbono). Por esta razn, estudios se han enfocado en el entendimiento de la relacin estructura-funcin, para lo cual han usado la metodologa de mutagenesis aleatoria. P450 parecen ser ideal para este estudio debido a la baja actividad catalizadora inherente de las enzimas y su potencial para explotar una gran variedad de sustratos. Sin embargo, pocos estudios han utilizado esta metodologa debido a la limitacin presentada en el screening. Problemas de expresin de P450 en bacterias: Principales problemas: 1. Lograr la expresin de enzimas catalticamente activas: se usa un mtodo bicistronico donde se expresa de forma individual la protena P40 y NADPH-P450 reductasa (NPR).

2. Lograr la generacin de libreras de P450: se necesita el uso de estrategias DNa recombinante (ej. DNA shuffle) 3. La parte ms crtica en la mutagenesis aleatoria se encuentra en el sistema de screening donde se requiere de una alta capacidad para
evaluar las libreras y su actividad biolgica.

b) La introduccin de un tomo de oxgeno en una molcula orgnica es una reaccin muy til en la naturaleza. Con la monooxigenacin, el catabolismo de carbonos de hidrgenos puede ser iniciado. Molculas hidrfobicas pueden ser solubilizados y transformados tras la adicin un grupo funcional para formar un producto que puede ser utilizado por una variedad de vas biosintticas o degradativas. Este tipo de modificaciones qumicas pueden causar alteraciones estructurales significativas o no al compuesto. P450 o CYP son una de las familias de protenas ms grandes, diversas y antiguas. Actualmente existen ms de 1500 genes P$%) distribuidos en arqueas, bacterias, eucariotas simples (fungi), plantas y animales. La mayora de estas enzimas presentan la siguiente reaccin: La forma ms obvia de oxidacin es la insercin formal de un tomo de oxgeno en un sustrato:

Los mecanismos qumicos de la catlisis de P450 han sido revisados. La reaccin general y mas comn sigue el siguiente esquema general:

El hierro del grupo hemo prosttico es el sitio principal de los eventos catalticos, incrementado por la interaccin de algunos aminos cidos individuales. Las P450 son clasificadas en diferentes clases de acuerdo a la naturaleza de su actividad cataltica. La mayora catalizan reacciones de monooxigenacion y generalmente requieren una o mas enzimas accesorias o redox partners que le permiten utilizar los cofactores redox NADPH o NADH. En mamferos, P450 tienen dos funciones principales: La biosntesis de qumicos lipofilicos involucrados en la trasmisin de seales qumicas (ej. Hormonas esteroides y protanoides), y la degradacin de qumicos endobioticos o xenobioticos. La degradacin de qumicos extraos puede ser considerada un tipo de sistema de defensa qumica. P450 cataliza reacciones de funcionalizacin, generalmente adicionando o exponiendo grupos hidrofilicos funcionales que usualmente incrementan la solubilidad en agua, dejando el compuesto disponible para un metabolismo posterior. Frecuentemente, ese cambio estructural tambin afecta las propiedades biolgicas de un compuesto. La habilidad de monooxigenar sirve con el propsito general de terminar la actividad biolgica e incrementar la limpieza de qumicos. Para que sirva como sistema de defensa qumica, el sistema necesita interactuar con una amplia variedad de sustratos qumicos. Esto es logrado por la expresin de un nmero pequeo de enzimas en el hgado y el intestino de mamferos, algunas ms diversas y otras con similar especificidad de sustrato. Las tan llamadas formas P450 metabolizadoras de xenobioticos de los humanos han sido bien caracterizadas actualmente. Aproximadamente 12 formas de las familias CYP1, CYP2 y CYP3 aparentan tener la mayor importancia en este metabolismo, especficamente 1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2B6, 2C6, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, y 3A5. Cada P450 aparenta tener unas preferencias estructuras en sustrato, y algunas son ms verstiles que otras. Gran inters se ha tenido sobre el estudio de las restricciones estructurales de los sustratos que puedan permitir una prediccin ms efectiva sobre el metabolismo de nuevos medicamentos. Expresin de protenas recombinantes P450 Una variedad de sistemas han sido usados para la expresin de P450 mamferos, en los cuales problemas tcnicos de han debido a la naturaleza lipofilica y su asociacin a membrana. La expresin en bacterias permite la produccin de grandes cantidades de enzima la cual ha sido coexpresada con la reductasa, permitiendo cuantificar si actividad sin necesidad de aislar la enzima.

c) En el campo de biotecnologa hay un inters constate para extender la diversidad creando mejores catalizadores para diferentes reacciones qumicas. Las enzimas citocromo P450 se encuentra entre los catalizadores ms verstiles conocidos. Estas hemoproteinas, que usualmente catalizan la incorporacin de un tomo de oxgeno en un sustrato, estn presentes en casi todos los organismos vivos. Adicionalmente, las enzimas P450 involucradas en el metabolismo de xenobioticos en mamferos presentan una amplia variedad de especificidad de sustrato, convirtindolas en un punto de inicio ideal para el diseo de catalizadores qumicos para uso industrial. DNA shufflinf es un tipo de tcnica de evolucin dirigida que imita el proceso natural de evolucin in vitro, bajo condiciones de laboratorio, en donde se genera diversidad de secuencia al combinar varios genes de un numero de formas parentales relacionadas evolutivamente y con alta identidad de secuencia. Este mtodo presenta tres pasos generales: 1. Digestin enzimtica de genes y coleccin de fragmentos de DNA. 2. Reensamblaje de fragmentos DNA en un proceso direccionado de secuencia por hibridacin no aleatoria por PCR 3. Amplificacion de los clones recombinados por PCR. La mayor ventaja de esta tcnica comparada con otras tcnicas de evolucin dirigida es la generacin de variantes altamente diversos con un bajo nivel de mutaciones deletreas. P450 existen en subfamilias con una identidad de amino acidos mayor al ~55%, lo cual es optimo para este tipo de tcnicas recombinatorias.

d) La familia del citocromo P450 (oficialmente abreviado como CYP) es un grupo grande y diverso de enzimas. La funcin de la mayora de las enzimas CYP es catalizar la oxidacin de sustancias orgnicas. Los sustratos de las enzimas CYP son intermediarios metablicos, tales como lpidos, hormonas esteroides, as como sustancias xenobiticas como drogas. La reaccin ms comn catalizada por el citocromo P450 es una reaccin monooxigenasa, o sea, de insercin de un tomo de oxgeno en un sustrato orgnico (RH), mientras que el otro tomo de oxgeno se reduce a agua: RH + O2 + 2H+ + 2e- ROH + H2O Los citocromos P450 pertenecen a la superfamilia de protenas que contienen un cofactor hemo y, por tanto, tambin son hemoprotenas. Los citocromos de la familia P450 utilizan una variedad de molculas pequeas y grandes como sustrato en sus reacciones enzimticas. A menudo forman parte de cadenas de transporte de electrones, llamado comunmente sistemas P450. Los citocromos P450, han sido nombrados sobre la base de su locacin celular (cito) y sus caractersticas espectrofotomtricas (cromo): cuando el hierro hemo es reducido, las enzimas P450 absorben la luz en longitudes de onda cercanas a 450 nm, identificada por un caracterstico pico de Soret. Las enzimas del CYP se han identificado en todos los reinos vivientes, es decir, en los animales, plantas, hongos, bacterias y arqueas. Se conocen ms de 11.500 protenas distintas CYP. Los citocromos P450 humanos son principalmente protenas asociados a membranas, localizados en la membrana interna de las mitocondrias o en el retculo endoplsmico celular. Los CYP metabolizan miles de compuestos endgenos y exgenos. La mayora de CYP pueden metabolizar sustratos mltiples, y muchos pueden catalizar reacciones mltiples, lo que explica su importancia central en el metabolismo de gran cantidad de molculas endgenas y exgenas. En el hgado, estos sustratos incluyen las drogas y compuestos txicos, as como productos metablicos como la bilirrubina (un producto de degradacin de la hemoglobina). Las enzimas del citocromo P450 estn presentes en la mayora de los otros tejidos del cuerpo, y juegan un papel importante en la sntesis de hormonas y distribucin (incluyendo el estrgeno y la sntesis de testosterona y el metabolismo), la sntesis del colesterol y el metabolismo de la vitamina D. Los citocromos P450 hepticos son los ms ampliamente estudiados. El citocromo P450 (abreviado CYP en ingls, o CIP en espaol, o simplemente P450) es una enorme y diversa superfamilia de hemoprotenas encontradas en bacterias, archaea y eucariotas.1 Las protenas del citocromo P450 usan un amplio rango de compuestos exgenos y endgenos como sustratos de sus reacciones enzimticas. Por lo general forman parte de cadenas de transferencia de electrones con multicomponentes, denominadas sistemas contenedoras de P450. Los CYP en el hombre son protenas asociadas a las membranas citoplasmtica, mitocondrial y del retculo endoplsmico, donde actan metabolizando cientos de sustancias endgenas y exgenas. La mayora de los CYP actan sobre varios sustratos, pudiendo algunas de ellas catalizar varios tipos de reacciones. In vivo, estos sustratos incluyen numerosas drogas o componentes txicos derivados de metabolismo, como es el caso de la bilirrubina. Las enzimas del citocromo p450 estn presentes en la mayora de los tejidos del organismo, jugando un papel fundamental en la sntesis de hormonas (incluyendo estrgenos y testosterona), colesterol o vitamina D3, an cuando son las CYP del hgado las ms estudiadas. Por otra parte, el CYP constituye el mayor complejo enzimtico involucrado en el metabolismo de los frmacos en nuestro organismo, al jugar un papel fundamental en la fase oxidativa del metabolismo (conocida como fase I). Algunos de estos frmacos tienen la capacidad de aumentar o disminuir la actividad de las enzimas (fenmenos conocidos como induccin enzimtica e inhibicin enzimtica, respectivamente). Esto tiene una trascendencia fundamental en la valoracin de las interacciones de frmacos entre s. Si, por ejemplo, un frmaco inhibe la enzima que degrada a un segundo frmaco, en presencia de ambos el segundo frmaco aumentar sus niveles en sangre y, subsiguientemente, las posibilidades de dar patologa por sobredosis. De forma inversa, si lo que hace es inducir el metabolismo, las concentraciones del segundo frmaco disminuirn, estando por debajo de los niveles teraputicos, factor de vital importancia por ejemplo en los antibiticos. Esto nos lleva a que sea necesario un completo conocimiento de las enzimas implicadas en el metabolismo de los frmacos utilizados en el hombre para evitar errores de ventana teraputica o de efectos secundarios. Especialmente los laboratorios farmacuticos estn muy interesados en estos estudios por las posibilidades que presentan. El sitio activo del citocromo P450 contiene un centro hierro asociado al grupo hemo. El hierro est enlazado a la protena P450 por medio de un ligando de tiolato que proviene de un residuo de cistena. Esa cistena y otros residuos circunvecinos (RXCXG) son altamente conservados entre los CYP conocidos,7 queriendo decir que existe poca variedad entre un CYP y otro en su sitio de unin con el hierro. Debido a la gran variedad de reacciones catalizadas por los CYP, sus actividades y propiedades varan entre un miembro y el otro en muchos aspectos. Las principales propiedades de una enzima P450 incluyen: 1.El estado en reposo de la protena contiene un grupo Fe3+ (oxidado). 2.La unin de un sustrato inicia el transporte de electrones y los enlaces al oxgeno.

3.Los electrones son donados al CYP por otra protena, bien sea un citocromo P450 reductasa, ferredoxina o citocromo b5, con el fin de reducir el hierro del hemo. 4.El oxgeno molecular se une con y es reducido por el hierro del hemo. 5.Un oxidante unido al hierro, oxida el sustrato bien sea a un alcohol o a un epxido, regenerando es estado de reposo del CYP. La reaccin tpica catalizada por protenas P450 es la monooxigenacion, seguida por otras reacciones inusuales como reducciones, dehalogenaciones, transferencia de grupos, formacin de anillos, entre otras. Investigaciones muestran un potencial considerable para el desarrollo de biocatalizadores P450 por evolucin dirigida. Proteinas P450 de mamferos metabolizantes de xenobioticos son un modelo apropiado debido a si amplio rango de sustratos con diferencias estructurales y fisicoqumicas, por lo cual representan un punto de inicio para el mejoramiento de propiedades como especificidad de sustrato, regioselectividad, eficiencia cataltica y otras propiedades. Mientras que algunas caractersticas de las protenas P450 mamiferos no son ideales para la aplicacin biotecnolgica ( baja tasa turnover, naja estabilidad, otros) estas limitaciones pueden ser solucionadas a travs de evolucin dirigida. La evolucin dirigida es iterativa, un mtodo semi-aleatorio de ingeniera de protenas. El xito depende no solo del entendimiento de las caractersticas a disenar pero tambin a los enfoques tradicionales que involucran ingeniera racional como mutagnesis de sitio dirigida. Enzimas han evolucionado naturalmente para cumplir una funcion en un nicho fisiologico particular en vez de ajustarse a procesos industriales. Su uso en condiciones diferentes a las naturales pueden afectar su estabilidad y fuincinalidad. Por medio de la evolucion dirigida las enzimas pueden ser optimizadas para un sustrato/reaccion/cofactor no natural, y sus propiedades quimicas. DNA shuffling de una familia de proteinas involucra la recombinacion entre diferentes partes de estructuras homologas de una misma superfamilia estructural. Con este metodo, los elementos estructurales importantes son conservados y las mutaciones son introducidas generalmente en al menos un ortologo o forma parental y que se han retenido por el proceso evolutivo. Frecuentemente estos no tienen un efecto desestabilizador en el plegamiento general de la proteina. Otros metodos quimeragenicos o recombinatorios presentan las mismas ventajas que la tecnica DNA shuffling pero difieren enla factibilidad deobtener secuencias con menor o mayor diversidad. En la tecnica stEP (staggered extension process) las condiciones de PCR son ajustadas para promover una extension limitada de primers en cada ciclo, facilitando el intercambio y recombinacion entre fragmentos DNa entre ciclos. Este proceso logra el mismo efecto general en el reensamblaje de fragmentos aleatorios. Quimeragenesis entre secuencias distantes puede ser problemtica debido que las interacciones entre residuos que son escenciales para el mantenimiento estructural o la integridad funcional de la proteina. Este problema puede ser resuelto usando SCHEMA, un algoritmo para el mejoramiento de estrategias de recombinacion que minimisa el numero de contactos entre residuos que son rotos cuando un mutante es generado.

e) La habilidad para conservar la estructura mientras se explora en la diversidad de secuencia es esencial en la ingeniera de protenas por mtodos de recombinacin homologa, donde segmentos de secuencia de protenas similares o iguales estructuralmente son intercambiados para formar nuevas molculas quimricas, potenciales con propiedades mejoradas. Comparado con mutagenesis aleatoria, el xito de la tasa de recombinacin es alta pero con una proporcin mayor de quimeras no viables estructuralmente. Para facilitar la ingeniera de protenas se ha enfocado en determinar que caractersticas de secuencia determinan las diferencias funcionales que puedan permitir controlar los parmetros de recombinacin. Una bsqueda sin restricciones no es posible debido a la naturaleza combinatoria del espacio de secuencia. Por lo contrario, una metodologa guiada es preguntarse que caractersticas de secuencia son predecibles al buscar en sitios conservados estructuralmente por todos los miembros de la familia. Las caractersticas de secuencia presentes en una librera de mutantes es esxaminada por un algoritmo de aprendizaje de maquinas para crear un mapa de secuencia-funcion. Ademas de realizar permitir la bsqueda mas factible al guiar hacia el espacio de secuencia, nuestro objetivo es desarrollar un mtodo que tome la estructura de protenas representadas, observar la librera de mutantes y crear un modelo predictivo.

f)
P450 subfamilia de monooxigenasas, hemo protenas que realizan una serie de reacciones oxidativas como hidroxilacion de uniones C-H, Ndealquilacion, N-hidroxilacion, O-dealquilacion, S-oxidacion, y epoxidacion de compuestos endgenos y exgenos. Centrales en el estudio toxicolgico debido que estn involucradas en la eliminacin de la mayora de frmacos, activacin de pro-farmacos, interaccin farmaco-farmaco y frmaco-alimento, y el metabolismo de carcingenos y otros contaminantes. Actualmente hay aproximadamente 7000 secuencias CYP conocidas. Su versatilidad cataltica y diversidad de sustrato han enfocado su aplicacin biotecnolgica como biocatalizadores en reas como medicina y biorremediacin. CYP bacterianas son solubles y catalticamente independientes debido que el domino con actividad reductasa que realiza la transferencia de electron (flavin mononucleotido FMN/ Flavn adenn dinucletido FAD) y el dominio monooxigenasa P450 se encuentran en un nico pptido, pero estas enzimas metabolizan solo un nmero limitado de sustratos naturales como cidos grasos, vitaminas, eritromicina, estireno, terpenos. Por otro lado, las protenas CYP de mamferos son integradas a membrana y metabolizan una amplia cantidad de sustratos como esteroides, cidos grasos, frmacos, pro-farmacos, carcingenos, pesticidas, herbicidas. Estas necesitan un agente reductor adicional, como la reductasa citocromo P450 (CPR), citocromo b5, o cofactor NADPH el cual es costoso. Adicionalmente, las CYP bacterianas presentan un mayor turnover, nivel de expresin en E. coli y eficiencia de acoplamiento (uso de NADPH metabolismo del sustrato vs formacin de superoxido, perxido y molculas de agua) comparado con las CYP de mamiferos. Estas caractersticas sugieren que las CYP bacterianas con de fcil uso como biocatalizadores, mientras que las CYP mamiferos presentan una variedad mas amplia de aplicaciones biotecnolgicas. Aplicaciones de los biocatalizadores citocromo P450 En anos recientes ha ido incrementando el inters en el uso de CYP para la sntesis industrial de qumicos, farmacuticos, agroqumicos y ingredientes de alimentos, especialmente cuando se requiere una alta regio- y estereoselectividad (es la formacin preferente de un estereoismero sobre todos los posibles. Puede ser parcial, donde la formacin de un estereoismero est favorecida sobre el resto, o puede ser

total, cuando slo se forma un estereoismero de los posibles. Estereoismero es un ismero que tiene la misma frmula molecular y la misma secuencia de tomos enlazados, con los mismos enlaces entre sus tomos, pero difieren en la orientacin tridimensional de sus tomos en el espacio) en la hidroxilacion de sustratos especificos. Adicionalmente, hay una alta demanda de biocatalizadores CYP para la detoxificacion de contaminantes ambientales, terapia profarmacos para el tratamiento de cncer. 1. Biotecnologia: Estas enzimas tienen un potencial tremendo en la sntesis y descubrimiento de nuevos frmacos, asi como en el desarrollo de estos. Aun que varios microorganismos han sido usados para la sntesis de frmacos usando una reaccin de hidroxilacion, la aplicacin comercial mejor establecida de las enzimas CYP es en la biotransformacion de esteroides como 11B-hidroxilacion para la produccin de hidrocortisona por Curvularia sp.. Muchos procesos sintticos de antibiticos involucran P450 bacterianas ej, la sntesis de eritromicina y tetracenomicina requiere P50. Asi mismo, enzimas CYP de plantas estn involucradas en la biosntesis del frmaco quimioteraputico taxol debido que su sntesis completa en microorganismos ha sido difcil. En el desarrollo de frmacos es importante evaluar la eficacia, toxicidad y farmacocintica. Estos estudios requieres grandes cantidades de metabolitos puros que son difciles de sintetizar por mtodos qumicos, especialmente cuando se requiere regio y estereoselectividad en hidroxilacion de sustratos especificos. Una ruta alternativa para la sntesis de frmacos es el uso de CYPs humanas, pero su principal limitacin se debe a la baja actividad, estabilidad y expresin en E.coli. Adicionalmente a los frmacos y metabolitos de frmacos, diversos productos comerciales como tintes (indigo a partir de triptofano), pesticidas y produccin de flores con colores inusuales a travs del uso de CYP. 2. Medicina: Terapia profarmaco de enzima dirigida a gen incrementa la quimiosensibilidad de clulas tumorales al estimular la activacin de profarmacos para mejorar la eficacia de agentes quimioteraputicos anticancergenos. En los ltimos aos se han realizado estudios en el desarrollo de activacin de ciclofosfamida (CPA) e isofosfamida (IFA) por medio del uso de CYP en estas terapias profarmacos. Otra aplicacin de estas enzimas en la medicina es en el rea de biosensores para monitorear niveles de frmacos en el plasma sanquineo. Este monitoreo es critico debido a la presencia de variantes genticas o de interacciones frmaco-farmaco o frmaco alimentos debido que pueden alterar la respuesta al frmaco y a toxicidad. Numerosos frmacos han demostrado inhibir o activar enzimas CYP humanas, lo cual altera el metabolismo de otros frmacos, resultando en toxicidad. Adicionalmente, biosensores CYP pueden ser usados para detectar contaminantes en alimentos como carbamato y pesticidas organofosforados para mejorar la seguridad alimentaria. Por lo tanto, una enzima CYP inmovilizada en un electrodo puede unirse a frmacos o convertirlos en productos oxidados, actuando como biosensor. Un potencial electroqumico es generado tras la unin o el metabolismo, el cual puede ser usado para monitorear niveles de toxicidad de contaminantes de frmacos o alimentos. CYP es el tercer biosensor ms importante, despus de citocromo c y glucosa oxidasa. Biorremediacin: Existen tres principales clases de contaminantes industriales presentes en aire, agua y suelo; hidrocarburos aromticos policicliclos (PAHs), dibenzo p-dioxinas policloradas (PCDDs) y bifeniles policlorinados (PCBs). PAHS son compuestos ubicuos originados depirolisis de materia organica como quema de bosques, consumo de combustibles, procesos de industrias de aceites. Las enzimas CYP101, CYP102, CYP1A1, CYP1A2 y CYP1B1 son conocidas por metabolizar estos compuestos. Sistemas de expresin como S. cereviciae han logrado expresa CYP1A1 que satisfactoriamente biodegradan PCDDs. Los PCBs son metabolizados por varias enzimas CYP y los principales factores que influyen en el grado de metabolismo son al nivel de cloracin y la posicin de los tomos de cloro en el ncleo bifenil. En contraste, CYP1A1 tambin es conocida por bioactivar estos contaminantes en compuestos genotoxicos y carcingenos representando un riesgo para el desarrollo de cncer de pulmn, razones por la cual su uso debe realizarse con precaucin. Los herbicidas son una alternativa para mejorar la produccin y calidad de cultivos. Muchos herbicidas son removidos del medio ambiente por enzimas CYP bacterianas y vegetales, las cuales realizan su conversin a metabolitos menos toxicos y lipofilicos. Solo algunos genes CYP metabolizantes de herbicidas han sido caracterizados.

3.

Fuente de electrones costo-efectiva Las enzimas CYP requieren una fuente de electrones via agente redox y NADPH, por lo cual es critico encontrar estrategias alternar para su aplicacin. La forma mas difcil y costosa requiere el uso de NADPH y enzimas CPR, CYP y citrocromo b5 purificadas. El costo de HADPH puede ser reducido al usar un sistema de regeneracin NADPH, lo cual es principalmente usado en la sntesis de compuestos especficos y biorremediacin. El

requerimiento de agentes reductores puede ser solucionado al expresar CYP y CPR en el mismo plasmido (expresin bicistronica) o en uno diferente (co-expresion). El mtodo mas costo-efectivo y simple consiste en superar los requisitos CYP, citrocromo b5 y NADPH al usar oxidantes alternos como perxidos, polvos de metales (Zn, Pt) o electrodos de metales (oro, carbn tipo vidrio). Estas estrategias pueden ser usadas para la sntesis, biorremediacin y aplicacin de biosensores. El uso de perxidos y polvos de metales es la via mas costo-efectiva para la sntesis de frmacos, metabolitos o otros qumicos, mientras que el uso de electrodos de metal es econmico para el diseo de biosensores. Sin embargo, no todas las enzimas CYP no muestran una actividad o presentan baja actividad con estos oxidantes alternos. Debido a esta situacin se ha encontrado una oportunidad para la ingeniera de protenas CYP en la bsqueda de propiedades mejoradas u oxidantes alternos. Recientemente varias CYP han sido diseadas por enfoques racional y evolucin dirigida. Ingenieria de protenas CYP 1. Racional: Este enfoque requiere conocimiento previo de la relacin estructura-funcion por medio de quimeragenesis, mutagenesis dirigida, estructura cristalogrfica por rayos X, modelamiento de protenas y termodinmica de las enzimas CYP. Esta informacin es obtenida de diferentes fuentes, lo cual provee un acercamiento al rol funcional de residuos de amino acidos, los cuales pueden ser reemplazados por otros residuos para mejorar solubilidad, estabilidad, expresin y actividad, asi como alterar la especificidad de sustrato y regioselectividad (es la preferencia que tiene una reaccin para romper o crear un enlace en una direccin en particular por encima de todas las dems posibles. Una reaccin que puede dar lugar a diversos productos que son ismeros estructurales (o regioisomeros) ser regioselectiva si da lugar casi exclusivamente a un nico producto). Este mtodo ha sido empleado para la ingeniera de varias enzimas CYP. Semi-racional: Este enfoque determina la actividad relativa, estabilidad o expresin de enzimas CYP de una misma subfamilia como las enzimas CYP2B (2B1, 2B4, 2B6 y 2B11). Luego las secuencias de aminocidos de un grupo de enzimas, que presentan baja o alta actividad, estabilidad o expresin, son comparadas para determinar los residuos que pueden ser responsables de las diferencias funcionales. Adicionalmente, la accesibilidad del solvente de estos amino acidos es determinada usando anlisis computacionales basados en estructuras critalograficas rayos X o modelos estructurales generados a travs de estructuras de cristal. Los residuos seleccionados responsables de la baja actividad, estabilidad, o expresin, son reemplazados por residuos que mejoran estas propiedades por mutagenesis dirigida. Conservacion de secuencias de motivos (CSM): Este anlisis es realizado por alineamiento multiple de secuencias al emplear una combinacin linear de 237 propiedades fisicoqumicas de 20 aminoacidos. Una correlacion puede ser encontrada entre motivos/residuos dentro de motivos y sus funciones conocidas a travs de variantes genticas y mutaciones dirigidas. Esto sugiere que el anlisis CSM es un enfoque importante para la identificacin del rol funcional de residuos dentro de motivos. (Secuencia de motive: sequence motif is a nucleotide or amino-acid sequence pattern that is widespread and has, or is conjectured to have, a biological significance. For proteins, a sequence motif is distinguished from a structural motif, a motif formed by the three dimensional arrangement of amino acids, which may not be adjacent. Consensus sequence refers to the most common nucleotide or amino acid at a particular position after multiple sequences are aligned. A consensus sequence is a way of representing the results of a multiple sequence alignment, where related sequences are compared to each other, and similar functional sequence motifs are found.) Evolucin dirigida: No requiere conocimiento previo de la funcin y estructura. Es realizado al crear variantes usando ep-PCR, mutagnesis de sitio dirigido o recombinacin seguida por el screening y seleccin de variantes con caractersticas deseadas como mayor actividad, estabilidad, expresin, o especificidad de sustrato alterada. La evolucin dirigida ha sido usada de forma satisfactoria y aplicada para el diseo de biocatalizadores industriales para una mayor eficiencia cataltica, nuevas actividades, estabilidad mejorada. El principal requisito de este enfoque es el desarrollo de un sistema screening de alto rendimiento (HTS) para el tamizaje y seleccin de los mutantes con las caractersticas deseadas. El desarrollo de HTS requiere encontrar un mtodo simple, costo-efectivo y eficiente para medir la actividad de la enzima en un microplato mltiple. Por lo tanto el uso de oxidantes alternos como perxidos que soluciona la necesidad de uso de agentes redox, lpidos y NADPH es muy deseable. Recientemente un sistema HTS para CYP se ha desarrollado basado en sustratos fluorescentes, perxidos y sistemas buffer. El screening puede ser realizado de manera ms exhaustiva al evaluar otras caractersticas como tolerancia a temperaturas y solvente incubando mutantes a una temperatura y concentracin DMSO especfica donde la enzima mantenga el 50% de su actividad (T50). Citometria de flujo ha sido recientemente incorporada para el anlisis de celulas mutantes con actividad mejorada, el cual requiere el uso de un sustrato fluorogeno.

2.

3.

4.

Conclusiones En la pasada dcada ha emergido una necesidad de biocatalizadores CYP debido a su uso en: 1) Sintesis de frmacos y metabolitos de frmacos en la industria farmacutica; 2) Sintesis de compuestos coloreados con indigo en las industrias horticultura y tintes; 3) Sintesis de agroqumicos y otros compuestos en las industrias qumicas y de alimentos; 4) GDEPT basado en enzimas P450 para la activacin de profarmacos anticancergenos; 5) Diseno de biosensores para el monitoreo de niveles de frmacos en plasma sanquineo en medicina y componentes dainos en la industria alimentaria; 6) Biorremediacion usando plantas transgenicas y sistemas inmovilizados.

Desde el reconocimiento de la necesidad de biocatalizadores CYP se han realizado estudios en el diseo de estas enzimas por los mtodos racional, semi-racioinal, CSM y evolucin dirigida para mejorar su eficiencia cataltica, estabilidad, expresin, requerimiento de cofactores, viabilidad de enzimas CYP-CPR fusionadas y la regio y estereoselectividad en la hidroxilacion de sustratos especficos. Adicionalmente, investigadores se encuentran activamente buscando por oxidantes alternativos como perxidos, polvo de metal, y electrodos de metal para adquirir estrategias simples, costo-efectivas y eficientes para mediar reacciones con enzimas CYP. La ingeniera de estas enzimas por los mtodos racional, semi-racional y CSM es limitado debido a la falta de entendimiento sobre la relacin estructura-funcin de estas enzimas. Por lo tanto, la evolucin dirigida con mutagenesis aleatoria y DNA shuffling, seguida de mtodos HTS efectivos, puede lograr la ingeniera de nuevas protenas CYP con propiedades mejoradas como actividad, estabilidad y expresin en E. coli, asi como especificidad de sustrato alterada y regio- estereoselectividad, y agentes reductores. Por estas razones, la ingeniera de protenas CYP para su aplicacin industrial, mdico y ambiental aparenta un futuro prometedor.