Universidade de Itana

Faculdade de Farmcia

Mtodos Fsico-Qumicos de Anlise

Aula 1: Cromatografia
Professor Fernando Csar Silva

1 Semestre de 2012

Programa
Aula 1: Cromatografia
- Cromatografia em Camada Delgada;

- Cromatografia em Coluna;
- Cromatografia Gasosa e, - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.

Programa
Aula 2: Espectroscopia na regio do infravermelho
- Processo de absoro no IV; - Modos de vibrao;

- Propriedades das ligaes e a absoro;

- Absoro de grupos funcionais mais comuns e, - Anlise de espectros.

Programa
Aula 3: Ressonncia Magntica Nuclear
- Mecanismo de absoro (ressonncia);

- RMN de 1H;
- Deslocamento qumico e blindagem; - Integrais e integrao; - Ambiente qumico e deslocamento qumico; - Regra de separao spin-spin; - RMN de 13C e DEPT 135 e, - Anlise de espectros.

Programa
Aula 4: Ressonncia Magntica Nuclear Bidimensional

- HSQC; - HMBC e, - NOESY.

Programa
Aula 5: Espectrometria de Massas
- Mtodos de ionizao;
- Fragmentaes caractersticas; - Anlise de espectros e,

- Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas.

Programa
Aula 6: Combinao de mtodos

- IV; - EM e, - RMN.

Atividades
- Testinhos de aulas prticas e tericas;
Relatrios de aulas prticas; APS;

Participao em aulas prticas;

Resumos e,
Avaliaes.

Dados de 2010 colocam o mercado farmacutico

brasileiro na oitava posio no posio no ranking

mundial da indstria farmacutica com um faturamento de 36,25 bilhes de reais.

Ministrio da Cincia, Tecnologia e Inovao. Estratgia Nacional de Cincia, Tecnologia e Inovao 2012 2015: Balano das Atividades Estruturantes 2011.

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Histrico da Cromatografia
- 1906 (Tsweet) separao de pigmentos de extratos de folhas; - 1930 (Kuhn) separao de produtos naturais; - 1941 (Martin e Synge) separao de aminocidos acetilados (cromatografia de partio lquido-lquido);

- 1944 (Consden, Gordon e Martin) anlise de mistura de aminocidos acetilados (cromatografia em papel);
- 1948 (Evans e Partidge) separao de alcaloides (cromatografia de partio); - 1952 (Martin e Synger) laureados com o Prmio Nobel de Qumica e,

- 1958 (Stahl) aplicabilidade da cromatografia em camada delgada (CCD).

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Cromatografia

a separao de uma mistura de dois ou mais componentes por distribuio entre duas fases, uma das quais estacionria, e a outra, se move.

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Cromatografia

13

Cromatografia

Os mtodos cromatogrficos dependem, basicamente, das solubilidades ou das adsortividades diferenciais das substncias a serem separadas em relao s duas fases entre as quais elas se particionam.

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Cromatografia
O equilbrio de distribuio dinmico, com molculas sendo
constantemente adsorvidas e dessorvidas na fase estacionria. O nmero mdio de molculas que ficam adsorvidas na fase estacionria

depende da molcula envolvida e da capacidade de dissoluo do

solvente (fase mvel) com o qual o adsorvente deve competir.

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Adsorventes

16

Interaes
Por exemplo: Fase estacionria alumina Amostra composto orgnico

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Interaes

A intensidade das interaes varia na seguinte ordem aproximada:

Formao de sal > coordenao > ligao de hidrognio > dipolo dipolo > foras de Van der Waals

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Solventes (eluentes)

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A fase mvel ascende uma camada fina de adsorvente que cobre um

suporte de apoio.

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A anlise em CCD permite avaliar o grau de complexidade de uma mistura e a identificao de compostos por meio da comparao com amostra autntica.

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

22

Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Aplicao da

amostra

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Eluio

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Visualizao

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Fator de reteno (Rf)c

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Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Deteco rpida de drogas

Cocana Herona

Amostra

Anfetamina

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Podemos utilizar a CCD para:

- Mostrar que dois compostos so idnticos;
- Determinar o nmero de componentes de uma mistura; - Determinar o solvente apropriado para uma separao por cromatografia em coluna; - Acompanhar uma separao por cromatografia em coluna; - Verificar a eficincia de uma separao feita em coluna, cristalizao ou por extrao e, - Acompanhar o progresso de uma reao.

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Cromatografia em Coluna (Adsoro)

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Parmetros que afetam a separao:

- Adsorvente escolhido; - Polaridade dos solventes escolhidos;

- Tamanho da coluna (comprimento e dimetro) em relao ao material a ser cromatografado e, - Velocidade de eluio (ou fluxo).

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Sequncia de etapas de uma separao cromatogrfica

32

Cromatografia em Coluna

33

Empacotamento da Coluna (a seco)

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Empacotamento da Coluna (a seco)

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Aplicao da amostra

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Eluio

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Cromatografia em coluna Flash

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40

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Cromatografia Gasosa
Caractersticas
- Fase mvel: gs - Vaporizao da amostra - Substncias chegam sada da coluna em tempos diferentes

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Diagrama de blocos de um cromatgrafo a gs tpico

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Equipamento

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Vantagens

- Anlise de dezenas de substncias em uma mesma amostra; - Necessidade de pequenas quantidades de amostra e, - Anlise quantitativa.

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Desvantagens
- Pode ser usada somente para substncias volteis e termicamente estveis; - O preparo da amostra pode ser complexo e caro e, - Anlise qualitativa (necessidade de outros mtodos).

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48

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50

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Cromatograma

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Cromatograma (Padro)
FID1 A, of 26_06_09\AMOSTR02.D counts

200000

150000

14

.8
100000 0 5 10 15 20 25 30 35 min

32 10 . 11 885 .8 60 12 . 13 820 .7 48 15 .5 33 17 .2 50 8 1 .2 81
50000

2.

45

16

.4

61

56
Data File C:\HPCHEM\1\DATA\26_06_09\amostr02.D Sample Name: HC29 Instrumento 1 26/06/09 12:56:49 Lucienir ===================================================================== Injection Date : 26/06/09 12:20:23 Seq. Line : 2 Sample Name : HC29 Vial : 1 Acq. Operator : Lucienir Inj : 1 Inj Volume : 2 l Different Inj Volume from Sequence ! Actual Inj Volume : 4 l Sequence File Method Last changed : C:\HPCHEM\1\SEQUENCE\12_05_09.S : C:\HPCHEM\1\METHODS\180M.M : 26/06/09 12:29:14 by Lucienir (modified after loading) METODO 180M 180oC 0MIN 8oC/MIN ATE 310oC 20 min INJ=DET=300oC ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted by Signal Multiplier Dilution Signal 1: FID1 A, Peak RT Type Width Area Height Area # [min] [min] counts*s [counts] % |----|---------|------|-------|------------|------------|-----------| 1 2.455 BB 0.046 17509.86133 5708.70410 0.7750 2 8.879 BV 0.033 8272.44141 4196.77441 0.3661 3 10.885 BB 0.033 15015.15625 7112.15820 0.6646 4 11.860 BB 0.046 13817.00000 6731.98242 0.6115 5 12.820 BB 0.052 43216.23828 21986.59766 1.9127 6 13.748 BV 0.047 51371.15625 22583.62500 2.2736 7 14.831 BV 0.092 1515791.37500 211098.35938 67.0876 HC29 8 15.533 BB 0.043 48946.37891 24127.35156 2.1663 9 16.460 BV 0.083 457738.78125 108127.35937 20.2591 10 17.250 BB 0.038 13221.98730 5441.32275 0.5852 11 18.281 BV 0.049 74522.23437 23683.37305 3.2983 Totals : 2259422.50000 440797.59375 ===================================================================== *** End of Report *** : : 1.000000 1.000000

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Cromatograma (Amostra)
FID1 A, of 26_06_09\AMOSTR04.D counts 30000

10000

5000

9 7. 08 90 86 .9 9. 12 91 7 10 . 11 11 . 5 905 . 8 20 74 12 .8 13 23 .7 41 15 .4 96 17 .2 31
10 15 20

15000

6.

14

.6

41

20000

18

.2

50

25000

16

.3

71

25

30

min

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Data File C:\HPCHEM\1\DATA\26_06_09\AMOSTR04.D Sample Name: C3 Instrumento 1 26/06/09 16:02:38 Lucienir ===================================================================== Injection Date : 26/06/09 13:39:49 Seq. Line : 4 Sample Name : C3 Vial : 3 Acq. Operator : Lucienir Inj : 1 Inj Volume : 2 l Different Inj Volume from Sequence ! Actual Inj Volume : 4 l Acq. Method Last changed : C:\HPCHEM\1\METHODS\180M.M : 26/06/09 13:36:37 by Lucienir (modified after loading) Analysis Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\ALCATRO.M Last changed : 26/06/09 16:02:07 by Lucienir (modified after loading) METODO 180M 180oC 0MIN 8oC/MIN ATE 310oC 20 min INJ=DET=300oC ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted by Signal Multiplier Dilution Signal 1: FID1 A, Peak RT Type Width Area Height Area # [min] [min] counts*s [counts] % |----|---------|------|-------|------------|------------|-----------| 1 6.908 VB 0.030 3081.48340 1582.45593 1.5174 2 7.906 BB 0.029 2470.04028 1282.45325 1.2163 3 8.912 VB 0.030 5019.25586 2646.31543 2.4716 4 9.917 VV 0.031 4546.51416 2245.21582 2.2388 5 10.893 Fsho 0.000 0.00000 3633.50488 0.0000 6 10.905 PB 0.031 11976.50195 5847.20410 5.8976 7 11.520 BV 0.033 7533.57617 3436.87793 3.7097 8 11.874 BB 0.036 8038.99609 3318.20776 3.9586 9 12.823 VB 0.032 14373.70703 6867.59912 7.0780 10 13.716 Fsho 0.000 0.00000 1462.23596 0.0000 11 13.741 BV 0.038 7480.38086 2764.16357 3.6835 12 14.641 BB 0.030 24221.11328 11944.73242 11.9272 13 15.496 BV 0.053 8572.68066 2577.55249 4.2214 14 16.371 BV 0.034 55113.08203 25723.41602 27.1392 15 17.231 BV 0.040 6080.19824 2268.38672 2.9941 16 18.250 BB 0.042 44567.87109 15647.80078 21.9465 Totals : 203075.40625 93248.12500 ===================================================================== *** End of Report *** : : 1.000000 1.000000

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Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

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Anlises Qumicas e Bioqumicas demoradas e/ou difceis em

outros tipos de tcnicas;

Anlises de frmacos aps sua fabricao para controle de sua

estabilidade;
Anlise de soro sanguneo de pacientes; Anlise de vitaminas;

Anlise de aucares e outros tipos de alimentos;

Anlise ambiental devido a contaminaes por inseticida, por

exemplo, fungicidas e herbicidas.

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Adsoro

Partio

Troca inica

Quiral

Fase ligada

Excluso

Bioafinidade Diferentes mecanismos de separao em HPLC.

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Esquema de um HPLC

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(A)

(B)

Colunas de separao: (A) HPLC, (B) CG.

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Absoro ndice de refrao Fluorescncias Espalhamento de luz Espectrometria de massas Dicrosmo circular Eletroqumica Radioatividade Outros 70 % UV-Vis

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Amostras solveis na fase mvel; Lquidos e slidos, inicos ou covalentes com

massas de 32 at 4.000.000 ua; Amostras de gs lbeis, termicamente instveis, possveis de adsorver sobre superfcies metlicas;

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Desvantagens
Alto Custo: Equipamento e Manuteno Ausncia de detector universal Vantagens Fase Estacionria utilizada vrias vezes

Versatilidade: solubilidade da amostra (nico requisito)

Tempo de anlise reduzido Alta resoluo Boa detectabilidade: UV-Vis (10-10 g), fluorescncia (10-12 g) Automao

Bom mtodo para anlises qualitativas e quantitativas