Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco

Verano de Investigacin Cientfica

Proyecto: ANALISIS DE ANTIOXIDANTES CON ACTIVIDAD NEUROPROTECTORA

Realiz: Erendira Villalobos Snchez Asesor: Dr. Alejandro Arturo Canales Aguirre.

Agosto 2011

CONTENIDO
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER ................................................................................................... 3 HIPOTESIS -AMILOIDE (CASCADA AMILOIDE) ................................................................. 5 PRODUCCION DEL PEPTIDO -AMILOIDE ........................................................................ 7 ESTRS OXIDATIVO ................................................................................................................... 8 SUSCEPTIBILIDAD DEL CEREBRO AL ESTRS OXIDATIVO ....................................... 10 APLICACIN DE AGENTES ANTIOXIDANTES EN LA ENFERMEDAD ....................... 10 ANTIOXIDANTES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ........................................................... 11 MECANISMO DE ACCION DE LOS ANTIOXIDANTES.................................................... 12 ANTIOXIDANTES NATURALES .......................................................................................... 13 OBJETIVO ........................................................................................................................................ 13 OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................................ 13 DETERMINACION DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR ABTS .................................... 14 DETERMINACION DE CAPACIDAD ANTIOXIDANNTE POR DPPH ................................. 15 RESULTADOS ................................................................................................................................. 18 DISCUSION DE RESULTADOS .................................................................................................... 19 CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 20 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................................................................................. 21

INTRODUCCION

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

El aumento progresivo de la longevidad humana est dando origen a la presentacin de nuevos sndromes psicopatolgicos invalidantes, entre los cuales destacan prioritariamente la demencia senil y muy especialmente la enfermedad de Alzheimer (EA). (Mas 2005). La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurolgico que provoca la muerte de las clulas nerviosas en el cerebro. Por lo general, la enfermedad de Alzheimer comienza paulatinamente y sus primeros sntomas pueden atribuirse a la vejez o al olvido comn. A medida en que avanza la enfermedad, se van deteriorando las capacidades cognitivas, entre ellas la capacidad para tomar decisiones y llevar a cabo las tareas cotidianas, adems surgir modificaciones de la personalidad, as como conductas problemticas. En sus etapas avanzadas, la Enfermedad de Alzheimer conduce a la demencia y finalmente a la muerte. (Mas 2005) Por lo general, el principio de la demencia es engaoso. El paciente o la familia notan olvidos menores, intranquilidad o apata, una tendencia incrementada a perder cosas pequeas, inconsistencias en algunos de los quehaceres normales cotidianos, conductas y palabras repetitivas. Con el tiempo, el proceso demencial se agrava y se van alterando las funciones cognitivas. Las personas dejan de trabajar, se llegan a perder en sus alrededores, dejan de reconocer a personas, revierten su ciclo de sueo, etc. (Feria 2005). El mal de Alzheimer es la demencia ms frecuente en la poblacin anciana, representando de un 50 al 60 % de las demencias. Se calcula que en el mundo existen 22 millones de personas que la sufren y que en tres dcadas el nmero se duplicar. Segn la Asociacin Internacional de Alzheimer, la enfermedad puede comenzar a una edad tan temprana como los 50 aos, sin que hasta el momento exista una cura. Esta demencia neurodegenerativa, se caracteriza por fallo en la consciencia en combinacin con amiloidosis cerebral, cambios fibrilares intraneuronales, prdida neuronal y sinptica y deficiencias en los neurotransmisores. (Parquet. 2007)

FACTORES IMPLICADOS EN LA PATOGNESIS DE LA ENFERMEDAD

Hasta ahora no se ha identificado un solo factor como la causa de la EA. Es probable que una combinacin de factores, incluyendo la edad, la herencia gentica, la dieta y el estado de salud en general sean responsables. Como factores primarios responsables de esta patognesis, se han propuesto diversos parmetros independientes que incluyen: la hiperfosforilacin de las protenas tau del citoesqueleto que se ensamblan formando las maraas neurofifrilares en el interior de las neuronas, el genotipo de la apolipoprotena E, que ha sido detectada mediante inmunohistoqumica en las placas seniles y los ovillos neurofibrilares, y el metabolismo anormal de la protena amiloide causante de las placas amiloides que forman conglomerados extracelulares (M. Cascales Angosto 2010). El genotipo de la apolipoproteina E (ApoE) es el ms conocido y estudiado de todos. Todos tenemos apoE que ayuda a transportar el colesterol en la sangre. El gen de la apoE tiene tres formas ApoE2, ApoE3 y ApoE4, una parece proteger a una persona de la enfermedad de Alzheimer, y otra parece que aumenta las probabilidades del desarrollo de la enfermedad en la persona. Haber heredado un gen del tipo 4 implica que se tienen ms riesgo de desarrollar la enfermedad que los que no lo han heredado. Los que tienen un gen del tipo 2 tienen el efecto opuesto. Tener uno de estos genes no es determinante para que aparezca la enfermedad, aunque es un factor de riesgo muy importante. (N. Padrn Prez 2002).

La protena Tau se encuentra en los ovillos de degeneracin neurofibrilar, los cuales constituyen una de las caractersticas histolgicas ms importantes de la EA. Se encuentran en el citoplasma neuronal y su nmero est directamente relacionado con la severidad de la demencia. Estn constituidos por cmulos de filamentos helicoidales emparejados, que presentan caractersticas diferentes de los neurofilamentos y microtbulos normales. Uno de sus constituyentes fundamentales es una forma anormalmente fosforilada de la protena de los microtbulos, llamada protena Tau. Los ovillos de degeneracin neurofibrilar suelen ser ms abundantes en las reas donde es ms intensa la destruccin neuronal, es decir, el hipocampo y las zonas adyacentes del lbulo temporal, que son estructuras que tienen una gran importancia en la funcin de la memoria. (S. Gra Menndez 2002).

HIPOTESIS -AMILOIDE (CASCADA AMILOIDE)

El descubrimiento de que las mutaciones tenan como resultado final el aumento en la concentracin del pptido A, condujo a la proposicin de la hiptesis que se conoce como "cascada amiloide" (figura1). Segn esta teora, la produccin excesiva del pptido A especialmente la produccin del pptido A-42 conducira a la formacin de depsitos extracelulares de substancia amiloide en forma de placas seniles. Estos depsitos resultaran txicos para las clulas que entraran en contacto con ellos y conduciran a la formacin de ovillos neurofibrilares y, posteriormente a la muerte celular y la aparicin de la demencia. (Prez-Tur s.f.) La hiptesis del pptido -amiloide es probablemente la ms defendida en la actualidad. Aunque presenta algunas deficiencias, no ha surgido todava ninguna otra hiptesis con tanto soporte experimental, que explique los mecanismos moleculares responsables de la enfermedad. Hace 20 aos se demostr que el componente principal de las placas seniles presentes en el cerebro de los pacientes afectos por la enfermedad de Alzheimer, era la protena -amiloide. Ahora se sabe que esta protena es el producto de un metabolismo inadecuado de la protena precursora de amiloide (APP), debido a su protelisis por las enzimas y -secretasas, sin que intervenga la enzima secretasa. Aunque todava se desconoce el mecanismo neurotxico especfico de la protena amiloide, muchos estudios demuestran que tiene un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad. (Ballester 2011). De acuerdo con sta hiptesis, el aumento de beta-amiloide es lo que da lugar a todas las caractersticas patolgicas de la enfermedad, incluyendo la hiperfosforilacin de la protena tau, la formacin de ovillos neurofibrilares, la disfuncin sinptica y la muerte neuronal. (A.M. Simn 2010). La toxicidad del A se ha asociado a la generacin de radicales libres que causan peroxidacin de lpidos y oxidacin de protenas entre otros daos. Se ha planteado que el A pueda reconocer a receptores especficos que median a su vez neurotoxicidad. Entre estos se encuentra el receptor scavenger o pepenador que se expresa en la microglia y es capaz de internalizar agregados de este pptido. Independientemente de la va de entrada del pptido a la clula, ste genera un estado de estrs oxidativo que eventualmente desencadena la muerte celular. (N. Manzano Len 2006)

Figura 1: Esquema de Patogenia de la enfermedad de Alzheimer. Cascada Amiloide (Ballester 2011).

El trmino amiloide hace referencia al almidn o a un compuesto parecido a la celulosa. Fue en 1851 cuando Virchow lo us por primera vez para referirse a depsitos de polisacridos que se

tien con el colorante rojo Congo. Este pptido se produce normalmente en forma monomrica soluble y circula en concentraciones bajas en el lquido cefalorraqudeo y sangre. En concentraciones fisiolgicas acta como factor neurotrfico y neuroprotector, sin embargo con el envejecimiento y sobre todo en la enfermedad de Alzheimer se acumula, forma fibrillas insolubles y causa neurotoxicidad.(Oliva 2006). Por otra parte, amiloidosis es un trmino usado en la medicina para describir cmulos de pptidos que se presentan en varias enfermedades y en diferentes tejidos y que tienen la capacidad de agregarse como fibras insolubles. Estas fibras amiloidticas forman filamentos no ramificados de entre 6 y 10 nm de dimetro y presentan una estructura secundaria de lmina plegada, conformacin indispensable para que estos pptidos sean txicos. (Oliva 2006)

PRODUCCION DEL PEPTIDO -AMILOIDE

El -amiloide es un fragmento proteico que proviene de una protena de mayor tamao denominada APP (Protena Precursora de Amiloide). Esta protena es necesaria para el crecimiento y supervivencia de la neurona. En la enfermedad de Alzheimer, sta protena se corta en varios fragmentos mediante la accin de enzimas proteolticas, por un proceso no muy bien conocido. Uno de estos fragmentos es el -amiloide insoluble que se deposita fuera de las neuronas. (M. Cascales Angosto 2010) La proteasa -secretasa escinde la protena APP entre los residuos de 16 y 17 de A para liberar el APP soluble y forma un fragmento C- terminal. La - secretasa rompe proteolticamente APP en el lado de N-terminal de A (1-42), mientras que -secretasa escinde APP en la terminal de carboxilo de esta secuencia. La -secretasa acta en diferentes residuos cerca del carboxilo terminar de la A principalmente en el sitio 40 y 42, A (1-40) y A (1-42), respectivamente (Figura 2). Estos dos pptidos conforman la mayora del pptido que reside en el cerebro. El ms txico de los dos pptidos es A (1-42), que se agrega ms rpidamente que A (1-40). (Butterfield 2007)

FIGURA 2. Diagrama que muestra la protena precursora del -amiloide (APP). Se muestran los Sitios de rotura por las secretasas y . La accin secuencial de la secretasa y la secretasa , origina el pptido amiloide.

ESTRS OXIDATIVO
En los ltimos aos se ha publicado un gran nmero de estudios que analizan el posible papel de las reacciones oxidativas en la patogenia del envejecimiento tisular y de muchas enfermedades. Estas reacciones son mediadas por los llamados radicales libres o especies reactivas de oxgeno (ROS) que generan los seres vivos como resultado del metabolismo aerobio y cuya produccin aumenta ante cualquier lesin tisular. La presencia de estrs oxidativo se debe a un exceso de produccin de sustancias oxidantes, y al dficit de mecanismos de defensa contra la oxidacin, o a ambos factores. (F.J. Jimnez-Jimnez 2006).

A: Radical Libre
*O2- Radical superxido *OH- Radical Hidroxilo RO2* Radical peroxilo RO* Radical alcoxilo o fenoxilo L* Radical perxido lpido *NO2 Radical de xido ntrico

B: Reaccin ms comn que los origina

NADPH + 2O2 NADPH++ H+ + 2 *O2*UQ- + H2O2 UQ + *OH + *OHLH + RO2* L* + H2O R* + O2 RO* L O2* + LH LOOH + L* *OH + NO2- OH- + *NO2

Cuadro 1. . A:Ejemplo de los radicales libres ms frecuentemente producidos por los sistemas biolgicos que dan origen a especies reactivas y B: reacciones ms comunes que los origina. (C. Cerd Mic 2010)

Existen numerosas situaciones en las que la formacin de ROS aumenta, como ocurre en alteraciones nutricionales y metablicas, en la exposicin a contaminantes ambientales, durante procesos de sobrecarga fsica, o bien, en estados carenciales de las funciones orgnicas como el cncer y el envejecimiento. La reactividad de las ROS les permite interaccionar con macromolculas de diversa naturaleza, entre las que se incluyen los lpidos, las protenas y los cidos nucleicos, modificando su estructura y su funcin. Para contrarrestar los efectos del estrs oxidativo las clulas han desarrollado a lo largo de su evolucin mecanismos moleculares muy efectivos conocidos como antioxidantes, de los cuales existe una gama muy variada que proporciona al organismo una cobertura defensiva muy eficaz. Un antioxidante es aquella molcula capaz de prevenir y/o evitar la oxidacin de otra molcula, bien por interaccin y estabilizacin de especies reactivas, o bien por la transformacin de stas en configuraciones ms estables y de reactividad reducida. (C. Cerd Mic 2010)

Con el desarrollo de la vejez, las acciones de las especies reactivas de oxgeno y de otros radicales son mucho ms perjudiciales, debido a que con el proceso de envejecimiento los sistemas antioxidantes se ven disminuidos y por tanto existe una mayor probabilidad de que las especies reactivas ejerzan su accin sobre sus molculas blancos. Los efectos observados en los cidos nucleicos por los radicales libres de oxgeno son por causa de fenmenos de hidroxilacin de bases nitrogenadas, escisin de hebras de ADN. Esto ocasiona alteraciones en la duplicacin y transcripcin, que explican la asociacin de la generacin de radicales libres de oxgeno con la carcinognesis y el envejecimiento. (F.J. Jimnez-Jimnez 2006)

La oxidacin causa alteraciones en la estructura de algunas protenas y la formacin de agregados protenicos; estas protenas anormales inducen dao oxidativo y estn presentes en las enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer los -amiloides pueden estimular la oxidacin a travs de mltiples vas, actan sobre el receptor p75 y el receptor de productos de glicosilacin avanzada (RAGE), lo que provoca una entrada masiva de Ca+2 y la activacin de caspasas que llevan a la muerte celular por apoptosis. La produccin aumentada de ROS y un aumento de Ca+2 intracelular son componentes muy importantes en varios tipos de neuropatologas. Un aumento en la concentracin de Ca+2 intracelular activa la liberacin de neurotransmisores, pero cuando este aumento se mantiene por ms tiempo tambin se activan proteasas, lipasas, y endonucleasas. La activacin de proteasas dependientes de Ca+2 puede daar al citoesqueleto y a las protenas de membrana. La activacin de las lipasas, cataliza la hidrlisis de

los fosfolpidos de la membrana, al actuar sobre los fosfolpidos de la membrana, libera cido araquidnico, cuyos metabolitos son de considerable importancia como mediadores del dao oxidativo en varios trastornos clnicos. Adems la activacin de las endonucleasas dependientes de Ca+2, provoca fragmentacin del DNA el cual es un evento importante en la apoptosis. (C. Dorado Martnez 2003)

SUSCEPTIBILIDAD DEL CEREBRO AL ESTRS OXIDATIVO

Si bien la totalidad de las clulas aerbicas son susceptibles de sufrir los efectos del EO, el cerebro de los mamferos es todava ms vulnerable a la accin nociva de las ROS. Una de las razones es su alto consumo de oxgeno (20% del oxgeno total). (C. Cerd Mic 2010). Es particularmente vulnerable al estrs oxidativo ya que presenta una elevada tasa metablica derivada de la glucosa, posee niveles muy bajos de defensas antioxidantes, contiene altas concentraciones de cidos grasos poliinsaturados, que son posible blanco de peroxidacin lipdica, y adems es rico en actividades enzimticas relacionadas con metales de transicin, los cuales pueden catalizar la formacin de radicales libres. (Oliva 2006).

Aunque el mecanismo por el cual el A genera radicales libres en la enfermedad de Alzheimer no se conoce, se ha definido que estas especies reactivas causan peroxidacin de lpidos, oxidacin de protenas y prdida de integridad de la membrana. Esto trae como consecuencia la inhibicin de ATPasas, prdida de la homeostasis del calcio, inhibicin del sistema de captura de glutamato dependiente de sodio en clulas gliales, alteracin de vas de sealizacin, activacin de factores transcripcionales y finalmente apoptosis. (N. Manzano Len 2006)

APLICACIN DE AGENTES ANTIOXIDANTES EN LA ENFERMEDAD

Se ha demostrado que el cerebro de personas con la enfermedad de Alzheimer presenta una generacin excesiva de especies reactivas del oxgeno (ROS) y estrs oxidativo. El dao oxidativo se ha encontrado en todas las clases de molculas orgnicas esenciales para la integridad neuronal estructural y funcional. La peroxidacin lipdica excesiva, la oxidacin de protenas, ADN y ARN y la glicoxidacin han sido documentados en el cerebro con de personas con AD. (N. Manzano Len 2006)

La evidencia acumulada indica que el estrs oxidativo se produce antes del inicio de los sntomas en "AD" y tales cambios oxidativos son generados en todo el cuerpo, asociados principalmente a las regiones vulnerables del cerebro que han sido afectadas en la enfermedad. El dao oxidativo es un factor clave en la iniciacin o progresin de la enfermedad. Desafortunadamente, no existe un tratamiento definitivo para la prevencin o cura de la enfermedad de Alzheimer. Los frmacos actualmente aprobados no se dirigen a ninguna de los principales mecanismos se cree que causan la muerte neuronal. En consecuencia, se considera que los antioxidantes que previenen las consecuencias perjudiciales del estrs oxidativo tienen un enfoque prometedor para la neuroproteccin. Los antioxidantes constituyen una parte importante del grupo de frmacos experimentales y clnicos que actualmente se consideran para la prevencin y la terapia AD. (N. Manzano Len 2006)

ANTIOXIDANTES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Todos los seres vivos que utilizan el oxgeno para obtener energa, liberan radicales libres, lo cual es incompatible con la vida a menos que existan mecanismos celulares de defensa que los neutralice. A estas defensas se les denomina antioxidantes. Con el envejecimiento, los niveles tisulares de antioxidantes que se producen de forma natural como las vitaminas E, C, el glutatin y la catalasa se reducen; por lo tanto, el estado antioxidante total esta disminuido, por los daos acumulados por los radicales libres con los aos, entre otros factores. Es por eso que se necesita de un mayor consumo de compuestos antioxidantes durante esta etapa de la vida. (E. Zorrilla Garca 2002), Muchos estudios han demostrado que un aporte suplementario de antioxidantes reduce la incidencia de ciertas enfermedades crnico degenerativas como el alzheimer, y mejora el estado de salud de los ancianos. (Garca 2002).

Los antioxidantes son un conjunto heterogneo de sustancias formado por vitaminas (A, E, C), minerales (cobre, hierro, manganeso, selenio, zinc), pigmentos naturales (flavonoides, carotenoides), coenzimas (Q), enzimas (catalasas, oxidasas) y otros compuestos (cido lipoico), que bloquean el efecto daino de los radicales libres, por ello la importancia del estudio de la capacidad antioxidante de ciertas molculas y de los alimentos. La ingesta de alimentos ricos en sustancias antioxidantes como vitaminas C y E, carotenoides o compuestos fenlicos, previene o disminuye el desarrollo de las enfermedades antes mencionadas. (Kuskoski et al., 2005)

MECANISMO DE ACCION DE LOS ANTIOXIDANTES

La capacidad antioxidante celular est dada por mecanismos a travs de los cuales la clula anula la reactividad y/o inhibe la generacin de radicales libres. Estos mecanismos son adecuados a la muy corta vida media de los radicales libres y comprenden molculas pequeas, endgenas y exgenas con capacidad antioxidante. Algunos de los antioxidantes, no tienen una funcin nutritiva que se conozca, pero son sin embargo son importantes para la salud humana debido a su gran poder antioxidante. El antioxidante al colisionar con el radical libre le cede un electrn, se debilita su accin y en algunos casos, puede regenerarse a su forma primitiva por la accin de otros antioxidantes. (M. Avello 2006).

Los antioxidantes pueden actuar en las formas siguientes: 1. Disminuyendo la concentracin de oxidantes. 2. Evitando la iniciacin de la reaccin en cadena al barrer (cubrir o detener una reactividad qumica muy alta), los primeros radicales libres que se forman. 3. Unindose a iones metlicos para evitar la formacin de especies reactivas. 4. Transformando los perxidos en productos menos reactivos. 5. Deteniendo la propagacin y el aumento de radicales libres. (C. Dorado Martnez 2003)

Existen diversos mtodos para evaluar la actividad antioxidante, ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias ms aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromgenas de naturaleza radical; la prdida de color ocurre de forma proporcional con la concentracin. (E. Kuskoski 2005). Alternativamente, diversos compuestos cromgenos como el ABTS* 2,2-azinobis (3-ethilbenzotiazolina-6-acido sulfonic) y el DPPH* (1,1-difenil-2pricrilhidrazil) son utilizados para determinar la capacidad de los compuestos fenlicos que contienen los frutos para captar los radicales libres generados, operando as en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidacin, que implican a especies reactivas de oxgeno (EROS). (E. Kuskoski 2005).

ANTIOXIDANTES NATURALES
La dieta es esencial para mantener las defensas antioxidantes ya que es la va de ingreso de los compuestos antioxidantes al organismo. Los granos enteros contienen una amplia gama de antioxidantes por lo que su ingesta puede contribuir a elevar la capacidad antioxidante corporal y a prevenir las enfermedades en las cuales el estrs oxidativo est presente. Los productos fabricados con granos enteros presentan mayor actividad antioxidante en relacin a los vegetales y frutas comunes. El maz tiene el ms alto poder antioxidante total seguido del trigo, avena y arroz, as mismo presenta el mayor contenido fenlico total. Aunque tambin aparecen libres en estos granos la mayor proporcin de compuestos fenlicos se encuentra bajo la forma unida, es decir, ligados a componentes de la pared celular. La forma unida es la que ms contribuye a la actividad antioxidante total. El cido ferlico es el principal compuesto fenlico en el maz, trigo, avena y arroz. En el colon, los cidos fenlicos unidos a la fibra pueden ser liberados y las clulas endoteliales colnicas pueden absorberlos, en stas aumentan la defensa antioxidante. (N. Ruiz F. 2005)

OBJETIVO - Determinar la capacidad protectora Neuronal de diferentes compuestos fenlicos derivados del cido Ferlico. OBJETIVOS ESPECIFICOS -

Determinar la capacidad antioxidante de los compuestos fenlicos Determinar la capacidad protectora neuronal de los compuestos fenlicos mediante la prueba de toxicidad MTT. Determinar apoptosis celular con el inductor mediante la prueba de citometria de flujo.

METODOLOGIA

Las muestras que se analizaron en los siguientes mtodos se enlistan en el cuadro 2:

MUESTRAS ACIDO FERULICO ACIDO FERULICO CAPE CAPE ACIDO CLOROGENICO ACIDO CLOROGENICO BUTIL FERULATO BUTIL FERULATO ACIDO CAFEICO ACIDO CAFEICO PROPIL FERULATO PROPIL FERULATO METIL FERULATO METIL FERULATO ETIL FERULATO ETIL FERULATO FENETIL FERULATO FENETIL FERULATO Cuadro 2. CONCENTRACIN 800 M 400 M 800M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M 800 M 400 M

DETERMINACION DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR ABTS

Segn la metodologa desarrollada, el radical ABTS se obtiene tras la reaccin de ABTS (7mM)
+

con persulfato potsico (2.4mM concentracin final) incubados a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS se diluye con etanol hasta obtener un
+

valor de absorbancia comprendido entre 0,70-1.0 a 734nm (longitud de onda de absorcin). En una placa de 96 pozos se colocarn 20 l de la muestra y se le aadirn 200 l de solucin diluida del catin ABTS; se mantendr a temperatura ambiente por 6 minutos y se leer a 734nm.

El antioxidante sinttico de referencia, Trolox, se ensaya a una concentracin de 800 M. Los resultados se expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox).

Siendo

la media aritmtica de la absorbancia del control y

la media aritmtica de la

absorbancia de la muestra. La capacidad antioxidante se evalu por triplicado, empleando el mtodo del radical ABTS basado en la decoloracin del catin ABTS+.

DETERMINACION DE CAPACIDAD ANTIOXIDANNTE POR DPPH

La siguiente metodologa se basa en atrapar al radical libre DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil). En una placa de 96 pozos se aadirn por triplicado 20 l de las muestras usando como control positivo BHT (butil hidroxil tolueno) 100M, adicionando a cada una de las muestras 200l de una solucin DPPH 150M. La placa se leera al cabo de 90 minutos de incubacin a 520nm en un espectrofotmetro. La actividad antiradical (ARA) se calcular como porcentaje de decoloracin de DPPH. Siendo Am la media aritmtica del incremento de la absorbancia del control y Am la media aritmtica del incremento de la absorbancia de la muestra.

DETERMINACION DE VIABILIDAD CELULAR POR MTT

El ensayo se basa en la reduccin del bromuro 3-[4,5-dimetil-2-thiazol-il]2,5-difenil tetrazolio (MTT) en el interior de las mitocondrias a formazn, el cual puede ser cuantificado espectrofotomtricamente a la longitud de onda de 570nm. La cantidad de formazn producido es proporcional al nmero de clulas metablicamente activas presentes. Se aade un 10% de la solucin MTT (5mg/m en PBS) por pocillo, incubndose en oscuridad y en una atmosfera de 5% de CO2. En el crecimiento celular, usar un volumen inicial de 250,000 cel/ml fijadas en una placa de

96 pozos con poli-D-lisina para adherirlas y hacer una diferenciacin celular con el Factor de crecimiento neural. El tratamiento con las muestras y el inductor de apoptosis celular se realizaron en las siguientes condiciones: Amiloide 0.5g/ml Muestras 1.25 m

Los medios utilizados en la prueba se detallan en los siguientes cuadros (cuadro 3, medio de crecimiento y cuadro 4, medio de diferenciacin neuronal)

MEDIO DE CRECIMIENTO Suero Fetal equino Suero Fetal Bovino Penicilina-Ampicilina Glutamax Cuadro 3. MEDIO DE DIFERENCIACION Suero Fetal equino Suero Fetal Bovino Penicilina-Ampicilina Glutamax Factor de crecimiento neural Cuadro 4.

CONDICIONES 10% 5% 1% 1%

CONDICIONES 1% 0.5% 1% 1% 100 ng/ml

DETERMINACION DE CELULAS APOPTOTICAS POR CITOMETRIA DE FLUJO La citometra de flujo es un proceso que permite que las clulas pasen en fila de una en una, dentro de un flujo a travs del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medicin simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sla clula. La ventaja analtica de la citometra de flujo tiene como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamtricas en un nmero estadsticamente adecuado de clulas para definir las propiedades de una poblacin celular o de las subpoblaciones que la componen. El anlisis multiparamtrico hace posible evaluar poblaciones celulares particulares

dentro de una mezcla compleja, ya que aprovecha propiedades intrnsecas de la clula como la dispersin de la luz, y caractersticas controladas como la fluorescencia. Las clulas se trataron con antioxidantes en una concentracin 1.25M durante 24 horas para despus de indujo la apoptosis celular mediante el inductor Amiloide a una concentracin de 0.5g/ml. Transcurridas 43 horas de haber inducido la apoptosis se realiz la prueba de citometra de flujo, lavando primeramente las clulas (1ml en concentracin de aprox. 150,000 cel/ml) con PBS y resuspendiendo las clulas en 100l de buffer de unin a anexina, despus se aadieron 5l de anexina y 5l de ioduro de propidio; se dej reposar 30 minutos y se aadieron 400l de Buffer de unin a anexina y analizar las muestras en el citometro de flujo.

RESULTADOS
En la grfica 1 se muestran los datos en porcentaje de inhibicin de cada una de las muestras usadas para la prueba con el radical ABTS+.

%Inhibicin
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Grafica 1. Porcentajes de inhibicin obtenidos de la prueba de ABTS para las concentraciones 400 y 800M de las diferentes muestras.

En la grfica 2 se muestran los datos en porcentaje de inhibicin de cada una de las muestras para la prueba con el radical DPPH+.

%Inhibicin
80 70 60 50 40 30 20 10 0

Grafica 2. Porcentajes de inhibicin obtenidos de la prueba de DPPH para las concentraciones 400 y 800M de las diferentes muestras.

En la grfica 3 se muestran los datos en porcentaje viabilidad celular de cada una de las muestras en la concentracin 1.25M, para la prueba de toxicidad con el compuesto MTT.

% Viabilidad Celular
120 100 80 60 40 20 0

Grafica 4. Porcentaje de viabilidad celular para las distintas muestras en una concentracin 1.25M para la prueba de MTT.

DISCUSION DE RESULTADOS

Segn los datos obtenidos en las grficas 1 y2, los compuestos cido clorognico y CAPE muestran un comportamiento secuestrante elevado de los catines ABTS+ y DPPH+, puesto que disminuy significativamente la absorbancia con respecto los controles y su porcentaje de inhibicin es mayor a un 80% en la prueba de ABTS y un 70% en la prueba del radical DPPH. De los compuestos derivados del cido ferlico, los compuestos con

mayor porcentaje de inhibicin fueron el Butil Ferulato (800M) , Metil Ferulato (800M) y Etil Ferulato (800M) con los porcentajes de inhibicin de 56.94, 73.98 y 83.91 % respectivamente para la prueba de ABTS. De igual manera estos compuestos mostraron un comportamiento similar en la prueba de DPPH, con el porcentajes de inhibicin de 33.25, 33.13 y 42.93 %. Los compuestos derivados del cido ferlico con menor porcentaje de inhibicin de los radicales usados fueron el Propil Ferulato (800M) y Fenetil ferulato (800M), siendo ste ltimo el que mostro el menor porcentaje de inhibicin con 9.43% y 24.26% en las pruebas DPPH y ABTS respectivamente. Se considera un valor relativamente bajo, debido a que el cido ferlico mostro ms porcentaje inhibicin a los radicales que este compuesto, con una diferencia de casi un 24% ms en cada una de las pruebas. De la prueba de toxicidad podemos decir, que los compuestos con mayor proteccin celular al inductor Amiloide despus de 24 horas de tratamiento son los derivados de cido ferlico Propil Ferulato, Metil ferulato y Butil Ferulato con porcentajes de viabilidad celular de 93.98, 93.5 y 100% respectivamente, y los copmpuestos con menor proteccin celular son el CAPE y Etil Ferulato con los porcentajes de viabilidad de 49.76 y 53.29%. De la prueba de Citometria de flujo los resultados obtenidos mostraron que a las 43 horas las muestras fenlicas pierden su actividad antioxidante e inducen necrosis en las clulas.

CONCLUSIONES

Se determin la capacidad antioxidante de las muestras fenlicas mediante las pruebas con los radicales ABTS y DPPH, obteniendo como resultados que las muestras Butil Ferulato, Metil Ferulato y Etil Ferulato son los antioxidantes que tienen mayor capacidad de secuestrar a los radicales libres; a su vez tambin se determin la capacidad neuroprotectora de estas muestras mediante la prueba de toxicidad con el compuesto MTT, de los cuales los compuestos Propil Ferulato, Metil Ferulato y Butil Ferulato mostraron el mayor porcentaje de viabilidad. A partir de estos datos concluimos que los derivados fenlicos del cido ferulico, Butil Ferulato y Metil Ferulato son los compuestos con mayor capacidad protectora neuronal ya que presentan mayor capacidad antioxidante y neuroproteccin contra el pptido amiloide.

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